FR3055550B1 - Nouvel actif immunomodulateur et composition le comprenant - Google Patents

Abstract

La présente demande concerne un polysaccharide sulfaté extrait d'une algue rouge de l'espèce Haliptilon subulatum, ou un sel de celui-ci en tant que principe actif. Plus particulièrement, la présente demande concerne un polysaccharide sulfaté extrait d'une algue rouge de l'espèce Haliptilon subulatum, ou un sel de celui-ci en tant que principe actif, pour son utilisation dans la modulation de la réponse immunitaire chez l'être humain ou l'animal, notamment dans la prévention et/ou le traitement des maladies inflammatoires, en particulier au niveau de la peau.

Description

Nouvel actif immunomodulateur et composition le comprenant.

La présente invention concerne un polysaccharide sulfaté extrait d’une algue rouge pour son utilisation dans la modulation de la réponse immunitaire chez l’être humain ou l’animal.

La peau est un épithélium multi-stratifié kératinisé entourant toute la surface externe de l’Homme. La peau joue notamment un rôle : de barrière mécanique au développement bactérien, virale et parasitaire, grâce à une faible perméabilité et à la desquamation de la peau, de barrière chimique présentant des protéines et des peptides antimicrobiens pouvant entraîner : une rupture mécanique des membranes bactériennes, une déstructuration enzymatique des membranes bactériennes et une séquestration de nutriment, de barrière biologique présentant une flore commensale qui est un ensemble de bactéries se situant sur la peau et les muqueuses et jouant un rôle important de barrière.

La peau est en contact permanent avec de nombreux facteurs environnementaux (virus, parasites et bactéries, mais également exposition au soleil et notamment aux UV) susceptibles de l’endommager. En réponse à divers facteurs environnementaux, le système immunitaire élabore des mécanismes de défense naturelle (immunité innée appelée aussi naturelle ou non spécifique) et acquise (immunité adaptative ou spécifique).

Quand l’agent infectieux a franchi la barrière épidermique, les motifs moléculaires caractéristiques des micro-organismes vont interagir avec les récepteurs de type Toll présents sur la membrane des kératinocytes, des cellules dendritiques, des mastocytes et des macrophages. Ces cellules activées deviennent effectrices (phagocytose des bactéries par les cellules dentritiques et les macrophages) et libèrent des médiateurs vasodilatateurs permettant l’exsudation plasmatique et des cytokines inflammatoires comme le TNFa, IL1a, IL8, ce qui amplifie à nouveau la réaction de vasodilatation et vasoperméabilisation.

Le VEGF (facteur de croissance endothélial vasculaire) est un facteur épidermique essentiel au processus de vasodilatation. Son expression est souvent augmentée dans les pathologies présentant des anomalies vasculaires, comme la couperose et les kératinocytes sont capables de sécréter du VEGF sous l'effet entre autre des cytokines inflammatoires. Le VEGF agit donc directement sur les cellules endothéliales de la paroi des vaisseaux sanguins, et entraîne donc une dilatation et une perméabilisation de cette paroi. De plus, il favorise la production d'enzymes appelés MMP (Matrix Metallo-Protéases) qui sont capables de dégrader les fibres de soutien du derme (collagène et élastine), cette dégradation participe alors au relâchement des parois des vaisseaux sanguins et leur fragilisation entraînant des rougeurs installées.

Des crèmes comprenant des composés de type corticoïdes, dermocorticoïdes, anti-acnéiques, oestrogènes ou encore des anti-inflammatoires stéroidiens ou non stéroidiens, obtenus par synthèse chimique, sont couramment utilisées pour traiter les inflammations de la peau. Or, les composés chimiques contenus dans ces crèmes peuvent générés lors de leur administration au patient des effets secondaires, comme notamment des réactions allergiques.

Par conséquent, il apparaît nécessaire de disposer de nouvelles compositions d’origine naturelle, capables d’inhiber ou d’antagoniser les effets du VEGF, afin de prévenir et /ou traiter les maladies inflammatoires, notamment au niveau de la peau, tout en diminuant les risques d’effets secondaires.

De manière tout à fait surprenante, les inventeurs ont montré que les polysaccharides sulfatés extrait de l’algue rouge marine du genre Haliptilon subulatum présentent des propriétés immunomodulatrices intéressantes, en particulier sur l’inhibition de la libération de facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) par les cellules impliquées dans le processus inflammatoire et/ou comme antagoniste du VEGF.

Ainsi la présente invention a pour objet un polysaccharide sulfaté extrait d’une algue rouge de l’espèce Haliptilon subulatum ou un sel de celui-ci pour son utilisation dans la modulation de la réponse immunitaire chez l’être humain ou l’animal.

Par « modulation de la réponse immunitaire », on entend la signification habituellement apportée à ces termes et bien connue de l'Homme du métier, en particulier toute propriété permettant de stimuler ou d’inhiber les réactions immunitaires du corps humain ou animal.

Les polysaccharides issus des algues rouges sont construits sur la base d’un enchaînement linéaires d’unités 3-/3-galactopyranoses et 4-a-galactopyranose alternant régulièrement. L’unité /3-galactopyranose appartient toujours à la série d, alors que l’unité α-galactopyranose est de configuration d chez les carraghénanes et de configuration L chez les agarocolloïdes. Par ailleurs, une partie des résidus 4-a-galactopyranoses peut exister sous la forme de 3,6-anhydrogalactose. La forme 3,6-anhydrogalactose est obtenue par une élimination de l'ester sulfate porté par le carbone 6 de l'unité a-galactose liée en 4, sous l'action de galactose-6-sulfurylases lors de la biosynthèse ou par un traitement alcalin.

Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le polysaccharide sulfaté est extrait à partir d’une algue rouge, avantageusement à partir d’une algue marine rouge, avantageusement une algue marine rouge de la classe des Florideophyceae, encore plus avantageusement d’une algue marine rouge de l’espèce Haliptiion subulatum.

