JP3214106B2 - 新規なタンパク質 - Google Patents
新規なタンパク質Info
- Publication number
- JP3214106B2 JP3214106B2 JP29613392A JP29613392A JP3214106B2 JP 3214106 B2 JP3214106 B2 JP 3214106B2 JP 29613392 A JP29613392 A JP 29613392A JP 29613392 A JP29613392 A JP 29613392A JP 3214106 B2 JP3214106 B2 JP 3214106B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- protein
- buffer
- acid sequence
- daltons
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規なタンパク質に関
し、詳細には肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を特定の位置で
切断し、１本鎖型から２本鎖型へ変換させるプロテアー
ゼ活性を有するタンパク質の前駆体に関する。
し、詳細には肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を特定の位置で
切断し、１本鎖型から２本鎖型へ変換させるプロテアー
ゼ活性を有するタンパク質の前駆体に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ヒト
ＨＧＦ（ｈＨＧＦ）の生理活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実
験において１本鎖ではみられず、２本鎖になった場合に
発現することが知られている。本願発明者らは先に、哺
乳動物の血清中には１本鎖ｈＨＧＦを２本鎖ｈＨＧＦに
切断するプロテアーゼが存在し、このプロテアーゼは、
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量
が約３４，０００ダルトンの新規のタンパク質であるこ
とを見出した（特願平３−２７１３６２号）。当プロテ
アーゼは、血清中でのみ活性型として検出されるため、
当プロテアーゼを精製するには血液から血清の調製が必
要とされる。血清の調製は手間がかかり、均一標品を得
るのが困難という問題がある。また、活性型のプロテア
ーゼの血清中での安定性にも問題がある。
ＨＧＦ（ｈＨＧＦ）の生理活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実
験において１本鎖ではみられず、２本鎖になった場合に
発現することが知られている。本願発明者らは先に、哺
乳動物の血清中には１本鎖ｈＨＧＦを２本鎖ｈＨＧＦに
切断するプロテアーゼが存在し、このプロテアーゼは、
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量
が約３４，０００ダルトンの新規のタンパク質であるこ
とを見出した（特願平３−２７１３６２号）。当プロテ
アーゼは、血清中でのみ活性型として検出されるため、
当プロテアーゼを精製するには血液から血清の調製が必
要とされる。血清の調製は手間がかかり、均一標品を得
るのが困難という問題がある。また、活性型のプロテア
ーゼの血清中での安定性にも問題がある。
【０００３】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、１本鎖ｈ
ＨＧＦを活性型の２本鎖ｈＨＧＦに変換するヒト血清中
のプロテアーゼを、前駆体としてヒト血しょうから精製
することを試みた。その結果、ヒト血清中の活性型プロ
テアーゼに対するマウス抗体と反応し、ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動による分子量が約３４，００
０ダルトンと約９６，０００ダルトンの二つの新規なタ
ンパク質を見出し、そして同タンパク質をスロンビンで
処理することにより特願平３−２７１３６２号記載のタ
ンパク質と同様の活性を有するようになることを初めて
見出し、本発明を完成するに至った。
ＨＧＦを活性型の２本鎖ｈＨＧＦに変換するヒト血清中
のプロテアーゼを、前駆体としてヒト血しょうから精製
することを試みた。その結果、ヒト血清中の活性型プロ
テアーゼに対するマウス抗体と反応し、ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動による分子量が約３４，００
０ダルトンと約９６，０００ダルトンの二つの新規なタ
ンパク質を見出し、そして同タンパク質をスロンビンで
処理することにより特願平３−２７１３６２号記載のタ
ンパク質と同様の活性を有するようになることを初めて
見出し、本発明を完成するに至った。
【０００４】即ち、本発明の第１の要旨は、下記の理化
学的性質を有することを特徴とするヒト血しょう由来の
新規な前駆体タンパク質に存する。 （ｉ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による
分子量が約９６，０００ダルトンである。 （ii）スロンビンで処理することにより、７２８アミノ
酸残基より成る１本鎖型ヒト肝細胞増殖因子をそのアミ
ノ末端から４９４番目のアミノ酸であるアルギニンと４
９５番目のアミノ酸であるバリンとの間で特異的に切断
して活性型の２本鎖型ヒト肝細胞増殖因子に変換するプ
ロテアーゼ活性を有するようになる。（iii）部分アミノ酸配列として配列表の配列番号１に
記載のアミノ酸配列を有する。本発明の第２の要旨は、
下記の理化学的性質を有することを特徴とするヒト血し
ょう由来の新規な前駆体タンパク質に存する。 （ ｉ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による
分子量が約３４，０００ダルトンである。 （ii）スロンビンで処理することにより、７２８アミノ
酸残基より成る１本鎖型ヒト肝細胞増殖因子をそのアミ
ノ末端から４９４番目のアミノ酸であるアルギニンと４
９５番目のアミノ酸であるバリンとの間で特異的に切断
して活性型の２本鎖型ヒト肝細胞増殖因子に変換するプ
ロテアーゼ活性を有するようになる。 （iii）部分アミノ酸配列として配列表の配列番号１に
記載のアミノ酸配列を有する。
学的性質を有することを特徴とするヒト血しょう由来の
新規な前駆体タンパク質に存する。 （ｉ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による
分子量が約９６，０００ダルトンである。 （ii）スロンビンで処理することにより、７２８アミノ
酸残基より成る１本鎖型ヒト肝細胞増殖因子をそのアミ
ノ末端から４９４番目のアミノ酸であるアルギニンと４
９５番目のアミノ酸であるバリンとの間で特異的に切断
して活性型の２本鎖型ヒト肝細胞増殖因子に変換するプ
ロテアーゼ活性を有するようになる。（iii）部分アミノ酸配列として配列表の配列番号１に
記載のアミノ酸配列を有する。本発明の第２の要旨は、
下記の理化学的性質を有することを特徴とするヒト血し
ょう由来の新規な前駆体タンパク質に存する。 （ ｉ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による
分子量が約３４，０００ダルトンである。 （ii）スロンビンで処理することにより、７２８アミノ
酸残基より成る１本鎖型ヒト肝細胞増殖因子をそのアミ
ノ末端から４９４番目のアミノ酸であるアルギニンと４
９５番目のアミノ酸であるバリンとの間で特異的に切断
して活性型の２本鎖型ヒト肝細胞増殖因子に変換するプ
ロテアーゼ活性を有するようになる。 （iii）部分アミノ酸配列として配列表の配列番号１に
記載のアミノ酸配列を有する。
【０００５】本発明をさらに詳細に説明するに、本発明
の新規なタンパク質は以下のような精製段階を経ること
により得られる。分子量が約９６，０００ダルトンのタ
ンパク質の場合、例えば健常人より採血した血液に凝固
系の作用を止めるため、エチレンジアミン４酢酸塩（Ｅ
ＤＴＡ）、ベンズアミジン、ε−アミノカプロン酸ヘキ
シルエステル、ダイズトリプシンインヒビター、６−ア
ミジノ−２−ナフチルｐ−グアニジノベンゾエート ジ
メタンスルフォネート（メシル酸ナファモスタット）、
アプロチニン等を適量添加し、細胞を遠心分離により除
去した血しょうを材料とする。この血しょうを水で２〜
５倍に希釈後、Ｈｅｐａｒｉｎ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカ
ラム（ファルマシア社製等）等に供する。そのカラムク
ロマトグラフィーにより得られた当該タンパク質を含む
フラクションを疎水クロマトグラフィー（例えば、ファ
ルマシア社製Ｐｈｅｎｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム
等）にかける。得られた当該タンパク質を含むフラクシ
ョンを抗体アフィニティークロマトグラフィー（特願平
３−２７１３６２号記載の新規なヒト由来のタンパク質
を、常法にしたがってマウスに免疫し、そのひ臓細胞と
ミエローマ細胞を常法に従って細胞融合し、免疫したタ
ンパク質と反応する抗体を産生するハイブリドーマを得
る。そのハイブリドーマの産生する抗体を常法に従って
適当な樹脂に固定して、抗体アフィニティーカラムを作
成する。）に供し、本タンパク質を得ることができる。
の新規なタンパク質は以下のような精製段階を経ること
により得られる。分子量が約９６，０００ダルトンのタ
ンパク質の場合、例えば健常人より採血した血液に凝固
系の作用を止めるため、エチレンジアミン４酢酸塩（Ｅ
ＤＴＡ）、ベンズアミジン、ε−アミノカプロン酸ヘキ
シルエステル、ダイズトリプシンインヒビター、６−ア
ミジノ−２−ナフチルｐ−グアニジノベンゾエート ジ
メタンスルフォネート（メシル酸ナファモスタット）、
アプロチニン等を適量添加し、細胞を遠心分離により除
去した血しょうを材料とする。この血しょうを水で２〜
５倍に希釈後、Ｈｅｐａｒｉｎ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカ
ラム（ファルマシア社製等）等に供する。そのカラムク
ロマトグラフィーにより得られた当該タンパク質を含む
フラクションを疎水クロマトグラフィー（例えば、ファ
ルマシア社製Ｐｈｅｎｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム
等）にかける。得られた当該タンパク質を含むフラクシ
ョンを抗体アフィニティークロマトグラフィー（特願平
３−２７１３６２号記載の新規なヒト由来のタンパク質
を、常法にしたがってマウスに免疫し、そのひ臓細胞と
ミエローマ細胞を常法に従って細胞融合し、免疫したタ
ンパク質と反応する抗体を産生するハイブリドーマを得
る。そのハイブリドーマの産生する抗体を常法に従って
適当な樹脂に固定して、抗体アフィニティーカラムを作
成する。）に供し、本タンパク質を得ることができる。
【０００６】分子量が約３４，０００ダルトンのタンパ
ク質の場合、例えば健常人より採血した血液にＥＤＴ
Ａ、ε−アミノカプロン酸ヘキシルエステル等を適量添
加した血しょうを材料とする。この血しょうを上記と同
様にＨｅｐａｒｉｎ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム等に供
する。そのカラムクロマトグラフィーより得られた当該
タンパク質を含むフラクションを上記と同様に疎水クロ
マトグラフィー等にかける。得られた当該タンパク質を
含むフラクションを例えば、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ固定化
アフィニティーカラム（ペンタファーム社製等）に供
し、その素通り画分を上記した抗体アファニティーカラ
ムに供し、本タンパク質を得ることができる。また本発
明のタンパク質は、いずれも必要に応じて、イオン交換
カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグ
ラフィー、ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラ
フィー等を精製のステップに組み込むこともできる。
ク質の場合、例えば健常人より採血した血液にＥＤＴ
Ａ、ε−アミノカプロン酸ヘキシルエステル等を適量添
加した血しょうを材料とする。この血しょうを上記と同
様にＨｅｐａｒｉｎ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム等に供
する。そのカラムクロマトグラフィーより得られた当該
タンパク質を含むフラクションを上記と同様に疎水クロ
マトグラフィー等にかける。得られた当該タンパク質を
含むフラクションを例えば、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ固定化
アフィニティーカラム（ペンタファーム社製等）に供
し、その素通り画分を上記した抗体アファニティーカラ
ムに供し、本タンパク質を得ることができる。また本発
明のタンパク質は、いずれも必要に応じて、イオン交換
カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグ
ラフィー、ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラ
フィー等を精製のステップに組み込むこともできる。
【０００７】精製された本発明のタンパク質はＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約９
６，０００ダルトンと約３４，０００ダルトンであり、
スロンビンで処理することで、特願平３−２７１３６２
号記載のヒト由来のタンパク質と同様の活性を有する。
また、本発明のタンパク質は配列表の配列番号：１に記
