HU203257B - Process for producing monoclonal antiurokinase antibodies and for cleaning and testing urokinase - Google Patents
Process for producing monoclonal antiurokinase antibodies and for cleaning and testing urokinase Download PDFInfo
- Publication number
- HU203257B HU203257B HU853722A HU372285A HU203257B HU 203257 B HU203257 B HU 203257B HU 853722 A HU853722 A HU 853722A HU 372285 A HU372285 A HU 372285A HU 203257 B HU203257 B HU 203257B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- urokinase
- antibody
- molecular weight
- priority
- antigen
- Prior art date
Links
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 title claims abstract description 201
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 title claims abstract description 171
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 title claims abstract description 171
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 59
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 8
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 title description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 32
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 30
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 40
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 40
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 40
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 30
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 24
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 claims description 16
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 16
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 claims description 15
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 14
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 14
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 14
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 13
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 11
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 11
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 11
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 11
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 claims description 10
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 claims description 10
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 claims description 10
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 claims description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 8
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 claims description 8
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 8
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 7
- 230000003024 amidolytic effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 6
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 claims description 5
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 claims description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 5
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 claims description 5
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 claims description 5
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 5
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 5
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 4
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 4
- 229940066758 endopeptidases Drugs 0.000 claims description 4
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 claims description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 4
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 claims description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 239000012085 test solution Substances 0.000 claims description 3
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 claims description 2
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 claims description 2
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 claims description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 claims description 2
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 claims description 2
- 229920006184 cellulose methylcellulose Polymers 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 2
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 claims 1
- 241000894007 species Species 0.000 claims 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 abstract description 3
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 17
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 8
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 7
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 6
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 6
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 6
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 6
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 6
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 230000000058 esterolytic effect Effects 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 5
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 4
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 4
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 239000012490 blank solution Substances 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 4
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 108010073863 saruplase Proteins 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical group O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 3
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 3
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HHOLXTXLQMKUGJ-QMMMGPOBSA-N N(alpha)-acetyl-L-lysine methyl ester Chemical compound COC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCCCN HHOLXTXLQMKUGJ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical class ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 2
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical compound O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCO PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010051055 Deep vein thrombosis Diseases 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N Epichlorohydrin Chemical compound ClCC1CO1 BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- XEQLGWAGMYUVTR-UHFFFAOYSA-N O=C1NC=NC2=C1NC=N2.C1=CN=C2C(=O)NC(NN)=NC2=N1 Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2.C1=CN=C2C(=O)NC(NN)=NC2=N1 XEQLGWAGMYUVTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 206010053648 Vascular occlusion Diseases 0.000 description 1
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004872 arterial blood pressure Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 239000001273 butane Substances 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N diisopropyl fluorophosphate Chemical compound CC(C)OP(F)(=O)OC(C)C MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- YVIGPQSYEAOLAD-UHFFFAOYSA-L disodium;dodecyl phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].CCCCCCCCCCCCOP([O-])([O-])=O YVIGPQSYEAOLAD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 229940073579 ethanolamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 229960005051 fluostigmine Drugs 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N monoethanolamine hydrochloride Natural products NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N n-butane Chemical compound CCCC IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N n-pentane Natural products CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 108010003233 preprourokinase Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001957 retinal vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229920002379 silicone rubber Polymers 0.000 description 1
- 239000004945 silicone rubber Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 208000021331 vascular occlusion disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6462—Plasminogen activators u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21073—Serine endopeptidases (3.4.21) u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/972—Plasminogen activators
- G01N2333/9723—Urokinase
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás új típusú IgG j monoklonális antitestek előállítására, amely a humán urokináz egy külső pontjára irányul, szelektíve kötődik a nagy molekulatömegü (54000) urokinázhoz, vagy annak egyláncú prekurzorához anélkül, hogy a kis molekulatömegű (33 000) urokinázhoz kötődne; urokinázra vonatkozó affinitási állandója alapján alkalmas egy immunadszorpción alapuló tisztítási eljárásban való felhasználásra, mely tisztítási eljárás szintén a találmány tárgya. A szóban forgó antitest nem károsítja az urokináz enzimaktivitását.
A találmány szerinti eljárással előállított monoklonális antitestek megfelelő mátrixhoz kapcsolva immunadszorbens mátrixot szolgáltatnak, amely alkalmas a biológiai kiindulási anyagokban jelen levő emberi urokináz vagy egyláncú prekurzora tisztítására. Ezek az immunadszorbens anyagok - az antitest antigénje iránti optimális affinitása miatt - különösen alkalmasak ipari méretekben is a humán urokináz vagy egyláncú prekurzora tisztítására.
A találmány tárgya továbbá vizsgálati módszer, mely a monoklonális antitestek felhasználásával nagy molekulatömegű humán urokináz (HMW-urokináz) vagy egy egyláncú prekurzora kimutatására irányul.
A humán urokináz egy ismert plazminogén aktivátor (PA), amely főként a vesesejtekben képződik.
Fontosabb fiziológiai szerepe láthatóan az, hogy aktiválja a fibrinolitikus rendszert. Az urokináz ezért ajánlható egyes akut érrendszeri rendellenességek kezelésére, amilyen pl. a szívizominfarktus, szélütés, tödőembólia, mélyvénás trombózis, perifériás érelzáródás, vérzések és vénaelzáródás a retinán.
A plazminogén aktivátorok (PA) olyan szerin proteázok, amelyek a plazminogént plazminná alakítják át. A plazmin egy proetáz, amelyet magas fokú fajlagosság jellemez a fibrin iránt (ez a vérrögök alapvető öszszetevője). Tenyésztett rosszindulatú sejtvonalakból legalább 2, immunológiailag különböző típusú PA-t izoláltak. Az egyik típus hasonló a szöveti plazminogén aktivátorhoz (TPA) - D. C. Rijken et al., Biochim. Biophys. Acta 380, p. 140, 1979 -, a másik pedig a vizeletben előforduló aktivátorhoz (UPA), amelyet urokináznak is neveznek (J. R. B. Williams, Br. J. Exp. Pathol. 32, p. 530,1951). Az urokináz típusút, amelyet eredetüeg kétláncú proteinként állították elő, vizeletből kiinduló tisztítással, újabban (pro-urokináznak nevezett) proenzim alakban különítették el, pl. a HEp3 humán epidermoid ráksejtvonalból (T. D. Wunt et al., J. Bioi. Chem. 257, p. 7262,1982), humán glioblasztóma sejtekből (L.-S. Nielsen et. al. Biochem. 21, p. 6410,1982), vizeletből (S. C. Húsain et al., Arch. Biochem. Biophys. 220, p. 31,1983) és az emberi veséből származó TCL-598 állandó sejtvonalból (T. Kohno et al., Biatechnol. 2, p. 628). Újabban az A431 humán epidermoid ráksejtvonal felülúszójából azonosítottak egy, az urokinázzal immunológiai szempontból rokon proenzimet.
Ez a pro-urokináz zimogén egy egyláncú protein, molekula tömege 50-54000; amidáz aktivitása nincs vagy alacsony és fibrin-affinitása magas; ellenálló a diizopropil-fluorfoszfát kezeléssel és a plazma inhibitorokkal történő inaktiválással szemben (I. Gurewich et al., J. Clin. Invest. 73, p. 1731,1984) és plazminnal végzett kezeléssel átalakítható a kétláncú aktív enzimmé, az urokinázzá.
A humán urokinázmolekulát számos, biológiailag aktív alakban különítették el. Általában azonban azzal jellemezhető, hogy egy magas (kb. 54 000) és egy alacsony (kb. 33000) molekulatömegű részből áll. Az alacsony molekulatömegű alak (LMW) enzimes bontással állítható elő a nagy molekulatömegű (HMW) alakból.
A HMW alak egy 30000 molekula tömegű nehéz láncból (B-lánc) és egy kb. 2000 molekulatömegű rövid láncból (A-lánc) áll, amelyeket diszulfidkötés köt össze. Az LMW alak a teljes B-lánccal azonos; ez tartalmazza az aktív helyet és egy kis, a proteolízisnek ellenálló fragmentumot (molekulatömeg 2,427), amely a diszulfid kötéssel összekötött A-láncból vezethető le. Az A-lánc proteolízissel két fragmentumra bontható fel: egy 18000 molekulatömegű fragmentumra és az előbbi 2472 molekulatömegűre. Úgy tűnik, hogy az LMW urokináz a HMW urokináznál kevésbé aktív, a vérrög in vivő lízisének gyorsításában. (M. Samama et al., Thromb. Haemost. 40, 578-580, 1979, G. Murano et al., Blood 55,p. 430-436,1980). A humán urokinázt jelenleg főként biológiai anyagokból - pl. emberi vizeletből, szövettenyészetekből, különösen normális és rákos vesesejt-tenyészetekből - állítják elő a szokásos tisztítási eljárások segítségével. A humán urokinázzimogén hasonló fiziológiai szerepet játszhat, mihelyt aktiválás folytán urokinázzá alakul. Újabban leírták, hogy a humán urokinázt DNS-technológiával állítják elő (92182 sz. közzétett európai szabadalmi bejelentés).
C. Milstein és G. Kohler monoklonális antitest-képző sejthibridekre vonatkozó úttörő munkáját - amelyet a Natúré 256, p. 495-497,1975 helyén írtak le követően a szakirodalomban megjelentek az urokináz elleni monoklonális antitestek. Pl. a 896253 sz. belga szabadalmi leírás többféle monoklonális antitestet tárgyal, amelyeket úgy állítanak elő, hogy egereket kis molekulatömegű urokinázzal (33000) immunizálnak. Ezek a monoklonális antitestek nyüvánvalóan egy, az urokináz kis molekulatömegű alakján jelen levő külső pont ellen irányulnak. Az egyik ilyen - AAU2 jelzéssel ellátott - antitestet izolálták és az urokináz tisztítására használták fel (P. Herion, A Bollen, Bioscience Reports 3, p. 373-379,1983). A kapott urokináz természetesen mind az alacsony, mind a magas molekulatömegű anyagot kell hogy tartalmazza. D. Vetterlein és G. J. Colton (Thromb. Haemostas, Stuttgart, 49, p. 2427,1983) leírja az urokináz tisztítását, amelynek során a könnyű urokinázlánccal szembeni, rögzített monoklonális antitesteket alkalmaznak. A leírt tisztítási tényező 2,4-nél kisebb (60000-70000 CTA egység/mg értékről 142000-167000 CTA egység/mg értékre, 1. 25. oldal, jobb oldali oszlop, 10-11. sor). A leírt kísérletben a vizelettel az immunadszorbenshez kötött urokináz (300 ml vizelet/1 ml gyanta, 1.26. ol-21
HU 203 257 Β dal, a 2. ábrához fűzött megjegyzések 2. szakasza) nem alkalmas az ipari léptékű tisztításra. Ezek a szerzők továbbá rámutatnak arra, hogy az urokináz monoklonális antitest immunadszorbens alkalmazásával történő üzemi méretű tisztításának problémáját még meg kell oldani. („Ennek az affinitástechnikának a nagyüzemi alkalmazhatóságát azonban még igazolni kell”: 27. oldal, bal oldali oszlop, 13-14. sor).
A 84 344. sz. közzétett európai szabadalmi bejelentés nagy vonalakban ír le egyes anti-urokináz monoklonális antitesteket. Ezek állítólag felhasználhatók, az urokináz tisztítására, valamint diagnosztikai és analitikai célokra. Az urokináz végterméket azonban nem jellemzik, sem a magas, ill. alacsony molekulatömegű alak mennyiségét, sem a biológiailag aktív anyag vagy a toxikus szennyezések mennyiségét illetően. G. Salerno et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 81, p. 110-114,1984) más anti-urokináz monoklonális antitesteket ír le, amelyek - mint erre az alábbiakban rámutatunk megkötik az urokináznak mind a magas, mind az alacsony molekulatömegű alakját és olyan affinitási állandóval rendelkeznek, hogy az nem megfelelő a hatékony affinitáskromatográfiához. Más, „anti-urokináz” monoklonális antitesteket tartalmazó immunadszorbenseket ír le L. S. Nielsen et al. - Biochemistry 21, p. 6410-6415, 1982 - és K. Kaltoft et al. - Proc. Natl. Acad. Sci. 79, p. 3720-3723,1982). A leírt monoklonális antitestek gátolják a plazminogén - ezt a szerzők HPA 52-nek nevezik - enzimaktivitását. A mátrixhoz -1 ml mátrixra számítva - kötődő antitest mennyisége és a végső módosított mátrix kapacitása azonban nem megfelelő az ipari léptékű alkalmazásra Ezenkívül 2 egymásutáni kromatográfiás lépésre van szükség a HPA 52 tisztításához, glioblasztóma sejttenyészetből kiindulva (I. táblázat, p. 6412).
A találmány szerinti eljárással a következő jellemzőkkel rendelkező anti-(humán urokináz) monoklonális antitest állítható elő:
a) IgGt típusú;
b) affinitási állandója (1,42 ± 1,5) x 1071 .mól-1 az immobilizált urokinázra vonatkoztatva, a meghatározás során, lényegében a Tsapis et al. által leírt (Eur. J. Biochem. 64, p. 369,1976) eljárást követve;
c) kötődik a nagy molekulatömegű (54000) urokinázhoz vagy ennek egyláncú prekurzorához anélkül, hogy megkötné az alacsony molekulatömegű (33 000) urokinázt;
d) kötődik az A-láncból proteolízissel előállított 18 000 molekulatömegű fragmentumhoz;
e) nem lép keresztreakcióba a szérum vagy a vizelet urokináztól különböző enzimaktivitást mutató endopeptidázaival.
Tekintettel a találmány szerinti monoklonális antitestek azon jellemzőjére, hogy egyaránt kötődnek a magas molekulatömegű urokinázhoz és az urokináz prekurzorhoz, a leírás további részeiben és az igénypontokban, amikor a találmány szerinti monoklonális antitestek fajlagosságával és kötő tulajdonságaival foglalkozunk, az „urokináz” kifejezést abban az értelemben használjuk, hogy az magában foglalja mind az urokináz nagy molekulatőmegű alakját, mind az urokináz prekurzort. Ugyanilyen szövegkörnyezetben az „urokináz nagy molekulatömegű alakjára” való hivatkozást úgy kell érteni, hogy az magában foglalja prekurzorait is, amelyeket hasonlóképpen megkötnek a találmány szerinti monoklonális antitestek
A leírásban és az igénypontokban az „urokináz prekurzor” kifejezés a „természetes” egyláncú urokináz prekurzorokra vonatkozik - amilyen az előbbiekben említett urokináz zimogén -, valamint a rec-DNStechnikákkal előállított urokináz prekurzorokra vagy hasonló anyagokra, amelyek közös tulajdonsága az, hogy megkötik a találmány szerinti monoklonális antitesteket.
A találmány szerinti anti-urokináz monoklonális antitesteket szomatikus sejtfúzióval állítjuk elő,,nem kiválasztó” típusú egér mielóma sejtekből (ezek olyan mielóma sejtek, amelyek nem választanak ki immunglobulinokat) és urokinázzal előzetesen immunizált egerek lépsejt jeiből.
Röviden: Balb/c egereket nagy tisztaságú, 54000 molekulatömegű urokinázzal immunizálunk és az eltávolított lépsejteket fúzióba visszük nem kiválasztó mielóma sejtekkel. Ez utóbbiak bizonyos genetikai hibákkal jellemezhetők, amelyek képtelenné teszik őket arra, hogy egy bizonyos közegben - amely nagyon hasznos lesz a hibridsejtek későbbi izolálásához fennmaradjanak. Ilyen sejtvonal pl. az X63-Ag8653 jelű, amelyet Kearney et al. írt le (J. ImmunoL 123, p. 1548-1550, 1979), ATCC száma ATCC CCL 61 (CHO KI törzs) és amely a szakember által ismert és > hozzáférhető.
Az ilyen mielóma sejtek a köz számára általában hozzáférhetők, számos tudományos intézmény segítségével, amilyen pl. a Salk Intézet (Cell Distribution Center, P. O. Box 1809, San Diego, Califomia 92112) vagy az Orvosi Kísérleti intézet (NIGMS Cell Repository, Copewood and Davis Streets, Camden, New Jersey 08103). A sejtfúziót polietilénglikol, előnyösen polietilénglikol (PEG) 6000jelenlétében hajtjuk végre.
A nagy tisztaságú, 54 000 molekulatömegű urokináz (HMW urokináz) több forrásból is hozzáférhető a kereskedelemben. Egy megfelelő nagy tisztaságú urokinázkészítmény a következőkkel jellemezhető: nemzetközi egységekben (IU) kifejezve magas titer, magas fibrinolitikus/eszterolitikus aktivitás arány és a trömboplasztin típusú szennyezésének nagyon alacsony koncentrációja vagy gyakorlati hiánya. Előnyben részesített nagy tisztaságú urokinázkészítmény a kereskedelemben PERSOLVr kereskedelmi névvel forgalmazott tennék (Gruppo Lepetit SPA), amelynek fibrinolitikus aktivitása 100000 IU/mg fölötti, a fibrinolitikus/eszterolitikus aktivitás aránya 1,4-nél magasabb, nyulakban 20000 IU/kg feletti dózisokban apirogén és 200 IU/ml plazmakoncentrációk mellett is nulla a koagulációs aktivitása.
Az immunizálási lépést előnyösen az urokináz alacsony dózisban való bevitele jellemzi. Egy tipikus immunizálási eljárás egerekben a következő fázisokból áll: először, 60 nappal a fúzió előtt komplett Freund-f.
HU 203 257 Β adjuvánsban alacsony dózisban viszünk be nagy tisztaságú, 54000 molekula tömegű urokinázt (120000 IU/mg, kb. 10 gg); másodszor 30 nappal a fúziót megelőzően ugyanezt a mennyiséget visszük be inkomplett Freund-f. adjuvánsban; végül, 5 nappal a fúzió előtt ugyanezzel a dózissal emlékeztető oltást adunk.
A végső emlékeztető dózist csak azoknak az állatoknak adjuk be - és a továbbiakban csak azokkal foglalkozunk -, amelyek anti-urokináz antitest titere 10 nappal a fúzió előtt 1:10000-nél magasabb.
A lépeket eltávolítjuk és a lépsejteket kb. 1085 x 107 arány mellett fúziós reakcióba visszük mielóma sejtekkel. A fúzió után a sejteket megfelelő táptalajban - amilyen pl. a Dulbecco-f. módosított Eagletáptalaj: ez kb. 10% borjúembrió-szérumot tartalmaz - tenyésztjük és a fuzionált sejteket hipoxantin-aminopterin-timidin (HAT) táptalajon szelektáljuk. A sejttenyészetek felülúszóinak anti-urokináz antitest tartalmát ELISA módszerekkel határozzuk meg, amelyek „hagyományosan” anti-urokináz antiszérum alkalmazását irányozzák elő. Az így azonosított antiurokináz monoklonális antitestek tisztítása ioncserélő kromatográfia vagy urokináz-agaróz oszlopon végzett affinitáskromatográfia segítségével történhet, míg a kapott termék homogenitásának értékelésére az elektroforézis a célszerű eszköz. Ezután értékeljük ezeknek az anti-urokináz monoklonális antitest készítményeknek az osztályspecificítását és az agarózon rögzített antigénre vonatkozó affinitási állandót. Az osztályspecificitást az Outcherlony-f. kettős immundiffúziós technikával határozzuk meg (Acta Pathol. Microbiol. Scand. 26, p. 507,1949); az affinitási állandót egyensúlyi megkötési vizsgálatokkal határozzuk meg, lényegében Tsapis et al. (Eur. J. Biochem. 64, p. 369,1976) módszere szerint. Ezekben a kísérletekben lényegében tiszta monoklonális antitesteket - amelyeket előzetesen pH 7,2-n foszfáttal puff erőit sóoldatban dializáltunk - növekvő koncentrációban felviszünk egy urokinázt tartalmazó mátrixra, pl. urokináz-agaróz mátrixra. A meg nem kötött antitest koncentrációját spektrofotometriásán határozzuk meg, a megkötött antitestek koncentrációját pedig a különbség alapján számítjuk ki a teljes beadagolt antitestmennyiség ismeretében. A kötődési adatokat ismert statisztikai módszerekkel dolgozzuk fel, amilyen pl. a G. Scatchard által leírt módszer (Ann. Ν. Y. Acad. Sci. 51, p. 660-672, 1949).
A találmány szerinti monoklonális antitest affinitási állandója az előbbiekben leírt kísérletben (1,42 ± 1,5) x 107l Jnól-1.
A találmány tárgya: a találmány szerinti monoklonális antitesteknek az urokináz üzemi méretű tisztítására való felhasználása, egy immunadszorpciós rendszerben.
A szakember számára nyilvánvaló, hogy egy üzemi méretű eljárásban való felhasználásra nem bármely monoklonális antitest alkalmas, amely egy adott antigén (a jelen esetben urokináz) ellen irányul. Ténylegesen ismeretes, hogy a „laboratóriumi” és az „üzemi” méretű műveletek között rendszerint szakadék tátong.
A nagyságrendi változás ténylegesen jelentősen növeli a megoldandó problémák körét és számos esetben egy olyan megoldás, amely a laboratóriumi méretű művelet esetében megfelelő, nem alkalmas az üzemi méretű műveletben való alkalmazásra.
A jelen esetben a megfelelő monoklonális antitestet az kell hogy jellemezze, hogy optimális affinitással rendelkezik az antigén iránt, annak érdekében, hogy hatékonyan kösse meg az antigént Uyen körülmények között. így lehetségessé válik a kötött antigén átöblítése anélkül, hogy lényeges leoldás következne be, és a mátrixról való eltávolítás lényegesen eltérő körülmények között végezhető.
A leválasztás körülményeinek viszont eléggé enyhének kell lenniük annak érdekében, hogy elkerüljük akár az antigén, akár az immunadszorbens károsodását.
Mivel bizonyos mértékben az antitest antigén iránti affinitása határozza meg a végső immunadszorbens kapacitását, az antitest iránti alacsony affinitás általában az immunadszorbens túlságosan alacsony kapacitásával jár együtt és ennek a következménye az alacsony tisztítási hatásfok (pl. mivel aktivitásvesztés következik be az átöblítés alatt). Ezzel szemben az antitest magas affinitása általában arra vezet, hogy az antigén túl erősen kötődik az immunadszorbenshez, és ennek a következménye az alacsony kitermelés, mivel pl. az eluálás nehézségekkel jár, vagy túlságosan drasztikus (és esetleg denaturáló) eluációs körülményeket kell alkalmazni. A monoklonális antitest affinitási állandója és a megfelelő immunadszorbens kapacitása nem a kizárólagos kritikus paraméterek egy immunadszorpción alapuló üzemi méretű tisztítási eljárásban, mivel a monoklonális antitest szelektivitása ugyancsak nagyon fontos szerepet játszik ebben a folyamatban.
A találmány szerinti monoklonális antitestek ténylegesen megkötik a nagy molekulatömegű urokinázt, de nem kötik meg az alacsony molekulatömegű alakot vagy bármely más, szérumban vagy vizeletben előforduló enzimesen aktív endopeptidáz-féleséget.
Közelebbről: nem mutatnak keresztreakciót az ismert szérum- vagy vizeleteredetű tromboplasztinszerű szennyezésekkel. Ezenkívül a találmány szerinti monoklonális antitestek fenntartják specificitásukat a végső immunadszorbensben, a mátrixhoz kötődve is.
Konkrétan: a találmány szerinti monoklonális antitestek - amelyekre az előbbiekben leírt specificitás jellemző -, mint már amlítettük, az előbbiekben leírt kísérletben (1,42± 1,5) x 107ljnól-1 affinitási állandót mutatnak és a megfelelő mátrixhoz kapcsolva olyan immunadszorbenst eredményeznek, amelynek kapacitása 150 000 IU/ml-nél magasabb.
A találmány szerinti monoklonális antitestek tehát IgGj típusú anyagok; affinitási állandójuk kb. (1,42± 1,5) x 107ljnól-1 az előbbiekben leírt kísérletben (amely rögzített urokinázt alkalmaz); jó a specificitásuk az urokináz nagy molekulatömegű alakja vagy ennek egyláncú prekurzora iránt, anélkül hogy kötődnének az alacsony molekulatömegű alakhoz
HU 203 257 Β vagy keresztreakcióba lépnének az urokináztól különböző szérum vagy vizelet endoproteázokkal; és a megfelelő mátrixhoz kötődve olyan immunadszorbens mátrixokat képesek eredményezni, amelyek kapacitása 150000 IU/ml-nél magasabb; képesek megkötni az antigént pH 4,5 és 8,0 között, még max. kb. 0,5M vizes nátriumklorid-oldatban is és a megkötött antitest pH 3,0-4,0 között 0,5-1M vizes nátriumkloríd-oldattal leoldható. A találmány szerinti kitüntetett monoklonális antitest jelzése 5B4 és a következő jellemzőket mutatja:
a) az IgG j osztályba tartozik;
b) affinitási állandója kb. 1,42 x 107 mól-1 lényegében a Tsapis et al. által leírt eljárást (Eur. J. Biochem. 64, p. 369,1976) követve végezve a mérést;
c) specifikusan az urokináz nagy molekulatömegű (54000) alakját vagy ennek prekurzorát köti meg anélkül, hogy az alacsony molekulatömegű (33 000) alakot vagy bármüyen szérum vagy vizeleteredetű tromboplasztinszerű urokinázszennyezést megkötne;
d) megköti az A-lánc 18 000 molekulatömegű proteolízissel előállított fragmentjét,
e) nem károsítja a deszorbeált urokináz enzimaktivitását;
f) izoelektromos pontja kb. 5,75.
Jellegzetes mátrixok, amelyek alkalmasak a találmány szerinti monoklonális antitestekkel való kapcsolásra, a keresztkötéses dextrán és az ellenőrzött pórusú keresztkötéses dextrán, agaróz, a módosított és aktivált agaróz, pl. a karboximetil-agaróz, a keresztkötéses agaróz N-hidroxi-szukcinimid-észter származékai, a cellulóz és a karboximetil-cellulóz. Ezek a mátrixok sok esetben a kereskedelemben hozzáférhetők akár aktivált, akár nem aktivált alakban. Az aktivált mátrixokat általában előnyben részesítjük, mivel, mint ismeretes, kezelésük a kapcsolási reakcióban előnyösen oldható meg.
A találmány szerinti immunadszorbens elkészítése során a kitüntetett mátrix az aktivált agaróz. A találmány szerinti monoklonális antitestnek a mátrixhoz való kapcsolása ismert módon végezhető. Ha az alkalmazott mátrix nem aktivált, a kapcsolást előnyösen ismert aktiválószerek - pl. cianogén bromid, epiklórhidrin, l,4-bisz(2,3-diepoxi-propioxi)-bután vagy 3amino-propil-trietoxi-szilán - segítségével végezzük.
A találmány szerinti immunadszorbens egyik kitüntetett alkalmazási területe az 54000 molakulatömegű urokináz vagy prekurzora biológiai forrásokból kiinduló tisztítása, különösen az üzemi méretű tisztítás. Ezenkívül az immunadszorbens előnyösen alkalmazható analitikai teszt-rendszerekben, pl. radioimmun-vizsgálatokban, enzimekkel összefüggő immunvizsgálatokban és más ismert, kompetitív kötődésen alapuló vizsgálatokban, az antigén iránti affinitása és a megkötött monoklonális antitest specificitása miatt.
A találmány egy további tárgya: eljárás az 54000 molekulatömegű urokináz (HMW urokináz) vagy prekurzora biológiai anyagokból kiinduló tisztítására, amely abból áll, hogy egy biológiai forrást vagy ennek koncentrátumát érintkezésbe hozunk egy, a találmány szerinti immunadszorbenssel, pH 4,5-8,0 között, annak érdekében, hogy szelektíve megkössük az 54000 molekulatömegű urokinázt a találmány szerinti immunadszorbensen; a rendszert pH 6-8 között pufferolt oldattal öblítjük át és a megkötött antigént felszabadítjuk az immunadszorbensről, vizes oldattal amely nátriumkloridra 0,5-1 M-os - pH 3,0-4,0 között végezve az eluációt.
Ebben az eljárásban az antigénnek az immunadszorbenshez való kötődése elérhető 0,5M-ig terjedő nátriumklorid koncentrációk mellett is, vizes oldatban, míg az antigén felszabadítása a komplex antigén/immunadszorbens rendszerből 0,5-1M nátriumklorid koncentrációk mellett - vizes oldatban történhet.
Mint ez a szakember számára ismert, a vizes nátriumklorid-oldat helyettesíthető bármely ekvivalens töménységű vizes oldattal, amely nem befolyásolja kedvezőtlenül a tisztítási eljárás menetét.
A leírásban és az igénypontokban a „biológiai források” kifejezés körébe a következők tartoznak: biológiai folyadékot (pl. vizelet és vér), szövettenyészetek folyadékai és genetikai úton előállított olyan mikroorganizmusok fermentációs tenyészetei, amelyek képesek a találmány szerinti monoklonális antitest által felismerhető urokináz vagy plazminogén aktivátor termelésére.
Mint már említettük, a találmány szerinti immunadszorbens képes az urokináz nagy molekulatömegű alakjának közvetlenül a biológiai forrásokból kiinduló tisztítására. Ha pl. a biológiai forrás emberi vizelet, a következő tulajdonságokkal rendelkező urokinázterméket kapunk:
a) fibrinolítikus titere 130000 IU/ml-nél magasabb;
b) nagy mennyiségben tartalmaz magas molekulatömegű urokinázt;
c) gyakorlatilag mentes az alacsony molekulatömegű urokináztól;
d) fibrinolitikus/észteráz aktivitásának aránya 2000nél magasabb;
e) gyakorlatilag mentes a tromboplasztinszerű szenynyezésektől (nulla koagulációs aktivitás kb. 200 IU/ml koncentrációknál).
Bármely más biológiai forrásból kiindulva lényegében az előbbi jellemzőkkel rendelkező urokináztermékhez juthatunk.
Az üzemi méretű tisztítás gyakorlatában egyes esetekben előnyös lehet a biológiai folyadék mint olyan helyett a biológiai folyadék koncén trátumának alkalmazása a találmány szerinti immunadszorbens segítségével végzett tisztítási folyamatban, annak érdekében, hogy csökkentsük az immunadszorbenssel érintkezésbe hozott (vagy az immunadszorbenst tartalmazó oszlopon átvezetett) folyadék térfogatát, következésképpen csökkentsük az egész művelet időtartamát és költségeit.
A találmány szerinti immunadszorbens ebben az esetben is megőrzi hatékonyságát és a fenti jellemzőkkel rendelkező tisztított terméket eredményez.
HU 203 257 Β
A találmány egyik tárgyát képező tisztítási eljárásban alkalmazható monoklonális antitest kiválasztása problémájának jobb megvilágítása érdekében bemutatjuk a következő táblázatot. Ez a találmány szerinti kitüntetett - 5B4-nek nevezett - monoklonális antitest és egy, Salemo et al. által leírt (Proc. Natl. Acad. Sci. 81, p. 110,1984) és mAB 105.1F 10-zel jelzett (az 5B4-éhez hasonló affinitási állandóval rendelkező) monoklonális antitest összehasonlításának eredményeit mutatja be.
I. táblázat
Az 5B4 és a 105.1F10 monoklonális antitest (mAB) affinitási állandói mAB Ka(ljnór')
105.1F10 4,92 x 106
5B4 1,42 xlO7
Ez a két monoklonális antitest - amely azonos osztályhoz (mindkettő IgGj) tartozik - azonos mennyiségben azonos mennyiségű aktivált agarózhoz kapcsolva (Affi-gel R10) lényegesen eltérő eredményeket ad urokinázkészítmények tisztításában.
Közelebbről: ha azonos tisztaságú (897 észterolitikus egység) urokinázkészítményeket vezetünk át a két különböző immunadszorbensen, a megkötött frakció mennyisége a 105.1F 10 esetében 10%-nál alacsonyabb és az mAB 5B4 esetében 70%-nál magasabb (azaz 77,5%).
A találmány szerinti monoklonális antitestek - az antigén iránti affinitásuk és specifikusságuk folytán előnyösen alkalmazhatók a vizsgálati vagy meghatározási eljárásokban. Különböző markerekkel (pl. fluoreszkáló festékekkel, radioizotópokkal és enzimekkel) jelölhetők és felhasználhatók az immunfluoreszcenciában, radioimmunvizsgálatokban vagy az enzimes immunvizsgálatokban.
A találmány egy további tárgya ezért a humán urokináz vagy ennek egy prekurzora enzim-immunvizsgálata, a találmány szerinti monoklonális antitestek segítségével.
A humán urokinázt rendszerint fibrinolitikus vagy észterolitikus módszerrel határozzuk meg. Az első módszer egy vérrög lízisén alapul, amely annak eredményeként keletkezett, hogy az urokináz aktiváló hatására a plazminogén plazminná alakult át. A második módszer alapját az képezi, hogy az urokináz közvetlenül hidrolizál egy szintetikus szubsztrátumot, az acetü-lizin-metil-észtert (ALME). Ezért ezek a módszerek csak az enzim aktív alakját mutatják ki. Az urokináz inaktív prekurzorai - pl. a preprourokináz vagy a prourokináz - vagy az inhibitor-enzim komplexek üy módon nem határozhatók meg. Azok az immunológiai vizsgálatok viszont, amelyek a molekula antigén tulajdonságain - és nem az aktivitásán - alapulnak, lehetővé teszik mind az enzim aktív, mind inaktív alakjának meghatározását.
Egy nagyon célszerű immunmeghatározási módszer - amely az urokináz vagy egy „inaktív” prekurzora (pl. egy urokináz zimogén vagy a prourokináz) ki6 mutatására vagy meghatározására használható fel, a „kettős antitest szendvics” eljárás, amely a következőkből áll:
a) egy kísérleti oldatot, amely az antigént tartalmazza, reagáltatunk egy 1. anti-urokináz antitesttel - amelyet szilárd fázisú hordozón rögzítettünk - az antigénnek a szüárd fázishoz kötése érdekében;
b) a megkötött antigént érintkezésbe hozzuk egy, a 2. anti-urokináz antitestet tartalmazó oldattal, amelyhez előzetesen egy meghatározható markert kapcsoltunk (ennek során az 1. és a 2. antitest közül az egyik a találmány szerinti monoklonális antitest);
c) kimutatjuk vagy meghatározzuk az antigént annak alapján, hogy a meghatározható marker müyen mértékben kötődött a szilárd fázisú hordozóhoz.
Az 1. antitestet előnyösen a következők közül választjuk ki: anti-urokináz antiszérum, anti-urokinázzal tisztított immunglobulin G (IgG j) és egy monoklonális antitest, amelyről ismert, hogy az antigén egy olyan helyéhez kötődik, amely nem azonos a 2. antitest kötődési helyével (és nyilvánvalóan nem befolyásolja a 2. antitest kötődését). A „meghatározandó oldat” bármely olyan oldat lehet, amelyről feltételezhető, hogy tartalmazza a találmány szerinti monoklonális antitest által megköthető antigént, üyen pl. valamely biológiai folyadék, a fennentlevek, amelyeket pl. génsebészeti úton kapott mikroorganizmusokkal áüítottunk elő, valamint a sejttenyészetek folyadéka és kivonatai. A 2. antitest előnyösen egy, a találmány szerinti monoklonális antitest, egy megfelelő, meghatározó ligandumhoz kapcsolva, amilyen pl. egy enzim, egy fluoreszcens festék vagy egy radioaktív csoport. Kitüntetett meghatározó marker egy enzim, és a kitüntetett „marker” a torma-peroxidáz. A találmány szerinti kitüntetett monoklonális antitest az előbbiekben leírt 5B4 jelű monoklonális antitest.
Ha mind az 1., mind a 2. antitest monoklonális amelyek közül az egyik a találmány szerinti monoklonális antitest, míg a másik egy további, humán urokináz elleni monoklonális antitest, amely az antigénnek nem ugyanahhoz a helyéhez kötődik, mint a találmány szerinti antitest és amelynek a kötődése nem befolyásolja a találmány szerinti monoklonális antitest kötődését, ezek általában az előbbiekben leírt meghatározási eljárásban felcserélhetők. Más szavakkal: a két monoklonális antitest közül bármelyik lehet az 1., és a fennmaradó 2. antitest és vica versa. Ezzel szemben olyan vizsgálat esetében, amelyben az egyik „antitest” egy szokásos antiszérum, ezt csaknem kivétel nélkül az 1. antitestként alkalmazzuk, mivel ebben az esetben a rendszer hatékonysága nagyobb, mint a fordított esetben.
A monoklonális antitestnek az enzim markerhez való kapcsolását ismert módszerekkel végezzük. Kitüntetett kapcsoló reagens a glutáraldehid. Ha a meghatározható marker egy enzim, színfejlesztő, kromogén enzimszubsztrátumot alkalmazunk; ez a jelölő enzim ismert szintetikus szubsztrátuma, amely az en-61
HU 203 257 Β zimmel való inkubálás után színes származékot eredményez. A szín intenzitását a vizsgálati vegyűlet standard készítményeiből kifejlesztett színekkel összehasonlítva mérjük és értékeljük. Ezeken a kvantitatív vonatkozásokon kívül a módszer minden esetben kvalitatív célokra is alkalmazható, amikor egyszerűen azt akarjuk kimutatni, hogy az antigén jelen van-e egy ismeretlen mintában.
A szilárd fázisú hordozó előnyösen cellulózrészecskéket, poliakrilamidot, keresztkötéses dextránokat, szilikongumit, mikrokristályos üveget és műanyagot jelenthet, mégpedig előnyösen formázott anyagokat, így műanyagból - pl. polistirolbol, polipropilénből vagy pdivinilkloridból - öntött csöveket, lapokat vagy mikrdemezeket. Előnyben részesítjük szilárd fázisú hordozóként a polivinil-mikrolemezeket. A találmányszerinti módszer kitüntetett alkalmazási tartománya 15-100 mg/ml antigén. Mint ez a szakember számára nyilvánvaló, ha a minták antigén-koncentrációja ezeken ahatárokon kívül helyezkedik el, a meghatározandó mintákat előzetesen hígítani, vagy adott esetben töményíteni kell annak érdekében, hogy közelítően ezt az optimális koncentrációtartományt érjük eL A módszert a meghatározáson belüli és a két meghatározás közötti pontosság és az analitikai visszanyerés meghatározásával hitelesítjük. A meghatározáson belüli pontosság (CV) általában 4-8%, a két meghatározás közötti pontosság (CV) általában 7-23%, míg azanalitikai visszanyerés 87-114%. Kimutattuk, hogy a találmány szerinti monoklonális antitest specifikus egy urokinázszeríí plazminogén aktivátor prekurzor vonatkozásában is (ez egy egyláncú prekurzor, amelyet humán epidermoid ráksejtek, az A431 sejtek termelnek, [ATCC CRL1555, Fabricant et al., Proc. Netl. Acad. Sci. 74, p. 565, (1977)] és a találmány szerinti eljárás alkalmazásával meghatároztuk a keletkezett prekurzort
A találmány további illusztrálására a következő példákat mutatjuk be, amelyek nem tekinthetők a találmány oltalmi köre vonatkozásában korlátozó jellegűnek:
1. példa
Az 5B4 anti-urokináz monoklonális antitest előállítása
a) Az anti-urokináz monoklonális antitest előállítása hetes nőnemű Balb/C egerek immunizálására nagy tisztaságú, 54000 dalton molekulatömegü urokinázt - 120000 IU/mg, (PERSOLVr R1CHTER) - használunk fel. Ebből az urokinázból 10 pg-t komplett Freund-f. adjuvánsban oldva injektálunk az állatok hashártyájába, 60 nappal a fúzió előtt.
nap múlva további 10 pg urokinázt adagolunk az egerekbe. 10 nappal a fúziót megelőzően a szokásos ELISA-módszerrel mérjük az anti-urokináz antitest-szintet a farokvénákból vett vérmintákban. 5 nappal a fúzió előtt egy utolsó amlékeztető injekciót (10 pg) adunk i. v. azoknak az állatoknak, amelyek antitest-titere 1:10000-nél magasabb. Ezután a fúzió napján eltávolítjuk a lépet és a lépsejteket (kb. 1 x 10°) 5 x 107 x 63-Ag-8653 egér mielómasejttel 50%-os PEG 6000-ben fúziós reakcióba visszük.
A fúzió megtörténte után - amelyet lényegében Milstein és Köhler módszerét követve hajtunk végre - a sejteket újra szuszpendáljuk Dulbecco-f. módosított Eagle-f. táptalajban (DMEM), amelyet 10% borjúembrió szérummal és HAT táptalajjal (0,1 mM hipoxantin, 0,25 mM aminopterin,
0,017 mM timidin, Flow Laboratories) egészítettünk ki és 5 különböző, a Costar cég által gyártott Costar lemezre visszük fel, amelyek egér makrofágokat (tápréteg) tartalmaznak.
A HAT táptalajt 3 naponként cseréljük és a fúzió utáni 10. napon és ezt követően 2-3 naponként ELISA immunmeghatározási módszerrel megvizsgáljuk a felül úszó anti-urokináz monoklonális antitest tartalmát.
b) Az anti-urokináz monoklonális antitest termelő hibridómák kiszűrése ELISA-módszerrel
A Perlman-módszer egy módosított változatát követve (Immunochemistry 8, p. 873,1971) 96 helyes rugalmas mikrotitráló lemezeket (Dynatech) pl/lyuk mennyiség alkalmazásával bevonunk egy oldattal, amely 20 pg/ml urokinázt tartalmaz pH 7,2 foszfát-pufferes sóoldatban, valamint pH 7 nátriumfoszfát oldattal, amely 0,5M nátriumkloridot tartalmaz, és a lemezeket 1 órán át szobahőmérsékleten inkubálják. Alapos mosás után - 0,05%
Tween 20-at tartalmazó foszfát-pufferes sóoldattal V
- a lyukakba 3% szérumalbumint (szarvasmarha) tartalmazó foszfát-pufferes sóoldatot mérünk és a lemezeket 3 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, a nem specifikus kötődés elkerülésére. Alapos mosás után 50 pl hibridóma tenyészet felülúszót (vagy ugyanilyen térfogatú aszcitesz folyadékot) adagolunk a lyukakba és 2 órán át szobahőmérsékleten lefolytatjuk a reakciót. A lemezeket ezután mossuk és 90 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk egy torma-peroxidázzal konjugált nyúl-antiegérlg-ből(PI61,DAKO) készített 1:1000 hígítással. Alapos mosás után a lemezeket 200 pg/lyuk mennyiségben a kromogén oldatával kezeljük (SIGMA : 1 mg/ml o-fenilén-diamén pH 5,0,lM citrátpufferben, amely H2O2-ra 1,7M)· A szín 20 perc alatt kifejlődik Az optikai sűrűséget 492 nm-en olvassuk le olyan vakoldattal szemben, amely sem antigént, sem antitestet nem tartalmaz.
Pozitívnek tekintjük azokat a lyukakat, amelyek folyadéka a vakoldathoz képest több, mint négyszeres színintenzitású,
c) Az anti-urokinázt termelő hibridómák tömegtenyésztése
Az anti-urokináz antitesteket termelő hibridómákat elkülönítjük, a hígítás korlátozása mellett klónozzuk, tömegtenyészetekben tenyésztjük és injekcióval bevisszük Balb/C egerek hashártyájába, amelyeket előzetesen 0,5 ml prisztánnalR (2,6,10,-14tetrametil-pentadekán, Aldrich) kezeltünk. 15 nap elteltével összegyűjtjük az aszcitesz folyadékokat.
Az anti-urokináz monoklonális antitestek koncent7
HU 203 257 Β rációja a 10-20 mg/ml tartományban helyezkedik el. A tisztítást protein-A Sepharose-zal (Pharmacia), vagy urokináz-Sepharose affinitáskromatográf iával végezzük.
d) Az anti-urokináz monoklonális antitestek tisztítása 5 affínitáskromatográfíával, Sepharose8-urokináz oszlopon
Sepharose-urokináz konjugátumot állítunk elő oly módon, hogy CNBr-dal aktivált Sepharose-t nagy tisztaságú HMW urokinázzal (120000 IU/mg) reá- 10 gáltatunk. A kapcsolási hatásfok kb. 20 mg urokináz/duzzadt gél. Az előbbiek szerint előállított aszcitesz folyadékot (1 ml/termelő hibridóma) ezután felvisszük a Sepharose-urokináz affinitáskromatográfiás oszlopra (1,6 cm x 15 cm), amelyet előze- 1S tesen pH 8,0 0,01M nátriumfoszfát pufferrel hoztunk egyensúlyba. Ugyanezzel a pufferrel végzett öblítés után a szelektíven adszorbeálódott anti-urokináz monoklonális antitesteket pH 3,0 0,lM ecetsav pufferrel eluáljuk. Az antitestet tartalmazó 20 frakciókat összeöntjük és PSDE 09005 (Milüpore cég által gyártott membránon való ultraszűréssel betöményítjük, majd felhasználásig fagyasztva tároljuk.
e) A monoklonális antitestkészítmények tisztasága- 25 nak és homogenitásának meghatározása gélelektroforézissel
Az előbbiek szerint előállított monoklonális antitesteket SDS-PAGE-nek (nátrium-dodecilfoszfátpoliakrilamid gélelektroforézisnek) vetjük alá a W. 30
K. Laemmli által leírt módszer szerint (Natúré 227, p. 680, 1970). Csak az IgG nehéz és könnyű láncának megfelelő sávok észlelhetők; ez arra mutat, hogy az előbbiek szerint előállított eluátum tiszta immunglobulinokat tartalmaz. 35
f) Az affinitás! állandó meghatározása
20%-os Sepharose-urokináz szuszpenzióból - amelyet pH 7 foszfátpufferes sóoldattal készítettünk el - alikvot mennyiségeket (0,5-0,5 ml-t) adagolunk növekvő koncentrációjú tisztított anti-urokináz 40 monoklonális antitestkészítményekhez (ezeket az előbbi d) pont szerint állítottuk elő és pH 7 foszfátpufferes sóoldatban dializáltuk). A mintákat 2 órán át szobahőmérsékleten egy keverődobban forgatjuk. A kontrollokhoz nem adagoltunk gyantát. 45
A meg nem kötött antitest koncentrációját spektrofotometriásán határozzuk meg 280 nm-en (Ej**-14), míg a megkötött antitest koncentrációját a különbség alapján számítjuk ki a beadagolt antitest teljes mennyiségének ismeretében. Vala- 50 mennyi, a kötődésre vonatkozó adatot Scatchard szerint dolgozzuk fel (Amm. Ν. Y. Acad. Sci. 51, p. 660-672,1949). Az 5B4 jelű monoklonális antitest affinitási állandója 1,42 x 107 ljnól-1.
2. példa
Az 5B4 anti-urokináz monoklonális antitest rögzítése aktivált agarózon.
Aktivált agarózt (Affi-gel 10K, Bio-rad Inc., 14 g, nedves; keresztkötéses agaróz gyöngyök, N-hidroxi- 60 szukcinimid aktív észter származék, 10 atomnyi hosszúságú tőltésmentes távkarral) 3 térfogatnyi ízopropilalkohollal és 3 térfogatnyi hideg desztillált vízzel mosunk 20 percen át. A gélt ezután pH 8 1M nátriumhidrogénkarbonát pufferben szuszpendáljuk (végtérfogat 20 ml). A gélszuszpenzióhoz hozzáadunk az előbbiek szerint előállított nagy tisztaságú 5B4 monoklonális antitesteket pH 8 1M nátriumhidrogénkarbonát pufferben szuszpendálva (9,7 ml). 4 órai állás után, szobahőmérsékleten, 1,5 ml pH 8 1M vizes etanolamin-hidrokloridot adagolunk a gyanta nem reagált észtercsoportjainak megkötésére. A blokkolási reakció szobahőmérsékleten 1 óra alatt lezajlik A gélt ezután betöltjük egy oszlopba és a következőkkel mossuk: 10 térfogatnyi kapcsoló puffer (0,lM pH 9 vizes nátriumhidrogénkarbonát), 0,lM vizes ecetsav, majd 0,lM vizes ecetsav, amely nátriumkloridra 1M töménységű és végül pH 7 0.05M vizes nátriumfoszfát puffer, amely nátriumkloridra 0,5M. A kapcsolás hatékonyságát spektrofotometriásán értékeljük ki 280 nm-en, a reakció előtt és után mérve a felülúszó optikai sűrűségét. A meghatározás előtt a mintákat pH 2-re állítjuk be annak érdekében, hogy a leolvasás során kiküszöböljük az N-hidroxi-szukcinimid interferenciáját.
ml gyantára számítva 2,5-4 mg 5B4 monoklonális antitestet rögzítettünk.
3. példa
a) Az 5B4-agaróz immunadszorbens kapacitásának meghatározása
Az 5B4 agaróz piaximális kapacitását „tiszta” és „nyers” urokinázkészítményekkel határozzuk meg. 5B4 agaróz oszlopot (1,6 x 10 cm) pH 7 0,5M NaG0.05M Na-foszfátpuffer oldattal hozunk egyensúlyba és az oszlopra „tiszta” urokinázt viszünk fel (120000 IU/mg), amíg eszterolitikus aktivitás mutatható ki a kifolyóban. Az oszlopot ezután az egyensúlyozó pufferrel mossuk és az enzimet 1M NaG-0,lM ecetsav oldattal végzett eluációval deszorbeáljuk. Az oszlop maximális kapacitásának a megkötött frakcióban kinyert teljes aktivitást tekintjük.
Az urokináz (120000 IU/mg) esetében az 5B4 agaróz kapacitása 216000 IU/ml.
Ugyanezt a kísérletet megismételjük egy nyers urokinázkészítmény (700 IU/mg) felhasználásával. Ekkor 174 000 IU/ml kapacitás értéket kapunk.
b) A HMW, LMW urokináz és a 18000 molekulatömegű, proteolízissel előállított urokináz fragmentum immunadszorpciója 5B4 agarózon Tisztított HMW urokinázt (30 mg) 8 órán át inkubálunk 1 ml pH 8 50mM nátriumfiszfát pufferben, amely NaCl-ra, 0,2M töménységű. Kb. 4:4:2 arányban HMW és LMW urokinázt, ill. 18 000 molekula tömegű proteolitikus fragmentumot kapunk. Ezeket a termékeket gélszűréssel különítjük el egy keresztkötéses, ellenőrzött molekulatömegű polidextrán (Sephadex8 G100, szuperfinom; 1,5 x 100 cm) alkalmazásával. Az oszlopot előzetesen 5mM nátriumfoszfát pufferrel egyensúlyoztuk ki (pH 4), amely NaG-ra 0,2M-81
HU 203 257 Β os. Az eluálást ugyanazzal az oldattal végezzük, 3 ml/óra áramlási sebességgel. Ezután összeöntjük az egyes termékeket tartalmazó frakciókat. Skaláris mennyiségű (az előbbiekben leírtak szerint előállított), 5B4-agaróz szuszpenziókat, pH Ifi foszfátpufferes sóoldatban, amely 0,l/térf/térfy% TweenR20-at tartalmaz, adunk hozzá kémcsövekhez, amelyekbe 0,5 ml-t mértünk be 250 pg/ml töménységű HMW, LMW urokinázoldatból és 18000 molekulatömegű proteolitikus urokináz fragmentum oldatból (ugyanezzel a pufferrel elkészítve) és a végtérfogatot ugyanezzel a pufferrel 1 fi ml-re állítjuk be.
A mintákat 1 órán át szobahőmérsékleten keverődobban forgatjuk, majd 5 percen át 2000 ford/perc sebességgel centrifugáljuk. A meg nem kötött anyagot oly módon határozzuk meg, hogy leolvassuk a felülúszó optikai sűrűségét 280 nm-en, a megkötött anyag mennyiségét a teljes hozzáadott mennyiség ismerete alapján a különbség képviseli.
A proteolízist ismert módon, az alábbiak szerint végezzük
A tisztított urokinázt 0,05 M foszfát pufferben (pH 7) feloldjuk és 120 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk majd felvisszük egy Sephadex G-100 szu perfinom oszlopra. Az eluálást 0,05 M foszfát puffer/0,2 M NaCl-dal végezzük & kapott három frakciót bekoncentráljuk és NaDod SO4/poliakrilamid elektroforézis gélen (12,5% akrilamid) analizáljuk Az egyes frakciók tartalmazzák az 54000,33000 és az 18000 dalton molekulatömegű urokinázt.
Ebben a kísérletben a HMW urokináz és a 18000 molekulatömegű proteolitikus fragmentum mennyiségének több, mint 90%-a immunadszorpcióval megkötődik a 5B4 agarózon, mig az LMW urokináz nem adszorbeálódik
4. példa
Az urokináz tisztítása immunaffinitás alapján 5B4 agarózon
Kromatográfiás oszlopot (1,6 x 9 cm) megtöltünk a 2. példa szerint előállított 5B4-agaróz immunadszorbenssel és egyensúlyba hozzuk pH 7 0,5M vizes nátriumklorid- 0,05M vizes foszfátpuff er oldattak Ezután egy nyers urokinázkoncentrátumot viszünk fel az oszlopra 60 ml/óra sebességgel. Az egyensúlyozó pufferrel végzett mosás után az urokinázt 1M vizes nátriumklorid-oldattal és 0,1M vizes ecetsawal eluáljuk
Az urokinázt tartalmazó frakciókat összeöntjük, semlegesítjük és fagyasztva szárít juk
A kinyert urokináz fajlagos aktivitása minden eset- ben nagyobb volt, mint 130000IU/mg. s
A kvantitatív adatokat a Π. táblázatban mutatjuk be. *
Π. táblázat
| Frakció | Térf. ml | Összes fibrinoli- tikusakt.a) IU | % | Összes észteroli- tikusakt.b) EU | Összes fehérje, mg | Faji. akt. IU/mg | Tisztítási faktor | IU/EU |
| Nyers kivonat | 186 | 1772394 | 100 | 897 | 2007 | 883 | - | - |
| Meg nem kötött frakció (A) | 270 | 141791 | 8 | 164 | - | - | - | 846 |
| Megkötött frakció (B) | 56 | 1374240 | 77,5 | 683 | 9,52 | 144353 | 163 | 2012 |
a) lényegében a British Pharmacopoea 1979. évi Addenduma módszere szerint végezve meghatározást
b) lényegében Sherry et al. (J. Láb. Clin. Med 64, p. 145,1964) módszere szerint végezve a meghatározást
1Π. táblázat
Tromboplasztinszerű szennyezések nulla koaguláció 193 IU/ml plazma mellett (a National Heart and Lung Institute, AEÁ szerinti nulla koagulációs érték 80 IU/ml plazma)
Akut toxieitás egérben: nem toxikus 100000 IU/kg iv. mellett
Szisztémás elviselhetőség kutyában: 20000 IU/kg mellett nincs jelentős változás az artériás vérnyomásban
A HPLC elemzése a nagy molekulatömegű (54 000) urokináz jelenlétére és a kis molekulatömegű (33 000) urokináz távollétére mutat.
A kapott urokináz tisztaságát nátrium-dodecilszulfát-poliakrüamidon végzett gélelektroforézissel is ellenőriztük. Ez a vizsgálat ténylegesen ugyancsak azt erősíti meg, hogy az 5B4-agarózon tisztított urokináz tennék lényegében az 54 000 molekulatömegű urokináz.
A kísérleteket többször (több mint 50 ciklus) megismételtük anélkül, hogy az eredményekben bármilyen jelentős változás következett volna be.
A megkötött frakciókban állandó jelleggel az osz9
HU 203 257 Β lopra felvitt fibrinolitikus aktivitás 70-80%-a mutatható ki. Ha a meg nem kötött frakciókat visszavisszük az oszlopra, a teljes aktivitás a kifolyóban mutatható ki. Fy arra mutat, hogy ez az aktivitás valószínűleg nem az urokináznak tulajdonítható, hanem inkább 5 egy aspecifikus, fibrinolitikus aktivitással rendelkező proteáz jelenlétére mutat, amely nem rokon az urokinázzal.
Lényegében az előbbi eljárást követve, de vizeletet (4 liter) alkalmazva vizeletkoncentrátum helyett 10 olyan urokinázt kapunk, amely lényegében az előbbi jellemzőkkel rendelkezik.
5. példa
A431 sejt f elülúszójának elállítása 15
A431 sejteket tenyésztünk Dulbecco-f. módosított Eagle-f. táptalajban, amely 10% borjúembrió szérumot (Flow Laboratories), 100 E/gl penicillint,
100 pg/ml streptomicint, (Flow Laboratories) és 2mM glutamint (Flow Laboratories) tartalmaz, 150 cm2 nö- 20 vekedési felületet biztosító műanyag tenyésztő lombikokban (NUNC), amíg a sejtek össze nem folynak. Ezután összegyűjtjük a felülúszókat, a sejtmaradékok eltávolítására centrifugáljuk és proteáz inhibitor (aprótinin, 10 gg/ml) jelenlétében a felhasználásig -80 °C- 25 on tároljuk.
6. példa
Az egyláncú urokináz prekurzor kinyerése és tisztítása A43j sejtekből 5B4-agarózon végzett immun- 30 affinitás-kromatográfiával.
Az 5. példa szerint előállított centrifugált felülúszóból 1,5 litert felviszünk egy 5B4-agaróz immunadszorbens oszlopra (10 mmx30 mm), amelyet lényegében a 2. példa szerinti eljárással állítottunk elő 35 és előzetesen pH 7 0,15M NaCl-0,05M Na-foszfát pufferrel hoztunk egyensúlyba; az áramlási sebesség 40 ml/óra. Az oszlopot 50 ml egyensúlyozó pufferrel mossuk és 1M NaCl-Ο,ΙΜ ecetsavoldattal eluáljuk. A frakciók urokináz antigén tartalmát a kettős antitest 40 szendvics immun-módszerrel vizsgáljuk meg, amely 5B4 monoklonális antitestek alkalmazását irányozza elő (1. a 70. példát). A kapott terméket (egyláncú urokináz prekurzor, SC-UK) pH 4,8-n -80 °C-on tároljuk.
Ennek a terméknek a fibrinolitikus aktivitását a fib- 45 rinlemez módszerrel határozzuk meg (J. Plough et al.; Biochim. Biophys. Acta 24, p. 278,1957), míg az amidolitikus aktivitást Sherry, et al. módosíott eljárásával (J. Láb. Clin. Med. 64, p. 145,1964) értékeljük, acetillizin-metilészter (ALME) alkalmazásával. Az aktivá- 50 lást úgy érjük el, hogy 10 gg tisztított SC-UK-t 4 gg plazminnal (Sígma) keverünk össze 0,4 ml vértérfogatban pH 6 0,5M NaCl-0,05M Na-foszfát pufferben.
Ezt szobahőmérsékleten végzett inkubálásköveti. Különböző időpontokban vett mintákban meghatározzuk 55 az amidolitikus aktivitást. A plazmin reakcióját úgy állítjuk le, hogy 10 gl pufferben oldva 100 gg aprotinint adagolunk.
Az SDS-poliakrilamid gélelektroforézist (SDS-PAfíF.) redukáló és nem redukáló körülmények között La- 60 emmli módszere (Natúré, 227, p. 1970) szerint végezzük. Az immun-foltképzési vizsgálatokat lényegében az előzőekben leírtak szerint végezzük (G. Salerao et el., Proc.Natl.Acad.Sci.81,p. 110,1984) olymódon, hogy az immunreakcióban tiszta MAB 5B4-t, antiurokinázt és (anti-szöveti PA)-antiszérumokat alkalmazunk.
Az MAB 5Β4 immun-foltképzési térképe arra mutat, hogy reakció megy végbe a HMW urokinázzal és a HMW urokináz A-láncából levezethető 18000 molekulatömegű proteolitikus fragmentummal. Ez azt jelzi, hogy a külső pontnak az A-láncon kell elhelyezkednie. Ha a HMW urokinázt beta-merkapto-etanollal redukáljuk, nem figyelhető meg redukció. Ez ahhoz a feltevéshez vezet, hogy a redukálószer által előidézett konformációváltozások károsítják a külső pontot.
A tennék SDS-PAGE elemzése egy fő sáv jelenlétére mutat, amely egy 52000 molekulatömegű egyszeres polipeptid láncnak felel meg. Ez az érték valamivel alacsonyabb, mint a humán urokináz SDS-PAGE-vel meghatározott látszólagos molekulatömege (54000). Az SC-UK monoklonális vagy poliklonális anti-urokináz antitestekkel végzett immun-foltképzési reakciói arra mutatnak, hogy a fehérje immunológiailag az urokinázzal rokon. Anti-szöveti PA-val nem figyeltünk meg reakciót.
Az SC-UK-t a továbbiakban fibrinolitikus és amidolitikus aktivitása tekintetében jellemezzük. Az SCUK fibrinolitikus aktivitása - a fibrinlemezmódszerrel mérve - 18 823 IU/ml (OD280) értékűnek bizonyul, azaz hetedakkora, mint a tiszta, 54000 molekulatömegű urokináz fajlagos aktivitása. Az amidolitikus aktivitás is - az ALME szintetikus szubsztátumon mérve - kb. 1/12-e volt az urokinázénak. Az amidolitikus aktivitás azonban plazminnal végzett kezelés után 8-szorosára nőtt. Ez a növekedés azzal függ össze, hogy az egyszeres láncú fehérje kettős láncúvá alakul át, amely elektroforetikusan hasonló a humán urokinázhoz. Ez azt erősíti meg, hogy az SC-UK a humán urokináz prekurzora.
A tisztításra vonatkozóan néhány kvantitatív adatot a következő oldalon lévő táblázatban mutatunk be.
7. példa
Kettős antitest szendvics (ELISA) módszer
Rugalmas, 96 lyukú mikrotitráló lemezeket (FALCON 3912) 100 gl/lyuk mennyiségben bevonunk tisztított anti-UK IgG-kel (egy előállítási módszert az utóbbival kapcsolatban a 8. példában mutatunk be), amelyet 1:200 arányban pH 7,2 PBS-sel hígítottunk (10 gg/ml IgG-ok) és 1 órán át 37 °C-on inkubálunk. 0,05%-os PBS-Tween oldattal való mosás után a lyukakat 2 órán át szobahőmérsékleten 250 gl/lyuk mennyiségben 3%-os PBS-BSA-val hozzuk érintkezésbe, a be nem vont műanyag felület blokkolására. Ezt az oldatot eltávolítjuk, mindegyik lyukba bemérünk 100 gl megfelelő hígítású standard urokinázoldatot -10% borjúembrió-szérummal dúsított Dulbecco-f. módosított Eagle-f. táptalajban (DMEM, Flow Laboratories) - vagy 100 gl A431 sejt-felülúszót és egy éjjelen át szobahőmérsékleten hagyjuk végbe-101
HU 203 257 Β
ΙΠ. táblázat
Az SC-UK tisztítása A43 j sejt felülúszóból 5B4-agaróz oszlopon végzett affinitáskromatográfiával
| Frakció | Térf. (ml) | Urokináz antigén3) | Fibrinolitikus aktivitás (U.I/ml) | Optikai sűrűség 280 nm | o • 00 • | |
| (pg) | % | |||||
| nyersanyag | 1100 | 265,0 | 100,00 | - | - | - |
| meg nem kötött frakció | 1150 | 6,7 | 2,5 | - | - | - |
| megkötött frakció | 6 | 176,7 | 66,7 | 640 | 0,034 | 18823 |
a) kettős antitest szendvics immunmeghatározási módszerrel mérve menni a reakciót. A mikrotitráló lemezeket ezután 0,05%-os PBS-Tween oldattal mossuk és 100 pj/lyuk mennyiségű 5B4-HRP konjugátummal (előállítási módját 1. a 9. példában) - amelyet 1:100 arányban 20 0,3% PBS-BSA-t és 0,05% Tween-t tartalmazó oldattal hígítunk - inkubáljuk 30 percen át 37 °C-on. Mosás után a mikrotitráló lemezeket 200 pl/lyuk mennyiségben 30 percen át 37 °C-on pH 5 O,1M nátriumcitráttal készített 1 mg/ml töménységű o-fenilén-diamin oldat- 25 tál inkubáljuk, amely H2O2-re nézve 5mM töménységű. A reakciót 4,5M H2SO4-gyel állítjuk le és 492 nmen leolvassuk az optikai sűrűséget. Külön-külön határozzuk meg a vakoldat, a standard oldatok és a vizsgálati oldatok optikai sűrűségének átlagértékeit. Miután 30 a vakoldat optikai sűrűségértékeit kivonjuk a standard oldatokéiból, illetve a meghatározandó mintákéiból, a meghatározandó minták urokináztartalmát úgy kapjuk meg, hogy a kalibrációs görbén interpoláljuk a megfelelő kompetíciós arány értékeket. A kalibrációs 35 görbét előnyösen féllogaritmikus papíron rajzoljuk fel: az egyes standard minták 492 nm-en mért optikai sűrűségét vesszük fel a megfelelő urokinázkoncentrációval szemben. Hitelesítési vizsgálatok arra mutatnak, hogy a meghatározáson belüli pontosság (CV) 4 és 40 8% között váltakozik, míg a meghatározások közötti pontosság (CV) általában 7-23%. Az analitikai visszanyerés 87-114%. Az alkalmazási tartomány 15100 mg/ml antigén.
8. példa
Anti-urokináz immunglobulinok tisztítása egy szokásos anti-UK antiszérumot kiindulva Nyúl anti-UK antiszérumot állítunk elő a szokásos immunizálási eljárás szerint, nagy tisztaságú, 54 000 50 molekulatömegü urokinázt (kb. 120000 IU/mg) alkalmazva.
Pontosabban: egészséges New Zealand fehér nyulakat immunizálunk 500 pg nagy tisztaságú, 54 000 molekulatömegű urokinázzal (kb. 120000 IU/mg), ame- 55 lyet komplett Freund-f. adjuvánsban oldunk
4,6 és 8 hét múlva emlékeztető oltásokat adunk ugyanilyen mennyiségű antigénnel, inkomplett Freund-f. adjuvánsban oldva. Az állatokból hetenként vérmintát veszünk és az anti-urokináz antiszémm en- 60 zim-immunmeghatározás segítségével meghatározzuk az anti-urokináz antitest titereket. 12 hét után az állatokat elvéreztetjük és fehérje-A Sepharose-on végzett affinitáskromatográfiával tisztítjuk az IgG immunglobulin frakciót.
A kapott antiszérumból 1 ml-t felviszünk egy Protein A-Sepharose oszlopra, 20 ml/óra sebességgel, amelyet előzetesen pH 8 0,1 M nátriumfoszfát H pufferrel hoztunk egyensúlyba (oszlopméret: a l,6cmx4 cm). Ugyanezzel a pufferrel való mosás ú után az IgG-okat pH 3 0, IM ecetsawal eluáljuk 2 ml- ** es frakciókat szedünk és az IgG-ok jelenlétét enzim- 7 immunmeghatározással mutatjuk ki. Az IgG-t tártálmazó frakciókat pH 7,2-re állítjuk be és felhasználá- -Ά sig -20 °C-on tároljuk.
IS
9. példa
Az 5B4 monoklonális antitest jelölése torma-pero- Λ xidázzal
Az MAB 5B4-t torma-peroxidázzal (HRP) jelöljük keresztkötést képző reagensként glutáraldehidet alkalmazva, a következő eljárás szerint. 100 mg HRP-t 200 pl pH 6,8 0,lM nátriumfoszfát pufferben oldjuk, amely 1% glutáraldehidet tartalmaz, és szobahőmérsékleten 18 órán át állni hagyjuk a rendszert, a reakció lefolytatására. A reakcióelegyet 0,9%-os NaCl oldattal szemben dializáljuk és ugyanezzel az oldattal a térfogatot 1 ml-re egészítjük ki. Ezután 1 ml 0,9%-os NaCl-ot adagolunk - amely 5 mg MAB 5B4-t és200 pl pH 9, 0,5M nátriumkarbonát oldatot tartalmaz - és 4 °C-on 24 órán át folytatjuk le a reakciót. A fennmaradó aktív csoportok blokkolására 100 pl 0,2M lizint adunk a rendszerhez és szobahőmérsékleten 2 órán át állni hagyjuk.
A keveréket ezután egy éjjelen át 0,9%-os NaCl-dal szemben dializáljuk és SephacrylR S-200 géloszlopon (oszlopméret: 1,6 cm x 100 cm) szűrjük át, amelyet előzetesen fiziológiás sóoldattal hoztunk egyensúlyba (áramlási sebesség: 14 ml/óra). A kromatográfiát oly módon követjük, hogy mérjük az áteresztést 280 nmen.
Az oszlop üres térfogatának megfelelő eluált anyagot (csúcs) összegyűjtjük és felhasználásig -20 °C-on tároljuk.
-111
HU 203 257 Β
Claims (22)
1. Eljárás monoklonális egér anti-humán-urokináz antitest-képző hibridómák előállítására - amelyek képesek, tenyésztés során, az alábbi tulajdonságokkal 5 rendelkező anti-humán-urokináz antitest képzésére:
a) IgGj osztályba tartozik,
b) affinitási állandója (1,42+0,71) x 107lmól-1 rögzített humán urokinázra vonatkoztatva, a mérést lényegében Tsapis és munkatársai eljárása szerint 10 (Eur. J. Biochem. 64, p. 369,1976) végezve,
c) kötődik a nagy molekulatömegű (54 000) urokinázhoz és/vagy ennek egyláncú prekurzorához anélkül, hogy kötődne a kis molekula tömegű (33 000) urokinázhoz, 15
d) megköti az urokináz A-láncának 18000 molekulatömegű proteolitikus fragmentumát,
e) az urokináz kivételével nem lép keresztreakcióba a szérumban vagy a vizeletben található enzimatikuson aktív endopeptidázokkal -, 20 azzal jellemezve, hogy egy 54000 molekulatömegű humán urokinázzal immunizált egérből vett limfocitákkal és ugyanezen állatfaj mielóma sejtjeivel szomatikus fúziót hajtunk végre, és a keresett anyagot termelő hibridómákat enzimes immunmeghatározás segítsé- 25 gével kiszűrjük a termelt antitest osztály specificitásának, affinitási állandójának és antigén specificitásának meghatározása mellett. (Elsőbbsége: 1984.08.31.)
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy limfocitaként egér lépsejteket és mielóma 30 sejtként egér mielóma sejteket alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1985.04.26.)
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mielómasejtként X63-Ag 8653 egér mielómasejteket (ATCC CCL61) alkalmazunk. (Elsőbbsé- 35 ge: 1984.08.31.)
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fúziót polietilénglikol jelenlétében hajtjuk végre. (Elsőbbsége: 1984.08.31.)
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez- 40 ve, hogy a fúziót 6000 molekulatömegű polietilénglikol (PEG 6000) jelenlétében hajtjuk végre. (Elsőbbsége: 1985.04.26.)
6. Eljárás az alábbi tulajdonságokkal rendelkező monoklonális egér anti-humán-urokináz antitest elő- 45 állítására:
a) IgGj osztályba tartozik,
b) affinitási állandója (1,42 + 0,71) x 1071 .mól-1 rögzített humán urokinázra vonatkoztatva, a mérést lényegében Tsapis és munkatársai eljárása szerint 50 (Eur. J. Biochem. 64. p. 369,1976) végezve,
c) kötődik a nagy molekulatömegű (54 000) urokinázhoz és/vagy ennek egyláncú prekurzorához anélkül, hogy kötődne a kis molekulatömegű (33 000) urokinázhoz, 55
d) megköti az urokináz A-láncának 18000 molekulatömegű proteolitikus fragmentumát,
e) az urokináz kivételével nem lép keresztreakcióba a szérumban vagy a vizeletben található enzimatikusan aktív endopeptidázokkal, 60 azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljá- 5 rással előállított hibridómát egy megfelelő gazdaszer- 1 vezetben vagy táptalajban tenyésztjük és az antitestet } kinyerjük. (Elsőbbsége: 1984.08.31.) j
7. A 6. igénypont szerinti eljárás olyan humán mo- j noklonális anti-urokináz antitest előállítására, amely- ;
nek izoelektromos pontja 5,75, azzal jellemezve, l hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított hib- { ridómát egy megfelelő gazdaszervezetben vagy tápta- j lajban tenyésztjük és az antitestet kinyerjük. (Élsőbb- l sége: 1984.08.31.) j
8. Eljárás az 54 000 molekulatömegű urokináz vagy J egyláncú prekurzora biológiai forrásokból kiinduló } tisztítására, azzal jellemezve, hogy a biológiai forrást j vagy koncentrátumát érintkezésbe hozzuk egy im- j munadszorbenssel - amelyet úgy állítunk elő, hogy I egy, a következő tulajdonságokkal rendelkező egér an- j ti-humán-urokináz antitestet:
a) IgG i osztályba tartozik,
b) affinitási állandója (1,42 ±0,71) x 107l mól-1 rögzített humán urokinázra vonatkoztatva, a mérést lényegében Tsapis és munkatársai eljárása szerint i (Eur. J. Biochem 64, p, 369.1976) végezve, )
c) kötődik a nagy molekulatömegű (54 000) urokináz- j hoz és/vagy ennek egyláncú prekurzorához anélkül, hogy kötődne a kis molekulatömegű (33 000) urokinázhoz,
d) megköti az urokináz A-láncának 18 000 molekulatömegű proteolitikus fragmentumát,
e) az urokináz kivételével nem lép keresztreakcióba a szérumban vagy a vizeletben található enzimatikusan aktív endopeptidázokkal -, hozzákapcsolunk agaróz vagy módosított vagy aktivált agaróz, keresztkötésű dextrán, cellulóz vagy karboximetil-cellulóz mátrixhoz pH 4,5-8,0 között, a rendszert pH 6-8 közötti pufferoldattal öblítjük át és a megkötött antigént leoldjuk az immunadszorbensről egy olyan oldattal való eluáiással, amely előnyösen
0,5-1 mól/1 nátriumkloridot tartalmazó 3,0-4,0 pH értékű vizes oldat. (Elsőbbsége: 1984.08.31.)
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antigénnek az immunadszorbenshez való kötését max. 0,5 mól/1 nátriumkloridot tartalmazó vizes oldatban végezzük (Elsőbbsége: 1984.08.31.)
10. A 8. igénypont szerinti eljárás a következő tulajdonságokkal rendelkező urokináz tisztítására:
a) fibrinolitikus titere 130 000 IU/mg-nál magasabb,
b) nagy mennyiségben tartalmazza a nagy molekulatömegű urokinázt vagy egyláncú prekurzorát,
c) gyakorlatilag nem tartalmazza a kis molekulatömegű urokinázt,
d) s fibrinolitikus/észteráz aktivitás aránya 2000-nél magasabb,
e) gyakorlatüag nem tartalmaz tromboplasztinszerű szennyezéseket (nulla koagulációs aktivitás 200 IU/ml koncentrációban), azzal jellemezve, hogy a tisztítási eljárást a megfelelő biológiai forrásból kiindulva végezzük. (Elsőbbsége:
1984.08.31.)
11. A 8. igénypont szerinti eljárás a következő tulaj12
-121
HU 203 257 Β donságokkal rendelkező humán urokináz prekurzor tisztítására:
a) egyláncú protein, amelynek molekulatömege 5054000,
b) amidolitikus aktivitása gyakorlatilag nulla, 5
c) fibrinolitikus aktivitása magas,
d) plazma-inhibitorok nem inaktiválják,
e) plazminnal kezelve kétláncú aktív plazminogén aktivá torrá alakítható, azzal jellemezve,.hogy a tisztítási eljárást a megfelelő 10 biológiai forrásból kiindulva végezzük (Elsőbbsége: 1984.08.31.)
12. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a monoklonális antitestet agaróz mátrixhoz kapcsoljuk. (Elsőbbsége: 1984.08.31.) 15
13. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan monoklonális antitestet alkalmazunk, amelynek Ízoelektromos pontja 5,75. (Elsőbbsége: 1984.08.31.)
14. Eljárás kettős antitest szendvics módszerrel an- 20 tigénként humán urokináz vagy prekurzora kimutatására vagy meghatározására, oly módon, hogy
- az antigént tartalmazó vizsgálandó oldatot reagáltatjuk egy első urokináz antitesttel, amelyet szilárd fázisú hordozón rögzítettünk az antigénnek a szí- 25 lárd fázishoz való kötésére,
- a megkötött antigénnel érintkezésbe hozunk egy második anti-urokináz antitestet tartalmazó oldatot, amely antitesthez egy meghatározható markert kapcsoltunk és 30
- az antigént kimutatjuk vagy meghatározzuk annak alapján, hogy a meghatározható marker milyen mértékben kötődött a szilárd fázisú hordozóhoz, azzal jellemezve, hogy az említett első és második antitest közül egyikként a 8. igénypont szerint előállított 35 monoklonális antitestet alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1985.03.29.)
15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 5,75-ös ízoelektromos ponttal rendelkező monoklonális antitestet alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1985.03.29.)
16. A14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első antitestként egy anti-urokináz antiszérumot, egy tisztított anti-urokináz immunglobulin G-t (IgG) vagy egy olyan monoklonális antitestet alkalmazunk, amelyről ismert, hogy az antigénnek más helyéhez kötődik, mint a második monoklonális antitest, és második monoklonális antitestként a 6. igénypont szerinti monoklonális antitestet alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1985.03.29.)
17. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tesztoldatként hígított, nem hígított vagy töményített biológiai folyadékokat vagy fermentleveleket, génsebészeti úton előállított mikroorganizmusok vagy sejttenyészetek kivonatait alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1985.03.29.)
18. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy meghatározható markerként a második antitesthez kötve egy enzimet alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1985.03.29.)
19. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jelle- a mezve, hogy meghatározható markerként a második í antitesthez kötve torma-peroxidázt alkalmazunk (El- » sőbbsége: 1985.03.29.)
20. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jelle- JA mezve, hogy szüárd fázisú hordozóként műanyag ré- 3 szecskéket alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1985.03.29.) .¼
21. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez- SI ve, hogy szilárd fázisú hordozóként mikrolemezeket alkalmazunk (Elsőbbsége: 1985.03.29.) -s
22. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez- « ve, hogy szilárd fázisú hordozóként alakos polivinil mikroleme/t alkalmazunk (Elsőbbsége: 1985.03.29.)
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB848422007A GB8422007D0 (en) | 1984-08-31 | 1984-08-31 | Anti-urokinase monoclonal antibody |
| GB858508244A GB8508244D0 (en) | 1985-03-29 | 1985-03-29 | Anti-urokinase monoclonal antibody |
| GB858510716A GB8510716D0 (en) | 1985-04-26 | 1985-04-26 | Anti-urokinase monoclonal antibody |
| PCT/EP1985/000428 WO1986001411A1 (en) | 1984-08-31 | 1985-08-21 | Anti-urokinase monoclonal antibody; its production and use |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT40574A HUT40574A (en) | 1987-01-28 |
| HU203257B true HU203257B (en) | 1991-06-28 |
Family
ID=27262453
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU853722A HU203257B (en) | 1984-08-31 | 1985-08-21 | Process for producing monoclonal antiurokinase antibodies and for cleaning and testing urokinase |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0192675B1 (hu) |
| KR (1) | KR930002834B1 (hu) |
| AT (1) | ATE56617T1 (hu) |
| AU (1) | AU590216B2 (hu) |
| CA (1) | CA1297818C (hu) |
| DE (1) | DE3579808D1 (hu) |
| DK (1) | DK176986A (hu) |
| ES (3) | ES8704351A1 (hu) |
| FI (1) | FI86255C (hu) |
| GR (1) | GR852008B (hu) |
| HU (1) | HU203257B (hu) |
| IL (1) | IL76187A0 (hu) |
| NO (1) | NO172549C (hu) |
| NZ (1) | NZ213125A (hu) |
| PT (1) | PT81050B (hu) |
| WO (1) | WO1986001411A1 (hu) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8604851D0 (en) * | 1986-02-27 | 1986-04-03 | Lepetit Spa | Immunosorbent-amidolytic method |
| WO1987006240A1 (en) * | 1986-04-14 | 1987-10-22 | The General Hospital Corporation | Heterobifunctional antibodies and method of use |
| AT388618B (de) * | 1987-05-05 | 1989-08-10 | Binder Bernd Dr | Verfahren zur quantitativen bestimmung von funktion und antigener konzentration einer in einer biologischen fluessigkeit enthaltenen substanz |
| US5811265A (en) * | 1988-08-19 | 1998-09-22 | The General Hospital Corporation | Hybrid immunoglobulin-thrombolytic enzyme molecules which specifically bind a thrombus, and methods of their production and use |
| US5609869A (en) * | 1988-08-19 | 1997-03-11 | The General Hospital Corporation | Hybrid immunoglobulin-thrombolytic enzyme molecules which specifically bind a thrombus, and methods of their production and use |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3790663A (en) * | 1970-07-07 | 1974-02-05 | Us Health | Preparation of dry antiserum coated solid-phase for radioimmunoassay of antigens |
| EP0084344A3 (en) * | 1982-01-14 | 1983-08-03 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Anti-urokinase monoclonal antibodies and process for preparing the same |
| BE896253A (fr) * | 1983-03-24 | 1983-07-18 | Wallone Region | Anticorps monoclonaux diriges contre l'urokinase humaine |
| WO1985000663A1 (en) * | 1983-07-25 | 1985-02-14 | Beckman Instruments, Inc. | Immunometric assay using polyclonal and monoclonal antibodies and a kit for use therein |
-
1985
- 1985-08-16 NZ NZ213125A patent/NZ213125A/en unknown
- 1985-08-19 GR GR852008A patent/GR852008B/el unknown
- 1985-08-21 AU AU47730/85A patent/AU590216B2/en not_active Ceased
- 1985-08-21 EP EP19850904112 patent/EP0192675B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-08-21 KR KR1019860700225A patent/KR930002834B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1985-08-21 DE DE8585904112T patent/DE3579808D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-08-21 WO PCT/EP1985/000428 patent/WO1986001411A1/en active IP Right Grant
- 1985-08-21 HU HU853722A patent/HU203257B/hu not_active IP Right Cessation
- 1985-08-21 AT AT85904112T patent/ATE56617T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-08-26 IL IL76187A patent/IL76187A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-08-29 CA CA000489659A patent/CA1297818C/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-08-29 PT PT81050A patent/PT81050B/pt not_active IP Right Cessation
- 1985-08-30 ES ES546594A patent/ES8704351A1/es not_active Expired
-
1986
- 1986-02-17 ES ES552073A patent/ES8707563A1/es not_active Expired
- 1986-02-17 ES ES552074A patent/ES8706445A1/es not_active Expired
- 1986-04-17 DK DK176986A patent/DK176986A/da not_active Application Discontinuation
- 1986-04-18 NO NO86861554A patent/NO172549C/no unknown
- 1986-04-24 FI FI861715A patent/FI86255C/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL76187A0 (en) | 1985-12-31 |
| EP0192675A1 (en) | 1986-09-03 |
| ES8707563A1 (es) | 1987-08-01 |
| NO172549B (no) | 1993-04-26 |
| NZ213125A (en) | 1991-06-25 |
| NO172549C (no) | 1993-08-04 |
| NO861554L (no) | 1986-04-18 |
| ATE56617T1 (de) | 1990-10-15 |
| ES552074A0 (es) | 1987-07-01 |
| FI86255C (fi) | 1992-08-10 |
| PT81050B (pt) | 1987-10-20 |
| ES552073A0 (es) | 1987-08-01 |
| FI861715L (fi) | 1986-04-24 |
| AU590216B2 (en) | 1989-11-02 |
| CA1297818C (en) | 1992-03-24 |
| EP0192675B1 (en) | 1990-09-19 |
| HUT40574A (en) | 1987-01-28 |
| ES546594A0 (es) | 1987-04-01 |
| ES8706445A1 (es) | 1987-07-01 |
| DE3579808D1 (de) | 1990-10-25 |
| KR930002834B1 (ko) | 1993-04-10 |
| ES8704351A1 (es) | 1987-04-01 |
| DK176986D0 (da) | 1986-04-17 |
| FI861715A0 (fi) | 1986-04-24 |
| GR852008B (hu) | 1985-12-30 |
| PT81050A (en) | 1985-09-01 |
| KR870700022A (ko) | 1987-02-28 |
| FI86255B (fi) | 1992-04-30 |
| DK176986A (da) | 1986-04-17 |
| AU4773085A (en) | 1986-03-24 |
| WO1986001411A1 (en) | 1986-03-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Nielsen et al. | Monoclonal antibodies to human 54,000 molecular weight plasminogen activator inhibitor from fibrosarcoma cells-inhibitor neutralization and one-step affinity purification | |
| US5202253A (en) | Monoclonal antibody specific for protein C and antibody purification method | |
| EP0419574B1 (en) | Monoclonal antibodies to the light chain region of human factor xii and methods of preparing and using the same | |
| Birkedal-Hansen et al. | Monoclonal antibodies to human fibroblast procollagenase. Inhibition of enzymatic activity, affinity purification of the enzyme, and evidence for clustering of epitopes in the amino-terminal end of the activated enzyme | |
| US5444156A (en) | Monoclonal antibodies to human plasma prekallikrein | |
| AU598572B2 (en) | Monoclonal antibody specific for human colon fibroblast- derived t-pa | |
| EP0190711B1 (en) | Monoclonal antibodies to tissue plasminogen activator derived from human normal cells | |
| US5102787A (en) | Method, device and kit for measurement of tissue plasminogen activator activity | |
| HU203257B (en) | Process for producing monoclonal antiurokinase antibodies and for cleaning and testing urokinase | |
| JPS63500564A (ja) | モノクロ−ナル抗体 | |
| US5422245A (en) | Plasminogen activator inhibitor monoclonal antibodies, hybridomas, monoclonal antibody production and use of the antibodies for assay of the inhibitors | |
| US5416006A (en) | Modification of plasminogen activators | |
| CA1291424C (en) | Immunosorbent-amidolytic method for detecting human urinary plasminogenactivator precursor (pro-upa) and human urinary plasminogen activator (u-pa) | |
| EP0354408A1 (en) | Anti-urokinase monoclonal antibodies | |
| US4889922A (en) | Monoclonal antibody specific for human colon fibroblast-derived T-PA | |
| US4891312A (en) | Monoclonal antibody specific for human colon fibroblast-derived t-PA | |
| EP0169549A2 (en) | Immunological determination of human plasmin/alpha2-plasmin inhibitor | |
| KR19990068047A (ko) | 활성화된 응고 인자 ｖｉｉ에 특이적인 모노클로날 항체 및 이의 용도 | |
| JPS61181964A (ja) | 人正常細胞由来の組織型プラスミノーゲンアクチベーターに対するモノクロナル抗体を用いる免疫学的測定試薬 | |
| JPH0260267B2 (hu) | ||
| JPH0235099A (ja) | プラスミノーゲンアクティベーターインヒビターに対するモノクローナル抗体 | |
| JPH0575394B2 (hu) | ||
| JPS62500379A (ja) | 抗ウロキナ−ゼモノクロ−ナル抗体：その製造及び使用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |