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DE69721810T2 - Konjugate zur behandlung von prostatakrebs - Google Patents

Konjugate zur behandlung von prostatakrebs Download PDF

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DE69721810T2
DE69721810T2 DE69721810T DE69721810T DE69721810T2 DE 69721810 T2 DE69721810 T2 DE 69721810T2 DE 69721810 T DE69721810 T DE 69721810T DE 69721810 T DE69721810 T DE 69721810T DE 69721810 T2 DE69721810 T2 DE 69721810T2
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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Für 1994 wird erwartet, daß Prostatakrebs bei 200.000 Männern in den USA diagnostiziert werden wird und 38.000 amerikanische Männer an dieser Krankheit sterben werden (Garnick, M. B. (1994), The Dilemmas of Prostate Cancer, Scientific American, April: 72–81). Somit ist Prostatakrebs das am häufigsten diagnostizierte Malignom (außer denjenigen der Haut) bei Männern in den USA und die zweithäufigste Ursache von krebsbedingten Toden (nach Lungenkrebs) in dieser Gruppe.
  • Prostataspezifisches Antigen (PSA) ist ein einkettiges Glycoprotein von 33 kD, welches fast ausschließlich von dem Human-Prostataepithel gebildet wird und in Niveaus von 0,5 bis 2,0 mg/ml in menschlicher Samenflüssigkeit vorkommt (Nadji, M., Taber, S. Z., Castro, A., et al. (1981), Cancer 48: 1229; Papsidero, L., Kuriyama, M., Wang, M., et al. (1981), JNCI 66: 37; Qui, S. D., Young, C. Y. F., Bihartz, D. L., et al. (1990), J. Urol. 144: 1550; Wang, M. C., Valenzuela, L. A., Murphy, G. P., et al. (1979), Invest. Urol. 17: 159). Die einzige Kohlenhydrateinheit ist mit dem Asparaginrest Nr. 45 verknüpft und macht 2 bis 3 kD der gesamten Molekülmasse aus. PSA ist eine Protease mit chymotrypsin-ähnlicher Spezifität (Christensson, A., Laurell, C. B., Lilja, H. (1990), Eur. J. Biochem. 194: 755–763). Es wurde gezeigt, daß PSA hauptverantwortlich ist für die Auflösung der bei der Ejakulation gebildeten Gelstruktur durch Proteolyse der Hauptproteine in dem das Sperma einschließenden Gel, Semenogelin I und Semenogelin II und Fibronectin (Lilja, H. (1985), J. Clin. Invest. 76: 1899; Lilja, H., Oldbring, J., Rannevik, G., et al. (1987), J. Clin. Invest. 80: 281; McGee, R. S., Herr, J. C. (1988), Biol. Reprod. 39: 499). Die PSA-vermittelte Proteolyse der gelbildenden Proteine erzeugt mehrere lösliche Semenogelin I- und Semenogelin II-Fragmente und lösliche Fibronectin-Fragmente unter Verflüssigung des Ejakulats und Freisetzung von zunehmend beweglichen Spermatozoen (Lilja, H., Laurell, C. B. (1984), Scand. J. Clin. Lab. Invest. 44: 447; McGee, R. S., Herr, J. C. (1987), Biol. Reprod. 37: 431). Darüber hinaus kann PSA IGFBP-3 (insulinähnlichen Wachstumsfaktor bindendes Protein 3) proteolytisch abbauen und erlaubt IGF, spezifisch das Wachstum von PSA-sekretierenden Zellen zu stimulieren (Cohen et al., (1992), J. Clin. Endo. & Meta. 75: 1046–1053).
  • PSA, das mit Alpha-1-Antichymotrypsin komplexiert ist, ist die überwiegende molekulare Form von Serum-PSA und kann bis zu 95% des nachgewiesenen Serum-PSA ausmachen (Christensson, A., Björk, T., Nilsson, O., et al. (1993), J. Urol. 150: 100–105; Lilja, H., Christensson, A., Dahlén, U. (1991), Clin. Chem. 37: 1618–1625; Stenman, U. H., Leinoven, J., Alfthan, H., et al. (1991), Cancer Res. 51: 222–226). Es wird angenommen, daß das Prostatagewebe (normales, gutartig-hyperplastisches oder malignes Gewebe) hauptsächlich die reife, enzymatisch aktive Form von PSA freisetzt, nachdem diese Form für die Komplexbildung mit Alpha-1-Antichymotrypsin erforderlich ist (Mast, A. E., Enghild, J. J., Pizzo, S. V., et al. (1991), Biochemistry 30: 1723–1730; Perlmutter, D. H., Glover, G. I., Rivetna, M., et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3753–3757). Deshalb wird angenommen, daß das PSA in der Mikroumgebung von PSA-sekretierenden Prostatazellen prozessiert und in seiner reifen enzymatisch aktiven Form, nicht mit irgendeinem inhibitorischen Molekül komplexiert, sekretiert wird. PSA bildet auch stabile Komplexe mit Alpha-2-Makroglobulin, nachdem dies jedoch zu einer Verkapselung des PSA und vollständigem Verlust der PSA-Epitope führt, ist die Bedeutung dieser Komplexbildung in vivo unklar. Eine freie, nicht-komplexierte Form von PSA stellt eine Nebenfraktion des Serum-PSA dar (Christensson, A., Björk, T., Nilsson, O., et al. (1993), J. Urol. 150: 100–105; Lilja, H., Christensson, A., Dahlén, U. (1991), Clin. Chem. 37: 1618–1625). Die Größe dieser Form von Serum-PSA ist ähnlich derjenigen von PSA in Samenflüssigkeit (Lilja, H., Christensson, A., Dahlén, U. (1991), Clin. Chem. 37: 1618–1625), es ist jedoch noch unbekannt, ob die freie Form von Serum-PSA ein Zymogen, eine intern gespaltene, inaktive Form von reifem PSA, oder ein PSA, welches Enzymaktivität zeigt, sein kann. Es erscheint jedoch unwahrscheinlich, daß die freie Form von Serum-PSA Enzymaktivität zeigt, da es in Serum im Vergleich mit den nachgewiesenen Serumniveaus der freien 33-kD-Form von PSA einen beträchtlichen (100- bis 1000fachen) molaren Überschuß an sowohl nicht-umgesetztem Alpha-1-Antichymotrypsin als auch Alpha-2-Makroglobulin gibt (Christensson, A., Björk, T., Nilsson, O., et al. (1993), J. Urol. 150: 100– 105; Lilja, H., Christensson, A., Dahlén, U. (1991), Clin. Chem. 37: 1618–1625).
  • Serummessungen von PSA sind zur Überwachung der Behandlung von Adenokarzinomen der Prostata von Nutzen (Duffy, M. S. (1989), Ann. Clin. Biochem. 26: 379–387; Brawer, M. K. und Lange, P. H. (1989), Urol. Suppl. 5: 11–16; Hara, M. und Kimura, H. (1989), J. Lab. Clin. Med. 113: 541–548), obwohl höhere als normale Serumkonzentrationen von PSA auch bei gutartigen Prostata-Hyperplasien und nach einem chirurgischen Trauma der Prostata berichtet wurden (Lilja, H., Christensson, A., Dahlén, U. (1991), Clin. Chem. 37: 1618–1625). Von Prostata-Metastasen ist ebenfalls bekannt, daß sie immunologisch reaktives PSA sekretieren, da Serum-PSA bei Patienten mit Prostatektomie, die einen breit gestreuten metastatischen Prostatakrebs aufweisen, in hohen Niveaus nachweisbar ist (Ford, T. F., Butcher, D. N., Masters, R. W., et al. (1985), Brit. J. Urology 57: 50–55). Deshalb sollte eine zytotoxische Verbindung, welche durch die proteolytische Aktivität von PSA aktiviert werden könnte, prostatazell-spezifisch sowie spezifisch für PSA-sekretierende Prostata-Metastasen sein.
  • Die Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung einer zur Behandlung von Prostatakrebs geeigneten neuen Antitumor-Zusammensetzung, die Oligopeptide, welche selektiv von freiem prostataspezifischem Antigen (PSA) proteolytisch gespalten werden und welche eine cyclische Aminosäure mit einem hydrophilen Substitutienten umfassen, in Konjugation mit einem zytotoxischen Agens umfaßt.
  • Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Behandlung von Prostatakrebs, welches die Verabreichung der neuen Antitumor-Zusammensetzung umfaßt.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Es werden chemische Konjugate offenbart, die Oligopeptide mit Aminosäuresequenzen, welche selektiv von freiem prostataspezifischem Antigen (PSA) proteolytisch gespalten werden und welche eine cyclische Aminosäure mit einem hydrophilen Substituenten einschließen, und bekannte zytotoxische Agenzien umfassen. Solche Konjugate eignen sich zur Behandlung von Prostatakrebs und gutartiger Prostata-Hyperplasie (BPH).
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue Antitumor-Zusammensetzungen, welche für die Behandlung von Prostatakrebs geeignet sind. Solche Zusammensetzungen umfassen die Oligopeptide direkt oder über einen chemischen Linker kovalent an eine zytotoxisches Agens gebunden. Die Oligopeptide sind aus Oligomeren ausgewählt, welche selektiv von dem freien prostataspezifischen Antigen (PSA) erkannt werden und in der Lage sind, von der enzymatischen Aktivität des freien prostataspezifischen Antigens proteoytisch gespalten werden. Eine solche Kombination eines Oligopeptids und zytotoxischen Agens kann als Konjugat bezeichnet werden.
  • Die Konjugate der vorliegenden Erfindung sind ferner gekennzeichnet durch die Inkorporation einer cyclischen Aminosäure mit einem hydrophilen Substituenten als Teil der Oligopeptide, wobei die cyclische Aminosäure zur Wasserlöslichkeit des Konjugats beiträgt. Beispiele solcher hydrophilen cyclischen Aminosäuren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, hydroxylierte, polyhydroxylierte und alkoxylierte Prolin- und Pipecolinsäure-Gruppierungen.
  • Idealerweise ist die zytotoxische Aktivität des zytotoxischen Agens weitgehend reduziert oder fehlt, wenn das Oligopeptid, welches die proteolytische PSA-Spaltstelle enthält, direkt oder über einen chemischen Linker an das zytotoxische Agens gebunden und intakt ist.
  • Idealerweise nimmt auch die zytotoxische Aktivität des zytotoxischen Agens nach proteolytischer Spaltung des verknüpften Oligopeptids an der Spaltstelle signifikant zu oder kehrt zu der Aktivität des unmodifizierten zytotoxischen Agens zurück.
  • Ferner ist es bevorzugt, daß das Oligopeptid aus Oligopeptiden ausgewählt ist, welche in Gegenwart von proteolytischen Nicht-PSA-Enzymen im Vergleich zur Spaltung der Oligopeptide in Gegenwart von freiem enzymatisch aktivem PSA nicht gespalten werden oder mit einer viel langsameren Geschwindigkeit gespalten werden.
  • Aus den obigen Gründen ist es wünschenswert, daß das Oligopeptid eine kurze Peptidsequenz, vorzugsweise weniger als 10 Aminosäuren, umfaßt. Am meisten bevorzugt umfaßt das Oligopeptid sieben oder sechs Aminosäuren. Nachdem das Konjugat vorzugsweise eine kurze Aminosäuresequenz umfaßt, kann die Löslichkeit des Konjugats in größerem Maße durch den im allgemeinen hydrophoben Charakter der Komponente des zytotoxischen Agens beeinflußt werden. Deshalb werden die hydrophilen Substituenten auf der cyclischen Aminosäure der vorliegenden Konjugate so gewählt, daß sie einen solchen hydrophoben Beitrag durch das zytotoxische Agens ausgleichen oder verringern.
  • Obwohl es zur Realisierung dieses Aspekts der Erfindung nicht erforderlich ist, ist eine bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung ein Konjugat, bei dem das Oligopeptid und der chemische Linker, falls vorhanden, von dem zytotoxischen Agens durch die proteolytische Aktivität des freien PSA und etwaiger anderer nativer proteolytischer Enzyme, die in der Gewebenachbarschaft vorliegen, abgespalten wird, wodurch das zytotoxische Agens oder ein zytotoxisches Agens, welches einen Teil der Oligopeptid/Linker-Einheit behält, jedoch zytotoxisch bleibt, der physiologischen Umgebung am Ort der proteolytischen Spaltung präsentiert wird. Pharmazeutisch annehmbare Salze der Konjugate sind ebenfalls eingeschlossen.
  • Es versteht sich, daß das Oligopeptid, welches mit dem zytotoxischen Agens konjugiert ist, sei es über eine direkte kovalente Bindung oder über einen chemischen Linker, nicht das Oligopeptid sein braucht, welches am besten von freiem PSA erkannt wird und am leichtesten von freiem PSA proteolytisch gespalten wird. Somit wird das Oligopeptid, welches zur Inkorporation in einer solchen Antitumor-Zusammensetzung ausgewählt wird, sowohl wegen seiner selektiven proteolytischen Spaltung durch freies PSA als auch wegen der zytotoxischen Aktivität des Konjugats von zytotoxischem Agens und proteolytischem Rest (oder, was als Idealfall betrachtet wird, des unmodifizierten zytotoxischen Agens), welches das Ergebnis einer solchen Spaltung ist, ausgewählt werden. Der Begriff „selektiv", wie in Verbindung mit der proteolytischen PSA-Spaltung verwendet, bedeutet eine größere Spaltungsgeschwindigkeit einer Oligopeptid-Komponente der vorliegenden Erfindung durch freies PSA im Vergleich zur Spaltung eines Oligopeptids, welches eine statistische Sequenz von Aminosäuren umfaßt. Deshalb ist die Oligopeptid-Komponente der vorliegenden Erfindung ein bevorzugtes Substrat von freiem PSA. Der Begriff „selektiv", gibt auch an, daß das Oligopeptid zwischen zwei spezifischen Aminosäuren in dem Oligopeptid durch freies PSA proteolytisch gespalten wird.
  • Die Oligopeptid-Komponenten der vorliegenden Erfindung werden selektiv von dem freien prostataspezifischen Antigen (PSA) erkannt und sind in der Lage, von der enzymatischen Aktivität des freien prostataspezifischen Antigens proteolytisch gespalten zu werden. Solche Oligopeptide umfassen ein Oligomer, ausgewählt aus:
    Figure 00050001
    wobei Haa eine cyclische Aminosäure ist, die mit einer hydrophilen Gruppierung substituiert ist, Xaa irgendeine Aminosäure ist, hArg Homoarginin ist, Cha Cyclohexylalanin ist und Chg Cyclohexylglycin ist.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt das Oligopeptid ein Oligomer, welches ausgewählt ist aus:
    Figure 00050002
    Figure 00060001
  • In einer bevorzugteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt das Oligopeptid ein Oligomer, welches ausgewählt ist aus:
    Figure 00060002
    Figure 00070001
    wobei 4-Hyp 4-Hydroxyprolin ist, Xaa irgendeine Aminosäure ist, hArg Homoarginin ist, Cha Cyclohexylalanin ist und Chg Cyclohexylglycin ist.
  • Vorzugsweise ist Xaa in der bevorzugteren Ausführungsform aus Ala, Ser und Ile ausgewählt.
  • Der Begriff „Oligomere, welche eine Aminosäuresequenz umfassen", wie oben und an anderer Stelle in der detaillierten Beschreibung der Erfindung gebraucht, beschreibt Oligomere von etwa drei bis etwa 100 Aminosäureresten, welche in ihrer Aminosäuresequenz die beschriebene spezifische Aminosäuresequenz einschließen und deshalb innerhalb der beschriebenen Aminosäuresequenz von freiem PSA proteolytisch gespalten werden. Vorzugsweise weist das Oligomer 5 bis 10 Aminosäurereste auf. So umfaßt beispielsweise das folgende Oligomer: hArgSer-4-HypChgGln|SerLeu (SEQ-ID-Nr. 61) die Aminosäuresequenz: 4-HypChgGln|SerLeu (SEQ-ID-Nr. 56) und würde deshalb von der vorliegenden Erfindung umfaßt werden.
  • Ein Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Peptidchemie würde unschwer erkennen, daß bestimmte Aminosäuren in einem biologisch aktiven Oligopeptid durch andere homologe, isostere und/oder isoelektronische Aminosäuren ersetzt werden können, wobei die biologische Aktivität des ursprünglichen Oligopeptids in dem modifizierten Oligopeptid erhalten bleibt. Bestimmte unnatürliche und modifizierte natürliche Aminosäuren können ebenfalls eingesetzt werden, um die entsprechende natürliche Aminosäure in den Oligopeptiden der vorliegenden Erfindung zu ersetzen. Somit kann beispielsweise Tyrosin durch 3-Iodtyrosin, 2-Methyltyrosin, 3-Fluortyrosin, 3-Methyltyrosin und dgl. ersetzt werden. Ferner kann beispielsweise Lysin durch N'-(2-Imidazolyl)lysin und dgl. ersetzt werden. Die folgende Liste von Aminosäureaustauschen ist beispielhaft und nicht beschränkend zu verstehen:
    Ursprüngliche Aminosäure Ersatz-Aminosäure(n)
    Ala Gly
    Arg Lys, Ornithin
    Asn Gln
    Asp Glu
    Glu Asp
    Gln Asn
    Gly Ala
    Ile Val, Leu, Met, Nle
    Leu Ile, Val, Met, Nle
    Lys Arg, Ornithin
    Met Leu, Ile, Nle, Val
    Ornithin Lys, Arg
    Phe Tyr, Trp
    Ser Thr
    Thr Ser
    Trp Phe, Tyr
    Tyr Phe, Trp
    Val Leu, Ile, Met, Nle
  • So können beispielsweise die folgenden Oligopeptide nach Techniken synthetisiert werden, die Durchschnittsfachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt sind, und es ist von ihnen zu erwarten, daß sie von freiem PSA proteolytisch gespalten werden, wenn sie in einem Konjugat der Erfindung inkorporiert sind:
    Figure 00090001
  • Der Einschluß des Symbols „|'" in eine Aminosäuresequenz zeigt die Stelle innerhalb der Sequenz an, an der das Oligopeptid durch freies PSA proteolytisch gespalten wird.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können Asymmetriezentren aufweisen und als Racemate, racemische Mischungen und als individuelle Diastereomere vorliegen, wobei alle möglichen Isomere, einschließlich optischer Isomere, in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind. Soweit nicht anders angegeben, sind die angegebenen Aminosäuren so zu verstehen, daß sie die natürliche „L"-Stereokonfiguration aufweisen.
  • Die folgenden Abkürzungen werden in der Beschreibung und den Tabellen verwendet, um die angegebenen Aminosäuren und Gruppierungen zu bezeichnen:
    hR oder hArg: Homoarginin
    hY oder hTyr: Homotyrosin
    Cha: Cyclohexylalanin
    Amf: 4-Aminomethylphenylalanin
    DPL: 2-(4,6-Dimethylpyrimidinyl)lysin
    (Imidazolyl)K: N'-(2-Imidazolyl)lysin
    Me2PO3-Y: O-Dimethylphosphotyrosin
    O-Me-Y: O-Methyltyrosin
    TIC: 1,2,3,4-Tetrahydro-3-isochinolincarbonsäure
    DAP: 1,3-Diaminopropan
    TFA: Trifluoressigsäure
    AA: Essigsäure
    3PAL: 3-Pyridylalanin
    4-Hyp: 4-Hydroxyprolin
    Abu: Alpha-Aminobuttersäure
    Thi: Thienylalanin
  • Es ist im Stand der Technik wohl bekannt und versteht sich in der vorliegenden Erfindung, daß therapeutische Peptidyl-Agenzien wie die vorliegenden Oligopeptid-zytotoxisches Agens-Konjugate vorzugsweise die terminale Aminogruppierung eines Oligopeptid-Substituenten mit einer geeigneten Schutzgruppe, wie z. B. Acetyl, Benzoyl, Pivaloyl und dgl., geschützt aufweisen. Ein solcher Schutz der terminalen Aminogruppe verringert oder eliminiert den enzymatischen Abbau solcher therapeutischer Peptidyl-Agenzien durch die Wirkung von Aminopeptidasen, welche im Blutplasma von Warmblütlern vorliegen.
  • Solche Schutzgruppen umfassen auch hydrophile Blockierungsgruppen, welche auf Grundlage der Anwesenheit einer hydrophilen Funktionalität gewählt werden. Blockierungsgruppen, welche die Hydrophilizität der Konjugate erhöhen und somit die Wasserlöslichkeit der Konjugate erhöhen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, hydroxyliertes Alkanoyl, polyhydroxyliertes Alkanoyl, hydroxyliertes Aroyl, polyhydroxyliertes Aroyl, Polyethylenglycol, Glycosylate, Zucker und Kronenether. N-terminate, nicht in der Natur vorkommende Aminosäuregruppierungen können ebenfalls einen solchen enzymatischen Abbau durch Aminopeptidasen verringern.
  • Vorzugsweise ist die N-terminale Schutzgruppe ausgewählt aus
    • a) Acetyl;
      Figure 00100001
    worin:
    R1 und R2 unabhängig ausgewählt sind aus:
    • a) Wasserstoff,
    • b) unsubstituiertem oder substituiertem Aryl, unsubstituiertem oder substituiertem Heterocyclus, C3-C10-Cycloalkyl, C2-C6-Alkenyl, C2-C6-Alkinyl, Halogen, C1-C6- Perfluoralkyl, R3O-, R3C(O)NR3-, (R3)2NC(O)-, R3 2N-C(NR3)-, R4S(O)mNH, CN, NO2, R3C(O)-, N3, -N(R3)2 oder R4OC(O)NR3-,
    • c) unsubstituiertem C1-C6-Alkyl,
    • d) substituiertem C1-C6-Alkyl, wobei der Substituent auf dem substituiertem C1-C6-Alkyl aus unsubstituiertem oder substituiertem Aryl, einem unsubstituierten oder substituierten Heterocyclus, C3-C10-Cycloalkyl, C2-C6-Alkenyl, C2-C6-Alkinyl, R3O-, R4S(O)mNH, R3C(O)NR3-, (R3)2NC(O)-, R3 2N-C(NR3)-, CN, R3C(O)-, N3, -N(R3)2 und R4OC(O)-NR3- ausgewählt ist; oder

    R1 und R2 miteinander vereinigt sind, um -(CH2)S- zu bilden, worin eines der Kohlenstoffatome gegebenenfalls durch eine Gruppierung ersetzt ist, die aus O, S(O)m, -NC(O)-, NH und -N(COR4)- ausgewählt ist;
    R3 ausgewählt ist aus: Wasserstoff, Aryl, substituiertem Aryl, Heterocyclus, substituiertem Heterocyclus, C1-C6-Alkyl und C3-C10-Cycloalkyl;
    R4 ausgewählt ist aus: Aryl, substituiertem Aryl, Heterocyclus, substituiertem Heterocyclus, C1-C6-Alkyl und C3-C10-Cycloalkyl;
    m 0, 1 oder 2 ist;
    n 1, 2, 3 oder 4 ist;
    p 0 oder eine ganze Zahl zwischen 1 und 100 ist;
    q 0 oder 1 ist, vorausgesetzt, daß, wenn p 0 ist, q 1 ist;
    r eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist; und
    s 3, 4 oder 5 ist.
  • Vorzugsweise ist r 1, 2 oder 3.
  • Die Oligopeptide der vorliegenden Konjugate umfassen eine cyclische Aminosäure, die mit einer hydrophilen Gruppierung substituiert ist, zuvor durch den Begriff "Haa" dargestellt, welche auch durch die Formel:
    Figure 00110001
    dargestellt werden kann, worin:
    R5 aus HO- und C1-C6-Alkoxy ausgewählt ist;
    R6 aus Wasserstoff, Halogen, C1-C6-Alkyl, HO- und C1-C6-Alkoxy ausgewählt ist; und
    t 3 oder 4 ist.
  • Die Struktur
    Figure 00120001
    repräsentiert eine cyclische Amingruppierung mit 5 oder 6 Gliedern im Ring, z. B. ein cyclisches Amin, welches gegebenenfalls mit einem Phenylring oder Cyclohexylring kondensiert sein kann. Beispiele einer solchen cyclischen Amingruppierung umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die folgenden speziellen Strukturen:
    Figure 00120002
  • Die Konjugate der vorliegenden Erfindung können Asymmetriezentren aufweisen und als Racemate, racemische Mischungen und als individuelle Diastereomere vorliegen, wobei alle möglichen Isomere, einschließlich optischer Isomere, in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind. Wenn irgendeine Variable (z. B. Aryl, Heterocyclus, R3 etc.) mehr als einmal in irgendeinem Bestandteil vorkommt, ist deren Definition bei jedem Vorkommen unabhängig von jedem anderen Vorkommen. Beispielsweise repräsentiert HO(CR1R2)2-, HOCH2CH2-, HOCH2CH(OH)-, HOCH(CH3)CH(OH)- etc. Auch sind Kombinationen von Substituenten und/oder Variablen nur zulässig, falls solche Kombinationen zu stabilen Verbindungen führen.
  • „Alkyl" und der Alkylanteil von Aralkyl und ähnlichen Begriffen, wie hier verwendet, soll sowohl verzweigte als auch geradkettige gesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppen mit der angegebenen Anzahl von Kohlenstoffatomen einschließen; „Alkoxy" repräsentiert eine Alkylgruppe der angegebenen Anzahl von Kohlenstoffatomen, welche über eine Sauerstoffbrücke verbunden ist.
  • Wie hier verwendet, soll „Cycloalkyl" nicht-aromatische cyclische Kohlenwasserstoffgruppen mit der angegebenen Anzahl von Kohlenstoffatomen einschließen. Beispiele von Cycloalkylgruppen schließen Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl und dgl. ein.
  • „Alkenyl"gruppen schließen diejenigen Gruppen ein, welche die angegebene Anzahl von Kohlenstoffatomen und eine oder mehrere Doppelbindungen aufweisen. Beispiele von Alkenylgruppen schließen Vinyl, Allyl, Isopropenyl, Pentenyl, Hexenyl, Heptenyl, Cyclopropenyl, Cyclobutenyl, Cyclopentenyl, Cyclohexenyl, 1-Propenyl, 2-Butenyl, 2-Methyl-2-butenyl, Isoprenyl, Farnesyl, Geranyl, Geranylgeranyl und dgl. ein.
  • „Alkinyl"gruppen schließen diejenigen Gruppen mit der angegebenen Anzahl von Kohlenstoffatomen und einer Dreifachbindung ein. Beispiele von Alkinylgruppen schließen Acetylen, 2-Butinyl, 2-Pentinyl, 3-Pentinyl und dgl. ein.
  • „Halogen" oder „Halo", wie hier verwendet, bedeutet Fluor, Chlor, Brom und Iod.
  • Wie hier verwendet, sollen „Aryl" und der Arylanteil von Aralkyl und Aroyl irgendeinen stabilen monocyclischen oder bicyclischen Kohlenstoffring mit bis zu 7 Gliedern in jedem Ring bedeuten, wobei mindestens ein Ring aromatisch ist. Beispiele solcher Arylelemente schließen Phenyl, Naphthyl, Tetrahydronaphthyl, Indanyl, Biphenyl, Phenanthryl, Anthryl oder Acenaphthyl ein.
  • Der Begriff Heterocyclus oder heterocyclisch, wie hier verwendet, bedeutet einen stabilen 5- bis 7-gliedrigen monocyclischen oder stabilen 8- bis 11-gliedrigen bicyclischen heterocyclischen Ring, welcher entweder gesättigt oder ungesättigt ist und welcher aus Kohlenstoffatomen und ein bis vier Heteroatomen besteht, die aus der Gruppe, bestehend aus N, O und S, ausgewählt sind, und schließt jede bicyclische Gruppe ein, worin irgendeiner der oben definierten heterocyclischen Ringe mit einem Benzolring kondensiert ist. Der heterocyclische Ring kann mit irgendeinem Heteroatom oder Kohlenstoffatom verbunden sein, welches zur Bildung einer stabilen Struktur führt. Beispiele solcher heterocyclischen Elemente schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Azepinyl, Benzimidazolyl, Benzisoxazolyl, Benzofurazanyl, Benzopyranyl, Benzothiopyranyl, Benzofuryl, Benzothiazolyl, Benzothienyl, Benzoxazolyl, Chromanyl, Cinnolinyl, Dihydrobenzofuryl, Dihydrobenzothienyl, Dihydrobenzothiopyranyl, Dihydrobenzothiopyranylsulfon, Furyl, Imidazolidinyl, Imidazolinyl, Imidazolyl, Indolinyl, Indolyl, Isochromanyl, Isoindolinyl, Isochinolinyl, Isothiazolidinyl, Isothiazolyl, Isothiazolidinyl, Morpholinyl, Naphthyridinyl, Oxadiazolyl, 2-Oxoazepinyl, Oxazolyl, 2-Oxopiperazinyl, 2-Oxopiperdinyl, 2-Oxopyrrolidinyl, Piperidyl, Piperazinyl, Pyridyl, Pyrazinyl, Pyrazolidinyl, Pyrazolyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl, Pyrrolidinyl, Pyrrolyl, Chinazolinyl, Chinolinyl, Chinoxalinyl, Tetrahydrofuryl, Tetrahydroisochinolinyl, Tetrahydrochinolinyl, Thiamorpholinyl, Thiamorpholinylsulfoxid, Thiazolyl, Thiazolinyl, Thienofuryl, Thienothienyl und Thienyl.
  • Wie hier verwendet, schließen die Begriffe „substituiertes C1-8-Alkyl", „substituiertes Aryl" und „substituierter Heterocyclus" Gruppierungen ein, die neben der Verknüpfungsstelle mit dem Rest der Verbindung 1 bis 3 Substituenten enthalten. Solche zusätzlichen Substituenten sind ausgewählt aus F, Cl, Br, CF3, NH2, N(C1-C6-Alkyl)2, NO2, CN, (C1-C6-Alkyl)O-, -OH, (C1-C6-Alkyl)S(O)m-, (C1-C6-Alkyl)C(O)NH-, H2N-C(NH)-, (C1-C6-Alkyl)C(O)-, (C1-C6-Alkyl)OC(O)-, N3, (C1-C6-Alkyl)OC(O)NH- und C1-C20-Alkyl.
  • Der Begriff „eine ganze Zahl zwischen 1 und 10" bedeutet die Zahlen 1 und 10 sowie die ganzen Zahlen zwischen diesen Zahlen. Der Begriff „eine ganze Zahl zwischen 1 und 100" bedeutet die Zahlen 1 und 100 sowie die ganzen Zahlen zwischen diesen Zahlen.
  • Wenn R1 und R2 miteinander kombiniert werden, um -(CN2)S zu bilden, umfassen die so definierten cyclischen Gruppierungen und heteroatom-enthaltenden cyclischen Gruppierungen folgende, sind jedoch nicht darauf beschränkt:
    Figure 00140001
  • Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „PEG" bestimmte polyethylenglycol-enthaltende Substituenten mit der genannten Anzahl von Ethylenoxy-Untereinheiten. Somit bedeutet der Begriff „PEG(2)":
    Figure 00140002
    und der Begriff „PEG(6)" bedeutet:
    Figure 00140003
  • Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „(2R)(2,3-Dihydroxypropionyl)" die folgende Struktur:
    Figure 00150001
  • Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „(2R, 3S) 2,3,4-Trihydroxybutanoyl" die folgende Struktur:
    Figure 00150002
  • Da die Konjugate der Erfindung zur Modifizierung einer gegebenen biologischen Reaktion eingesetzt werden können, soll das zytotoxische Agens nicht als auf klassische chemische therapeutische Agenzien beschränkt angesehen werden. Beispielsweise kann das zytotoxische Agens ein Protein oder ein Polypeptid sein, das eine gewünschte biologische Aktivität besitzt. Solche Proteine können beispielsweise ein Toxin, wie z. B. Abrin, Ricin A, Pseudomonas-Exotoxin oder Diphtherie-Toxin, ein Protein, wie z. B. Tumornekrosefaktor, α-Interferon, β-Interferon, Nervenwachstumsfaktor, Thrombozyten-Wachstumsfaktor, Gewebeplasminogenaktivator, oder Modifikatoren biologischer Reaktionen, wie z. B. Lymphokine, Interleukin-1 ("IL-1"), Interleukin-2 ("IL-2"), Interleukin-6 ("IL-6"), Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor ("GM-CSF"), Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor ("G-CSF") oder andere Wachstumsfaktoren einschließen.
  • Die bevorzugten zytotoxischen Agenzien schließen allgemein Alkylierungsmittel, antiproliferative Agenzien, tubulin-bindende Agenzien und dgl. ein. Bevorzugte Klassen von zytotoxischen Agenzien schließen beispielsweise die Anthracyclin-Familie von Arzneiwirkstoffen, die Vinca-Arzneiwirkstoffe, die Mitomycine, die Bleomycine, die zytotoxischen Nukleoside, die Taxane, die Pteridin-Familie von Arzneiwirkstoffen, Diinene und die Podophyllotoxine ein. Besonders geeignete Mitglieder dieser Klassen schließen beispielsweise Doxorubicin, Carminomycin, Daunorubicin, Aminopterin, Methotrexat, Methopterin, Dichlormethotrexat, Mitomycin C, Porfiromycin, 5-Fluoruracil, 6-Mercaptopurin, Cytosinarabinosid, Podophyllotoxin oder Podophyllotoxin-Derivate, wie z. B. Etoposid oder Etoposid-Phosphat, Melphalan, Vinblastin, Vincristin, Leurosidin, Vindesin, Leurosin, Taxol und dgl. ein. Andere geeignete zytotoxische Agenzien schließen Estramustin, Cisplatin und Cyclophosphamid ein. Ein Fachmann auf dem Gebiet kann bei dem gewünschten zytotoxtischen Agens chemische Modifizierungen vornehmen, um die Reaktionen dieser Verbindung für die Zwecke der Herstellung von Konjugaten der Verbindung geeigneter zu machen.
  • Eine stark bevorzugte Gruppe von zytotoxischen Agenzien für die vorliegende Erfindung schließt Arzneiwirkstoffe der folgenden Formeln ein: die Methotrexat-Gruppe der Formel (1):
    Figure 00160001
    worin
    R12 Amino oder Hydroxy ist;
    R7 Wasserstoff oder Methyl ist;
    R8 Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom oder Iod ist;
    R9 Hydroxy oder eine Gruppierung ist, welche ein Salz der Carbonsäure komplettiert; die Mitomycin-Gruppe der Formel (2):
    Figure 00160002
    worin
    R10 Wasserstoff oder Methyl ist; die Bleomycin-Gruppe der Formel (3):
    Figure 00170001
    worin
    R11 Hydroxy, Amino, C1-C3-Alkylamino, Di(C1-C3-alkyl)amino, C4-C6-Polymethylenamino,
    Figure 00170002
    ist. Melphalan der Formel (4):
    Figure 00170003
    6-Mercaptopurin der Formel (5):
    Figure 00180001
    ein Cytosinarabinosid der Formel (6):
    Figure 00180002
    die Podophyllotoxine der Formel (7):
    Figure 00180003
    worin
    R13 Wasserstoff oder Methyl ist;
    R14 Methyl oder Thienyl ist;
    oder ein Phosphatsalz davon; die Vinca-Alkaloidgruppe von Arzneiwirkstoffen der Formel (8):
    Figure 00190001
    worin
    R15 H, CH3 oder CHO ist; wenn R17 und R18 einzeln genommen werden,
    R18 H ist und eines von R16 und R17 Ethyl ist und das andere H oder OH ist, wenn R17 und R18 zusammen mit den Kohlenstoffatomen, mit denen sie verknüpft sind, einen Oxiran-Ring bilden, R16 in diesem Fall Ethyl ist;
    R19 Wasserstoff, (C1-C3-Alkyl)-CO oder chlorsubstituiertes (C1-C3-Alkyl)-CO ist; Difluornukleoside der Formel (9):
    Figure 00190002
    worin
    R21 eine Base einer der Formeln:
    Figure 00190003
    Figure 00200001
    ist, worin
    R22 Wasserstoff, Methyl, Brom, Fluor, Chlor oder Iod ist;
    R23 -OH oder -NH2 ist;
    R24 Wasserstoff, Brom, Chlor oder Iod ist; oder die Anthracyclin-Antibiotika der Formel (10):
    Figure 00200002
    worin
    Ra -CH3, -CH2OH, -CH2OCO(CH2)3CH3 oder -CH2OCOCH(OC2H5)2 ist;
    Rb -OCH3, -OH oder -H ist;
    Rc -NH2, -NHCOCF3, 4-Morpholinyl, 3-Cyano-4-morpholinyl, 1-Piperidinyl, 4-Methoxy-1-piperidinyl, Benzylamin, Dibenzylamin, Cyanomethylamin oder 1-Cyano-2-methoxyethylamin ist;
    Rd -OH, -OTHP oder -H ist; und
    Re -OH oder -H ist, vorausgesetzt, daß R6 nicht -OH ist, wenn R5 -OH oder -OTHP ist.
  • Estramustin (11):
    Figure 00210001
  • Cyclophosphamid (12):
    Figure 00210002
  • Die am meisten bevorzugten Arzneiwirkstoffe sind die oben beschriebenen Anthracyclin-Antibiotika der Formel (10). Ein Fachmann auf dem Gebiet versteht, daß diese Strukturformel Verbindungen einschließt, welche Arzneiwirkstoffe oder Derivate von Arzneiwirkstoffen sind, die im Stand der Technik unterschiedliche generische Bezeichnungen oder Trivialnamen erhalten haben. Die folgende Tabelle 1 präsentiert eine Anzahl von Anthracyclin-Arzneiwirkstoffen, welche für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt sind, und deren generische Bezeichnungen oder Trivialnamen.
  • TABELLE 1
    Figure 00210003
  • Figure 00220001
  • Von den in Tabelle 1 gezeigten Verbindungen sind die am meisten bevorzugten zytotoxischen Agenzien Doxorubicin, Vinblastin und Desacetylvinblastin. Doxorubicin (hier auch als "DOX" bezeichnet) ist das Anthracyclin der Formel (10), worin Ra -CH2OH ist, Rb -OCH3 ist, Rc -NH2 ist, Rd -OH ist und Re -H ist.
  • Das Oligopeptid-zytotoxisches Agens-Konjugat der vorliegenden Erfindung, worin das zytotoxische Agens das bevorzugte zytotoxische Agens Doxorubicin ist, kann durch die allgemeine Formel I unten beschrieben werden:
    Figure 00220002
    worin:
    das Oligopeptid ein Oligopeptid ist, welches selektiv von dem freien prostataspezifischen Antigen (PSA) erkannt wird und in der Lage ist, von der enzymatischen Aktivität des freien prostataspezifischen Antigens proteolytisch gespalten werden, wobei das Oligopeptid eine cyclische Aminosäure der Formel
    Figure 00230001
    umfaßt, und worin
    das C-terminale Carbonyl kovalent an das Amin von Doxorubicin gebunden ist;
    R ausgewählt ist aus
    • a) Wasserstoff,
    • b) -(C=O)R1a,
      Figure 00230002
    R1 und R2 unabhängig ausgewählt sind aus: Wasserstoff, OH, C1-C6-Alkyl, C1-C6-Alkoxy, C1-C6-Aralkyl und Aryl;
    R1a C1-C6-Alkyl, hydroxyliertes Aryl, polyhydroxyliertes Aryl oder Aryl ist,
    R5 aus HO- und C1-C6-Alkoxy ausgewählt ist;
    R6 aus Wasserstoff, Halogen, C1-C6-Alkyl, HO- und C1-C6-Alkoxy ausgewählt ist; und
    n 1, 2, 3 oder 4 ist;
    p 0 oder eine ganze Zahl zwischen 1 und 100 ist;
    q 0 oder 1 ist, vorausgesetzt, daß, wenn p 0 ist, q 1 ist;
    r eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist; und
    t 3 oder 4 ist;
    oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Oligopeptid-zytotoxisches Agens-Konjugat ist die cyclische Aminosäure
    Figure 00240001
    R ist ausgewählt aus
    • a) Wasserstoff
    • b) -(C=O)R1a,
      Figure 00240002
      Figure 00250001
    R1 und R2 sind unabhängig aus Wasserstoff, C1-C6 und Aryl ausgewählt;
    R1a ist C 1-C6-Alkyl Oder Aryl;
    n ist 1, 2, 3 oder 4;
    n' ist 0, 1, 2 oder 3;
    p ist 0 oder eine ganze Zahl zwischen 1 und 14;
    q ist 0 oder 1, vorausgesetzt, daß, wenn p 0 ist, q 1 ist;
    r ist eine ganze Zahl zwischen 1 und 10; und
    t ist 3;
    oder ein optisches Isomer oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
  • Die folgenden Verbindungen sind spezielle Beispiele des Oligopeptid-zytotoxisches Agens-Konjugats der vorliegenden Erfindung:
    Figure 00250002
    worin X ist:
    Figure 00260001
    Figure 00270001
    oder ein optisches Isomer oder pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
  • Das Oligopeptid-zytotoxisches Agens-Konjugat der vorliegenden Erfindung, worin das zytotoxische Agens das bevorzugte zytotoxische Agens Vinblastin oder Desacetylvinblastin ist, kann mit der folgenden allgemeinen Formel II beschrieben werden:
    Figure 00280001
    wobei:
    das Oligopeptid ein Oligopeptid ist, welches spezifisch von dem freien prostataspezifischen Antigen (PSA) erkannt wird und in der Lage ist, von der enzymatischen Aktivität des freien prostataspezifischen Antigens proteolytisch gespalten zu werden, und das Oligopeptid eine cyclische Aminosäure der Formel
    Figure 00280002
    umfaßt;
    XL -NH-(CH2)u-NH- ist,
    R ausgewählt ist aus
    • a) Wasserstoff
    • b) -(C=O)R1a,
      Figure 00280003
      Figure 00290001
    R1 und R2 unabhängig ausgewählt sind aus: Wasserstoff, OH, C1-C6-Alkyl, C1-C6-Alkoxy, C1-C6-Aralkyl und Aryl;
    R1a C1-C6-Alkyl, hydroxyliertes Aryl, polyhydroxyliertes Aryl oder Aryl ist;
    R19 Wasserstoff, (C1-C3-Alkyl)-CO oder chlorsubstituiertes (C1-C3-Alkyl)-CO ist;
    n 1, 2, 3 oder 4 ist;
    p 0 oder eine ganze Zahl zwischen 1 und 100 ist;
    q 0 oder 1 ist, vorausgesetzt, daß, wenn p 0 ist, q 1 ist;
    r 1, 2 oder 3 ist;
    t 3 oder 4 ist;
    u 1, 2, 3, 4 oder 5 ist;
    oder das pharmazeutisch annehmbare Salz davon.
  • Eine weitere Ausführungsform des Oligopeptid-zytotoxisches Agens-Konjugat der vorliegenden Erfindung, wobei das zytotoxische Agens das bevorzugte zytotoxische Agens Vinblastin oder Desacetylvinblastin ist, kann mit der folgenden allgemeinen Formel III beschrieben werden:
    Figure 00290002
    wobei:
    das Oligopeptid ein Oligopeptid ist, welches spezifisch von dem freien prostataspezifischen Antigen (PSA) erkannt wird und in der Lage ist, von der enzymatischen Aktivität des freien prostataspezifischen Antigens proteolytisch gespalten zu werden, und das Oligopeptid eine cyclische Aminosäure der Formel:
    Figure 00300001
    umfaßt;
    Rg und Rh unabhängig aus Wasserstoff, C1-C6-Alkyl, -C1-C6-Alkyl-OH, -C1-C6-Alkyl-di-OH, -C1-C6-Alkyl-tri-OH und
    Figure 00300002
    ausgewählt sind, vorausgesetzt, daß mindestens ein Rd und Re nicht Wasserstoff oder C1-C6-Alkyl ist, oder
    R9 und Rh vereinigt werden, um einen zweiwertigen Rest -CH2CH2OCH2CH2- zu bilden;
    R19 Wasserstoff, (C1-C3-Alkyl)-CO oder chlorsubstituiertes (C1-C3-Alkyl)-CO ist;
    p 0 oder eine ganze Zahl zwischen 1 und 100 ist;
    q 0 oder 1 ist, vorausgesetzt, daß, wenn p 0 ist, q 1 ist;
    oder das pharmazeutisch annehmbare Salz davon.
  • Die folgenden Verbindungen sind spezielle Beispiele des Oligopeptid-Desacetylvinblastin-Konjugats der vorliegenden Erfindung:
    Figure 00310001
    Figure 00320001
    oder ein optisches Isomer oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
  • Die Oligopeptide, Peptid-Untereinheiten und Peptid-Derivate (auch als „Peptide" bezeichnet) der vorliegenden Erfindung können aus ihren Aminosäurebestandteilen durch herkömmliche Peptidsynthesetechniken, vorzugsweise Festphasen-Technologie, synthetisiert werden. Die Peptide werden dann durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) gereinigt.
  • Standardverfahren der Peptidsynthese sind beispielsweise in den folgenden Arbeiten offenbart: Schroeder et al., „The Peptides", Bd. I, Academic Press 1965; Bodansky et al., „Peptide Synthesis", Interscience Publishers, 1966; McOmie (Hrsg.) „Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, 1973; Barany et al, „The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology" 2, Kap. 1, Academic Press, 1980, und Stewart et al., „Solid Phase Peptide Synthesis", Zweite Auflage, Pierce Chemical Company, 1984. Die Lehren dieser Arbeiten sind hier durch die Bezugnahme mit eingeschlossen.
  • Die in geeigneter Weise substituierte cyclische Aminosäure mit einem hydrophilen Substituenten, welche mittels Standardverfahren der Peptidsynthese in die vorliegenden Konjugate inkorporiert werden kann, ist entweder selbst im Handel erhältlich oder wird unschwer nach Techniken synthetisiert, die im Stand der Technik wohlbekannt oder hier beschrieben sind. So werden Synthesen geeignet substituierter Proline in den folgenden Artikeln und dort zitierten Referenzen beschrieben: J. Ezquerra et al., J. Org. Chem. 60: 2925–2930 (1995); P. Gill und W. D. Lubell, J. Org. Chem, 60: 2658–2659 (1959); und M. W. Holladay et al., J. Med. Chem., 34: 457–461 (1991). Die Lehren dieser Arbeiten sind hier durch die Bezugnahme mit eingeschlossen.
  • Die pharmazeutisch annehmbaren Salze der Verbindungen dieser Erfindung umfassen die herkömmlichen nicht-toxischen Salze der Verbindungen dieser Endung, wie sie z. B. von nicht-toxischen anorganischen oder organischen Säuren gebildet werden. Beispielsweise schließen solche herkömmlichen nicht-toxischen Salze diejenigen ein, welche von anorganischen Säuren wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Sulfaminsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure und dgl. abgeleitet sind, und die Salze, die von organischen Säuren wie Essigsäure, Propionsäure, Bernsteinsäure, Glycolsäure, Stearinsäure, Milchsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Citronensäure, Ascorbinsäure, Pamoasäure, Maleinsäure, Hydroxymaleinsäure, Phenylessigsäure, Glutaminsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Sulfanilsäure, 2-Acetoxybenzoesäure, Fumarsäure, Toluolsulfonsäure, Methansulfonsäure, Ethandisulfonsäure, Oxalsäure, Isethionsäure, Trifluoressigsäure und dgl. gebildet werden.
  • Die Konjugate der vorliegenden Erfindung, welche das Oligopeptid, das die PSA-Spaltstelle enthält, und ein zytotoxisches Agens umfassen, können auf ähnliche Weise nach Techniken synthetisiert werden, welche auf dem Gebiet der medizinischen Chemie wohlbekannt sind. Beispielsweise kann eine freie Amingruppierung auf dem zytotoxischen Agens kovalent mit dem Oligopeptid am Carboxyterminus verknüpft werden, so daß eine Amidbindung gebildet wird. Auf ähnliche Weise kann eine Amidbindung durch kovalente Kopplung einer Amingruppierung des Oligopeptids und einer Carboxylgruppierung des zytotoxischen Agens gebildet werden. Für diese Zwecke kann ein Reagenz, z. B. 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,3,3-Tetramethyluroniumhexafluorphosphat (als HBTU bekannt) und 1-Hydroxybenzotriazol-Hydrat (als HOBT bekannt), Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), N-Ethyl-N-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC), Diphenylphosphorylazid (DPPA), Benzotriazol-1-yl-oxytris-(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat (BOP) und dgl., in Kombination oder einzeln eingesetzt, verwendet werden.
  • Ferner kann das vorliegende Konjugat durch eine Nicht-Peptidylbindung zwischen der PSA-Spaltstelle und einem zytotoxischen Agens gebildet werden. Beispielsweise kann das zytotoxische Agens über eine Hydroxylgruppierung auf dem zytotoxischen Agens kovalent mit dem Carboxyterminus des Oligopeptids verknüpft werden, wodurch eine Esterverknüpfung gebildet wird. Für diesen Zweck kann ein Reagens, z. B. eine Kombination von HBTU und HOBT, eine Kombination von BOP und Imidazol, eine Kombination von DCC und DMAP und dgl., eingesetzt werden. Die Carbonsäure kann auch durch Bildung des Nitrophenylesters oder dgl. aktiviert und in Gegenwart von DBU (1,8-Diazabicyclo[5,4,0]undec-7-en) umgesetzt werden.
  • Das vorliegende Konjugat kann auch durch Verknüpfung des Oligopeptids mit dem zytotoxischen Agens über eine Linker-Einheit gebildet werden. Solche Linker-Einheiten schließen beispielsweise einen zweiwertigen Biscarbonylalkylrest ein, wodurch eine Amingruppierung auf dem zytotoxischen Agens mit der Linker-Einheit verknüpft wird, um eine Amidbindung zu bilden, und der Aminoterminus des Oligopeptids mit dem anderen Ende der Linker-Einheit ebenfalls unter Bildung einer Amidbindung verknüpft wird. Andererseits kann auch eine zweiwertige Diaminoalkyl-Linker-Einheit, wodurch eine Carbonylgruppierung auf dem zytotoxischen Agens kovalent mit einem der Amine der Linker-Einheit verknüpft wird, während das andere Amin der Linker-Einheit kovalent mit dem C-Terminus des Oligopeptids verknüpft wird, geeignet sein. Andere solche Linker-Einheiten, welche in der physiologischen Umgebung stabil sind, wenn sie nicht in Gegenwart von freiem PSA vorliegen, jedoch nach Spaltung der proteolytischen Spaltstelle für PSA spaltbar sind, werden ebenfalls in Betracht gezogen. Ferner können Linker-Einheiten eingesetzt werden, die nach Spaltung der proteolytischen PSA-Spaltstelle mit dem zytotoxischen Agens verbunden bleiben, jedoch die zytotoxische Aktivität eines solchen zytotoxischen Agens-Derivats nach der Spaltung im Vergleich zu einem unmodifizierten zytotoxischen Agens nicht signifikant herabsetzen.
  • Ein Fachmann auf dem Gebiet versteht, daß es bei der Synthese von Verbindungen der Erfindung erforderlich sein mag, verschiedene reaktive Funktionalitäten auf den Ausgangsverbindungen und Zwischenprodukten zu schützen, während eine gewünschte Reaktion mit anderen Teilen des Moleküls durchgeführt wird. Nachdem die gewünschten Reaktionen abgeschlossen sind oder zu irgendeinem gewünschten Zeitpunkt werden solche Schutzgruppen normalerweise auf z. B. hydrolytische oder hydrogenolytische Weise entfernt. Solche Schritte des Schutzes und der Schutzgruppenbefreiung sind in der organischen Chemie üblich. Der Fachmann wird bezüglich der Lehre von Schutzgruppen, welche zur Herstellung von Verbindungen der vorliegenden Erfindung geeignet sein mögen, auf Protective Groups in Organic Chemistry, McOmie, Hrsg., Plenum Press, NY, NY (1973), und Protective Groups in Organic Synthesis, Greene, Hrsg., John Wiley & Sons, NY, NY (1981), verwiesen.
  • Lediglich als Beispiele können geeignete Aminoschutzgruppen z. B. C1-C10-Alkanoylgruppen, wie z. B. Formyl, Acetyl, Dichloracetyl, Propionyl, Hexanoyl, 3,3-Diethylhexanoyl, γ-Chlorbutryl und dgl., C1-C10-Alkoxycarbonyl- und C5-C15-Aryloxycarbonylgruppen, wie z. B tert-Butoxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, Allyloxycarbonyl, 4-Nitrobenzyloxycarbonyl, Fluorenylmethyloxycarbonyl und Cinnamoyloxycarbonyl, Halogen-(C1-C10)-alkoxycarbonyl, z. B. 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl, und C1-C15-Arylalkyl- und Alkenylgruppen wie Benzyl, Phenethyl, Allyl, Trityl und dgl. einschließen. Andere allgemein eingesetzte Aminoschutzgruppen sind diejenigen in Form von Enaminen, die mit β-Keto-Estern, z. B. Methyl- oder Ethylacetoacetat, hergestellt wurden.
  • Geeignete Carboxyschutzgruppen können beispielsweise C1-C10-Alkylgruppen, z. B. Methyl, tert-Butyl, Decyl, Halogen-C1-C10-alkyl, wie z. B. 2,2,2-Trichlorethyl und 2-Iodethyl, C5-C15-Arylalkyl, z. B. Benzyl, 4-Methoxybenzyl, 4-Nitrobenzyl, Triphenylmethyl, Diphenylmethyl, C1-C10-Alkanoyloxymethyl, z. B. Acetoxymethyl, Propionoxymethyl und dgl., und Gruppen wie Phenacyl, 4-Halogenphenacyl, Allyl, Dimethylallyl, Tri-(C1-C3-alkyl)silyl, z. B. Trimethylsilyl, β-p-Toluolsulfonylethyl, β-p-Nitrophenylthioethyl, 2,4,6-Trimethylbenzyl, β-Methylthioethyl, Phthalimidomethyl, 2,4-Dinitrophenylsulfenyl, 2-Nitrobenzhydryl und verwandte Gruppen einschließen.
  • Gleichermaßen können geeignete Hydroxyschutzgruppen beispielsweise die Formylgruppe, die Chloracetylgruppe, die Benzylgruppe, die Benzhydrylgruppe, die Tritylgruppe, die 4-Nitrobenzylgruppe, die Trimethylsilylgruppe, die Phenacylgruppe, die tert-Butylgruppe, die Methoxymethylgruppe, die Tetrahydropyranylgruppe und dgl. einschließen.
  • Bezüglich der bevorzugten Ausführungsform eines Oligopeptids, das mit dem Anthracyclin-Antibiotikum Doxorubicin kombiniert ist, illustrieren die folgenden Reaktionsschemata die Synthese der Konjugate der vorliegenden Erfindung.
  • REAKTIONSSCHEMA I
    Figure 00360001
  • REAKTIONSSCHEMA II
    Figure 00370001
  • REAKTIONSSCHEMA III
    Figure 00380001
  • REAKTIONSSCHEMA IV
    Figure 00390001
  • REAKTIONSSCHEMA V
    Figure 00400001
  • Reaktionsschema erläutert die Herstellung von Konjugaten, die bei dem vorliegenden Behandlungsverfahren eingesetzt werden, wobei die Oligopeptide mit dem zytotoxischen Vinca-Alkaloid-Agens Vinblastin kombiniert sind. Die Verknüpfung des N-Terminus des Oligopeptids mit Vinblastin wird erläutert (S. P. Kandukuri et al., J. Med. Chem. 28: 1079–1088 (1985)).
  • Reaktionsschema VII erläutert die Herstellung von Konjugaten der Oligopeptide der vorliegenden Erfindung und des zytotoxischen Vinca-Alkaloid-Agens Vinblastin, wobei die Verknüpfung von Vinblastin am C-Terminus des Oligopeptids erfolgt. Die Verwendung des 1,3-Diaminopropan-Linkers ist nur illustrativ; andere Spacereinheiten zwischen dem Carbonyl von Vinblastin und dem C-Terminus des Oligopeptids kommen ebenfalls in Betracht. Ferner erläutert das Schema VII eine Synthese von Konjugaten, bei der die Hydroxygruppierung an der C-4-Position nach der Addition der Linker-Einheit reacetyliert wird. Die Anmelder haben festgestellt, daß das Desacetylvinblastin-Konjugat ebenfalls wirksam ist und durch Eliminierung der im Reaktionsschema VII gezeigten Schritte des Schutzes des primären Amins des Linkers und Umsetzung des Zwischenprodukts mit Essigsäureanhydrid, gefolgt von Schutzgruppenbefreiung des Amins, hergestellt werden kann. Die Konjugation des Oligopeptids an anderen Positionen und funktionellen Gruppen von Vinblastin kann von einem Durchschnittsfachmann unschwer vorgenommen werden und es steht auch zu erwarten, daß sie Verbindungen ergibt, die zur Behandlung von Prostatakrebs geeignet sind.
  • Es versteht sich auch, daß Konjugate hergestellt werden können, bei denen der N-Terminus des Oligopeptids, welches eine cyclische Aminosäure mit einem hydrophilen Substituenten umfaßt, das im vorliegenden Behandlungsverfahren eingesetzt wird, mit einem zytotoxischen Agens, zum Beispiel Vinblastin, kombiniert ist, während der C-Terminus gleichzeitig mit einem anderen zytotoxischen Agens verknüpft ist, welches das gleiche oder ein anderes zytotoxisches Agens, z. B. Doxorubicin, ist. Reaktionsschema VIII erläutert die Synthese eines solchen polyzytotoxischen Agens-Konjugats. Ein solches polyzytotoxisches Konjugat könnte Vorteile gegenüber einem Konjugat bieten, das nur ein zytotoxisches Agens enthält.
  • REAKTIONSSCHEMA VI
    Figure 00420001
  • REAKTIONSSCHEMA VI (Fortsetzung)
    Figure 00430001
  • REAKTIONSSCHEMA VII
    Figure 00440001
  • REAKTIONSSCHEMA VII (Fortsetzung)
    Figure 00450001
  • REAKTIONSSCHEMA VIII
    Figure 00460001
  • REAKTIONSSCHEMA VIII (Fortsetzung)
    Figure 00470001
  • Die Oligopeptid-zytotoxisches Agens-Konjugate der Erfindung werden dem Patienten in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht, welche ein Konjugat der vorliegenden Erfindung und einen) pharmazeutisch annehmbaren Träger, Exzipienten oder Verdünnungsmittel dafür umfaßt. "Pharmazeutisch annehmbar", wie verwendet, bezieht sich auf diejenigen Agenzien, welche zur Behandlung oder Diagnose eines Warmblüters, einschließlich beispielsweise eines Menschen, Pferds, Schweins, Rinds, einer Maus, eines Hundes, einer Katze oder eines anderen Säugetiers, sowie eines Affen oder eines anderen Warmblüters geeignet sind. Die bevorzugte Verabreichungsweise ist parenteral, insbesondere auf intravenösem, intramuskulärem, subkutanem, intraperitonealem oder intralymphatischem Weg. Solche Formulierungen können unter Verwendung von Trägern, Verdünnungsmitteln oder Exzipienten, die Fachleuten bekannt sind, hergestellt werden. Siehe diesbezüglich beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, 1980, Mack Publishing Company, herausgegeben von Osol et al. Solche Zusammen setzungen können Proteine einschließen, beispielsweise Serumproteine, z. B. Humanserumalbumin, Puffer oder puffernde Substanzen, wie z. B. Phosphate, andere Salze oder Elektrolyte und dgl. Geeignete Verdünnungsmittel können beispielsweise steriles Wasser, isotonische Salzlösung, verdünnte wässerige Dextrose, einen mehrwertigen Alkohol oder Mischungen solcher Alkohole, beispielsweise Glycerin, Propylenglycol, Polyethylenglycol, und dgl. einschließen. Die Zusammensetzungen können Konservierungsmittel, z. B. Phenethylalkohol, Methyl- und Propylparabene, Thimerosal und dgl., einschließen. Gewünschtenfalls kann die Zusammensetzung etwa 0,05 bis etwa 0,20 Gewichtsprozent eines Antioxidationsmittels wie Natriummetabisulfit oder Natriumbisulfit beinhalten.
  • Wie hier verwendet, soll der Begriff „Zusammensetzung" ein Produkt umfassen, das die angegebenen Bestandteile in den speziellen Mengen enthält, sowie jedes Produkt, das direkt oder indirekt das Ergebnis der Kombination der spezifischen Bestandteile in den angegebenen Mengen ist.
  • Zur intravenösen Verabreichung wird die Zusammensetzung vorzugsweise so zubereitet werden, daß die dem Patienten verabreichte Menge etwa 0,01 bis etwa 1 g des Konjugats betragen wird. Vorzugsweise wird die verabreichte Menge im Bereich von etwa 0,2 bis etwa 1 g des Konjugats liegen. Die Konjugate der Erfindung sind über einen breiten Dosisbereich wirksam, der von Faktoren wie dem zu behandelnden Krankheitszustand oder der zu modifizierenden biologischen Wirkung, der Art und Weise, in der das Konjugat verabreicht wird, dem Alter, Gewicht und Zustand des Patienten sowie anderen Faktoren, die von dem behandelnden Arzt zu bestimmen sind, abhängt. Somit muß die Menge, die irgendeinem gegebenen Patienten verabreicht wird, auf individueller Basis festgelegt werden.
  • Ein Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, daß, obwohl spezielle Reagenzien und Reaktionsbedingungen in den folgenden Beispielen angegeben sind, Modifizierungen vorgenommen werden können, welche vom Erfindungsgedanken und Umfang der Erfindung umfaßt sein sollen. Die folgenden Präparationen und Beispiele sollen daher die Erfindung näher erläutern und stellen keine Beschränkung dar.
  • BEISPIELE
  • BEISPIEL 1
  • Herstellung von Oligopeptiden, welche die PSA-vermittelte Spaltstelle umfassen:
  • Blockierte Oligopeptide wurden durch Festphasen-Synthese unter Verwendung eines Doppelkopplungsprotokolls für die Einführung von Aminosäuren mit dem automatischen Peptid-Synthesizer Modell 430 A von Applied Biosystems hergestellt. Die Befreiung von der Schutzgruppe und die Entfernung des Oligopeptids von dem Harz-Träger wurden durch Behandlung mit flüssiger Flußsäure erzielt. Die Oligopeptide wurden durch präparative Hochdruckflüssigkeitschromatographie auf Umkehrphasen-C18-Silica-Säulen unter Verwendung eines wässerigen 0,1%-Trifluoressigsäure/Acetonitril-Gradienten gereinigt. Identität und Homogenität der Oligopeptide wurden durch Analyse der Aminosäurezusammensetzung, Hochdruckflüssigkeitschromatographie und FAB („fast atom bombardment")-Massenspektroskopie-Analyse bestätigt. Die nach diesem Verfahren hergestellten Oligopeptide sind in Tabelle 2 gezeigt.
  • TABELLE 2
    Figure 00490001
  • BEISPIEL 2
  • Beurteilung der Erkennung von Oligopeptiden durch freies PSA:
  • Die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellten Oligopeptide wurden individuell in PSA-Verdauungspuffer (12 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan, pH 8,0, 25 mM NaCl, 0,5 mM CaCl2) gelöst und die Lösung zu PSA in einem Molverhältnis von 100 zu 1 zugegeben. Alternativ ist der verwendete PSA-Verdauungspuffer 50 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan, pH 7,4, 140 mM NaCl. Die Reaktion wird nach verschiedenen Reaktionszeiten durch die Zugabe von Trifluoressigsäure (TFA) auf schließlich 1% (Volumen/Volumen) gestoppt. Alternativ wird die Reaktion mit 10 mM ZnCl2 gestoppt. Die gestoppte Reaktion wurde mittels HPLC auf einer Umkehrphasen-C18-Säule unter Verwendung eines wässerigen 0,1%-TFA/Acetonitril-Gradienten analysiert. Die Ergebnisse der Beurteilung sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 zeigt die Zeitspanne (in Minuten), die für eine 50%ige Spaltung der angegebenen Oligopeptide mit enzymatisch aktivem freiem PSA erforderlich ist. Oligopeptide, die freie Amingruppierungen enthalten (d. h., hArg, Orn, Lys und/oder 3PAL enthalten), wurden als TFA-Salze getestet. Alle anderen Oligopeptide wurden als neutrale Verbindungen getestet.
  • BEISPIEL 3 Herstellung von [N-Ac-(4-trans-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox (SEQ-ID-Nr. 68)
    Figure 00500001
  • Schritt A: [N-Ac-(4-trans-L-Hyp(Bzl))]-Ala-Ser(Bzl)Chg-Gln-Ser(Bzl)Leu-PAM-Harz (3-1)
  • Ausgehend von 0,5 mMol (0,67 g) Boc-Leu-PAM-Harz, wurde das geschützte Peptid mit einem 430A ABI-Peptid-Synthesizer synthetisiert. Bei dem Protokoll wurde ein vierfacher Überschuß (2 mMol) einer jeden der folgenden geschützten Aminosäuren verwendet: Boc-Ser(Bzl), Boc-Gln, Boc-Chg, Boc-Ala, N-Boc-(4-trans-L-Hyp(Bzl)). Die Kopplung wurde unter Einsatz von DCC und HOBT-Aktivierung in Methyl-2-pyrrolidinon erzielt. Zur Einführung der N-terminalen Acetylgruppe wurde Essigsäure verwendet. Die Entfernung der Boc-Gruppe verfolgte unter Verwendung von 50%iger TFA in Methylenchlorid und das TFA-Salz wurde mit Diisopropylethylamin neutralisiert. Nach Beendigung der Synthese wurde das Peptid-Harz getrocknet, um das Zwischenprodukt 3-1 zu ergeben.
  • Schritt B: [N-Ac-(4-trans-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-OH (3-2)
  • Das geschützte Peptid-Harz (3-1), 1,2 g, wurde mit HF (20 ml) 1 h lang bei 0°C in Gegenwart von Anisol (2 ml) behandelt. Nach Verdampfung der HF wurde der Rückstand mit Ether gewaschen, filtriert und mit H2O (200 ml) extrahiert. Das Filtrat wurde lyophilisiert, um das Zwischenprodukt 3-2 zu ergeben.
  • Schritt C: [N-Ac-(4-trans-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox
  • Das oben beschriebene Zwischenprodukt (3-2), 1,157 g (1,45 mMol), wurde in DMSO (30 ml) gelöst und mit DMF (30 ml) verdünnt. Zur Lösung wurde Doxorubicin-Hydrochlorid, 516 mg (0,89 mMol), gefolgt von 0,310 ml Diisopropylethylamin (1,78 mMol) zugegeben. Die gerührte Lösung wurde gekühlt (0°C) und 0,276 ml Diphenylphosphorylazid (1,28 mMol) wurden zugegeben. Nach 30 Minuten wurden weitere 0,276 ml (1,28 mMol) DPPA zugegeben und der pH-Wert wurde mit Düsopropylethylamin (DIEA) auf ∼7,5 (pH-Papier) eingestellt. Der pH-Wert der gekühlten Reaktion (0°C) wurde mit DIEA für die nächsten 3 h bei ∼7,5 gehalten und die Reaktion über Nacht bei 0–4°C gerührt. Nach 18 h wurde die Reaktion (mittels analytischer HPLC, System A, als vollständig befunden) zu einem Öl konzentriert. Die Reinigung des Rohprodukts wurde durch präparative HPLC, Puffer A = 0,1% NH4OAc-H2O; B = CH3CN, erzielt. Das Rohprodukt wurde in 400 ml 100%igem Puffer A gelöst, filtriert und auf einer C-18-Umkehrphasen-HPLC-Radialkompressionssäule (Waters, Delta-Pak, 15 μM, 100 Å) gereinigt. Ein Stufengradient von 100% A bis 60% A wurde mit einer Durchflußrate von 75 ml/Min (UV = 214 nm) eingesetzt. Homogene Produktfraktionen (mittels HPLC beurteilt, System A) wurden vereinigt und gefriergetrocknet. Das Produkt wurde in H2O (300 ml) gelöst, filtriert und gefriergetrocknet, um die gereinigte Titelverbindung zu ergeben.
  • HPLC-Bedingungen, System A
  • Säule: Vydac 15 cm #218TP5415, C18
    Elutionsmittel: Gradient 95 : 5 (A : B) bis 5 : 95 (A : B) im Verlauf von 45 Minuten; A = 0,1% TFA/H2O, B = 0,1% TFA/Acetonitril
    Durchfluß: 1,5 ml/Min.
    Wellenlänge: 214 nm, 254 nm
    Retentionszeiten: Doxorubicin = 13,66 Min.
  • Figure 00520001
  • PHYSIKALISCHE EIGENSCHAFTEN
  • Die physikalisch/chemischen Eigenschaften des Produkts von Schritt C sind im folgenden dargestellt:
    Molekülformel: C62H85N9O23
    Molekulargewicht: 1323,6
    Hochauflösende ES-Massenspektroskopie: 1341,7 (NH4 +)
    HPLC: System A
    Säule: Vydac 15 cm #218TP5415, C18
    Elutionsmittel: Gradient 95 : 5 (A : B) bis 5 : 95 (A : B) im Verlauf von 45 Minuten; A = 0,1% TFA/H2O, B = 0,1 TFA/Acetonitril
    Durchfluß: 1,5 ml/Min.
    Wellenlänge 214 nm, 254 nm
    Retentionszeit: 18,2 Min.
    Analyse der Aminosäurezusammensetzung1:
    Theorie Gefunden
    Ala (1) 1,00
    Ser (2) 1,88
    Chg (1) 0,91
    Gln2 (1) 1,00 (als Glu)
    Hyp (1) 0,80
    Leu (1) 1,01
    Peptidgehalt: 0,657 μMol/mg
  • Anmerkung:
  • Tabelle 3 zeigt weitere Peptid-Doxorubicin-Konjugate, welche nach den in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren, jedoch unter Verwendung der entsprechenden Aminosäurereste und Blockierungsgruppenacylierung, hergestellt wurden.
  • TABELLE 3
    Figure 00530001
  • BEISPIEL 4 Herstellung von [N-Glutaryl-(4-trans-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox (SEQ-ID-Nr. 71)
    Figure 00530002
  • Schritt A: [N-Glutaryl(OFm)-(4-trans-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-PAM-Harz
  • Ausgehend von 0,5 mMol (0,67 g) Boc-Leu-PAM-Harz, wurde das geschützte Peptid mit einem 430A ABI-Peptid-Synthesizer synthetisiert. Bei dem Protokoll wurde ein vierfacher Überschuß (2 mMol) einer jeden der folgenden geschützten Aminosäuren eingesetzt: Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Chg, Fmoc-Ala, Boc-(4-trans-L-Hyp). Eine Kopplung wurde unter Verwendung von DCC und HOBT-Aktivierung in Methyl-2-pyrrolidinon erzielt. Das Zwischenprodukt Monofluorenylmethylester von Glutarsäure [Glutaryl(OFm)] wurde zur Einführung der N-terminalen Glutarylgruppe verwendet. Die Entfernung der Fmoc-Gruppe erfolgte unter Verwendung von 20%igem Piperidin. Die säure-sensitiven Schutzgruppen Boc, Trt und tBu wurden mit 50%iger TFA in Methylenchlorid entfernt. Die Neutralisation des TFA-Salzes erfolgte mit Düsopropylethylamin. Nach Beendigung der Synthese wurde das Peptid-Harz getrocknet, um die Titelverbindung zu ergeben.
  • Schritt B: [N-Glutaryl(OFm)-(4-trans-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-OH
  • Das geschützte Peptid-Harz aus Schritt A, 1,2 g, wurde mit HF (20 ml) eine Stunde lang bei 0°C in Gegenwart von Anisol (2 ml) behandelt. Nach Verdampfung der HF wurde der Rückstand mit Ether gewaschen, filtriert und mit DMF extrahiert. Das DMF-Filtrat (75 ml) wurde bis zur Trockne konzentriert und mit H2O trituriert. Das unlösliche Produkt wurde filtriert und getrocknet, um die Titelverbindung zu ergeben.
  • Schritt C: [N-Glutaryl(OFm)-(4-trans-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox
  • Das oben hergestellte Zwischenprodukt aus Schritt B (1,33 g, 1,27 mMol) wurde in DMSO (6 ml) und DMF (69 ml) gelöst. Zu der Lösung wurde Doxorubicin-Hydrochlorid, 599 mg (1,03 mMol), gefolgt von 376 μl Düsopropylethylamin (2,16 mMol) zugegeben. Die gerührte Lösung wurde gekühlt (0°C) und 324 μl Diphenylphosphorylazid (1,5 mMol) wurden zugegeben. Nach 30 Minuten wurden weitere 324 μl DPPA zugegeben und der pH-Wert mit Diisopropylethylamin (DIEA) auf ∼7,5 (pH-Papier) eingestellt. Der pH-Wert der gekühlten Reaktion (0°C) wurde mit DIEA für die nächsten 3 Stunden bei ∼7,5 gehalten und die Reaktion bei 0–4°C über Nacht gerührt. Nach 18 Stunden wurde die Reaktion (mittels analytischer HPLC, System A, als vollständig befunden) konzentriert, um die Titelverbindung als Öl zu ergeben.
  • Schritt D: [N-Glutaryl-(4-trans-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox
  • Das obige Produkt aus Schritt C wurde in DMF (54 ml) gelöst, gekühlt (0°C) und 14 ml Piperidin wurden zugegeben. Die Lösung wurde bis zur Trockne konzentriert und mittels präparativer HPLC gereinigt (A = 0,1% NH4OAc-H2O; B = CH3CN). Das Rohprodukt wurde in 100 ml 80%igem Puffer A gelöst, filtriert und auf einer C-18-Umkehrphasen-HPLC-Radialkompressionssäule (Waters, Delta-Pak, 15 μ, 100 Å) gereinigt. Ein Stufengradient von 80% A bis 67% A wurde mit einer Durchflußrate von 75 ml/Min. eingesetzt (UV = 214 nm). Homogene Produktfraktionen (mittels HPLC, System A, beurteilt) wurden vereinigt und gefriergetrocknet. Das Produkt wurde unter Verwendung der obigen HPLC-Säule weiter gereinigt. Puffer A = 15% Essigsäure-H2O; B = 15% Essigsäure-Methanol. Das Produkt wurde in 100 ml 20% B/80% A-Puffer gelöst und gereinigt. Ein Stufengradient von 20% B bis 80% B wurde mit einer Durchflußrate von 75 ml/Min. (UV = 260 nm) eingesetzt. Homogene Produktfraktionen (mittels HPLC, System A, beurteilt) wurden vereinigt, konzentriert und aus H2O gefriergetrocknet, um die gereinigte Titelverbindung zu ergeben.
  • HPLC-Bedingungen, System A
  • Säule: Vydac 15 cm #218TP5415, C18
    Elutionsmittel: Gradient 95 : 5 (A : B) bis 5 : 95 (A : B) im Verlauf von 45 Minuten; A = 0,1% TFA/H2O, B = 0,1% TFA/Acetonitril
    Durchfluß: 1,5 ml/Min.
    Wellenlänge: 214 nm, 254 nm
    Retentionszeiten: Doxorubicin = 13,66 Min.
    [N-Glutaryl(OFm)-(4-trans-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-OH = 19,66 Min.
    [N-Glutaryl(OFm)-(4-trans-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox = 24,8 Min.
    [N-Glutaryl-(4-trans-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox = 18,3 Min.
    Hochauflösende ES-Massenspektroskopie: 1418,78 (Na+)
    HPLC: System A
    Säule: Vydac 15 cm #218TP5415, C18
    Elutionsmittel: Gradient 95 : 5 (A : B) bis 5 : 95 (A : B) im Verlauf von 45 Minuten; A = 0,1% TFA/H2O, B = 0,1% TFA/Acetonitril
    Durchfluß: 1,5 ml/Min.
    Wellenlänge: 214 nm, 254 nm
    Retentionszeit: 18,3 Min.
    Analyse der Aminosäurezusammensetzung1:
    Theorie Gefunden
    Ala (1) 0,99
    Ser (2) 2,02
    Chg (1) 1,00
    Gln2 (1) 1,01 (als Glu)
    Hyp (1) 0,99
    Leu (1) 1,00
    Peptidgehalt: 0,682 μMol/mg
  • Anmerkung:
  • Tabelle 4 zeigt andere Peptid-Doxorubicin-Konjugate, welche mit den in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren, jedoch unter Einsatz der entsprechenden Aminosäurereste und Blockierungsgruppenacylierung, hergestellt wurden.
  • TABELLE 4
    Figure 00560001
  • BEISPIEL 5 Herstellung von (4-trans-L-Hyp)-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox (SEQ-ID-Nr. 70)
    Figure 00560002
  • Schritt A: Fmoc-(4-trans-L-Hyp(Bzl)-Ala-Ser(Bzl)Chg-Gln-Ser(Bzl)Leu-PAM-Harz
  • Ausgehend von 0,5 mMol (0,67 g) Boc-Leu-PAM-Harz, wurde das geschützte Peptid mit einem 430A ABI-Peptid-Synthesizer synthetisiert. Das Protokoll verwendete einen vierfachen Überschuß (2 mMol) einer jeden der folgenden geschützten Aminosäuren: Boc-Ser(Bzl), Boc-Gln, Boc-Chg, Boc-Ala, N-Boc-(4-trans-L-Hyp(Bzl)). Die Kopplung wurde mittels DCC und HOBT-Aktivierung in Methyl-2-Pyrrolidinon erreicht. Fmoc-OSu (Succinamidylester von Fmoc) wurde zur Einführung der N-terminalen Schutzgruppe verwendet. Die Entfernung der Boc-Gruppe erfolgte unter Verwendung von 50%iger TFA in Methylenchlorid und das TFA-Salz wurde mit Düsopropylethylamin neutralisiert. Nach Beendigung der Synthese wurde das Peptid-Harz getrocknet, um das Titelzwischenprodukt zu ergeben.
  • Schritt B: Fmoc-(4-trans-L-Hyp)-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-OH
  • Das geschützte Peptid-Harz aus Schritt A, 1,1 g, wurde mit HF (20 ml) 1 h lang bei 0°C in Gegenwart von Anisol (2 ml) behandelt. Nach Verdampfung der HF wurde der Rückstand mit Ether gewaschen, filtriert und mit H2O (200 ml) extrahiert. Das Filtrat wurde lyophilisiert, um das Titelzwischenprodukt zu ergeben.
  • Schritt C: Fmoc-(4-trans-L-Hyp)-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox
  • Das Zwischenprodukt aus Schritt B, 0,274 g, wurde in DMSO (10 ml) gelöst und mit DMF (10 ml) verdünnt. Zu der Lösung wurde Doxorubicin-Hydrochlorid, 104 mg, gefolgt von 62 μl Düsopropylethylamin zugegeben. Die gerührte Lösung wurde gekühlt (0°C) und 56 μl Diphenylphosphorylazid wurden zugegeben. Nach 30 Minuten wurden weitere 56 μl DPPA zugegeben und der pH-Wert mit Düsopropylethylamin (DIEA) auf ∼7,5 (pH-Papier) eingestellt. Der pH-Wert der gekühlten Reaktion (0°C) wurde mit DIEA bei ∼7,5 gehalten. Nach 4 Stunden wurde die Reaktion (mittels analytischer HPLC, System A, als vollständig befunden) zu einem Öl konzentriert; HPLC-Bedingungen, System A.
  • Schritt D: (4-trans-L-Hyp)-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox
  • Das obige Produkt aus Schritt C wurde in DMF (10 ml) gelöst, gekühlt (0°C) und 4 ml Piperidin wurden zugegeben. Die Lösung wurde bis zur Trockne konzentriert und mittels präparativer HPLC gereinigt (A = 0,1% NH4OAc-H2O; B = CH3CN). Das Rohprodukt wurde in 100 ml 90%igem Puffer A gelöst, filtriert und auf einer C-18-Umkehrphasen- HPLC-Radialkompressionssäule (Waters, Delta-Pak, 15 μ, 100 Å) gereinigt. Ein Stufengradient von 90% A bis 65% A wurde bei einer Durchflußrate von 75 ml/Min. (UV = 214 nm) eingesetzt.
  • Homogene Produktfraktionen (mittels HPLC, System A, beurteilt) wurden vereinigt und gefriergetrocknet.
  • HPLC-Bedingungen, System A
  • Säule: Vydac 15 cm #218TP5415, C18
    Elutionsmittel: Gradient 95 : 5 (A : B) bis 5 : 95 (A : B) im Verlauf von 45 Minuten; A = 0,1% TFA/H2O, B = 0,1% TFA/Acetonitril
    Durchfluß: 1,5 ml/Min.
    Wellenlänge: 214 nm, 254 nm
    Retentionszeiten: Doxorubicin = 13,66 Min.
    Fmoc-(4-trans-L-Hyp)-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-OH = 18,6 Min.
    Fmoc-(4-trans-L-Hyp)-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox = 23,8 Min.
    (4-trans-L-Hyp)-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox = 17,6 Min.
    Molekülformel: C60H83N9O22
    Molekulargewicht: 1281,56
    Hochauflösende ES-Massenspektroskopie: 1282,59 (MH+)
    HPLC: System A
    Säule: Vydac 15 cm #218TP5415, C18
    Elutionsmittel: Gradient 95 : 5 (A : B) bis 5 : 95 (A : B) im Verlauf von 45 Min.; A = 0,1% TFA/H2O, B = 0,1% TFA/Acetonitril
    Durchfluß: 1,5 ml/Min.
    Wellenlänge: 214 nm, 254 nm
    Retentionszeit: 17,6 Min.
    Analyse der Aminosäurezusammensetzung1:
    Theorie Gefunden
    Ala (1) 1,00
    Ser (2) 1,94
    Chg (1) 0,94
    Gln2 (1) 1,05 (als Glu)
    Hyp (1) 0,96
    Leu (1) 1,03
    Peptidgehalt: 0,690 μMol/mg
    Anmerkung:
  • BEISPIEL 6
  • Beurteilung der Erkennung von Oligopeptid-Doxorubicin-Konjugaten durch freies PSA:
  • Die wie in den Beispielen 3–5 beschrieben hergestellten Konjugate wurden einzeln in PSA-Verdauungspuffer (12 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan, pH 8,0, 25 mM NaCl, 0,5 mM CaCl2) gelöst und die Lösung wurde zu PSA in einem Molverhältnis von 100 : 1 zugegeben. Alternativ ist der verwendete PSA-Verdauungspuffer 50 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan, pH 7,4, 140 mM NaCl. Die Reaktion wird nach unterschiedlichen Reaktionszeiten durch die Zugabe von Trifluoressigsäure (TFA) auf schließlich 1% (Volumen/Volumen) gestoppt. Alternativ wird die Reaktion mit 10 mM ZnCl2 gestoppt. Die gestoppte Reaktion wurde mittels HPLC auf einer Umkehrphasen-C18-Säule unter Verwendung eines wässerigen Gradienten von 0,1% TFA/Acetonitril analysiert. Die Ergebnisse der Beurteilung sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 zeigt den Zeitaufwand (in Minuten), der für eine 50%ige Spaltung der angegebenen Oligopeptid-zytotoxisches Agens-Konjugate mit enzymatisch aktivem freiem PSA erforderlich war. Falls kein Salz für das Konjugat angegeben ist, wurde das freie Konjugat getestet. Die in den Beispielen 4 und 5 beschriebenen Oligopeptid-zytotoxisches Agens-Konjugate wurden hinsichtlich des Zeitaufwandes (in Minuten) beurteilt, der für eine 50%ige Spaltung des Oligopeptids mit enzymatisch aktivem freiem PSA erforderlich war, und eine 50%ige Spaltung fand für diese Konjugate in weniger als 2 Stunden statt.
  • BEISPIEL 7
  • In vitro-Assay der Zytotoxizität von Peptidyl-Derivaten von Doxorubicin:
  • Die Zytotoxizitäten der spaltbaren Oligopeptid-Doxorubicin-Konjugate, hergestellt wie in den Beispielen 3 und 4 beschrieben, für eine Zellinie, von der bekannt ist, daß sie durch unmodifiziertes Doxorubicin abgetötet wird, wurden mit einem Alamar-Blau-Assay beurteilt. Konkret wurden Zellkulturen von LNCaP-Prostatatumorzellen (welche enzymatisches aktives PSA exprimieren) oder DuPRO-Zellen in 96-Mulden-Platten mit Medium (Dulbecco's Minimum Essential Medium-α [MEM-α]) verdünnt, das unterschiedliche Konzentrationen eines gegebenen Konjugats enthielt (endgültiges Plattenmuldenvolumen von 200 μl). Die Zellen wurden 3 Tage lang bei 37°C inkubiert, 20 μl Alamar-Blau werden der Assay-Mulde zugegeben. Die Zellen wurden weiter inkubiert und die Assay-Platten mit einem EL-310 ELISA-Lesegerät bei den beiden Wellenlängen von 570 und 600 nm 4 und 7 Stunden nach Zugabe von Alamar Blau abgelesen. Die relative prozentuale Lebensfähigkeit bei der unterschiedlichen Konzentration an getestetem Konjugat wurde dann gegenüber Kontrollkulturen (kein Konjugat) berechnet. Einige Ergebnisse dieser Beurteilung sind in Tabelle 5 gezeigt. Wenn kein Salz angegeben ist, wurde das freie Konjugat getestet.
  • TABELLE 5
    Figure 00600001
  • BEISPIEL 8
  • In vivo-Wirksamkeit von Peptidyl-zytotoxisches Agens-Konjugaten
  • LNCaP.FGC- oder DuPRO-1-Zellen werden mit Trypsin behandelt, in dem Wachstumsmedium resuspendiert und 6 Minuten bei 200 × g zentrifugiert. Die Zellen werden in serumfreiem MEM-α resuspendiert und gezählt. Das geeignete Volumen dieser Lösung, welches die gewünschte Anzahl an Zellen enthält, wird dann in ein konisches Zentrifugenröhrchen überführt, wie zuvor zentrifugiert und im geeigneten Volumen einer kalten 1 : 1-Mischung von MEM-α-Matrigel (Collaborative Biomedical Products, New Bedford, Mass.) resuspendiert. Die Suspension wird auf Eis gehalten, bis die Tiere geimpft werden.
  • Männliche nackte Harlan-Sprague-Dawley-Mäuse (10–12 Wochen alt) werden ohne Betäubung festgehalten und erhalten eine Impfung mit 0,5 ml Zellsuspension auf der linken Flanke durch subkutane Injektion unter Verwendung einer 22G-Nadel. Die Mäuse erhalten entweder 5 × 105 DuPRO-Zellen oder 1,5 × 107 LNCaP.FGC-Zellen.
  • Nach Impfung mit den Tumorzellen werden die Mäuse nach einem von zwei Protokollen behandelt:
  • Protokoll A:
  • Einen Tag nach der Impfung mit Zellen erhalten die Tiere durch intraperitoneale Verabreichung eine Dosis von 0,1–0,5 ml Volumen Test-Konjugat, Doxorubicin oder Vehikelkontrolle (steriles Wasser). Die Dosierungen des Konjugats und Doxorubicins sind anfänglich die maximale nicht-letale Menge, können jedoch anschließend niedriger titriert werden. Identische Dosen werden in 24-stündigen Intervallen 5 Tage lang verabreicht. Nach 10 Tagen werden Blutproben den Mäusen entnommen und der Serumspiegel an PSA wird bestimmt. Ähnliche Serum-PSA-Spiegel werden in Intervallen von 5–10 Tagen bestimmt. Am Ende von 5,5 Wochen werden die Mäuse getötet und die Gewichte etwaiger vorhandener Tumore werden gemessen und erneut Serum-PSA bestimmt. Die Gewichte der Tiere werden zu Beginn und Ende des Assays bestimmt.
  • Protokoll B:
  • Zehn Tage nach der Impfung mit Zellen werden den Tieren Blutproben entnommen und Serumspiegel an PSA bestimmt. Die Tiere werden dann nach ihren PSA-Serumspiegeln in Gruppen eingeteilt. 14–15 Tage nach der Impfung mit Zellen erhalten die Tiere durch intraperitoneale Verabreichung eine Dosis von 0,1–0,5 ml Volumen Test-Konjugat, Doxorubicin oder Vehikelkontrolle (steriles Wasser). Die Dosierungen des Konjugats und Doxorubicins sind anfänglich die maximale nicht-letale Menge, können jedoch anschließend niedriger titriert werden. Identische Dosen werden in 24-stündigen Intervallen 5 Tage lang verabreicht. Serum-PSA-Spiegel werden in Intervallen von 5–10 Tagen bestimmt. Am Ende von 5,5 Wochen werden die Mäuse getötet, die Gewichte etwaiger vorhandener Tumore gemessen und erneut Serum-PSA bestimmt. Die Gewichte der Tiere werden zu Beginn und Ende des Assays bestimmt.
  • Protokoll C:
  • Einen Tag nach der Impfung mit Zellen erhalten die Tiere durch intraperitoneale Verabreichung eine Dosis von 0,1–0,5 ml Volumen Testkonjugat, Doxorubicin oder Vehikelkontrolle (steriles Wasser). Die Dosierungen des Konjugats und Doxorubicins sind anfänglich die maximale nicht-letale Menge, können jedoch anschließend niedriger titriert werden. Identische Dosen werden in 7-tägigen Intervallen für 5 aufeinanderfolgende Wochen verabreicht. Die Serum PSA-Niveaus werden unmittelbar vor oder zum Zeitpunkt der Tötung der Mäuse bestimmt. Am Ende der 5,5 Wochen werden die Mäuse getötet und die Gewichte etwaiger vorhandener Tumore gemessen. Die Gewichte der Tiere werden zu Beginn und Ende des Assays bestimmt.
  • BEISPIEL 9
  • In vitro-Bestimmung der proteolytischen Spaltung von Konjugaten durch endogene Nicht-PSA-Proteasen
  • Schritt A: Herstellung von proteolytischen Gewebeextrakten
  • Alle Prozeduren werden bei 4°C durchgeführt. Geeignete Tiere werden getötet und die relevanten Gewebe werden isoliert und in flüssigem Stickstoff gelagert. Das gefrorene Gewebe wird mit Hilfe eines Mörsers und Pistills pulverisiert und das pulverisierte Gewebe in einen Potter-Elvejeh-Homogenisator überführt und 2 Volumina Puffer A (50 mM Tris, enthaltend 1,15% KCl, pH 7,5) werden zugegeben. Das Gewebe wird dann mit 20 Stößen aufgebrochen, wobei zuerst ein locker passendes und dann ein genau passendes Pistill verwendet wurde. Das Homogenat wird bei 10.000 × g in einem Schwingbecherrotor (HB4-5) zentrifugiert, das Pellet wird verworfen und der Überstand bei 100.000 × g (Ti 70) zentrifugiert. Der Überstand (Zytosol) wird gewonnen.
  • Das Pellet wird in Puffer B (10 mM EDTA, enthaltend 1,15% KCl, pH 7,5) unter Verwendung desselben Volumens wie oben mit Puffer A eingesetzt resuspendiert. Die Suspension wird in einem Dounce-Homogenisator homogenisiert und die Lösung bei 100.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Pellet (Membran) in Puffer C (10 mM Kaliumphosphatpuffer, enthaltend 0,25 M Sucrose, pH 7,4) unter Verwendung der Hälfte des oben eingesetzten Volumens resuspendiert und mit einem Dounce-Homogenisator homogenisiert.
  • Der Proteingehalt der beiden Lösungen (Zytosol und Membran) wird mit Hilfe des Bradford-Assays bestimmt. Assay-Aliquots werden dann entnommen und in flüssigem N2 eingefroren. Die Aliquots werden bei –70°C gelagert.
  • Schritt B: Proteolytischer Spaltungs-Assay
  • Für jeden Zeitpunkt werden 20 μg Peptid-Doxorubicin-Konjugat und 150 μg Gewebeprotein, hergestellt wie in Schritt A beschrieben und wie mittels Bradford in Reaktionspuffer bestimmt in Lösung mit einem Endvolumen von 200 μl in Puffer (50 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7,2) gebracht. Assay-Reaktionen werden 0, 30, 60, 120 und 180 Minuten laufengelassen und dann sofort in siedendem Wasser für 90 Sekunden gestoppt. Die Reaktionsprodukte werden durch HPLC unter Verwendung einer VYDAC-C18-Säule von 15 cm in Wasser/Acetonitril (5 % bis 50% Acetonitril über 30 Minuten) analysiert.
  • SEQUENZVERZEICHNIS
    Figure 00630001
  • Figure 00640001
  • Figure 00650001
  • Figure 00660001
  • Figure 00670001
  • Figure 00680001
  • Figure 00690001
  • Figure 00700001
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  • Figure 00730001
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  • Figure 00830001
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  • Figure 01000001
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  • Figure 01030001
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  • Figure 01070001
  • Figure 01080001
  • Figure 01090001
  • Figure 01100001
  • Figure 01110001
  • Figure 01120001
  • Figure 01130001
  • Figure 01140001
  • Figure 01150001
  • Figure 01160001

Claims (25)

  1. Konjugat, welches sich zur Behandlung von Prostatakrebs eignet, umfassend ein zytotoxisches Agens in Verknüpfung mit einem Oligopeptid, wobei das Oligopeptid eine Sequenz von Aminosäuren umfaßt, welche von freiem prostataspezifischem Antigen selektiv proteolytisch gespalten wird, und wobei das Verknüpfungsmittel eine kovalente Bindung oder ein chemischer Linker ist, wobei die Sequenz von Aminosäuren mindestens eine cyclische Aminosäure mit einem hydrophilen Substituenten umfaßt, oder das pharmazeutisch annehmbare Salz davon.
  2. Konjugat nach Anspruch 1, wobei das zytotoxische Agens ein Vertreter einer Klasse von zytotoxischen Agentien ist, die aus den folgenden Klassen ausgewählt ist: a) der Anthracyclin-Familie von Arzneiwirkstoffen, b) den Vinca-Alkaloid-Arzneiwirkstoffen, c) den Mitomycinen, d) den Bleomycinen, e) den zytotoxischen Nucleosiden, f) der Pteridin-Familie von Arzneiwirkstoffen, g) Diinenen, h) Estramustin, i) Cyclophosphamid, j) den Taxanen und k) den Podophyllotoxinen, oder das pharmazeutisch annehmbare Salz davon.
  3. Konjugat nach Anspruch 1, wobei das zytotoxische Agens aus den folgenden zytotoxischen Agentien ausgewählt ist: a) Doxorubicin, b) Carminomycin, c) Daunorubicin, d) Aminopterin, e) Methotrexat, f) Methopterin, g) Dichlormethotrexat, h) Mitomycin C, i) Porfiromycin, j) 5-Fluoruracil, k) 6-Mercaptopurin, l) Cytosinarabinosid, m) Podophyllotoxin, n) Etoposid, o) Etoposidphosphat, p) Melphalan, q) Vinblastin, r) Vincristin, s) Leurosidin, t) Vindesin, u) Estramustin, v) Cisplatin, w) Cyclophosphamid, x) Taxol und y) Leurosin, oder das pharmazeutisch annehmbare Salz davon.
  4. Konjugat nach Anspruch 2, wobei das zytotoxische Agens aus Doxorubicin und Vinblastin oder einem zytotoxischen Derivat davon ausgewählt ist.
  5. Konjugat nach Anspruch 2, wobei das zytotoxische Agens Doxorubicin oder ein zytotoxisches Derivat davon ist.
  6. Konjugat nach Anspruch 1, wobei das Oligopeptid ein Oligomer umfaßt, welches ausgewählt ist aus:
    Figure 01180001
    Figure 01190001
    wobei Haa eine cyclische Aminosäure ist, die mit einer hydrophilen Gruppierung substituiert ist, Xaa irgendeine Aminosäure ist, hArg Homoarginin ist, Cha Cyclohexylalanin ist und Chg Cyclohexylglycin ist.
  7. Konjugat nach Anspruch 1, wobei das Oligopeptid ein Oligomer umfaßt, welches ausgewählt ist aus:
    Figure 01190002
    Figure 01200001
  8. Konjugat nach Anspruch 1, wobei das Oligopeptid ein Oligomer umfaßt, welches ausgewählt ist aus:
    Figure 01200002
    wobei 4-Hyp 4-Hydroxyprolin ist, Xaa irgendeine Aminosäure ist, hArg Homoarginin ist, Cha Cyclohexylalanin ist und Chg Cyclohexylglycin ist.
  9. Konjugat nach Anspruch 1, wobei die cyclische Aminosäure mit einem hydrophilen Substituenten ausgewählt ist aus:
    Figure 01210001
    worin: R5 aus HO- und C1-C6-Alkoxy ausgewählt ist; R6 aus Wasserstoff, Halogen, C1-C6-Alkyl, HO- und C1-C6-Alkoxy ausgewählt ist; und t 3 oder 4 ist.
  10. Konjugat, welches sich zur Behandlung von Prostatakrebs eignet, der Formel I:
    Figure 01210002
    wobei: das Oligopeptid ein Oligopeptid ist, welches selektiv von dem freien prostataspezifischen Antigen (PSA) erkannt wird und in der Lage ist, von der enzymatischen Aktivität des freien prostataspezifischen Antigens proteolytisch gespalten zu werden, wobei das Oligopeptid eine cyclische Aminosäure der Formel:
    Figure 01220001
    umfaßt, und wobei das C-terminale Carbonyl kovalent an das Amin von Doxorubicin gebunden ist; R ausgewählt ist aus a) Wasserstoff, b) -(C=O)R1a,
    Figure 01220002
    R1 und R2 unabhängig aus Wasserstoff, OH, C1-C6-Alkyl, C1-C6-Alkoxy, C1-C6-Aralkyl und Aryl ausgewählt sind; R1a C1-C6-Alkyl, hydroxyliertes Aryl, polyhydroxyliertes Aryl oder Aryl ist; R5 aus HO- und C1-C6-Alkoxy ausgewählt ist; R6 aus Wasserstoff, Halogen, C1-C6-Alkyl, HO- und C1-C6-Alkoxy ausgewählt ist; und n 1, 2, 3 oder 4 ist; p 0 oder eine ganze Zahl zwischen 1 und 100 ist; q 0 oder 1 ist, vorausgesetzt, daß wenn p 0 ist, q 1 ist; r eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist; und t 3 oder 4 ist; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
  11. Konjugat nach Anspruch 10, wobei die cyclische Aminosäure
    Figure 01230001
    R aus a) Wasserstoff, b) -(C=O)R1a,
    Figure 01230002
    Figure 01240001
    ausgewählt ist, R1 und R2 unabhängig aus Wasserstoff, C1-C6-Alkyl und Aryl ausgewählt sind; R1a C1-C6-Alkyl oder Aryl ist, n 1, 2, 3 oder 4 ist; n' 0, 1, 2 oder 3 ist; p 0 oder eine ganze Zahl zwischen 1 und 14 ist; q 0 oder 1 ist, vorausgesetzt, daß wenn p 0 ist, q 1 ist; r eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist; t 3 ist; oder ein optisches Isomer oder pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
  12. Konjugat nach Anspruch 10, wobei das Oligopeptid ein Oligomer ist, welches eine Aminosäuresequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus:
    Figure 01240002
    Figure 01250001
    wobei 4-Hyp 4-Hydroxyprolin ist, Xaa irgendeine Aminosäure ist, hArg Homoarginin ist, Cha Cyclohexylalanin ist und Chg Cylohexylglycin ist, oder ein optisches Isomer oder pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
  13. Konjugat nach Anspruch 12, wobei Xaa Alanin oder Isoleucin ist, oder ein optisches Isomer oder pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
  14. Konjugat nach Anspruch 10, welches ausgewählt ist aus:
    Figure 01250002
    Figure 01260001
    Figure 01270001
    oder ein optisches Isomer oder pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
  15. Konjugat nach Anspruch 10, welches
    Figure 01270002
    ist, oder ein optisches Isomer oder pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
  16. Konjugat nach Anspruch 10, welches [N-Ac-(4-trans-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox (SEQ-ID-Nr. 68)
    Figure 01280001
    ist, oder ein optisches Isomer oder pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
  17. Konjugat nach Anspruch 10, welches
    Figure 01290001
    oder ein optisches Isomer oder pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
  18. Konjugat nach Anspruch 10, welches
    Figure 01290002
    (SEQ-ID-Nr. 70) ist, oder ein optisches Isomer oder pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
  19. Konjugat nach Anspruch 1 der Formel II:
    Figure 01300001
    wobei: das Oligopeptid ein Oligopeptid ist, welches spezifisch von dem freien prostataspezifischen Antigen (PSA) erkannt wird und in der Lage ist, von der enzymatischen Aktivität des freien prostataspezifischen Antigens proteolytisch gespalten zu werden, und das Oligopeptid eine cyclische Aminosäure der Formel:
    Figure 01300002
    umfaßt; XL -NH-(CH2)u-NH- ist, R ausgewählt ist aus a) Wasserstoff b) -(C=O)R1a;
    Figure 01310001
    R1 und R2 unabhängig aus Wasserstoff, OH, C1-C6-Alkyl, C1-C6-Alkoxy, C1-C6-Aralkyl und Aryl ausgewählt sind; R1a C1-C6-Alkyl, hydroxyliertes Aryl, polyhydroxyliertes Aryl oder Aryl ist; R19 Wasserstoff, (C1-C3-Alkyl)-CO oder chlorsubstituiertes (C1-C3-Alkyl)-CO ist; n 1, 2, 3 oder 4 ist; p 0 oder eine ganze Zahl zwischen 1 und 100 ist; q 0 oder 1 ist, vorausgesetzt, daß wenn p 0 ist, q 1 ist; r 1, 2 oder 3 ist; t 3 oder 4 ist; u 1, 2, 3, 4 oder 5 ist, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
  20. Konjugat nach Anspruch 16, welches ausgewählt ist aus:
    Figure 01320001
    oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder optisches Isomer davon.
  21. Konjugat nach Anspruch 1 der Formel III:
    Figure 01320002
    wobei: das Oligopeptid ein Oligopeptid ist, welches spezifisch von dem freien prostataspezifischen Antigen (PSA) erkannt wird und in der Lage ist, von der enzymatischen Aktivität des freien prostataspezifischen Antigens proteolytisch gespalten zu werden, und das Oligopeptid eine cyclische Aminosäure der Formel
    Figure 01330001
    umfaßt; Rg und Rh unabhängig aus Wasserstoff, C1-C6-Alkyl, -C1-C6-Alkyl-OH, -C1-C6-Alkyl-di-OH, -C1-C6-Alkyl-tri-OH und
    Figure 01330002
    ausgewählt sind, vorausgesetzt, daß mindestens eines von Rg und Rh nicht Wasserstoff oder C1-C6-Alkyl ist, oder Rg und Rh kombiniert werden, um einen zweibindigen Rest -CH2CH2OCH2CH2-zu bilden; R19 Wasserstoff, (C1-C3-Alkyl)-CO oder chlorsubstituiertes (C1-C3-Alkyl)-CO ist; p 0 oder eine ganze Zahl zwischen 1 und 100 ist; q 0 oder 1 ist, vorausgesetzt, daß, wenn p 0 ist, q 1 ist; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
  22. Konjugat nach Anspruch 18, welches
    Figure 01340001
    oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder optisches Isomer davon.
  23. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen pharmazeutischen Träger und darin dispergiert eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung nach Anspruch 1, 10, 14 oder 17.
  24. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 23 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Prostatakrebs.
  25. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 23 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von gutartiger Prostata-Hyperplasie.
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