載のアミノ酸配列を部分アミノ酸配列として含む。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約９
６，０００ダルトンと約３４，０００ダルトンであり、
スロンビンで処理することで、特願平３−２７１３６２
号記載のヒト由来のタンパク質と同様の活性を有する。
また、本発明のタンパク質は配列表の配列番号：１に記
載のアミノ酸配列を部分アミノ酸配列として含む。
【０００８】
【発明の効果】本発明に係わるタンパク質は、１本鎖肝
細胞増殖因子（ＨＧＦ）を活性型の２本鎖ＨＧＦに変換
する能力を持つ特願平３−２７１３６２号に記載のヒト
由来のタンパク質の前駆体であるため、スロンビンで処
理することによって特願平３−２７１３６２号記載のタ
ンパク質と同様の活性を持つ。従って、ｉｎｖｉｖｏま
たはｉｎ ｖｉｔｏｒｏでのＨＧＦの活性の調節因子と
して使用される。
細胞増殖因子（ＨＧＦ）を活性型の２本鎖ＨＧＦに変換
する能力を持つ特願平３−２７１３６２号に記載のヒト
由来のタンパク質の前駆体であるため、スロンビンで処
理することによって特願平３−２７１３６２号記載のタ
ンパク質と同様の活性を持つ。従って、ｉｎｖｉｖｏま
たはｉｎ ｖｉｔｏｒｏでのＨＧＦの活性の調節因子と
して使用される。
【０００９】
【実施例】以下の実施例により、本発明をさらにより詳
細に説明するが、本発明は、その要旨を越えない限り、
以下の実施例によって限定されるものではない。 実施例１（分子量が約９６，０００ダルトンのタンパク
質の精製とアミノ酸配列解析） 終濃度として１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭベンズアミ
ジン（ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌ社製等）、５ｍ
Ｍε−アミノカプロン酸ヘキシルエステル（東京化成社
製等）、２ｍｇ／ｍｌダイズトリプシンインヒビター
（シグマ社製等）、５０ｍＭメシル酸ナファモスタット
（鳥居薬品社製等）、５００ＫＩＵ／ｍｌアプロチニン
（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ社製等）となる様に、健常人よ
り採血した血液とこれらを混和する。即座に、遠心分離
機にて細胞を除去して血しょうを得る。この血しょうを
水で３倍に希釈し、それをＨｅｐａｒｉｎ−ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅカラム（ファルマシア社製：緩衝液Ａ（１０ｍ
Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 −Ｎａ 2 ＨＰＯ4 バッファー、ｐＨ
７、５０ｍＭ ＮａＣｌ含）で平衡化されている）に添
加し、緩衝液Ａで洗浄後、この緩衝液Ａと緩衝液Ｂ（１
０ｍＭ ＮａＨ2 ＰＯ4 −Ｎａ2 ＨＰＯ4 バッファー、
ｐＨ７、７００ｍＭ ＮａＣｌ含）を用いて、ＮａＣｌ
濃度５０ｍＭから７００ｍＭの濃度勾配溶出を行った。
細に説明するが、本発明は、その要旨を越えない限り、
以下の実施例によって限定されるものではない。 実施例１（分子量が約９６，０００ダルトンのタンパク
質の精製とアミノ酸配列解析） 終濃度として１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭベンズアミ
ジン（ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌ社製等）、５ｍ
Ｍε−アミノカプロン酸ヘキシルエステル（東京化成社
製等）、２ｍｇ／ｍｌダイズトリプシンインヒビター
（シグマ社製等）、５０ｍＭメシル酸ナファモスタット
（鳥居薬品社製等）、５００ＫＩＵ／ｍｌアプロチニン
（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ社製等）となる様に、健常人よ
り採血した血液とこれらを混和する。即座に、遠心分離
機にて細胞を除去して血しょうを得る。この血しょうを
水で３倍に希釈し、それをＨｅｐａｒｉｎ−ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅカラム（ファルマシア社製：緩衝液Ａ（１０ｍ
Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 −Ｎａ 2 ＨＰＯ4 バッファー、ｐＨ
７、５０ｍＭ ＮａＣｌ含）で平衡化されている）に添
加し、緩衝液Ａで洗浄後、この緩衝液Ａと緩衝液Ｂ（１
０ｍＭ ＮａＨ2 ＰＯ4 −Ｎａ2 ＨＰＯ4 バッファー、
ｐＨ７、７００ｍＭ ＮａＣｌ含）を用いて、ＮａＣｌ
濃度５０ｍＭから７００ｍＭの濃度勾配溶出を行った。
【００１０】そして、実施例３に示すように、特願平３
−２７１３６２号に記載のヒト由来のタンパク質を常法
に従ってマウスに免疫し、そのひ臓細胞とミエローマ細
胞を常法に従って細胞融合して得られたハイブリドーマ
からの抗体を用いての抗原サンドイッチ型の酵素標識抗
体固相法（ＥＬＩＳＡ）にて、当タンパク質が存在する
画分（約１００ｍＭ−２５０ｍＭ ＮａＣｌ画分）を回
収した。この画分を、２Ｍ硫酸アンモニウムと当量混合
後、１Ｍ硫酸アンモニウムで平衡化されたＰｈｅｎｙｌ
−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ファルマシア社製）に添
加した。１Ｍ硫酸アンモニウムで洗浄後、硫酸アンモニ
ウム１Ｍから０Ｍへの負の濃度勾配溶出を行い、ＥＬＩ
ＳＡにて当タンパク質が存在する画分（約４００ｍＭ−
１００ｍＭ硫酸アンモニウム画分）を回収した。当画分
をアミコン限外濾過膜ＹＭ−３０にて濃縮し、緩衝液Ｃ
（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー、ｐＨ８、１
５０ｍＭ ＮａＣｌ含）に置換した。緩衝液Ｃで平衡化
した実施例３記載の抗体アフィニティーカラムに添加し
た。緩衝液Ｃで洗浄後、緩衝液Ｄ（５０ｍＭ Ｇｌｙｓ
ｉｎｅ／ＨＣｌバッファー、ｐＨ３）で溶出した。溶出
画分を集め、緩衝液Ｅ（１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ
８）で中和した。この標品を用いて以下に述べる、スロ
ンビンによる活性化とアミノ酸配列の解析並びにＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。
−２７１３６２号に記載のヒト由来のタンパク質を常法
に従ってマウスに免疫し、そのひ臓細胞とミエローマ細
胞を常法に従って細胞融合して得られたハイブリドーマ
からの抗体を用いての抗原サンドイッチ型の酵素標識抗
体固相法（ＥＬＩＳＡ）にて、当タンパク質が存在する
画分（約１００ｍＭ−２５０ｍＭ ＮａＣｌ画分）を回
収した。この画分を、２Ｍ硫酸アンモニウムと当量混合
後、１Ｍ硫酸アンモニウムで平衡化されたＰｈｅｎｙｌ
−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ファルマシア社製）に添
加した。１Ｍ硫酸アンモニウムで洗浄後、硫酸アンモニ
ウム１Ｍから０Ｍへの負の濃度勾配溶出を行い、ＥＬＩ
ＳＡにて当タンパク質が存在する画分（約４００ｍＭ−
１００ｍＭ硫酸アンモニウム画分）を回収した。当画分
をアミコン限外濾過膜ＹＭ−３０にて濃縮し、緩衝液Ｃ
（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー、ｐＨ８、１
５０ｍＭ ＮａＣｌ含）に置換した。緩衝液Ｃで平衡化
した実施例３記載の抗体アフィニティーカラムに添加し
た。緩衝液Ｃで洗浄後、緩衝液Ｄ（５０ｍＭ Ｇｌｙｓ
ｉｎｅ／ＨＣｌバッファー、ｐＨ３）で溶出した。溶出
画分を集め、緩衝液Ｅ（１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ
８）で中和した。この標品を用いて以下に述べる、スロ
ンビンによる活性化とアミノ酸配列の解析並びにＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。
【００１１】上記の精製されたタンパク質を活性化させ
るため、１ｕｎｉｔ／ｍｌ スロンビン（エンザイム・
リサーチ社製）含緩衝液Ｃと３７℃で２時間インキュベ
ーションした。この活性化されたタンパク質を、緩衝液
Ｆ（６Ｍ塩酸グアニジン、０．００２Ｍエチレンジアミ
ン４酢酸、１Ｍトリス塩酸バッファー、ｐＨ８．５）中
で、２−メルカプトエタノールにより、４０℃、２時間
還元した後、等濃度のモノヨード酢酸を加え、窒素ガス
下、室温、遮光下で１時間反応させ、カルボキシメチル
化を行った。反応後、ＹＭＣ ｐａｃｋ Ｃ４カラム
（ワイエムシー社製）に添加し、アセトニトリル／イソ
プロピルアルコール（３／７）濃度１０％から７０％ま
で２０分間の濃度勾配溶出を行い、２本のピークを分取
した。これらピークを真空状態で乾燥した後、５０％ト
リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）６０μｌに溶解し、ポリブレ
ン処理したグラスフィルターに添加し、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製４７０Ａシークエンサーで
エドマン分解し、Ｎ末端のアミノ酸配列を決定した。フ
ェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸の同定は、
三菱化成社製ＭＣＩ ｇｅｌ ＯＤＳ ＩＨＵ（０．４
６×１５ｃｍ）カラムを用い、酢酸緩衝液（１０ｍＭ酢
酸緩衝液、ｐＨ４．７、０．０１％ＳＤＳ、３８％アセ
トニトリル）による単一溶媒溶出法を流速１．２ｍｌ／
分、温度４３℃で行い、ＰＴＨアミノ酸の検出は２６９
ｎｍの吸光度で行った。この結果、還元カルボキシメチ
ル化されたこのタンパク質から得られる１つのペプチド
のＮ末端アミノ酸配列は、後述の配列番号：１に示すよ
うであった。もう一つのペプチドのＮ末端はブロックさ
れていた。
るため、１ｕｎｉｔ／ｍｌ スロンビン（エンザイム・
リサーチ社製）含緩衝液Ｃと３７℃で２時間インキュベ
ーションした。この活性化されたタンパク質を、緩衝液
Ｆ（６Ｍ塩酸グアニジン、０．００２Ｍエチレンジアミ
ン４酢酸、１Ｍトリス塩酸バッファー、ｐＨ８．５）中
で、２−メルカプトエタノールにより、４０℃、２時間
還元した後、等濃度のモノヨード酢酸を加え、窒素ガス
下、室温、遮光下で１時間反応させ、カルボキシメチル
化を行った。反応後、ＹＭＣ ｐａｃｋ Ｃ４カラム
（ワイエムシー社製）に添加し、アセトニトリル／イソ
プロピルアルコール（３／７）濃度１０％から７０％ま
で２０分間の濃度勾配溶出を行い、２本のピークを分取
した。これらピークを真空状態で乾燥した後、５０％ト
リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）６０μｌに溶解し、ポリブレ
ン処理したグラスフィルターに添加し、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製４７０Ａシークエンサーで
エドマン分解し、Ｎ末端のアミノ酸配列を決定した。フ
ェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸の同定は、
三菱化成社製ＭＣＩ ｇｅｌ ＯＤＳ ＩＨＵ（０．４
６×１５ｃｍ）カラムを用い、酢酸緩衝液（１０ｍＭ酢
酸緩衝液、ｐＨ４．７、０．０１％ＳＤＳ、３８％アセ
トニトリル）による単一溶媒溶出法を流速１．２ｍｌ／
分、温度４３℃で行い、ＰＴＨアミノ酸の検出は２６９
ｎｍの吸光度で行った。この結果、還元カルボキシメチ
ル化されたこのタンパク質から得られる１つのペプチド
のＮ末端アミノ酸配列は、後述の配列番号：１に示すよ
うであった。もう一つのペプチドのＮ末端はブロックさ
れていた。
【００１２】実施例２（分子量が約３４，０００ダルト
ンのタンパク質の精製とアミノ酸配列解析） 終濃度として１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭベンズアミ
ジン（ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌ社製等）、５ｍ
Ｍε−アミノカプロン酸ヘキシルエステル（東京化成社
製等）となる様に、健常人より採血した血液を混和す
る。即座に、遠心分離機にて細胞を除去して血しょうを
得る。この血しょうをＨｅｐａｒｉｎ−ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅカラム（ファルマシア社製：緩衝液Ｇ（１０ｍＭ
ＮａＨ2ＰＯ4 −Ｎａ2 ＨＰＯ4 バッファー、ｐＨ７、
１５０ｍＭ ＮａＣｌ含）で平衡化されている）に添加
し、緩衝液Ｇで洗浄後、この緩衝液Ｇと緩衝液Ｂ（１０
ｍＭ ＮａＨ2 ＰＯ4 −Ｎａ2 ＨＰＯ4 バッファー、ｐ
Ｈ７、７００ｍＭ ＮａＣｌ含）を用いて、ＮａＣｌ濃
度１５０ｍＭから７００ｍＭの濃度勾配溶出を行った。
ンのタンパク質の精製とアミノ酸配列解析） 終濃度として１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭベンズアミ
ジン（ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌ社製等）、５ｍ
Ｍε−アミノカプロン酸ヘキシルエステル（東京化成社
製等）となる様に、健常人より採血した血液を混和す
る。即座に、遠心分離機にて細胞を除去して血しょうを
得る。この血しょうをＨｅｐａｒｉｎ−ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅカラム（ファルマシア社製：緩衝液Ｇ（１０ｍＭ
ＮａＨ2ＰＯ4 −Ｎａ2 ＨＰＯ4 バッファー、ｐＨ７、
１５０ｍＭ ＮａＣｌ含）で平衡化されている）に添加
し、緩衝液Ｇで洗浄後、この緩衝液Ｇと緩衝液Ｂ（１０
ｍＭ ＮａＨ2 ＰＯ4 −Ｎａ2 ＨＰＯ4 バッファー、ｐ
Ｈ７、７００ｍＭ ＮａＣｌ含）を用いて、ＮａＣｌ濃
度１５０ｍＭから７００ｍＭの濃度勾配溶出を行った。
【００１３】そして、実施例３に示すように、特願平３
−２７１３６２号に記載のヒト由来のタンパク質を常法
に従ってマウスに免疫し、そのひ臓細胞とミエローマ細
胞を常法に従って細胞融合して得られたハイブリドーマ
からの抗体を用いての抗原サンドイッチ型の酵素標識抗
体固相法（ＥＬＩＳＡ）にて、当タンパク質が存在する
画分（約３００ｍＭ−４５０ｍＭ ＮａＣｌ画分）を回
収した。この画分を、実施例１と同様の方法でＰｈｅｎ
ｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ファルマシア社製）
を用いて負の濃度勾配溶出を行い、ＥＬＩＳＡにて当タ
ンパク質が存在する画分（約７００ｍＭ−５００ｍＭ硫
酸アンモニウム画分）を回収した。当画分をアミコン限
外濾過膜ＹＭ−３０にて濃縮し、緩衝液Ｃ（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー、ｐＨ８、１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ含）に置換した。得られた当該タンパク質を含む
溶液を緩衝液Ｃで平衡化したアプロチニン固定化アフィ
ニティーカラム（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ社製）に供し、
その素通り画分を緩衝液Ｃで平衡化した実施例３記載の
抗体アフィニティーカラムに添加した。緩衝液Ｃで洗浄
後、緩衝液Ｄ（５０ｍＭ Ｇｌｙｓｉｎｅ／ＨＣｌバッ
ファー、ｐＨ３）で溶出した。溶出画分を集め、緩衝液
Ｅ（１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８）で中和した。こ
の標品を用いて以下に述べる、スロンビンによる活性化
とアミノ酸配列の解析並びにＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を行った。
−２７１３６２号に記載のヒト由来のタンパク質を常法
に従ってマウスに免疫し、そのひ臓細胞とミエローマ細
胞を常法に従って細胞融合して得られたハイブリドーマ
からの抗体を用いての抗原サンドイッチ型の酵素標識抗
体固相法（ＥＬＩＳＡ）にて、当タンパク質が存在する
画分（約３００ｍＭ−４５０ｍＭ ＮａＣｌ画分）を回
収した。この画分を、実施例１と同様の方法でＰｈｅｎ
ｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ファルマシア社製）
を用いて負の濃度勾配溶出を行い、ＥＬＩＳＡにて当タ
ンパク質が存在する画分（約７００ｍＭ−５００ｍＭ硫
酸アンモニウム画分）を回収した。当画分をアミコン限
外濾過膜ＹＭ−３０にて濃縮し、緩衝液Ｃ（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー、ｐＨ８、１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ含）に置換した。得られた当該タンパク質を含む
溶液を緩衝液Ｃで平衡化したアプロチニン固定化アフィ
ニティーカラム（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ社製）に供し、
その素通り画分を緩衝液Ｃで平衡化した実施例３記載の
抗体アフィニティーカラムに添加した。緩衝液Ｃで洗浄
後、緩衝液Ｄ（５０ｍＭ Ｇｌｙｓｉｎｅ／ＨＣｌバッ
ファー、ｐＨ３）で溶出した。溶出画分を集め、緩衝液
Ｅ（１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８）で中和した。こ
の標品を用いて以下に述べる、スロンビンによる活性化
とアミノ酸配列の解析並びにＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を行った。
【００１４】上記の精製されたタンパク質を活性化させ
るため、１ｕｎｉｔ／ｍｌ スロンビン（エンザイム・
リサーチ社製）含緩衝液Ｃと３７℃で２時間インキュベ
ーションした。この活性化されたタンパク質を、緩衝液
Ｆ（６Ｍ塩酸グアニジン、０．００２Ｍエチレンジアミ
ン４酢酸、１Ｍトリス塩酸バッファー、ｐＨ８．５）中
で、２−メルカプトエタノールにより、４０℃、２時間
還元した後、等濃度のモノヨード酢酸を加え、窒素ガス
下、室温、遮光下で１時間反応させ、カルボキシメチル
化を行った。反応後、ＹＭＣ ｐａｃｋ Ｃ４カラム
（ワイエムシー社製）に添加し、アセトニトリル／イソ
プロピルアルコール（３／７）濃度１０％から７０％ま
で３０分間の濃度勾配溶出を行い、ピークを分取した。
これらのピークを真空状態で乾燥した後、５０％トリフ
ルオロ酢酸（ＴＦＡ）６０μｌに溶解し、ポリブレン処
理したグラスフィルターに添加し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製４７０Ａシークエンサーでエド
マン分解し、Ｎ末端のアミノ酸配列を決定した。フェニ
ルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸の同定は、三菱
化成社製ＭＣＩ ｇｅｌ ＯＤＳ ＩＨＵ（０．４６×
１５ｃｍ）カラムを用い、酢酸緩衝液（１０ｍＭ酢酸緩
衝液、ｐＨ４．７、０．０１％ＳＤＳ、３８％アセトニ
トリル）による単一溶媒溶出法を流速１．２ｍｌ／分、
温度４３℃で行い、ＰＴＨアミノ酸の検出は２６９ｎｍ
の吸光度で行った。この結果、還元カルボキシメチル化
されたこのタンパク質から得られる１つのペプチドのＮ
末端アミノ酸配列は、後述の配列番号：１に示すようで
あった。
るため、１ｕｎｉｔ／ｍｌ スロンビン（エンザイム・
リサーチ社製）含緩衝液Ｃと３７℃で２時間インキュベ
ーションした。この活性化されたタンパク質を、緩衝液
Ｆ（６Ｍ塩酸グアニジン、０．００２Ｍエチレンジアミ
ン４酢酸、１Ｍトリス塩酸バッファー、ｐＨ８．５）中
で、２−メルカプトエタノールにより、４０℃、２時間
還元した後、等濃度のモノヨード酢酸を加え、窒素ガス
下、室温、遮光下で１時間反応させ、カルボキシメチル
化を行った。反応後、ＹＭＣ ｐａｃｋ Ｃ４カラム
（ワイエムシー社製）に添加し、アセトニトリル／イソ
プロピルアルコール（３／７）濃度１０％から７０％ま
で３０分間の濃度勾配溶出を行い、ピークを分取した。
これらのピークを真空状態で乾燥した後、５０％トリフ
ルオロ酢酸（ＴＦＡ）６０μｌに溶解し、ポリブレン処
理したグラスフィルターに添加し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製４７０Ａシークエンサーでエド
マン分解し、Ｎ末端のアミノ酸配列を決定した。フェニ
ルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸の同定は、三菱
化成社製ＭＣＩ ｇｅｌ ＯＤＳ ＩＨＵ（０．４６×
１５ｃｍ）カラムを用い、酢酸緩衝液（１０ｍＭ酢酸緩
衝液、ｐＨ４．７、０．０１％ＳＤＳ、３８％アセトニ
トリル）による単一溶媒溶出法を流速１．２ｍｌ／分、
温度４３℃で行い、ＰＴＨアミノ酸の検出は２６９ｎｍ
の吸光度で行った。この結果、還元カルボキシメチル化
されたこのタンパク質から得られる１つのペプチドのＮ
末端アミノ酸配列は、後述の配列番号：１に示すようで
あった。
【００１５】実施例３（抗体の調製とその抗体を用いて
のＥＬＩＳＡの系と抗体アフィニティーカラムの調製） 特願平３−２７１３６２号に記載のヒト由来の新規なタ
ンパク質を常法に従ってＢａｌｂ／ｃマウスに免疫し
た。初回免疫はＦｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ
ａｄｊｕｖａｎｔと抗原約１０μｇを、以後の追加免疫
はＦｒｅｕｎｄ’ｓ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕ
ｖａｎｔと抗原約１０μｇを用いてマウス腹腔内に行っ
た。最終免疫は抗原約１０μｇを尾静脈に行った。最終
免疫の３日後、マウスひ臓細胞を取り出し、マウスミエ
ローマ細胞のＰ３Ｕ１細胞と常法に従ってポリエチレン
グリコール存在下で細胞融合を行った。そして、免疫し
たタンパク質と反応する抗体を産生するハイブリドーマ
を、抗原固相法によるＥＬＩＳＡにて酵素標識抗マウス
抗体を用いてスクリーニングした。得られたハイブリド
ーマを無血清培養下で培養して、その上清をＰｒｏｔｅ
ｉｎ Ａアフィニティーカラムに供し抗体を得た。得ら
れた抗体の中で、抗原の認識部位の異なる２つの抗体を
用いて常法に従ってＥＬＩＳＡの系を組み立てた。２次
抗体の標識はペルオキシデースを用いて常法に従って行
った。また、得られた抗体の内１つを、ＣＮＢｒ−ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社製）に常法に従ってカ
ップリングさせ、抗体アフィニティーカラムを作成し
た。
のＥＬＩＳＡの系と抗体アフィニティーカラムの調製） 特願平３−２７１３６２号に記載のヒト由来の新規なタ
ンパク質を常法に従ってＢａｌｂ／ｃマウスに免疫し
た。初回免疫はＦｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ
ａｄｊｕｖａｎｔと抗原約１０μｇを、以後の追加免疫
はＦｒｅｕｎｄ’ｓ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕ
ｖａｎｔと抗原約１０μｇを用いてマウス腹腔内に行っ
た。最終免疫は抗原約１０μｇを尾静脈に行った。最終
免疫の３日後、マウスひ臓細胞を取り出し、マウスミエ
ローマ細胞のＰ３Ｕ１細胞と常法に従ってポリエチレン
グリコール存在下で細胞融合を行った。そして、免疫し
たタンパク質と反応する抗体を産生するハイブリドーマ
を、抗原固相法によるＥＬＩＳＡにて酵素標識抗マウス
抗体を用いてスクリーニングした。得られたハイブリド
ーマを無血清培養下で培養して、その上清をＰｒｏｔｅ
ｉｎ Ａアフィニティーカラムに供し抗体を得た。得ら
れた抗体の中で、抗原の認識部位の異なる２つの抗体を
用いて常法に従ってＥＬＩＳＡの系を組み立てた。２次
抗体の標識はペルオキシデースを用いて常法に従って行
った。また、得られた抗体の内１つを、ＣＮＢｒ−ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社製）に常法に従ってカ
ップリングさせ、抗体アフィニティーカラムを作成し
た。
【００１６】実施例４（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動） 実施例１と２に従って精製された当該タンパク質の見掛
け上の分子量を求めるため、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を行った。最終的に精製された当該タン
パク質を１２．５％のポリアクリルアミド・スラブゲル
を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に、
非還元下で供した。分子量マーカーとしては、ファルマ
シア社製のものを用いた。電気泳動後、クマシーブリリ
アントブルーＲ２５０（ＣＢＢ）を用いて染色した。当
該タンパク質と分子量マーカータンパク質との泳動距離
の相対的比較により、実施例１のタンパク質はＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動上のみかけの分子量は
約９６，０００ダルトンであり、実施例２のタンパク質
は約３４，０００ダルトンであった。
ル電気泳動） 実施例１と２に従って精製された当該タンパク質の見掛
け上の分子量を求めるため、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を行った。最終的に精製された当該タン
パク質を１２．５％のポリアクリルアミド・スラブゲル
を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に、
非還元下で供した。分子量マーカーとしては、ファルマ
シア社製のものを用いた。電気泳動後、クマシーブリリ
アントブルーＲ２５０（ＣＢＢ）を用いて染色した。当
該タンパク質と分子量マーカータンパク質との泳動距離
の相対的比較により、実施例１のタンパク質はＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動上のみかけの分子量は
約９６，０００ダルトンであり、実施例２のタンパク質
は約３４，０００ダルトンであった。
【００１７】実施例５（活性化と測定方法） 実施例１と２で精製された当該タンパク質を活性化させ
るため、１ｕｎｉｔ／ｍｌスロンビン（エンザイムリサ
ーチ社製）含緩衝液Ｃと３７℃で２時間インキュベーシ
ョンした。この活性化されたタンパク質を、特願平３−
２７１３６２号の参考例に記載された方法で調製された
１本鎖ヒトＨＧＦ５μｇを含む１０ｍＭベンズアミジ
ン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス塩酸バッフ
ァー、ｐＨ８、溶液４０μｌに添加した。３７℃で２時
間インキュベーション後、この混合液を、還元条件下で
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。電
気泳動後、ＣＢＢで染色し、１本鎖型ＨＧＦと２本鎖型
ＨＧＦの割合を比較することで、活性を検出した。結果
を図１に示す。図中、１は約９６，０００ダルトンのタ
ンパク質を、２は約３４，０００ダルトンのタンパク質
を活性化後、約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で当測定に供し
た場合の結果を表す。３は当該タンパク質無添加のとき
の値である。
るため、１ｕｎｉｔ／ｍｌスロンビン（エンザイムリサ
ーチ社製）含緩衝液Ｃと３７℃で２時間インキュベーシ
ョンした。この活性化されたタンパク質を、特願平３−
２７１３６２号の参考例に記載された方法で調製された
１本鎖ヒトＨＧＦ５μｇを含む１０ｍＭベンズアミジ
ン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス塩酸バッフ
ァー、ｐＨ８、溶液４０μｌに添加した。３７℃で２時
間インキュベーション後、この混合液を、還元条件下で
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。電
気泳動後、ＣＢＢで染色し、１本鎖型ＨＧＦと２本鎖型
ＨＧＦの割合を比較することで、活性を検出した。結果
を図１に示す。図中、１は約９６，０００ダルトンのタ
ンパク質を、２は約３４，０００ダルトンのタンパク質
を活性化後、約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で当測定に供し
た場合の結果を表す。３は当該タンパク質無添加のとき
の値である。
【００１８】
配列番号：１ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：部分ペプチド 起源：生物名：ヒト 組織の種類：血しょう 配列 Ile Ile Gly Gly Ser Ser Ser Leu 1 5 8
【図１】活性化された本発明のタンパク質の有無による
１本鎖型ＨＧＦおよび２本鎖型ＨＧＦの生成割合を示す
図面である。図中、１は約９６，０００ダルトンのタン
パク質を、２は約３４，０００ダルトンのタンパク質を
活性化後、約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で当測定に供した
場合の結果を表す。３は当該タンパク質無添加のときの
値である。
１本鎖型ＨＧＦおよび２本鎖型ＨＧＦの生成割合を示す
図面である。図中、１は約９６，０００ダルトンのタン
パク質を、２は約３４，０００ダルトンのタンパク質を
活性化後、約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で当測定に供した
場合の結果を表す。３は当該タンパク質無添加のときの
値である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/47 C12N 9/64 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質を有することを特徴
とするヒト血しょう由来の新規な前駆体タンパク質。 （ｉ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による
分子量が約９６，０００ダルトンである。 （ii）スロンビンで処理することにより、７２８アミノ
酸残基より成る１本鎖型ヒト肝細胞増殖因子をそのアミ
ノ末端から４９４番目のアミノ酸であるアルギニンと４
９５番目のアミノ酸であるバリンとの間で特異的に切断
して活性型の２本鎖型ヒト肝細胞増殖因子に変換するプ
ロテアーゼ活性を有するようになる。（iii）部分アミノ酸配列として配列表の配列番号１に
記載のアミノ酸配列を有する。 - 【請求項２】 下記の理化学的性質を有することを特徴
とするヒト血しょう由来の新規な前駆体タンパク質。 （ ｉ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による
分子量が約３４，０００ダルトンである。 （ii）スロンビンで処理することにより、７２８アミノ
酸残基より成る１本鎖型ヒト肝細胞増殖因子をそのアミ
ノ末端から４９４番目のアミノ酸であるアルギニンと４
９５番目のアミノ酸であるバリンとの間で特異的に切断
して活性型の２本鎖型ヒト肝細胞増殖因子に変換するプ
ロテアーゼ活性を有するようになる。 （iii）部分アミノ酸配列として配列表の配列番号１に
記載のアミノ酸配列を有する。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29613392A JP3214106B2 (ja) | 1992-11-05 | 1992-11-05 | 新規なタンパク質 |
| CA002102463A CA2102463A1 (en) | 1992-11-05 | 1993-11-04 | Protein and gene encoding said protein |
| DE69324547T DE69324547T2 (de) | 1992-11-05 | 1993-11-05 | Protease, die menschlichen Hepatozytwachtumsfaktor umsetzt, und dafür kodierendes Gen |
| AT93117988T ATE179213T1 (de) | 1992-11-05 | 1993-11-05 | Protease, die menschlichen hepatozytwachtumsfaktor umsetzt, und dafür kodierendes gen |
| US08/148,910 US5466593A (en) | 1992-11-05 | 1993-11-05 | Hepatocyte growth factor activating protease and gene encoding the protease |
| EP93117988A EP0596524B1 (en) | 1992-11-05 | 1993-11-05 | Hepatocyte growth factor HGF converting protease and gene encoding said protease |
| US08/448,937 US5677164A (en) | 1992-11-05 | 1995-05-24 | Hepatocyte growth factor activating protease and gene encoding the protease |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29613392A JP3214106B2 (ja) | 1992-11-05 | 1992-11-05 | 新規なタンパク質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06141859A JPH06141859A (ja) | 1994-05-24 |
| JP3214106B2 true JP3214106B2 (ja) | 2001-10-02 |
Family
ID=17829579
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29613392A Expired - Fee Related JP3214106B2 (ja) | 1992-11-05 | 1992-11-05 | 新規なタンパク質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3214106B2 (ja) |
-
1992
- 1992-11-05 JP JP29613392A patent/JP3214106B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06141859A (ja) | 1994-05-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0150735B2 (en) | Protein composition exhibiting coagulation activity and method for the preparation thereof | |
| Goldsmith et al. | Adsorption protein of the bacteriophage fd: isolation, molecular properties, and location in the virus | |
| US5004804A (en) | Method and composition for preparation of factor VIIIC | |
| Salier et al. | Purification of the human serum inter-α-trypsin inhibitor by zinc chelate and hydrophobic interaction chromatographies | |
| KR960013386B1 (ko) | 항혈액응고 작용을 갖는 폴리펩티드 | |
| EP0303983B1 (de) | Synthetische Peptide, gegen diese gerichtete Antikörper und deren Verwendung | |
| KR960013460B1 (ko) | 안티-pci 모노클로날 항체 | |
| DE3486023T2 (de) | Verfahren zur herstellung von urokinase zymogen. | |
| JP3214106B2 (ja) | 新規なタンパク質 | |
| KR960002740B1 (ko) | 안티-트롬빈-결합물질 모노클로날 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 및 모노클로날 항체를 이용한 트롬빈-결합물질의 정제법 및 측정법 | |
| CA1341535C (en) | Transforming growth factor peptides | |
| EP0380443A2 (en) | Monoclonal antibodies specific for thrombin hirudin | |
| IE911285A1 (en) | Monoclonal antibodies against PP4, processes for the¹preparation thereof and the use thereof | |
| JPH09235300A (ja) | ヒトｔｉｍｐ−３及び抗ヒトｔｉｍｐ−３モノクローナル抗体並びにその用途 | |
| US5688919A (en) | Process for the purification of factor XIII, monoclonal antibodies against factor XIIIA, the preparation and use thereof | |
| EP0354408A1 (en) | Anti-urokinase monoclonal antibodies | |
| Bose-Bierne et al. | Production and characterization of four monoclonal antibodies against porcine pancreatic colipase | |
| Przysiecki et al. | Characterization of recombinant antistasin secreted by Saccharomyces cerevisiae | |
| EP0320840A2 (de) | Peptide, Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Verwendung zur Gewinnung von Antikörpern sowie deren Verwendung zur Blockierung der PAI-1-Aktivität menschlichen Blutes | |
| CA1340711C (en) | Cancer cell-produced polypeptides and their production and use | |
| EP0336441B1 (en) | Anti-CPBII monoclonal antibody | |
| Bedi et al. | Single-Step Purification of “Kall Ikrein-Resistant” Kininogen from Rat Plasma Using Monoclonal-Antibody Immunoaffinity Chromatography | |
| KR970002916B1 (ko) | 폴리펩티드를 코딩하는 신규 dna, dna를 함유하는 재조합 플라스미드 및 재조합 플라스미드를 함유하는 형질전환세포 | |
| KR100506485B1 (ko) | T7 박테리오 파아지 gene9 단백질에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 융합세포 및 그에 의해 생산되는 모노클로날 항체 | |
| EP1418182A1 (en) | Method of preparing peptide fragment having cell death inhibitory activity |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080727 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080727 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090727 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090727 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100727 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100727 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110727 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120727 Year of fee payment: 11 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |