JPS63500564A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 モノクローナル抗体 用組氷顕 この発明は、モノクローナル抗体、該抗体の製造方法、該抗体を生産することが できるハイブリドーマ及び該抗体の使用に関する。

首且茨逝 マウス骨髄腫細胞と免疫感作されたマウスからの肺細胞との融合〔Ｋδｈｌｅｒ 及びＭｉｌｓｔｅｔｎ　、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７５）　＋　２５６　、４９ ６−４９７〕が、均一な（いわゆる“モノクローナル”）抗体を生産する連続性 セルラインを得ることができることを示した最初のものである。それ以来、種々 のバイブリド細胞（いわゆる“ハイブリドーマ”）を調製しそしてこれらの細胞 により生成された抗体を種々の科学研究のために使用するための多数の試みが行 われた［Ｃｕｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎ ｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　Ｖｏ１８１．　”Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　Ｈｙｂｒ ｉｄｏｍａｓ″、　Ｆ、Ｍｅｌｃｈｅｒｓ等、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ ｇ（１９７８）及びこの中の参照文献；　Ｃ，Ｊ。

Ｂａｒｎｓｔａｂｌｅ等、Ｃｅ１ｌ　（１９７８）　、　１４　、９−２０　； 　Ｐ、Ｐａｒｈａｍ　、　Ｗ、Ｆ。

Ｂｏｄｍｅｒ　、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７８）　、　２７６　、３９７−３９ ９　；　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ ｇｙ、第３版、　Ｖｏｌ　２　、　Ｄ、Ｍ、Ｗｉｅｒｌｉ　。

Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　、　１９７８　、２５章、　Ｃｈｅｍ、　Ｅｎｇ、　Ｎｅ ｗｓ　、　１５−１７（１９７９）；Ｋｅｎｎｅｔｔ　、　Ｒ，）１．　、　Ｍ ｃＫｅａｒｎ　、　Ｊ、Ｔ、、及びＢｅｃｈｔｏｌ　、　Ｘ、Ｂ、（１９８０） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　八ｎｔｉｂｏｖｉｅｓ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ　：　Ａ 　ｎｅｗ　Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　ｉｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｎｏｌｙｓｉｓ 　（Ｐｌｅｎｕｍ、、ニーニーヨーク）。これらの報告はハイブリドーマによる モノクローナル抗体の製造のための主たる技法を記載している。

ヒトープラスミノーゲンアクチベーター〔ウロキナーゼ型（ｕ　−Ｐ　Ａ）及び 組織−型（ｔ−ＰＡ））に対するものでありそしてハイブリドーマにより生産さ れたモノクローナル抗体が調製され、そしてこれらのアクチヘーター及びそのプ ロ酸素の精製、同定及び免疫化学的位置決定のために使用されている（Ｋａｌ　 ｔｏｆ　ｔ、に、、Ｎ１ｅｌｓｅｎ　、　Ｌ、Ｓ、　、　Ｚｅｕｔｈｅｎ　、　 Ｊ、、及びＤａｎφ、　Ｋ、　（１９８２）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　、　７９　、３７２０−３７２３　；　Ｎ１ｅｌ ｓｅｎ　、　Ｌ、Ｓ、、Ｈａｎｓｅｎ　、　Ｊ、Ｇ、％　Ａｎｄｒｅａｓｅｎ　 、　Ｐ、Ａ、。

５ｋｒｔｖｅｒ　、　Ｌ、、Ｄａｎφ、に８、及びＺｅｕｔｈｅｎ　、　Ｊ、（ １９８３）　ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　、　２　、１１５−１１９　；　 Ｎ１ｅｌｓｅｎ　＋　Ｌ、Ｓ、、Ｈａｎｓｅｎ　。

Ｊ、Ｇ、、５ｋｒｉｖｅｒ　、　Ｌ、、Ｗｉｌｓｏｎ　、　Ｅ、Ｌ、、Ｋａｌｔ ｏｆｔ　、　Ｋ、、Ｚｅｕｔｈｅｎ。

Ｊｌ、及びＤａｎφ、　Ｋ、　（１９８２）　、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　 、　２１　、６４１０−６４１５；Ｄａｎφ、に９、Ｄａｂｅｌｓｔｅｅｎ　、 　Ｅ、、Ｎ１ｅｌｓｅｎ　、Ｌ、Ｓ、、Ｋａｌｔｏｆｔ　。

Ｋ１、Ｗｉｌｓｏｎ　、　Ｅ、Ｌ、、及びＺｅｕｔｈｅｎ　、　Ｊ、（１９８２ ）　、　Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ。

Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、＋３０　、１１６５−１１７０　；　Ａｎｄｅａｓｅｎ　、 　Ｐ、Ａ、、Ｎ１ｅｌｓｅｎ　＋Ｌ、Ｓ、、Ｇｒφｎｄａｈｌ−Ｈａｎｓｅｎ　 、　Ｊ、、５ｋｒｉｖｅｒ　、　Ｌ、、Ｚｅｕｔｈｅｎ　、　Ｊ、、５ｔｅｐｈ ｅｎｓ　、　Ｒ，Ｗ、、及びＤａｎφ、　Ｍ、（１９８４）　Ｔｈｅ　ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ。

３　、５１−５６　）。最近、プラスミノーゲンアクチベーターの阻害物質がプ ラスミン介在蛋白質分解の制御に重要な役割を演することが示された。この様な 阻害物質は種々の組織、体液及び培養された細胞中に同定されている（Ｈｏｌｍ ｂｅｒｇ　、　Ｌ、、Ｌｅｃａｎｄｅｒ　、　１．、Ｐｅｒｓｓｏｎ　＋　Ｂ、 、及び人５ｔｅｄｔ　、　Ｂ、（１９７８）　。

Ｂｉｏｃｈｉａ＋、Ｂｉｏｐｈｙｓ、八ｃｔａ　、５４４　、　１２８−１３７ 　；　５ｅｉｆｅｒｔ　、Ｓ、Ｃ，、及びＧｅ１ｅｈｒｔｅｒ　＋　Ｔ、Ｄ、（ １９７８）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ＋ ７５　、６１３０−６１３３　；　Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋａ　、　Ｊ、、Ｒ：＋ ｎｂｙ　、　Ｍ、、及び−１１１１ａｎ＋Ｂ、　（１９８３）　、　Ｔｈｒｏｍ ｂ、　Ｒｅｓ、　、　３１　、４２７−４３１　：　Ｅｍｅｉｓ　、　Ｊ、Ｊ、 、Ｖａｎ　Ｈｉｎｄｓｂｅｒｇｈ　、　Ｖ、Ｗ、Ｍ、、Ｖｅｒｈｅｔｊｅｎ、　 Ｊ、Ｈ，、及びＷｉｊｎｇａａｒｄｓ　。

Ｇ、（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｎｔ ｕｎ、、１１０　、３９１−３９８；Ｇｏｌｄｅｒ　、　Ｊ、Ｐ、、及び５ｔｅ ｐｈｅｎｓ　、　Ｒ，Ｗ、（１９８３）Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ　、。

１３６　．５１７−５２２　；　Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ　、Ｄ、Ｊ、、ｖａｎ　Ｍ ｏｕｒｉｋ　、Ｊ、Ａ、、Ｅｒ１ｃｋｓｏｎ　、　Ｌ、Ａ、、及びＬａｗｒｅｎ ｃｅ　、　Ｄ、　（１９８３）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　、　８０　、２９５６−２９６０　；　Ｐｈ１ｌｉ ｐｓ　、Ｍ、、Ｊｕｕｌ　。

Ａ、−Ｇ、、及びＴｈｏｒｓｅｎ　＋　Ｓ、（１９８４）　、　Ｂｉｏｃｈｉｍ 　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ。

８０２　、９９−１１０　；　Ｖａｓｓａｌｌｉ　、Ｊ、−Ｄ、、　Ｄａｙｅｒ 　、Ｊ、−Ｍ、、Ｗｏｈｌｗｅｎｄ　、　Ａ、、及びＢ１１１ｎ　、　Ｄ、（１ ９８４）　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　、　１５９゜１６５３−１６６８　；　 Ｅｒ１ｃｋｓｏｎ　、　Ｌ、Ａ、、Ｇｉｎｓｂｅｒｇ　、　Ｍ、）１．、及びＬ ｏｓｋｕｔｏｆｆ、Ｄ、Ｊ、（１９８４）　、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、 ７４　、１４６５−１４７２；Ｃｗｉｋｅｌ　、Ｂ、Ｊ、、Ｂａｒｏｕｓｋｉ− Ｍｉｌｌｅｒ　ｌ　Ｐ、八０、Ｃｏｌｅｍａｎ　＋　Ｐ、Ｌ、、及びＧｅ１ｅｈ ｒｔｅｒ　、　Ｔ、Ｄ、（１９８４）　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、 　２５９　、６８４７−６８５１；人５ｔｅｄｔ　＋　Ｅｌ、Ｌｅｃａｎｄｅｒ ｓ　＋　１．、Ｂｒｏｄｉｎ　、　Ｔ、、Ｌ　ｕ　ｎ　ｄ　ｂ　１　ａ　ｄ　＋ Ａ０、及びＬａｗ　、　Ｋ、　（１９８５）　、　Ｔｈｒｏｍｂｏｓ、　Ｈａｅ ｍｏｓｔ、　、　５３　、１２２−１２５；Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、（１ ９８５）　、　２６０　、７０２９−７０３４　）　、これらの阻害物質の相互 関係は現在十分には解明されていないが、最近の証拠に、少なくとも３種類の免 疫学的に類似するタイプのプラスミノーゲンアクチベーター阻害物質が存在する ことを示している。これらには（１）プロテアーゼネクシン（ｎｅｘｉｎ）、（ ２）胎盤から精製されたプラスミノーゲンアクチベーター阻害物質〔人５ｔｅｄ ｔ　、　Ｂ、、Ｌｅｃａｎｄｅｒ　、　１．、Ｂｒｏｄｉｎ　、　Ｔ、、Ｌｕｎ ｄｂｌａｄ。

Ａ１、及びＬ２ｉｗ　Ｋ、　、　（１９８５）　Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓ ｔ、　５３　、１２２−１２５　）　。

及び（３）ｕ−ＰＡ及びｔ−ＰＡを阻害しそして典型的にはヒト内皮細胞、ヒト 線維肉腫細胞（ＨＴ−１０８０）　、ヒト血小板及びラット肝癌細胞から行われ ているプラスミノーゲンアクチベーター阻害物質〔以下内皮型プラスミノーゲン アクチベーター阻害、物質（ｅ−ＦＡＩ）と称する〕が含まれる。

ｅ−ＰＡＮに顕著な類似性を有する阻害物質がヒト血漿中に見出されている（Ｔ ｈｏｒｓｅｎ　、　Ｓ、、及びＰｈ１ｌｉｐｓ　、　Ｍ、（１９８４）Ｂｉｏｃ ｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　、　８０２　、１１１−１１８　）。

胎盤プラスミノーゲンアクチベーター阻害物質に対するモノクローナル抗体が調 製されており、そしてこれらの抗体は前記阻害剤の精製のために使用されている （人５ｔｅｄｔ　、Ｂ、、Ｌｅｃａｎｄｅｒ　、　１．、Ｂｒｏｄｉｎ　、　Ｔ 、、Ｌｕｎｄｂｌａｄ　、　Ａ、、及びＬａｗ　、　Ｋ、　。

（１９８５）　Ｔｂｒｏｍｂ’、　）Ｉａｅｍｏｓｔ、　５３　、１２２−１２ ５　）。

光１公皿丞 この発明は、内皮型プラスミノーゲンアクチベーター阻害物質及び免疫学的に類 似の阻害物質に対するモノクローナル抗体を提供する。

“免疫学的に類似の阻害物質”なる語は、内皮型プラスミノーゲンアクチベータ ー阻害物質の上記定義と関連して述べた起原のいずれかに由来する阻害物質に対 して生じたポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体と交差反応するプラスミ ノーゲンアクチベーター阻害物質を意味する。

これらの抗体の提供により、フィブリン分解を含むプラスミン介在蛋白質分解に おけるプラスミノーゲンアクチベーター阻害物質の役割及び前記プラスミノーゲ ンアクチベーター阻害物質の相互関係の研究が可能となる。さらに、これらのモ ノクローナル抗体は免疫吸着クロマトグラフィーによるプラスミノーゲンアクチ ベーター阻害物質の精製のため、免疫吸着により体液及び他の生物学的材料から 該阻害物質を除去するため、プラスミノーゲンアクチベーター阻害物質の阻害活 性を中和するため、並びに例えばＥＬＴＳＡ法により体液、正常な又は悪性の細 胞及び組織、及び他の生物学的材料中のプラスミノーゲンアクチベーター阻害物 質の検出、同定及び定量のために有用である。

この発明はまた、上記の抗体の製造方法を提供する。この方法は、骨髄腫細胞を 、内皮型プラスミノーゲンアクチベーター■害物質もしくは免疫学的に類似の阻 害物質により免疫感作された哺乳類から得られた抗体産生細胞と、又は前記プラ スミノーゲンアクチベーター阻害剤によりインビトロで免疫感作された抗体産生 細胞と融合せしめ、そして前記の阻害物質に対する抗体を生産するハイブリドー マを選択することを含んで成る。すなわち、ハイブリドーマは前記のに５ｈｌｅ ｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの方法の変法により製造される。使用される抗体産生細 胞は好ましくは肺細胞又はリンパ節細胞である。骨髄腫細胞及び抗体産生細胞が 由来する特定の哺乳類種は、一方の種の細胞が他方と融合することができる限り 特に臨界的ではなく、例えばマウス対ラット、ラット対ヒト、又はマウス対ヒト である。

しかしながら、骨髄腫細胞及び抗−プラスミノーゲンアクチベーター阻害物質− 抗体産生細胞の両者の起原として同じ動物種を使用するのが好ましい。この発明 を実施するための１つの好ましいセルラインは、プラスミノーゲンアクチベータ ー阻害物質でプライムされたマウス牌細胞とマウス骨髄腫細胞との間の融合細胞 バイブリドである。

融合により生成するハイブリドーマは、プラスミノーゲンアクチベーター阻害物 質と選択的に反応する抗体の生産についてＵ織的に試験される。

なお、１つの抗原に対して生じた複数のモノクローナル抗体はそれらの生成を導 いた決定基に依存して相互に区別されるが、しかしある１つのハイブリドーマ（ クローン）については、それが生産する抗体のすべてがプラスミノーゲンアクチ ベーター阻害物質分子の中の特定の抗原決定基に体して単一特異的（ｍｏｎｏｓ ｐｅｃｉ　ｆ　ｉｃ）である。

この発明はまた、内皮型プラスミノーゲンアクチベーター阻害物質及び免疫学的 に類似の阻害物質に対するモノクローナル抗体を生産することができるハイブリ ドーマに関する。

−ｍに、ハイブリドーマの製造は次の段階を含んで成る。

Ａ１部分精製されたプラスミノーゲンアクチベーター阻害物質による哺乳類の免 疫感作。この目的のためにＢａ１ｂ／ｃマウスが有用であることが見出されてい るが、他の哺乳類を使用することもできる。免疫感作法及びプラスミノーゲンア クチベーター阻害物質の濃度は、適当な量の抗原刺激されたリンパ球が生成する 様に選択すべきである。

Ｂ、免疫感作された哺乳類の肺臓又はリンパ節の採取、及び適当な媒体中牌細胞 懸濁液又はリンパ節細胞懸濁液の調製。

Ｃ０適当な融合促進剤（例えばポリエチレングリコール）を使用しての、懸濁さ れた肺細胞又はリンパ節細胞と適当なセルラインの骨髄腫細胞（例えばＮＳｌ− Ａｇ　４／１骨髄腫細胞）との融合。骨髄腫細胞当り約１０の肺細胞又はリンパ 細胞の比率が好ましい。１０１１個の肺細胞又はリンパ節細胞のために全容量約 １ｒｒｌの融合媒体が適当である。使用される骨髄腫セルラインは好ましくはい わゆる“薬剤耐性”型であるべきであり、これによって選択培地中で未融合骨髄 腫細胞は死滅し、他方バイブリドは生存する。酵素ヒボキサンチン−グアニン・ ホスホリボシルトランスフェラーゼを欠きそしてそれ故にＨＡＴ培地（ヒボキサ ンチン、アミノプテリン、チミジン）中で増殖することができない８−アザグア ニン耐性セルラインが最も頻繁に使用される。

使用される骨髄腫セルラインはまた、好ましくは、それ自身が抗体又は免疫グロ ブリンのＨ鎖もしくは■、鎖を生産しないように“非分泌”型であるべきである 。

Ｄ、未融合骨髄腫細胞が分裂せずその結果未融合細胞が死滅する選択培地での、 未融合肺細胞又はリンパ節細胞、未融合骨髄腫細胞及び融合した細胞の個々のベ ッセル中での稀釈及び培養（約１〜２週間）。所定数の細胞（約１〜４個）が各 個々のベッセル（例えば、ミクロタイタープレートの各つエル）に入れられる様 に稀釈剤の容量を調整することにより個々の融合細胞を単離する。培地（例えば ＨＡ　Ｔ培地）は耐性（例えば８−７ザグアニンに対する）を有する未融合骨髄 腫セルラインの増殖を防止し、そしてそれ故にそのセルラインは死滅する。未融 合の肺細胞又はリンパ節細胞は限られた数の分裂サイクルのみを有しそしてそれ 故にこれらの細胞もある期間（約１〜２週間）の後に死滅する。これに対して、 融合した細胞は親骨髄腫細胞からの遺伝的な永久増殖性と親牌細胞又はリンパ節 細胞からの酵素ヒボキサンチン−グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ 合成能とを有するため、分裂を続け、そしてそれ故にそれらは選択培地中で生存 することができる。

Ｅ、各ベンセル中、プラスミノーゲンアクチベーター阻害物質に対する抗体の存 在のチェック。

Ｆ、所望の抗体を生産するハイブリドーマの選択（例えば限界稀釈法による）及 びクローニング。

所望のハイブリドーマが選択されそしてクローン化された場合、該ハイブリドー マを適当な培地中である時間培養しそして上清から抗体を得そして精製すること により非常に高純度のモノクローナル抗体が得られる。適切な培地及び最適培養 時間は容易に決定することができる。このインビトロ技法は、異種血清（例えば ウシ胎児血清）からの少量のみの蛋白質により汚染されたモノクローナル抗体を 提供する。

わずかにのみ低下した純度を有する有意に高い濃度のモノクローナル抗体を製造 するためには、選択されたハイブリドーマを、好ましくは同系の（ｓｙｎｇｅｎ ｅｉｃ）又は単回系の（ｓｅｍｉｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）マウスに注射することが できる。あるインキュベーション時間の後、マウス中の腫瘍の形成を導き、この 腫瘍は宿主動物の血液中及び腹腔滲出液（腹水）中に高濃度の抗体（５〜２０■ ／　ｍ　ｉ　）を放出する。これらのマウスが血液及び腹水中に正常抗体を有す るとしても、これらはモノクローナル抗体の約５％の濃度で生ずるに過ぎない。

」皿皇斑華り説里 本発明は図面に言及しながらさらに詳細に記載されよう。

第１図は、トリニトロフェニル（対照）及びｅ−ＦＡＩに対するモノクローナル 抗体が連結されたセファロースカラムを通す前及び後のセルラインＨＴ　−１０ ８０のデキサメタシン処理されたヒト線維肉腫細胞又は調帯内皮細胞による条件 化培養液中のプラスミノーゲンアクチベーター阻害物質の逆（ｒｅｖｅｒｓｅ） ザイモグラフィ−（ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）を示すザイムグラムであり； 第２図は、ｅ−ＦＡＩに対するモノクローナル抗体による免疫吸着クロマトグラ フィーにより精製されたｅ−ＰＡＩ及びＩＩＴ　−１，０８０細胞培地の逆フィ ブリンーアガロースザイムグラフィー及び５ｐｓ−ＰＡＧＥを示すグラフであり ；第３図は、ｅ−ＦＡＩに対するモノクローナル抗体によるｅ−ＰＡＩの阻害作 用の中和を示すグラフであり；第４図は、ｅ−ＦＡＩに対するモノクローナル抗 体を含むセファロースカラムへのｕ−ＰＡとｅ−ＰＡＩとの複合体の結合を示す ザイムグラムであり；そして、第５図は、ｅ−ＰＡＩに対するモノクローナル抗 体によるＨＴ−１０８０細胞のイムノパーオキシダーゼ染色を示す写真である。

■を　するための９ この発明は、例に言及しながらさらに詳細に記載されよう。

例１〜５はデキサメタシン処理されたヒト線維肉腫細胞から培養液に放出された 内皮型プラスミノーゲンアクチベーター阻害物質（ｅ−ＦＡＩ）に対するモノク ローナル抗体の製造及び使用を説明する。この阻害物質はヒトーウロキナーゼ型 プラスミノーゲンアクチベータ−（ｕ−ＰＡ）及び組織型プラスミノーゲンアク チベーター（ｔ−ＰＡ）を阻害する。

、ｆ２ＬＬ−免Ｍ＝”！＝　のために　される−原の＋ｌ青ウシ内皮細胞からの プラスミノーゲンアクチベーター阻害物質についてｖａｎ　Ｍｏｕｒｉｋ　、　 Ｊ、Ａ、、Ｌａｗｒｅｎｃｅ　、　Ｄ、Ａ、、及びＬｏｓｋｕｔｏｆｆ　、　Ｄ 、Ｊ、（１９８４）　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５９　、１４９１ ４−１４９２１により記載された方法から適合された方法により、セルラインＨ Ｔ−１０８０（ＡＴＣＣＣＣＬ１２１）のデキサメタシン処理されたヒト線維肉 腫細胞の無血清条件化培養液から阻害物質を精製した。

ＩＴ−１０８０セルラインは、１０％のウシ胎児血清を補充されたダルベコ改変 イーグル培地を用いて、モルレーヤー培養として維持された。コンフルエント・ モルレーヤー培養から無血清培養液を調製した。合成グルココルチコイドである デキサメタシンを１０−６Ｍの濃度で無血清培地に加えた。ＨＴ−１０８０細胞 は比較的多量のｕ−ＰＡを生産し、このものは使用された培養条件下ではプロ酵 素形である。阻害物質を精製する前に、セファロース上に固定化されたモノクロ ーナル抗−Ｕ−ＰＡＩｇＧＯカラムに培養液を通すことによって該培養液からｕ −ＰＡを除去した（Ｎｉｅｌｓｅｎ　、　Ｌ、Ｓ、、１ｌａｎｓｅｎ　、　Ｊ、 Ｇ、、５ｋｒｉｖｅｒ。

Ｌｏ、Ｗｉｌｓｏｎ　、　Ｅ、Ｌ、、Ｋａｌｔｏｆｔ　、　Ｋ、、Ｚｅｕｔｈｅ ｎ　、Ｊ、、及びＤａｎφ。

Ｍ、（１９８２）　Ｂｉｏｃｈｅｍｔｓｔｒｙ　、　２４　、６４１０−６４１ ５　）　ｏ次に、培養液リットル当り５ｍ／のコンカナバリンＡ−セファロース を用いて、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐ）１７．４）　、０．１５Ｍ　Ｎａ Ｃ１（ＰＢＳ）により平衡化されたコンカナバリンＡ−セファロースのカラムに 、３０ｍｊ！／時の流速で前記培養液を適用した。このカラムを５容量の０．３ 　Ｍ　ＮａＣｊ！含有ＰＢＳにより洗浄した。０．５　Ｍ　ＮａＣ１及び０．２ 　Ｍ　α−メチル−Ｄ−マンノシドを含むＰＢＳにより、結合した蛋白質を溶出 した。２８０ｎｍにおける吸光を測定することにより決定される蛋白質のピーク を含む両分をプールし、そしてさらに分析するために使用した。

クマソシーブルー染色されたポリアクリルアミドゲルの６００ｎｍにおける測光 スキャニングから、部分精製された調製物が約７０％のＭｒ（分子量）約５４， ０００の蛋白質を含有することが推定され、その電気泳動移動度は逆ザイモグラ フィー（下記参照のこと）により決定された阻害活性と一致した。

免疫感作の前にこの調製物をＰＢＳに対して透析した。

ＢＡＬＢ／ｃ−マウスの　疫ヒ ４匹のＢＡＬＢ／ｃ−マウスを、フロイントの不完全アジュバント巾約２０μｇ の上に得られたＭｒ約５４，０００の蛋白質によリ、０日、７日、１４日及び２ １日目に皮肉に免疫感作した。

各マウスの血漿をＥＬＩＳＡ（エンザイム・リンクド・イムノソルベント・アッ セイ）により分析し、そして免疫感作調製物に対して最高のタイターを示すマウ スを静脈内注射及び骨髄腫細胞との融合のために使用した。ＰＢＳ中に溶解され た上記と同様の量の静脈注射を２８日目に行い、そして４日後に肺臓を摘出した 。

組上涛ロＩｌΣ鮭胞皿−養− 肺細胞をＮＳＴ−Ａｇ　４　／　］骨髄腫細胞（０，１ｍＭｂ−チオグアニンに 耐性；に軽鎖を合成するがしかし分泌しない）（Ｋ８ｈ　Ｉｅｒ及びＭｉｌｓｔ ｅｉｎ（１９７６）　、　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　６　、５１１−５１ ９　）と１０：１の比率（１０”個の肺細胞対１０’個）ＮＳＩ−Ａｇ　４／１ 細胞）で混合し、そしてリン酸緩衝化塩溶液中５０ｗ／ν％ポリエチレングリコ ール１ｍｌと共に３７℃にて９０秒間インキュベートした。この懸濁液にダルベ コ改変イーグル培地（２０ｍβ）を加え、そして細胞を１１０００Ｘにて遠心分 離した。細胞ベレットを、１０％のウシ胎児血清を補充したヒボキサンチン／ア ミノプテリン／チミジン培地（Ｌｉｔｔｌｅｆ　１ｅｌｄ。

Ｊ、Ｗ、（１９６４）　５ｃｉｅｎｃｅ１４５　、７０９−７１０　）　９６　 ｍｅ中に再懸濁し、そして４８ウエルのコスタ−トレイ　（コスタ−、ケンブリ ッジ、Ｍ、、Ａ、）に分配した。培地を週２回変えた。

ハイブリドーマの゛ ＥＬＩＳ八（エンザイム・リンクド・イムノソルベント・アッセイ）を用いてハ イブリドーマ上清をスクリーニングするため、イムノプレートのウェルを、０． １　ＭＮ８２ＣＯｆｆ　（＋）Ｈ９，８＞巾約４μｇ　／　ｍ　ｉ！の蛋白質を 含有するコンカナバリンＡ−セファロース精製されたプラスミノーゲンアクチベ ーター阻害物質をウェル当り１００μ！、３７℃にて一夜コーＩ、した。残留結 合部位をブロックするため、ウェルをＰＢＳ中０．２５％のＢＳＡと共に１５分 間以上インキュベートした。次に、ウェルをハイブリドーマ上清と共に１時間イ ンキュベートし、そして最後に、０．１％のトウィーン２０を含有するＰＢＳ中 に１：８００に稀釈されたマウスＩｇに対するパーオキシダーゼ接合ラビット抗 体（ダコパソッ、コペンハーゲン、デンマーク）と共に１時間インキュベートシ た。１００μｌの０．１　Ｍクエン酸塩−リン酸塩（ｐＨ５，０）中０．１％の フェニレンジアミン及び０．０１％の）＋２０２を用いてパーオキシダーゼ反応 を５分間行った。

１００μｌの１Ｍ１１□ＳＯ４を添加することによって反応を停止せしめ、そし て吸光を２９４ｎｍにて読み取った。

イムノブロッティングによってスクリーニングするため、ＨＴ−１０８０細胞か らの無匍清培地１０ｍｆｆ中の蛋白質をトリクロロ酢酸を用いる沈澱によって濃 縮し、そして１０ｃｍ広レーンしでの５Ｏ３−ＰＡＧＥにより分離した。蛋白質 をポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース紙に電気泳動的に移行せしめた （１０　Ｖ、２５０ｍＡ　、室温にて１６時間）。使用した移行緩衝液ば０．１ ２５　ＭＴｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！　、０．１−９Ｍグリシン、２０ｖ／ｖ％メタノー ル、０．１　ｗ／ｖ％ＳＤＳ　（ｐＨ８，６）であった。ニトロセルロース紙を ０．０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，４）　、０．１５Ｍ　Ｎａ（Ｊ！　 。

１％トリトンＸ−１００（ＴＢＳ−１−リドン）中で室温にて１５分間洗浄し、 そしてヒト血清アルブミン（１０■／ｍ１．）を含有するＴＢＳ−１−リドンと 共に３０分間インキュベートした。次に、この紙をＴＢＳ−）リドン中で１５分 間ずつ２回洗浄した。垂直レーンを切り取り、そしてハイブリドーマからの培養 上清と共に４°Ｃにて一夜インキユベートした。レーンをＴＢＳ−）リドン中で １５分間ずつ３回洗浄し、パーオキシダーゼ接合ラビットＩｇＧ抗−マウス免疫 グロブリン（ＴＢＳ−）リドン中に１：５０で稀釈）と共に室温にて１時間イン キュベートし、そして０．０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｊｌ！　（ｐＨ７，６）中で１ ０分間ずつ３回洗浄した。次に、０．０１％のｏ　ｚ　ｏ　ｚ中０．５■／ｒｒ ｌのジ−アミノベンジジンと共に室温にて５分間パーオキシダーゼ反応を行った 。

対照として、ニトロセルロースレーンを無関係の特異性（抗−トリニトロフェニ ル）の抗体（Ｓｈｕｌｍａｎ　＋　Ｍ、、Ｗｔｌｄｅ。

Ｃ，Ｄ、、及びに６ｈｌｅｒ　、　Ｇ、（１９７８）　Ｎａｔｕｒｅ　、　２７ ６２６９　）を生産するハイブリドーマ（Ｈｙ　２．１５）からの上清と共にイ ンキュベートした。

ハイブリドーマを１０日間培養した後、１６個の一次ウエルからの上清が強い陽 性ＥＬＩＳＡ反応を示した。これらのウィルからのハイブリドーマを限界稀釈法 （Ｋｅｎｎｅｔｔ　、　Ｒ，Ｈ，、ＭｃＫｅａｒｎ　＋　Ｊ、Ｔ、、及びＢｅｃ ｈｔｏｌ　、　Ｋ、Ｂ、　（１９８０）　、　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ八ｎｔｉｂ ｏｄｉｅへ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ　：　八　Ｎｅｗ　Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　ｉ ｎ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｎａｌｙｓｉｓ　（ブレナム、ニューヨーク）〕に よりクローン化及び再クローン化した。クローン化及び再クローン化の後、４個 の安定なＥＬＴＳＡ陽性クローンが残った。イムノブロッティング分析は、４種 類すべてのクローンがｌ（Ｔ　−１０８０細胞がらの粗条件化培養液中のＭｒ約 ５４．０００のバンドと反応したことを示した。

Ｍ、葬皇猜翌 得られた４個のクローンにより生産されたモノクローナル抗体を、プロティンＡ −セファロースカラム上でハイブリドーマ培養液から次の様にして精製した。ハ イブリドーマからの条件化培養液２００ｍ、Ａを５ｒｒｌのプロティンＡ−セフ ァロースカラム（１２Ｘ４３ｍｍ）に適用した。このカラムを３Ｑｍｌの０．１ 　ＭＴｒｉｓ−ＨＣＡ　（ｐＨ８，１）により洗浄した。０．１Ｍ酢酸ナトリウ ム（ｐＨ４，０）　、０．１５Ｍ　ＮａＣＪ！により溶出を行った。

２ｍβずつの両分を２００μｌのＩ　Ｍ　Ｔｒｔｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ９，０＞を 収容したチューブに集めた。精製された調製物中のＩｇＧ−１４）。不純溶液中 のＩｇＧの濃度は標準として精製マウスＩｇＧを用いて単一放射免疫拡散法によ り決定した。

クローンヒハイブリドーマによ　−−れた　の　・団 バイブリドクローンにより生産された抗体のクラス及びサブクラスを、クラス− 及びサブクラス−特異的ヤギ抗体に対する免疫拡散により分析した（Ｍｅｌｏｙ 　、ν、Ａ、　、　ＵＳＡ）。４種類のクローンから生産された４種類すべての 抗体はＩｇＧ、サブクラスに属した。

６％のポリアクリルアミド及び６％のキャリヤー両性電解質（ファルマライト） を含有するスラブゲル中での４種類の精製されたモノクローナル抗体の等電点沈 澱は、これらの等電点が異る（５と７．５の間にある）ことを示した。ＥＬＩＳ Ａにより測定した場合の固相回置物質へ、の抗体の結合特性は大きく異っていた 。従って、これらは異るハイブリダイゼーション事象に由来すると考えられた。

４個のクローンをそれぞれ抗−プラスミノーゲンアクチベーター阻害物質クロー ン１゜２．３．及び４と命名した。

見ＬＩＬ匹１梃ｍ左ｈ９１壽弓（（／−ゲンアクチベーター皿五１頂寥］」ｊ」 はレソ１λを九友翅ｌ二Ｉンアク九べ二りＩＩＪ律ｕしし死郊羞反笈 ヒ）Ｒ帯内皮細胞からの条件化培養液も逆フィブリンーアガロースザイモグラフ ィーにより検出可能なプラスミノーゲンアクチベーター阻害物質を含有する（Ｓ ｐｒｅｎｇｅｒ　、　Ｅ、Ｏ，、νｅｒｂｅｉｊｅｎ　、　Ｊ、Ｈ，、Ｖａｎ　 Ｉ（ｉｎｄｓｂｅｒｇ、Ｖ、Ｗ、Ｍ、、及びＥｍｅｉｓ、Ｊｊ＋（１９８４）　 、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　８０１，１６３−１７ ０　）　、この阻害物質は）ＩＴ　−１０８０阻害物質のそれと区別できない電 気泳動移動度を有する。第１図は、ＴＮＰに対する（ｂ　、　ｅ）及びＩＩＴ− １０８０プラスミノーゲンアクチベークー阻害物質に対する（ｃ　、　ｅ）モノ クローナル抗体が連結されたセファロースカラムニ通した後、又は前（ａ　、　 ｄ）　（７）、ＩＩＴ　−１０８０ｍ胞により（ａ−ｃ）又は騰帯内皮細胞によ り（ｄ−ｆ）条件化された培養液中のプラスミノーゲンアクチベーター阻害物質 についての逆ザイモグラフィーを示すザイモグラムである。連結の方法について は例２を参照のこと。それぞれ約１■のモノクローナル抗−ＴＮＰＩｇＧ及びク ローン１からのモノクローナル抗−プラスミノーゲンアクチベーター阻害物質１ ｇＧを含有する１ｒｎ２のカラム２本を、０．１　ＭＴｒｉｓ−ＨＣ７！（ｐ！ １８．１）。

０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００を含有する緩衝液により平衡化した。

両力ラムにＨＴ　−１０８０細胞からの無血清細胞培養液１ｎｌを加え・そして 流過液を集めた。ヒＩ−Ｆ帯内皮細胞からの無血清細胞培養液を同様に処理した 。電気泳動の後、ゲルをプラスミノーゲンアクチベーター阻害物質についての逆 ザイモグラフィーのために１．５時間のインキュベーションにより処理した。逆 ザイモグラフィーをＥｒ１ｋｓｓｏｎ　、　Ｌ、Ａ、、Ｌａｗｒｅｎｃｅ　、　 Ｄ、Ａ、、及びＬｏｓｋｕｔｏｆｆ　、　Ｄ、Ｊ、　（１９８４）　、　Ａｎａ ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３７　、４５４−４６３により記載された様にして 行った。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中のプラスミノーゲンアクチベーター阻 害物質は、フィブリン、プラスミノーゲン及びプラスミノーゲンアクチベーター を含有するアガロースゲルに前記ゲルを重層することにより検出される。阻害物 質がポリアクリルアミノゲルからフィブリン／プラスミノーゲン／プラスミノー ゲンアクチベーターゲル中に拡散し、そしてその存在がプラスミノーゲンアクチ ベーターにより触媒される溶解に抵抗するフィブリンのゾーンにより示される。

Ｍｒママ−−の位置が示されている。

逆フィブリンーアガロース・サイモグラフィーにより示される様に、抗−阻害物 質１ｇＧクローン１がらの抗体を含むセファロースカラムにＨＴ−１０８０培地 を通すことにより阻害活性が除去され、モノクローナル対照抗体（抗−ＴＮＰ　 ＩｇＧ）を含む対照カラムを通ず効果は存在しなかった。前記ヒト内皮細胞から のプラスミノーゲンアクチベーター阻害物質がクローン１からのモノクローナル 抗体を含むカラムに適用される場合、該阻害物質はカラムに結合する（第１図） 。クローン２．３．又は４からの抗体を含有するカラムを使用した場合、結果は 同じであった（結果は示さない）。これは、この阻害物質とＨＴ−１０８０プラ スミノーゲンアクチベーター阻害物質との間の免疫学的類似性を示している。

同じ技法を用いて、我々はまた、ＨＴ　−１０８０−阻害物質に対する抗体がＥ ｒ１ｋｓｏｎ　、Ｌ、八８、Ｇｉｎｓｂｅｒｇ　、　Ｍ、Ｈ，、及びＬｏｓｋｕ 　ｔｏｆ　ｆ　。

Ｄ、Ｊ、（１９８４）　、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　、　７４　、 １４６５−］、４７２により記載された方法により調製されたヒト血小板から抽 出されたプラスミノーゲン阻害物質と交差反応することも示した。

内皮細胞プラスミノーゲンアクヂベーター阻害物質、血小板阻害物質（Ｅｒｉｋ ｓｏｎ　＋　Ｌ、Ａ、、Ｇｉｎｓｂｅｒｇ　、　Ｍ、）！、、及びＬｏｓｋｕｔ ｏｆｆ。

Ｐ、Ｊ、（１９８４）　、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　、　７４　、 １４６５−１４７２　）及びＨＴＣセルラインのラット肝癌細胞からの阻害物質 が免疫学的類似性を示すことが報告されているＣＤ、Ｊ、Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ及 びＴ、Ｄ。

Ｇｅ１ｅｈｒｔｅｒ　＋私信〕。従って、ＨＴ−１０８０−阻害物質が異る細胞 又は組織から単離された多数のプラスミノーゲンアクチベーター阻害物質に類似 することが明らかである。

五ム　■前立１ｐ逸筬玉ｌ■木 セファロースへの連結の後、抗−プラスミノーゲンアクチベーター阻害物質クロ ーン１により生産された抗体を使用してカラム法によりＨＴ−１０８０細胞培養 液から阻害物質を精製した。抗−阻害剤１ｇＧクローン１からのモノクローナル 抗体８■を２ｍｌの臭化シアン活性化セファロース４Ｂに連結した。材料をカラ ム（２０Ｘ　１６ｉｎ）に充填し、これをＯ，ｌ　ＭＴｒｉｓ−１（ニア！（ｐ ）１８．１　）　ニより平衡化した。ＨＴ−１０８０細胞からの条件化細胞培養 液を５０ｍβ／時の流速で適用した。カラムを平衡緩衝液（流速５０ｍβ／時） で洗浄し、次に０．１　ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，１）　、ＬＭ　ＮａＣ ｊ！　（５０ｍ、ｊ？　／時）で洗浄した。

０、１　Ｍ　Ｃｌ５ＣＯＯＨ（１）Ｈ２，７）により２５ｍ１！／時の流速にお いて溶出を行い、２ｍ／ずつの画分を２００　ｐ　ｉ！のＩ　ＭＴｒｉｓ−）１ （Ｊ！（ｐＨ９，０）を含有するチューブに集めることにより溶出液を中和し７ た。２８０ｎｍでの吸光測定により決定した場合に蛋白質を含有する両分をブ・ −ルした。

阻害活性の定量のため、２５μｌのアッセイ緩衝液中０．００５プラグユニット （Ｐｌｏｕｇ　Ｕｎｉｔ）のウロキナーゼを同じ緩衝液中に稀釈された２５μβ の阻害物質と混合し、この混合物をアッセイ緩衝液により５００ｘｒβに稀釈し 、そして（”り−フィブリンプレートウエル（例３を参照のこと）に加えた。

固定された濃度のウロキナーゼ標準及び阻害物質調製物の逐次稀釈物を用いる測 定から、ウロキナーゼ標準の５０％の阻害を生じさせる阻害物質の稀釈を計算し た。５０％阻害を示ずウェル中の阻害物質の量を０．００２５阻害物質二ニア　 ）　（Ｉｎｈ。

Ｕ、）と定義した。測定の前に阻害物質調整物を最終濃度０゜１％のＳＤＳによ り処理し、２５℃にて１時間のインキュベーションの後、トリトンＸ−１００を １％の最終濃度に添加した。

ヒト線維肉腫細胞からの阻害物質の精製の結果を第１表にに示す。

第１表に示す様に、阻害活性の８６％がカラムにより結合された。洗浄の後、カ ラムに結合した阻害活性の９９％が低ｐＨにおいて溶出した。阻害活性の４５倍 の精製が得られ、そして溶出液はＭｒ約５４．０００の蛋白質バンドのみを含ん でいた。

これは５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのクマフシーブルー染色により評価した ものである。この蛋白質の電気泳動移動度は逆フィブリンーアガロースザイモグ ラフィーによす決定される阻害活性の移動度と一致した（第２図）。５ＤＳ−ポ リアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけられたサンプルは、 ＨＴ　−１０８０細胞からの１．５ｍｊ２の粗培養液（ａ）、１０μｇの蛋白質 に相当する溶出液（ｂ）　、ＢＴ−１０８０細胞からの１０μｌの粗培養液（ａ ’）、及び５０ｎｇの蛋白質に相当する溶出液（ｂ′）であった。電気泳動の後 、ゲルをクマッシーブルーにより染色する（ａ　、　ｂ）か、又はゲル中の阻害 物質を２時間にわたる逆フィブリンーアガロース・ザイモグラフィーにより可視 化した。次のマーカーの位置が示されている。ラビット−ホスホリラーゼｂ（９ ７Ｋ）、ウシ血清アルブミン（６７Ｋ）、オバルブミン（４３Ｋ）、カーボニッ クアンヒドラーゼ（３０Ｋ）、大豆トリプシン阻害物質（２０，１Ｋ）　、及び α−ラクトアルブミン（１４，４Ｋ＞である。

粗培養液及び精製された調製物についての染色されたポリアクリルアミドゲルの 分光スキャンニングからの判定によれば、強いＭｒ約５４．０００のバンドが阻 害活性として同じ程度に精製された。６〜１６％直線濃度勾配のポリアクリルア ミドゲルのスラブゲルでの、粗培養液及び免疫吸着カラムからの流過液の５ＤＳ −ＰＡＧＥは、Ｍｒ約５４　、０００のバンドは非常に減少し、他方その他のバ ンドはいずれも影響を受けないことを示した（結果は示してない）。

還元条件下での５Ｏ３−ＰＡＧＥはＭｒ約５４．０００の１つのバンドを示し、 精製された阻害物質が１つのポリペプチド鎖から成ることが示された（結果は示 してない）。

貫１　且寡皿担 阻害物質の阻害活性に対するモノクローナル抗体の効果を（ＩＺＪ：ｌ−フィブ リンブレートアッセイにより試験した。

この方法は、ｕ−ＰＡによるプラスミノーゲンの活性化、及びそれに続く生成し たプラスミンによる（＋２５１）−フィブリンの分解を含む（Ｎｉｅｌｓｅｎ、 　Ｌ、Ｓ、、）Ｉａｎｓｅｎ、Ｊ、Ｇ、、Ａｎｄｒｅａｓｅｎ。

Ｐ、八３．５ｋｒｉｖｅｒ、　Ｌ、、ＤａｎφｌＫ＋、及びＺｅｕｔｈｅｎｊ、 　（１９８３）ＥＭＢＯＪ、、２．１１５−１１９）を参照のこと。（＋’２５ ７）−フィブリンブレートアッセイは次の様にして行った。Ｌｏｎｇの阻害物質 を（１２５１）−フィブリンブレートアッセイウェルに、合計５００１！の０． 　Ｉ　ＭＴｒｉｓ−ＨＣ＆　（ｐＨ８，１）　、０．１％トリトンＸ−１００， ０，２５％ゼラチン（アッセイ緩衝液）中０．２ｎｇの活性ｕ−ＰＡ、１μｇの Ｇｌｕ−プラスミノーゲン及び示されるｉｇＧと共に加えた。ｕ−ＰＡを伴わな い平行対照アッセイにおいて放出される放射能（約５００ｃｐｍ）を差引き、そ して阻害物質の存在下で放出される放射能を阻害物質の非存在下で放出されるそ れ（約３０００ｃｐｍ）に対する百分率として計算した。

（ＩＺＪ）−フィブリンブレートアッセイウェル中の全放射能は約６０，０００ 　ｃｐｍであった。各点は２個の測定の平均を表わす。クローン２からの抗−阻 害物質ＩｇＧの濃度の増加と共に増加する阻害活性の中和が観察され〔第３図、 （・）、他方クローン１からの抗体〔第３図、（・）〕及び無関係の対照モノク ローナル抗体（抗−ＴＮＰ　ＩｇＧ）（第３図、（）〕の阻害に対する有意な効 果は存在しなかった。クローン３及び４からの抗−阻害物質１ｇＧについては中 和効果が観察されなかった（結果は示してない）。

貫土　天ムえ豆二史水坑二旦憲貰！Ｗ本ユ■ｕＰＡ／　人　の七人 ｕ−ＰＡがＨＴ　−１０８０阻害物質と等モル複合体を形成することが示された 。この複合体は５ＯＳ−ＰＡＧＥにおいてＭｒ約１１０．０００に相当する電気 泳動移動度を有し、そしてそれはフィブリン−アガロース・ザイモグラフィーに より測定されるそのプラスミノーゲンアクチベーター活性を回復するため検出可 能である。ポリアクリルアミドゲル中でのプラスミノーゲンアクチベーター活性 は、フィブリン及びプラスミノーゲンを含有するアガロースゲル上にゲルを重層 することにより検出される。この場合、プラスミノーゲンアクチベーターがアガ ロースゲル中に拡散しそしてプラスミノーゲンを活性化して可視的溶解ゾーンを 生成せしめる（Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ、Ａ、及びＲｅ１ｃｈ、Ｅ、 （１９７８）、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１４８．２２３−２３４）　、第４図は 、ＨＴ−１０８０阻害物質に対するモノクローナル抗体を含有するセファロース カラムへのｕ−ＰＡと）ＩＴ−１０８０＝阻害物質との複合体の結合を示すザイ モグラムである。１■のモノクローナル抗−ＴＮＰ抗体（ａ）、抗−阻害物質Ｉ ｇＧクローン１からの抗体（ｂ）、又はクローン２からの抗−プラスミノーゲン アクチベーター阻害物質ＩｇＧ（ｃ）を含有する約１ｍ１Ｏカラムを、０．１　 ＭＴｒｔｓ−Ｈ（Ｊ！　（ｐＨ８，ｉ　）　、０．１％トリトンＸ−１００，０ ，２５％ゼラチンを含有する緩衝液により平衡化した。

０、１　ＭＴｒｉｓ−ＨＣｉ２　（ｐＨ８，１）　、０．１％トリトンＸ−１０ ０の緩衝液中でアクチベーター（２５ｎｇ／ｍ！りと阻害物質（５００ｎｇ／ｍ ｌ）を２５℃にて１時間インキュベートすることにより得られたｕ−ＰＡ−阻害 物質複合体１ｍｊ２を各カラムに加え、そして各カラムからの７５μβの流過液 を５ＯＳ−ＰＡＧＥにかけ、次にプラスミノーゲンアクチベーターについてザイ モグラフィーを行った。Ｍｒ−マーカーの位置が示されている。抗−阻害物質ク ローン２からの抗体はこれらの複合体を結合し、他方、抗−阻害物質クローン１ からの抗体又は抗−ＴＮＰについては結合が観察されなかった。同様に、クロー ン４からのモノクローナル抗−プラスミノーゲンアクチベーター阻害物質１ｇＧ は複合体を結合し、他方３からの抗体は結合しなかった（結果は示してない）。

前記の反応性の差を遊離の■害物質対複合体結合阻害物質の定量において使用す ることが正常な又は悪性の細胞及び組織中の阻害物質の免疫細胞化学的位置決定 のためにモノクローナル抗−プラスミノーゲンアクチベーター阻害物質抗体を使 用することができる。

デキサメタシンの存在下無血清培地中で培養された）ＩＴ−１０８０細胞を顕微 鏡スライド上に接種しそして０．１　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，８） 中４％バラホルムアルデヒドにより３０分間固定した。１％のトリトンＸ−１０ ０を含有する０、０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣＡ　（ｐＨ７，４）　、０．１５Ｍ　Ｎ ａ（Ｊ　（ＴＢＳ）（ＴＢＳ　−トリトン）により３０分間洗浄した後、細胞を ＴＢＳ中１０％ラビット血清に３０分間暴露し、そして１０％のラビット抗体を 含むＴＢＳ中に稀釈された精製モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍ７りと共に４ °Ｃにて一夜インキユベートした。１時間の温度再平衡に続き、細胞をＴＢＳ− ）ウィーンで洗浄し、そして結合したモノクローナル抗体を１０％のラビット血 清を含有するＴＢＳ中に稀釈（１：　６０）されたパーオキシダーゼ接合ラビッ ト抗−マウスＩｇＧと共にインキュベートし、次にジアミノベンジジン−過酸化 水素による発色によって、結合したモノクローナル抗体を証明した。細胞をヘマ トキシリンにより軟く対比染色し、脱水し、装着し、そして写真に撮った。全細 胞質中に分布しているらしい弱い拡散染色と共に核周囲にしばしば局在する強い 顆粒状染色が観察された（第５図上）。４種類すべてのクローンからの抗体を用 いて明瞭な顆粒状染色が観察された（クローン１についてのみ結果を示す）。モ ノクローナル抗−阻害物質抗体を無関係な特異性のモノクローナルＩｇＧ（抗− ＴＮＰ抗体）又は緩衝液のみにより代替した場合（第５図下）、染色は見られな かった。

本発明を、デキサメタシン処理されたヒト線維肉腫細胞からの培養液中に放出さ れたＭｒ約５４，０００のプラスミノーゲンアクチベーター阻害物質に対するモ ノクローナル抗体の製造及び使用に言及しながら説明したが、しかしこの阻害物 質はヒト内皮細胞、ヒト血小板、及びラット肝癌細胞由来のプラスミノーゲンア クチベーター阻害物質に免疫学的に類似しているから、これらの起源からのプラ スミノーゲンアクチベークー阻害物質及びこれらの起因のいずれかに由来するプ ラスミノーゲンアクチベーター阻害物質に類似するプラスミノーゲンアクチベー ター阻害物質に対するモノクローナル抗体も本発明の範囲に属すると理解すべき である。

？ 父に− ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、４ ＦｆＧ、５ 国際調査報告 Ｉｌｌ＋−輸１＾ｐ両−ｓ、　ＰＣＴ／ＤＫ％ん■８０

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．内皮型プラスミノーゲンアクチベーター阻害物質及び免疫学的に類似の阻害 物質に対するモノクローナル抗体。
2. ２．前記抗体がヒト臍帯内皮細胞からの培養液中に存在する組織プラスミノーゲ ンアクチベーター阻害物質と交差反応することを特徴とする請求の範囲第１項に 記載のモノクローナル抗体。
3. ３．内皮型プラスミノーゲンアクチベーター阻害物質及び免疫学的に類似の阻害 物質に対するモノクローナル抗体の製造方法であって、骨髄腫細胞を、前記タイ プのプラスミノーゲンアクチベーター阻害物質により免疫感作された哺乳類から 得られた抗体産生細胞と又は前記プラスミノーゲンアクチベーター阻害物質によ りインビトロで免疫感作された抗体産生細胞と融合せしめ、そして前記の阻害物 質に対する抗体を生産するハイブリドーマを選択することを特徴とする方法。
4. ４．前記抗体産生細胞を脾細胞及びリンパ節細胞から成る群から選択することを 特徴とする請求の範囲第３項に記載の方法。
5. ５．前記抗体産生細胞が脾細胞であることを特徴とする請求の範囲第４項に記載 の方法。
6. ６．マウスの細胞を使用することを特徴とする請求の範囲第３項〜第５項のいず れか１項に記載の方法。
7. ７．免疫感作のために使用されるプラスミノーゲンアクチベーター阻害物質がヒ ト血小板中のプラスミノーゲンアクチベーター阻害物質との免疫学的交差反応を 示すことを特徴とする請求の範囲第３項〜第６項のいずれか１項に記載の方法。
8. ８．前記プラスミノーゲンアクチベーター阻害物質がデキサメタゾン処理された ヒト線維肉腫細胞の培養液から単離されることを特徴とする請求の範囲第３項〜 第７項のいずれか１項に記載の方法。
9. ９．デキサメタゾン処理されたヒト線維肉腫細胞がセルラインＨＴ−１０８０の 細胞であることを特徴とする請求の範囲第８項に記載の方法。
10. １０．内皮型プラスミノーゲンアクチベータ一阻害物質及び免疫学的に類似する 阻害物質に対するモノクローナル抗体を生産することができるハイブリドーマ細 胞。
11. １１．これらが免疫感作されたマウスからの脾細胞とマウス骨髄腫細胞との融合 により生成したものであることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載のハイブ リドーマ細胞。
12. １２．これらが、セルラインＨＴ−１０８０のデキサメタゾン処理されたヒト線 維肉腫細胞の培養液から単離されたＭｒ約５４，０００のプラスミノーゲンアク チベーター阻害物質により免疫感作されたマウスからの脾細胞とマウス骨髄腫細 胞との融合により生成したものであることを特徴とする請求の範囲第１１項に記 載のハイブリドーマ細胞。
13. １３．免疫吸着クロマトグラフィーによるプラスミノーゲンアクチベーター阻害 物質の精製のための、内皮型プラスミノーゲンアクチベーター阻害物質及び免疫 学的に類似の阻害物質に対するモノクローナル抗体の使用。
14. １４．体液及び他の生物学的流体からプラスミノーゲンアクチベーター阻害物質 を除去するための、内皮型プラスミノーゲンアクチベーター阻害物質及び免疫学 的に類似の阻害物質に対するモノクローナル抗体の使用。
15. １５．内皮型プラスミノーゲンアクチベーター阻害物質及び免疫学的に類似の阻 害物質に対するモノクローナル抗体の、該阻害物質の阻害活性の中和のための使 用。
16. １６．遊離阻害物質対複合体結合阻害物質の定量のための、内皮型プラスミノー ゲンアクチベーター阻害物質及び免疫学的に類似の阻害物質に対するモノクロー ナル抗体の使用。
17. １７．体液、正常な又は悪性の細胞及び組織並びに他の生物学的材料中のプラス ミノーゲンアクチベーター阻害物質の検出、同定、免疫染色及び定量のための、 内皮型プラスミノーゲンアクチベーター阻害物質及び免疫学的に類似の阻害物質 に対するモノクローナル抗体の使用。