HRP970566A2

HRP970566A2 - Conjugates useful in the treatment of prostate canser

Info

Publication number: HRP970566A2
Application number: HR9718160.6A
Authority: HR
Inventors: Jones Deborah Defeo
Original assignee: Jones Deborah Defeo
Priority date: 1996-10-30
Filing date: 1997-10-24
Publication date: 1998-08-31
Also published as: DZ2333A1; ATE239509T1; CA2268738A1; ES2196374T3; JP2000509407A; PE17399A1; TW425286B; IS5025A; EP0942754A2; ID21358A; EE03858B1; CO4930281A1; WO1998018493A3; EA199900428A1; NO992069L; BR9712589A; KR20000052970A; PL333004A1; KR100508199B1; CZ155599A3

Description

Stanje tehnike

Očekuje se da će se u 1994. godini karcinom prostate dijagnosticirati kod 200,000 muškaraca u SAD-u, a 38,000 Amerikanaca umrijet će od ove bolesti (Garnick, M.B. (1994). The Dilemmas of Prostate Cancer. Scientific American, travanj: 72-81). Stoga je karcinom prostate najčešće dijagnosticirana zloćudna bolest (izuzev zloćudne bolesti kože) muškaraca u SAD-u te je drugi po redu uzrok smrtnosti uzrokovane rakom (karcinom) (odmah iza raka pluća) u toj skupini.

Prostata specifični antigen (PSA) je jednolančani glikoprotein od 33 kDa koji stvara gotovo isključivo epitel ljudske prostate te se u sjemenoj tekućini čovjeka pojavljuje u razinama od 0,5 do 2,0 mg/ml (Nadji, M., Taber, S.Z., Castro, A., et al. (1981) Cancer48:1229; Papsidero, L, Kuriyama, M., Wang, M., etal. (1981). JNCI 66:37; Qui, S.D., Voung, C.V.F., Bihartz, D.L, et al. (1990), J. Urol. 144:1550; Wang, M.C., Valenzuela, L.A., Murphy, G.P., etal. (1979). Invest. Urol. 17:159). Jedna jedina ugljikohidratna jedinica vezana je za asparaginski ostatak broj 45 i čini 2 do 3 kDa ukupne molarne mase. PSA je proteaza sa specifičnošću sličnom kimotripsinu (Christensson, A., Laurell, C.B., Lilja, H. (1990). Eur. J. Biochem. 194:755-763). Pokazalo se daje PSA uglavnom odgovorna za otapanje želatinozne građe koja tijekom ejakulacije nastaje proteolizom glavnih proteina u želatini za hvatanje spermija (Sperm entrapping gel), Semenogelina l i Semenogelina II, te fibronektina (Lilja, H. (1985). J. Clin. Invest. 76:1899, Lilja, H., OIdbringJ., Rannevik, G., etal. (1987). J. Clin. Invest. 80:281; McGee, R.S., Herr, J.C. {1988). Biol. Reprod. 39:499). Proteoliža proteina koji stvaraju želatinu posredovana od PSA stvara nekoliko topljivih fragmenata Semenogelina I i Semenogelina II te topljivih fragmenata fibronektina sa rastaljivanjem ejakulata i oslobađanjem progresivno pokretljivih spermatozoida (Lilja, H., Laurell, C.B. (1984). Scand. J. Clin. Lab. Invest. 44:447; McGee, R.S., Herr, J.C. (1987). Biol. Reprod. 37:431). Nadalje, PSA može proteolitički razgraditi IGFBP-3 (inzulinu sličan protein 3 koji se veže za faktor rasta) omogućujući IGF-u da stimulira specifičan rast stanica koje luče PSA (Cohen et al., (1992) J. Clin. Endo. & . 75:1046-1053).

PSA koji je u kompleksu sa alfa 1 - antikimotripsinom je predominantni molekularni oblik serumskog PSA i može činiti i do 95% pronađenog serumskog PSA (Christensson, A., Bjork, T., Nilsson, O., etal. (1993). J.Urol. 150:100-105; Lilja, H., Christensson, A., Dahlen, U., (1991). Clin. Chem. 37:1618-1625; Stenman, U.K, Leinoveji, J., Alfthan, H., et al. (1991). Cancer Res. 51:222-226). Smatra se da tkivo prostate (normalno, benigno hiperplastično ili maligno tkivo) uglavnom otpušta zreli, enzimski aktivan oblik PSA jer je taj oblik potreban za složeno spajanje sa alfa 1-antikimotripsinom (Mast, A.E., Enghild, J.J., Pizzo, S.V., etal. (1991). Biochemistry 30:1723-1730; Perlmutter, D.H., Glover, G.I., Rivetna, M., etal. (1990). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3753-3757). Stoga se vjeruje da se u mikrookolišu stanica prostate koje luče PSA stvara i izlučuje PSA u svom zrelom, enzimski aktivnom obliku nevezan u kompleks sa bilo kojom inhibitornom molekulom. PSA također stvara stabilne komplekse sa alfa 2-makroglobulinom, no budući da to dovodi do inkapsuliranja PSA i potpunog gubitka PSA epitopa, in vivo značenje stvaranja ovog kompleksa je nejasno. Slobodan PSA oblik koji nije vezan ni u kakav složeniji oblik (kompleks) čini manji dio (frakciju) serumskog PSA (Christensson, A., Bjork, T., Nilsson, O., etal. (1993). J.Urol. 150:100-105; Lilja, H., Christensson, A., Dahlen, U. (1991). Clin. Chem. 37:1618-1625), no još uvijek nije poznato može li slobodan oblik serumskog PSA biti zimogen; interno cijepan, neaktivni oblik zrelog PSA; ili PSA koji pokazuje enzimsku aktivnost. Međutim, čini se malo vjerojatnim da slobodan oblik serumskog PSA pokazuje enzimsku aktivnost zato što postoji značajan (100 do 1000- struki) molarni višak nereagiranog i alfa l - antikimotripsina i alfa 2-makroglobulina u serumu, u usporedbi sa pronađenim serumskim razinama slobodnog 33 kDa oblika PSA (Christensson, A.f Bjork, T., Nilsson, O., etal. (1993). J.Urol. 150:100-105; Lilja, H.;-Christensson, A., Dahlen, U., (1991). Clin. Chem. 37:1618-1625).

Serumska mjerenja PSA korisna su za praćenje liječenja adenokarcinoma prostate (Duffy, M.S. (1989). Ann. Clin. Biochem. 26:379-387; Bravver, M.K. i Lange, P.H. (1989). Urol. Suppl. 5:11-16; Hara, M. i Kimura, H. (1989). J. Lab. Clin. Med. 113:541-548), iako su gore spomenute normalne serumske koncentracije PSA primjećene i kod benigne hiperplazije prostate i naknadne kirurške traume prostate (Lilja, H., Christensson, A., Dahlen, U. (1991). Clin. Chem. 37:1618-1625). Također je poznato i da metastaze prostate luče imunološki reaktivan PSA jer se serumski PSA može otkriti u visokim razinama kod prostatektomiziranih pacijenata ukazujući na metastatski prošireni karcinom prostate (Ford, T.F., Butcher, D.N., Masters, R.W., etal. (1985). Brit. J. Urology 57:50-55). Stoga, citotoksični spoj koji bi mogao biti aktiviran proteolitičkom aktivnošću PSA trebao bi biti specifičan za stanice prostate kao i za metastaze prostate koje luče PSA.

Cilj ovog izuma je osigurati novu smjesu (composition) za protukarcinomsko djelovanje korisnu u liječenju karcinoma prostate koja sadrži oligopeptide koje slobodan prostata specifičan antigen (PSA) selektivno proteolitički cijepa te koji uključuje cikličku aminokiselinu sa hidrofilnim supstituentom, konjugiranu (svezanu) sa citotoksičnim agensom.

Drugi cilj ovog izuma je osigurati postupak za liječenje karcinoma prostate koji se sastoji u primjeni nove protukarcinomske smjese.

Sažetak izuma

Prikazani su kemijski konjugati koji sadrže oligopeptide sa nizovima aminokiselina koje slobodni prostata specifični antigen (PSA) selektivno preteolitički cijepa te koji uključuju cikličku aminokiselinu sa hidrofilnim supstituentom, te poznati citotoksični agens. Takvi konjugati korisni su u liječenju raka prostate i benigne hiperplazije prostate (BPH).

Detaljan opis izuma

Ovaj izum odnosi se na nove protukarcinomske smjese korisne u liječenju karcinoma prostate. Takve smjese sadrže oligopeptide koji su direktno kovalentno vezani ili su vezani preko kemijskog vezača (chemical linker) za citotoksicni agens. Oligopeptidi su odabrani iz oligomera koje slobodni prostata specifični antigen (PSA) selektivno prepoznaje, te su u stanju biti proteolitički cijepani enzimskom aktivnošću slobodnog prostata specifičnog antigena. Takva kombinacija oligopeptida i citotoksičnog agensa može se nazvati konjugatom.

Konjugati ovog izuma još su karakterizirani činjenicom da sadrže cikličku aminokiselinu sa hidrofilnim supstituentom kao dijelom oligopeptida te da je dotična ciklička aminokiselina ona koja pridonosi topljivosti konjugata u vodi. Primjeri ovakvih cikličkih aminokiselina uključuju, ali nisu na njih ograničeni, dijelove hidroksiliranog, polihidroksiliranog i alkoksiliranog prolina i pipekolinske kiseline.

U idealnom slučaju je citotoksična aktivnost citotoksičnog agensa uvelike smanjena ili odsutna kad je oligopeptid koji sadrži mjesto za PSA proteolitičko cijepanje direktno vezan, ili putem kemijskog vezača, za citotoksični agens te je netaknut. Također u idealnom slučaju, citotoksična aktivnost citotoksičnog agensa značajno se povećava ili se vraća na aktivnost nemodificiranog citotoksičnog agensa kod proteolitičkog cijepanja vezanog oligopeptida na mjestu cijepanja.

Nadalje, poželjno je da oligopeptid bude izabran iz onih oligopeptida koji nisu cijepani ili su cijepani u mnogo manjoj mjeri u prisutnosti ne-PSA proteolitičkih enzima, u usporedbi sa cijepanjem oligopeptida u prisutnosti slobodnog enzimski aktivnog PSA.

Zbog gore navedenih razloga, poželjno je da oligopeptidi sadrže kratak peptidni niz (sekvencu), ako je moguće sa manje od deset aminokiselina. U najpoželjnijem slučaju oligopeptid sadrži sedam ili šest aminokiselina. Budući daje poželjno da konjugat sadrži kratke aminokiselinske nizove, na topljivost konjugata može u većoj mjeri utjecati opći hidrofobni karakter komponente citotoksičnog agensa. Stoga, hidrofilni supstituenti na cikličkoj aminokiselini ovih konjugata izabrani su kako bi izjednačili ili smanjili takav hidrofobni doprinos citotoksičnog agensa.

lako nije nužno za primjenu ovog aspekta izuma, poželjan oblik ovog izuma je konjugat pri čemu su oligopeptid, kao i kemijski vezač, ako je prisutan, odvojeni od citotoksičnog agensa proteolitičkom aktivnošću slobodnog PSA i bilo kojih drugih nativnih proteolitičkih enzima prisutnih u blizini tkiva, čime se citotoksični agens ili citotoksični agens koji podupire dio jedinice oligopeptid/vezač, ali ostaje citotoksičan, uvodi u fiziološki okoliš na mjestu proteolitickog cijepanja. Farmaceutski prihvatljive soli konjugata su također uključene.

Podrazumijeva se da oligopeptid koji je konjugiran sa citotoksičnim agensom, bilo putem direktne kovalentne veze ili putem kemijskog vezača, ne mora biti oligopeptid kojeg slobodni PSA najbolje prepoznaje i koji će najvjerojatnije biti proteolitički cijepan od slobodnog PSA. Stoga će oligopeptid koji je izabran za inkorporiranje u takvu protukarcinomsku smjesu biti odabran i zahvaljujući tome da se selektivno, proteolitički cijepa pod djelovanjem slobodnog PSA, i zahvaljujući citotoksičnoj aktivnosti konjugata citotoksičnog agensa i proteolitičkog ostatka (ili, u situaciji koja se smatra idealnom, nemodificirani citotoksični agens) koji se dobiva takvim cijepanjem. Izraz "selektivan" kako se koristi u vezi sa proteolitičkim cijepanjem PSA označava veću stopu cijepanja neke oligopeptidne komponente ovog izuma od strane slobodnog PSA u odnosu na cijepanje oligopeptida koji sadrži slučajan niz aminokiselina. Stoga, oligopeptidna komponenta ovog izumaje predstavlja poželjan supstrat slobodnog PSA. Izraz "selektivan" također ukazuje na to da slobodni PSA proteolitički cijepa oligopeptid između njegove dvije specifične aminokiseline.

Slobodni prostata specifično antigen (PSA) selektivno prepoznaje oligopeptidne komponenete ovog izuma i one smogu biti proteolitički cijepane enzimskom aktivnošću slobodnog prostata specifičnog antigena. Takvi oligopeptidi sadrže oligomer izabran iz:

a) HaaXaaSerTirGln/SerSer (SEQ.ID.NO.:1);

b) HaaTirGln/SerSer (SEQ.ID.NO.:2);

c) HaaXaaLizTirGln/SerSer (SEQ.ID.NO.:3);

d) HaaXaaLizTirGln/SerSe (SEQ.ID.NO.:4);

e) HaaXaahArgTirGln/SerSer (SEQ.ID.NO.:5);

f) HaaXaahArgChaGln/SerSer (SEQ.ID.NO.:6);

g) HaaXaaSerTirGln/SerXaa (SEQ.ID.NO.:7);

h) HaaTirGln/SerXaa (SEQ.ID.NO.:8);

i) HaaXaaSerChgGln/SerXaa (SEQ.ID.NO.:9);

j) HaaChgGln/SerXaa (SEQ.ID.NO.:10);

naznačen time da je Haa ciklička aminokiselina supstituirana sa hidrofilnim dijelom, Xaa je bilo koja aminokiselina, hArg je homoarginin, Cha je cikloheksilalanin i Chg je cikloheksilglicin.

U jednom obliku ovog izuma, oligopeptid sadrži oligomer izabran iz:

a) HaaTirGln/SerSerSerLeu (SEQ.ID.NO.:11),

b) HaaXaaSerTirGln/SerAla (SEQ.ID.NO.:12),

c) AlaHaaXaaSerTirTir/Ser (SEQ.ID.NO.:13),

d) AlaAsnHaaXaaSerTirGln/Ser (SEQ.ID.NO.:14),

e) HaaXaaSerTirSln/SerSerTr (SEQ.ID.NO.:15),

f) HaaTirGln/SerSerTr (SEQ.ID.NO.:16),

g) HaaXaaSerTirGln/SerSerSer (SEQ.ID.NO.:17),

h) HaaTirGln/SerSerSer (SEQ.ID.NO.:18),

i) HaaXaaLizTirGln/SerSerSer (SEQ.ID.NO.:19),

j) HaaXaahArgTirGln/SerSerSer (SEQ.ID.NO.:20),

k) HaaXaaSerTirGln/SerSerteu (SEQ.ID.NO.:21),

l) HaaTirGln/SerSerLeu (SEQ.ID.NO.:22),

m) HaaXaaSerTirGln/SerLeu (SEQ.ID.NO.:23),

n) HaaTirGIn/SerLeu (SEQ.ID.NO.:24),

p) HaaXaaSerTirGln/SerNle (SEQ.ID.NO.:25),

q) HaaTirGIn/SerNIe (SEQ.ID.NO.:26),

r) HaaXaaSerTirGln/SerTIC (SEQ.ID.NO.:27),

s) HaaTirGln/SerTIC (SEQ.ID.NO.:28),

t) HaaXaaSerChgGln/SerLeu (SEQ.ID.NO.:29),

u) HaaChgGln/SerLeu (SEQ.ID.NO.:30),

v) HaaXaaSerChgGln/SerNle (SEQ.ID.NO.:31),

w) HaaChgGln/SerNle (SEQ.ID.NO.:32),

x) HaaXaaSerChgGln/SerTIC (SEQ.ID.NO.:33),

y) HaaChgGln/SerTIC (SEQ.ID.NO.:34),

z) hArgChgGln/SerLeu (SEQ.ID.NO.:35),

aa) hArgTirGln/SerLeu (SEQ.ID.NO.:36),

U poželjnijem obliku ovog izuma, oligopeptid sadrži oligomer koji je izabran iz:

a) 4-HipXaaSerTirGln/SerSer (SEQ.ID.NO.: 37),

b) 4-HipXaaSerTirGln/SerAla (SEQ.ID.NO.: 38),

c) Ala-4-HipXaaSerTirTir/Ser (SEQ.ID.NO.: 39),

d) AlaAsn4-HipXaaSerTirGln/Ser (SEQ.ID.NO.: 40),

e) 4-HipXaaSerTirGln/SerSerTr (SEQ.ID.NO.: 41),

f) 4-HipTirGln/SerSerTr (SEQ.ID.NO.: 42),

g) 4-HipXaaSerTirGln/SerSerSer (SEQ.ID.NO.: 43),

h) 4-HipTirGln/SerSerSer (SEQ.ID.NO.: 44),

i) 4-HipXaaLizTirGln/SerSerSer (SEQ.ID.NO.: 45),

j) 4-HipXaahArgTirGln/SerSerSer (SEQ.ID.NO.: 46),

k) 4-HipXaaSerTirGln/SerSerLeu (SEQ.ID.NO.: 47);

l) 4-HipTirGln/SerSerLeu (SEQ.ID.NO.: 48);

m) 4-HipXaaSerTirGln/SerLeu (SEQ.ID.NO.: 49);

n) 4-HipTirGln/SerLeu (SEQ.ID.NO.: 50);

p) 4-HipXaaSerTirGln/SerNle (SEQ.ID.NO.: 51);

q) 4-HipTirGln/SerNle (SEQ.ID.NO.: 52);

r) 4-HipXaaSerTirGln/SerTIC (SEQ.ID.NO.: 53);

s) 4-HipTirGln/SerTIC (SEQ.ID.NO.: 54);

t) 4-HipXaaSerChgGln/SerLeu (SEQ.ID.NO.: 55);

u) 4-HipChgGln/SerLeu (SEQ.ID.NO.: 56);

v) 4-HipXaaSerChgGln/SerNle (SEQ.ID.NO.: 57);

w) 4-HipChgGln/SerNle (SEQ.ID.NO.: 58);

x) 4-HipXaaSerChgGln/SerTIC (SEQ.ID.NO.: 59);

y) 4-HipChgGln/SerTIC (SEQ.ID.NO.: 60);

naznačen time daje 4-Hip 4-hidroksiprolin, Xaa je bilo koja aminokiselina, hArg je homoarginin, Cha je cikloheksilalanin i Chgje cikloheksilglicin.

Po mogućnosti Xaa je u poželjnijem obliku izabran iz , Ser i Ne.

Izraz "oligomeri koji sadrže niz aminokiselina" kao što je navedeno gore i u Detaljnom opisu izuma, odnosi se na oligomere s oko 3 do oko 100 ostataka aminokiselina koji uključuju u svoj niz aminokiselina opisani specifični niz aminokiselina i koji se stoga proteolitički cijepaju unutar niza aminokiselina opisanih pomoću slobodnog PSA. Poželjno je da oligomer sadrži 5 do 10 ostataka aminokiselina. Tako, na primjer, oligomer:

hArgSer4-HipChgGln/SerLeu (SEQ.ID.NO.: 61);

sadrži niz aminokiselina:

4-HipChgGln/SerLeu (SEQ.ID.NO.: 56);

te bi stoga bio obuhvaćen ovim izumom.

Prosječni stručnjak za područje kemije peptida odmah će uočiti da se neke aminokiseline u biološki aktivnom oligopeptidu mogu zamijeniti drugim homolognim, izosteričnim i/ili izoelektroničkim aminokiselinama pri čemu je biološka aktivnost izvornog oligopeptida sačuvana u modificiranom oligopeptidu. Neke umjetne i modificirane prirodne aminokiseline mogu se također koristiti za zamjenu odgovarajućih prirodnih aminokiselina u oligopeptidima ovog izuma. Tako se, na primjer, tirozin može zamijeniti s 3-jodtirozinom, 2-meti Iti razinom, 3-fluortirozinom, 3-metiltirozinom i slično. Nadalje, lizin se može zamijeniti s N'-(2-imidazolil)lizinom i slično. Slijedi popis zamjenskih aminokiselina, čija je svrha da bude ilustrativan, a ne ograničavajući:

Izvorna aminokiselina Zamjenska aminokiselina/e

Gli

Arg Liz, Ornitin

Asn Gln

Asp Glu

Glu Asp

Gln Asn

Ile Val, Leu, Met, Nle

Leu Ile, Val, Met, Nle

Liz Arg, Ornitin

Met Leu, Ile, Nle, Val

Ornitin Liz, Arg

Fe Tir, Trp

Ser Tr

Tr Ser

Trp Fe, Tir

Tir Fe, Trp

Val Leu, Ile, Met Nle

Tako se, na primjer, sljedeći oligopeptidi mogu sintetizirati pomoću tehnika dobro poznatih prosječnim stručnjacima za ovo područje i za očekivati je da se proteolitički cijepaju pomoću slobodnog PSA kada postanu dijelom konjugata ovog izuma:

Asn4-HiplleSerTirGln/Ser (SEQ.ID.NO.: 62)

Asn4-HipValSerTirGln/Ser (SEQ.ID.NO.: 63)

4-HipAlaSerTirGln/SerSer (SEQ.ID.NO.: 64)

(3,4-dihidroksiprolin)AlaSerTirGln/SerSer (SEQ.ID.NO.: 65)

3-hidroksiprolinSerChgGln/Ser (SEQ.ID.NO.: 66)

4-HipAlaSerChgGln/SerSer (SEQ.ID.NO.: 67).

Uvrštavanje simbola 7' u niz aminokiselina označava točku unutar niza gdje slobodni PSA proteolitički cijepa oligopeptid.

Spojevi ovog izuma mogu imati asimetrične centre i pojavljuju se kao racemati, racemičke smjese i kao pojedinačni diastereomeri, sa svim mogućim izomerima, uključujući optičke izomere, koji su uključeni u ovaj izum. Ako nije drugačije napomenuto, podrazumijeva se da navedene aminokiseline imaju prirodnu "L" stereokonfiguraciju.

Sljedeće kratice koriste se u specifikacijama i tablicama za obilježavanje prikazanih aminokiselina i dijelova:

hR ili hArg: homoarginin

hl ili hTir: homotirozin

Cha: cikloheksilalanin

Amf: 4-aminometilfenilalanin

DPL: 2-(4,6-dimetilpirimidinil)lizin

(imidazolil)K: N'-(2-imidazolil)lizin

Me2PO3-l: O-dimetilfosfotirozin

O-Me-l: O-metiltirozin

TIC: 1,2,3,4-tetrahidro-3-izokvinolin karboksilna kiselina

DAP: 1,3-diaminopropan

TFA: trifluoroctena kiselina

AA: octena kiselina

3PAL 3-piridil-alanin

4-Hip 4-hidroksiprolin

Abu alfa-aminomaslačna kiselina

Ti tienilalanin

Opće je poznato u struci, te se podrazumijeva i kod ovog izuma, da peptidilna terapeutska sredstva kao što su konjugati oligopeptida i citotoksičnih agensa po mogućnosti imaju krajnji (terminalni) amino dio bilo kojeg supstituenta oligopeptida zaštićen odgovarajućom zaštitnom grupom, kao stoje acetil, benzolil, pivaloil i slično. Takva zaštita krajnje (terminalne) amino grupe smanjuje ili uklanja enzimsku razgradnju peptidilnih terapijskih sredstava djelovanjem amino peptidaza koje se nalaze u krvnoj plazmi toplokrvnih životinja.

Takve zaštitne grupe također uključuju hidrofilne blokirajuće grupe koje su izabrane na osnovi postojanja hidrofilne funkcionalnosti. Blokirajuće grupe koje pojačavaju hidrofilnost spojeva i tako povećavaju topivost konjugata u vodi, uključuju, iako nisu ograničene samo na njih, hidrirani alkanoil, polihidroksiliran alkanoil, hidrirani aroil, polihidroksiliran aroil, polietilen glikol, glikozilate, šećere i krunske etere.

Također i N-terminalni dijelovi umjetnih aminokiselina mogu poboljšati enzimsku razgradnju pomoću amino peptidaza.

mogućnosti N-terminalna zaštitna grupa izabrana je iz

a) acetila;

b) [image]

c) [image]

d) [image]

gdje:

R1 i R2 su neovisno izabrani iz:

a) vodika,

b) nesupstituiranog ili supstituiranog arila, nesupstituiranog ili supstituiranog heterocikličkog spoja, C3-C10 cikloalkila, C2-C6 alkenila, C2-C6 alkinila, halogena, C1-C6 perfluoralkila, R3O-, R3C(O)NR3-, (R3)2NC(O)-, R32N-C(NR3)-, R4S(O)mNH, CN, NO2, R3C(O)-, N3, -N(R3)2, ili R4OC(O)NR3-,

c) nesupstituiranog C1-C6alkila,

d) supstituiranog C1-C6 alkila gdje je substituent na zamijenjenom C1-C6 alkilu izabran iz nesupstituiranog ili supstituiranog arila, nesupstituiranog ili supstituiranog heterocikličkog spoja, C3-C10 cikloalkila, C2-C6 alkenila, C2-C6 alkinila, R3O-, R4S(O)mNH, R3C(O)NR3-, (R3)2NC(O)-, R32N-C(NR3)-, CN, R3C(O)-, N3, -N(R3)2, i R4OC(O)NR3-; ili

R1 i R2 su kombinirani da tvore -(CH2)S- gdje je jedan od ugljikovih atoma po izboru zamijenjen dijelom izabranim iz: O, S(O)m, -NC(O)-, NH i -N(COR4)-;

R3 je izabran iz: vodika, arila, supstituiranog arila, heterocikličkog spoja, supstituiranog heterocikličkog spoja, C1-C6 alkila i C3-C10 cikloalkila;

R4 je izabran iz: arila, supstituiranog arila, heterocikličkog spoja, supstituiranog heterocikličkog spoja, CrC6 alkila i C3-C10 cikloalkila;

m je 0, 1 ili 2;

n je 1, 2, 3 ili 4;

p je nula ili cijeli broj između 1 i 100;

q je 0 ili 1, pod uvjetom da ako je p nula, q je 1;

r je cijeli broj između l i 10; i

s je 3, 4 ili 5.

Poželjno je daje r 1, 2 ili 3.

Oligopeptidi ovih konjugata sadrže ciklički amnokiselinski supstituent sa hidrofilnim dijelom, prethodno predstavljen izrazom "Haa" koji može biti predstavljen i formulom:

[image]

gdje je:

R5 je zabran iz HO- i C1-C6 alkoksi;

R6 je izabran iz vodika, halogena, C1-C6 alkila, HO- i C1-C6 alkoksi; i

t je 3 ili 4.

Struktura

[image]

prikazuje ciklički amino-dio koji ima 5 ili 6 članova u prstenu. Takav ciklički amin može se po izboru spojiti s fenilnim ili cikloheksilnim prstenom. Primjeri takvog cikličkog amino-dijela uključuju, iako nisu samo na njih ograničeni, sljedeće specifične strukture:

[image]

Konjugati ovog izuma mogu imati asimetrične centre i pojavljuju se kao racemati, racemičke smjese, te kao pojedinačni diastereomeri, sa svim mogućim izomerima, uključujući optičke izomere, koji su uključeni u ovaj izum. Kada se bilo koja varijabla (npr. aril, heterociklički spoj, R3 itd.) pojavi više od jednog puta u bilo kojem sastojku, njena je definicija pri svakom pojavljivanju neovisna o drugim pojavljivanjima. Na primjer, HO(CR1R2)2- predstavlja HOCH2CH2-, HOCH2CH(OH)-, HOCH(CH3)CH(OH)-, itd. Također kombinacije supstituenata i/ili varijabla su dozvoljene samo ako te kombinacije rezultiraju stabilnim spojevima.

Ovdje korišteni izraz "alkil" i alkilni dio aralkila, te slični izrazi označavaju razgranate i ravno-lanačane zasićene grupe alifatskih ugljikovodika koje imaju određen broj ugljikovih atoma; "alkoksi" označava alkilnu grupu koja ima određen broj ugljikovih atoma spojenih pomoću kisikovog mosta.

Ovdje korišteni izraz "cikloalkil" označava nearomatične grupe cikličkih ugljikovodika koje imaju određen broj ugljikovih atoma. Primjeri cikloalkilnih grupa obuhvaćaju ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil i slično.

"Alkenilne" grupe obuhvaćaju one grupe koje imaju određen broj ugljikovih atoma, te jednu ili nekoliko dvostrukih veza. Primjeri alkenilnih grupa obuhvaćaju vinil, alil, izopropenil, pentenil, heksenil, heptenil, ciklopropenil, ciklobutenil, ciklopentenil, cikloheksenil, 1-propenil, 2-butenil, 2-metil-2-butenil, izoprenil, farnezil, geranil, geranilgeranil i slično.

"Alkinilne" grupe obuhvaćaju one grupe koje imaju određen broj ugljikovih atoma ijednu trostruku vezu. Primjeri alkinilnih grupa obuhvaćaju acetilen, 2-butinil, 2-pentinil, 3-pentinil i slično.

"Halogen" ili "halo" kako su ovdje korišteni označavaju fluor, klor, brom i jod.

Ovdje korišteni izraz "aril" i arilni dio aralkila i aroila, označava bilo koji stabilni monociklički ili biciklički ugljikov prsten s najviše 7 članova u svakom prstenu, gdje je barem jedan prsten aromatičan. Primjeri takvih arilnih elemenata uključuju fenil, naftil, tetrahidronaftil, indanil, bifenil, fenantril, antril ili acenaftil.

Izraz heterociklički spoj, kako je ovdje korišten, predstavlja 5 do7-člani monociklički ili stabilni 8 do 11-člani biciklički heterociklički prsten koji je zasićen ili nezasićen, i koji se sastoji od ugljikovih atoma i od jednog do četiri heteroatoma izabranih iz grupe koja se sastoji od N, O, i S i koja uključuje bilo koju bicikličku grupu u kojoj je bilo koji od gore definiranih heterocikličkih prstena spojen s benzenskim prstenom. Heterociklički prsten može biti pripojen na bilo koji heteroatom ili ugljikov atom što rezultira stvaranjem stabilne strukture. Primjeri takvih heterocikličkih elemenata uključuju, iako nisu na njih ograničeni, azepinil, benzimidazolil, benzisoksazolil, benzofurazanil, benzopiranil, benzotiopiranil, benzofuril, benzotiazolil, benzotienil, benzoksazolil, kromanil, kinolinil, dihidrobenzofuril, dihidrobenzotienil, dihidrobenzotiopiranil, dihidrobenzotiopiranil sulfon, furil, imidazolidinil, imidazolinil, imidazolil, indolinil, indolil, izokromanil, izoindolinil, izokvinolinil, izotiazolidinil, izotiazolil, izotiazolidinil, morfolinil, naftiridinil, oksadiazolil, 2-oksoazepinil, oksazolil, 2-oksopiperazinil, 2-oksopiperdinil, 2-oksopirolidinil, piperidil, piperazinil, piridil, pirazinil, pirazolidinil, pirazolil, piridazinil, pirimidinil, pirolidinil, pirolil, kvinazolinil, kvinolinil, kvinoksalinil, tetrahidrofuril, tetrahidroizokvinolinil, tetrahidrokvinolinil, tiamorfolinil, tiamorfolinil sulfoksid, tiazolil, tiazolinil, tienofuril, tienotienil i tienil.

Ovdje korišteni izrazi "supstituirani C1-C8 alkil"supstituirani aril" i "supstituirani heterociklički spoj" obuhvaćaju dijelove koji sadrže od 1 do 3 supstituenta, uz točku spajanja na ostatak spoja. Takvi dodatni supstituenti izabrani su iz F, Cl, Br, CF3, NH2, N(C1-C6alkil)2, NO2, CN, (C1-C6alkil)O-, -OH, (C1-C6alkil)S(O)m-, (C1-C6alkil)C(O)NH-, H2N-C(NH)-, (C1-C6alkil)C(O)-, (C1-C66alkil)OC(O)-, N3, (C1-C6alkil)OC(O)NH- i C1-C20alkil.

Izraz "cijeli broj između 1 i 10" predstavlja brojeve 1 i 10, a također i cijele brojeve između njih. Izraz "cijeli broj između 1 i 100" predstavlja brojeve 1 i 100, kao i cijele brojeve između njih.

Kada su R1 i R2 kombinirani da tvore -(CH2)S-, ciklički dijelovi i ciklički dijelovi koji sadrže heteroatom uključuju, iako nisu ograničeni samo na njih:

[image]

Ovdje korišteni izraz "PEG" označava polietilen glikol koji sadrži supstituente koji imaju određen broj etilenoksi podjedinica. Prema tome, izraz PEG(2) predstavlja

[image]

i izraz PEG (6) predstavlja

[image]

Ovdje korišteni izraz "(2R)(2,3-dihidroksipropionil)" predstavlja sljedeću strukturu

[image]

Ovdje korišteni izraz "(2R,3S)2,3,4-trihidroksibutanoil" predstavlja sljedeću strukturu:

[image]

Budući da se konjugati ovog izuma mogu koristiti za modificiranje određene biološke reakcije, citotoksično sredstvo (agens) ne treba biti tako napravljeno da se ograničava na klasična kemijska terapijska sredstva. Na primjer, citotoksično sredstvo može biti protein ili polipeptid koji posjeduje željeno biološko djelovanje. Takvi proteini mogu obuhvaćati, na primjer, otrov kao što su abrin, ricin A, egzotoksin pseudomonasa ili difterijski toksin; protein kao što su tumorski faktor nekroze, a-interferon, b-interferon, faktor rasta živca, faktor rasta trombocitnog podrijetla, aktivator tkivnog plazminogena; ili modifikatore biološke reakcije kao što su na primjer limfokini, interleukin-1 ("IL-1"), interleukin-2 ("IL-2"), interleukin-6 ("IL-6"), stimulirajući faktor kolonije granulocitnog makrofaga ("GM-CSF"), stimulirajući faktor kolonije granulocita ("G-CSF"), ili drugi faktori rasta.

Poželjna citotoksična sredstva uključuju, općenito, alkilirajuća sredstva, antiproliferativna sredstva, sredstva za vezanje tubulina i slično. Poželjne skupine citotoksičnih sredstava uključuju, na primjer, porodicu antracikličkih lijekova, vinka lijekove, mitomicine, bleomicine, citotoksične nukleozide, taksane, porodicu pteridinskih lijekova, diinene i podofilotoksine. Osobito korisni članovi tih skupina su, na primjer, doksorubicin, karminomicin, aunorubicin, aminopterin, metotreksat, metopterin, dikloro-metotreksat, mitomicin C, porfiromicin, 5-fiuorouracil, 6-merkaptopurin, citozin arabinozid, podofilotoksin, ili derivati podofilotoksina kao što su etopozid ili etopozid fosfat, melfalan, vinblastin, vinkristin, leurozidin, vindezin, leurozin, toksol ili slično. Druga korisna citotoksična sredstva uključuju estramustin, cisplatin i ciklofosfamid. Stručnjaci u struci mogu kemijski modificirati željeno citotoksično sredstvo da bi reakcije određenog spoja postale pogodnije za pripremanje konjugata ovog izuma.

Vrlo poželjna grupa citotoksičnih sredstava za izum koji se predstavlja uključuje-lijekove slijedećih formula:

METOTREKSATNA GRUPA FORMULE (1):

[image]

u kojoj

R12 je amino ili hidroksi;

R7 je vodik ili metil;

R8 je vodik, fluor, klor, brom ili jod;

R9 je hidroksi ili dio koji dopunjuje sol karboksilne kiseline;

MITOMICINSKA GRUPA FORMULE (2):

[image]

u kojoj

R10je vodik ili metil;

BLEOMICINSKA GRUPA FORMULE (3):

[image]

u kojoj

R11 je hidroksi, amino, C1-C3 alkilamino, di(C1-C3 alkil)amino, C4-C6 polimetilen amino,

[image]

MELFALAN FORMULE (4):

[image]

6-MERKAPTOPURIN FORMULE (5):

[image]

ACITOZIN ARABINOZID FORMULE (6):

[image]

PODOFILOTOKSINI FORMULE (7):

[image]

u kojoj

R13 je vodik ili metil;

R14 je metil ili tienil; ili njegova fosfatna sol;

VINKA ALKALOIDNA GRUPA LIJEKOVA FORMULE (8):

[image]

u kojoj

R15 je H, CH3 ili CHO; kada su R17 i R18 uzeti pojedinačno;

R18 je H, jedan od R16 i R17 je etil, a drugi je H ili OH; kada su R17 i R18 uzeti zajedno s ugljikom s kojim su spojeni, oni tvore oksiranski prsten i u tom slučaju R16 je-etil;

R19 je vodik, (C1-C3 alkil)-CO, ili klorosupstituirani (C1-C3 alkil)-CO;

DIFLUORNUKLEOZIDI FORMULE (9):

[image]

u kojoj

R21 je lužina koja ima jednu od formula:

[image]

u kojima

R22 je vodik, metil, brom, fluor, klor ili jod;

R23 je -OH ili-NH2;

R24 je vodik, brom, klor ili jod;

ili,

ANTRACIKLIČKI ANTIBIOTICI FORMULE (10):

[image]

u kojoj

Ra je -CH3, -CH2OH, -CH2OCO(CH2)3CH3, ili -CH2OCOCH(OC2H5)2;

Rb je -OCH3, -OH ili -H;

Rc je -NH2, -NHCOCF3, 4-morfolinil, 3-cijano-4-morfolinil, 1-piperidinil, 4-metoksi-1-piperidinil, benzilamin, dibenzilamin, cijanometilamin, ili 1-cijano-2-metoksietil amin;

Rd je -OH -OTHP ili -H; i

Re je -OH ili -H pod uvjetom da

R6 nije -OH kada je R5 -OH ili -OTHP.

ESTRAMUSTIN (11)

[image]

CIKLOFOSFAMID (12)

[image]

Daleko najpoželjniji lijekovi su gore opisana antraciklička antibiotska sredstva formule (10). Stručnjaci za ovo područje znaju da ta strukturalna formula uključuje spojeve koji su lijekovi, ili su derivati lijekova, i koji su dobili u struci različita generička i tvornička imena. Tablica 1, koja slijedi, predstavlja nekoliko antracikličkih lijekova čija je uporaba naročito poželjna za ovaj izum, te njihova generička ili tvornička imena.

Tablica 1

[image]

Od spojeva prikazanih u tablici 1, najpoželjnija citotoksična sredstva su doksorubicin, vinblastin i dezacetilvinblastin. Doksorubicin (na koji se također u tekstu odnosi i "DOX") je antraciklin formule (10) u kojoj Ra jeCH2OH, Rb je -OCH3, Rc je je -OH, i Re je-H.

Konjugat oligopeptida i citotoksičnog sredstva ovog izuma u kojem je citotoksično sredstvo po mogućnosti citotoksično sredstvo doksorubicin, može se opisati općom formulom l ovdje prikazanom:

[image]

gdje:

oligopeptid je oligopeptid kojeg prostata specifični antigen (PSA) selektivno prepoznaje te kojima ima svojstvo da se proteolitički cijepa enzimskim djelovanjem slobodnog prostata specifičnog antigena, te oligopeptid sadrži cikličku aminokiselinu formule:

Od spojeva prikazanih u tablici 1, najpoželjnija citotoksična sredstva su doksorubicin, vinblastin i dezacetilvinblastin. Doksorubicin (na koji se također u tekstu odnosi i "DOX") je antraciklin formule (10) u kojoj Ra jeCH2OH, Rb je -OCH3, Rc je NH2, Rd je -OH, i Re je -H.

[image]

gdje:

[image]

i gdje

je C-kraj karbonil kovalentno vezan za amin doksorubicina;

R je izabran iz

a) vodika,

b) -(C=O)Rla,

[image]

R1 i R2 su neovisno izabrani iz: vodika, OH, C1-C6 alkil, C1-C6 alkoksi, C1-C6 aralkil i aril;

Rla je C1-C6alkil, hidroksiliran aril, polihidroksiliran aril ili aril,

R5 je izabran iz HO- i C1-C6 alkoksi;

R6 je izabran iz vodika, halogena, C1-C6 alkil, HO- i C1-C6 alkoksi; i

n je 1,2,3 ili 4;

p je nula ili cijeli broj između 1 i 100;

q je 0 ili 1, pod uvjetom da ako je p nula, q je 1;

r je cijeli broj između 1 i 10; i

t je 3 ili 4;

ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol.

U poželjnijem obliku konjugat oligopeptida i citotoksičnog agensa:

ciklička aminokiselina je

[image]

R je izabran iz

a) vodika,

b -(C=O)Rla,

c) [image]

[image]

R1 i R2 su neovisno izabrani iz: vodika, C1-C6 alkila i arila;

Rla je C1-C6-alkil ili aril,

n je 1, 2, 3 ili 4;

n' je 0, 1, 2 ili 3;

p je nula ili cijeli broj između 1 i 14;

q je 0 ili 1, pod uvjetom da ako je p nula, q je 1;

r je cijeli broj između l i 10; i

t je 3;

ili optički izomer ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol.

Spojevi koji slijede su specifični primjeri konjugata oligopeptida i citotoksičnog sredstva ovog izuma:

[image]

gdje X je:

[image] [image] (SEQ.ID.NO.: 70),

[image] (SEQ.ID.NO.: 71),

[image] (SEQ.ID.NO.: 72),

[image] (SEQ.ID.NO.: 73),

[image] (SEQ.IO.NO.: 74),

[image] ili njihov optički izomer ili farmaceutski prihvatljiva sol.

Konjugat oligopeptida i ciklotoksičkog agensa ovog izuma gdje je citotoksični agens po mogućnosti citotoksično sredstvo vinblastin ili dezacetilvinblastin te se može opisati općom formulom II (vidi dolje):

[image]

gdje:

oligopeptid je oligopeptid kojeg prostata specifični antigen (PSA) specifično prepoznaje te kojima ima svojstvo da se proteolitički cijepa enzimskim djelovanjem slobodnog prostata specifičnog antigena, te oligopeptid sadrži cikličku aminokiselinu formule:

[image]

XL je- (CH2)u-NH-

R je izabran iz

a) vodika

b) -(C=O)Rla,

c) [image]

d) [image]

e) [image]

R1 i R2 su neovisno izabrani iz: vodika, OH, C1-C6 alkila, C1-C6 alkoksi, C1-C6aralkila i arila;

Rla je C1-C6-alkil, hidroksilirani aril, polihidroksilirani aril ili aril, R19 je vodik, (C1-C3 alkil)-CO, ili klorosupstituiran (C1-C3 alkil)-CO;

n je 1, 2, 3 ili 4;

p je nula ili cijeli broj između 1 i 100;

q je 0 ili 1, pod uvjetom da ako je p nula, q je 1;

r je 1, 2 ili 3;

t je 3 ili 4;

uje 1, 2, 3, 4 ili 5,

ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol.

Drugi oblik konjugata oligopeptida i citotoksičnog sredstva ovog izuma gdje je citotoksično sredstvo po mogućnosti citotoksično sredstvo vinblastin ili dezacetilvinblastin može se opisati općom, dolje prikazanom formulom III:

[image]

gdje:

[image]

Rg i Rh su neovisno izabrani iz: vodika, C1-C6 alkila, -C1-C6 alkil-OH, -C1-C6 alkil-di-OH, -C1-C6 alkil-tri-OH i

[image]

pod uvjetom da barem jedan Rd i Re nije vodik ili C1-C6 alkil, ili Rg i Rh su kombinirani da tvore -CH2CH2OCH2CH2- diradikal; R19 je vodik, (C1-C3 alkil)-CO, ili klorom zamijenjen (C1-C3 alkil)-CO;

p je nula ili cijeli broj između 1 i 100;

q je 0 ili 1, pod uvjetom da ako je p nula, q je 1;

ili njihova farmaceutski prihvatljiva sol.

Spojevi koji slijede specifični su primjeri konjugata oligopeptida i dezacetilvinblastina ovog izuma:

[image]

ili njihov optički izomer ili farmaceutski prihvatljiva sol.

Oligopeptidi, podjedinice peptida i derivati peptida (također nazvani "peptidi") ovog izuma mogu se sintetizirati iz njihovih sastavnih aminokiselina pomoću uobičajenih tehnika sinteze peptida, po mogućnosti pomoću čvrsto-fazne tehnologije. Peptidi se zatim pročišćavaju pomoću reverzno-fazne tekuće kromatografije visoke performanse.

Standardni postupci sinteze peptida izloženi su, na primjer, u sljedećim djelima: Schroeder et al., "Peptidi", Vol. 1, Academic Press 1965; Bodansky et al., "Sinteza peptida", Interscience Publishers, 1966; McOmie (ed.) "Zaštitne grupe u organskoj kemiji", Plenum Press, 1973; Barany et al., "Peptidi: analiza, sinteza, biologija" 2, Poglavlje 1, Academic Press, 1980, i Stewart et al., "Čvrsta faza sinteze peptida", drugo izdanje, Pierce Chemical Company, 1984. Spoznaje iz ovih djela su korištene i ovdje.

Odgovarajuće supstituirana ciklička aminokiselina koja ima hidrofilini supstituent, a koja se može inkorporirati u ove konjugate pomoću standardnih tehnika sinteze peptida, dostupna je u trgovini ili se lako sintetizira pomoću tehnika dobro poznatih u struci ili ovdje opisanih. Tako su sinteze odgovarajuće zamijenjenih prolina opisane u slijedećim člancima i tamo navedenim referencama: J. Ezguerra et al., J. Org. Chem. 60:2925-2930 (1995); P. Gill i W. D. Lubell, J. Org. Chem., 60:2658-2659 (1995); i M. W. Holladay et al., J. Med. Chem., 34:457-461 (1991). Spoznaje iz ovih djela su korištene i ovdje.

Farmaceutski prihvatljive soli spojeva ovog izuma uključuju konvencionalne neotrovne soli spojeva ovog izuma koje nastaju iz, npr., neotrovnih anorganskih ili organskih kiselina. Na primjer, takve konvencionalne neotrovne soli uključuju soli dobivene iz anorganskih kiselina kao što su kloridna, bromidna, sulfatna, sulfamska, fosforna, nitratna i slično; i soli pripremljene iz organskih kiselina kao što su octena, propionska, sukcinatna, glikolna, stearinska, mliječna, malična, vinska, limunska, askorbinska, pamoična, maleinska, hidroksimaleinska, feniloctena, glutamska, benzoična, salicilna, sulfanililna, 2-acetoksibenzoična, mravlja, toluensulfonska, metansulfonska, etan disulfonska, oksalna, izotionska, trifluorooctena i slično.

Konjugati ovog izuma, koji obuhvaćaju oligopeptid koji sadrži mjesto cijepanja PSA i citotoksično sredstvo, mogu se također sintetizirati uz pomoć tehnika poznatih u medicinsko-kemijskoj struci. Na primjer, slobodni aminski dio na citotoksičnom sredstvu može se kovalentno spojiti s oligopeptidom u karboksilnom kraju tako da se stvori amidna veza. Isto tako, amidna veza može nastati kovalentnim spajanjem aminskog dijela oligopeptida i karboksilnog dijela citotoksičnog sredstva. U te svrhe može biti korišten reagens kao stoje 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,3,3-tetrametilluronium heksafluoro-fosfat (poznat kao HBTU) i 1-hiroksibenzotriazol hidrat (poznat kao HOBT), dicikloheksilkarbodiimid (DCC), N-etil-N-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid (EDC), difenilfosforilazid (DPPA), benzotriazol-1-il-oksi-tris-(dimetilamino)fosfonij heksafluorfosfat (BOP) i slični, korišteni u kombinaciji ili pojedinačno.

Nadalje, ovaj konjugat može se dobiti ne-peptidnom vezom između PSA mjesta cijepanja i citotoksičnog sredstva. Na primjer, citotoksično sredstvo može biti kovalentno vezan za karboksilni kraj oligopeptida putem hidroksilnog dijela na citotoksičnom sredstvu, te na taj način stvarati estersku vezu. U tu svrhu može se koristiti reagens poput kombinacije HBTU i HOBT, kombinacija BOP-a i imidazola, kombinacija DCC i DMAP i slično. Karboksilna kiselina također se može aktivirati stvaranjem nitrofenilnog estera ili sličnog te može reagirati u prisutnosti DBU (1,8-diazabiciklo[5,4,0]undec-7-en).

Ovaj konjugat isto se tako može dobiti vezanjem oligopeptida za citotoksični agens putem vezivne jedinice. Takve vezivne jedinice uključuju, na primjer, biskarbonilni alkilni diradikal pri čemu je aminski dio citotoksičnog sredstva povezan sa vezivnom jedinicom stvarajući amidnu vezu, a amino kraj oligopeptida je povezan sa drugim krajem vezivne jedinice također stvarajući amidnu vezu. Protivno tome, diaminoalkilna diradikalna vezivna jedinica kod koje je karbonilni dio na citotoksičnom agensu kovalentno vezan za jedan od amina vezivne jedinice, dok je drugi amin vezivne jedinice kovalentno vezan za C kraj oligopeptida, također može biti korisna. Druge takve vezivne jedinice koje su stabilne u fiziološkom okolišu kad nije prisutan slobodan PSA, ali se mogu cijepati cijepanjem na mjestu PSA proteolitičkog cijepanja, također su uzete u obzir. Nadalje, vezivne jedinice mogu se koristiti za to da, nakon cijepanja PSA, proteolitičko mjesto cijepanja ostane vezano za citotoksični agens bez da, u usporedbi sa nemodificiranim citotoksičnim agensom, značajno smanjuju citotoksičnu aktivnost takvog derivata citotoksičnog agensa nastalog nakon cijepanja.

Stručnjak za ovo područje razumije da u sintezi spojeva ovog izuma treba zaštititi različite je aktivne funkcionalne grupe polaznih spojeva i međuspojeva (intermedijera) dok se željena reakcija odvija na drugim dijelovima molekule. Nakon što željene reakcije završe, ili u bilo koje željeno vrijeme, obično se takve zaštite grupe odstrane pomoću, npr. hidrolitičkih ili hidrogenolitičkih sredstava. Ovakve etape (postupci) protekcije i deprotekcije su općeprihvaćene u organskoj kemiji. Stručnjak za ovo područje može potražiti radove Protective Groups in Organic Chemistrv. McOmie, ed., Plenum Press, (1973); i Protective Groups in Organic Svnthesis. Green, izd., John Wiley & Sons, NY, NY(1981) radi uvida u mišljenje autora o zaštitnim grupama koje mogu biti korisne u pripravi spojeva ovog izuma.

Samo radi primjera, korisne zaštitne grupe za amino mogu uključivati, na primjer, C1-C10 alkanoilne grupe, kao što su formil, acetil, dikloracetil, propionil, heksanoil, 3,3-dietilheksanoil, γ-klorbutril i slično; C1-C10 alkoksikarbonil i C5-C15 ariloksikarbonilne grupe kao što su terc-butoksikarbonil, benziloksikarbonil, aliloksikarbonil, 4-nitrobenziloksikarbonil, fluorenilmetiloksikarbonil i kinamoiloksikarbonil; halo-(C1-C10)-alkoksikarbonil kao stoje 2,2,2-trikloretoksikarbonil; i C1-C15arilalkil i alkenilna grupa poput benzila, fenetila, alila, tritila i sličnih. Druge zaštitne grupe za amino koje se obično koriste su u obliku enamina, pripravljene sa β-keto-esterima poput metila i etil acetoacetata.

Korisne zaštitne grupe za karboksil mogu, na primjer, uključivati C1-C10alkilne grupe poput metila, terobutila, decila; halo-C1-C10alkil poput 2,2,2-trikloretila i 2-jodetila; C5-C15 arilalkil poput benzila, 4-metoksibenzila, 4-nitrobenzila, trifenilmetila, difenilmetila; C1-C10alkanoiloksimetil poput acetoksimetila, propionoksimetila i sličnih; i grupe poput fenacila, 4-halofenacila, alila, diemtilalila, tri-(C1-C3 alkil)silila, poput trimetilsilila, β-p-toluensulfoniletila, β-p-nitrofeniltioetil, 2,4,6-trimetilbenzil, β-metiltioetil, ftalimidmetil, 2,4-dinitro-fenilsulfenil, 2-nitrobenzhidril i srodne grupe.

Slično tome, korisne zaštitne grupe za hidroksi mogu, na primjer, uključivati, formilnu grupu, kloracetilnu grupu, benzilnu grupu, benzhidrilnu grupu, tritilnu grupu, 4-nitrobenzilnu grupu, trimetilsililnu grupu, fenacilnu grupu, terc-butilnu grupu, metoksimetilnu grupu, tetrahidropiranilnu grupu i slično.

S obzirom na poželjan oblik oligopeptida kombiniranog sa antraciklinskim antibiotikom doksorubicinom, sljedeće reakcijske sheme ilustriraju sintezu konjugata ovog izuma.

REAKCIJSKA SHEMA I

[image]

REAKCIJSKA SHEMA II

[image]

REAKCIJSKA SHEMA III

[image]

REAKCIJSKA SHEMA IV

[image]

REAKCUSKA SHEMA V

[image]

Reakcijska Shema VI ilustrira pripravu konjugata koji se koriste u ovom postupku liječenja pri čemu su oligopeptidi kombinirani sa vinka alkaloidnim citotoksičnih sredstvom (agensom) vinblastinom. Ilustrirano je vezanje N-kraja oligopeptida za vinblastin (S.P. Kandukuri et ab, J. Med. Chem. 28: 1079-1088 (1985)).

Reakcijska Shema VII ilustrira pripravu konjugata oligopeptida ovog izuma i vinka alkaloidno citotoksično sredstvo vinblastin, pri čemu je vinblastin vezan za C-kraj oligopeptida. Primjena 1,3-diaminopropanskog vezača je samo ilustrativna; ostale prostorne jedinice između karbonila na vinblastinu i C-kraja oligopeptida također su prikazane. Nadalje, Shema VII ilustrira sintezu konjugata pri čemu je hidroksilni dio na položaju C-4 reacetiliran nakon adicije vezivne jedinice. Podnositelji ovog izuma otkrili su da je deacetilirani konjugat vinblastina također učinkovit te da može biti pripravljen eliminiranjem etapa prikazanih u Reakcijskoj shemi VII zaštite primarnog amina vezača i reakcije između međuspoja (intermedijera) i anhidrida octene kiseline, nakon čega je došlo do deprotekcije amina. Konjugaciju oligopeptida na drugim položajima i funkcionalnih grupa vinblastina lako mogu izvesti osobe koje se bave ovim područjem znanosti te se očekuje da će također osigurati spojeve korisne u liječenju karcinoma prostate.

Isto tako, podrazumijeva se da konjugati mogu biti pripravljeni kad je N-kraj oligopeptida, koji sadrži cikličku aminokiselinu sa hidrofilnim supstituentom, koji se koristi u ovoj metodi liječenja, kombiniran sa jednim citotoksičnim agensom, poput vinblastina, dok se C-kraj istovremeno veže za drugi citotoksični agens, koji može biti isti ili različiti citotoksični agens, poput doksorubicina. Reakcijska shema VIII ilustrira sintezu takvog konjugata policitotoksičnog agensa. Takav policitotoksični konjugat može imati više prednosti od konjugata koji sadrži samo jedan citotoksični agens.

REAKCIJSKA SHEMA VI

[image]

REAKCIJSKA SHEMA VI (Nastavak)

[image]

naznačen time da je R -NH2, -O-alkil i slično

REAKCIJSKA SHEMA VII

[image]

REAKCIJSKA SHEMA VII (Nastavak)

[image]

REAKCUSKA SHEMA VIII

[image]

REAKCIJSKA SHEMA VIII (Nastavak)

[image]

Konjugati oligopeptida i citotoksičnog sredstva (agensa) ovog izuma primjenjuju se na pacijenta u obliku farmaceutske smjese koja sadrži konjugat ovog izuma i farmaceutski prihvatljiv nosač, ekscipijent (inertno punilo) ili diluent. U ovom obliku u kojem se koristi, "farmaceutski prihvatljiv" odnosi se na sredstva korisna u liječenju ili dijagnosticiranju (bolesti ili poremećaja, op.p.) kod toplokrvnih životinja, uključujući, na primjer, ljude, konja, svinju, govedo, miša, psa, mačku ili druge sisavce, kao i ptice ili druge toplokrvne životinje. Poželjan oblik primjene je parenteralan, posebno intravenskim, intramuskularnim, subkutanim, intraperitonealnim ili intralimfatičkim putem. Takve formulacije mogu biti pripravljene pomoću nosača, diluenta ili ekscipijenta koji su poznati stručnjacima za ovo područje. U vezi s tim, vidi npr. Remington's Pharmaceutical Sciencies. 16. izdanje, 1980, Mack Publishing Company, izdavač Osol et al. Takve smjese mogu uključivati proteine, poput serumskih proteina, na primjer ljudski serumski albumin, pufere ili puferske tvari (supstance) kao što su fosfati, druge soli ili elektrolite i slično. Odgovarajući diluenti mogu, na primjer, uključivati sterilnu vodu, izotoničnu otopinu soli, razrijeđenu vodenu (akvoznu) dekstrozu, polihidričan alkohol ili smjese takvih alkohola, npr. glicerin, propilen glikol, polietilen glikol i slično. Ako se želi, smjesa može obuhvaćati oko 0,05 do oko 0,20 posto od težine nekog antioksidansa poput natrijevog metabisulfita ili natrijevog bisulfita.

U obliku u kojem se ovdje koristi, izraz "smjesa" trebao bi obuhvatiti produkt koji sadrži navedene sastojke u određenim količinama, kao i svaki produkt koji se direktno ili indirektno dobiva kombinacijom određenih sastojaka u navedenim količinama.

Za intravensku primjenu, poželjno je da smjesa bude pripravljena na takav način da količina koja se daje pacijentu iznosi od oko 0,01 do oko l g konjugata. Poželjno je da količina koja se primjenjuje bude u rasponu od 0,2 g do oko Ig konjugata. Konjugati izuma su učinkoviti u širokom rasponu doze ovisno o čimbenicima poput stanja bolesti koju se treba liječiti ili biološkog učinka koji se treba modificirati, načinu na koji se konjugat primjenjuje, dobi, težini i općem stanju pacijenta kao i drugim čimbenicima koje treba odrediti liječnik koji provodi liječenje. Stoga, količina koja se daje konkretnom pacijentu mora biti određena individualno.

: Stručnjaku za ovo područje bit će jasno da iako su u primjerima koji slijede izneseni određeni reagensi i reakcijski uvjeti, mogu se provoditi promjene za koje se podrazumijeva da su obuhvaćene duhom i opsegom izuma. Stoga su načini pripreme i primjeri koji slijede izneseni kako bi još bolje ilustrirali izum, te ne predstavljaju ograničenje.

Primjeri

PRIMJER 1

Priprava oligopeptida koji sadrži mjesto ciepania posredovano od PSA:

Blokirani oligopeptidi pripravljeni su sintezom krute faze, pomoću protokola vezanja za uvođenje aminokiselina na model 430 A Primjenjenih biosistema ("Applied Biosystems") automatiziranog peptidnog sintetizera. Deprotekcija i odstranjivanje oligopeptida iz potporne smole ("resin support") ostvareni su obradom s tekućom fluoridnom kiselinom. Oligopeptidi su pročišćeni preparativnom tekućom kromatografijom pod visokim tlakom na reverznoj fazi C 18 silika kolone pomoću vodenog 0,1% gradijenta truifluoroctene kiseli ne/aceton itrila. Identitet i istovrsnost oligopeptida potvrdila je analiza građe aminokiselina, tekuća kromatografija pod visokim tlakom i spektralna analiza mase brzim bombardiranjem atomima. Oligopeptidi pripravljeni na ovaj način prikazani su u Tablici 2.

TABLICA 2

[image] 4-trans-L-Hip je trans-4-hidroksi-L-prolin

Dehidro-Pro je 3,4-dehidro-L-prolin

PRIMJER 2

Ocjena prepoznavanja oligopeptida od strane slobodnog PSA:

Oligopeptidi pripravljeni na način opisan u Primjeru l pojedinačno se otapaju u PSA digestijskom puferu (12 mM tris(hidroksimetil)-aminometan pH 8, 0,25 mM NaCl, 0,5 mM CaCI2) i otopina se dodaje PSA u molarnom odnosu od 100 naprama 1. Alternativno, PSA digestijski pufer koji se koristi je 50 mM tris(hidroksimetil)-aminometan pH 7,4, 140 mM NaCl. Reakcija se zaustavlja nakon različitih reakcijskih vremena dodavanjem trilfuoroctene kiseline (TFA) do konačnih 1% (volumen/volumen). Alternativno, reakcija se zaustavlja sa 10 mM ZnCI2. Zaustavljena reakcija se analizira pomoću HPLC na reverzno-faznoj C18 koloni pomoću vodenog 0,1% TFA/acetonitril gradijenta. Rezultati ocjene izneseni su u Tablici 2. Tablica 2 prikazuje količinu vremena (u minutama) koja je potrebna za 50% cijepanje određenog oligopeptida sa enzimski aktivnim slobodnim PSA. Oligopeptidi koji sadrže slobodne aminske dijelove (npr., koji sadrže hArg, Orn, i ili 3 PAL) ispitani su pomoću TFA soli. Svi drugi Oligopeptidi ispitani su kao neutralni spojevi.

PRIMJER 3

Priprava [N-Ac-(4-trans-L-Hip)]--Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox-(SEO.ID.NO.:68)

[image]

Faza A: [N-Ac-(4-trans-L-Hip(Bzl))1-Ala-Ser(Bzl)Chg-Gln-Ser(Bzl)Leu-PAM smola (3-1).

Započevši sa 0,5 mmol (0,67 g) Boc-Leu-PAM smolom, zaštićeni (protektirani) peptid se sintetizira na ABI 430 A peptidnom sintetizeru (aparatu za sintezu). Protokol koristi četverostruki višak (2 mmol) od svake od sljedećih zaštićenih (protektiranih) aminokiselina: Boc-Ser(Bzl), Boc-Gln, Boc-Chg, Boc-Ala, N-Boc-(4-trans-L-Hip(Bzl)). Vezanje se ostvaruje pomoću DCC i HOBT aktivacije u metil-2-pirolidinonu. Za uvođenje N-terminalne acetilne grupe koristi se octena kiselina. Odstranjivanje Boe grupe izvodi se pomoću 50% TFA u metilen kloridu i TFA soli neutraliziranoj sa diizopropiletilaminom. Na kraju sinteze peptidna smola se suši kako bi se dobilo međuspoj (intermedijer) 3-1.

Faza B: [N-Ac-(4-trans-L-Hip)]--SerChg-Gln-Ser-Leu-OH (3-2)

Zaštićena (protektirana) peptidna smola (3-1), 1,2 g obrađuje se sa HF (20 ml) 1 sat na na 0°C u prisutnosti anizola (2 ml). Nakon isparavanja HF, ostatak se ispire eterom, filtrira i ekstrahira sa H20 (200 ml). Rltrat se liofilizira kako bi se dobilo međuspoj 3-2.

Faza C: [N-Ac-(4-trans-L-Hip)]--Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Doks

Gore opisani međuspoj (3-2), 1,157 g (1,45 mmol) otapa se u DMSO (30 ml) i razrjeđuje sa DMF (30 ml). Otopini se dodaje doksorubicin hidroklorid, 516 mg( 0,89 mmol), zatim 0,310 ml diizopropiletilamina (1,78 mmol). Promiješana otopina se ohladi (0°C) te se dodaje 0,276 ml difenilfosforil azida (1,28 mmol). Nakon 30 minuta, dodaje se još 0,276 ml(l,28 mmol) DPPA i pH se prilagođava na - 7,5 (pH papir) sa diizopropiletilaminom (DIEA). Pomoću DIEA, iduća 3 sata pH ohlađene reakcije (0°C) održava se na -7,5 te se reakcija preko noći miješa na 0-4°C. Nakon 18 sati, reakcija (za koju je analitička HPLC, sustav A, pokazala da je završena) koncentrira se u ulje. Pročišćavanje sirovog produkta ostvaruje se preparativnom HPLC, pufer A =0,1% NH4OAc-H2O; B=CH3CN. Sirovi produkt otapa se u 400 ml 100% A pufera, filtrira i pročišćava na C-18 reverznoj fazi HPLC radijalne kompresijske kolone (Waters, Delta-Pak, 15 μM, 100 A). Fazni gradijent od 100% A do 60% A koristi se pri brzini protoka od 75 ml/min (UV=214 nm). Homogene frakcije produkta (ocjenjene sa HPLC, sustav A) izdvajaju se i suše zamrzavanjem kako bi se osiguralo pročišćen produkt iz naslova.

HPLC uvjeti, sustav A

Kolona: Vycac 15 cm, #218TP5415, C18

Eluent: Gradijent 95:5 (A:B) do 5:95 (A:B) tijekom 45 minuta A=0,1 % TFA/H20, B=0,1 % TFA/Acetonitril

Protok: 1,5 ml/min

Dužina vala: 214 nm, 254 nm

Retencijska vremena: Doksorubicin=13,66 min.

Ac-Hip-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-OH = 10,8 min.

Ac-Hip-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Doks = 18,2 min.

FIZIKALNA SVOJSTVA

Niže su prikazana fizikalna/kemijska svojstva produkta iz Faze C:

Molekulska formula: C62H85N9O23

Molarna težina: 1323,6

ES Masena spektrografija

visoke rezolucije: 1341,7 (NH4+)

HPLC: Sustav A

Kolona: Vycac 15 cm, #218TP5415, C18

Eluent: Gradijent 95:5 (A:B) do 5:95 (A:B) tijekom 45 minuta A=0,1% TFA/H2O, B=0,1% TFA/Acetonitril

Protok: 1,5 ml/min

Dužina vala: 214 nm, 254 nm

Retencijsko vrijeme: 18,2 min.

Kompozicijska analiza aminokiselina1:

Teorija Pronađeno

(1) 1,00

Ser(2) 1,88

Chg(1) 0,91

Gln2(1) 1,00 (kao Glu)

Hip (1) 0,80

Leu(1) 1,01

Sadržaj peptida: 0,657 μmol/mg

Bilješka: 120 hr., 100°C, 6N HCl

2Gln konvertirano u Glu

Tablica 3 prikazuje druge konjugate peptida i doksorubicina koji su pripravljeni postupcima opisanim u Primjeru 3, ali koristeći odgovarajuće ostatke aminokiselina i blokirajući acilaciju grupe.

TABLICA 3

[image]

PRIMJER 4

Priprava [N-Glutaril-(4-trans-L-Hip)]--Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Doks-(SEQ.ID.NO.:71)

[image]

Faza A: [N-Glutaril(OFm)-(4-trans-L-Hip)]--Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-PAM smola

Započevši sa 0,5 mmol (0,67 g) Boc-Leu-PAM smolom, zaštićeni (protektirani) peptid se sintetizira na ABI 430 A peptidnom sintetizeru (aparatu za sintezu). Protokol koristi četverostruki višak (2 mmol) od svake od sljedećih zaštićenih (protektiranih) aminokiselina: Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Chg, Fmoc -, Boc-(4-trans-L-Hip). Vezanje se ostvaruje pomoću DCC i HOBT aktivacije u metil-2-pirolidinonu. Za uvođenje N-terminalne glutarilne grupe koristi se intermedijer monofluorenilmetilni ester glutarične kiseline [Glutaril(OFm)]. Odstranjivanje Fmoc grupe izvodi se pomoću 20% piriperidina. Zaštitne grupe osjetljive na kiseline, Boe, Trt i tBu odstranjuju se sa 50% TFA u metilen kloridu. Neutralizacija TFA soli izvodi se diizopropiletilaminom. Na kraju sinteze peptidna smola se suši kako bi se dobilo spoj iz naslova.

Faza B: [N-Glutaril(OFm)-(4-trans-L-Hip)]--Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-OH

Zaštićena (protektirana) peptidna smola iz faze A, 1,2 g, obrađuje se sa HF (20 ml) 1 sat na 0°C u prisutnosti anizola (2 ml). Nakon isparavanja HF, ostatak se ispire eterom, filtrira i ekstrahira sa DMF. DMF filtrat (75 ml) se koncentrira do suhoće i triturira sa H20. Netopljivi produkt se filtrira i suši kako bi se dobilo spoj iz naslova.

Faza C: [N-Glutaril(OFm)-(4-trans-L-Hip)]--Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Doks

Gore pripravljeni međuspoj iz faze B (1,33 g, 1,27 mmol) otapa se u DMSO (6 ml) i DMF-u (69 ml). Otopini se dodaje doksorubicin hidroklorid, 599 mg (1,03 mmol) te zatim 376 μl diizopropiletilamina (2,16 mmol). Promiješana otopina se hladi (0°C) te se dodaje 324 jal difenilfosforil azida (1,5 mmol). Nakon 30 minuta, dodaje se još 324 μl DPPA i pH se prilagođava na -7,5 (pH papir) sa diizopropiletilaminom (DIEA). Pomoću DIEA, iduća 3 sata pH ohlađene reakcije (0°C) održava se na -7,5 te se reakcija preko noći miješa na 0-4°C. Nakon 18 sati, reakcija (za koju je analitička HPLC, sustav A, pokazala da je završena) koncentrirana je kako bi se dobilo spoj iz naslova u obliku ulja.

Faza D: N-Glutaril-(4-trans-L-Hip)]--Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Doks

Gornji produkt iz faze C otapa se u DMF (54 ml), hladi (0°C) i dodaje se 14 ml piperidina. Otopina se koncentrira do suhoće i pročišćava preparativnom HPLC. (A=0,1% NH4OAc-H2O; B=CH3CN.) Sirovi (nepročišćeni) produkt se otapa u 100 ml 80% pufera A, filtrira i pročišćava na C-18 reverznoj fazi HPLC radijalne kompresijske kolone (Waters, Delta-Peak, 15 μ, 100 A). Fazni gradijent od 80% A do 67% A koristi se kod brzine protoka od 75 ml/min (uv=214 nm). Homogene frakcije produkta (ocijenjene pomoću HPLG, sustav A) se razdijele i osuše zamrzavanjem. Produkt je još pročišćen pomoću gornje HPLC kolone. Pufer A=15% octena kiselina-H2O; B=15% octena kiselina-metanol. Produkt se otapa u 100 ml 20% B/80% A pufera i pročišćava. Fazni gradijent od 20% B do 80% B koristi se pri brzini protoka od 75 ml/min (uv=214 nm). Homogene frakcije produkta (ocijenjene pomoću HPLC, sustav A) se razdijele i osuše zamrzavanjem iz H2O kako bi se dobilo pročišćeni produkt iz naslova.

HPLC uvjeti, sustav A

Kolona: Vycac 15 cm, #218TP5415, C18

Protok: 1,5 ml/min

Dužina vala: 214 nm, 254 nm

Retencijska vremena : Doksorubicin=13,66 min.

[N-Glutaril(OFm)-(4-trans-L-Hip)]--Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-OH=19,66 min.

[N-Glutaril(OFm)-(4-trans-L-Hip)]--Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Doks=24,8 min.

[N-Glutaril(4-trans-L-Hip)]--Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Doks=18,3 min.

ES Masena spektrografija

visoke rezolucije: 1418,78 (Na+)

HPLC: Sustav A,

Kolona: Vycac 15 cm, #218TP5415, C18

Eluent: Gradijent 95:5 (A:B) do 5:95 (A:B) tijekom 45 minuta

A=0f 1% TFA/H20, B=0f 1% TFA/Acetonitril Protok: 1,5 ml/min

Dužina vala: 214 nm, 254 nm Retencijsko vrijeme: 18,3 min

Kompozicijska analiza aminokiselina1:

Teorija Pronađeno

(1) 0,99

Ser(2) 2,02

Chg(1) 1,00

Gln2(1) 1,01 (kao Glu)

Hip (1) 0,99

Leu(1) 1,00

Sadržaj peptida: 0,682 μmol/mg

Bilješka: 120 hr., 100°C, 6N HCl

2Gln konvertirano u Glu

Tablica 4 prikazuje druge konjugate peptida i doksorubicina koji su pripravljeni postupcima prikazanim u Primjeru 4, ali korištenjem odgovarajućih ostataka aminokiselina i blokiranjem acilaciju grupe.

TABLICA 4

[image]

PRIMJER 5

Priprava (4-trans-L-Hip)--Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Doks-(SEQ.ID.NO.:70)

[image]

Faza A: Fmoc(4-trans-L-Hip(Bzn)--Ser(BznChg-Gln-Ser(Bzl)Leu-PAM smola

Započevši sa 0,5 mmol (0,67g) Boc-Leu-PAM smole, zaštićeni (protektirani) peptid se sintetizira na peptidnom sintetizeru 430A ABI. Protokol koristi četverostruki višak (2 mmol) od svake od sljedećih zaštićenih aminokiselina: Boc-Ser(Bzl), Boc-Gln, Boc-Chg, Boc-Ala, N-Boc-(4-trans-L-Hip(Bzl)). Vezanje se postiže pomoću DCC i HOBT aktivacije u metil-2-pirolidinonu. Fmoc-OSu (sukcinamidil ester Fmoc-a) koristi se za uvođenje zaštitne grupe N-kraja. Odstranjenje Boe grupe izvodi se pomoću 50% TFA u metilen kloridu i TFA sol se neutralizira sa diizopropiletilaminom. završetku sinteze peptidna smola se suši kako bi se dobilo međuspoj (intermedijer) iz naslova.

Faza B: Fmoc(4-trans-L-Hip)--Ser"Chg-Gln-Ser-Leu-OH

Zaštićena (protektirana) peptidna smola iz faze A, 1,1g, obrađuje se sa HF (20 ml) l sat na 0°C u prisutnosti anizola (2 ml). Nakon isparavanja HF, ostatak se ispire eterom, filtrira i ekstrahira sa H2O (200 ml). Filtrat se liofilizira kako bi se dobilo međuspoj.

Faza C: Fmoc(4-trans-L-Hip)--Ser-Chjg-Gln-Ser-Leu-Doks

Međuspoj iz faze B, 0,274 g, otapa se u DMSO (10 ml) i razrijeđuje sa DMF(10 ml). Otopini se dodaje doksorubicin hidroklorid, 104 mg te zatim 62 μl diizopropiletilamina. Promiješana otopina se hladi (0°C) te se dodaje 56 μl difenilfosforil azida. Nakon 30 minuta, dodaje se još 56 μl DPPA i pH se prilagođava na -7,5 (pH papir) sa diizopropiletilaminom (DIEA). Pomoću DIEA, pH ohlađene reakcije (0°C) održava se na -7,5. Nakon 4 sata, reakcija (za koju je analitička HPLC, sustav A, pokazala da daje završena) koncentrirana je u ulje. HPLC uvjeti, sustav A

Faza D: (4-trans-L-Hipl)--Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Doks

Gornji produkt iz faze C otapa se u DMF (10 ml), ohladi (0°C) i dodaje se 4 ml piperidina. Otopina se koncentrira do suhoće i pročišćava preparativnom HPLC. (A=0,1% NH4OAc-H2O; B=CH3CN.) Sirovi (nepročišćeni) produkt se otapa u 100 ml 90% pufera A, filtrira i pročišćava na C-18 reverznoj fazi HPLC radijalne kompresijske kolone (Waters, Delta-Peak, 15 μ, 100 A). Gradijent faze od 90% A do 60% A koristi se kod brzine protoka od 75 ml/min (uv=214 nm). Homogene frakcije produkta (ocijenjene pomoću HPLC, sustav A) se podijele i osuše zamrzavanjem.

HPLC uvjeti, sustav A

Kolona: Vycac 15 cm, #218TP5415, C18

Protok: 1,5 ml/min

Dužina vala: 214 nm, 254 nm

Retencijska vremena: Doksorubicin=13,66 min.

Fmoc(4-trans-L-Hip)--Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-OH = 18,6 min.

Fmoc(4-trans-L-Hip)--Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Doks = 23,8 min

(4-trans-L-Hip)--Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Doks = 17,6 min

Molekulska formula: C60H83N9O22

Molarna težina: 1281,65

ES Masena spektrografija

visoke rezolucije: 1282,59 (MH+)

HPLC: Sustav A

Kolona: Vycac 15 cm, #218TP5415, C18

Eluent: Gradijent 95:5 (A:B) do 5:95 (A:B) tijekom 45 minuta A=0,1% TFA/H20, B=0,1% TFA/Acetonitril

Protok: 1,5 ml/min

Dužina vala: 214 nm, 254 nm

Retencijsko vrijeme: 17,6 min.

Kompozicijska analiza aminokiselina1:

Teorija Pronađeno

(1) 1,00

Ser(2) 1,94

Chg(1) 0,94

Gln2(1) 1,05 (kao Glu)

Hip (1) 0,96

Leu(1) 1,03

Sadržaj peptida: 0,690 μmol/mg

Bilješka: 120 hr., 100°C, 6N HCl

2Gln konvertirano u Glu

PRIMJER 6

Ocjena prepoznavanja konjugata oligopeptida i doksorubicina od strane slobodnog PSA:

Konjugati pripravljeni na način opisan u primjerima 3-5 pojedinačno se otapaju u PSA digestijskom puferu (12 mM tris(hidroksimetil)-aminometan pH 8,0, 25 mM NaCl, 0,5 mM CaCl2) i otopini se dodaje PSA u molarnom odnosu od 100 naprama 1. Alternativno, PSA digestijski pufer koji se koristi je 50 mM tris(hidroksimetil)aminometan pH 7,4, 140 mM NaCl. Reakcija se zaustavlja nakon različitih reakcijskih vremena dodavanjem (adicijom) trifluoroctene kiseline (TFA) do konačnih 1% (volumen/volumen). Alternativno se reakcija zaustavlja sa 10 mM ZnCl2. Zaustavljena reakcija se analizira sa HPLC na reverzno-faznoj C-18 koloni korištenjem vodenog (akvoznog) 0,l%TFA/acetonitril gradijenta. Rezultati ocjene prikazani su u tablici 3. Tablica 3 prikazuje količinu vremena (u minutama) koja je potrebna za 50% cijepanje određenih konjugata oligopeptida i citotoksičnih agensa sa enzimski aktivnim slobodnim PSA. Ako nikakva sol nije indicirana za konjugat, ispituje se slobodni konjugat. Konjugati oligopeptida i citotoksičnog agensa opisani u primjerima 4 i 5 ocijenjeni su za količinu vremena (u minutama) koja je potrebna za 50% cijepanje oligopeptida sa enzimski aktivnim slobodnim PSA i 50% cijepanje se za te konjugate odvilo u manje od 2 sata.

PRIMJER 7

In vitro test (esej) citotoksičnost peptidilnih derivata doksorubicina:

Citotoksičnosti konjugata oligopeptida i doksorubicina koji se mogu cijepati, pripravljenih na način opisan u primjerima 3 i 4, u odnosu na niz stanica za koje se zna da ih ubija nemodificirani doksorubicin, ispitani su Alamar Blue tesom (esejom). Specifično, stanične kulture LNCap stanica prostatnog tumora (koje eksprimiraju enzimski aktivan PSA) ili DuPRO stanice u pločama sa 96 udubina razrijeđene su sa medijem (Dulbeccov minimalni esencijalni medij-α[MEM-α]) koji sadrži različite koncentracije određenog konjugata (konačni volumen ploče s udubljenjima od 200 μl). Stanice se inkubiraju 3 dana na 37°C, u udubine ploče za testiranje dodaje se 20 μl Alamar Blue-a. Stanice su dalje inkubirane i udubine ploče za testiranje su očitane na EL-310 ELISA čitaču na dualnim valnim dužinama od 570 i 600 nm na 4 i 7 sati nakon dodavanja Alamar Blue-a. Ispitan je relativni postotak održivosti u različitim koncentracijama konjugata, a onda izračunat u odnosu na kontrolne (ne konjugatne) kulture. Neki rezultati ovog ispitivanja (ocjenjivanja) prikazani su u tablici 5. Ako nikakva sol nije indicirana, ispituje se slobodni konjugat.

TABLICA 5

[image]

PRIMJER 8

In vivo učinkovitost konjugata peptidila i citotoksičnog agensa

LNCaP.FGC ili DuPRO-1 stanice se tripsiniziraju, resuspendiraju u mediju za rast i centrifugiraju 6 minuta na 200 xg. Stanice se resuspendiraju u MEM-α bez seruma i izbroje. Odgovarajući volumen ove otopine koji sadrži željeni broj stanica se zatim prebaci u čunjastu epruvetu, centrifugira kao ranije i resuspendira u odgovarajućem volumenu hladne smjese MEM-α Matrigela (Collaborative Biomedical Products, ). omjera 1:1. Suspenzija se drži na ledu do inakulacije životinja.

Harlan Sprague Dawley pokusni miš, mužjak (star 10-12 tjedana) se veže bez primjene anestezije te im se u lijevi bok inokulira 0,5 ml stanične suspenzije subkutanom injekcijom koristeći iglu 22G. Mišu se daje ili oko 5x105 DuPRO stanica ili 1,5x107 LNCap.FGC stanica.

Sljedeći inokulaciju stanicama tumora miševe se obrađuje prema jednom od dva protokola:

Protokol A:

Jedan dan nakon inokulacije stanica životinje se doziraju interperitonealnom primjenom sa 0,1-0,5 ml volumena ispitivanog konjugata, doksorubicina ili kontrolnog vehikula (sterilna voda). Doze konjugata i doksorubicina su u početku u maksimalnoj, ne-smrtonosnoj količini, no mogu kasnije biti niže titrirane. Identične doze se primjenjuju tijekom 5 dana u intervalima od po 24 sata. Nakon 10 dana, miševima se uzimaju uzorci krvi te se određuje razina PSA u serumu. Slične razine serumskog PSA određuju se u intervalima od 5-10 dana. Na kraju 5,5 tjedana miševi se žrtvuju i mjere se težine svih nađenih tumora te se ponovno određuje serumski PSA. Težine životinja se određuju na početku i kraju testa (eseja).

Protokol B:

Deset dana nakon inokulacije stanica, životinjama se uzimaju uzorci krvi i određuju se razine serumskog PSA. Zatim se životinje grupiraju prema njihovim razinama serumskog PSA. 14 -15 dana nakon inokulacije stanica, životinje se dozira interperitonealnom primjenom 0,1-0,5 ml volumena ispitivanog konjugata, doksorubicina ili kontrolnog vehikula (sterilna voda). Doze konjugata i doksorubicina su u početku u maksimalnoj, ne-smrtonosnoj količini, no mogu kasnije biti niže titrirane. Identične doze se primjenjuju tijekom 5 dana u intervalima od po 24 sata. Razine serumskog PSA određuju se u intervalima od 10-15 dana. Na kraju 5,5 tjedana miševi se žrtvuju i mjere se težine svih nađenih tumora te se ponovno određuje serumski PSA. Težine životinja se mjere na početku i kraju testa.

Protokol C:

Jedan dan nakon inokulacije stanica životinje se doziraju interperitonealnom primjenom sa 0,1-0,5 ml volumena ispitivanog konjugata, doksorubicina ili kontrolnog vehikula (sterilna voda). Doze konjugata i doksorubicina su u početku u maksimalnoj, ne-smrtonosnoj količini, no mogu kasnije biti niže titrirane. Identične doze se primjenjuju kontinuirano tijekom 5 tjedana u intervalima od 7 dana. Razine serumskog PSA određuju se neposredno prije ili u vrijeme žrtvovanja miševa. Na kraju 5,5 tjedana miševi se žrtvuju i mjere se težine svih nađenih tumora te se ponovno određuje serumski PSA. Težine životinja se određuju na početku i kraju testa (eseja).

PRIMJER 9

In vitro određivanje proteolitičkog cijepanja konjugata od endogene ne-PSA proteaze

Faza A: Priprava proteolitičkih ekstrakta tkiva

Svi postupci izvode se na 4°C. Odgovarajuće životinje se žrtvuju, a važna tkiva se izoliraju i pohranjuju u tekućem dušiku. Smrznuto tkivo se pretvori u prah pomoću mužara i tučka te se tkivo u praškastom stanju prebaci u Potter-Elvejeh homogenizer i dodaju se 2 volumena Pufera A (50 mM Tris koji sadrži 1,15% KCl, pH 7,5). Zatim se tkivo razbija sa 20 udaraca, prvo koristeći slobodnije podešen tučak, a zatim usko podešen tučak. Homogenat se centrifugira na 10,000 x g u ljuljajućem "bucket" rotoru (HB4-5), čestice (peleti) se odbacuju i supernatant se centrifugira na 100,000x g (Ti 70). Supernatant (citosol) se sprema. Čestice (peleti) se resuspendiraju u Puferu B(10 mM EDTA koji sadrži 1,15% KCl, pH 7,5) koristeći isti volumen koji se koristio gore, kod Pufera A. Suspenzija se homogenizira u "dounce" homogenizatoru, a otopina se centrifugira na 100,000 x g. Supernatant se baca i peleti (membranski) se resuspendiraju u Puferu C (10 mM pufer kalijev fosfat koji sadrži 0,25 M saharoze, pH 7,4) koristeći 3/2 volumena koji se koristio gore i homogenizira sa "dounce" homogenizatorom.

Sadržaj proteina u dvije otopine (citosol i membrana) određuje se Bradfordovim esejom. Alikvoti eseja se zatim odstranjuju i zamrzavaju u smrznutom N2-Alikvoti se pohranjuju na -70°C.

Faza B: Test (esej) proteolitičkog cijepanja

Za svaku vremensku točku, u otopinu konačnog volumena od 200 mikrolitara u puferu (50 mM TRIS, 140 mM NaCl, pH 7,2) stavlja se 20 mikrograma konjugata peptida i doksorubicina i 150 mikrograma tkivnog proteina, pripravljenih na način opisan u Fazi A te kako je određeno Bradfordom u reakcijskom puferu. Testne reakcije provode se tijekom O, 30, 60, 120 i 180 minuta te se zatim odmah zaustavljaju u kipućoj vodi tijekom 90 sekundi. Reakcijski produkti se analiziraju HPLC-om pomoću VVDAC C18 15-centimetarsku kolonu u vodi/acetonitril (5% do 50% acetonitril tijekom 30 minuta).

[image]

Claims

1. Konjugat koristan za liječenje raka(karcinoma) prostate koji sadrži citotoksičan agens vezan za neki oligopeptid, naznačen time da oligopeptid sadrži niz aminokiselina kojeg slobodni prostata specifični antigen selektivno cijepa pri čemu je sredstvo vezanja kovalentna veza ili kemijski vezač, a dotičan niz aminokiselina sadrži najmanje jednu cikličku aminokiselinu sa hidrofilnim supstituentom; ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol.

2. Konjugat prema zahtjevu 1, naznačen time da citotoksični agens pripada razredu citotoksičnih agensa izabranih iz sljedećih razreda: a) antraciklinska porodica lijekova, b) vinka alkaloidni lijekovi, c) mitomicini, d) bleomicini, e) citotoksični nukleozidi, f) pteridinska porodica lijekova, g) diineni, h) estramustini, i) ciklofosfamidi, j) taksani i k) podofilotoksini, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli.

3. Konjugat prema zahtjevu 1 naznačen time daje citotoksični agens izabran iz sljedećih citotoksičnih agensa: a) doksorubicin, b) karminomicin, c) daunorubicin, d) aminopterin, e) metotreksat, f) metopterin, g) diklor-metotreksat h) mitomicin C, i) porfiromicin, j) 5-fluoruracil, k) 6-merkaptopurin, l) citozin arabinozid, m) podofilotoksin, n) etopozid, o) etopozid fosfat, p) melfalan, q) vinblastin, r) vinkristin, s) leurozidin, t) vindezin, u) estramustin, v) cisplatin, w) ciklofosfamid, x) taksol, i y) leurozin, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli.

4. Konjugat prema zahtjevu 2, naznačen time da je citotoksicni agens izabran iz doksorubicina ili vinblastina ili njihovih citotoksičnih derivata.

5. Konjugat prema zahtjevu 2, naznačen time da je citotoksicni agens doksorubicin ili njegov citotoksicni derivat.

6. Konjugat prema zahtjevu 1, naznačen time da oligopeptid sadrži oligomer izabran iz: a) HaaXaaSerTirGln/SerSer (SEQ.ID.NO.:1); b) HaaTirGln/SerSer (SEQ.ID.NO.:2); c) HaaXaaLizTirGln/SerSer (SEQ.ID.NO.:3); d) HaaXaaLizTirGln/SerSe (SEQ.ID.NO.:4); e) HaaXaahArgTirGln/SerSer (SEQ.ID.NO.:5); f) HaaXaahArgChaGln/SerSer (SEQ.ID.NO.:6); g) HaaXaaSerTirGln/SerXaa (SEQ.ID.NO.:7); h) HaaTirGln/SerXaa (SEQ.ID.NO.:8); i) HaaXaaSerChgGln/SerXaa (SEQ.ID.NO.:9); j) HaaChgGln/SerXaa (SEQ.ID.NO.:10); naznačen time da je Haa ciklička aminokiselina supstituirana sa hidrofilnim dijelom, Xaa je bilo koja aminokiselina, hArg je homoarginin, Cha je cikloheksilalanin i Chg je cikloheksilglicin.

7. Konjugat prema zahtjevu 1, naznačen time da oligopeptid sadrži oligomer izabran iz: a) HaaTirGln/SerSerSerLeu (SEQ.ID.NO.:11), b) HaaXaaSerTirGln/SerAla (SEQ.ID.NO.:12), c) AlaHaaXaaSerTirTir/Ser (SEQ.ID.NO.:13), d) AlaAsnHaaXaaSerTirGln/Ser (SEQ.ID.NO.:14), e) HaaXaaSerTirSln/SerSerTr (SEQ.ID.NO.:15), f) HaaTirGln/SerSerTr (SEQ.ID.NO.:16), g) HaaXaaSerTirGln/SerSerSer (SEQ.ID.NO.:17), h) HaaTirGln/SerSerSer (SEQ.ID.NO.:18), i) HaaXaaLizTirGln/SerSerSer (SEQ.ID.NO.:19), j) HaaXaahArgTirGln/SerSerSer (SEQ.ID.NO.:20), k) HaaXaaSerTirGln/SerSerteu (SEQ.ID.NO.:21), l) HaaTirGln/SerSerLeu (SEQ.ID.NO.:22), m) HaaXaaSerTirGln/SerLeu (SEQ.ID.NO.:23), n) HaaTirGIn/SerLeu (SEQ.ID.NO.:24), p) HaaXaaSerTirGln/SerNle (SEQ.ID.NO.:25), q) HaaTirGIn/SerNIe (SEQ.ID.NO.:26), r) HaaXaaSerTirGln/SerTIC (SEQ.ID.NO.:27), s) HaaTirGln/SerTIC (SEQ.ID.NO.:28), t) HaaXaaSerChgGln/SerLeu (SEQ.ID.NO.:29), u) HaaChgGln/SerLeu (SEQ.ID.NO.:30), v) HaaXaaSerChgGln/SerNle (SEQ.ID.NO.:31), w) HaaChgGln/SerNle (SEQ.ID.NO.:32), x) HaaXaaSerChgGln/SerTIC (SEQ.ID.NO.:33), y) HaaChgGln/SerTIC (SEQ.ID.NO.:34), z) hArgChgGln/SerLeu (SEQ.ID.NO.:35), aa) hArgTirGln/SerLeu (SEQ.ID.NO.:36),

8. Konjugat prema zahtjevu 1, naznačen time da oligopeptid sadrži oligomer izabran iz: a) 4-HipXaaSerTirGln/SerSer (SEQ.ID.NO.: 37), b) 4-HipXaaSerTirGln/SerAla (SEQ.ID.NO.: 38), c) Ala-4-HipXaaSerTirTir/Ser (SEQ.ID.NO.: 39), d) AlaAsn4-HipXaaSerTirGln/Ser (SEQ.ID.NO.: 40), e) 4-HipXaaSerTirGln/SerSerTr (SEQ.ID.NO.: 41), f) 4-HipTirGln/SerSerTr (SEQ.ID.NO.: 42), g) 4-HipXaaSerTirGln/SerSerSer (SEQ.ID.NO.: 43), h) 4-HipTirGln/SerSerSer (SEQ.ID.NO.: 44), i) 4-HipXaaLizTirGln/SerSerSer (SEQ.ID.NO.: 45), j) 4-HipXaahArgTirGln/SerSerSer (SEQ.ID.NO.: 46), k) 4-HipXaaSerTirGln/SerSerLeu (SEQ.ID.NO.: 47); l) 4-HipTirGln/SerSerLeu (SEQ.ID.NO.: 48); m) 4-HipXaaSerTirGln/SerLeu (SEQ.ID.NO.: 49); n) 4-HipTirGln/SerLeu (SEQ.ID.NO.: 50); p) 4-HipXaaSerTirGln/SerNle (SEQ.ID.NO.: 51); q) 4-HipTirGln/SerNle (SEQ.ID.NO.: 52); r) 4-HipXaaSerTirGln/SerTIC (SEQ.ID.NO.: 53); s) 4-HipTirGln/SerTIC (SEQ.ID.NO.: 54); t) 4-HipXaaSerChgGln/SerLeu (SEQ.ID.NO.: 55); u) 4-HipChgGln/SerLeu (SEQ.ID.NO.: 56); v) 4-HipXaaSerChgGln/SerNle (SEQ.ID.NO.: 57); w) 4-HipChgGln/SerNle (SEQ.ID.NO.: 58); x) 4-HipXaaSerChgGln/SerTIC (SEQ.ID.NO.: 59); y) 4-HipChgGln/SerTIC (SEQ.ID.NO.: 60); naznačen time da je 4-Hip 4-hidroksiprolin, Xaa je bilo koja aminokiselina, hArg je homoarginin, Cha je cikloheksilalanin i Chg je cikloheksilglicin.

9. Konjugat prema zahtjevu 1, naznačen time da je ciklička aminokiselina koja sadrži hidrpfilni supstituent izabrana iz: [image] naznačena time da: R5 je izabran iz HO- i C1-C6alkoksi; R6 je izabran iz vodika, halogena, C1-C6alkila, HO- i C1-C6alkoksi; i t je 3 ili 4.

10. Konjugat koristan u liječenju karcinoma prostate formule I: [image] naznačen time da: oligopeptid je oligopeptid koji slobodni prostata specifični antigen (PSA) selektivno prepoznaje te da je u stanju biti proteolitički cijepan enzimskom aktivnošću slobodnog prostata specifičnog antigena, naznačenog time da oligopeptid sadrži cikličku aminokiselinu formule: [image] i gdje je Oterminalni karbonil kovalentno vezan za amin doksorubicina; R je izabran iz a) vodika, b) -(C=O)Rla c) [image] d) [image] e) [image] R1 i R2 su neovisno izabrani iz: vodika, OH, C1-C6 alkila, C1-C6 alkoksi, C1-C6 aralkila i arila; Rla je C1-C6 alkil, hidroksilirani aril, polihidroksilirani aril ili aril; R 5je izabran iz HO- i C1-C6 alkoksi; R6 je izabran iz vodika, halogena, C1-C6 alkila, HO- i C1-C6 alkoksi; i nje 1, 2, 3 ili 4; p je nula ili cijeli broj između 1 i 100; q je 0 ili 1, pod uvjetom da ako je p nula, q je 1; r je cijeli broj između 1i 10; i s je 3 ili 4. ili njihova farmaceutski prihvatljiva sol.

11. Konjugat prema zahtjevu 10 naznačen time da: ciklička aminokiselina je: [image] R je izabran iz a) vodika, b) -(C=O)Rla, c) [image] d) [image] e) [image] f) [image] g) [image] R1 i R2 su neovisno izabrani iz: vodika, C1-C6 alkila i arila; Rla je C1-C6 alkil ili aril; n je 1, 2, 3 ili 4; n’ je 0, 1, 2 ili 3; p je nula ili cijeli broj između 1 i 14; q je 0 ili 1, pod uvjetom da ako je p nula, q je 1; r je cijeli broj između 1 i 10; i t je 3; ili njihov optički izomer ili farmaceutski prihvatljiva sol.

12. Konjugat prema zahtjevu 10 naznačen time da je oligopeptid neki oligomer koji sadrži niz aminokiselina izabran iz: a) 4-HipXaaSerTirGln/SerSer (SEQ.ID.NO.: 37), b) 4-HipXaaSerTirGln/SerAla (SEQ.ID.NO.: 38), c) Ala-4-HipXaaSerTirTir/Ser (SEQ.ID.NO.: 39), d) AlaAsn4-HipXaaSerTirGln/Ser (SEQ.ID.NO.: 40), e) 4-HipXaaSerTirGln/SerSerTr (SEQ.ID.NO.: 41), f) 4-HipTirGln/SerSerTr (SEQ.ID.NO.: 42), g) 4-HipXaaSerTirGln/SerSerSer (SEQ.ID.NO.: 43), h) 4-HipTirGln/SerSerSer (SEQ.ID.NO.: 44), i) 4-HipXaaLizTirGln/SerSerSer (SEQ.ID.NO.: 45), j) 4-HipXaahArgTirGln/SerSerSer (SEQ.ID.NO.: 46), k) 4-HipXaaSerTirGln/SerSerLeu (SEQ.ID.NO.: 47); l) 4-HipTirGln/SerSerLeu (SEQ.ID.NO.: 48); m) 4-HipXaaSerTirGln/SerLeu (SEQ.ID.NO.: 49); n) 4-HipTirGln/SerLeu (SEQ.ID.NO.: 50); p) 4-HipXaaSerTirGln/SerNle (SEQ.ID.NO.: 51); q) 4-HipTirGln/SerNle (SEQ.ID.NO.: 52); r) 4-HipXaaSerTirGln/SerTIC (SEQ.ID.NO.: 53); s) 4-HipTirGln/SerTIC (SEQ.ID.NO.: 54); t) 4-HipXaaSerChgGln/SerLeu (SEQ.ID.NO.: 55); u) 4-HipChgGln/SerLeu (SEQ.ID.NO.: 56); v) 4-HipXaaSerChgGln/SerNle (SEQ.ID.NO.: 57); w) 4-HipChgGln/SerNle (SEQ.ID.NO.: 58); x) 4-HipXaaSerChgGln/SerTIC (SEQ.ID.NO.: 59); y) 4-HipChgGln/SerTIC (SEQ.ID.NO.: 60); naznačen time da je 4-Hip 4-hidroksiprolin, Xaa je bilo koja aminokiselina, hArg je homoarginin, Cha je cikloheksilalanin i Chg je cikloheksilglicin; ili njihov optički izomer ili farmaceutski prihvatljiva sol.

13. Konjugat prema zahtjevu 12, naznačen time da: Xaa je alanin ili izoleucin; ili njihov optički izomer ili farmaceutski prihvatljiva sol.

14. Konjugat prema zahtjevu 10, naznačen time da je izabran iz: [image] pri čemu je X: [image] (SEQ.ID.NO.: 68), [image] (SEQ.ID.NO.: 69), [image] (SEQ.ID.NO.: 70), [image] (SEQ.ID.NO.: 71), [image] (SEQ.ID.NO.: 72), [image] (SEQ.ID.NO.: 73), [image] (SEQ.ID.NO.: 74), [image] ili njihov optički izomer ili farmaceutski prihvatljiva sol.

15. Konjugat prema zahtjevu 10, naznačen time da je: [image] ili njihov optički izomer ili farmaceutski prihvatljiva sol.

16. Konjugat prema zahtjevu 10, naznačen time da je: [N-Ac(4-trans-L-Hip)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Doks (SEQ.ID.NO.: 68) [image] ili njegov optički izomer ili farmaceutski prihvatljiva sol.

17. Konjugat prema zahtjevu 10 naznačen time da je: [image] ili njegov optički izomer ili farmaceutski prihvatljiva sol.

18. Konjugat prema Zahtjevu 10 naznačen time da je: [image] ili njegov optički izomer ili farmaceutski prihvatljiva sol.

19. Konjugat prema zahtjevu 1 formule II: [image] naznačen time da: oligopeptid je oligopeptid kojeg prostata specifični antigen (PSA) specifično prepoznaje te kojima ima svojstvo da se proteolitički cijepa enzimskim djelovanjem slobodnog prostata specifičnog antigena, te oligopeptid sadrži cikličku aminokiselinu formule: [image] XL je-NH-(CH2)u-NH- ii R je izabran iz a) vodika b) -(C=O)Rla, c) [image] d) [image] e) [image] R1 i R2 su neovisno izabrani iz: vodika, OH, C1-C6 alkila, C1-C6 alkoksi, C1-C6 aralkila i arila; Rla je C1-C6-alkil, hidroksilirani aril, polihidroksilirani aril ili aril, R19 je vodik, (C1-C3 alkil)-CO, ili klorosupstituiran (C1-C3 alkil)-CO; n je 1, 2, 3 ili 4; p je nula ili cijeli broj između 1 i 100; q je 0 ili 1, pod uvjetom da ako je p nula, q je 1; r je 1, 2 ili 3; t je 3 ili 4; u je 1,2, 3, 4 ili 5, ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol.

20. Konjugat prema zahtjevu 16 naznačen time da je izabran iz: [image] ili je njegova farmaceutski prihvatljiva sol ili optički izomer.

21. Konjugat prema zahtjevu 1 formule III: [image] naznačen time da: oligopeptid je oligopeptid kojeg prostata specifični antigen (PSA) specifično prepoznaje te kojima ima svojstvo da se proteolitički cijepa enzimskim djelovanjem slobodnog prostata specifičnog antigena, te oligopeptid sadrži cikličku aminokiselinu formule: [image] Rg i Rh su neovisno izabrani iz: vodika, C1-C6 alkila, -C1-C6 alkil-OH, -C1-C6 alkil-di-OH, - C1-C6 alkil-tri-OH i [image] pod uvjetom da barem jedan Rd i Re nije vodik ili C1-C6 alkil, ili Rg i Rh su kombinirani da tvore -CH2CH2OCH2CH2- diradikal; R19 je vodik, (C1-C3 alkil)-CO, ili klorom zamijenjen (C1-C3 alkil)-CO; p je nula ili cijeli broj između 1 i 100; q je 0 ili 1, pod uvjetom da ako je p nula, q je 1; ili njihova farmaceutski prihvatljiva sol.

22. Konjugat prema zahtjevu 18 naznačen time da je: [image] ili njegova farmaceutski prihvatljiva soli ili optički izomer.

23. Farmaceutska smjesa naznačena time da sadrži farmaceutski nosač i u njemu raspršenu terapijski učinkovitu količinu spoja iz zahtjeva 1.

24. Farmaceutska smjesa naznačena time da sadrži farmaceutski nosač i u njemu raspršenu terapijski učinkovitu količinu spoja iz zahtjeva 10.

25. Farmaceutska smjesa naznačena time da sadrži farmaceutski nosač i u njemu raspršenu terapijski učinkovitu količinu spoja iz zahtjeva 14.

26. Farmaceutska smjesa naznačena time da sadrži farmaceutski nosač i u njemu raspršenu terapijski učinkovitu količinu spoja iz zahtjeva 17.

27. Postupak liječenja karcinoma prostate naznačen time da obuhvaća primjenu terapijski učinkovite količine smjese iz zahtjeva 23 na sisavca kojem je takvo liječenje potrebno.

28. Postupak liječenja karcinoma prostate naznačen time da obuhvaća primjenu terapijski učinkovite količine smjese iz zahtjeva 24 na sisavca kojem je takvo liječenje potrebno.

29. Postupak liječenja karcinoma prostate naznačen time da obuhvaća primjenu terapijski učinkovite količine smjese iz zahtjeva 25 na sisavca kojem je takvo liječenje potrebno.

30. Postupak liječenja karcinoma prostate naznačen time da obuhvaća primjenu terapijski učinkovite količine smjese iz zahtjeva 26 na sisavca kojem je takvo liječenje potrebno.

31. Postupak liječenja benigne hiperplazije prostate naznačen time da obuhvaća primjenu terapijski učinkovite količine smjese iz zahtjeva 23 na sisavca kojem je takvo liječenje potrebno.

32. Postupak liječenja benigne hiperplazije prostate naznačen time da obuhvaća primjenu terapijski učinkovite količine smjese iz zahtjeva 24 na sisavca kojem je takvo liječenje potrebno.

33. Postupak liječenja benigne hiperplazije prostate naznačen time da obuhvaća primjenu terapijski učinkovite količine smjese iz zahtjeva 25 na sisavca kojem je takvo liječenje potrebno.

34. Postupak liječenja benigne hiperplazije prostate naznačen time da obuhvaća primjenu terapijski učinkovite količine smjese iz zahtjeva 26 na sisavca kojem je takvo liječenje potrebno.

35. Farmaceutska smjesa naznačena time da je napravljena kombinacijom spoja l i farmaceutski prihvatljivog nosača.

36. Postupak dobivanja farmaceutske smjese naznačen time da se sastoji u kombiniranju spoja iz zahtjeva 1 i farmaceutski prihvatljivog nosača.