HU181089B

HU181089B - Process and reagent for enzymatical determining enzyme substrates

Info

Publication number: HU181089B
Application number: HU8080795A
Authority: HU
Inventors: Peter Scheibe; Erich Bernt; Sigmar Klose
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1979-04-04
Filing date: 1980-04-02
Publication date: 1983-05-30
Also published as: CS228127B2; EP0016947B1; ATE4126T1; AU5677980A; JPS55135599A; CA1152871A; DD150256A5; DE2913553C2; CS244665B2; FI70727B; YU91780A; DE2913553B1; AU515851B2; FI70727C; FI801025A; YU44100B; US4517287A; EP0016947A1; DE3064075D1; CS783481A2

Description

A találmány tárgya eljárás és reagens enzimszubsztrátok enzimatikus meghatározására.

Enzimszubsztrátok, például glükóz, húgysav, koleszterin, enzimatikus meghatározását főként az zavarja, hogy a reagensekben lévő anyagok, például redukáló vagy oxidáló anyagok, reagálnak a tesztrendszer köztitermékeivel vagy végtermékeivel. Ez a zavaró mellékreakció végbemehet tisztán kémiailag, vagy a zavarás történhet az enzim gátlása útján, az enzimatikus reakcióba versengő szubsztrátként való belépés útján és hasonló módon. Mindegyik esetben csökken a mért indikátortermék koncentrációja; kvantitatív, főleg fotometriás meghatározásoknál tehát például a képződő színezék koncentrációja. Az eljárás helyessége szempontjából lényeges egyenes arányosság a kimutatandó szubsztrátkoncentráció és a mért indikátortermék koncentrációja között ily módon megszűnik. A kimutatandó szubsztrátra kapott eredmény 100%-tól eltérő lesz. Másszóval, hamis eredményeket kapunk.

A találmány célja az, hogy megoldja ezt a problémát, és enzimszubsztrát zavaró anyagok jelenlétében való enzimatikus meghatározására olyan eljárást és reagenst bocsásson rendelkezésünkre, amely helyes eredményeket szolgáltat, és a fentebb felsorolt nehézségeket kiküszöböli.

Ezt a feladatot a találmány szerint enzim-szubsztrátnak zavaró anyagok — amelyek magával a szubsztráttal vagy az indikátorreakció egy közbülső vagy végtermékével reagálhatnak — jelenlétében való 181089 enzimatikus meghatározására szolgáló olyan eljárással oldottuk meg, amelyre az jellemző, hogy a vizsgálandó minta hozzáadása előtt először meghatározott mennyiségű szubsztrátot reagáltatunk a reagens5 sel, amíg elreagál, és csak azután adjuk hozzá a meghatározandó mintát.

A meghatározott mennyiségű szubsztrát hozzáadásával, amely mindig lényegesen kevesebb a mérő rendszer szubsztrát-meghatározó kapacitásánál, egy 10 előreakció lezajlását idézzük elő, amíg minden hozzáadott szubsztrát felhasználódik. Ennek az előreakciónak a során a zavaró anyagok is teljesen felhasználódnak. Amint ez a reakció tökéletesen végbement, adjuk csak hozzá az ismeretlen mennyiségű 15 meghatározandó szubsztrátot tartalmazó tulajdonképpeni megvizsgálandó mintát. A meghatározandó szubsztrát mennyisége azután a mérendő reakciótermékre végzett előreakció végértéke és a vizsgálandó minta hozzáadása után kapott végérték 20 közötti különbségből adódik. Lehetséges az is, hogy a tulajdonképpeni mintameghatározást kinetikusán végezzük, azaz ne végértékeket, hanem csak reakciósebességeket mérjünk.

A találmány szerint hozzáadandó szubsztrát 25 mennyiségére vonatkozólag semmilyen általános adat nem adható. Ez a mennyiség a mérőrendszertől és a várható zavaró anyagok mennyiségétől függ. Általában a zavaró anyagokra számítva elegendő szubsztrátfelesleget alkalmazunk, hogy biztonsággal kizár30 juk, hogy még el nem reagált zavaró anyagok legye-1181089 nek jelen, amikor a tulajdonképpeni ismeretlen mintát adjuk hozzá. Másrészt nem is túl sok szubsztrátot adunk hozzá, hogy a tulajdonképpeni mérőreakcióra ne kapjunk túl magas és a mérőreakció pontosságát negatívan befolyásoló nulla értéket. Az utóbbi játszik például szerepet egy eljárás szerint képződő színezék fotometriás méréseinél. Az ilyen, egy reakciótermékként keletkező színezék fotometriás meghatározásán alapuló módszerek esetében a hozzáadott meghatározott szubsztrátmennyiséget olyan alacsonyan tartjuk, hogy még ne keletkezzen zavaró koncentrációjú színezék. Ez a gyakorlatban minden esetben könnyen elérhető, mivel ilyenfajta színezék vagy egyéb indikátortermék csak olyan szubsztrátmennyiségből keletkezik, amely zavaró anyagok elreagál tatásához szükséges szubsztrátmennyiséget meghaladja.

A találmány szerinti eljárásnál nem szükséges a zavaró idegen anyagok fajtáját ismerni. Főként redukáló anyagokról van szó, de oxidáló vagy egyéb zavaró anyagok is biztonsággal kiküszöbölhetők a találmány szerinti eljárással.

A találmány tárgya továbbá enzimszubsztrát enzimatikus meghatározására szolgáló, a szubsztrát meghatározására alkalmas rendszert tartalmazó reagens, amely legalább egy enzimből, legalább egy pufferanyagból és legalább egy indikátoranyágból valamint adott esetben segédanyagokból áll, és amelyet az jellemez, hogy meghatározott mennyiségű szubsztrátot tartalmaz, az ezen szubsztrát meghatározására szolgáló rendszer szubsztrátmeghatározó kapacitásánál kevesebbet.

Ha a száraz formában lévő találmány szerinti reagenst vízben feloldjuk, a zavaró anyagok kiküszöbölésére szolgáló reakció már az oldás alatt és után végbemegy. Az igy kapott oldat azután közvetlenül alkalmazható az enzimszubsztrát tulajdonképpeni meghatározására, vagy újra szárazreagenssé alakítható, amely alkalmas későbbi újabb feloldásra a meghatározási reakció kivitelezése előtt. Lehetséges azonban az is, hogy a találmány szerinti reagenst csak közvetlenül felhasználása előtt komplettírozzuk szubsztrát-hozzáadással, vagy alternatív módon a reakció beindításához szükséges anyagot, például az enzimet, vagy többfokozatú enzimes reakció esetén a reakcióhoz szükséges valamely enzimet csak utólag adjuk hozzá.

A találmány szerinti reagens egyik előnyös kiviteli alakja szubsztrátként glükózt tartalmaz, és a glükóz szubsztrát meghatározására szolgáló rendszer glükózoxidázból (GOD), peroxidázból (POD), pufferból és ABTS® [2,2’-azino-di(3-etil-benztiazolin-6-szulfonát)] színreagensből áll.

Egy ilyenfajta reagens esetén, a szubsztrátmeghatározó rendszer 100 ml vizes oldatára számítva, körülbelül 750-1500 egység, előnyösen 900-1200 egység glükózoxidázt (GOD) használunk körülbelül 100 egység/mg fajlagos aktivitású enzimből. A megfelelő mennyiségek szintén körülbelül 100 .egység/mg aktivitású peroxidáz esetében: 10—150, előnyösen 80-120 egység/lOOml használatra kész reagensoldat. A megfelelő koncentrációk ABTS-re: 75—150, előnyösen 90—120 mg/100 ml. Pufferként 6,5-7,5 pH-jú, előnyösen 6,8-7,2 pH-jú pufferok jönnek számításba. A koncentráció célszerűen 50 és 200, előnyösen 80-120 mmól/liter közötti. Pufferként nátrium-foszfát puffer [Na₂HP04/NaH₂P0₄] az előnyös. Más alkalmas pufferokra példák: foszfát/trisz puffer, citromsav/trisz puffer, borkősav/trisz puffer és maleinsav/trisz puffer. A koncentrációra és a pH-értékre a fent megadottak érvényesek.

Az előzőekben leírt módon összeállított reagens esetén a glükóztartalom célszerűen 0,01—0,05, előnyösen 0,02-0,04 mg/100 ml oldat.

Egy glükózmeghatározásra szolgáló, találmány szerinti további előnyös reagens esetében a szubsztrát meghatározására szolgáló rendszer GOD és POD mellett színképző komponensekként 4-amino-fenazont (PAP) és fenolt tartalmaz. Ebben az esetben a használatra kész reagensoldatba 100 ml-enként 3000-5000 egység, előnyösen 3800-4200 egység GOD-t, 50—240 egység, előnyösen 160—200 egység POD-t, valamint 10-20 mg, előnyösen 13-17 mg PAP-t és 120-240 mg, előnyösen 160—200 mg fenolt adunk. Ebben az esetben pufferként a fentebb megadott pH-tartományon belüli kálium-foszfát puffer előnyös. A koncentrációnak célszerűen 150 és 250 mmól/liter, előnyösen 180—220 mmól/liter között kell lennie. Ez a reagens célszerűen 0,05-0,25 mg, előnyösen 0,1-03 mg glükózt tartalmaz 100 ml oldatban.

A fenti adatok az oldott reagensre vonatkoznak. Hasonló módon azonosak a 100 ml oldat készítéséhez szükséges szárazreagensben lévő mennyiségek.

Egy további előnyös reagens szubsztrátként húgysavat tartalmaz, és az ezen szubsztrát meghatározására szolgáló rendszer urikázból, POD-ból, színképzőből és pufferból áll. Színképzőként 2,4-diklór-fenol és 4-amino-antipirin előnyösek.

Egy ilyenfajta reagens célszerű kiviteli formájában 35-45 egység, előnyösen 38—42 egység urikázt tartalmaz 100 ml használatra kész oldatban körülbelül 9 egység/mg fajlagos aktivitású anyagból. A POD mennyisége körülbelül 100 egység/mg fajlagos aktivitású anyagból célszerűen 30—40 egység, előnyösen 33-37 egység 100 ml oldatban. A 2,4-diklór-fenoIt, amelyet alkálifémsóként, ammóniumsóként vagy aminnal képzett sóként, előnyösen etil-ammóniumsóként alkalmazunk, célszerűen 150—200 mg, előnyösen 165—180 mg közötti mennyiségben — az etil-ammóniumsóra vonatkoztatva - adjuk 100 ml oldathoz. Ezek a mennyiségi adatok természetesen változnak a kation fajtájától függően. A 4-amino-antipirint (4-amino-fenazon) célszerűen 150—250 mg, előnyösen 180-220 mg közötti mennyiségben adjuk 100 ml reagenshez.

A pufferanyagnak 8,5-9,5 pH-tartományban, előnyösen 8,7—93 pH-tartományban kell pufferolnia. A koncentráció célszerűen 100—200 mmól/liter, előnyösen 130-180 mmól/liter. Előnyös a trisz/citrát puffer, más jól alkalmazható pufferok a trisz/borkősav és a trisz/maleinsav puffer.

Ennél a reagensnél a húgysavadalék célszerűen 0,05 és 0,25 mg, előnyösen 0,1-0,2 mg 100 ml-enként, a lítium- vagy a nátriumsóra számítva.

A találmány szerinti egyik további előnyös reagens szubsztrátként koleszterint tartalmaz, és az ezen szubsztrát meghatározására szolgáló rendszer koleszterin-észterázból, koleszterin-oxidázból, POD-ból és színképzőből valamint pufferanyagból áll.

-2181089

Színképzőként különösen 4-amino-antipirin és fenol keveréke alkalmas.

Az egyik célszerű kiviteli alakjában ez a reagens lOOml-enként 15—25 egység, előnyösen 17-23 egység körülbelül 20 egység/mg fajlagos aktivitású 5 koleszterin-észterázt, 20-30 egység, előnyösen 22-28 egység körülbelül 25 egység/mg fajlagos aktivitású koleszterin-oxidázt, 50-200 egység, előnyösen 130-180 egység körülbelül 100 egység/mg aktivitású POD-t, 15-25 mg, előnyösen 17—23 mg 10

4-amino-antipirint és 40—60 mg, előnyösen 45— -55 mg fenolt tartalmaz. Pufferként valamilyen alkalmas 7-8,5 pH-jú, előnyösen 7,8-8,2 ρΗ-jú pufferanyagot használunk 150 és 250 mmól/liter, előnyösen 180-220 mmól/liter koncentrációban. Kü- 15 lönösen alkalmas a kálium-foszfát puffer, de más pufferanyagok is megfelelők, amelyek a megadott tartományban pufferolnak. Egy ilyenfajta reagens koleszterin-tartalma célszerűen 0,20-0,60 mg, előnyösen 0,30-0,50 mg 100 ml reagensoldatban illetve 20 ilyen reagensoldat készítésére alkalmas szárazreagens-mennyiségben.

Magától értetődik, hogy a fentebb megadott előnyös, találmány szerinti reagens-adalék mennyiségek csak az egyes enzimekre megadott fajlagos aktivitású 25 enzimekre vonatkoznak, és helyettesíthetők más aktivitású termékekkel.

Látható, hogy a találmány szerint az enzimszubsztrátok enzimatikus meghatározásainál fellépő zavaró reakciók kiküszöbölhetők. Ez lehetővé teszi, ₃₀hogy kevésbé tiszta reagenseket használjunk, meghosszabbítja azon reagensek eltarthatóságát, amelyeknél a tárolás során zavaró anyagok keletkeznek, és növeli a meghatározások pontosságát.

A következő példák a találmányt részletesebben szemléltetik.

1. példa

Reagens glükóz ABTS-módszer szerinti meghatározására.

Nátrium-foszfát puffer, pH 7,0

Glükózoxidáz (kb. 100 E/mg) Peroxidáz (kb, 100 E/mg) ABTS*

Glükóz

100 mmól/liter,

1000 E/100 ml,

E/100 ml,

100 mg/100 ml,

0,05 mg/100 ml.

3. példa

Reagens koleszterin meghatározására.

Kálium-foszfát puffer,
pH 7,9	200 mmól/liter,
Koleszterin-észteráz
(kb. 20 E/mg)	22 E/100 ml,
Koleszterin-oxidáz
(kb. 25 E/mg)	24 E/10Ö ml,
Peroxidáz (kb. 100 E/mg)	150 E/100 ml,
4-Amino-antipirin	21 mg/100 ml,
Fenol	47 mg/100 ml,
Koleszterin	0,4 mg/100 ml.

4. példa

Reagens húgysavmeghatározáshoz.

Trisz/acetát puffer, pH 9,1	150 mmól/liter,
Urikáz (kb. 9 E/mg)	39 E/100 ml,
Peroxidáz (kb. 100 E/mg)	36 E/100 ml,
2₎4-Diklór-fenol-(etil-
-ammónium)-só	170 mg/100 ml,
4-Amino-antipirin	190 mg/100 ml,
Húgysav (lítium- vagy
nátrium-só)	0,16 mg/100 ml.

példa összehasonlító glükózmeghatározás.

A glükózmeghatározás találmány szerinti javított 35 pontosságának bemutatására a következőképpen járunk el:

Két reagensoldatot (A és B) készítünk 1. példa szerinti reagens szükséges mennyiségű vízben való feloldásával. Az (A) oldat esetében azonban a 4θ glükóz-adalékot elhagyjuk. A meghatározáshoz 50-től 400 mg/100 ml-ig emelkedő koncentrációjú glükóz-standardsorozatot valamint humán-szérum standard-sorozatot készítünk.

Meghatározási körülmények: Hullámhossz: Hg 436 nm. Küvetta: 1 cm rétegvastagság. Inkubációs hőmérséklet: 20-25 °C.

*2,2’-azino-di(3-etil-benztiazolin-6-szulfonsav)-diammóniumsó.

2. példa

Reagens glükóz GOD-PAP módszer szerinti meg határozására.

Kálium-foszfát puffer, pH 7,1

Glükózoxidáz GOD;

kb. 100 E/mg) Peroxidáz (POD; kb. 100 PAP (4-amino-fenazon) Fenol

Glükóz

205 mmól/liter,

4100 E/100 ml, E/mg) 190 E/100 ml, mg/100 ml, 200 mg/100 ml, 0,2 mg/100 ml.

A mérés vakpróbával szemben történik kereskedelmi forgalomban lévő fotométerben. A küvettákba a következő oldatokat pipettázzuk:

	Vakpróba	Standard	Minta
Deszt. víz	0,1 ml	-	-
Hígított standardoldat	—	0,1 ml	—
Fehérjementesített minta	—	—	0,1 ml
Tesztreagens	5,0 ml	5,0 ml	5,0 ml

-3181089

Keverés után 20—25 °C-on inkubáljuk, majd 25-50 perc múlva mérjük a minta extinkcióját (E minta) és a standard extinkcióját (E_standard) ^a vakpróbával szemben.

A mintában lévő glükózkoncentráció számítása: Eminta c = 100 X ---------[mg/100 ml]

Estandard

Mérési eredmények:

Glükóz standard-sorozat (50—400 mg/100 ml)

Glükózkoncentráció	Extinkció a reagensekben
A	B
50 mg/100 ml	—	0,095
100 mg/100 ml	0,060	0,170
200 mg/100 ml	0,236	0,353
300 mg/100 ml	0,400	0,533
400 mg/100 ml	0,577	0,700

A fenti mérési eredményeket a mellékelt ábrán grafikusan ábrázoljuk. Az A oldatra kapott görbe azt mutatja, hogy a 70 mg/100 ml glükózkoncentráció alatt a mintafolyadékok nem mérhetők, mivel 5 nincs extinkció, azaz nem történik színképződés. Az általánosan szokásos egypont-standard (például 100 mg glükóz/100 ml) használatakor a 70 és 100 mg/100 ml közötti glükózkoncentrációjú mintákra túl alacsony, a 100 mg/100 ml glükóztar10 talom feletti mintákra túl magas értéket kapunk a tényleges tartalomhoz képest. Csak az olyan mintakoncentrációkra kapunk korrekt mérési értékeket, amelyek pontosan megfelelnek a standard koncentrációjának. A találmány szerinti B reagens ezzel 15 szemben végig helyes értékeket szolgáltat.

A humán-szérum mintákkal a fent leírt módon kaptunk eredményeket, míg összehasonlításhoz a 20 hexokináz-módszer (standard-módszer) szerint kapott értékeket határoztuk meg. Az eredményeket a következő táblázat mutatja.

	HK/G6P-DH (standard-módszer)	A reagens	B reagens
1. szérum	53 mg/100 ml	nincs mérési érték	51 mg/100 ml
2. szérum	84 mg/100 ml	55 mg/100 ml	83,5 mg/100 ml
3. szérum	135 mg/100 ml	213 mg/100 ml	135 mg/100 ml

Szabadalmi igénypontok:

Claims

Szabadalmi igénypontok:

1. Reagens enzimszubsztrát enzimatikus meghatározására, amely a szubsztrát meghatározására szolgáló olyan rendszert tartalmaz, amely legalább egy enzimből, legalább egy pufferanyagból és legalább egy indikátoranyagból, valamint adott esetben segédanyagokból áll, azzal jellemezve, hogy a fentieken kívül ezen szubsztrát meghatározására szolgáló rendszer szubsztrátmeghatározó kapacitásánál kevesebb, meghatározott mennyiségű szubsztrátot is tartalmaz.
2. Az 1. igénypont szerinti reagens kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy szubsztrátként glükózt tartalmaz, és a szubsztrát meghatározására szolgáló rendszer glükózoxidázból, peroxidázból, 2,2’-azino-di(3-etil-benztiazolin-6-szulfonát)-ból és pufferból áll.
3. Az 1. igénypont szerinti reagens kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy szubsztrátként húgysavat tartalmaz, és a szubsztrát meghatározására szolgáló rendszer urikázból, peroxidázból, 2,4-diklór-fenolátból, 4-amino-antipirinből és pufferból áll.
4. Az 1. igénypont szerinti reagens kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy szubsztrátként koleszterint tartalmaz, és a szubsztrát meghatározására szolgáló rendszer koleszterin-észterázból, koleszterin-oxidázból, peroxidázból, 4-amino-antipirinből, fenolból és pufferból áll.
5. Az 1. igénypont szerinti reagens kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy szubsztrátként glükózt tartalmaz, és a szubsztrát meghatározására szolgáló rendszer glükózoxidázból, peroxidázból, 4-amino-fenazonból, fenolból és pufferból áll.
6. Eljárás enzimszubsztrát olyan zavaró anyagok jelenlétében való enzimatikus meghatározására, amelyek a szubsztráttal magával vagy az indikátorreakció egy köztitermékével vagy végtermékével reagálhatnak, azzal jellemezve, hogy a vizsgálandó minta hozzáadása előtt először a szubsztrát meghatározott, a reagens szubsztrát meghatározó kapacitásánál kisebb mennyiségét reagáltatjuk a reagenssel, amíg elreagál, és csak utána adjuk hozzá a meghatározandó mintát.