CS244665B2

CS244665B2 - Method of enzymatic determination of enzyme substrates

Info

Publication number: CS244665B2
Application number: CS817834A
Authority: CS
Inventors: Peter Scheibe; Erich Bernt; Sigmar Klose
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1979-04-04
Filing date: 1980-04-03
Publication date: 1986-08-14
Also published as: CS228127B2; EP0016947B1; ATE4126T1; AU5677980A; HU181089B; JPS55135599A; CA1152871A; DD150256A5; DE2913553C2; FI70727B; YU91780A; DE2913553B1; AU515851B2; FI70727C; FI801025A; YU44100B; US4517287A; EP0016947A1; DE3064075D1; CS783481A2

Description

Způsob enzymatického stanovení enzymových substrátů v přítomnosti rušivých látek, ’ reagujících se samotným substrátem nebo s meziproduktem nebo konečným produktem indikátorové reakce spočívá v tom, že před přidáním vzorku, který se má zkoumat, se nejprve nechá reagovat s reakčním,činidlem enzymový substrát, například glukóza, kysleina močová nebo cholesterol, a teprve pak po jeho zreagování se přidá vzorek, který se má stanovit;.

Vynález se týká způsobu enzymatického stanovení enzymového substrátu v přítomnosti rušivých látek, které mohou reagovat se samotným substrátem nebo s meziproduktem nebo konečným produktem indikátorové reakce.

Enzymatická stanovení enzymových substrátů, jako je například glukóza, kyselina močová, cholesterol, jsou často rušena tím, že látky obsažené v reagenčních činidlech, například , redukující nebo oxidující látky, reagují s meziprodukty nebo výslednými produkty testovací soustavy. Tato rušivá vedlejší reakce může probíhat čistě chemicky nebo rušivý vliv může spočívat v blokování enzymu, ve vstupu v enzymatickou reakci jakožto konkurenční substrát apod. V každém případě se sníží koncentrace vlastního indikátorového produktu, který se stanoví, při kvantitativních zejména fotometrických stanoveních, tedy například vzniklého barviva. Úměrný vztah, podstatný pro správnost postupu, mezi koncentrací substrátu, který se má dokázat, a koncentrací měřeného indikátorového produktu se tímto způsobem poruší. Opět zjištění substrátu, který má dokázat, se tím odchýlí od 100 %. Jinými slovy, získají se chybné výsledky.

Úkolem vynálezu je tento problém odstranit a poskytnout způsob pro enzymatické stanovení enzymového substrátu v přítomnosti rušivých látek, kterýžto způsob ský.tá správné výsledky a odstraňuje výše uvedené obtíže.

Podle vynálezu se tento úkol řeší způsobem enzymatického stanovení enzymového substrátu v přítomnosti látek, reagujících se samotným substrátem nebo s meziproduktem nebo konečným produktem indikátorové reakce, kterýžto způsob se vyznačuje tím, že před přidáním vzorku, který se má zkoumat, se nejprve nechá reagovat s .reagěnčním činidlem enzymový substrát, například glukóza, kyselina močová neboccholesterol, a teprve po jeho zreagování se přidá vzorek, který se má stanovit.

Přidáním určitého množství substrátu, které je vždy zřetelně menší než odpovídá schopnosti analyzační soustavy pro stanovení substrátu, se zahájí předběžná reakce, která probíhá tak dlouho, až se veškerý přidaný substrát spotřebuje. V rámci této předběžné reakce se úplně spotřebují i rušivé látky. Jakmile je tato reakce skončena, přidá se vlastní vzorek, který se má zkoumat, s neznámým obsahem substrátu, který se má stanovit. Množství substrátu, který se má stanovit, je pak dáno rozdílem mezi výslednou hodnotou předběžné reakce pro stanovení reakčního produktu a výslednou hodnotou, která se získá po přidání vzorku, který se má zkoumat. Popřípadě je též možno sledovat vlastní zkoumání vzorku kineticky, tj. měřit nikoliv konečné hodnoty, nýbrž jen reakční rychlost.

Pokud jde o množství substráuu' které se má podle vynálezu přidat, nelze uvést žádné obecné údaje. Toto množství závisí na druhu soustavy pro stanovení enzymových substrátů a na množství rušivých látek, které lze v substrátu očekávat. Zpravidla se použije dostatečného nadbytku substrátu, pokud jde o rušivé látky, aby bylo s jistotou vyloučeno, že v okamžiku přidání vlastního neznámého vzorku jsou ještě přítomny nezreagované rušivé látky. Naopak se zase nebude přidávat příliš mnoho substrátu, aby se_; pro vlastní reakcí vzorku nezískala příliš vysoká nulová hodnota, nepříznivě ovlivňující přesnost měřící reakce. Toto posledně uvedené hraje roli například při fotometrických měřeních barviva, vzniklého jako reakční produkt. U takových metod, spočívajících, na fotometrickém stanovení barviva vzniklého jako reakční produkt, bude přidané určité množství substrátu tak · malé, že nevzniknou ještě žádné rušivé koncentrace barviva. Toho lze v praxi v každém jednotlivém případě snadno dosáhnout, poněvadž přece takové barvivo nebo jiný indikátorový produkt vznikne teprve takovým množstvím substrátu, které převyšuje množství substrátu, potřebné pro zreagování rušivých látek. Při způsobu podle vynálezu není nutné znát druh rušivých cizích látek, často zde jde o sice redukující látky, avšak způsobem podle vynálezu se bezpečně vyřadí o oxidující nebo jiné rušivé látky.

Reagenční činidlo, jehož se používá při způsobu podle vynálezu к enzymatickému stanovení enzymových substrátů v přítomnosti rušivých látek a které je předmětem čs. patentu č. 228127 sestává z alespoň jednoho enzymu, alespoň jednoho pufru a alespoň jedné indikátorové látky jakož popřípadě i z pomocných látek a vyznačuje se tím, že obsahuje určité množství substrátu, menší než je stanovovací kapacita této soustavy ke stanovení substrátu, pro stanovení tohoto substrátu.

Rozpustí-li se reakční činidlo, které je v podobě suché látky, ve vodě, proběhne už reakce к odstranění rušivých látek během rozpouštění a po něm. Takto získaného roztoku lze pak použít přímo pro vlastní stanovení enzymového substrátu nebo jej lze znovu převést do podoby suchého reagenčního činidla, které je určeno к pozdějšímu opětnému rozpuštění před provedením stanovovací reakce. Je však též možné, zkoumpletovat reagenční činidlo přidáním substrátu teprve bezprostředně před jeho použitím nebo alternativně teprve dodatečně přidat látku, potřebnou pro zahájení reakce, například enzym nebo - v případě vícestupňové reakce s větším počtem enzymatických stupňů - jeden z enzymů potřebných pro reakci.

Podle jednoho výhodného provedení reagenčního činidla obsahuje toto činidlo glukózu jakožto substrát a soustava ke stanovení glukózy jakožto substrátu sestává z glukózooxidázy /GOD/, perooxidázy /POD/, p-ufru a /2,2'-azino-di-f3-etylbenzthiazolinsulfonátu-/6/J/ /ABTS/ jakožto barevné reagencie.

U takovéhoto reagenčního činidla se použije, vztaženo na 100 ml vodného roztoku soustavy ke stanovení substrátu, asi 750 až 1 500 j., s výhodou 900 až 1 200 j. glukózooxidázy o specifické aktivitě přibližně 100 j./mg. Příslušná množství peroxidázy o specifické aktivitě rovněž asi 100 j/mg činí 10 až 150 j., s výhodou 80 až 120 j./ΙΟΟ ml roztoku reagenčního činidla připraveného к použití. Příslušné koncentrace pro /2,2 -azino-di-уз-etylbenzthiazolinsulfonát-/6/J/ činí 75 až 150 mg, s výhodou 90 až 120 mg/100 ml. Jako pufr přichází v úvahu pufr o pH v rozmezí 6,5 až 7,5, s výhodou 6,8 až 7,2. Koncentrace je účelně v rozmezí 50 až 200 mmolů, s výhodou 80 až 120 mmolů/litr. Výhodným pufrem je pufr na bázi fosforečnanu sodného /Иа₂НРО^/МаН2РОд/. Příklady jiných vhodných pufrů jsou pufr na bázi tris-fosfátu, pufr na bázi tris-kyseliny citrónové, tris-kyseliny vinné a tris-kyseliny maleinové. Pro koncentraci a hodnotu pH platí tytéž údaje, jak byly výše uvedeny.

U jednoho reagenčního činidla výše popsaného složení je obsah glukózy účelně v rozmezí 0,01 až 0,05 mg, s výhodou 0,02 až 0,04 mg/100 ml roztoku.

U jiného výhodného reagenčního činidla ke stanovení obsahu glukózy obsahuje soustava ke stanovení substrátu, kromě glukózy a peroxidázy 4-aminofenazon /РАР/ a fenol jakožto složky pro vytvoření barviva. V tomto případe se použije na 100 ml roztoku reagenčního činidla, připraveného к použití, 3 000 až 5 000 j. glukózooxidázy, s výhodou 3 800 až 4 200 j/100 ml, 50 až 240 j. peroxidázy, s výhodou 160 až 200 j./ΙΟΟ ml roztoku, jakož i 10 až 20 mg 4-aminofenazonu, s výhodou 13 až 17 mg/100 ml a 120 až 240 mg fenolu, s výhodou 160 až 200 mg/100 ml. Jakožto pufru se v tomto případě použije s výhodou pufru na bázi fosforečnanu draselného o pH ve výše uvedeném rozmezí. Koncentrace by měla být účelně v rozmezí od 150 do 250 mmolů, s výhodou od 180 do 220 mmolů/litr. U tohoto reagenčního činidla je obsah glukózy účelně v rozmezí 0,05 až 0,25 mg, s výhodou 0,1 až 0,2 mg/100 ml roztoku.

Výše uvedné údaje se vztahují na rozpuštěné reagenční ěinidlo. Platí stejně pro takové množství reagenčního činidla v podobě suché látky, které je určeno pro přípravu 100 ml roztoku

Další výhodné reakční činidlo obsahuje jako substrát kyselinu močovou a soustava ke stanovení tohoto substrátu sestává z urikázy, peroxidázy, látky vytvářející barvivo a pufru. Jako látky vytvářející barvivo se s výhodou používá směsi 2,4-dichlorfenolátu s 4-aminoantipyridem.

Takovéto reagenční činidlo obsahuje v účelném provedení 35 až 45 j., s výhodou 38 až 42 j. urikázy o specifické aktivitě přibližně 9 j./mg ve 100 ml roztoku připraveného k použití. Množství peroxidázy u- preparátu o aktivitě přibližně 100 j./mg je účelně v rozmezí 30 až 40 j., s výhodou 33 až 37 j./ΙΟΟ ml roztoku. Množství 2,4-dichlorfenolátu, kterého se používá v podobě alkalické soli, amoniové soli nebo aminosoli, s výhodou jako etylaminové soli, je účelně v rozmezí do 150 do 200 mg, s výhodou od 165 do 180 mg/100 ml, vztaženo na etylamoniovou sůl. Tyto údaje o množstvích se samozřejmě mění podle povahy kationtu. 4-aminoantipyrinu se účelně používá v množství od 150 do 250 mg, s výhodou od 180 do 220 mg/ /100 ml reagenčního činidla.

Pufrovací látka má udržovat hodnotu pH v rozmezí od 8,5 do 9,5, s výhodou od 8,7 do 9,3. Koncentrace pufru je účleně v rozmezí 100 až 200 mmolů, s výhodou 130 až 180 mmolů/litr. Výhodným je pufr na bázi tris-citrátu, jinými vhodnými pufrovacími látkami jsou pufr na bázi trls-kyseliny vinné a tris-kyseliny maleinové.

U tohoto reagenčního činidla činí přídavek kyseliny močové účelně od 0,05 do 0,25 mg s výhodou od 0,1 do 0,2 mg/100 ml, vztaženo na litnou nebo sodnou sůl.

Ještě jiné výhodné reagenční činidlo, používané při způsobu podle vynálezu, obsahuje cholesterol jakožto substrát a soustava ke stanovení tohoto substrátu sestává z cholesterolesterázy, choleteroloxidázy, peroxidázy a látky vytvářející barvivo jakožto i z pufru. Jako látka vytvářející barvivo je vhodná zejména směs 4-aminoantipyrinu s fenolem.

Při účelném provedení obsahuje toto reagenční činidlo 15 až 25 j., s výhodou 17 až 23 j. cholesterolesterázy o specifické aktivitě přibližně 20 j./mg na 100 ml roztoku reagenčního činidla, 20 až 30 j., s výhodou 22 až 28 j. cholesteroloxidázy o specifické aktivitě přibližně 25 j./mg na 100 ml roztoku, 50 až 200 j., s výhodou 130 až 180 j. peroxidázy o specifické aktivitě přibližně 100 j./mg na 100 ml roztoku, 15 až 25 mg, s výhodou 17 až 23 mg 4-aminoantipyrinu na 100 ml roztoku reagenčního činidla a 40 až 60 mg, s výhodou 45 až 55 mg fenolu na 100 ml roztoku reagenčního činidla. Jako pufru se použije vhodné pufrovací látky o pH v rozmezí 7 až 8-, 5, s výhodou 7,8 až 8,2, v koncentraci v rozmezí od 150 do 250 mmolů, s výhodou od 180 až do 220 mmolů/litr. Obvzláště vhodný je pufr na bázi fosforečnanu draselného, vhodné jsou však i jiné pufrovací látky, které jsou schopny udržovat pH v uvedeném rozmezí hodnot. Obsah cholesterolu v takovémto reagenčním činidle je účelně v rozmezí od 0,20 do 0,60 mg, s výhodou od 0,30 do 0,50 mg na 100 ml roztoku reagenčního činidla, popřípadě na takové množství reagenčního činidla v podobě suché látky, kterého je zapotřebí; pro .přípravu takovéhoto množství roztoku reagenčního činidla.

Je samozřejmé, že množství enzymů, uvedená pro výše popsaná výhodná složení reagenčního činidla používaného při způsobu podle vynálezu, platí pouze pro enzymy uvedených specifických aktivit a mohou být nahrazena preparáty jiné aktivity.

Jak je z uvedeného zřejmé, je možno způsobem podle vynálezu odstranit vliv rušivých reakcí při enzymatickém stanovení enzymových substrátů. To umožňuje použití méně čistých reagencií, prodloužit skladovatelnost reagencií, u nichž vznikají rušivé látky teprve během skladování, a zvýšit přesnost stanovení.

Dále uvedené příklady vynález .blíže objasňují.

Příklad 1

Reagenční činidlo pro stanovení glukózy způsobem používajícím kyselinu 2,2'-azino-di-^|3-eeylbenzthiazolⁱnsu^lfonovou-/6/J pufr na bázi fosforečnanu sodného, pH 7,0 100 mmolů/litr glukózooxidáza o specifické aktivitě přibližně 100 j./mg 1 000 j./ΙΟΟ ml

peroxidáza o specifické aktivitě přibližně 100 j./mg diamoniová sůl kysleiny 2,2'-azinodi-\|'3-etylbenz-	80 j./1ОО ml
thiazolinsulfonové-/6/J glukóza	100 mg/ml 0,05 mg/100 ml

Příklad 2

Reagenční činidlo pro stanovení glukózy způsobem používajícím glukozidázu a

4-aminofenazon pufr na bázi fosforečnanu draselného o pH 7,1 glukózooxidáza o specifické aktivitě přibližně 100 j./mg peroxidáza o specifické aktivitě přibližně 100 j./mg 4-aminofenazon fenol glukóza

Pří k. lad 3

Reagenční činidlo pro stanovení cholesterolu pufr na bázi fosforečnanu draselného o pH 7,9 cholesterolesteráza o specifické aktivitě přibližně 20 j./mg cholesteroloxidáza o specifické aktivitě přibližně 25 j./mg peroxidáza o specifické aktivitě přibližně 100 j./mg 4-aminoantipyrin fenol cholesterol

Příklad 4

Reagenční činidlo pro stanovení kyseliny močové pufr na bázi tris-citrátu o pH 9,1 urikáza o specifické aktivitě přibližně 9 j./mg peroxidáza o specifické aktivitě přibližně 100 j./mg etylamoniová sůl 2,4-dichlorfenolátu 4-aminoantipyrin kyselina močová /lithná nebo sodná sůl/

205	mmolů/litr
4 100	j./lOO	ml
190	j./lOO	ml
17	mg/100	ml
200	mg/100	ml

0,2 mg/100 ml

200	mmolů/litr
22	j./100	ml
24	j./lOO	ml
150	j./lOO	ml
21	mg/100	ml
47	mg/100	ml

0,4 mg/100 ml

150	mmolů/litr
39	j./lOO	ml
36	j./lOO	ml
170	mg/100	ml
190	mg/100	ml

0,16 mg/100 ml

Příklad 5

Srovnávací stanovení glukózy

Aby byla ukázána zlepšená přesnost stanovení glukózy způsobem podle vynálezu, postupuje se takto:

Rozpuštěním reagenčního činidla z příkladu 1 v potřebném množství vody se připraví dva roztoky А а В reagenčního činidla. U roztoku A se však vynechá přidání glukózy. Ke stanovení se použije glukózové standardní řady s obsahem glukózy, vzrůstajícím od 50 do 400 mg/100 ml jakož i lidského séra.

Násada pro stanovení:

vlnová délka: Hg 436 nm kyveta: tloušřka vrstvy 1 cm teplota inkubace: 20 až 25 °C

Měření se provádí komerčním fotometrem oproti slepé hodnotě. Do kyvet se napipetují tyto roztoky:

Slepá hodnota

Standard

Vzorek destilovaná voda 0,1 ml zředěný standardní roztok vzorek zbavený bílkovin testovací reagenční činidlo 5,0 ml /А/В/

0,1 ml

5,0 ml

0,1 ml

5,0 ml které se promísí a inkubují při teplotě v rozmezí 20 až 25 °C. Po 25 až 50 minutách se měří extinkce vzorku /^Evzorku/ ^a extinkce standardu /^Estanj_arj_u/ oproti slepé hodnotě.

Výpočet koncentrace glukózy ve vzorku se provádí podle vztahu:

vzorku

С = 100 X ;-------— — standardu /mg/100 ml/

Výsledky měření:

Glukózová standardní řada /50 až 400 ing/100 ml/

Koncentrace glukózy	Extinkce v reakčním činidle
A	В
50 mg/100 ml	-	0,095
100 mg/100 ml	0,060	0,170
200 mg/100 ml	0,236	0,353
300 mg/100 ml	0,400	0,533
400 mg/100 ml	0,577	0,700

Výše uvedené výsledky měření jsou graficky znázorněny na přiloženém výkresu. Křivka _1 pro reakční činidlo A ukazuje, že kapalné vzorky s obsahem glukózy pod přibližně 70 mg/ /100 ml se neměří, poněvadž nedochází к extinkci, tj. ke vzniku barvy. Při použití obvyklého jednobodového standardu například 100 mg glukózy/100 ml se vzorky o koncentraci glukózy od 70 do 100 mg/100 ml vyhodnotí' jako niéší než je skutečný obsah glukózy, vzorky o obsahu glukózy nad 100 mg/100 ml jako vyšší než je skutečný obsah glukózy. Jenom vzorky s koncentracemi, které přesně odpovídají koncentraci standardu, skýtají korektní výsledky při měření. Naproti tomu křivka 2 odpovídající reakčnímu činidlu B, použitému při způsobu podle vynálezu, skýtá průběžně správné výsledky při měření.

Testy se vzorky lidského séra se provedou výše popsaným způsobem, přičemž pro srovnání jsou určeny hodnoty, získané hexokinázovou metodou^což je standardní metoda. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:

HK/G6P-DH /standardní metoda/

Reakční činidlo A

Reakční činidlo В

sérum	1	53	mg/100	ml	nenaměřena žádná	51 mg/100 ml
					hodnota
sérum	2	84	mg/100	ml	55 mg/100 ml	'83,5 mg/100 ml
sérum	3	135	mg/100	ml	213 mg/100 ml	135 mg/100 ml

PŘEDMĚT

Claims

E Z

Způsob enzymatického stanovení enzymového substrátu v přítomnosti rušivých látek, reagujících se samotným substrátem nebo s meziproduktem nebo konečným produktem indikátorové reakce, vyznačující se tím, že před přidáním vzorku, který se má zkoumat, se nejprve nechá reagovat s reakčním činidlem enzymový substrát, například glukóza, kyselina močová nebo cholesterol, a teprve po jeho zreagování se přidá vzorek, který se má stanovit.

1 výkres