Dans un mode de réalisation particulier, le polysaccharide sulfaté selon l’invention, dans lequel le taux de sulfate dudit polysaccharide est inférieur ou égal à 20% en masse du polysaccharide, répond à la formule (I) : [(unité A)-(unité B)]n (l), dans laquelle : - l’unité A est un 3-/3-D-galactopyranose, dans lequel les fonctions hydroxylés libres sont substituées par un ou plusieurs groupements choisis parmi XA2, Xa4, Xa6, l’unité B est choisie dans le groupe constitué du résidu B1 et du résidu B2 : - le résidu B1 étant un 4-a-D/L-galactopyranose, dans lequel les fonctions hydroxylés libres sont substituées par un ou plusieurs groupements choisis parmi, XB2, Xb3 etXB6 et, - le résidu B2 étant un 4-a-3,6-anhydrogalactopyranose, dans lequel les fonctions hydroxylés libres du 4-a-3,6-anhydrogalactopyranose sont substituées par un groupement XB2 et, - les résidus B1 et B2 étant distribués de manière aléatoire dans le polysaccharide et le résidu B2 représentant au plus 5% en masse du polysaccharide, - l’unité A est reliée à l’unité B par une liaison O-glycosidique entre le carbone en position 1 de l’unité A et le carbone en position 4 de l’unité B et, - l’unité B est reliée à l’unité A par une liaison O-glycosidique entre le carbone en position 1 de l’unité B et le carbone en position 3 de l’unité A, - XA2, Xa4, Xa6, Xb2, Xb3 et Xb6 sont choisis indépendamment les uns des autres et indépendamment pour chaque unité A et/ou B dans le groupe comprenant : - un atome d’hydrogène; - un groupement sulfate, - un groupement pyruvate (-COO-CO-CH3), ledit groupement pyruvate étant lié au groupement XA4 par son carbone en position 2 et au groupement XA6 par son carbone en position 2; - une unité saccharidique liée à l’unité A ou B par une liaison de type O-glycosidique en position 1 (Ci) de l’unité saccharidique, l’unité saccharidique étant choisie parmi un galactose (ou T-galactose), un xylose (ou T-xylose), un arabinose (ou T-arabinose) et un acide glucuronique (ou T- acide glucuronique); et - un groupe (Ci-C6) alcoxyle, un groupe (Ci-C6) alkylcarbonyle, un groupe (Ci-C6) alkoxycarbonyle, un groupe (Ci-C6) acyloxy, un groupement issu d’un diacide, un groupement phosphate ; - un groupement -CH2Xa, dans lequel Xa représente un atome d’hydrogène, un groupe hydroxy, un groupe (Ci-C6) alcoxyle, un groupe (Ci-C6) acyloxy, un groupement sulfate ; - n est un entier compris entre 10 et 3000.

Les formules (la) et (lb) ci-dessous illustrent respectivement les motifs (unité A) - (résidu B1) et (unité A) - (résidu B2) :

Au sens de la présente invention, on entend par « polysaccharide » aussi bien un polysaccharide de haute masse moléculaire ou un polysaccharide de faible masse moléculaire. Par «polysaccharide de haute masse moléculaire», on entend un polysaccharide ayant une masse moléculaire comprise entre 100 et 1 000 kDa. Par «polysaccharide de faible masse moléculaire», on entend un polysaccharide ayant une masse moléculaire comprise entre 5 et 100 kDa.

Au sens de la présente invention, « n » représente un nombre entier compris entre 10 et 3000, avantageusement compris entre 10 et 2000, avantageusement compris entre 10 et à 1000, avantageusement compris entre 10 et 900, avantageusement compris entre 10 et 800 avantageusement compris entre 10 et 700. De manière avantageuse, «n» est compris entre 10 et 700, avantageusement entre 50 et 700, de manière plus avantageuse entre 70 et 650.

Au sens de la présente invention, on entend par « T-unité saccharidique », une unité saccharidique liée à l’unité A ou l’unité B par une liaison de type O-glycosidique en position 1 (Ci) de l’unité saccharidique. Ainsi, on entend respectivement par «T-galactose », « T-xylose », « T-arabinose » et « T-acide glucuronique », un galactose lié à l’unité A ou B par une liaison de type O-glycosidique en position 1 (Ci) du galactose, un xylose lié à l’unité A ou B par une liaison de type O-glycosidique en position 1 (Ci) du xylose, un arabinose lié à l’unité A ou B par une liaison de type O-glycosidique en position 1 (Ci) de l’arabinose et un acide glucuronique lié à l’unité A ou B par une liaison de type O-glycosidique en position 1 (Ci) de l’acide glucuronique.

Au sens de la présente invention, on entend par groupe (Ci-C6) alcoxyle ou (Ci-C6) alkoxyle ou (Ci-C6) alkyloxy, les groupes -OR-, R étant un groupe alkyle en Ci-C6, c’est-à-dire une chaîne droite ou ramifiée comprenant de 1 à 6 atomes de carbone. A titre d’exemples d’alkyles, on peut citer les groupes méthyle, éthyle, propyle, butyle, isobutyle, tert-butyle, pentyle, isopentyle, tert-pentyle, hexyle et isohexyle. On peut citer à titre d’exemples de (Ci-C6) alcoxyles, les groupes méthoxy (OCH3), éthoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, tert-butoxy, pentoxy, isopentoxy, tert-pentoxy, hexoxy, isohexoxy.

Au sens de la présente invention on entend par groupe (Ci.C6) alkylcarbonyle, les groupes -COR, R étant un groupe alkyle en Ci-C6tel que défini précédemment. On peut citer à titre d’exemples les groupes methylcarbonyle, ethylcarbonyle, n-propylcarbonyle, iso-propylcarbonyle, n-butylcarbonyle, iso-butylcarbonyle, sec-butylcarbonyle, tert-butylcarbonyle, n-pentylcarbonyle, iso-pentylcarbonyle, neo-pentylcarbonyle, tert-pentylcarbonyle n-hexylcarbonyle, iso-hexylcarbonyle.

Au sens de la présente invention, on entend par groupe (Ci.C6) alkoxycarbonyle, les groupes COOR, R étant un groupe alkyle en Ci-C6tel que défini précédemment. On peut citer à titre d’exemples les groupes méthoxycarbonyle (-COOCH3), éthoxycarbonyle, propoxycarbonyle, isopropoxycarbonyle, butoxycarbonyle, isobutoxycarbonyle, tert-butoxycarbonyle, pentoxycarbonyle, isopentoxycarbonyle, tert-pentoxycarbonyle, hexoxycarbonyle, isohexoxycarbonyle.

Au sens de la présente invention, on entend par groupe (Ci.C6) acyloxy, les groupes -OCOR où R est un groupe alkyle en Ci-C6 tel que défini précédemment. On peut citer à titre d’exemple les groupes acétyloxy (-OCOCH3), propionyloxy.

Au sens de la présente invention, on entend par groupement issu d’un diacide, un groupement répondant à la formule -COO -(CH2)P-COOH, où p est compris entre 0 et 4. On peut citer à titre d’exemple de diacide dont sont issus ces groupements : les groupes oxalate, malonate, succinate, glutarate.

Au sens de l'invention, on entend par « groupement sulfate », un groupement du type (-SO3H). Au sens de l'invention, on entend par « groupement phosphate », un groupement du type (-PO3H2).

Au sens de l'invention, on entend par « groupement sulfate », un groupement du type (-SO3H) ou de type -SO3'.

Dans un mode de réalisation avantageux, les groupements XA2, Xa4, Xa6, Xb2, Xb3 et Xb6 sont choisis indépendamment les uns des autres et indépendamment pour chaque unité A et/ou B dans le groupe comprenant : - un atome d’hydrogène, - un groupement sulfate, - un groupement pyruvate, ledit groupement pyruvate étant lié au groupement XA4 par son carbone en position 2 et au groupement XA6 par son carbone en position 2, - une unité saccharidique liée à l’unité A ou B par une liaison de type O-glycosidique en position 1 (Ci) de l’unité saccharidique et choisie parmi un T-galactose, un T-xylose, un T-arabinose et un T-acide glucuronique.

Dans un mode de réalisation plus avantageux, - Xa2, Xb2 et Xb3 sont choisis parmi un atome d’hydrogène et un groupement sulfate; - XA4 est choisi parmi un atome d’hydrogène, un groupement sulfate et un groupement pyruvate, ledit groupement pyruvate étant lié au groupement XA4 par son carbone en position 2 et au groupement XA6 par son carbone en position 2; - XA6 est choisi parmi un atome d’hydrogène, un groupement sulfate, une unité saccharidique T-galactose liée à l’unité A par une liaison de type O-glycosidique, une unité saccharidique T-xylose liée à l’unité A par une liaison de type O-glycosidique, une unité saccharidique T-arabinose liée à l’unité A par une liaison de type O-glycosidique et une unité saccharidique T-acide glucuronique liée à l’unité A par une liaison de type O-glycosidique, et - XB6 est choisi parmi un atome d’hydrogène, un groupement sulfate, une unité saccharidique T-galactose liée par une liaison de type O-glycosidique au résidu B1, une unité saccharidique T-xylose liée par une liaison de type O-glycosidique au résidu B1, une unité saccharidique T-arabinose liée par une liaison de type O-glycosidique au résidu B1, et une unité saccharidique T-acide glucuronique liée par une liaison de type O-glycosidique au résidu B1.

On entend par « sel», tout sel d’addition avec un acide minéral ou organique par action d’un tel acide au sein d’un solvant organique ou aqueux tel qu’un alcool, une cétone, un éther, et qui ne provoque pas de réactions allergiques lors de son contact avec la peau ou toute autre partie du corps humain ou de l’animal. A titre d’exemple de tels sels, on peut citer les sels suivants benzènesulfonate, bromhydrate, chlorhydrate, citrate, éthanesulfonate, fumarate, gluconate, iodate, iséthionate, maléate, méthanesulfonate, méthylène-bis-b-oxynaphtoate, nitrate, oxalate, palmoate, phosphate, salicylate, sulfate, tartrate, théophyllinacétate et p-toluènesulfonate. Dans un mode de réalisation particulier, le sel est un sel cosmétiquement acceptable ou un sel dermatologiquement acceptable.

Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le polysaccharide sulfaté peut inhiber la libération de VEGF par les cellules impliquées dans le processus inflammatoire.

Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le polysaccharide sulfaté peut être un antagoniste du VEGF.

De plus, comme démontré dans les exemples, le polysaccharide sulfaté selon l’invention est capable d’inhiber la formation des pseudotubes induite par le VEGF dans une coculture de cellules endothéliales dermiques humaines (HMVEC) et de fibroblastes humains normaux (NHDF), d’inhiber l’expression des gènes impliqués dans l’angiogénèse chez des kératinocytes épidermiques humains normaux (NHEK), et en particulier JAG1, VEGFA et CYR61. Le polysaccharide sulfaté est également capable d’inhiber la prolifération cellulaire, chez des cellules de type NHEK en stimulant l’expression du gène CDKN1C codant pour un inhibiteur de la prolifération cellulaire, ainsi que l’expression du gène CEBPA qui code pour une protéine CEBPA impliquée dans la régulation du cycle cellulaire. De plus, le polysaccharide sulfaté induit chez les mêmes cellules NHEK une inhibition de l’expression des gènes codant pour les facteurs de croissance (HBEGF et VEGFA) ou les gènes impliqués dans la régulation de la prolifération cellulaire (DUSP6, DUSP5, DUSP4, CDKN3).

De plus, ces polysaccharides sulfatés sont obtenus à partir d'algues, réduisant ainsi les coûts de production et les risques de contamination.

Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le polysaccharide sulfaté possède une masse moléculaire inférieure ou égale à 500 kDa. De manière avantageuse, le polysaccharide sulfaté selon l’invention possède une masse moléculaire inférieure ou égale à 450 kDa, avantageusement inférieure ou égal à 400 kDa, avantageusement inférieure ou égale à 350 kDa, avantageusement inférieure ou égal à 300 kDa, avantageusement inférieure ou égale à 250 kDa, avantageusement inférieur ou égal à 200 kDa. De manière avantageuse, le polysaccharide sulfaté selon l’invention possède une masse moléculaire comprise entre 10 kDa et 500 kDa, avantageusement comprise entre 10 kDa et 400 kDa, avantageusement comprise entre 10 kDa et 300 kDa, avantageusement comprise entre 10 kDa et 250 kDa.

Dans un autre mode de réalisation particulier de l’invention, le polysaccharide sulfaté présente un taux de sulfates inférieur ou égal à 20%. De manière avantageuse, le taux de sulfates du polysaccharide sulfaté est inférieur ou égal à 19%, avantageusement inférieur ou égal à 18%, avantageusement inférieur ou égal à 17%, avantageusement inférieur ou égal à 16%. De manière avantageuse, le taux de sulfates du polysaccharide sulfaté est compris entre 8% et 20%, avantageusement entre 9% et 18%, avantageusement entre 10% et 16%, avantageusement entre 13% et 16%.

Dans un autre mode de réalisation de l’invention, le polysaccharide sulfaté possède un taux de résidus 3,6-anhydrogalactopyranose inférieur ou égal à 5%. Dans un mode de réalisation avantageuse, le polysaccharide sulfaté possède un taux de résidus 3,6-anhydrogalactopyranose inférieur ou égal à 4%, avantageusement inférieur ou égal à 3%, avantageusement inférieur ou égal à 2%, avantageusement inférieur ou égal à 1,5%. De manière encore plus avantageuse, le polysaccharide sulfaté possède un taux de résidus 3,6-anhydrogalactopyranose inférieur ou égal à 1,4%.

La présente invention concerne également des compositions, notamment des compositions cosmétiques et/ou dermatologiques, permettant de réduire les anomalies vasculaires grâce à l'association d'actifs capables d’inhiber la formation des pseudotubes induite par le VEGF et de réduire la destruction des fibres de la matrice.

Dans un mode de réalisation particulier, la composition peut être une composition cosmétique ou une composition dermatologique.

Par « composition cosmétique », on entend toute substance ou préparation destinée à être appliquée sur la peau, en vue de la nettoyer, de la protéger, de la maintenir en bon état, d'en modifier l'aspect, de la parfumer ou d'en corriger l'odeur.

Par « composition dermatologique», on entend toute substance ou préparation destinée à être appliquée sur la peau, les muqueuses et les phanères (ongles, cheveux, poils) en vue de prévenir l’apparition de troubles cutanés et/ou de les traiter.

Dans les compositions selon l'invention, le polysaccharide sulfaté est utilisé en une quantité allant de 0,000001% à 10% en masse par rapport à la masse totale de la composition, avantageusement en une quantité allant de 0,0001% à 5 % en masse par rapport à la masse totale de la composition. De manière encore plus avantageuse, le polysaccharide sulfaté est utilisé en une quantité allant de 1% à 5 % en masse par rapport à la masse totale de la composition.

De façon connue, la composition de l'invention peut également contenir au moins un excipient pharmaceutiquement, dermatologiquement ou cosmétiquement acceptable habituel dans les domaines considérés, tels que les gélifiants hydrophiles ou lipophiles, les composés hydrophiles ou lipophiles, les huiles, les émulsifiants, les conservateurs, les antioxydants, les solvants, les parfums, les charges, les filtres, les absorbeurs d'odeur et les matières colorantes. Les quantités de ces différents excipients sont celles classiquement utilisées dans les domaines considérés, et par exemple de 0,01 % à 10 % de la masse totale de la composition. Ces excipients, selon leur nature, peuvent être introduits dans la phase grasse, dans la phase aqueuse et/ou dans les sphérules lipidiques.

Comme huiles utilisables dans l'invention, on peut citer les huiles minérales (huile de vaseline), les huiles végétales (fraction liquide du beurre de karité, huile de tournesol), les huiles animales (perhydrosqualène), les huiles de synthèse (huile de Purcellin), les huiles siliconées (cyclométhicone) et les huiles fluorées (perfluoropolyéthers). On peut ajouter à ces huiles des alcools gras et des acides gras (acide stéarique). Comme émulsionnants utilisables dans l'invention, on peut citer par exemple le stéarate de glycérol, le polysorbate 60 et le mélange de PEG-6/PEG-32/Glycol Stéarate. Comme solvants utilisables dans l'invention, on peut citer les alcools inférieurs, notamment l'éthanol et l'isopropanol. Comme gélifiants hydrophiles, on peut citer les polymères carboxyvinyliques (carbomer), les copolymères acryliques tels que les copolymères d'acrylates/alkylacrylates, les polyacrylamides, les polysaccharides tels que l'hydroxypropylcellulose, les gommes naturelles et les argiles, et, comme gélifiants lipophiles, on peut citer les argiles modifiées comme les bentones, les sels métalliques d'acides gras comme les stéarates d'aluminium, la silice hydrophobe, les polyéthylènes et l'éthylcellulose. Comme composés hydrophiles, on peut utiliser les protéines ou les hydrolysats de protéine, les acides aminés, les polyols, l'urée, l'allantoïne, les sucres et les dérivés de sucre, les vitamines, l'amidon, les extraits végétaux, notamment d'Aloe Vera, et les hydroxyacides.

Comme composés lipophiles, on peut utiliser le tocophérol (vitamine E) et ses dérivés, le rétinol (vitamine A) et ses dérivés, les acides gras essentiels, les céramides, les huiles essentielles.

On peut également associer les polysaccharides sulfatés à des agents actifs, notamment des agents anti-rougeurs, des décongestionnants, des antibactériens, des antiseptiques et des antimicrobiens, des anti-inflammatoires, des agents anti-irritants et ou apaisants, des agents cicatrisants et/ou restructurant de la barrière cutanée, des antioxydants, des agents hydratants / émollients, des agents anti-âge, des filtres et écrans solaires minéraux ou organiques, des actifs protecteurs solaires.

Parmi ces agents actifs, on peut citer à titre d'exemple: les agents anti-rougeurs tels que les peptides de lupin, le perméthol, la génistéine, l'esculoside, le sulfate de dextrane, l'hespéridine méthylchalcone, les rétinoïdes, la licochalcone, l'oxyméthazoline, la kinétine, l'extrait de réglisse, la vitamine P like, I ' extrait de petit houx, le Sophora japonica, l'extrait d'Hamamélis, le ruscus, les antibiotiques tels que la doxycycline, les polyphénols dont les tanins, les acides phénoliques, les anthocyanes, les procyanidols, les flavonoïdes avec par exemple la quercétine, les extraits de thé vert, de fruits rouges, de cacao, de raisin, de Passiflora incarnata, de Citrus ; les antiseptiques tels que l'acide salicylique et ses dérivés (acide n-octanoy1-5 salicylique), ou le crotamiton ; les antibactériens tels que le phosphate de clindamycine, l'érythromycine ou les antibiotiques de la classe des tétracyclines ; les antiparasitaires, en particulier le métronidazole ou les pyréthrinoïdes ; les antifongiques, en particulier les composés appartenant à la classe des imidazoles tels que l'éconazole, le kétoconazole ou le miconazole ou leurs sels, les composés polyènes, tels que l'amphotéricine B, les composés de la famille des allylamines, tels que la terbinafine, ou encore l'octopirox ; les agents anti-inflammatoires stéroïdiens (AIS), tels que les corticoïdes, l'hydrocortisone, le valérate de bétaméthasone ou le propionate de clobétasol, ou les agents antises sels, l'acide acétylsalicylique, l'acétaminophène ou l'acide glycyrrhétinique ou les agents anti-inflammatoires non- stéroïdiens (AINS) ; les agents anesthésiques tels que le chlorhydrate de lidocaïne et ses dérivés ; les agents antiprurigineux comme la thénaldine, la triméprazine ou la cyproheptadine; les agents anti-radicaux libres, tels que l'alpha-tocophérol ou ses esters, les superoxydes dismutases, certains chélatants de métaux ou l'acide ascorbique et ses esters ; les agents kératolytiques comme l'acide rétinoïque 13 cis ou ail trans, le peroxyde de benzoyle ou les hydroxyacides ; les agents antiviraux tels que l'acyclovir et le valacyclovir ; les agents anti-irritants et ou apaisants tels que l'acide glycyrrhétinique (les dérivés de réglisse) avec ses sels et esters, l'acide lipoïque, le beta- carotène, la vitamine B3 (niacinamide, nicotinamide), la vitamine E, la vitamine C, la vitamine B12, le lycopène ou la lutéine, les eaux de source ou thermales (eau d'Avène, eau de la Roche Posay, eau de Saint Gervais, eau d'Uriage, eau de Gamarde), ou encore la disulone topique. On peut citer également les isoflavones, notamment de soja, comme par exemple la génistéine/génistine, daidzéine/daidzine ; les agents cicatrisants et/ou restructurant de la barrière cutanée tels que le panthénol (vitamine B5), l'oxyde de zinc, l'acide madécassique ou asiatique, le sulfate de dextrane, le coenzyme Q10, la glucosamine et ses dérivés, la chondroïtine sulfate et globalement les glycosaminoglycanes, le sulfate de dextrane, les céramides, le cholestérol, le squalane, les phospholipides. Peuvent également être utilisés des agonistes des récepteurs activés par les proliférateurs de peroxysomes (PPARs) tels que le rosiglitazone ou le pioglitazone, les agonistes des récepteur X de rétinoïdes (RXR), les agonistes des récepteurs des oxystérols (LXR) ; les antioxydants tels que les thiols et les phénols, les dérivés de réglisse comme l'acide glycyrrhétinique avec ses sels et esters, l'alpha bisabolol, l'acide lipoïque, la vitamine B12, la vitamine B3 (niacinamide, nicotinamide), les vitamines C, les vitamines E, le coenzyme Q 10, le krill, le glutathion, le BHT pour butylhydroxytoluène, le BHA pour butylhydroxyanisol, le lycopène ou la lutéine, le beta-carotène. Dans le groupe des antioxydants, on trouve aussi les substances anti-glycation telles que la carnosine ou certains peptides, la n-acétyl-cystéine, ainsi que les enzymes antioxydants ou antiradicalaires comme la SOD (super oxyde dismutase), la catalase, la glutathion peroxydase, la thioredoxine réductase et leurs agonistes ; les agents hydratants / émollients tels que la glycérine ou ses dérivés, l'urée, l'acide pyrrolidone carboxylique et ses dérivés, l'acide hyaluronique de toute masse moléculaire, les glycosaminoglycanes et tout autre polysaccharides d'origine marine, végétale ou biotechnologique comme par exemple la gomme xanthane, le fucogel®, des acides gras comme l'acide laurique, l'acide myristique, les acides gras poly- et mono- insaturés de type oméga 3, 6 et 7, 9 comme l'acide linoléique et acide palmitoléique, certains beurre comme le beurre de karité ; les agents anti-âge tels que les vitamines C, l'acide hyaluronique de toute masse moléculaire, les rétinoïdes comme le rétinol, le rétinal et les rétinoïdes ; en particulier les rétinoïdes non aromatiques tels le rétinaldéhyde, la trétinoïne, l’isotrétinoïne et l'acide rétinoïque 9-cis, la vitamine A, les rétinoïdes monoaromatiques tels l'étrétinate, l'all-trans acitretine et le motrerinide, et les rétinoïdes polyaromatiques tels que l'adapalène, le tazarotène, le tamibarotène et l'arotinoïde methyl sulfone ; les actifs protecteurs solaires en particulier les filtres ou écrans solaires UVB et/ou UVA ; tels les écrans ou filtres minéraux et/ou organiques connus de l'Homme du métier qui adaptera leur choix et leurs concentrations en fonction du degré de protection recherché. A titre d'exemples d'actifs protecteur solaire, on peut notamment citer le dioxyde de titane, l'oxyde de zinc, le méthylène bis-benzotriazolyl tétraméthylbutylphénol (nom commercial : TINOSORB M®) et le Bis-éthylhéxyloxyphénol méthoxyphényl triazine (nom commercial : TINOSORB S®), l'octocrylène, le butyl méthoxydibenzoylméthane, l'acide terephthalylidene dicamphor sulfonique, le 4-méthylbenzylidène de camphre, le benzophénone, l'éthylhexyl méthoxycinnamate, l'éthylhexyl diméthyl PABA, le diéthylhexyl butamido triazone.

Les compositions selon l'invention peuvent se présenter sous toutes les formes connues de la personne du métier et adaptée à la voie d'administration, notamment par injection, par voie orale, par voie topique, ou encore sous forme de compléments et/ou produits alimentaires.

Pour une application topique, la composition peut se présenter notamment sous forme de solutions aqueuses, hydroalcooliques ou huileuses, ou de dispersions du type lotion ou sérum, d'émulsions de consistance liquide ou semi-liquide du type lait, obtenues par dispersion d'une phase grasse dans une phase aqueuse (Huile dans Eau) ou inversement (Eau dans Huile), ou de suspensions ou émulsions de consistance molle, semi-solide ou solide du type crème ou gel, de microémulsions, ou encore de microcapsules, de microparticules, ou de dispersions vésiculaires de type ionique et/ou non ionique. Elles peuvent être aussi conditionnées sous forme de compositions pour aérosol ou spray contenant également un agent propulseur sous pression. Ces compositions sont préparées selon les méthodes usuelles. Elle peut être également utilisée pour le cuir chevelu sous forme de solutions aqueuses, alcooliques ou hydroalcooliques, ou sous forme de crèmes, de gels, d'émulsions, de mousses, ou encore de compositions pour aérosol. Les compositions injectables peuvent se présenter sous forme d'une lotion aqueuse, huileuse ou sous forme de sérum.

Pour l'ingestion par voie orale, de nombreuses formes de réalisation et notamment de compléments alimentaires sont possibles. Leur formulation est réalisée par les procédés usuels pour produire des comprimés, des gélules, des capsules, des dragées, des émulsions, des gels, des sirops. En particulier, le polysaccharide sulfaté et les autres actifs de l'invention peuvent être incorporés dans toutes formes de compléments alimentaires ou d'aliments enrichis, par exemple, des barres alimentaires, des poudres compactées ou non, des boissons, des produits laitiers et en particulier des yaourts et des yaourts à boire. Les poudres peuvent être diluées dans de l'eau, des sodas, des jus de fruits, des produits laitiers ou à base de soja, de riz, ou être incorporées dans des barres alimentaires.

Les conditions opératoires pour préparer ces compositions selon l'invention font partie des connaissances générales de l'Homme du métier.

Les quantités des différents constituants des compositions selon l'invention sont celles classiquement utilisées dans les domaines considérés. Ces compositions constituent notamment des crèmes de protection, de traitement ou de soin pour le visage, pour les mains, pour les pieds, pour les grands plis anatomiques ou pour le corps, des laits corporels de protection ou de soin, des lotions, gels ou mousses pour le soin de la peau et des muqueuses, comme des lotions de nettoyage ou de désinfection, des compositions pour le bain, des compositions contenant un agent bactéricide. Les compositions peuvent également consister en des préparations solides constituant des savons ou des pains de nettoyage.

Lorsque la composition de l'invention est une émulsion, la proportion de la phase grasse peut aller de 5 % à 80 % en masse, et avantageusement de 5 % à 50 % en masse par rapport à la masse totale de la composition. Les huiles, les émulsionnants et les coémulsionnants utilisés dans la composition sous forme d'émulsion sont choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine dermatologique. L'émulsionnant et le coémulsionnant sont présents, dans la composition, en une proportion allant de 0,3 % à 30 % en masse, et de avantageusement de 0,5 à 20 % en masse par rapport à la masse totale de la composition. L'émulsion peut, en outre, contenir des vésicules lipidiques. Lorsque la composition est une solution ou un gel huileux, la quantité d'huile peut aller jusqu'à plus de 90 % en masse par rapport à la masse totale de la composition.

Un autre aspect de l’invention concerne une composition dermatologique comprenant au moins un polysaccharide sulfaté extrait d’une algue rouge de l’espèce Haliptilon subulatum, ou un sel dermatolologiquement acceptable de celui-ci, tel que décrit précédemment, pour son utilisation dans la prévention, la réduction et le traitement des maladies inflammatoires, notamment au niveau de la peau.

Le terme «traiter » ou « traitement » ou « traitement curatif » est défini par un traitement aboutissant à une guérison ou un traitement allégeant, améliorant et/ou éliminant, réduisant et/ou stabilisant les symptômes d'une maladie ou la souffrance qu'elle provoque.

Par « maladie inflammatoire au niveau de la peau » ou « dermite », on entend toute maladie entraînant une inflammation de la peau, caractérisée par la présence sur la peau d’une rougeur, d’un gonflement, d’une chaleur et d’une douleur. Ces maladies peuvent être dues à une infection, par exemple par un microbe, un parasite, un virus ou un champignon, à une inflammation des articulations, à des allergies, à des agressions mécaniques ou chimiques tels que les rayonnements de type ultraviolet ou les radiations, de type rayon X. A titre d’exemples, on citera comme maladie inflammatoire au niveau de la peau, le psoriasis, la dermatite atopique, la rosacée, la couperose, l’acné, les verrues vulgaires, les maladies cutanée bulleuses, l’eczéma de contact, les cancers de la peau, les rougeurs, les érythèmes, les télangiectasies, les inflammations de la peau liées à une exposition aux UV, telles que la photo-irritation, la photo-sensibilisation, le photovieillissement, la photo-carcinogénèse, les insuffisances veineuses lymphatiques ou syndrome de jambes lourdes, cette liste n’étant pas limitative.

Un autre aspect de l’invention concerne une méthode de prévention et/ou de traitement des maladies inflammatoires au niveau de la peau chez un patient comprenant l’administration audit patient, d’une composition dermatologique comprenant au moins un polysaccharide sulfaté extrait d’une algue rouge de l’espèce Haliptilon subulatum ou un sel cosmétiquement acceptable de celui-ci, telle que décrit précédemment.

Un autre aspect de l’invention concerne une méthode de prévention et/ou de traitement des maladies inflammatoires, notamment au niveau de la peau, comprenant l’administration à un patient en nécessitant, d’une composition dermatologique comprenant au moins un polysaccharide sulfaté extrait d’une algue rouge de l’espèce genre Haliptilon subulatum ou un sel dermatologiquement acceptable de celui-ci, telle que décrit précédemment.

Un autre aspect de l’invention concerne une composition cosmétique comprenant au moins un polysaccharide sulfaté extrait d’une algue rouge de l’espèce Haliptilon subulatum, ou un sel cosmétiquement acceptable de celui-ci, tel que décrit précédemment, pour son utilisation dans la prévention, la réduction et le traitement de l’apparition des rougeurs sur la peau.

De par ses propriétés anti-angiogéniques, le polysaccharide sulfaté permet également de diminuer la réactivité de certains types de peau susceptibles de développer des rougeurs, et ainsi prévenir et traiter l’apparition de ces rougeurs. Le polysaccharide sulfaté est extrait à partir d’une algue rouge de l’espèce Haliptilon subulatum, un des avantages de l’invention est donc de proposer aux personnes sujettes aux rougeurs cutanées et ayant donc une peau sensible, une composition comprenant essentiellement des produits d’origine naturelle.

Par « rougeurs de la peau », on entend les érythèmes, notamment les érythèmes faciaux et les télangiectasies, de toutes origines.

Par « prévenir les rougeurs de la peau » ou «prévention des rougeurs de la peau » ou « prophylaxie des rougeurs de la peau » ou « traitement préventif des rougeurs de la peau » ou « traitement prophylactique des rougeurs de la peau », on entend aussi bien un traitement aboutissant à la prévention des rougeurs inesthétiques sur la peau qu'un traitement réduisant et/ou retardant l'incidence des rougeurs de la peau ou le risque qu'elles surviennent. On entend également par « prévenir les rougeurs de la peau » ou «prévention des rougeurs de la peau » ou « prophylaxie des rougeurs de la peau » ou « traitement préventif des rougeurs de la peau » ou « traitement prophylactique des rougeurs de la peau », toute action permettant d’éviter ou tout du moins de réduire la formation de rougeurs inesthétiques, par application de la composition, avant et au cours d’un événement connu comme pouvant provoquer l’apparition de rougeurs, tel qu’une exposition solaire ou un stress.

Par « personne susceptible de développer des rougeurs ou ayant des rougeurs », on entend une personne présentant des rougeurs, quel que soit leurs localisations sur le corps et notamment sur le visage et quel que soit le stade auquel ces rougeurs peuvent être classifiées d’un point de vue clinique. Ces rougeurs peuvent être jugées inesthétiques et/ou handicapantes pour cette personne.

Un autre aspect de l’invention concerne une méthode de prévention et/ou de traitement de l’apparition des rougeurs sur la peau, comprenant l’administration à un patient en nécessitant, d’une composition dermatologique comprenant au moins un polysaccharide sulfaté extrait d’une algue rouge de l’espèce Haliptilon subulatum ou un sel dermatologiquement acceptable de celui-ci, telle que décrit précédemment.

Un autre aspect de l’invention concerne une méthode de soin cosmétique comprenant l’application sur la peau de la composition cosmétique telle que décrite précédemment pour la prévention et/ou le traitement de l’apparition des rougeurs sur la peau.

Par « application », on entend tout acte permettant de faire absorber au patient, la composition selon l’invention par n’importe quelle voie, forme ou mode d’administration.

Un autre aspect de la présente invention concerne un procédé d’obtention du polysaccharide sulfaté. Le polysaccharide sulfaté selon l’invention peut être obtenu par des procédés bien connus de l’Homme du métier. En particulier, l’extraction d‘un polysaccharide sulfaté de haute masse moléculaire peut notamment être réalisée par un procédé comprenant les étapes décrites ci-après : a) Dispersion dans l’eau d’une poudre d’algue rouge, en particulier une poudre d’ Haliptiion subulatum préalablement séchée ; b) Précipitation par au moins un solvant polaire des polysaccharides de haute masse moléculaire; c) Séchage du précipité contenant les polysaccharides de haute masse moléculaire.

Dans un mode de réalisation particulier, l’étape b) de précipitation alcoolique est réalisée en utilisant de l’éthanol ou de l’isopropanol. Dans un mode de réalisation particulier, l’étape de séchage du précipité (étape c) peut être réalisée par lyophilisation ou à l’aide d’une étuve, notamment à une température comprise entre 40°C et 75°C, avantageusement 50°C pendant une nuit. La méthode d’obtention selon l’invention peut être renouvelée plusieurs fois afin d’obtenir un degré de pureté du polysaccharide satisfaisant.

Le procédé d’extraction selon la présente invention permet l’obtention de polysaccharides sous forme d’une fine poudre blanc crème avec un rendement de production de l’ordre de 10-20% par rapport à la masse sèche de poudre d’algue Haliptilum subulatum utilisée.

Dans un autre mode de réalisation particulier, les polysaccharides sulfatés de faible masse moléculaire sont préparés par dégradation acide de polysaccharides de haute masse moléculaire. Les polysaccharides sulfatés de faible masse moléculaire peuvent également être obtenus par des techniques de dépolymérisation bien connues de l’Homme du métier, telles que les dépolymérisations radicalaire ou enzymatique.

Dans un mode de réalisation particulier, le procédé d’extraction d’un polysaccharide sulfaté de faible masse moléculaire à partir d’algue Haliptilon subulatum comprend les étapes suivantes : a) Dispersion de la poudre de polysaccharides de haute masse moléculaire dans une solution aqueuse à pH acide, en particulier un pH compris entre 3 et 6,5 ; b) Précipitation par au moins un solvant polaire des polysaccharides de faible masse moléculaire; c) Séchage du précipité contenant les polysaccharides de faible masse moléculaire.

Dans un mode de réalisation particulier, la solution aqueuse utilisée dans l’étape de dispersion (étape a)) est une solution d’acide chlorhydrique (HCl). Dans un mode de réalisation particulier, la solution d’HCI présente une concentration comprise entre 1M et 5M, avantageusement 2M, à une température allant de 50°C à 100°C et sous agitation pendant 30 à 60 minutes. Dans un mode de réalisation particulier, l’étape b) de précipitation alcoolique est réalisée en utilisant de l’éthanol ou de l’isopropanol. Dans un mode de réalisation particulier, l’étape de séchage du précipité (étape c)) est réalisée par lyophilisation ou à l’aide d’une étuve, notamment à une température comprise entre 40°C et 75°C, avantageusement 50°C pendant une nuit

Les polysaccharides sulfatés extraits à partir d’algues rouges selon l’invention présentent l’avantage de ne pas avoir les problèmes de contamination et de sécurité. De plus, ces polysaccharides sulfatés offrent un avantage économique. Le rendement approximatif de polysaccharides sulfatés de la présente invention est d'environ 10% à 20% par rapport au poids sec initial d'algues à partir desquelles il a été extrait. En outre, les algues rouges, en particulier de la classe des Florideophyceae, en particulier les espèces Haliptilon subulatum, sont faciles à cultiver ce qui contribue également au faible coût de revient du produit final

Les figures et les exemples qui suivent illustrent l’invention sans toutefois la limiter.

FIGURES

Figure 1 : Effets du polysaccharide sulfaté sur la formation des pseudotubes en condition basale ou stimulée avec du VEGF à 10ng/ml conformément à l’exemple 6.

EXEMPLES

Exemple 1 : Extraction des polysaccharides de haute masse moléculaire (PSHM)

Par « polysaccharide de haute masse moléculaire» ou « PSHM », on entend un polysaccharide ayant une masse molaire comprise entre 100 et 1000 kDa. L’extraction des polysaccharides de haute masse moléculaire est réalisée en dispersant 100 grammes de poudre d’algue Haliptilon subulatum dans 1 litre d’eau à 90 °C sous vive agitation (500 Tr/min) pendant 4H. Le mélange est ensuite filtré à chaud sur diatomée (100 g) sur un verre fritté (porosité 1, plus précisément 100 à 160 pm). Le filtrat est ensuite centrifugé (10000 g, 30 minutes) à température ambiante pour obtenir l’extrait d’algue enrichi en polysaccharides. L’extrait d’Haliptilon subulatum est ensuite précipité dans 3 volumes d’éthanol 96° (à 4°C) sous agitation (500 Tr/min) pendant 2 heures.

Le précipité est récupéré par filtration sur verre fritté (porosité 1 ou 2, plus précisément 100 à 160 pm ou 40 à 100 pm respectivement) ou centrifugation (10000 g, 30 minutes) à température ambiante puis lavé avec de l’acétone (50 à 100 mL). Ensuite, le précipité est récupéré par filtration sur verre fritté (porosité 2, plus précisément 40 à 100 pm) ou centrifugation (10000 g, 30 minutes) à température ambiante puis séché à l’étuve à 50°C durant une nuit. Finalement, le précipité est broyé (au Blender) afin d’obtenir une fine poudre de polysaccharides de haute masse moléculaire extraits d’Haliptilon subulatum.

Le rendement en polysaccharides de haute masse moléculaire ainsi obtenu est de l’ordre de 10 à 20% par rapport à la masse sèche de poudre d’algue Haliptilon subulatum utilisée.

Exemple 2 : Extraction des polysaccharides de faible masse moléculaire (PSFM)

Par « polysaccharide de faible masse moléculaire» ou « PSFM », on entend un polysaccharide ayant une masse moléculaire comprise entre 5 et 100 KDa.

La production de polysaccharides de faible masse moléculaires est réalisée en dispersant 2,5 grammes de poudre de polysaccharide de haute masse moléculaire (extraits d’Haliptilon subulatum) dans 125 mL d’HCI (2M) à 100 °C sous vive agitation (500 Tr/min) pendant 1 heure. Le mélange est ensuite refroidi à température ambiante puis neutralisé avec de la soude (5 M). