HU212071A9 - Alpha-amidating enzyme compositions and processes for their production and use - Google Patents

Description

Jelen találmány az alfa-amidáló enzimekre, az alfaamidáló enzimek előállítására és ezek felhasználására, az enzimek glicin-végcsoportú szubsztrátokra hatásával alfa-amidált termékek előállítására vonatkozik. Bizonyos előnyös megvalósítások során a találmány szerinti alfa-amidáló enzimek mezőgazdasági vagy gyógyászati alkalmazásra fontos alfa-amidált hormonok és termékek előállítására, beleértve kalcitoninokat, növekedési hormont felszabadító faktorokat, a kalcitonin génhez kötött peptideket és más alfa-amidált termékek előállítására alkalmazhatók.

2. A technika állása

A természetes fehérjék prekurzor formáinak előállítására irányuló, a nukleinsavakat kódoló szekvenciákból való transzlációt követő intracelluláris eljárások (hasítás és/vagy funkciós csoport módosítás) már világosan dokumentálásra került.

Általában emlős sejtek és más eukaroiták alkalmasak bizonyos transzláció utáni feldolgozásra, míg prokarioták nem. Egyes prokariotákat, mint pl. az E. coli-t széles körűen alkalmazzák gazdasejtként emlős fehérjék rekombináns DNS (rDNS) technológiák segítségével történő előállítására, minthogy azok könnyen növekednek szakaszos fermentációs művelettel, és minthogy azok genetikailag jól jellemezhetők. Mindamellett azonban számos géntechnológiával előállított emlős fehérje valamilyen transzláció utáni kezelést igényel, és ezt gyakran komplex, in vitro vegyi művelettel kell elvégezni, melyek költségességük miatt korlátozzák a nagyléptékű termelésben való alkalmazást.

A kezelés egyik típusa a fehérje karboxi-terminális aminosavának specifikus amidálását igényli. Számos természetben előforduló hormon és fehérje tartalmaz olyan módosulatot, amely gyakran nélkülözhetetlen ahhoz, hogy a fehérje biológiailag aktív legyen. Erre példa a kalcitonin, amelyben a natív forma amidált prolinjának nem amidált prolin-maradékkal történő helyettesítése a biológiai aktivitás háromezerszeres csökkentését eredményezi.

Egy C-terminális (alfa) amidálásra alkalmas reagens felismerhető az amidálandó aminosavat közvetlenül követő glicin-maradékról (R-X-gly, ahol R = a fehérje fő része, X = az amidálásra kerülő maradék és „gly” = a glicin maradék). A glicin hasításra kerül és ténylegesen átadja amino részét az utolsó előtti aminosavnak, egyben amidálva azt.

Az első szerzőit, akik egy alfa-amidáló enzim közelítő molekulasúlyát közölték Bradbury A. F. és társai, a Natúré, Vol. 298., 1982., 686-88, Sephadex G-100-at használva úgy találták, hogy a minimális látszólagos molekulatömeg mintegy 60 000 dalton.

Későbbi tanulmányok szerint ilyen enzimek molekulatömege 60 000 és 70 000 dalton között van (gélszüréses kromatográfiával mérve). Ezek a publikációk a kővetkezőit: Húsain I. és Taté S. S., FEBS Letters, 152/2, 1983., 277-281.; Eipper és mtsai., PNAS, 80. kötet, 1983., 5144-5148.; Gomez és mtsai, FEBS Letters, 167/1, 1984., 160-164. és Kizer J. S. és mtsai, PNAS, 81, 1984., 3228-3232.

Eipper és mtsai. PNAS 80, 1983., 5144—48. azt közölték, hogy az enzim maximális amidálási aktivitásához molekuláris oxigénen felül két cofaktor is szükséges, éspedig aszkorbinsav és réz(II)ion.

Egy fehérje karboxil-terminálásának amidálását eredményező kémiai reakcióhoz aminocsoport forrásra is szükség van. Bradbury A. F. és mtsai, Natúré 298.,

1982., 686-688. bemutatták, hogy glicin kerül hasításra, és átadja aminocsoportját az utolsó előtti aminosavnak, ezáltal ez amidálja utóbbit. Azt, hogy aminocsoport donorként glicin szükséges, más szerzőit is igazolták.

Landymore, A. Ε. N. és mtsai, BBRC 117/1, 1983., 289-293. kimutatták, hogy az amidálási reakcióban D-alanin is szerepelhet amino donorként. Ezt követően Kizer és mtsai., PNAS, 81., 1984, 3228-3232. azt közölték, hogy patkányagyban két különböző olyan enzimaktivitás van, amelyek alkalmasak az alfa-amidálási reakció katalizálására. A magasabb molekulatömegű fajtának (70 000 dalton) a szubsztrátum karboxi-terminális glicinjére korlátozott fajlagossága van. Az alacsonyabb molekulatömegű enzim karboxil-terminális aminosavként β-alanint tartalmazó szubsztrátot fogad el.

Sertés hipofízisből kivont és részlegesen tisztított alfa-amidáló enzimek pH optimumára vonatkozólag Bradbury A. E és Smythe D. G. a BBRC 112/2 kötetében, 1983., a 372-377. oldalakon azt közölte, hogy az körülbelül 7,0. Eipper, B. A. és mtsai., PNAS 80,

1983., 5144-5148, ezen eredményt azzal erősítették meg, hogy a patkány hipofízisből részben tisztított alfa-amidáló enzimek pH optimumát 7-nek találták. Azt is megfigyelték, hogy 6,5 pH érték alatt, vagy 7,5 pH fölött az enzim-aktivitás gyorsan csökkent.

Valamennyi fent említett publikációban (melyekre hivatkozás történik) a leírt kivonatok és részben tisztított enzim-keverékek olyan járulékos proteolitikus enzimeket is tartalmaznak, amelyek alkalmasak a potenciális szubsztrátumok és termékek, valamint maguknak az alfa-amidáló enzimeknek a lebontására is és ily módon lassítják a természetes forrásokból származó vagy rekombináns DNS-technikával készült peptidek és polipeptidek amidálását ezen enzimek segítségével.

Általában mások által korábban mért valamennyi amidáló aktivitás a D-szubsztrátumok, mint pl. a tripeptidek D-Tyr-Val-Gly-COOH-ból D-Tyr-ValCONH₂-vé történő átalakítás vizsgálatán alapult. A lehetséges kétféle térszerkezetből („D” vagy „L”) a természetben előforduló, biológiailag fontos aminosavak az „L” alakban fordulnak elő. Mégis a korábbi vizsgá2

HU 212 071 A9 lók részéről a „D” alak használatára azért volt szükség, hogy az ellensúlyozza az ezen kutatók által használt szennyezett enzimpreparátumokban jelen lévő idegen fehérjebontó enzimek jelenlétét. Ezen idegen enzimeknek kifejezett fehérjebontó hatása lehetett az L-aminosav szubsztrátumra, míg csekély hatása volt a Dszubsztrátumra. A kutatók, mivel enzimjük fehérjebontó és más szennyeződéseket is tartalmazott, nem természetes konfigurációjú D-szubsztrátumokat használtak e szennyeződések némely hatásának elkerülésére. Senki sem tudta korábban bizonyítani, hogy enzimkészítményeik bármely fiziológiailag fontos szubsztrátumok, pl. L-szubsztrátumok biológiailag aktív alfa-amidált L-termékekké való átalakítására képesek.

Mint ahogy a továbbiakban bizonyítást nyer, a jelen találmány szerinti készítmények alkalmasak L-szubsztrátumok és D-szubsztrátumok tényleges amidálására, és aktivitásuk 60-tól több mint 1000-szer nagyobb mint a technika állása szerint említett legmagasabb aktivitás, amiről a bejelentőnek tudomása van.

Különböző források írnak le peptidek és fehérjék karboxiterminálisainak amidálására alkalmas enzimkészítményeket. így pl. a Brandbury A. F. mtsai., Natúré

298., 1982., 686-688., (a teljes közlemény idevágó technika állásaként szolgál) beszámolnak egy alfa-amidáló enzimaktivitás jelenlétéről a sertés hipofízisben. A sertés hipofízisből készült preparátum, amely az enzimet tartalmazza, alkalmas arra, hogy licinterminális peptideket a megfelelő glicin-nélküli peptidil-amiddá alakítson át. Bradbury és mtsai., elismerik azonban, hogy e preparátumok a természetes forrásokból tisztított peptideket és pobpeptideket nem amidálják.

„Hipofízisben az amidálási aktivitás meghatározására és megbecsülésére szolgáló vizsgálati rendszert oly módon nyertünk, hogy megvizsgáltuk az enzimkészítmények képességét a szintetikus tripeptid D-tirozilvalil-glicinnek a megfelelő' dipeptid-amid D-tirozil-valin-amiddá való átalakítására... A D-tirozin maradék a szövethomogenizátumban jelenlévő aminopeptidázokkal történő lebontással szemben stabilitást mutatott ... Ellenőrző vizsgálatok azt mutatták, hogy ha szintetikus ...D-tirozil-valin-amidot inkubáltunk hasonló körülmények között, úgy az lassan lebomlott. így a hipofízis enzim révén történő dipeptid-amid keletkezését annak lebomlása követi a hipofízis kivonatban jelenlévő' más enzimek révén (686. oldal).

Ily módon Brandbury és mtsai. megerősítik, hogy a leírt preparátumok tartalmaznak más fehérjebontó enzimeket, amelyek a peptideket és polipeptideket lebontják, és hogy ezen lebomlás minimalizálására nem természetes eredetű D-tirozint alkalmaztak.

Bradbury és mtsai. ki tanítanak továbbá a kétségtelenül proteolitikus enzimekkel szennyezett amidáló enzimek tisztítására a homogenizálást vagy gélszűréses kromatográfiát követő gélszűréses kromatográfia alkalmazására.

Húsain, I„ and Taté, S. S„ FEBS Letters 152/2,

1983., 277-281., egy alfa-amidáló aktivitás jelenlétét írják le a marha hipofízis neuroszekréciós szemcséiben.

Eipper és mtsai., PNAS 80„ 1983., 5144-5148. leírják alfa-amidáló enzimaktivitás jelenlétét a patkány hipofízis mirigy első, középső és hátsó lebenyein és a marha középsó' hipofízisben. Ez a közlemény azonban csak a szintetikus D-Tyr-Val-Gly-szubsztrátum felhasználhatóságát tanítja az alfa-amidálási aktivitás felkutatására, ami a kapott preparátumok szennyezettségének felismerését jelenti.

Gomez és mtsai., FEBS Letters, 167/1., 1984., 160164„ megállapították, hogy a patkány hipotalamuszban is van alfa-amidáló enzimaktivitás.

Bradbury A. F., Smithe, D. G., Peptides Structure and Function: Proceedings of the Eighth American Peptide Symposium, 249-252. oldalak, (1983), (Szerkesztők: Hruby, V. J. és Rich, D. H.) leírják egy alfaamidáló enzimaktivitás jelenlétét patkány pajzsmirigyben.

Mains R. E. és mtsai., Endocrinology, 114. 1984., 1522-1530., arról számolnak be, hogy az egerek elülső hipofízislebenyéból nyert sejtvonal (ATT-20) is tartalmazott egy alfa-amidáló enzimaktivitást, amely idővel a tenyészetben érzékelhetően csökkent.

Oly mirigyek vagy szervek, amelyekről tudjuk, hogy amidált peptideket tartalmaznak, tartalmazhatnak az amidálási reakció katalizálására szolgáló enzimet is. Például alacsonyabb életformákból, pl. kisebb cápákról (Squalus acanthias) jelentették O’Donohue T. L. és mtsai., Peptides 3„ 1982., 353-395., hogy hipofízis-kivonataik amidált peptideket tartalmaznak. Scheller, R. H. és mtsai., Cell, 32. 1983., 7-22. amidáló szignál peptidek jelenlétét írták le az aplysia tengeri csigában. Annak ellenére, hogy a fenti jelenség a természetben látszólag széleskörűen előfordul, az enzim fizikai-kémiai sajátosságairól kevés került nyilvánosságra. Ez annak tudható be, hogy ezekben a neuroendokrin szervekben az enzim igen alacsony szinten van jelen.

Egy meghatározott szövetben az amidált peptidek jelenléte nem jár szükségszerűen együtt az alfa-amidáló enzimek magas szintű jelenlétével. Például a patkányok elülső hipofízis-szövetének magas az alfa-amidáló aktivitása, de nem ismertek szubsztrátumai (Eipper és mtsai., PNAS 80, 5144-5148., 1983.). Patkány hátsó hipofízis-szövetekben vannak amidált peptidek (oxitocin és vazopresszin), de alfa-amidáló aktivitása igen kicsi (Eipper és mtsai., Endo 116., 2497-2504., 1985.). Ezért, az egyes szövetek alfa-amidáló aktivitásának vizsgálatáig az enzim jelenléte vagy lehetséges szintje nem látható előre.

A TALÁLMÁNY CÉLJA ÉS ÖSSZEFOGLALÁSA

A jelen találmány célja egyrészt eljárás alfa-amidáló enzimkészítmények előállítására, amelynek lépései, valamely alfa-amidáló enzim kódolására alkalmas DNS-szekvencia kiválasztása, az említett DNS-szekvencia expressziós vektorba kötése, ezen expressziós vektornak az említett DNS-szekvencia expressziójára képes gazdasejtbe vitele és adott esetben a DNS-szekvenciát tartalmazó és expresszáló gazdasejtek szelektálása.

A jelen találmány célja, másrészt peptid szubsztrát3

HU 212 071 A9 nak peptid amiddá történő konverzióját katalizáló alfaamidáló enzimet kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó expressziós vektorral transzformált vagy transzfektált gazdasejt.

A jelen találmány vonatkozik továbbá alfa-amidáló enzimkészítményekre, amelyek hatékonyan képeznek hasznos alfa-amidált termékeket még L-aminosavakat tartalmazó szubsztrátokból például természetes forrásból származó vagy rekombináns technikával előállított tisztított peptid vagy polipeptid szubsztrátumokból is.

Jelen találmány továbbá foglalkozik az enzimkészítmény előállításának hatékony és költségkímélő módszereivel.

A jelen találmány vonatkozik továbbá alfa-amidáló enzimre specifikus monoklonális antitestekre, immobilizált antitestekre, derítő' gyantákra, immun-affinitásos oszlopokra és hasonlókra, amelyek az említett antitestek alkalmazásával hatékonyan tisztítják az alfa-amidáló enzimet.

A jelen találmány továbbá az alfa-amidáló enzim nagy hatékonyságú expressziójára képes géntechnikai úton előállított gazdasejtekre is irányul.

A jelen találmány vonatkozik továbbá a C-terminális glicin-maradékú szubsztrátokból származó alfaamidált termékekre, a szubsztrátumokat az enzimkészítmény jelenlétében reagáltatják.

Ezek és a további vonatkozások világossá válnak a leírás tanulmányozása során. A találmánynak megfelelően a bejelentő megfelelő tisztaságú új alfa-amidáló enzimkészítményekkel foglalkozik, amelyek specifikus alfa-amidáló aktivitást mutatnak az enzimkészítményben jelenlévő' legalább mintegy 25 mU/mg protein, célszerűen azonban 50 vagy 150 mU/mg feletti proteintartalom esetén. Egy mU olyan aktivitás menynyiséget jelent, amely ahhoz szükséges, hogy egy nanomól (nmól) Danzil-D-Tyr-Val-Gly-COOH-t egy nmól Danzil-D-Tyr-Val-CONH₂-vé alakítson át percenként, 37 °C hó'mérsékleten 7,0 pH mellett, 3 mM aszkorbát ionkoncentráció (teljes reakcióelegyre vonatkoztatva, amely magában foglalja az enzimet, a szubsztrátumot, a ko-faktorokat, stb.), a szubsztrátumhoz képest moláris feleslegben lévő molekuláris oxigén és a maximális aktivitás elérését szolgáló réz(II)ion koncentráció (általában mintegy 2 μΜ az enzim tisztasági fokától függően) jelenlétében.

A találmány szerinti alfa-amidáló enzimek, mint pl. peptidil-glicin alfa-amidáló monooxigénáz, alkalmasak legalábbis a peptid-lánc C- terminálisán glicin végcsoporttal rendelkező' peptidil-vegyületeknek a C-terminálisú glicin helyett aminocsoporttal rendelkező' megfelelő' peptidil-amid-vegyületté való átalakításának katalizálására. „Peptid-lánc” alatt bármely oly polipeptidet értünk, amelyben legalább két aminosav van peptidkötéssel összekötve. A „peptidil-vegyület” kifejezés alatt bármely olyan vegyületet értünk, melynek peptidlánca van. A „megfelelő peptidilamid” kifejezés bármely olyan reakciótermékre utal, melynél egy peptidlánc C-terminálisú glicinje helyére egy aminocsoport kerül.

Célszerű, ha az alfa-amidálási reakció oxigén és egy redukáló ágens jelenlétében történik. Használható redukáló ágensek - korlátozó jelleg nélkül - aszkorbinsav, aszkorbinsav-sók, dihidroxi-fumarátok, fém-cianid-vegyületek és tetrahidropterin. Úgy találtuk, hogy bizonyos ko-faktorok segítik a reakció lefolyását és/vagy az enzim lebomlását, vagy inaktívvá válását késleltetik. Ilyen ko-faktorok - korlátozó jelleg nélkül - kataláz, etanol, káliumjodid és réz(II)-ionok. A találmány szerinti tisztított enzimkészítmények kellően mentesek az olyan fehérjebontó aktivitástól, amely lebonthatná akár az alfa-amidáló enzimet, akár pedig az alfa-amidálási reakció termékeit vagy reagenseit úgy, hogy az enzimkészítmények még akkor is tudják katalizálni az alfa-amidálási reakciót, ha a szubsztrátum és a termék L-aminosavakat tartalmaz. Az amidáló reakciókeverékben jelentkező fehérjebontó aktivitás nem tükrözi közvetlenül a proteáz koncentrációt. Az aktivitás még nagy proteáz koncentráció mellett is visszaszorítható, pl. különböző inhibitorok révén. A fehérjebontó aktivitás hiánya, amely az enzimkészítmény kereskedelmi és gyakorlati előnyeit fokozza L-aminosavakat tartalmazó szubsztrátumoknál való felhasználása esetén, semmiképpen sem csökkenti a készítmények előnyös tulajdonságait L-aminosavakat nem tartalmazó szubsztrátumoknál történő alkalmazásnál sem.

Amint az a következőkből majd kitűnik, a bejelentők számos specifikus, jelentős amidáló aktivitással rendelkező fehérjefajtát tisztítottak. „Alfa-amidáló aktivitás” alatt oly aktivitást értünk, amely arra irányul, hogy csak egy aminocsoportot hagyjon abban a pozícióban, amelyet előzetesen egy szubsztrátum peptidil vegyület C-terminálisú glicinje foglalt el. Ilyen helyettesítés magával hozhatja az összes aminocsoport hasítását, kivéve a glicinét, úgy hogy a korábban a teljes glicin-rész által elfoglalt helyen csupán egy aminocsoport marad. „Alfa-amidáló enzim” alatt olyan készítményt vagy vegyületet értünk, amely alfa-amidáló hatást fejt ki, valamint annak aktív homológjait és töredékeit.

A találmány szerinti tisztított enzimkészítmények addig tisztíthatok, amíg homogének nem lesznek. A „homogén” kifejezés oly enzimkészítményekre utal, amelyek nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélen történő elektroforézist követően egyetlen, jól definiált sávot mutatnak, és a szokásos szekvenálási módszerrel egyetlen aminosav-szekvencia adatot adnak.

Egyes, a jelen találmány szerint homogénné tisztított alfa-amidáló enzimek specifikus enzimaktivitása 1500 mU/mg fehérje fölötti értéket is adott.

A jelen találmány szerint készült enzimkészítmények hasznos alfa-amidált peptidil termékek előállításához használhatók fel oly módon, hogy az enzimkészítmények a termékek alfa-amidálását katalizálják. Oly szubsztrátumot veszünk, amely oly peptidil-vegyület, melyben legalább a peptidlánc C-terminálisán glicin-maradék van, aholis a C-terminális glicin aminocsoporttal való helyettesítése eredményezi a kívánt terméket. A szubsztrátumot, előnyösen oxigén és egy redukáló ágens jelenlétében, valamint a jelen találmány szerint készült enzimkészítmény jelenlétében oly idő4

HU 212 071 A9 tartamig reagáltatjuk, amely elegendő a peptidil-vegyiilet megfelelő' peptidil-amiddá történő átalakítására. Az átalakulás mindjárt a szubsztrátum és az enzim első érintkezésénél megkezdó'dik, de a reakciósebesség jelentősen változó a pH, a hőmérséklet, a szubsztrátum mibenléte, a kofaktorok koncentrációja és más paraméterek függvényében, mely utóbbiakat ismert módon állíthatjuk be a reakció optimalizálására. A reakció időtartamát általában a kívánt konverziós százalék (szubsztrátum - termék viszony) függvényében állítjuk be. Előnyös foganatosítást módok értelmében ko-faktorokat alkalmazunk, éspedig olyanokat, amelyekről már említés történt annak érdekében, hogy a reakció előrehaladását elősegítsük és/vagy, hogy az enzim aktivitását növeljük vagy fenntartsuk.

Számos hasznos termék, beleértve természetes hormonokat és hasonlókat, készülhet a jelen találmány szerint, melyeknél az alfa-amidálás célszerű vagy szükséges, glicinnel meghosszabbított peptidil-vegyületeknek alfa-amidáló enzim készítmények jelenlétében történő reagáltatásával. Ezek a termékek, amelyek pl. a mezőgazdaságban vagy oly betegségek kezelésére használhatók, amelyekre hormon-hiány jellemző, magukban foglalják, bár ezekre nincsenek korlátozva, a különböző kalcitoninokat, növekedési hormon felszabadító faktorokat, kalcitonin génhez kötött peptideket és hasonlókat. A fentebb említett hormonok, vagyis a kalcitonin, a növekedési hormon felszabadító faktorok, a kalcitonin génhez kötött peptidek, mint ez a szakértőit előtt ismert, tartalmaznak C-terminálisú amid fehérjefajtákat, amelyek az említett hormonok jellemző aktivitását mutatják. Például a kalcitonin magában foglalja mindazon fajtákat, amelyek a kalciumnak a csontba való felvételének szabályozására szolgálnak, ami jellemző az ismert kalcitoninokra. Különböző itt tárgyalt fehérjefajták homológjait a fajták definíciója magában foglalja és bármely, itt tárgyalandó nukleotidvagy aminosav-szekvenciák úgy értelmezendők, hogy azok a homológ szekvenciákat magukban foglalják azzal a kiegészítéssel, hogy a helyettesítések, hozzáadások vagy kihagyások nem érintik lényegesen a tárgyalandó szekvenciák funkcióit. Célszerűen a peptidekben lévő aminosavak legalább 40%-a, még inkább 50%-a megfelel az itt tárgyaltaknak. Ami a nukleotid szekvenciákat illeti, azok kódonjai természetesen helyettesíthetők egyenértékű kódonokkal, amelyek ugyanazon aminosavakat kódolnak.

A találmány szerinti enzimkészítmények azon képessége, hogy az alfa-amidálási reakció katalizálását még L-aminosavakat tartalmazó szubsztrátumokon is el tudják végezni, lehetővé teszi ezen termékek hatékony és gazdaságos előállítását természetes forrásokból tisztított vagy rekombináns DNS-technikával készített szubsztrátumok felhasználásával.

Egyes eló'nyös foganatosítást módok szerint, az alfa-amidálási reakció megkönnyíthető' az enzimek oly szilárd hordozón való immobilizálásával, amely vizes közegben oldhatatlan és a rekació körülményei között lebomlásnak ellenálló, és ellenáll a rögzített enzim fölötti szubsztrátum-áramlásnak, előnyösen megfelelő ko-faktorok jelenlétében. Az „immobilizálás” kifejezés azt jelenti, hogy az enzimet egy hordozóhoz kötjük. Az e célra alkalmazható hordozók - korlátozó jelleg nélkül - például szabályozott pórusú üveg vagy egy aktivált abszorbens, mint pl. brómciánnal aktivált Sepharose. Az ily módon immobilizált enzimek ismét felhasználhatók a reakciókeveréknek a szilárd hordozóról való eltávolítása után, minthogy az megtartja az enzimet a későbbi felhasználáshoz.

Bejelentők felismerték, hogy a találmány szerinti enzimkészítmények számos módszerrel nyerhetők és tisztíthatók. Úgy találták, hogy a nyers alfa-amidáló enzim forrásaként különösen eló'nyös a pajzsmirigy veló'állományának rákos szövete főképp patkányokból nyerve, annak sejtvonalai és/vagy ezen sejtvonalakból származó sejttenyészetek. A nyers alfa-amidáló enzim tisztítása úgy történhet, hogy azt mind kiszorításos, mind pedig anioncserélő, célszerűen erős anioncserélő kromatográfiának vetjük alá. „Erős” anioncserélő kromatográfia alatt olyat értünk, melyet olyan gyantán végzünk, amely a pH 2-12 tartományban állandó pozitív töltést tart fenn. Egyes eló'nyös foganatosítást módok értelmében a kiszorításos kromatográfia megelőzi az erős anioncserélő kromatográfiát, sőt még a kiszorításos kromatográfiai lépést is megelőzheti egy másik anioncserélő' kromatográfiai lépés. Az elsó' lépés után pedig kívánatos lehet egy másik erős anioncserélő kromatográfiai lépés, továbbmenó'en az egyik eló'nyös foganatosítást mód szerint vagy az első vagy a második erős anioncserélő kromatográfiai lépés közül az egyiket bázikus pH mellett végezzük, míg a másikat savas pH tartományban vezetjük.

Oly enzimfajtákat használva, amelyek a jelen találmány értelmében alapjában véve homogénné lettek tisztítva, az enzimre specifikus monoklonális és poliklonális antitestek készültek a tisztított enzimet antigénként felhasználva egerekben, illetve csirkékben való immunreakció kiváltása céljából. Bármely fajtából ily módon származtatott antitestek tisztíthatók és szilárd hordozón rögzíthetó'k az enzimre specifikus immunoaffinitásos oszlopok készítése céljából. Ilyen oszlopok a nyers enzimanyag tisztítására alkalmazhatók, ami az enzimaktivitás és újrafelhasználhatóság növekedéséhez vezet.

A jelen találmány szerinti tisztított enzimet annak tripszines töredékeivel együtt ismert módszerekkel szekventáltuk és a szekvencia adatokat oligonukleotid minták készítésére használtuk. Az ily módon készített jelzett oligonukleotid minták felhasználásával bejelentők egy, az alfa-amidáló enzimet kódoló gént különítettek el abból a cDNS könyvtárból, amelyet patkány velős pajzsmirigy rákos szövetekből nyert poliA RNSból szintetizáltak.

A gén, amely részletesebben a jelen leírás adatokkal ismertetett részeiben kerül jellemzésre, egy megfelelő' expressziós vektorba beépíthető' és bármilyen, a gén expressziójára alkalmas gazdasejtbe bevihető. Megfelelő gazdasejtek, beleértve de nem ezekre korlátozva, az E. coli, élesztő törzsek, mint például az S. cerevisiae, vagy magasabb rendű eukariota sejtek, mint

HU 212 071 A9 pl. az a sejtvonal, amelyből az enzimet eredetileg tisztították.

A tömegtermelés, várhatóan az alfa-amidáló enzimet nagy mennyiségben expresszáló, a fentiek szerint genetikailag előállított valamely mikroorganizmussal képzelhető el.

Az enzimek természetes forrásokból történő tömegtermelése lehetséges oly tisztítási módszerekkel, amelyek mind a kiszorításos, mind pedig az anioncserélő kromatográfiát magukban foglalják, melynek során az anioncserélő kromatográfiás oszlopban visszamaradt enzimfajtákat 250 mM fölötti, célszerűen 350 mM-t vagy 500 mM-t elérő koncentrációjú sóoldatok segítségével aluáljuk. Magas sókoncentrációknál a legtöbb visszamaradt enzimfajta eluálásra kerül. A kiszorításos kromatográfia szolgál az 58 000 és 67 000 dalton közötti látszólagos molekulatömegű fajták elválasztására. A tisztított készítmény alkalmas természetes forrásokból tisztított vagy rekombináns DNS-technikával előállított peptidil vegyületek, azaz L-aminosavakat tartalmazó peptidek amidálására.

AZ ÁBRÁK RÖVID ISMERTETÉSE Az I-V.

ábrák az 1. példára vonatkoznak, és ott kerülnek ismertetésre.

AVI-XII.

ábrák a 2. példára vonatkoznak, és ott kerülnek ismertetésre.

A XIIIXVI. ábrák a 3. példára vonatkoznak és ott kerülnek ismertetésre.

A XVIIXXI. ábrák a 4. példára vonatkoznak és ott kerülnek ismertetésre.

A XXII.

ábra a 10. példára vonatkozik és ott kerül ismertetésre.

A XXIII.

ábra a 6. példára vonatkozik és ott kerül ismertetésre.

NÉHÁNY ELŐNYÖS KIVITELI PÉLDA RÉSZLETESISMERTETÉSE

Felismertük, hogy homogén alfa-amidáló enzim többlépcsős művelettel nyerhető, szilárd daganatszövet-kivonatokból, daganatsejtvonalakból és az ilyen sejtvonalakból származó szövettenyészetekbóT, kiszorításos és ioncserélős kromatográfia kombinációját alkalmazva.

Az enzimet patkány velős pajzsmirigy rákszövetekbol („MTCs”) vontuk ki, amelyek WAG/Rij Wistar patkányokban kerültek kifejlesztésre, amint azt Roos, B. A. és mtsai. Endocrinology, 1979., 150/1, 27-32. leírják. Ez a szövet IVI 10028 (ATCC 75168) sz. alatt került letétre. Az enzimet más forrásokból is kivontuk, nevezetesen emberi és patkány velős pajzsmirigy rákos sejtvonalakból. A patkány sejtvonal („CA-77”) patkány velős pajzsmirigy rákos daganatokból sorozatos passzállással került kinyerésre, amint azt Muszynski, M. és mtsai., JBC 1983., 258. kötet 11678-83. oldalain leírják. Ez a sejtvonal IVI 10029 (ATCC CRL 10.919) sz. alatt került letétre. A humán sejtvonalat („HTT 54(34)”) B. A. Roos fejlesztette ki a VAMedical Centerben, Cleveland Ohioban, az elsődleges tenyészethez humán velős pajzsmirigy rákos sejteket használva. Ezen emberi HTT 54(34) sejtvonal IVI 10031 (ATCC CRL 10918) sz. alatt került letétre, (ld.: „A szabadalmaztatást eljárások céljaira a mikroorganizmus letétek elismerése”, amely ezen letétekről bizonyításul szolgál és a „Budapesti jegyzőkönyv” 34. sz. 1983. november

3. megállapodásokat, melyekre a jelen bejelentés keretében hivatkozhatunk.)

Kimutattuk, hogy meghatározott, humán- és patkány sejtvonalakból származó szövettenyészetek tápközege jelentős szintű alfa-amidáló aktivitást tartalmaz, jelezve, hogy az enzim egy része a sejtekből választódik ki. Az enzimet úgy nyerhetjük ki és tisztíthatjuk, hogy a nyersanyagot (amely elhasznált tápközegeket, enzimet és szennyezéseket tartalmaz) célszerűen, először anioncserélő kromatográfiának vetjük alá. A mintát, pl. teljes tömegében betápláljuk egy preparatív léptékű anioncserélőre, mint pl. egy dietil-amino-etil („DEAE”) töltetre, mint amilyen pl. a CUNO Corp.-tól beszerezhető, CUNO 250.

A töltetről eluált, alfa-amidáló aktivitást tartalmazó készítményt azután, alkalmas elválasztóképességű gyantán, például a Pharmacia Fine Chemicals-tól beszerezhető Sephacryl S-2000, különlegesen finom oszlopon, kiszorításos kromatográfiának vetjük alá.

Az enzimaktivitást tartalmazó eluált frakciót ezután, erős anioncserélő töltetet használva, ioncserélő kromatográfiának vetjük alá, alkalmazható gyanta, például a Pharmacia Fine Chemicals cégtől beszerezhető Mono Q HR5/5 jelű erős anioncserélő gyanta, és az enzim homogén tisztítása céljából az oszlopon való egyszeri vagy többszöri áteresztés lehet szükséges. A Mono Q HR5/5 oszlop szemcsenagysága 10 μιη. pórus térfogata 40%, és olyan gél, melynek töltéssel rendelkező csoportja CH₂-N⁺-(CH₃)₃, ionkapacitása pedig 0,28 és 0,38 mmól/ml közötti.

Mindegyik tisztítási lépcső ellenőrizhető mind fehérje tartalomra, mind pedig az alfa-amidáló aktivitás szintjére nézve. Ez az információ alkalmas az enzim specifikus aktivitásának kiszámítására, amely az enzim viszonylagos tisztaságánakjellemzésére szolgál.

A jelen találmány szerint tisztított peptidil-glicin alfa-amidáló monooxigenáz [a patkányból származó enzim letéti száma IVI 10032 (ATCC 75145), az emberből származó enzim letéti száma IVI 10033 (ATCC 75146)] molekulatömege, gélszűréssel meghatározva, mintegy 60 000 és 65 000 dalton közötti.

Az enzim olyan mértékben lett tisztítva, hogy specifikus enzimaktivitása legalább mintegy 25 mU/mg fehérje, előnyösen azonban legalább mintegy 50 mU/mg fehérjét meghaladó mértékű aktivitást mutat. Az alfa-amidáló enzimet olyan mértékben is megtisztítottuk, hogy nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gé6

HU 212 071 A9 leken (SDS-PAGE) történő elektroforézist követően egyetlen, homogén, jól definiált, éles sávot mutatott.

A tisztított peptidi-glicin alfa-amidáló monooxigenázt terminális glicin-maradékkal rendelkező polipeptid alfa-karboxil-csoportjának amidálására alkalmaztuk, amelynek során a glicin aminocsoport donorként szerepelt. Apeptid vagy polipeptid szubsztrátumot tisztíthatjuk természetes forrásokból, szintetizálhatjuk az alkotó aminosavakból, vagy nyerhetjük rekombináns DNS-technikával. A glicin-termináhs polipeptid az enzim hatásos mennyisége jelenlétében oxigénnel reagál. A szükséges enzimmennyiség számos változótól függ, amelyek e szakterületen ismertek, így különösen, de nem ezekre korlátozottan, a következőktől: egy adott enzimkészítmény specifikus aktivitása, az átalakítandó szubsztrátum mennyisége és kémiai jellemzői, a konverzió előirányzott időtartama, a reakciókeverék hőmérséklete és pH-ja. Az e területen szakértők azonban más változókat is ismernek, amelyek befolyásolhatják az enzim pontosan szükséges mennyiségét egy adott esetben. Az oxigén általában a szubsztrátum-koncentrációhoz viszonyítva moláris feleslegben van jelen a reakcióban. A kívánatos rézion-koncentráció bármely olyan rézsóval biztosítható, melynek anionja nem befolyásolja hátrányosan a reakciót. Olyan enzim esetén, melynek specifikus enzimatikus aktivitása csupán mintegy 1 mU/mg fehérje, maximális alfa-amidálás viszonylag magas, mintegy 4 μΜ-os réz(II)ion koncentráció mellett érhető el. Az enzim tisztaságának növelése esetén a beadott réz(II)ion koncentrációját csökkenteni lehet. Az enzimaktivitás aszkorbát ionok jelenlétével is növelhető, ami bármely aszkorbinsavsóval biztosítható mindaddig, amíg ezen sók kationja nem befolyásolja hátrányosan a reakciót. Tisztított enzimek esetében, amelyek specifikus enzimaktivitása mintegy 50 mU/mg fehérje, maximális alfa-amidálási aktivitás mintegy 5 mM aszkorbát esetében jelentkezik. Az alfa-amidálási aktivitást kataláz adagolásával növelhetjük. A biológiailag megfelelő szubsztrátum amidált termékké való átalakításának optimális pH-ja 6,5 és 7,5 között van.

Az enzimre specifikus monoklonális és poliklonális antitesteket úgy nyertünk, hogy homogén enzimet használtunk antigénként, hogy az egerekben, illetve csirkékben immun választ váltson ki. Bejelentők mind monoklonális, mind pedig poliklonális antitesteket előállítottak és tisztítottak, amint az a 8. példából kitűnik. Az alfa-amidáló enzimre specifikus antitestek gyűjteményét a bejelentő laboratóriumaiban őrzik.

Az antitestek oly szilárd ágyon rögzíthetők, amely nem oldható azon közegben, amelyben felhasználásra kerül. Célszerűen az ágy mechanikailag ellenálló legyen. A mátrixot a fehérjéket megkötni tudó funkciós csoporttal látjuk el, míg a funkciós csoportok azután kovalensen kötődnek az antitestekhez. Az antitestek ilyen immobibzálása megkönnyíti az alfa-amidáló enzimek elkülönítését a természetes és/vagy a rekombináns forrásoktól. Ezt a rögzített antitesteknek a nyers enzim preparátumaival való keverése révén valósítjuk meg. Az antitestek specifikusan megkötik az alfa-amidáló enzim molekulákat. A szennyező fehérjék nem kötődnek az antitestekhez és eluálással vagy kíméletes centrifugálással könnyen eltávolíthatók. A szennyezések eltávolítása után az alfa-amidáló enzim az immobilizált antitestekről az ionerősség vagy a pH változtatásával vagy kaotróp ionok adagolásával (Affinity Chromatography: Principles and Methods, Manual, Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Svédország) eltávolítható és nagytisztaságú formában kinyerhető.

A kellően megtisztított enzim lehetőséget jelent, hogy az aminosav-szekvenciája meghatározható legyen. Ezt az információt az enzim nukleinsav kódjának meghatározására használták fel.

Az ezt követő bevitel egy megfelelő egysejtű szervezetbe vagy egy többsejtű szervezetből izolált gazdasejtbe standard rekombináns DNS módszerekkel történik, mint amilyen található Maniatis és társai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982., vagy Wu, R., ed., Methods in Enzymology, 68. kötet, Academic Press, 1979. idézett publikációban. Az ily módon létrejövő sejtek, amelyek az alfa-amidáló enzim heterológ DNS kódját tartalmazzák, lehetővé teszik az enzim kellő mennyiségben való termelését a célból, hogy in vitro transzláció utáni alfa-amidálást lehessen végezni és elméletileg azt is lehetővé teszik, hogy e sejtek a peptidek vagy polipeptidek ezen módosítását in vivő végezzék.

Ámbár a jelen találmány leírása a célszerű kiviteli, illetve foganatosítási módokkal összhangban történt, szakember számára nyilvánvaló, hogy számos változat és módosítás lehetséges. A találmány előnyös megvalósítását mutatjuk be a következő példákkal.

1. példa

Eljárás alfa-amidáló enzim preparátumok tisztítására MTC (medullary thyroid carcinoma) daganatokból

Fagyasztott patkány MTC daganatokat kis részekre porítottunk és azt homogenizáltuk 150 mM 7,5 pH-jú Tris-ben, amely 250 mM szacharózt 0,25% N-acetilglukopiranozidot, 0,1 mM PMSF-t, (fenil-metilszolfanil-fluorid) 20 pg/inl pepsztatint és 100 pg/inl szójabab tripszin inhibitort tartalmazott. Mintaként 25 g daganatszövetet homogenizáltunk a fenti pufferoldat 200 ml-ében, jégen. E homogenizálást egy Politron homogenizálóval (Brinkman) végeztük 7-es beállítás mellett négy, egyenként 20 másodperces kezelést alkalmazva. A homogenizátumot 15 percig centrifugáltuk 9000 x g-n, egy JA 20 jelű rotorban (Beckman), és a felülúszót (Fu.l) dekantáltuk. A lepényt újra homogenizáltuk a homogenizáló pufferoldat 60 ml-ében, 7-es beállításnál három, egyenként 20 másodperces kezeléssel. E második homogenizátumot hasonlóképpen, 15 percig centrifugáltuk, 9000 x g-n. Az ebből a centrifugálásból származó felülúszót (Fu.2) az Fu.l-gyel egyesítettük. Az egyesített Fu.l és Fu.2-t azután 30 percig centrifugáltuk, 100 000 x g-n, 4 C°-on, egy SW28 jelű rotorban (Beckman). A tisztított homogenizátumhoz (Fu.3) annyi ammónium-szulfát-kristályt adagoltunk, hogy az oldat ammónium-szulfát tartalma 25% legyen. A kris7

HU 212 071 A9 tályok adagolása fokozatosan történt a homogenizátum állandó keverése közben, 15 perc alatt, 4 °C-on. 4 C°-on történő' további 30 perces keverés után a keveréket 15 percig centrifugáltuk, ugyancsak 4 °C-on, 27 000 x g-vel egy JA-20 jelű rotorban (Beckman). A felülúszót dekantáltuk és további ammónium-szulfátot adagoltunk hozzá úgy, hogy az oldat ammónium-szulfát tartalma 40% legyen. Újabb 30 perces keverés után a keveréket ismét 15 percig centrifugáltuk mint az előbb 27 000 x g-n. Az ebből a centrifugálásból származó felülúszót eldobtuk és a lepényt, amely homogenizátumban levő teljes enzimaktivitás legalább 50%-át tartalmazta, újra szuszpendáltuk 7,0 pH-jú 50 mM-os Tris HCl-ben, hogy ez képezze a Mintát. Az aktivitás

8.2 mU/mg fehérje volt.

Sepharcyl S-300-as gélszűrés

Kiszorításos kromatográfia

Sepharcyl S-300-at (Pharmacia) egyensúlyba hoztunk 7,0-es pH-jú 50 mM Tris HCl-ben és a gyártó cég utasításainak megfelelően egy K 50/100-as oszlopba (Pharmacia) öntöttük. Az oszlop ágytérfogata mintegy

1.3 liter volt. A mintát az oszlopra öntöttük, az oszlopágytérfogata mintegy 3%-ának megfelelő térfogatban. Fehérjéket eluáltunk az oszlopból, 50 mM-es 7,0 pH-jú Tris HCl-ben, percenként mintegy 2 ml-es átfolyási sebességgel. 10 ml-es frakciókat gyűjtöttünk és azok alfa-amidáló enzimaktivitását vizsgáltuk Danzil-DTyr-Val-Gly szubsztrátummal. Az oszlopról az enzim egyetlen aktivitáscsúcsban eluálódott, 60 000-65 000 daltonos molekulatömeggel, amint ezt az I. ábra mutatja. Az aktivitás legalább 50 mU/mg fehérje volt.

Mono Q kromatográfia 6,0 pH-nál

Erős anioncserélő kromatográfia

A Sephacryl S-300-as oszlopból származó, a legtöbb enzimaktivitást mutató frakciókat egyesítettük, és 4 liter 20 mM-os, 6,0 pH-jú bis-Tris (bis-(2-hidroximetil)-amino-tris-(hidroximetil)-metán) pufferoldattal dializáltuk.

Az egyesített anyagot azután egy Mono Q HR 5/5 oszlopra (Pharmacia) vittük, amelyet előzetesen a gyártó cég utasításainak megfelelően előkezeltünk és 20 mM 6,0 pH-s bis-Tris-szel kiegyenlítettünk. Ezután az oszlophoz nem kötődött fehérjéket az oszlop eluátumában összegyűjtöttük, a megkötődött fehérjéket pedig 0-300 mM NaCl tartalmú 20 mM 6,0 pH-jú bis-Tris lineáris grádienselúcióval eluáltuk. Az oszlopot 0,5 ml percenkénti átfolyási sebességgel működtettük és egyenként 2 ml-es frakciókat gyűjtöttünk. A Mono Q oszlopból 6,0 pH-nál eluálódó fehérjeoldatokat azonnal semlegesítettük, egyenként 200 μΐ, 7,0 pH-jú 1,0 M Tris tartalmú csövekbe gyűjtve. A frakciókat alfa-amidáló enzimaktivitásra vizsgáltuk, mint az előzőekben, és az aktivitás csúcsát, az oszlopból mintegy 160 mM NaCl-nál eluálódott frakciónál találtuk (II. ábra). Az aktivitás 161 mU/mg fehérje volt.

Mono Q kromatográfia 8,0 pH-nál

Azokat a 6,0 pH melletti Mono Q kromatográfiából származó frakciókat, amelyek alfa-amidáló enzim aktivitási csúcsokat mutattak, két adag, egyenként 4 liternyi 50 mM 8,0 pH-jú Tris HCl-el dializáltuk. Az enzimet azután 50 mM 8,0 pH-jú Tris HCl-el kiegyenlített Mono Q HR 5/5 oszlopra (Pharmacia) vittük. A fehérjéket 0-300 mM NaCl tartalmú 50 mM 8,0 pH-jú Tris HCl-es sógradienssel eluáltuk. Percenként 0,5 ml-es átfolyási sebességet alkalmaztunk és 2 ml-es frakciókat gyűjtöttünk. Mindegyik frakciót a gyűjtőcsövek mindegyikébe tett 200 μΐ 1,0 M 7,0 pH-jú Tris hozzáadásával semlegesítettük. Két különböző enzimaktivitási csúcs jelentkezett, 190 mM NaCl-nél, illetve 220 mM NaCl-nél eluálódva (III. ábra). Az aktivitásértékek legalább 80 mU/mg fehérje és 400 mU/mg fehérje voltak.

A 8,0 pH érték melletti Mono Q kromatográfiából származó enzim csúcs frakciók gélelektroforézise A 220 mM NaCl-nál eluáló és 408 mU/mg fehérjeaktivitással rendelkező enzim csúcs frakció alikvot részét egy 10%-os SDS-poliakrilamid gélre vittük egy SDS-t és B-merkaptoetanolt tartalmazó pufferoldatban való hődenaturálás után (IV. ábra). Egyetlen sávot észleltünk a 220 mM NaCl-nál eluáló frakciónál. Ezen sáv látszólagos molekulatömege mintegy 73 000-75 000 dalton.

A 73 000-75 000 daltonos sáv alfa-amidáló enzimkénti azonosságának igazolása

További alfa-amidáló enzim preparátumokból, amelyek tisztítása a korábbiaknak megfelelő kritériumok mellett történt, alikvot részt használtunk nem denaturáló 10%-os akrilamid gélen való elektroforézishez. A két sáv mindegyikére 50 μΐ alikvot részt töltöttünk. Elektroforézis után a sávok egyikén a fehérjét ezüstfestéses technikával láthatóvá tettük. A második sávból egyenként 3 mm-es csíkokat vágtunk és ezek mindegyikét egy mikrotiter lap üregében inkubáltuk. Mindegyik üregbe 100 μΐ keveréket adagoltunk, amely Danzil szubsztrátumot, katalázt, aszkorbinsavat és 150 mM 7,0 pH-jú Tris-t tartalmazott. Az inkubálás 15 óra hosszat tartott 37 °C-on, állandó rázás mellett. Ezután valamennyi üregből kivett alikvotban vizsgáltuk a szubsztrátból amidált termékké történt konverziót. Két géldarabnál észleltünk enzimes aktivitást. Az aktivitás együtt vándorolt egy intenzíven festett fehérje sávval a megfelelő festett gélpályán (V. ábra).

2. példa

Eljárások rekombináns humán kalcitonin előállítására

A humán kalcitonin 32 aminosavból álló peptid hormon, melynek karboxil terminálisán amidált prolilmaradék van. Egy mikroorganizmust genetikailag kezeltünk, hogy oly rekombináns fúziós fehérjét termeljen, amely tartalmazza a humán kalcitoninnak megfelelő aminosav-szekvenciát. A fúziós fehérje gén úgy került megtervezésre, hogy a humán kalcitonin-szekvenciát annak amino terminálisán egy arginil-maradék és karboxil terminálisán egy glicil-maradék zárja közbe, amely a rekombináns fúziós fehérjét is terminálja (ld.

HU 212 071 A9

VII. ábra). A humán kalcitonin génnek a megfelelő fúziós plazmid képzése céljából egy plazmidba való bevitel után, ezen plazmid segítségével egy mikroorganizmus került átalakításra és így a fúzió expresszióját nyertük (ld. VI. ábra). Ezt a humán kalcitonin-tartalmú fehérjét a rekombináns mikroorganizmus sejtbomlás termékeitől kicsapással különítettük el. A ciszteinilmaradékokat ezt követően S-szulfonátokká alakítottuk át, a lizil-maradékokat pedig citrakonsav (metil-maleinsav) anhidriddel reagáltatva reverzibilisen blokkoltuk. Minthogy a humán kalcitonin nem tartalmaz arginint, a rekombináns fúziós fehérje tripszines kezelése olyan peptidet hozott létre, amely a humán kalcitoninszekvenciát karboxil-terminális glicin végcsoporttal tartalmazta. Ezt a peptidet vagy fordított fázisú HPLCvel különítettük el (ld. VIII. ábra), vagy pedig ioncserélő kromatográfiával, és szerkezetét aminosav- és mikroszekvenálásos elemzéssel állapítottuk meg.

A peptid glicil-maradékát eltávolítottuk és az utolsó előtti profil-maradékot a jelen találmány szerinti alfa-amidáló enzimkészítmény segítségével prolinamiddá alakítottuk át. Ezen peptiden alkalmazott félpreparatív léptékű alfa-amidálásnál alkalmazott körülményekre példa a következő: A liofilizált peptidet (200-300 nanomól) (szubsztrátum) 200 μΐ olyan 7 pH-jú 150 mM Tris-HCl pufferoldatban oldottuk fel, amely mintegy 750 pl! alfa-amidáló enzimkészítményt tartalmazott. Az enzimet vagy patkány MTC szövetbóT, vagy patkány MTC CA-77 sejtvonalból származó használt szövettenyészet tápközegéból nyertük. Az enzimet olyan mértékig tisztítottuk, hogy abból minden fehérjebontó aktivitást eltávolítottunk. Ezt az ioncseréléses és kiszorításos kromatográfia kombinációjával értük el (ld. a korábban leírt eljárást). Tiszta, homogén enzim azonban nem feltétel. Ezt követően aszkorbinsavat és rézszulfátot adagoltunk e keverékhez oly mennyiségben, hogy azok végső koncentrációja mintegy 3 mM, és 2 μΜ legyen. A kapott oldatot kevertük és 37 °C-on 5-6 óráig inkubáltuk. A szubsztrátum termékké való átalakítására jellemző konverzió értéke 70-90%. Az S-szulfonátcsoport eltávolítása után a rekombináns humán kalcitonint (rhCT) fordított fázisú HPLC segítségével tisztítottuk (ld. IX. ábra). A végső terméket a fordított fázisú HPLC-n észlelt retenciójával (ld. X. ábra), kvantitatív tripszines feltérképezéssel (ld. XI. ábra), aminosav elemzéssel (ld. I. táblázat) és a biológiai aktivitásával (ld. XII. ábra) jellemeztük. A rekombináns humán kalcitonin minden esetben megkülönböztethetetlen volt a szintetikus humán kalcitonintól.

Az elmondottak azt mutatják, hogy a találmány szerinti készítmények alkalmasak fiziológiailag fontos szubsztrátumok amidálására, így pl. rekombináns DNS-technikával előállított, azaz csak L-amino-savakat tartalmazó humán kalcitonin előállítására.

Összehasonlító példák

Az igényelt készítmények aktivitásának összehasonlítása a technika állásával

Az igényelt készítmények specifikus aktivitásának meghatározására szolgáló vizsgálati módszerek összehasonlítása

Korábban számos aktivitás-vizsgálati módszert alkalmaztak. A legtöbb, a technika ismertetése során említett műben, a vizsgálat a D-Tyr-Val-Gly-nek D-TyrVal-amiddá való átalakításán alapult. E vizsgálatok kvantifikálása radioaktivitással jelzett anyag (¹²⁵I-DTyr-Val-Gly) segítségével történt, amelyet a fölöslegben lévő, nem jelzett anyaghoz (D-Tyr-Val-Gly) kevertek. Ajelzett anyag konverziójának mérése lehetővé teszi a nem jelzett anyagra vonatkozó extrapolálást, és így az aktivitás kiszámítása lehetséges.

Noha a bejelentőit ezt a vizsgálatot használták, az igényelt készítmények aktivitásának meghatározása a Danzil-Tyr-Val-Gly-nek Danzil-Tyr-Val-amiddá való alakulásának közvetlen mérésén alapul.

A technika állása szerinti készítmények a jelen találmány szerinti készítmények specifikus aktivitásának ésszerű összehasonlítása érdekében a vizsgálati rendszerek összehasonlítására kísérletek történtek.

E kísérleti eredmények a következők:

I. Monodanzil-L-Tyr-Val-Gly

Ezekben a kísérletekben alfa-amidáló enzimkészítményeket izoláltunk enzimforrásként patkány velős pajzsmirigy rákos daganataiból és a CA-77 sejtek gyűjtött szövettenyészeteibóT. Az enzimkoncentrációt valamennyi kísérletben állandó értéken tartottuk, kivéve ahol másra utalás történik.

A monodanzil szubsztrátum átalakítására szolgáló reakciókeverék a következó'ket tartalmazta:

μΐ enzim μΐ 30 mM szkorbát μΐ 20 μΜ CuSO₄ μΐ 100 μg/ml-es marha hasnyálmirigy kataláz μΐ-ben a szubsztrát 2 nmól-ját μΐ 150 mM 7,0 pH-jú TES puffer ZN-tris (hidroximetil)metil-2-amino-etánszulfonsav/

A mintákat két párhuzamosban készítettük el és 37 °C-on inkubáltuk 10, 20 és 30 perc időtartamig. Az enzimreakciót 10 μΐ 500 mM EDTA hozzáadásával állítottuk meg. A szubsztrátumot és a terméket RP (reverz fázisú) HPLC segítségével különítettük el egy Hewlett Packard-1090 folyadékkromatográfiás rendszerrel, a számszerű értékelés pedig ΗΡ-3392-es integrátor segítségével történt.

A monodanzil L-Tyr-Val-Gly-nek alfa-amidált termékké való átalakulása az idővel arányosnak bizonyult.

II. ^,25I-D-Tyr-Val-Gly

D-Tyr-Val-Gly-t és D-Tyr-Val-NH₂-t Pierce Chemical Company jódágyai segítségével jódoztunk. A szulfil-propil kationcserélő oszlop kalibrálásához radioaktivitással jelzett szubsztrátumot és terméket alkalmaztunk. 650 μΜ D-Tyr-Val-Gly-hez ¹²⁵I-D-Tyr-Val-Gly-t adagoltunk és ezt használtuk szubsztrátumként. A monodanzil szubsztrátum átalakítására szolgáló reakciókeverék a következőket tartalmazta:

μΐ enzim

HU 212 071 A9 μΐ aszkorbát (30 mM) μΐ 100 μg/ml ka taláz μΐ 20 μΜ CuSO₄ μΐ szubsztrátum, 650 μΜ végső koncenttációban μΐ 150 mM pH 7,0 TES

A mintákat 37 C°-on 10, 20, 30 percen át inkubáltuk. A reakciót 500 mM EDTA hozzáadásával állítottuk meg. A teljes mintát 10 mM 5,2 pH-jú nátriumfoszfát pufferoldattal hígítottuk és egy szulfil-propil kationcserélő oszlopra vittük. A szubsztrátum nem köt az oszlophoz, az amidált terméket 500 mM NaCl-dal eluáltuk. A radioaktivitással jelzett szubsztrátum konverziója a termékké, az idő függvényében lineáris volt.

III. D-Tyr-Val-Gly

A D-Tyr-Val-Gly amidálásának reakciókörülményei azonosok voltak a danzil és jódozott szubsztrátumnál leírtakkal. A reakciókeverékben a szubszüátum-koncentráció 650 μΜ volt. A szubsztrátum és a termék szétválasztása RP-HPLC-n való gradiens elúcióval történt, egy HP-1090 kromatográfiai rendszer használatával. Az oszlopból kifolyó eluátumot 280 nmnél mérték. A mérés érzékenységi szintje sokkal alacsonyabb, mint akár a danzil-, akár pedig a jódozott szubsztrátumoké. Az alacsonyabb érzékenységi szinthez alkalmazkodva az alfa-amidálási reakciókat hoszszabb ideig végeztük és/vagy megnövelt mennyiségű alfa-amidáló enzimmel.

A ¹²⁵I-D-Tyr-Val-Gly-nek ¹²⁵I-D-Tyr-Val-amiddá és a danzil-Tyr-Val-Gly-nek danzil-Tyr-Val-amiddá való frakcionált konverziója adatainak vizsgálata azt mutatja, hogy minden időpontban mintegy 1,55-ször anynyi jódozott szubsztrátum alakult át, mint danzil szubsztrátum. Ily módon a bejelentő által alkalmazott vizsgálati rendszert, a technika állása szerintiekkel összehasonlítva, a danzil-szubsztrátumos módszer (a bejelentőé) által meghatározott aktivitás mintegy 1,5szörös konverziós faktora állapítható meg.

Ezen túlmenően valamelyest szigorúbb kinetikus analízist is alkalmaztunk a danzil-Tyr-Val-Gly vizsgálat (bejelentőé) és a D-Tyr-Val-Gly vizsgálat (ismert) összehasonlítására. Ez a következőket mutatta:

Szubsztrátum	Km	Vmax
D-Tyr-Val-Gly (ismert)	37	31
Danzil-Tyr-ValGly (bejelentőé)	1,7	21

Amint azt a két szubsztrátumra vonatkozó maximális sebesség (Vmax = pmol termék/perc/μΐ) összehasonlítása mutatja, a D-Tyr-Val-Gly (ismert) 1,48-szor akkora aktivitást ad, mint a danzil-Tyr-Val-Gly (bejelentőé). Ez egyező és megerősíti a korábbiakban megadott adatokat.

Az aktivitás összehasonlítása

Eipper és mtsai. (PNAS) az 5147. oldalon, a 4. ábrában 39 pikomól/mikrogramm/óra Vmax értéket tesznek közzé. Ez 0,65 mU/mg fehérje/perc specifikus aktivitásnak felel meg. Ez a legmagasabb aktivitás, ami bármely, a technika állásánál hivatkozott cikkben szerepel. Ez az előbb leírt 1,5-szörös konverziós faktorral elosztva 0,4 mU/mg fehérje/perc specifikus aktivitási érték adódik. Ezt az értéket lehet most már közvetlenül összehasonlítani a bejelentők által elért, korábban ismertetett aktivitással. Bejelentők. mint ezt korábban említettük, legalább 25 mU/mg fehérje és 1500 mU/mg fehérjét meghaladó aktivitási értéket értek el. Ilyen formán bejelentők az Eipper által publikált (PNAS) aktivitás 50-szeresétöl 3750-szeresét is meghaladó aktivitást értek el.

3. példa

A patkány MTC daganatokból származó alfa-amidáló enzimek tisztítása és jellemzése Fagyasztott patkány MTC szöveteket kis részekre aprítottunk és azokat Polytron homogenizálóval vizes TES-pufferoldatban homogenizáltunk. Kissebességű centrifugálást követően a felülúszót megtartottuk és a lepényt friss pufferoldattal újra extraháltuk. E második homogenizátumot ismét kis sebességű centrifugálásnak vetettük alá és ennek felülúszóját az előbbivel egyesítettük. Az egyesített két felülúszót azután nagysebességű centrifugálással tisztítottuk és az így kapott felülúszót használtuk az enzimtisztítás kiindulási anyagául.

A nagysebességű centrifugálással nyert felülúszót ammónium-szulfátos frakcionálásnak vetettük alá. Úgy találtuk, hogy az enzimaktivitás nagy része a 26^10% ammónium-szulfátos frakcióban csapódott le és ezen frakcióból származó lepényt tisztítottuk az alábbiak szerint tovább.

Kiszorításos kromatográfiát alkalmaztunk egy Sephacryl S-300-as oszlopon. A már ismertetett 1. példa szerint ebből az oszlopból az összes enzim egyetlen aktivitási csúcsban eluálódott. A jelen példa esetében az oszlop hosszát megnöveltük, az oszlop átfolyási sebességét pedig csökkentettük. Ezen új eluálási feltételek mellett egy nagyobb aktivitási csúcs mutatkozott, mint az 1. példában, amelyet egy kisebb elhúzódó csúcs követett, amely az enzim alacsonyabb molekulasúlyú alakjának felelhet meg. Jelenleg még nem világos, hogy létezik-e in vivő az enzim ilyen alacsonyabb molekulasúlyú formája, vagy az exttakció és a tisztítási művelet során alkalmazott részleges proteolitikus kezelés következménye.

Az S-300-as oszlopból származó nagyobb aktivitási csúcsot összegyűjtöttük és egy Mono Q oszlopon 6,0 pHnál kromatografáltuk. E példában az 1. példához képest egy nagyobb preparatív méretű oszlopot használtunk (a Mono Q HR 10/10-et), amelyet kevésbé meredek lineáris sógrádienssel eluáltunk. Ezen változtatások eredményeként, ezen szakaszban négy alfa-amidáló enzim aktivitás csúcsot találtunk, amelyek 160 mM, 200 mM, 220 mM és 240 mM NaCl-nél eluálódtak. (I, II, III és IV csúcsok, egyenként) XIII. ábra. Ez azt mutatja, hogy az enzimnek többféle alakja van és ezen alakoknak töltésheterogenitása van. Továbbmenően, az enzimaktivitási csúcsokban végzett poliakrilamid-géles fehérje-analízis azt mutatja,

HU 212 071 A9 hogy a II, III és IV csúcsok megközelítően azonos molekulasúlyú alfa-amidáló enzimet tartalmaznak (azaz 73 000-75 000 dalton), míg az I csúcsban egy különböző, feltehetően kisebb molekulasúlyú enzim van. AIII jelölésű csúcsban lévő aktivitást homogenitásig tisztítottuk a következőképpen:

AIII csúcs enzimet összegyűjtöttük és egy Mono Q HR 10/10 oszlopon 8,0 pH-nál kromatografáltuk (XIV. ábra). Az enzim ezen oszlopból egyetlen csúcsként eluálódott 250 mM NaCl-nél és gélanalízis igazolta, hogy az enzim homogénné volt tisztítva (XVa. ábra, 6 sáv). A III csúcsból a tisztított enzim jellemzésére a következő kísérleteket végeztük el:

1. Alii csúcs enzim molekulasúlyát 7% poliakrilamid-gél analízissel kb. 75 000 daltonnak állapítottuk meg (XV. b. ábra).

2. Megállapítottuk, hogy az enzim aktivitásának optimális pH-ja 5,0-5,5 pH közötti, Ndanzil-Tyr-Val-Gly-t használva szubsztrátumként (XVI. ábra). Mindazonáltal, minthogy az enzim stabilitása semleges pH-nál nagyobb, előnyös lehet az amidálási reakciót ilyen pH-nál végezni.

3. Megállapítást nyert, hogy az enzimaktivitás kofaktoraként szükséges réz mennyisége az enzim tisztaságával fordítva arányos. A homogénné tisztított enzim tisztaságával fordítva arányos. A homogénné tisztított enzim 0,1 μΜ vagy kevesebb Cu⁺⁺-t igényelt a maximális aktivitáshoz, míg nyers enzimkészítmények 2 pm Cu⁺⁺-t igényelnek.

4. Az enzim izoelektromos pontja (pl) 4,8 volt.

5. A III homogén enzim csúcs specifikus aktivitása 2100 mU/mg fehérje.

AII csúcs enzim is homogenitásig lett tisztítva. Mindazonáltal, ennél az enzimnél azt találtuk, hogy a Mono Q kromatográfia 8,0 pH-nál nem volt elegendő ahhoz, hogy homogén készítményt kapjunk. Ezért a 6,0 pH-jú Mono Q oszlopból származó II enzim csúcsot (XIII. ábra) 1 M 7,0 pH-s Tris-szel szemben dializáltuk, és fenil-szefaróz oszlopra vittük, amely ugyanezen pufferoldattal volt kiegyenlítve. A szennyező fehérjefajták többségét az eluátumból eltávolítottuk, és az amidáló enzimet, ami a későbbi fázisban eluálódott, alaposan megtisztítottuk. A fenil-szefaróz oszlopról összegyűjtött enzim további tisztítása egy Mono Q HR 10/10 8,0 pH-s oszlopon a II. csúcs enzim homogén készítményét eredményezte, amely az oszlopból 220 mM NaCl-nál, vagy afölött eluálódott.

E II jelölésű csúcs enzim jellemzése azt mutatta, hogy:

1. A II csúcs enzim molekulasúlya 7% poliakrilamid gél elektroforézissel kb. 73 00-75 000 dalton volt. így a II csúcs és a III csúcs enzimek molekulatömegük alapján megkülönböztethetetlenek.

2. A II csúcs enzim aktivitásának pH optimuma 5,0-5,5 pH volt. A II csúcs enzim ezen jellemzője azonos a III csúcs enzimével.

3. AII csúcs enzim izoelektromos pontja (pl) közelítően 5,8 volt.

4. példa

A CA-77 sejttenyészet tápközegéből nyert alfaamidáló enzim tisztítása és jellemzése A CA-77 jelű patkány velős pajzsmirigy rákos sejtvonalat felületi kultúrában, 150 cm³-es T-palackokban (Corning) tenyésztettük, 8% CO₂ mellett. A tenyészetet meghatározott közegben tartottuk, amely Dulbeccoféle Módosított Minimál Táptalaj: F-10-et (1:1), 3,7 g/liter NaHCO₃-ot, 5 pg/ml transzeferrint, 10 pg/ml inzubnt, 30 mM szelént és 4 pg/ml gentamicin-szulfátot tartalmazott. Az ilymódon tenyésztett kultúrák korlátlan ideig fenntarthatóak voltak, ha a tápközeget 48 óránként cseréltük. A sejtutánpótlás biztosítására azokat oltottuk és tenyésztettük szérum (5% ló és 2,5% magzati borjúszérum) tartalmú táptalajban is, három napon át. A sejteket ezt követően kétszer mostuk foszfáttal pufferolt sóoldattal, majd újra feltöltöttük az adott tápközeggel.

A szövettenyészet tápközegét 48 óránként aszeptikusán összegyűjtöttük és -20 °C-on tároltuk tisztításig. A szövettenyészet tápközegét (rutinszerűen 6 liter) 2 liter ionmentes vízzel hígítottuk (3:1) és 50 ml/perces átfolyási sebességgel egy DEATE gyenge anioncserélő töltetre (Cuno #250) engedtük, amelyet előzetesen 1,0 liter 20 mM pH 6-os bis Tris HCl-el 4 °C-on kiegyenlítettük. A töltetből az alfa-amidáló enzimet („alfa-AE”) lépcsőzetesen eluáltuk 500 mM NaCl tartalmú 50 mM Tris HCl-el (pH 7,0) mintegy 50 ml/perces átfolyási sebesség mellett. Két anioncserélő preparátumról származó, alfa-AE aktivitású (specifikus aktivitás 10-15 mU/mg) frakciókat egyesítettünk és csökkentett nyomáson, Savant RH-100 prep rotor segítségével 4-5szörösére koncentráltuk.

A fentiek szerint nyert anyagot vittük fel közvetlenül egy Sephacryl 300-SF (Pharmacia) tartalmú 5 x 50 cm-es oszlopra. A mozgó fázis 100 mM Tris HC1 volt, 1,0 ml/perces átfolyási sebességgel. Valamennyi gélszűréses kromatográfiát szintén 4 °C-on végeztük (XVII. ábra).

Az amidáló enzimkészítmény a tisztítás ezen fokán a nem specifikus fehérjebontó aktivitástól mentes, és aktivitása legalább 50 mU/mg fehérje. Az ezen lépésből származó amidáló enzimkészítményt sikeresen alkalmaztuk rekombináns Gly-végű humán kalcitonin és növekedési hormon felszabadító faktor amidálására. 1-1,5 x 10^{4 * 6} sejt/ml (T-palackokból) sejtsűrűséggel indulva, rutinszerűen - e két tisztítási műveletet követően - 200-350 mU értékű amidáló enzimaktivitás/liter elhasznált tápközeg hozamot kaptunk. Az enzim stabil és oldatban vagy szilárd hordozóhoz történt immobilizálás után felhasználásra alkalmas.

Az alfa-AE aktivitástartalmú frakciókat egyesítettük és azokat 6 liter 6,0 pH-jú 20 mM bis Tris HCl-lel dializáltuk. Az enzimet a Mono Q HR 10/10 erős anioncserélő oszlopra (Pharmacia) vittük fel, melyet előzetesen 6,0 pH-jú 20 mM bis Tris HCl-el kiegyenlítettük. Az enzimet az oszlopból 0-300 mM NaCl-os lineáris grádiens elúcióval, több mint 3 órán át 2,5 ml/perces átfolyási sebességgel eluáltuk az oszlopból. Ezen tisztítási művelet során négy, kromatográfiailag elhatárolható alfa-amidáló enzimaktivitási formát különítettünk el. A csúcsokat az oszlopból való eluálási sorrendben számoztuk meg (XVIII. ábra). A III és IV csúcsok az enzim magasabb molekulasúlyú alakjait

HU 212 071 A9 képviselik, és megfelelnek az MTC daganatoknál kapott II és III jelölésű csúcsoknak. Az I és II csúcsok az enzim alacsonyabb molekulasúlyú alakjait jelölik, amelyek a III és IV csúcsok fehérjebontott töredékeit képviselhetik.

Az alfa-amidáló enzim négy, laboratóriumunkban felismert formája, felületi töltésükben különböznek egymástól, amint az nyilvánvaló az eró's anioncseréló kromatográfia során tapasztalt eltérő' retenciós időkből (XVIII. ábra). Az enzim ezen négy, kromatográfiásan különböző formájának pH optimuma is különböző. A XIX. ábrán bemutatott eredmények azt mutatják, hogy a III és IV csúcsok pH optimuma azonosan 5,0 és 5,5 pH közötti. Ezek az eredmények egyeznek az MTC daganatokból tisztított II és III csúcsokra vonatkozóan meghatározott pH optimumokkal. Az I és II csúcsok aktivitási pH tartománya sokkal szélesebb, pH 5 és 8,5 közötti optimummal (XIX. ábra). Ezek az eredmények szorosan megegyeznek azokkal a pH optimumokkal, melyeket Eipper és mtsai., Peptides 4. kötete, 921-28. oldalain (1983) és Murthy és mtsai. a J. Bioi Chem, 261. kötete, 1815-22. oldalain (1986) tettek közzé.

AII és IV enzim csúcsok radioaktív jelzése Na¹²⁵Ivel és azt követő SDS-PAGE, megerősítette, hogy a IV csúcs aktív enzimjének közelítő molekulatömege 7375 kDal volt, míg a II csúcs enzimaktivitásé 55 kDal alatti. A II csúcs enzim pontos molekulatömege nem ismert, minthogy azt nem tisztítottuk homogenitásig (számos fehérjesáv található a 44-55 kDal tartományban.)

A III és IV csúcs enzim homogenitásig tisztítható hidrofób interaktív kromatográfia és eró's anioncseréló' kromatográfia pH 8,0-nál kombinálásával. A IV csúcs (XVIII. ábra) enzimaktivitását összegyűjtöttük vákumban mintegy 2 ml-re koncentráltuk és közvetlenül rávezettük egy 1,3 x 8 cm-es fenil-szefaróz oszlopra (Pharmacia), amelyet 7,0 pH-jú 500 mM Tris-HCl-lel egyenlítettünk ki. alfa-AE aktivitástartalmú frakciókat a kiegyensúlyozó pufferoldattal eluáltuk, 0,5 ml/perc átfolyási sebesség mellett (XX. ábra.)

Az alfa-amidáló aktivitást mutató csúcs frakciókat egyesítettük, 50 mM 8,0 pH-jú Tris HCl-lel szemben dializáltuk, majd 50 mM 8,0 pH-jú Tris HCl-lel kiegyenlített MONO Q HR 10/10 oszlopra vittük fel.

Az enzimet az oszlopból 0-300 mM NaCl lineáris gradienst alkalmazva három órán keresztül 2,0 ml/perces átfolyási sebességgel eluáltuk (XXI. ábra). Az alfaAE aktivitást tartalmazó, közel 240 mM-nál vagy afölött eluálódott frakciókat összegyűjtöttük, Triton X100-ban 0,001%-ra (v/v) beállítottuk és 4 °C-on tároltuk. A tisztított enzim specifikus aktivitását meghatároztuk, az pH 7,0-nál közelítően 1500 mU/mg fehérje volt. A III csúcs alfa-AE aktivitást a IV csúcsnál eltrtakkal azonos módszerekkel tisztítottuk homogenitásig.

A tumor peak (3. példából) és a szövettenyészet IV. peak (4. példából) fiziko-kémiai jellemzői, beleértve a molekulatömeget (73 000-75 000 dalton), a pH optimumot (5,05-5,5), az amino terminális szekvenciát és az eluálódás helyét (nagyobb mintegy 240 mM nátriumkloridnál, pH 8,0-nál végrehajtott anioncserélő kromatográfiánál), azt mutatják, hogy ez a két csúcs jelentheti ugyanazt az enzimet.

5. példa

Biológiai vonatkozású peptidhormonok alfa-amidálása az alfa-amidáló enzim segítségével Számos rekombináns peptidhormon szubsztrátum készült és lett sikeresen alfa-amidálva a találmány szerinti alfa-amidáló enzimkészítmény segítségével, többek között lazac- és humán kalcitonin, humán növekedési hormont felszabadító faktor, és humán kalcitonin génhez kötött peptidek. Az alábbiakban példaként a rekombináns lazac kalcitonin, a humán kalcitonin génhez kötött peptidek és a humán növekedési hormont felszabadító faktor előállításánál alkalmazott eljárásokat foglaljuk össze. Hasonló típusú megközelítések alkalmazhatóak más rekombináns peptidekhez is.

A lazac kalcitonin 32 tagú peptidhormon, melynek karboxi terminálisán alfa-amidált prolii maradék van. Egy mikoorganizmust genetikailag kezeltünk, olyan rekombináns fúziós fehérje képzésre, amely a lazac kaltioninnak megfelelő aminosav-szekvenciát tartalmaz. A fúziós fehérje gént úgy terveztük, hogy a lazac kalcitonin szekvenciát az amino terminálisán egy metionil-maradék, karboxil terminálisán pedig egy glicilmaradék zárja közbe, mely utóbbi egyben zárta a rekombináns fúziós fehérjét. A lazac kalcitonin génnek egy plazmidba történő kötését követően e plazmiddal átalakítottunk egy mikroorganizmust és így a fúziós fehéije expresszióját nyertük. E kalcitonintartalmú fehérjét a rekombináns mikroorganizmus sejtbomlás termékeitől kicsapással elkülönítettük és ciszteinil maradékát S-szulfonáttá alakítottuk. Minthogy a lazac kalcitonin nem tartalmaz metionint, a rekombináns fúziós fehéije brómciános hasítása olyan peptidhez vezetett, amely a lazac kalcitonin szekvenciát karboxil terminálisán egy további glicinnel kiegészítve tartalmazta. Ezt a peptidet vagy fordított fázisú HPLC-vel, vagy ioncserélős kromatográfiával különítettük el és szerkezetét aminosav összetétel és mikroszekvencia analízissel állapítottuk meg.

Az utolsó előtti prolii maradék az alfa-amidáló enzim hatására prolinamiddá alakult át. Az ezen peptid alfa-amidálásánál alkalmazott körülményekre példa a következő: A liofílizált peptid szubsztrátumot (glicinnel meghosszabbított lazac kalcitonin prekurzor, 200300 nanomól) 200 μΐ, közelítően 7-es pH-jú, 150 mM Tris-HCl pufferoldatban oldottuk fel. Az enzim akár MTC daganatból, akár a patkány MTC CA-77 sejtvonal elhasznált szövettenyészet tápközegéből származhatott. Az enzimet olyan mértékig kellett megtisztítani, hogy valamennyi idegen proteolitikus enzim aktivitást eltávolítsunk. Ez rendszerint az ioncserélő és kiszorításos kromatográfia kombinációjával valósítható meg (lásd 4. példa). Tiszta, homogén enzim nem követelmény. Ehhez a keverékhez azután aszkorbinsavat és rézszulfátot adtunk elegendő mennyiségben ahhoz, hogy a végső koncentráció 3 mM, illetve 2 μΜ legyen. Adhatunk a reakciókeverékhez katalázt (7,5 μg/ml),

HU 212 071 A9 etanolt (1% v/v) és káliumjodidot (50 mM) az alfaamidált lazac kalcitonin kitermelés növelése céljából. A kapott keveréket kevertük, és 37 °C-on 5-6 órán át inkubáltuk.

Az S-szulfonát-csoportokat béta-merkaptoetanollal történt kezeléssel eltávolítottuk, majd a rekombináns lazac kalcitonint fordított fázisú HPLC-vel tisztítottuk. A végtermék jellemzésére a fordított fázisú HPLC-ben mért retenciós idejét, kvantitatív tripszines feltérképezést és aminosav analízist alkalmaztunk. A rekombináns lazac kalcitonin minden esetben megkülönböztethetetlen volt a szintetikus lazac kalcitonintól.

A humán kalcitonin génhez kötött peptid 37 tagú peptid hormon, karboxi terminálisán egy alfa-amidált fenilalanil-maradékkal. A fúziós protein gént a lazac kalcitoninéhoz hasonló módon megjelöltük (lásd fent) úgy, hogy a humán kalcitonin génhez kötött szekvenciáját az amino terminálisán egy metionil-maradékkal, a karboxi terminálisán egy glicil-maradékkal közbezártuk, mely utóbbi a rekombináns fúziós protein végcsoportja is. A rekombináns humán kalcitonin génhez kötött peptid prekurzor felszabadítását, tisztítását, alfaamidálását és jellemzését analóg módon hajtottuk végre, mint a rekombináns lazac kalcitoninnál.

A humán növekedési hormont felszabadító faktor (hGHRF) olyan 44 tagú peptid hormon, amelynek karboxil terminálisán alfa-amidált leucil-maradék van. A hGHRF fúziós fehérje gén úgy lett tervezve, hogy a peptid hormon aminosav-szekvenciája annak amino terminálisán egy triptofanil-maradékkal, karboxil terminálisán pedig egy glicil maradékkal lett közbezárva, mely utóbbi egyben a rekombináns fehérje végcsoportja is. A hGHRF tartalmú fúziós proteint a rekombináns mikroorganizmus bomlástermékeitől kicsapással különítettük el. A fúziós protein nem hGHRF részét a ciszteinil-maradékok Sszulfonát-származékokká történő konverziójával denaturáltuk. Mivel a hGHRF nem tartalmaz triptofánt, a rekombináns fúziós fehérje BNPS-szkatol reagenssel történt kémiai kezelése oxidatív módon hasította a fúziós fehérjét, eközben karboxil-terminális glicin végcsoporttal rendelkező amidálatlan hGHRF-et képezve. Egyidejűleg a hGHRF molekula 27. pozíciójában lévő metionil maradék metionin-szulfoxiddá oxidálódott. E glicinnel meghosszabbított peptidet gélszűréssel és fordított fázisú HPLC-vel különítettük el. Szerkezetét a tripszines kezeléssel előállított peptid fragmensek aminosav analízisével állapítottuk meg.

Az utolsó előtti leucil-maradékot a jelen találmány szerinti alfa-amidáló enzimmel kezelve leucinamiddá alakítottuk. Az alfa-amidált hGHRF előállításánál alkalmazott körülményekre egy példa a következő:

A liofilizált peptid szubsztrátumot (20-40 nanomól) 150 μΐ ioncserélt vízben oldottuk és 90 μΐ (500 μυ), (pH 7,0) akár patkány MTC daganatból akár patkány CA-77 sejtvonal elhasznált szövettenyészet tápközegéből nyert alfa-amidáló enzimkészítménnyel elkevertük. Az enzimet valamennyi szennyező proteolitikus enzim eltávolításával, kiszorításos és ioncserélő kromatográfia kombinációjával megtisztítottuk. Azután az enzim és szubsztrát keverékhez aszkorbinsavat és rézszulfátot adtunk a 3 mM és 2 μΜ végkoncentráció eléréséhez elegendő mennyiségben. A kapott oldatot 37 °C-on kevertük és inkubáltuk 4-6 órán keresztül. A szubsztrátnak termékké alakulási konverziója tipikusan 95%, a tripszines kezeléssel felszabadított fragmensek analízise alapján. Végül a metionin-szulfoxid maradékot pH 4-nél 10 mM nátrium-acetáttal puffereit 4 M béta-merkaptoetanollal kezelve 80 °C-on egy óra alatt metioninná redukáltuk. A végterméket fordított fázisú HPLC-vel tisztítottuk és retenciós idejével, tripszin kezeléses analízisével és aminosav analízisével jellemeztük. A rekombináns alfa-amidált termékeket biológiai aktivitásukra nézve is teszteltük. A rekombináns hGHRF valamennyi esetben megkülönböztethetetlen volt a szintetikus hGHRF-tól.

A fenti kísérleteket kiegészítve két, a kereskedelemben kapható, glicinnel-hosszabbított peptid-hormont vizsgáltunk mint alfa-amidáló enzim szubsztrátjait. Ezek az alfa-melanocit stimuláló hormon és a P szubsztancia prekuzorai. Mindkét esetben az eredmények jelezték, hogy mindkét peptid az alfa-amidáló enzim alkalmas szubsztrátja.

6. példa

Tisztított, patkány eredetű, alfa-amidáló enzim szekvencia analízise

Tisztított alfa-amidáló enzim tartalmú frakciókat gyűjtöttünk patkány MTC daganat szövetekből, vagy CA-77 sejttenyészet felülúszókból és az enzim szulfhidril-csoportjait redukáltuk, majd karboximetileztük. A kapott reakciókeverékeket azután Vydac C4 fordított fázisú HPLC oszlopra vittük (5 pm szemcsenagyság, 33 nm pórusméret) amelyet 0,1% vizes trifluorecetsavval egyenlítettünk ki. Az oszlopot ezzel az oldattal mostuk át a puffersók feleslegének eltávolítására. A sómentesített enzimet a HPLC oszlopból 0,08% trifluorecetsavat tartalmazó 80%-os acetonitrillel eluáltuk. Az oszlop eluátumának vizsgálata UV detektálással 220 nm-nél történt. A kapott fehérjefrakciókat gyűjtöttük, egyesítettük és liofilizáltuk. Ezt az anyagot azután újra feloldottuk 100 μΐ 0,1%-os SDS-ben majd egy Applied Biosystem model 470 A fehérje szekvenáló készülékbe vittük be. A mikroszekvencia analízis módszerei az Applied Biosystem cég által megadottak voltak. A kapott feniltiohidantoin aminosavakat HPLC-vel analizáltuk egy Hypersil C18 oszlopon (5 pm szemcseméret, 10 nm pórus méret), ahol az abszorbancia mérése 269 és 313 nmnél Hewlett-Packard 1090 jelű folyadék-kromatográf rendszerrel történt. A daganatszövet főkomponens enzim csúcsának (III peak) aminosav-szekvenciája a következő volt:

3456 78 9 10

NH₂-Ser-Phe-Ser-Asn-Glu-Cys-Leu-Gly-Thr-Ile11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Gly-Pro-Val-Thr-Pro-Leu-Asp-Ala-Ser-Asp-Phe22 23 24 25 26 27 28

Ala-Leu-Asp-Ile-Arg -Met-Pro.

A CA-77 sejtszövettenyészet felülúszójából származó enzim fő komponensű formájának (IV peak) amino13

HU 212 071 A9 terminális szekvencia adatai jelzik, hogy ez azonos a daganatszövet enzimével (III peak). Mindazonáltal ezen enzim mifcroszekvencia analízise során egy minor komponenset is detektáltunk, amely úgy tűnik, hogy az alfa-amidáló enzim fő formájához képest egy aminoterminális hosszabbítást tartalmaz. Ezen komponens jelenléte feltehetően az enzim különböző, transzláció utáni kezelésének tudható be. E komponens aminoterminális aminosav-szekvenciája a következő volt:

123456789 10

NHn-Phe-Lys-Glu-Thr-Thr-Arg-Ser-Phe-Ser-Asn11 12 13 14

Glu-Cys-Leu-GlyA patkány MTC daganatszövetből származó alfaamidáló enzimre vonatkozó további aminosav-szekvencia adatokat kaptunk a következő módon: Mintegy 400 pg tisztított enzimet redukáltunk és karboximetileztünk. Ezen műveleteket követően az enzim-oldatot dialízis csövekbe vittük át és 18 órán át dializáltuk 25 mM pH 8,0/0,5M ureával szemben. A maradékot ezután áttöltöttük egy 1,5 ml-es centrifuga-csőbe és csökkentett nyomáson 600 μΐ térfogatúra koncentráltuk. Az enzim oldathoz hozzáadtunk 2 μΐ (2 pg) tripszint és a keveréket 37 °C-on egy órán keresztül inkubáltuk. Ekkor hozzáadtunk egy második tripszin adagot (2 pg) és az inkubálást 37 °C-on további két órán át folytattuk. A kezelést 200 pl 4 M urea/10% ecetsav hozzáadásával fejeztük be. A kezelt anyagot azután egy Vydac C 18 fordított fázisú HPLC oszlopra vittük (5 pm szemcseméret, 33 nm pórus méret), melyet 0,1%-os vizes trifluor-ecetsavval hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot ezután lineáris grádiensű acetonitrillel 50% koncentrációig eluáltuk 4 órán át, és 2 percenként frakciókat szedtünk. A trip színnel kezelt enzim jellegzetes, fordított fázisú HPLC elúciós csúcsait a XXIII. ábrán ábrázoltuk. A kapott triptikus peptidek közül hármat automatizált szekvencia analízisnek vetettünk alá a fentiekben leírtaknak megfelelően, ezek eredménye az alábbi: (az egyes peptideket azok frakciósorszámával jelöltük).

65-ös sorszámú peptid

-Ser-Met-Gln-Pro-Gly-Ser-Asp-Gln-Asn-His-PheSer-Gln-Pro-Thr58-as sorszámú triptikus peptid

-Asn-Gly-Gln-Trp-Thr-Leu-Ile-Gly-Arg86-os sorszámú triptikus peptid

-Phe-Val-Thr-Gln-Trp-Gly-Glu7. példa

A patkány MTC vagy CA-77 sejt alfa-amidáló enzimét kódoló gén vagy DNS-szekvencia molekuláris klónozása

Az alfa-amidáló enzimet kódoló gén vagy DNSszekvencia klónozhatósága számos kritikus információ és reagens hozzáférhetőségétől függ. Találni kell egy megbízható enzim fehérje forrást, ami aztán az enzim hírvivő RNS-ének (mRNS) és végül komplementer DNS-ének (cDNS) forrásául fog szolgálni.

Az enzim génjének vagy cDNS-ének elkülönítése szükségessé tesz egy, a szóbanforgó enzimre specifikus molekuláris próbát. Általában ez a molekuláris próba két lehetséges alak egyike, vagy egy oligonukleotid, melynek szekvenciája komplementer az enzim-gén egy szakaszával, vagy egy antitest-molekula (vagy antitestmolekulák gyűjteménye), amely specifikusan felismeri az enzim-fehérjét. E molekuláris próbák kialakítása szükségessé teszi oly enzimtisztító módszer kidolgozását, hogy vagy az enzimre specifikus antitestek legyenek előállíthatók, vagy az enzim aminosav-szekvenciája legyen meghatározó az oligonukleotid próbák megtervezésére. Ezeknek a feladatoknak a találmány szerinti alfa-amidáló enzimre vonatkozólag eleget tettünk.

Az alfa-amidáló enzimet patkány MTC szövetből és patkány CA-77 sejt tenyésztett tápközegéből tisztítottuk. Megállapítottuk, hogy ezek a sejtforrások tartalmazzák az enzim-fehérjét kódoló mRNS-t. A módszerek, amelyekkel az alfa-amidáló enzimekhez a cDNS-t előállítottuk, jól ismertek a molekuláris biológiai szakirodalomban. Ezen különféle módszerek leírásai megtalálhatók laboratóriumi kézikönyvekben, mint például Molecular Cloning (1982), DNA Cloning (1. kötet), a Practical Approach (1985), vagy eredeti irodalmi hivatkozásokban, mint például Gubler, V. and Hofman, B. J. Gene, Vol.25, 262-69 (1983); vagy Young, R. A. és Davis, R. W., PNAS, Vol.80, 1194-98, (1983). Ezek a módszerek általánosan alkalmazhatóak, az alkalmazott mRNS forrástól függő kritikai változtatásokkal. Az amidáló enzimre specifikus cDNS előállítására mind patkány MTC szövet mRNS-t, mind pedig CA-77 sejt mRNS-t alkalmaztunk. A szintetizált kettős szálú cDNS mintákat pedig, ismert módon, külön-külön génkönyvtárak előállítására használtuk.

Mint fentebb említettük, az alfa-amidáló enzim mRNS-ének megfelelő cDNS-ek azonosításához molekuláris próbákra van szükség, amelyek ezeket a rekombinánsokat egy adott könyvtár más rekombinánsaitól meg tudják különböztetni. A 3. és 4. példákban részleteztük a molekuláris próbákhoz szükséges enzimek előállításához használt tisztítási módszereket. A 6. példa leírja ezen fehérje alkalmazását az aminosav-szekvencia meghatározásához, míg a 8. példa ismerteti a tisztított fehérje alkalmazását enzim specifikus antitestek előállítására.

A 6. példa szerinti aminosav-szekvenciák elegendőek specifikus szelektív oligonukleotid próbák generálásához. Az oligonukleotid próbák készítésénél azonban számos tényező fontos ahhoz, hogy a próbák szelektívek legyenek. Ezen megfontolások teljeskörű ismertetése található meg Lathe, R. J., J. Mól. Biok, 183. kötete 1-12. oldalain (1985). Minthogy általában egynél több nukleotid-szekvencia tudja kódolni ugyanazt az aminosav-szekvenciát (amely jelenség genetikai kód degeneráltsága elveként ismert), egy adott nukleotid-szekvencia a lehetséges génszekvenciák sorának csupán egyikét fogja képviselni. A garancia, hogy egy oligonukleotid próba a kérdéses gént valóban felismeri, hogy az amidáló enzimre jellemző aminosav-szekvenciát kódoló valamennyi lehetséges nukleotid-szekvencia ekvimoláris keverékét kell előállítani. Ilyen keverékek komplexitása azonban rontja azok abszolút szelektivitását, ezért általában olyan oligonukleotid keveré14

HU 212 071 A9 keket kell használni, amelyek egy fehérje aminosavszekvenciája több, mint egy területének felelnek meg, hogy abszolút specifikus szelektivitást kapjunk egy adott génre.

Alternatív módon, úgy is készíthetünk a szóbanfor- 5 gó génre nézve szelektív oligonukleotidot, hogy egy olyan hosszúságú egyedi nukleotid-szekvenciát készítünk, amely még a kissé tökéletlen komplementeritás ellenére is stabil hibridet képez a kívánt génnel. Annak a valószínűsége, hogy ez az egyedülálló szekvencia 10 más génszekvenciákkal képez stabil hibridet, igen kicsi (hosszúság-függó'). Ez az egyedi szekvencia a fehérjeszekvencia minden egyes aminosava számára a leggyakrabban használt kódont tartalmazza. Egy adott fajra nézve a kódon használat frekvenciáját az ismert 15 génszekvenciák és az adott faj megfelelő' fehérjéi aminosav-szekvenciájának összevetésébóT határozhatjuk meg. Ezek a módszerek jól ismertek a molekuláris biológia szakemberei számára.

Specifikus oligonukleotid próbák készítésének al- 20 kalmazható további lehetó'sége dezoxi-inozin-maradékok beépítése az oligonukleotidba, a leginkább degenerált pozícióiba. Ez a nukleotid-helyettesítés azt a célt szolgálja, hogy csökkentsük a próbaminta degeneráltságát és így a szelekciós eljárásnál eló'nyös ha- 25 tásokat érjünk el. [Egy fejtegetést a dezoxi-inozin alkalmazásáról az oligonukleotid próbáknál ld. Ohtsuka és mtsai., J. Bioi. Chem. 260. kötet 2605-08. (1985)].

Az alfa-amidáló enzim fehérje-szekvenciákat számos olyan obgonukleotid próba tervezésére alkalmaztuk, amelyek alkalmasak az amidáló enzim cDNS-ének izolálására. Az alkalmazott szekvenciákat és a készített próbákat a II. TÁBLÁZAT mutatja. Megjegyzendő' azonban, hogy ha az aminosav-szekvenciák rendelkezésre állnak, egy molekuláris biológiában jártas szakértő' a gén-izolálásra alternatív stratégiákat is kidolgozhat, próba hibridizálással.

Az ily módon előállított oligonukleotid próbákat jól kidolgozott módszerekkel alkalmazták (ld. Molecular Cloning, 1982) mind a plazmid, és a bakteriofág cDNS könyvtárak szkrínelésére, mind pedig az alfa-amidáló enzim cDNS-ek elkülönítésére.

II. TÁBLÁZAT

Ez a táblázat egy alfa-amidáló enzim-fehérje szelektív területeinek valamennyi lehetséges génszekvenciáját bemutatja. A tervezett szekvenciák alatt a gén kiegészítő oligonukleotid próbák némelyike van feltüntetve, melyek használatosak a cDNS azonosítására és izolálására.

Amino terminális szekvencia

AA#: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Szekvencia: Ser Phe Ser Asn Glu Cys Leu Gly Thr He Gly Pro Val Thr Pro Leu Asp Alá Tervezett gén szekvciák:

TCC TTC TCC AAT GAG TGC CTG GGC ACC ATT GGC CCT GTG ACC CCC CTG GAT GCC

AGT

A

G

TAGT

A

G

TT

A

G

Oligonukleotid próba AE1:³ TTA CTC ACG GAC CCG TGG TAA CCG GCA CAC TGG GGG GAC CTA CG⁵' T G

Obgonukleotid próba AE8:³’AC CCG TGG TAA CCG GGA CAC TG⁵’

II III II

AA#: 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

Szekvencia: Ser Asp Phe Alá Leu Asp He Arg Met Pro Tervezett gén szekvenciák: TCT GAC TTT GCC CTG GAC ATC CGG ATG CCT

AGC

G

TT T A A G C triptikus peak

AA#: 123456789

Szekvencia: Asn Gly Gin Trp Thr Leu He Gly Arg

Tervezett gén szekvenciák: ⁵ AAT GGC CAG TGG ACC CTG ATT GGC CGG³

TT C A T G G

Obgonukleotid próba AE4:^3>TTA CCG GTC ACC TG⁵' G T T

Obgonukleotid próba AE5:³'TTA CCG GTC ACC TG⁵' GAT

HU 212 071 A9

Triptikus peak

AA#: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Szekvencia: Ser Met Gin Pro Gly Ser Asp Gin Asn His Phe Ser Gin Pro Thr

Tervezett ⁵TCC ATG CAG CCT GGC TCT GAC CAG AAC CAC TTC TCC CAG CCC ACT³' gén AGT szekvenciák: A

G

AAGC G A T G

T AGT

A

G

Oligonukleotid próba AE6:³ TAC GTC GGI CCI ÁGI CTG GTC TT⁵ T AT

Oligonukleotid próba AE7:³ TAC GTC GGI CCI TCA CTG GTC TT⁵'

T GAT

Oligonukleotid próba AE10:³'CTG GTC TTG GTG AA⁵'

A A A

Oligonukleotid próba AE11:³'CTG GTT TTG GTG AA⁵'

A A A

86. számú tripszines csúcs

AA#: 1 2 3 4 5 6 7

Szekvencia: Phe Val Thr Gin Trp Gly Glu

Tervezett gén szekvenciák: ⁵ TTT GTG ACC CAG TGG GGA GAG³ C C T A T A

T A G

A G C

Oligonukleotid próba AE9:³'AAA CAC TGC GTC ACC CCC CT⁵'

G I I T I

8. példa sejteket szelektív HAT táptalajban tartottuk, amely

A. Alfa-amidáló enzimre specifikus monoklonális antitestek előállítása egerekben

Tizenegy Balb/cJ egeret immunizáltunk, tisztított amidáló enzim készítménnyel oltottunk. Az egerektől vért vettünk, a szérumot kezeltük, és a tisztított enzimhez viszonyítva ELIS A-teszttel meghatároztuk a titerét. A vizsgálatot (az alkalmazott módszerek jól ismertek) úgy végeztük, hogy a tisztított enzimet polisztirol lemezre abszorbeáltuk, amelyet azután mostunk és marha szérum albuminnal (BSA) telítettünk (az antitesteknek a laphoz való túlzott kötődése elkerülésére). A hígított egér szérumot (amely a feltételezett antitesteket tartalmazta az amidáló enzimmel szemben) azután az amidáló enzimmel bevont lemezen inkubáltuk és mostuk. Az üregekben ezután egy második antitestet (jelzett alkálikus foszfatázzal megjelölt, amely megkönnyíti annak bizonyítását, hogy az első antitest kötődött a lapot bevonó enzimhez) inkubáltunk. Mosás és a szubsztrát oldat hozzáadása után, a jelet kolorimetrikusan, spektrofotometriás műszerrel mértük. „Pozitív” szérumok legalább 2:1es jel-zaj viszonyt mutattak.

A #7. egeret, amely az ELISA-tesztben magas titert mutatott, négy nappal az utolsó oltás után leöltünk. Lépét aszeptikusán eltávolítottuk és roncsoltuk (mechanikusan), összesen 132,6 x 10⁶ lépsejtet kaptunk, melyeket 122,8 x 10⁶ NS-1 csontveló'daganat sejttel fuzionáltattunk, 1,28 ml PEG (polietilénglikol) 4000 segítségével. A sejteket ezután egyenlően szétosztottuk öt 24-kamrás lemezbe, melyeket eló'zetesen tápsejtként szolgáló Balb/cJ timusz- és lépsejtekkel vontunk be. A csak a hibrid sejtek túlélését engedi meg.

A 116 sejtből származó felülúszókat, amelyek klónos növekedést mutattak, radioimmun vizsgálattal és ELISA módszerrel antitest termelésre vizsgáltuk meg. A radioimmun vizsgálati módszer hasonló volt a ko35 rábban ismertetett ELISA-hoz, kivéve, hogy a második antitestet ¹²⁵I-tel jelöltük és, hogy a radioaktív méréseket gamma számlálóval végeztük.

A 116 sejtből 56 pozitív antitest termelőnek mutatkozott, ezt követően ezeket alfa-amidáló enzim aktivi40 tásukra nézve is vizsgáltuk. Huszonöt olyan kiónt, amelyik pozitívnak tűnt alfa-amidáló enzimként, sorozatos hígításos módszerrel klónoztunk. Az elsó'dleges kiónokat mind alfa-amidáló enzim, mind pedig BSAval szemben screeneltük (minthogy a polisztirol lapok

BSA-val lettek telítve, a laphoz kötött antitestek esetleg csupán a BSA-hoz kötődtek, vagy a BSA által abszorbeálódtak nem specifikus módon), hogy megállapítsuk, vajon ténylegesen specifikusak-e az amidáló enzimre. Azokat a kiónokat, amelyek az alfa-amidáló enzimre nézve legalább kétszer akkora jelet adtak, mint a BSA-ra klónoztuk 1 sejt/2 üreg elosztási arány mellett.

Huszonegy pozitív hibridoma (ld. III. táblázat) harmadlagos klónozásra került és húszat közülük an55 titest osztályra nézve, mind Ocuchterlony, mind pedig ELISA módszerekkel jellemeztünk. A kiónok közül tizenhétnek IgG_2a nehéz lánca, háromnak pedig IgGj nehéz lánca van. Mind a húsz jellemzett klón kappa könnyű láncú ellenanyagokat, antitestet szekre60 tál.

HU 212 071 A9

Mindegyik vonalat sejttenyészetben külön növesztettük és a sejtek aliquotjait cseppfolyós nitrogénben lefagyasztottuk. Prisztánnal kezelt Balb/cJ egereket 5 x 10⁶ hibridóma sejttel intraperitoneálisan oltottunk. Egy héttel később azoknak az egereknek, amelyeknél nem mutatkoztak az asciteses daganat nyomai, a sejtekből ismételten emlékeztető oltást adtunk. Az ascites folyadékot és a vért 1-2 héttel később eltávolítottuk. Kezelés után az ascitest és a szérumokat az alfa-amidáló enzimmel és a negatív antigénnel szemben screeneltük (pl. marha szérum albumin, tojás albumin, karbon anhidráz, és növekedési hormon felszabadító faktor), hogy megbizonyosodjunk annak specifikus antitest voltáról.

III. TÁBLÁZAT

Balb/cJ alfa-amidáló enzim monoklonális sejtvonalak

Sejtvonal	Nehéz lánc	Ti tér1
4-1-4-20-3	IgG2a	-1:5,000
4-1-4-18-1	IgG2a
4-5-7-3	IgG2a	-1:5,000
4-2-3-17-7	IgG2a
3-7-1-20-24	IgG2a	-1:10,000
4-8-15-2-6	IgG2a
4-7-21-14-9	IgG2a
4-10-45-1-16	IgG2a
54-2-1-39-2	IgG2a	-1:10,000
4-6-12-3-17	IgG2a
52-1-31-24-2	IgG2a
4-3-11-46-1	IgG2a
3-7-9-9-3	IgG2a
86-1-38-15	IgGl	1:1,000
4-5-6-1	IgGj	1:1,000
4-4-24-3-5	IgG2a	-1:5,000
4-11-3-1-8	IgGl
8-9-94-4-2	IgG2a
4-10-30-3-1	IgG2a
75-10-17-14-4	IgG2a
92-10-26-32-39	Nincs osztályozva

¹ Az ascites folyadékokat 100 ng tiszta enzimmel titereztük, szilárd-fázisú ELISA-ban.

B. Egerekben termelt monoklonális antitestek tisztítási eljárása

Az alfa-amidáló enzimre monoklonális antitesteket, melyek a fent leírt módszer szerint készültek, a következólíéppen tisztítottuk. Antitest forrásként számos, azonos kiónnal beoltott egértől gyűjtött ascites folyadék szolgált. Az ascites folyadékot 10 mM pH 6-os MES-szel hígítottuk (ötszörösére). A hígított ascites folyadékot vittük fel egy 1,5 x 20 cm-es oszlopra, amely 40 μπι ABX kevert típusú szilíciumdioxidos gyantát (J. T. Baker) tartalmazott és előzetesen 10 mM pH 5,6-os MES pufferoldattal lett kiegyenlítve. Az oszlopról a monoklonális antitesteket 0-500 mM nátriumacetát grádienssel eluáltuk 7,0 pH értéken. A tisztított antitesteket tartalmazó frakciókat egyesítettük, specifikus aktivitásukra nézve megvizsgáltuk, és további felhasználásukig 4 °C-on tároltuk.

C. Alfa-amidáló enzimre specifikus poliklonális antitestek generálása csirkében.

Két tojós tyúkot Ribi adjuvánssal kevert, tyúkonként mintegy 50 pg tisztított alfa-amidáló enzimmel oltottunk intravénásán, intramuszkulárisan és szubkután. A Ribi adjuváns egy teljesen metabolizálható lipid emulziós rendszer, amely csirke lymphocytákra ható mitogént és oly hatásnövelőt tartalmaz, amely baromfiakban növeli az antitest választ antigénekre (Ribi Immunochem Research, Montana). A kezdeti immunizáció után két emlékeztető injekciót adtunk kéthetes időközönként, csirkénként mintegy 30 pg enzim tartalommal. Az állatoktól a 21. és 35. napon vért vettünk és a szérumot feldolgoztuk, majd specifikus antitestek jelenlétére screeneltük a következő eljárással: mindkét csirkéből származó szérumot a 0. napon (immunizálás előtt), a 21. napon és a 35. napon screeneltük, szilárd fázisú ELISA-teszttel, 100 ng tisztított alfa-amidáló enzimmel szemben. Negatív kontrollként marha szérum albumint használtunk a nem specifikus antitest megkötésére. Az enzim-specifikus antitestek kimutatása nyúl anti-csirke IgG alkalikus-foszfatázzal jelzett szérummal történt.

A fenti vizsgálatok eredményei azt igazolták, hogy specifikus antitestek észlelhetőek a 257. számú csirke szérumban a 35. napon. Az 1:10 000-re hígított szérum mintegy 4:1-es jel-zaj viszonyt adott. A 258. számú csirke enzim-specifikus antitesteket mutatott a 21. és 35. napon. Mindkét vérvételből származó szérumok: 1:10 000-re hígítva, mintegy 4:1-es jel-zaj viszonyt adtak. A tojásgyűjtést mindkét tyúknál az 56. napon kezdtük. Az immunizálás előtti tojások és az immunizálás utáni tojások IgY-jait polietilén-glikolos (PEG) lecsapással izoláltuk Ouchterlony módszerrel analizáltuk és az enzim-specifikus antitesteket ELISA-val screeneltük.

D. A csirke IgY antitestek tisztítása

Az alfa-amidáló enzimre specifikus poliklonális madár antitesteket állítottunk elő csirkékben a fentiekben leírt módon. Az immunizált tyúkok tojásait összegyűjtöttük és vagy paraffinba ágyaztuk, vagy lefagyasztottuk az IgY tisztítására történő felhasználásig. A tojásfehérjéket elkülönítettük a tojássárgáktól, amelyek az α-AE specifikus antitesteket tartalmazzák. A tojássárgákat háromszorosára hígítottuk 0,1 M NaCl és 0,01% nátriumazid tartalmú, pH 7,5-ös 10 mM nátrium-foszfáttal. Egy kezdeti PEG kicsapási lépést végeztünk 3,5% végső koncentrációjú PEG 8000 felhasználásával. A kicsapást 30 percig hagytuk lefolyni szobahőmérsékelten, azután centrifugáltunk és a felülúszót

HU 212 071 A9 (amely az IgY-t tartalmazza) kinyertük. A felülúszóhoz további PEG-et adtunk, a 12,5% PEG végkoncentráció eléréséig. Ennél a PEG koncentrációnál az IgY antitestek kicsapódtak és azokat centrifugálással leválasztottuk. Az ilyen tisztaságú IgY antitesteket két módszerrel tisztítottuk tovább:

1. ) A kicsapott IgY antitesteket újra szuszpendáltuk 10 mM pH 5,6-os MES pufferben, azután éjszakán át dializiáltuk 4 °C-on ugyanezen pufferrel szemben. A mintát ezt követően 1,5 x 20 cm-es, 40 gm módosított ABX szilíciumdioxidos gyantát tartalmazó oszlopra vittük (J. T. Baker). Az ezt követő tisztítási eljárás megegyezett az ascites folyadéknál leírttal.

2. ) Alternatív módon az IgY-t tartalmazó üledéket újra szuszpendáltuk a kiindulási pufferoldatban és azután telített ammóniumszulfát (3:1 v/v) felhasználásával ismét leválasztottuk. Az IgY tartalmú lepényt ezután újra szuszpendáltuk egy kevés desztillált vízben, és a további felhasználásig 4 C°-on tároltuk. A csirke IgY immobilizálási eljárás a 12. példában kerül ismertetésre.

9. példa

Az alfa-amidáló enzim aktivitás kinetikus vizsgálatai

Az alfa-amidáló enzim, melyet homogenitásig tisztítottunk (mind velős pajzsmirigy rákos CA-77 sejtekből, tenyészetben, mind -pedig a megfelelő daganatos szövetekbóT, melyeket laboratóriumi patkányokból távolítottunk el), az inaktív glicinnel végződő peptid prohormonoknak a bioaktív C-terminális amidokká való átalakításában játszik szerepet. Vizsgálataink szerint a prohormon C-terminális aminosavjának glicin-csoportnak kell lennie ahhoz, hogy az enzim azt felismerje és amidálja a következők szerint:

amidáló enzim

R-X-G ly-COOll+O₂ R-X-C0NH₂+HC0-C0 redukáló oxidátl

0H+H₂0 redukáló szer

Ezen aktivitás in vitro helyreállítása a peptid szubsztrátum mellett feltétlenül szükségessé tesz molekuláris oxigént és egy redukálószert (L-aszkorbinsav). Azt találtuk azonban, hogy az enzimatikus aktivitás jelentősen növelhető Cu⁺²-ionok (réz-szulfát) és kataláz hozzáadásával. Ezt a külső rezet az enzim megköti és a molekuláris oxigén kötési helyéül és aktivitásra használja. Másfelől, a kataláz oly enzim, mely a hidrogénperoxid eltávolítására szolgál, mely utóbbi egyébként feldúsulna, mégpedig mellékreakciók révén oxigént, aszkorbátot és rezet vonna be és így tönkretenné az amidáló enzimet.

Sikeresen dolgoztunk ki érzékeny, nem radiometrikus vizsgálati módszereket az alfa-amidáló enzim aktivitás detektálására. Ezek a vizsgálatok magukban foglalják szintetikus tripeptid szubsztrátumok alkalmazását. Ezen szubsztrátumok amidálása hagyományosan ellenőrizhető elválasztással és a termék (amidált dipeptid és szubsztrátum tripeptid) HPLC-s kvantifikálásával. A kidolgozott legérzékenyebb vizsgálat monodanzil-L-Tyr-Val-Gly-t használt szubsztrátumként. Ez a vegyület rendkívül kis szinteknél is észlelhető, minthogy a danzil-csoport fluoreszcens. Ebből következik, hogy ezen vizsgálat érzékenysége összehasonlítható más laboratóriumokban kifejlesztett radiometrikus vizsgálatokéval.

Ezt a vizsgálatot az alfa-amidáló enzim kinetikus sajátságainak vizsgálatára használtuk. Pontosabban meghatároztuk a Km és Vmax kinetikus paramétereket a szubsztrát koncentrációnak az enzimaktivitás változására gyakorolt hatásának vizsgálata alapján. Km azon affinitás mértéke, amellyel az enzim egy adott szubsztrátumra vonatkozóan rendelkezik. Minél kisebb Km értéke, annál nagyobb az affinitás. Vmax pedig az a maximális sebesség, amellyel az enzim a szubsztrátumot termékké alakítja és a szubsztrátum telítési koncentrációinál kerül megfigyelésre, (azaz amikor a szubsztrátum az enzimhez képest nagy fölöslegben van jelen).

Egy jellegzetes amidáló enzim vizsgálatnál a reakcióelegy (50 gl) a következó'ket tartalmazza: enzim (mintegy 7 gg), danzil-L-Tyr-Val-Gly (40 μΜ-ig), Laszkorbinsav (3 mM), kataláz (0-100 gg ml^-1) és rézszulfát (0-2 gM) 60 nM TES pufferoldatban, 7,0 pHnál. A reakciót 37 °C-on az enzim adagolásával indítjuk és egy meghatározott idő után 0,1 M EDTA (végső koncentráció) hozzáadásával állítjuk le, mely utóbbi megköti a rezet és így azt az enzim számára hozzáférhetetlenné teszi.

Az alfa-amidáló enzim nagy affinitást mutat a danzil L-Tyr-Val-Gly enzimatikus amidálására, 1-2 μΜ közötti Km-mel. Ez az érték állandónak látszik, függetlenül az enzim tisztasági állapotától. Úgy a Sephacryl S-300 kromatográfiás oszlopokról nyert enzim ugyanolyan Km értékű, mint az elektroforetikusan tiszta, Mono Q pH 8,0 kromatográfiával nyert enzimpreparátumok vagy az alacsonyabb molekulatömegű, Mono Q pH 6,0 kromatográfiával reszolvált formák. Másfelől amint ez várható volt, a Vmax értékek (protein mg-ra vonatkoztatva) nagymértékben változnak a tisztítás mértékével. így, míg a Sephacryl S-300 segítségével előállított anyag Vmax értéke mintegy 50-100 nmol átalakult termék percenként és fehérje mg-onként, addig a tiszta daganatenzim Vmax értéke kb. 5000 nmol termelt termék per mg protein.

Azt találtuk, hogy bizonyos körülmények között az aszkorbát és a szubsztrátum versenyezhetnek egymással az enzimért. így például, ha a szubsztrátum koncentrációját lényegesen megnöveljük, a telítési szint fölé, az enzimaktivitás csökken az enzim és az aszkorbinsav közötti káros kölcsönhatás miatt. Úgy tűnik, minden adott szubsztrátum esetében érzékeny egyensúly van az optimális szubsztrátum/aszkorbát arány esetén, amely az enzimnek az adott szubsztrátum iránti affinitásától függ.

Az amidáló enzim affinitása glicinnel meghosszabbított peptidek iránt

A monodanzil-L-Tyr-Val-Gly amidálás vizsgálatát érzékeny próbaként használtuk fel az amidáló enzim és

HU 212 071 A9 különféle gly-vel meghosszabbított peptid prohormonok reakciójára. E tanulmány célja az volt, hogy megvizsgáljuk az enzim viszonylagos aktivitását bizonyos különbözei típusú peptid szubsztrátumok kötésére. Ámbár már korábban bemutattuk, hogy az enzim sikeresen amidálja a humán kalcitonin glicinnel meghosszabbított prekurzor szubsztrátumait és a humán növekedési hormont felszabadító faktort, ez semmit nem mond az enzim azon képességéről, hogy preferálva köti-e ezeket vagy más peptid-származékokat egymáshoz.

Bemutattuk, hogy glicinnel nyújtott alfa-melanocita stimuláló hormon, szubsztancia-P, vazopresszin analógok és növekedési hormont felszabadító faktor nagy affinitással reagálnak az amidáló enzimmel, megakadályozván azt, hogy metabolizálja a danzil-L-Tyr-ValGly-t. Továbbá olyan pentapeptid jellegű vegyületek, amelyek megfelelnek a glicinnel meghosszabbított humán kalcitonin, neuropeptid Y, kolecisztokinin, kortikotrofin felszabadító faktor és kalcitonin génhez kötött peptid öt C-terminális aminosav maradékának, e vizsgálatban kompetíciót mutatnak. Más szóval, az enzimnek megvan az a képessége, hogy megkösse és feltehetőleg amidálja mindezen glicinnel meghosszabbított peptid szubsztrátumokat.

Ezzel ellentétben, amikor az ezen szubsztrátumoknak megfelelő' amidált peptideket vizsgáltuk, azt találtuk, hogy azok sokkal kevésbé képesek reakcióba lépni az enzimmel. Ezen enzim aktív centrumának azon képessége, hogy a glicinnel meghosszabbított szubsztrátumok széles körét felismeri, különösen hasznos, általános reagenssé teheti a rekombináns DNS-technológiával generált peptid prohormonok ipari léptékű amidálására.

10. példa

A III jelölésű csúcs alfa-amidáló enzimet kódoló

DNS-szekvencia izolálása

RNS-eló'állítás:

Patkány MTC szövetekből teljes RNS-t készítettünk a guanidin tiocianátos módszerrel. Poli A RNS-t szelektáltunk oligo dT cellulóz segítségével.

cDNS-szintézis:

Kettős szálú cDNS-t készítettünk jól ismert módszerekkel. A patkány MTC szövetből származó poli A RNS-t használva templátként és oligo dT₁₂.₁₈-at printerként, az első szál szintézisét enzimes reakcióval végeztük reverz transzkriptázzal. A cDNS-t és az RNS-t elkülönítettük és az RNS-t lúggal degradáltuk. A második szál cDNS-szintézise önmagától indult be

E. coli DNS polimeráz I. alkalmazásával. SÍ nukleáz kezelést alkalmaztunk a hajtűhurkok eltávolítására a cDNS-ben és a cDNS bármely egyes szálú szakaszának lebontására. A DNS polimeráz I-gyel való reakció után a célból, hogy a cDNS-en nyitott végeket képezzünk, a kettős szálú cDNS-t EcoRI metilázzal és s-adenozil-metionin-nal kezeltük az EcoRI helyek metilezése, és azok későbbi enzimatikus hasításának megakadályozása céljából. A cDNS-hez EcoRI linkereket kapcsoltunk. Az EcoRI kezelést követően, a fölösleges linkereket a cDNS-től elkülönítettük és a cDNS-t egy Sepharose 4B oszlopon méret szerint frakcionáltuk. Az egyik ilyen szintézis során 500 bázispárnál nagyobb molekulákat gyűjtöttünk, míg egy másikban 1000 bázispárnál nagyobbakat gyűjtöttünk klónozás céljából.

kgt 11 cDNS-könyvtár készítése:

A linker által összeillesztett kétszálas cDNS szintézisét követően, a molekulákat cDNS-könyvtárak generálására használtuk az Xgt 11 vektorban. Ezt úgy értük el, hogy a cDNS-t olyan Xgt 11 DNS-hez kötöttük, amelyet EcoRI-el hasítottunk, és a vektor önmagával való kapcsolódása megelőzésére foszfatázzal kezeltünk. A DNS-ek kötése után a rekombináns DNS-eket in vitro pakoltuk, hogy fertőző bakteriofág részecskéket készítsünk. (A pakolás céljaira szolgáló kivonatok a kereskedelemben kaphatók a Promega Biotech-nél, vagy a Clontech Laboratories cégnél, vagy ismert módszerekkel előállíthatók.)

A DNS pakolása után, a pakoló elegy aliquotjait vizsgálatuk a könyvtárakban lévő rekombinánsok számának meghatározására. Úgy találtuk, hogy az egyik könyvtár mintegy 2,57 x 10⁶ fertőzött részecskét tartalmazott, azok mintegy 78%-a rekombinánsnak látszott (X-Gal lemezeken világos plakkokat adva, ha IPTG jelenlétében lettek növesztve). A másik könyvtárban mintegy 27,75 x 10⁶ foltképző egységet találtunk öszszesen, és mintegy 81% tűnt rekombinánsnak.

Könyvtár szkrínelés:

Annak érdekében, hogy azonosítsuk, hogy melyik rekombináns bakteriofág tartalmazott cDNS-t az alfaamidáló enzim proteinhez, a fágokat az alfa-amidáló enzim specifikus aminosav-szekvenciái alapján tervezett radiojelzett oligonukleotid próbákkal vizsgáltuk (ld. 7. példa, II. TÁBLÁZAT). A vizsgálat során a bakteriofág mintákat lemezen tenyésztettünk és a fágokat nitrocellulóz szűrőlapokra vittük át. A fágok immobilizálása nitrocellulóz szűrőkön általánosságban ismert. Mindegyik lemezről két szűrőlap lett hibridizálva ³²P-jelzett oligonukleotid AE9-cel. A hibiridázációt 37 °C-on végeztük, 20-24 órán át 6 x NET, 0,5% NP40, 5 x Denhardt-féle oldatban, 100 μ g/ml lazac sperma DNS és 0,3-0,4 pmol/ml oligonukleotid próbával. A hibridizáció után a szűrőket a 6 x SSC-vel mostuk 4445 C°-on, több órán át, és azokról röntgen filmfelvétel készült. A pozitívan hibridizálódott fágok a két szűrőn egybeeső pontként mutatkoztak. Ezeket tisztítottuk úgy, hogy több ciklusban megismételtük a lemezelést és hibridizálást. Kb. 4-5 x 10⁴ megvizsgált fágból, 18 volt azonosítható AE9-cel.

Hogy biztosak legyünk a kiválasztás specifitásában, egy második alfa-amidáló enzim oligonukleotiddal, AE8-cal is elvégeztük a hibridizációt. Ez a vizsgálat kimutatta, hogy az említett 18 fágból legalább négy az alfa-amidáló enzim fehérje szekvenciát kódoló cDNS-t hordozott. Ezt további specifikus oligonukleotid hibiridizációval (AE4-gyel és AE5-tel), valamint DNS-szekvencia analízissel igazoltuk.

HU 212 071 A9

Az alfa-amidáló enzim expressziója:

Az III ocAE peak, melynek fehérje-szekvenciáit meghatároztuk, kb. 75 000 dalton molekulasúlyú. Ha egy aminosav átlag molekulasúlyát 120 daltonnak vesszük, akkor az amidáló enzimnek legfeljebb 625 5 aminosava van. 625 aminosav génjének legalább 1875 bázispárjának kell lennie. Mind a négy cDNS, melyeket alfa-amidáló enzimre specifikusként izoláltunk, elegendó'en nagy ahhoz, hogy a teljes alfa-amidáló enzim fehérjét kódolja. A cDNS kiónok egyike a 10 λΑΕΙ, közelító'en 2200 nukleotid hosszúságú. Egyik végétód az elsó' 50 nukleotidon belül elkezdi a kódolást azon aminosav-szekvenciákra, amelyeket a III enzim peak aminoterminálisaként azonosítottunk. Ebbód az következtethető, hogy ez a cDNS tartalmazza a III 15 peak enzimhez szükséges teljes kódoló kapacitást. Ezen adott információ és a 2200 bp cDNS végein lévő nukleotid-szekvenciák segítségével viszonylag egyszerű művelet a cDNS alkalmassá tétele az expresszióra egy prokarióta gazdában, mint pl. E. coli-ban. 20

Egy, a λΑΕΙ cDNS-nél alkalmazható lehetséges megoldás látható a XXII. ábrán. Például a λΑΕΙ által hordozott 2200 bázispárnyi cDNS-t a rekombináns bakteriofág DNS EcoRI enzimes kezelését és agar óz gél elektroforézisét követó'en izoláltunk. Ezt EcoRI- 25 ba, pBR322 helyére klónoztuk, a pAE8-l plazmid létrehozására. A pAEB-1 a cDNS szekvenciákon belül egyetlen KpnI hasító hellyel rendelkezik és egyetlen HindlII hellyel a pBR322 szekvenciákon belül. A pAE8-l kezelése KpnI-gyel és HindlII-mal, egy 30 mintegy 2,15 kb-s töredéket eredményez, amely kb.

cDNS bázispárt veszített (a cDNS aminoterminálist kódoló végén). A III peak amidáló enzim amino terminálisán található aminosavak visszaépítése céljából, továbbá a cDNS-nek egy expressziós plazmid- 35 ba való klónozása céljából, a KpnI-HindlII-végű töredéket egy oligonukleotid linker adapterhez kötjük. A bemutatott példában a Pharmacia cégtód vásárolt pKK233-2 E. coli expressziós plazmidot használtuk. A 2,15 kb cDNS töredéket kettó's szálú linker-adapterhez kötöttük, amely a következőkből áll:

AE17(+)30⁵’CATGTCAITITCCAATGAATGCCTTGGTAC³ és

AE18(-)22⁵’ C AAGGCATTCATTGGA AAATGA³'

A linkerrel kapcsolt töredéket azután a pKK233-2 DNS-hez kötöttük, amely eló'zetesen Ncol-gyel és HindlII-mal lett hasítva, hogy 4,6 kb-s lineáris vektort adjon. A ligáit termék, pAE12, az alfa-amidáló enzimet kódoló cDNS-t tartalmazza, elódte egy ATG start kódon és egy riboszóma kötési hely van, valamint egy hibrid, IPTG-vel indukálható promoter, trc ellenó'rzése alatt. A gént egy 5S RNS gén és egy transzkripciós terminációs hely követi. A plazmid DNS-t laci^q genotípusé E. coli törzsbe történő' transzformációját követó'en a pAE12 expressziója 1PTG indukálhatóvá válik.

A 1AE1 2,2 kb cDNS inszertumának részleges

DNS-szekvenciája

A 2,2 kb-s hosszúságú darabot a λ-AEl EcoRIgyel történő' kezelésével kivágtuk, és az inszertumot ³²P-vel jelzetté tettük. Hinc II-vel történő' másodlagos kezelés után a kapott 1,6 kb-s és 0,6 kb-s fragmenteket Maxam és Gilbert-féle kémiai lebontásos módszerrel szekvenáltuk.

A λΑΕ-1 600 bp-s fragmentjének Maxam-Gilbert szekvenálással kapott DNS-szekvenciája az Eco RÍ végtód:

v v v v 50v

AATTCCGGTCTTTAAGAGGTTTAAAGAAACTACCAGATCATTTTCCAATG v v v v lOOv

AATGCCTTGGTACCATTGGACCAGTCACCCCTCTTGATGCATCAGATTTT v v v v 150v

GCGCTGGATATTCGCATGCCTGGGGTTACACCTAAAGAGTCTGACACATA v v v v 200v

CTTTCTGCACGTCCATGCGTCTACCT

A λΑΕ-1 1660 bp-s fragmentjének Maxam-Gilbert szekvenálással kapott DNS-szekvenciája az Eco RÍ végtől: v v v v 50v

AATTCCGTCTCAGTTTCTGTTTCTCTTGCATCTTCTGCAATTCTGAGGAG v v v v lOOv

GTGGGTTTGTTCTCCACTTTGGGTTCGACAACTGCCTCGGCTTCTTTGAT v v v v 150v

TTCGTGGACTTCGATGCCAGCCTTTTTAACTGACGCATGCTCCATTTTTT v v v v 200v

CGGTCAGGGTGAACTTCCACACGGTGTTGTGTGTGCGCTCGAAGACCG

Szekvencia-homológiai vizsgálat az AE8(-)22 oligonukleotid próbához

Komputer vizsgálat történt az AE-8 próba kialakításához alkalmazott aminosavak (Leu-Gly-Thr-IleGly-Pro-Val-Thr) és a λΑΕΙ 600 bp-s fragmensének 60 részleges DNS-szekvenciája közötti homológiára vonatkozólag.

Tökéletes homológiai tartományt kaptunk és ezt a tartományt a DNS-szekvenciában csillagokkal jelöltük, az aminosavakat pedig nagybetűkkel. A tisztított

HU 212 071 A9 amidáló enzim NH2-terminálisú szekvenálásával felismert aminosavakat zárójelbe tettük. Azokat az aminosavakat, amelyekróT azt találtuk, hogy különböznek azoktól, amelyeket a DNS-szekvencia jósolt, „+’ jellel jelöltük.

AATTCCGGTCTTTAAGAGGTTTAAAGAAACTACCAGATCATTTTCCAATG ----’-----1-----’-----1-----’-----1-----’-----1----’-----1- 50 ip vf k r fk e t t r(sf sn e

AATGCCTTGGTACCATTGGACCAGTCACCCCTCTTGATGCATCAGATTTT ----’----+----’----_h----’----_h----’----_h----’----+ 100 cLGTIGPVTp ldasdf + +

GCGCTGGATATTCGCATGCCTGGGGTTACACCTAAAGAGTCTGACACATA

----’----+----’----+----’----+----’----+----’----+ 150 a ldi rmpjqvtpkes dty +

CTTTCTGCACGTCCATGCGTCTACCT

----’----+----’---+---176 flhv hast.

11. példa

Enzim immobilizálás

Az α-AE tisztítása:

Rögzítés előtt az alfa-amidáló enzimet gyenge-ani- 25 oncseréló's és gélszüréses kromatográfiával tisztítottuk (4. példa). Egyes esetekben az enzimkészítmény tovább tisztítható akár immun-affinitásos, akár szefarózos kromatográfia alkalmazásával. Az ezt követő immobilizálási eljárás független a tisztítási módszertóT, 30 mégis célszerű, hogy a specifikus aktivitás legalább 25 mU, célszerűen 50 mU vagy még magasabb legyen.

Az α-AE immobilizálása:

Az alfa-amidáló enzim immobilizálásának technológiája három komponens egyidejű reakcióján alapul- 35 hat, az enzim, egy vízoldható akrilamid kopolimer (PAN), és egy kis molekulasúlyú térhálósító szer (TÉT). Az előre készített polimer (PAN) akrilamidból és N-akriloxi-szukcinimidbóT áll, amelyet THF oldatban polimerizáltunk, azobis-szel hőiniciálva. A térháló- 40 sító reagens lehet: α,ω-diamin, trietilén-tetramin (TÉT), cisztamin. A diamin és a PAN aktív észter-csoportjainak reakciója egy amid-kötéssel térhálósítja a polimerláncokat és oldhatatlan gélt képez. Ugyanakkor az enzim amino funkciói (célszerűen a lizin ε-amino- 45 csoportja) reagál a gélen maradt aktív észterekkel és stabil kovalens amid-kötéseket képez. Az immobilizálási folyamatot szubsztrátum és ko-faktorok jelenlétében végezzük. Egy nagy affinitású szubsztrátum és Km-nél nagyobb koncentrációjú ko-faktorok jelenléte 50 gátolják a PAN aktív észterek és a nukleofil csoportok közötti reakciót az enzim katalitikus részén vagy annak közelében, ily módon védve az enzimet a kémiai inaktivitástól.

Az immobilizálás feltételei: 55

Részlegesen tisztított α-ΑΕ-et feloldunk 7,0 pHjú 3 mM HEPES pufferben. A PAN és a TÉT arányát úgy választjuk meg, hogy az aktív észterek 15%-a reagálatlan maradjon, ami az alfa-amidáló enzim kötési helyeiként funkcionál. A standard PAN oldat 20 60 t-os (w/w). Az alfa-amidáló enzim reakciókeverék a következőkből áll: 0,2 μΜ CuSO₄, 40 μΜ danzil His-Phe-Gly és 10 mM aszkorbát, valamint 0,5-2,0 mg α-ΑΕ/gramm PAN. A TÉT koncentrációja úgy van számítva, hogy megfeleljen 0,85 ekvivalens primer amin/ekvivalens észternek. Rutinszerűen, az optimális feltételek megállapítására egy enzim nélküli reakciót játszatunk le a gél-idő megállapítására, amely idő szükséges a TÉT adagolásától a gélképződésig. Az alfa-amidáló enzim immobilizálás optimális hatásfokát akkor érjük el, ha az enzim adagolása időpontját a gél ponthoz közelebb hozzuk. Az az általános szabály, hogy minél rövidebb az az idő, amíg az enzim a PAN-nal reagál a gél képződése előtt, annál nagyobb az aktív immobilizált enzim hozama. A legtöbb reakció esetében az alfa-amidáló enzimet (kb. 2,0 mg/g PAN) 45-60 másodperccel a TÉT adagolása után adjuk a reakciókeverékhez. Az enzimtartalmú gélt mintegy egy óra hosszat állni hagyjuk szobahőmérsékleten, hogy a kapcsolódási reakció befejeződjék. 60 perc eltelte után a gélt mozsárban mozsártörővei átlagosan 100 μπι szemcseméretű részecskékké aprítjuk. E részecskéket a meg nem kötött reagensek eltávolítása és a maradék aktív észter-csoportok amiddá való átalakítása érdekében ammónium-szulfáttal mossuk, ezzel mintegy rögzítve a reaktív csoportokat. Az immobilizálást követően az aktív alfa-amidáló enzim hozama várhatóan 60% alatti. A megkötés utáni mosófolyadékok a kiindulási aktivitás 30-40%-át tartalmazhatják. Az alfa-amidáló enzim e mosófolyadékokból az ammóniumszulfát koncentrációnak 45%-ra történő növelésével visszanyerhető, ami az aktív alfa-amidáló enzim kicsapódását eredményezi.

Az immobilizált gélrészecskék alkalmasak szakaszos alfa-amidáló reakciókra, ahol a részecskéket mechanikus keverővei szuszpenzióban tartjuk. Az enzimatikus reakció lejátszódása után a részecskéket ülepedni hagyjuk és az amidált peptid terméket tartalmazó

HU 212 071 A9 felülúszót dekantáljuk. Ez az eljárás azonban nem optimális nagyobb léptékű reakciókhoz. Az enzimtartalmú gélrészecskék nem elég szilárdak ahhoz, hogy oszlopba töltsük és kielégítő' átfolyási sebességeket kapjunk. E probléma megkerülésére két alternatív megközelítés lehetséges:

1. A gélt üvegszemcsék jelenlétében polimerizálódni hagyjuk; jellegzetesen, egy perccel a gél-pont előtt, a reakciókeverékhez üvegszemcséket adagolunk, és mechanikus keverővei addig keverjük, amíg e szemcsék a PAN oldatból származó réteggel vonódnak be. Ennek az összetett anyagnak az áramlási karakterisztikái sokkal jobbak, mint a gélszemcséknek külön.

2. Alternatív módon a PAN részecskéket Celite 545 szűrési segédanyaggal keverjük össze. Egy jellegzetesen PAN és Celite keverékben kevesebb, mint 8% w/w (száraz súly) PAN van. Ezen típusú oszlop készítésére a gélrészecskéket 50 mM Tris HCl-ben, pH 7,0 szuszpendáljuk, állandó keverés közben hozzáadjuk a Celite 545-t, és két óra hosszat kevertetjük. Egy oszlopot (3 x 40 cm) ezen szuszpenzióval megtöltünk, és az oszlop hőmérsékletét 37 °C-on tartjuk az amidálási reakció elősegítésére. Ezen megközelítéssel 8-10 liter/nap átfolyási sebesség tartható fenn.

Az oszlopkromatográfiának vonzó alternatívája a tangenciális átfolyási rendszer alkalmazása. A PAN polimert, gél-pontja előtt, egy 0,45 μιη-es pórustartó poliszulfon lemezre öntjük. A gélképződés után e lemezeket feldaraboljuk, hogy beleférjenek a Millipore vagy New Brunswick tangenciális áramlásé ultraszürő egységekbe. Ebbe a kivitelbe az összetett poliszulfon PAN-nal immobilizált enzim gél lemezek rétegekben kerülnek berakásra és ily módon a felület rendkívüli módon megnövekszik. Ez a módszer az áramlási sebesség növelésére is irányulhat, a több liter/perc nagyságrendet is elérheti. Az ilyen típusú rendszer megfelelő módszert jelent a reakcióelegy visszanyerésére és a peptid szubsztrát amidálásának maximalizálására.

Az alfa-amidáló enzim immobilizálás előnye az enzim visszanyerése és újra felhasználása is. Másrészt az immobilizálás növeli az enzim stabilitását és lehetővé teszi az enzim alkalmazását nagy volumenű amidálási reakciókban is (g-kg szubsztrát mennyiségekhez) hosszabb időszakon át.

talmazó 100 mM pH 8,3 NaHCO₃ ellenében. A kapcsolást az előzetesen megduzzasztott és mosott szilárd hordozó 8 ml-ének alkalmazásával végeztük el. A reakciót három órán keresztül játszattuk le, szobahőmérsékleten, 500 mM NaCl tartalmú 100 mM pH 8,3-as nátrium-bikarbonát pufferben, ami arra szolgált, hogy csökkentse a fehérjének a szilárd hordozóhoz történő nem specifikus kötését. A gél maradék aktív csoportjait 0,2 M glicin alkalmazásával megkötöttük. A megkötési lépést követően a gélt négyszerötször felváltva mostuk magas és alacsony pH-jú pufferekkel (a magas pH-jú puffer 100 mM NaHCO₃ pH 8,3 + 500 mM NaCl, az alacsony pH-jú puffer 100 mM acetát pH 4,0 + 500 mM NaCl). Ezek a mosási lépések minden meg nem kötött fehérjét és blokkoló reagenst (glicin) eltávolítottak a gyantáról. Az immunaffinitásos gyantát 4 °C-on tároltuk, bakteriosztatikus szerként mertiolátot tartalmazó, bázikus pH-jú pufferben. Minden ezt követő immunaffinitásos kromatográfiát 4 °C-on végeztünk. Hasonló módszer alkalmazható a tisztított monoklonális antitestek immobilizálására is.

B. Immunaffinitásos kromatográfia:

Az immunaffinitásos oszlopot az α-AE tisztítása során alternatív, nagy hatékonyságú lépésként használjuk. CA-77 sejtekből (ld. 4. példa) származó szövettenyészet tápközegét desztillált vízzel hígítjuk, és előzetesen 20 mM 6,0 pH-jú Bis Tris HCl-lel kiegyenlített DEAE anioncserélő tölteten szivattyúzzuk át. Az alfa-amidáló enzimet a töltetről 500 mM NaCl tartalmú pH 7,0, 50 mM Tris HCl-el eluáljuk. Az α-AE aktivitást tartalmazó frakciókat az immunaffinitásos kromatográfiát megeló'zó'en vagy 50 mM pH 7,0-s Tris HCl pufferrel dializáljuk, vagy gélszüréses kromatográfiával (4. példa) tovább tisztítjuk. Az α-AE tartalmú mintákat az immunaffinitásos oszlopon semleges pH-nál engedjük át. Az antitestek az alfaamidáló enzimet specifikusan megkötik, míg a szennyező proteinek nem kötődnek meg, és az eluenssel eltávoznak. Az alfa-amidáló enzim aktivitás az oszlopról 100 mM glicin : HCl pH 3,0-as pufferrel euálható (más deszorpciós szerek is alkalmazhatóak, köztük urea, dioxán, etilén-glikol és NaJ). A frakciókat pH 7,0-es 1,0 M Tris:HCl-ben gyűjtjük, hogy az semlegesítse a pufferrendszert, és ezáltal megóvja az α-AE aktivitást.

12. példa

Immunoaffinitás oszlop készítése a szennyezett alfa-amidáló enzimkészítmények tisztítására A. Immobilizálási eljárás

Az alkalmazott immobilizáló ágy ciánbromiddalaktivált Sepharose 4B (Pharmacia) volt. A száraz gélt először 1 mM HCl-lel (200 ml/g gyanta) mostuk, annak megduzzasztására és a szilárd hordozó mosására. Mintegy 40 mg csirke tojás sárgájából tisztított poliklonális antitestet dializáltunk 0,5 M NaCl-ot tar-

Claims (10)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás alfa-amidáló enzimkészítmények előállítására azzal jellemezve, hogy valamely alfa-amidáló enzim kódolására alkalmas DNS-szekvenciát választunk, az említett DNS-szekvenciát expressziós vektorba kötjük, az expressziós vektort az említett DNS-szekvencia expressziójára képes gazdasejtbe visszük be és végül adott esetben a DNS-szekvenciát tartalmazó és expresszáló gazdasejteket szelektáljuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve,

   HU 212 071 A9 hogy az említett DNS-szekvenciák legalább részben az ismert alfa-amidáló enzimet expresszálni képes sejt teljes RNS-éből poliadeninált RNS-ekbód származó cDNS-ek, és a fenti cDNS-t az alfa-amidáló enzimben jelenlevő aminosav bázisszekvencia kódolására képes specifikus oligonukleotid próbákkal történő azonosítást követően szelektíven izoláljuk.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az emb'tett DNS-szekvenciának legalább egy, az

   5 alábbi összetételű csoportból szelektált fragmense:

   (a) v v v v 50v

   AATTCCGGTCTTTAAGAGGTTTAAAGAAACTACCAGATCATTTTCCAATG v v v v lOOv

   AATGCCTTGGTACCATTGGACCAGTCACCCCTCTTGATGCATCAGATTTT v v v v 150v

   GCGCTGGATATTCGCATGCCTGGGGTTACACCTAAAGAGTCTGACACATA v v v v 200v

   CTTTCTGCACGTCCATGCGTCTACCT, (b) v v v v 50v

   AATTCCGTCTCAGTTTCTGTTTCTCTTGCATCTTCTGCAATTCTGAGGAG v v v v lOOv

   GTGGGTTTGTTCTCCACTTTGGGTTCGACAACTGCCTCGGCTTCTTTGAT v v v v 150v

   TTCGTGGACTTCGATGCCAGCCTTTTTAACTGACCGATGCTCCATTTTTT v v v v 200v

   CGGTCAGGGTGAACTTCCACACGGTGTTGTGTGTGCGCTCGAAGACCG .

   and
4. 4. Genetikai úton előállított mikroorganizmus, amely legalább egy, az 1., 2. vagy 3. igénypontban ismertetett eljárás szerinti előnyösen szelektált gazdasejtet tartalmaz.
5. 5. Peptid szubsztrátnak peptid amiddá történő konverzióját katalizáló alfa-amidáló enzimet kódoló DNSszekvenciát tartalmazó expressziós vektorral transzformáit vagy transzfektált gazdasejt.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti gazdasejt azzal jellemezve, hogy az említett gazdasejt jól oldódó peptidil-glicin alfa-amidáló monooxigenázt („PAM”) expresszál.
7. 7. Az 5. igénypont szerinti gazdasejt azzal jellemez30 ve, hogy az említett gazdasejt emlő peptidil-glicin alfaamidáló monooxigenázt („PAM”) expresszál.
8. 8. Az 5. igénypont szerinti gazdasejt azzal jellemezve, hogy az említett 60 000 és 65 000 dalton közötti molekulasúlyú (gélfiltrációval meghatározva) patkány peptidil-glicin alfa-amidáló monooxigenázt expresszál.
9. 9. Eljárás alfa-amidáló enzim előállítására, amelyet alapvetően a 6., 7. vagy 10. példákkal és a XXII. és XXIII. ábrákkal definiáltunk.
10. 10. Az 5. igénypont szerinti gazdasejt, amelyet alapvetően a 6., 7. vagy 10. példákkal és a XXII. vagy XXIII. ábrákkal definiáltunk.