HU203256B

HU203256B - Process for producing a new antibiotic called kammunocin, as well as pharmaceutical compositions comprising such compound as active ingredient

Info

Publication number: HU203256B
Application number: HU89543A
Authority: HU
Inventors: Christopher Milton Math Franco; Sugata Chatterjee; Erra Koteswara Sat Vijayakumar; Bimal Naresh Ganguli; Richard Helmut Rupp
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1988-02-05
Filing date: 1989-02-03
Publication date: 1991-06-28
Also published as: AU622145B2; DK51089D0; PT89631A; DK51089A; AU2958989A; JPH01273592A; IN166209B; ZA89853B; EP0327045A1; KR890013193A; HUT50361A; PT89631B

Description

A találmány tárgya eljárás a kammunocinnak nevezett új antibiotikum előállítására a Streptomyces Y84,36210 (a német törzsgyűjteményben 1987.12.23án DSM 4329 számon letétbe helyezett) törzs, valamint variánsai és mutánsai fermentálásával, valamint eljárás a hatóanyagként kammunocint tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására.

A Streptomyces Y-84,36210 törzset egy Pune-nál (Maharashtra, India) gyűjtött földmintából izoláltuk. A HIL Y-84,36210 törzs mutánsait és variánsait ismert módon, mutagének - például N-metil-N’-nitrozo-guanidin vagy ultraibolya sugárzás - alkalmazásával állítjuk elő. A Str. Y-84,36210 törzs az Actinomycetales rendbe, a Streptomycetaceae családba és a Streptomyces nemzetségbe tartozik.

A Str. Y-84,36210 törzset új törzsnek tekintjük, mivel egyes morfológiai, tenyésztési és fiziológiai tulajdonságaiban az ismert törzsektől különbözik, amint azt az alábbiakban ismertetjük. Másik oka, ami miatt ezt a törzset új törzsnek tartjuk, az, hogy ez a törzs az alábbiakban jellemzett, kammunocinnak nevezett új antibiotikum-komplexet képes termelni, amely eljárás a találmány tárgyát képezi.

A kammunocin - amint azt alább részletesen bizonyítjuk - egy peptid-antibiotikum, ami azonban a többi ismert peptid-antibiotikumtól - például aktinomicintől, viridogrizeintől, valinomicintől, kinomicintől, ciklosporintól, polimixintől vagy amfomicintől - különbözik. A többi ismert peptid- vagy peptidtartalmú antibiotikummal ellentétben a kammunocin legalább kb. 10 mmól kalciumion jelenlétét igényli ahhoz, hogy antibakteriális hatást fejtsen ki. Ezáltal ez az új antibiotikum jelentősen különbözik a többi ismert antibiotikumtól, például amfomicintől, glumamicintől, zaomicintől vagy az A 21978 C-komplextól -, amelyek antibiotikus hatásuk kifejtéséhez kevesebb, csak 1,0 mmól kalciumion jelenlétét igénylik. Az amfomicin, glumamicin és zaomicin a gyűrűs lipopeptid-antibiotikumok közé tartoznak, amelyeket a „CRC-Handbook of Antibiotic Compounds” [IV. kötet, 1. rész, 313-327. oldal, János Berdy (szerző) CRC Press, Boca Raton, Florida (1980)] irodalmi helyen ismertettek Egy 21978 C-komplexet - ami szintén gyűrűs lipopeptid-antibiotikum - a J. Antibiotics 40,761 777 (1987) irodalmi helyen írtak le.

A találmány szerinti eljárás értelmében az új, kammunocin nevű antibiotikum-komplexet úgy állítjuk elő, hogy a Streptomyces Y-84,36210 törzset vagy annak egy variánsát vagy mutánsát aerob körülmények között, 18 és 37 ’C közötti hőmérséklet-tartományban, szén- és nitrogénforrást, valamint ásványi anyagokat tartalmazó vizes tápközegben, előnyösen 6 és 9 közötti pH-tartományban tenyésztjük, majd az antibiotikum-komplexet a tápközegből kinyerjük

A találmány szerinti eljárással előállított új antibiotikum in vitro számos Gram-pozitív mikroorganizmus ellen hatásos, de csak kalciumionok jelenlétében, valamint immunmoduláló hatással is rendelkezik fenti tulajdonságai következtében gyógyszerkészítmények hatóanyagaként a humán gyógyászat területén használható.

A találmány szerinti eljárásban használt Str. Y84,36210 törzset talajból izoláltuk, mintegy 6,5 és 8,5 közötti pH-jú tápoldat ismert módon való alkalmazásával.

A mikroorganizmusok talajból való izolálására felhasznált tápoldatok szén- és nitrogénforrásból, szervetlen tápsókból és szilárdítóanyagokból állnak Szénforrásként előnyösen például glükózt, keményítőket, dextrint, glicerint, szacharózt vagy melaszt használhatunk A nitrogénforrás előnyösen pepton, élesztőkivonat, marhahúskivonat, malátakivonat, kazein vagy aminosavak például arginin vagy aszparigin lehet. Szervetlen tápsóként például előnyösen nátrium-, kálium-, magnézium-vagy kalcium-foszfátokat vagy -szulfátokat használhatunk A szilárdítóanyag például agar lehet

A találmány szerinti eljárással izolált mikroorganizmusok elágazó szubsztrátmicéliumokból színtelen légmicéliumokat növesztenek A légmicéliumokon spirál alakú spóraláncok képződnek A spirálok nyitottak Gyakoriak a rövid, RA-szakaszt (laza, nyitott kacs, Retinaculum apertum) képviselő spóraláncok is. Sem örvény-, sem ascospora-képződés nem tapasztalható. Az érett spóraláncok lánconként 30-50 spórából állnak. A mikroorganizmus tulajdonságait különféle táptalajokon való tenyésztés esetén az alábbiakban ismertetjük (vesd össze Oxoid-Handbuch 1972,

2. kiadás, kiadó: Oxoid Limited, London, Anglia; vagy Difco Manual, 9. kiadás 1977, kiadó: Difco Laboratories Detroit, Michigan, USA).

1. Élesztőkivonat-malátakivonat-agar tenyészet: jó, redős, száraz légmicélium: jó, poros, enyhén kékesszürke hátoldal: fekete-bíbor oldható pigment: barna-bíbor

2. Zabliszt-agar tenyészet: bőséges, sima, száraz légmicélium: bőséges, poros, halványszürke hátoldal: sötétbarna-bíbor oldható pigment: barna-bíbor

3. Szervetlen só-keményítő-agar tenyészet: bőséges, kiemelkedő, száraz légmicélium; jó, poros, világos kékesszürke hátoldal: sötét feketésibolya oldható pigment: világos mályvaszínű

4. Glicerin-aszparagin-agar tenyészet: jó, kiemelkedő, száraz légmicélium: jó, poros, szürkésrózsaszín hátoldal: fekete-bíbor oldható pigment: világos bíborbama

5. Pepton-élesztőkivonat-vas-agar tenyészet: jó, redős, nedves légmicélium: - nincs hátoldal: gyengén sárga oldható pigment: gyengén barna

6. Tirozin-agar tenyészet: bőséges, redős, száraz légmicélium: bőséges, poros, gyengén szürkéskék hátoldal: sötét feketésibolya oldható pigment: gyengén barnásibolya

HU 203 256 Β

7. Szacharóz-nitrát-agar tenyészet: bőséges, sima, száraz légmicélium: jó, poros, gyengén kékesszürke hátoldal: enyhén sárga oldható pigment: gyengén ibolyaszínű

8. Pepton-marhahúskivonat-agar (tápagar) tenyészet: mérsékelt, kiemelkedő, száraz légmicélium: gyenge, poros, sötétszürke, hátoldal: szürkésrózsaszín oldható pigment: nincs.

Az oldható pigment pH-indikátor tulajdonságú, savas közegben rózsaszínű, lúgos tartományban kékesibolyaszínű.

A találmány szerinti eljárásban használt mikroorganizmus optimális tenyésztési hőmérséklet-tartománya kb. 25 és 35 ’C között van. A mikroorganizmus a zselatint elfolyósítja a glükóz-pepton-zselatin tápközegben; a szervetlen só-keményítő-agar tápközegben a keményítőt hidrolizálja és a lefölözött tejet koagulálja. A Str. Y-84,36210 jól szaporodik Czapek-féle agaroldatban (Oxoid Handbuch) is.

Csak tirozin-agarban figyelhető meg kis mértékben oldhatatlan, sötét pigment képződése, míg peptonélesztőkivonat-vas-agarban vagy tripton-élesztőkivonat-húslevesben nincs oldhatatlan pigmentképződés.

A fenti mikroorganizmus szénforrás-asszimiláló képessége az alábbi:

pozitív: D-glükóz, L-arabinóz, D-xilóz, I-inozit, Dmannit, D-fruktóz, ramnóz, galaktóz, maltóz, cellobióz, N-glutamát, mannóz, laktóz;

kérdéses: szacharóz, szalicin;

negatív: raffinóz, cellulóz, dulcit.

A Str. Y-84,36210 törzset a streptomicin 1,6 (ig/ml-nél nagyobb koncentrációban gátolja; kb. 710% nátrium-klorid-koncentrációt visel el; és pH-tűrő képessége kb. pH 5,5-9,0.

Az ismert mikroorganizmusok közölt tenyésztési és fiziológiai tulajdonságai a találmány szerinti eljárással izolált mikroorganizmushoz viszonyítva jelentős eltéréseket mutatnak

Ezenkívül a Str. Y-84,36210 törzs fermentálással új antibiotikum-komplexet, kammunocint termel.

A fentiek következtében a találmány szerinti eljárással izolált mikroorganizmus új Streptomycestörzsnek tekintendő.

Szakemberek számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti eljárásban nemcsak a fent definiált mikroorganizmus használható, hanem annak minden olyan természetes és mesterséges mutánsa és variánsa is, amely képes az új antibiotikum-komplexet, a kammunocint termelni.

A találmány értelmében a kammunocint úgy állítjuk elő, hogy a Str. Y-84,36210 törzset előnyösen 6,0 és 9,0 közötti pH-tartományban, előnyösen 18 és 37 ’C közötti hőmérsékleten, aerob körülmények között, szén- és nitrogénforrást, szervetlen tápsókat, és adott esetben nyomelemeket tartalmazó tápközegben tenyésztjük, majd az antibiotikumot a tenyészléből ismert módon izoláljuk

Az új antibiotikum előállítására használt tápközeg szénforrásként előnyösen például glükózt, keményítőt, dextrint, glicerint, szacharózt, melaszt vagy olajat tartalmaz. A nitrogénforrás például szójababliszt, élesztőkivonat, marhahúskivonat, malátakivonat, kukoricalekvár, pepton és kazein lehet. Az új antibiotikum előállítására használt tápközeg szervetlen tápsóként/ásványi sóként például előnyösen nátrium-kloridot, magnézium-szulfátot, ammónium-szulfátot, vagy kalcium-karbonátot tartalmaz. Nyomelemként például vasat, mangánt, rezet, cinket vagy kobaltot alkalmazunk előnyösen.

A találmány szerinti eljárás egy előnyös megvalósítási módja szerint a Str. Y-84,36210 törzset 26-28 ’C-on, pH 6,4-6,6 értéken tenyésztjük A kívánt vegyületek legmagasabb hozamát 40-45 órán keresztül tartó fermentációval érjük el. A fermentálást előnyösen merített tenyészetben végezzük A fermentáció lefolyását és az új antibiotikum-komplex képződését a tenyészlé és a micélium antibakteriális hatásának mérésével követhetjük, tesztorganizmusként Staphylococcus aureus 290 P törzset használva, 30 mmól/1 kalcium-kloridot tartalmazó agar-tápközegben.

Kívánt esetben a fermentálás során a tápközeghez habzásgátló szert - például Desmophen* (poliol, Bayer AG, Leverkusen, NSZK terméke) - is adhatunk

A kammunocint a tenyészléből például megfelelő adszorbensen való közvetlen adszorpcióval vagy oldószeres extrahálással, majd azt követő adszorpcióval nyerhetjük ki. Oldószerként előnyösen például etilacetát vagy kloroform n-propanollal alkotott elegyeit, különösen előnyösen etil-acetát és n-propanol 2:1 térfogatarányú elegyét használjuk

A tenyészet szűrletét vagy a szűrlet találmány szerinti vegyűletet tartalmazó oldószeres extraktumát például aktív szólói, polimer adszorbensen, így például Diaion* ΗΡ-20-οη (Mitsubishi Chemical Indrustries, Japán) vagy Amberlit* XAD-on (polisztirol, akrilészter vagy aminoxid mátrixból álló polimer adszorbens, átlagos pórusátmérője 40 x 10^_1°-225 x 10“¹⁰ m, Rohm and Haas Co., USA) adszorbeálhatjuk Az oldószeres extraktumot az oldószer eltávolítása céljából előnyösen bepároljuk majd az adszorbensen kromatografáljuk A találmány szerinti vegyűletet megfelelő mozgó fázissal, például kloroformmal, metalonnal vagy acetonnal, illetve ezek egymással alkott elegyével, vagy vízzel eluálhatjuk az adszorbensről, majd az eluátumot szárazra pároljuk Eluensként előnyösen metanolt használunk

A kammunocint ioncserélő kromatográfiás eljárással is izolálhatjuk a tenyészet szűrletébőL Gyantaként például enyhén bázikus, polisztirol-, poliamin- vagy térhálósított aminoalkohol-poliakril-észter típusú anioncserélő gyantákat - például Dovex® (Dow Chemical Company, USA) vagy Amberlite® IRA 68 (Rohm and Haas Co., USA) gyantát használhatunk Az előnyösen alklamazható ioncserélő gyanta az Amberlite® IRA 86 (akril típusú, tere-amin funkciós csoporttal). Ebben az eljárásban a tenyészet szűrletét előnyösen oszlopkromatográfiás eljárásnak vetjük alá, amikor is Amberlite® IRA 68 (Cl^-) anioncserélő gyantával töltjük az oszlopot. A találmány szerinti vegyületeket elő3

HU 203 256 Β szőr az anioncserélőn adszorbeáljuk, majd megfelelő mozgó fázist - például vizes vagy metanolos nátriumvágy kálium-klorid-oldatot, híg sósavoldatot vagy nátrium-hidroxid-oldatot - alkalmazva eluáljuk, eluensként előnyösen 2 mól/1 koncentrációjú nátrium-kloridoldatot használunk. A hatóanyagot tartalmazó eluátumot koncentráljuk, és a fent említett adszorbensek segítségével sómentesítjük. Az így nyert, sómentes aktív eluátumot összegyűj tjük és koncentráljuk.

A fenti módon kapott, koncentrált, kammunocintartalmú eluátumot ezután különféle módszerekkel tovább tisztíthatjuk Például további adszorpciót és eluciót alkalmazhatunk, aktív szénen, polimer adszorbenseken - például Amberlite® XAD-4-en (polisztirolból álló polimer mátrixból áll, átlagos pórusátmérője 40 x 10“¹⁰ m), Amberlite XAD 7-en (akrilészter mátrixból áll, átlagos pórusátmérőie 40x10“¹⁰ m, Rohm and Haas Co., USA), Diaion® ΗΡ-20-οη (Mitsubishi Indrustries, Japán) - adszorbeálva, vagy lipofil gélszűrő anyagokon - például Sephadex® LH-20-οη vagy a G-sorozatba tartozó géleken (Pharmacia Fine Chemicals AB, Svédország) és hasonló termékeken gélszűrést végezhetünk, vagy ioncserélő gélszűrést végezhetünk dietil-amino-etil- (DEAE)-funkciós csoportoto tartalmazó gélekkel, például Sephadex® DEAE-gélekkel (Pharmacia Fine Chemicals AB, Svédország), vagy adszorpciós kromatográfiás eljárást alkalmazhatunk, alumínium-oxidon vagy szilikagélen, és ezeket a továbbtisztítás során egymással kombinálhatjuk is. A tisztítási eljárások közé sorolhatjuk még a vékonyréteg-kromatográfiát, a közepes nyomású, és nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárást is, megfelelő adszorbenseket, például szilikagélt és módosított szilikagél-C]₈-at (amelyet például szilikagél és oktadecil-triklór-szilán reagáltatásával kapunk) és egyéb megfelelő anyagokat használva. A tisztítás céljára megfelel ezenkívül a megfelelő oldórendszerekkel végzett ellenáramú kromatográfiás eljárás is.

A kammunocin színtelen, amorf por, amely vízben, metanolban, etanolban, propilénglikolban és dimetilszulfoxidban oldódik. A kammunocin acetonban, metilén-kloridban, etil-acetátban, kloroformban, hexánban és 40-60 °C-os forráspontú petroléterben nehezen, vagy nem oldható. Ninhidrines festési vizsgálatban negatív reakciót mutat.

A kammunocin vékonyréteg-kromatográfiás értékei az alábbi rendszerekben a következők:

Lemez: Kieselgel kész lemez, cikkszáma 5554 (Merck, Darmstadt)

Kammunocin Rf értéke: etil-acetát-metanol-víz (4:

4:1) elegyben 0,47 butanolecetsav-víz (4:4:1) elegyben 0,39.

Az 1. ábrán látható a kammunocin vékonyrétegkromatográfiás képe etil-acetát-metanol-víz (4:4: 1) elegyben, a detektálás 254 nm-en történt.

A 2. ábrán látható a kammunocin analitikai nagynyomású folyadékkromatogramja, amelyet az alábbi körülmények között vettünk fel:

oszloptöltet: ODS-Hypersil® (10 μ,

4x120 mm) (HPLC-anyag oktadecil-triklór-szilán csoportokkal, Shandon, USA) átfolyási sebesség: 0,5 ml/perc kimutatás: 234 nm-nél oldószer: metanol és 1%-os vizes ecetsavoldat 55:45 térfogatarányú elegye.

A kammunocin olvadáspontja 270 °C, bomlás közben.

A kammunocin spektroszkópiás adatai az alábbiak:

1. UV maximum metanolban kb. 224,280, 345 nm (3. ábra). A kammunocin UV-adszorpciós maximum értékeit 0,2 g/1 koncentrációértéknél határoztuk meg. Az adszorpciós spektrumot Uvikon 810 spektrofotométerrel határoztuk meg, a 200-800 nm tartományban.

2. Az IR-spektrumot (KBr-tabletta) Perkin Elmer spektrométerrel PE.521 mértük (4. ábra).

A fenti spektroszkópiás adatok, valamint a 6. példában ismertetett kémiai és spektroszkópiás analíziseredmények arra utalnak, hogy a kammunocin egymással rokon peptid-antibiotikumok komplexe.

A kammunocin egyedi jellemzője, hogy antibiotikus hatását Gram-pozitív baktériumok ellen csak kalciumionok jelenlétében fejti ki Más fémionok, például nátrium-, kálium-, bárium-, rubidium- és magnéziumionok nem rendelkeznek ilyen hatással. Ezért a kammunocint olyan agaros tápközegben vizsgáljuk, amely legalább kb. 10 mmól/1 kalcium-kloridot tartalmaz.

A fent megadott, kalciumban gazdag agarban a kammunocin in vitro mind érzékeny, mind rezisztens Staphylococcus aureus és Streptomyces faecalis törzsek ellen hatást mutat, ilyen törzsek például a Bacilus subtilis, Sarcina lutea, Streptococcus pzogenes és Micrococcus luteus. A minimális gátló koncentráció (MHK) értékeket is meghatároztuk a kammunocinra. Az eredményeket az 1. táblázatban ismertetjük.

1. táblázat:

Kammunocin minimális gátló koncentrációja Müller-Hington-agarban (Oxoid kézikönyv), különböző Ca²⁺-koncentrációk mellett.

Mikroorganizmus	Kalciumion-koncentráció (mmól/1)
0,0	2,5	10,0	30,0	60,0
S. aureus 209 P	>100,0	25,0	6,3	1,6	<0,1
S. aureus 20464 Mák®	>100,0	100,0	25,0	1,6	1,6

HU 203 256 Β . Kalciumion-koncentráció (mmól/1)

Mikroorganizmus -

	0,0	2,5	10,0	30,0	60,0
S. aureus 3066 Met^	>100,0	50,0	6,3	6,3	0,8
S. aureus R 85 Em^®^	>100,0	- >100,0	>50,0	25,0	6,3
S. aureus R 85/M Em^	>100,0	>100,0	>50,0	2,5	1,6
S. aureus 712 Met W	>100,0	100,0	6,3	6,3	0,4
S. aureus 789 Met^®*	>100,0	100,0	6,3	1,6	0,8
Str.faecalisUD86	>100,0	100,0	25,0	6,3	0,8
Str.faecalisEder Mák®	>100,0	100,0	25,0	6,3	1,6
S. aureus MLS 11	>100,0	>100,0	12,5	3,2	1,6
S. aureus MLS14	>100,0	50,0	25,0	12,5	1,6
S. aureus MLS 16	>100,0	100,0	25,0	25,0	1,6
S. aureus 011UC5	>100,0	100,0	>50,0	12,5	1,6
S. aureus 011GR5	>100,0	100,0	>50,0	>50,0	NT
Str.faecalis02	>100,0	100,0	25,0	6,3	1,6
Micrococcus luteus	>100,0	3,2	0,8	0,2	<0,1
Sarcina lutea	>100,0	25,0	6,3	1,6	0,8
Bacillus subtilis	>100,0	100,0	6,3	3,2	0,8
E. coli 9632	>100,0	>100,0	>100,0	>100,0	>100,0
E.coli 2231	>100,0	>100,0	>100,0	>100,0	>100,0
Candida albicans	>100,0	>100,0	>100,0	>100,0	>100,0
Aspergillusniger	>100,0	>100,0	>100,0	>100,0	>100,0

Mak^ makrolid-antibiotikum okkal szemben rezisztens

Met^ meticillinnel szemben rezisztens EM^O eritromicinnel szemben rezisztens

A kammunocin immunrendszer-moduláló hatását az alábbiak szerint vizsgáljuk. 40

Hemolízis-plakk vizsgálat (PFC)

16-18 g-os nőstény svájci egereket (csoportonként 6 állatot) 5 χ 10⁸ sejt juheritrocita intraperitoneális injektálásával szenzibilizálunk. 5 nap múlva az egereket nyaktöréssel elpusztítjuk, a lépet eltávolítjuk és Dulbecco-oldatban jéggel hűtve tároljuk. A lépet finomhálós drótráccsal óvatosan feldarabolva kapjuk a lépsejteket. Meghatározzuk az élő sejtek számát, és azok koncentrációját kb. 6 x 10⁶ sejt/ml-re állítjuk be.

Végül a lépsejteket juheritrocitákkal reagáltatjuk komplement jelenlétében, Cunningham-kamrában, 37 °C-on, 5% szén-dioxid-tartalom mellett. A képződött plakkokat 2 óra múlva megszámoljuk.

A kammunocint a szenzibilizálás napjától kezdve naponta 5, 10, illetve 20 mg/kg dózisban intraperito45 neálisan, vagy 10 mg/kg dózisban szubkután módon injektáljuk. A vegyület utolsó dózisát az 5. napon, az állat leölése előtt 1 órával adjuk be. Az eredményeket a 2. táblázatban ismertetjük.

2. táblázat

Dózis (mg/kg) x 5	Alkalmazás módja	PFC gátlása (%)
5,0	i.p.	31,20
10,0	i.p.	40,66 ±4,67
20,0	i.p.	41,4 ±4,89
10,0.	s.c.	38,4

HU 203 256 Β

A fenti eredmények azt mutatják, hogy a kammunocin immunszupresszív hatással rendelkezik, és fenti tulajdonsága következtében immunszuppresszív gyógyászati készítmények hatóanyagaként például a szervátültetéseknél használható.

A kammunocint farmakológiai tulajdonságai alkalmassá teszik gyógyszerkészítmények hatóanyagként való alkalmazására. A találmány tárgya tehát eljárás hatóanyagként kammunocint tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására, amely gyógyászati készítmények a hatóanyag mellett szokásos, általánosan használt segéd- és/vagy hordozóanyagokat tartalmaznak. A találmány szerinti eljárással előállított gyógyászati készítmények antibiotikus és/vagy immunszupresszív hatással rendelkeznek.

A találmányt közelebbről - a korlátozás széndéka nélkül - az alábbi példákkal kívánjuk ismertetni.

1. példa

Streptomyces Y-84,36210 törzs izolálása talajból

a)Az izolálásra használt tápközegek előállítása
1. Táp közeg:
glükóz	1,0 g
glicerin	i,0g
L-arginin	0,3 g
K₂HPO₄	0,3 g
MgSO₄7H₂0	0,2 g
NaCl	0,3 g
élesztőkivonat	0,2 g
Fe2(SO4)₃	10,0 mg
CuSO₄5H₂O	lmg
ZnSO₄7H₂O	lmg
MnSO₄7H₂O	lmg
agar	15,0 g
desztillált víz	1 liter
pH	6,5
2. Tápközeg:
glükóz	2,0 g
L-aszparagin	1.0 g
K₂HPO₄	0,5 g
MgSO₄7H₂O	0,5 g
talajkivonat (talajminta forralásával
és szűrésével előállítva)	200 ml
agar	15,Og
desztillált víz	800 ml
PH	8,0
3. Táp közeg:
keményítő	10,0 g
kazein	0,3 g
KNO₃	2,0 g
NaCL	2,0 g
K₂HPO₄	2,0g
MgSO₄7jj2O	0,05 g
CaCO₃	0,02 g
FeSO₄	10,01 g
agar	15,0 g
desztillált víz	1 liter
PH	7,2-7,5

A tápközegeket 121 °C-on 30 percen keresztül ste- 60 rilezzük. A sterilizált tápközeget 45 °C-ra hagyjuk hűlni, majd Petri-csészébe töltjük és hagyjuk megszilárdulni.

b) Talaj szuszpenzió előállítása lg talajt 1 órán keresztül 110 °C-on melegítünk forró levegős kemencében. A lehűlés után a talajt desztillált vízben szuszpendáljuk, és alaposan összerázzuk. A talajt leülepedni hagyjuk, és a felülúszót használjuk az egyes fent megadott izolációs tápköze10 gek beoltására.

c) Tápközeg beoltása

A fenti táptalajokból 50 ml tartalmazó Petri-csészékre 1 ml talajszuszpenziót oltunk.

d) Streptomyces Y-84,36210 izolálása

A beoltott Petri-csészéket 37 °C-on 10 napon keresztül inkubáljuk, majd a szaporodó mikroorganizmusok közül izoláljuk a Streptomyces Y-84,36210 törzset.

2. példa

Streptomyces Y-84,36210 tenyésztése a kammunocin fermentálása céljából A Streptomyces Y-84,36210 törzset az alábbi ösz-

szetételű élesztő-maláta-agaron tenyésztjük:
malátakivonat	10,0 g
élesztőkivonat	4,0 g
glükóz	4,0 g
agar	15,0 g
desztillált víz	1 liter
PH	7,0

A tápkozeget kémcsövekbe mérjük, és 30 percen keresztül 121 °C-on sterilezzük. A kémcsöveket ferde helyzetben lehűtve ferde agart kapunk A ferde agart a tenyészettel beoltjuk, és 10-15napon keresztül 28 °C35 on inkubáljuk, ezalatt jó növekedés és spóraképződés figyelhető meg. A ferde agairól desztillált vízzel nyert spóraszuszpenziót 5 db, egyenként 100 ml oltó-tápközeget tartalmazó 500 ml-es lombik, vagy egy, 1 liter oltóközeget tartalmazó 5 literes szívópalack beoltásá40 ra használjuk.

Az oltó-tápközeg összetétele:

glükóz	15,0 g
szójababliszt	15,0
kukoricalekvár	5,0 g
CaCO₃	2,0 g
NaCl	5,0 g
desztillált víz	1 liter
PH	6,5

A fenti tápközeget 100 ml-enként 500 ml-es Erlen50 meyer-lombikokba, vagy 1 literenként 5 literes szívópalackokba mérjük, és 30 percen keresztül 120 °C-on sterilezzük.

A lombikokat vagy palackokat lehűtjük, és a spóraszuszpenzióval beoltjuk, majd 72 órán keresztül

27 ± 1 °C-on rotációs rázógépen (240 fordulat/perc, 3,8 cm kitérés) rázatjuk. Az így kapott tenyészetet két, 10 liter oltó-tenyészetet tartalmazó 15 literes üvegfermentor beoltására használjuk, 8-10 térfogati menynyiségben.

A fermentálást 27±l°C-on, 180-200 fordu-61

HU 203 256 Β lat/perc keverés mellett, 6-7 liter/perc levegőztetést alkalmazva 24 órán keresztül végezzük. Az így kapott jól szaporodó, második átoltású oltó-tenyészetet használjuk az antibiotikum előállítására használt tápközeg beoltására.

Antibiotikum előállítására használt tápközeg

összetétele
glükóz	15,0 g
oldható keményítő	20,0 g
szójaton (szójaliszt enzimatikus
hidrolizátuma)	3,0 g
pepton	3,0 g
CaCO₃	2,0 g
NaCl	2,0 g
kukoricalekvár	2,0 g
(NH4)₂SO₄	0,5 g
desztillált víz	1 liter
pH	6,5

A fermentorba 0,025% Desmophent teszünk, habzásgátló szerként.

A fenti összetételű tápközeg 280 literét 390 literes fennen toredénybe mérjük. A tápközeget 121 °C-on 28 percen keresztül sterilezzük közvetett vagy közvetlen gőzzel. A fennentoredényt lehűlni hagyjuk, és 7 térfogat% második átoltású oltó-tenyészettel beoltjuk A fermentálást 27±l°C-on 100-120 fordulat/perc keverés mellett végezzük, a levegőztetés 170 liter percenként. A fermentálást 40-45 óra múlva fejezzük be, ekkor a tenyészet szűrletének gátlózóna-átmérője Staphylococcus aureus 209 P ellen 20 mm, agar-lyukasztásos módszert alkalmazva (6 mm lyukátmérő), 30 mmól kalciummal kiegészített agaron, a tápfolyadék pH-jának 6,5-6,9 értéke mellett.

A leülepedett sejttérfogat 20%.

Az antibiotikum-komplexet tartalmazó tenyészlevet összegyűjtjük és a micélium elválasztása céljából centrifugáljuk, majd a 4. példában ismertetett módon feldolgozzuk.

3. példa

Streptomyces Y-84,36210 tenyésztése kammunocin előállítása céljából

A 2. példában leírtak szerint járunk el, az alábbi körülmények között.

A Streptomyces Y-84,36210 törzset az alábbi ösz-

szetételű agaros tápközegben tenyésztjük
oldható keményítő	10,Og
K₂HPO₄	i,0g
MgSO₄7H₂O	i,0g
NaCl	i,0g
(NH^SC^	2,0 g
CaCO₃	2,0 g
FeSO₄7H₂O	0,1 mg
MoCl₂4H₂O	0,1 mg
ZnSO₄7H₂O	0,1 mg
desztillált víz	1 liter
pH	7,2

Az oltó-tápközeg összetétele azonos a 2. példában ismertetett oltó-tápközegével.

Fermentációs tápközeg összetétele:

glükóz	20,0 g
szójababliszt	10,0 g
CaCO₃	0,2g
CoCl₂6H₂O	1,0 mg
desztillált víz	1 liter
PH	7,0

100 liter fenti tápközeget 1501-es fermentoredénybe helyezünk A tápközeget 121 °C-on 28 percen keresztül közvetett vagy közvetlen gőzzel sterilezzük A fennentoredényt lehűtjük és 9 térfogat% második átoltású oltótenyészettel beoltjuk. A fermentálást 27 ± 1 °C-on, 80-90 fordulat/perc keverés és 60-70 liter/perc levegőztetés mellett 40-45 órán keresztül végezzük A fermentálás végén a tenyészlé pH-ja 6,45 és a Staphylococcus aureus 209 P elleni gátlózóna átmérője 22 mm, a tenyészet szűrletét agarlyukasztásos módszerrel (6 mm lyukátmérő) vizsgálva, 30 mmól kalciummal kiegészített agart használva. A leülepedett sejttérfogat 12 térfogat%. A tenyészlevet az 5. példában leírtak szerint dolgozzuk fel.

4. példa

240 ml 2. példa szerint előállított tenyészszűrletet 6 liter anioncserélő Amberlite® IRA 68 (Cl^-) gyantát (polisztirol-poliamin funkcionalitású ioncserélő gyanta) tartalmazó oszlopra viszünk Az oszlopot 40 liter sómentesített vízzel öblít jük majd 2,0 mól/1 koncentrációjú, ammóniával pH 8,5 értékre állított nátrium-klorid-oldattal eluáljuk Az így kapott aktív eluátumokat (30 liter) etil-acetát és n-propanol 2:1 térfogatarányú elegyével háromszor extraháljuk majd a pH-t sósavval 4,0 értékre állítjuk Az extraktumot vákuumban bepároljuk, és az így kapott 6,1 g koncentrátumot szilikagéllel (szitaméret 0,062-0,037 mm, 600 g) töltött oszlopon kromatográfiás eljárással tisztítjuk az eluálást kloroformtól kloroform-metanol 1:1 térfogatarányú elegyéig változó gradienssel végezzük

Az egyesített aktív frakciókat (3 g) telített, vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal extraháljuk majd az extraktum pH-ját sósavval 4,0-ra állítjuk, és etil-acetát és n-propanol 2:1 térfogatarányú elegyével újraextraháljuk. Az extraktumot vákuumban koncentráljuk, és a kapott 1,8 g anyagot 360 g szilikagéllel (szitaméret 0,062-0,037 mm) töltött oszlopon kromatografáljuk Az eluálást etil-acetáttól etil-acetát-metanol 1:1 térfogatarányú elegyéig változó koncentráció-gradienssel végezzük Bepárlással 860 mg biológiaüag aktív anyagot kapunk

A kapott anyagot 6 részre osztjuk, és külön-külön metanolban 50 g Sephadex®LH-20-at (lipofil gélszűrő anyag) tartalmazó oszlopra visszük az eluálást metanollal végezzük A fenti módon 360 mg kammunocint kapunk, amelynek fizikai állandóit a 6. példában ismertetjük

5. példa

A 3. példa szerint végrehajtott két párhuzamos fermentálásból nyert tenyészet szűrletét egyesítjük, így összesen 185 liter szűrletet kapunk A fenti szűrletet 4

HU 203 256 Β liter Amberlite® IRA 68-at (Cl^-) tartalmazó oszlopra visszük fel. A oszlopot 20 liter sómentesített vízzel mossuk, és 2,0 mól/1 koncentrációjú vizes nátriumklorid-oldattal eluáljuk, amelynek pH-ját ammóniával 8,5-re állítottuk.

Az így kapott 47 liter gktív eluátumot 3 liter Diaion® ΗΡ-20-at (polimer adszorbens, Mitsubishi Chemical Indrustries, Japán) tartalmazó oszlopra visszük fel; az oszlopot 7 liter sómentesített vízzel mossuk, és metanollal eluáljuk. Az aktív metanolos eluátumokat vákuumban koncentráljuk, és az így kapott vizes oldatot desztillált vízzel hígítjuk. A pH-t sósavval 3,0-ra állítjuk, és az oldatot Diaion ΗΡ-20-szal töltött oszlopra visszük. Az oszlopot sómentesített vízzel addig öblítjük, míg az öblítővíz kloridiontól mentes lesz. A kammunocint metanollal eluáljuk; a metanolos eluátumot vákuumban koncentráljuk és liofilizáljuk. A fenti módon 21 g nyers antibiotikum-komplexet kapunk.

A kapott nyersterméket kétszer desztillált vízben oldjuk, amelynek pH-ját ammóniával 1,7-re állítottuk, az oldatot két részre osztjuk, és két, a Sephadex® LH-20-at kétszer desztillált vízben tartalmazó,

6.4 x 84 cm-es oszlopra visszük fel. Az oszlopokat 0,5 ml/perc átfolyási sebesség mellett kétszer desztillált vízzel eluáljuk, és az eluátumot 20 ml-es frakciókban gyűjtjük. Az így kapott, összesen 1,1 liter aktív eluátumot liofilizáljuk, így 8 g antibiotikum-komplexet kapunk

A kapott anyagot Sephadex® LH-20-at tartalmazó oszlopon újrakromatografálva továbbtisztítjuk a fent ismertetett módon, így 4,45 g félig tiszta antibiotikum-komplexet kapunk.

A fenti félig tisztított komplexet 200 ml kétszer desztillált vízben feloldjuk, és 6 x 26 cm-es, DEAE Sephadex^R Α-25-tel (ioncserélő gyanta dietil-aminoetil-funkcionalitással) töltött oszlopon (kétszer desztillált vízben) kromatografáljuk. Az oszlopot vízzel öblítjük, majd vizes nátrium-klorid-oldattal eluáljuk, amelynek moláris koncentrációját 5%-onként lépcsőzetesen növeljük. Az antibiotikum-komplexet 6 liter

1.5 mól/1 koncentrációjú nátrium-klorid-oldattal, majd 5 liter 2 mól/1 koncentrációjú nátrium-klorid-oldattal eluáljuk. Az egyesített eluátumok pH-ját sósavval 2,0-re állítjuk, majd 2 liter Diaion® ΗΡ-20-at tartalmazó oszlopra visszük; az oszlopot vízzel addig öblítjük, míg az öblítővíz kloridion-mentes lesz. Az oszlopot ezután metanollal eluáljuk. A metanolt vákuumban ledesztilláljuk, és a maradékként kapott vizes oldatot liofilizáljuk.

700 mg tiszta kammunocint kapunk, amelynek fizikai állandóit a 6. példában ismertetjük

6. példa

A tiszta kammunocin antibiotikum-komplex nagynyomású folyadékkromatogramja ODS-Hypersü®-t (10 μ) tartalmazó, 4x120 mm nagyságú oszlopon, metanol és 1%-os vizes ecetsav 55:45 térfogatarányú elegyéből álló eluálószerrel, 0,5 ml/perc átfolyási sebesség mellett, 234 nm-en vizsgálva azt mutatja, hogy a kammunocin egy mikroheterogén keverék, azaz egymással rokon antibiotikus tulajdonságú vegyületek komplexe, amint az a 2. ábrán látható.

A kammunocint 6 n sósavoldattal hidrolizáljuk és az így kapott hidrolizátumot metilezés és trifluor-acetilezés után GC-EIMS (gázkromatográfiás elektronkilökéses tömegspektroszkópia) és GC-CIMS (gázkromatográfiás tömegspektroszkópia) kémiai ionizálássál) módszerrel analizáljuk, 3% OV-l-et tartalmazó gázkromon-Q-oszloppal ellátott Perkin-Elmer gázkromatográf segítségével, amelyhez on-line Datasystem DS-50 SM-mel ellátott AEI MS-9025 tömegspektrométert kapcsolunk

A következő aminosavak jelenlétét mutattuk ki:

Fő komponensek a-amino-adipinsav aszparaginsav glicin

4-hidroxi-fenilglicin szerin

Mellékkomponensek glutaminsav

3-hidroxi-aszparaginsav leucin

N-metilfenil-glicin prolin treonin.

A fenti adatokból arra következtethetünk, hogy a kammunocin egy peptid-antibiotikum-komplex.

A komplex fő komponensének móltömege 1516 (FAB-MS mérés szerint). A fő komponens kvantitatív aminosav-analízisének eredményei: a-amino-adipinsav: glicin :4-hidroxi-fenü-glicin: sze rin: treonin: aszparaginsav = 1:1:1:1:1:3; UV- és IR-spektruma a fent megadott; az antibiotikus aktivitás kifejtéséhez szükséges, 30 mmól/l-nél nagyobb Ca²⁺-igény egyedülálló, egyetlen ismert antibiotikumnál sem figyelhető meg.

Claims

1. Eljárás kammunocin - amelynek UV-spektruma metanolban a 3. ábra szerinti, abszorpciós sávjai 224, 280 és 345 nm körül vannak; IR-spektruma Kbr-tablettéban a 4. ábra szerinti, abszorpciós sávjai 3400, 1680,1559, 1250 és 600 cm^-1 körül vannak - előállítására, azzal jellemezve, hogy a Streptomyces Y84,36210 (deponálási szám: DSM 4329) törzset vagy annak egy variánsát vagy mutánsát aerob körülmények között, szén- és nitrogénforrást, valamint tápsókat és adott esetben nyomelemeket tartalmazó tápközegben tenyésztjük, és a kammunocint a tenyészléből izoláljuk és tisztítjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 18 és 37 °C közötti hőmérséklettartományban, 6 és 9 közötti pH-értéken végezzük

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 26 és 28 °C közötti hőmérséklet-tartományban, 6,4 és 6,6 közötti pH-értéken végezzük.

HU 203 256 Β

4. Az 1 -3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 40-45 órán keresztül folytatjuk

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerint' eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést merített tényé- 5 szetben végezzük

6. Eljárás gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1 -5. igénypontok bármelyike szerint előállított kammunocint a gyógyszerkészítésben szokásosan alkalmazott hordozóanyagokkal és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverjük és megfelelő dózisformává alakítjuk.

Kammunocin vékonyréteg - kromatogrammja Oldószer - rendszer: etil-acetát; metanol: viz (4:4:1)

1. ábra

Kammunocin nagynyomású folyadékknomatogrammja ODS - HiperziI (10/·) oszlopán (4 x 120 mm);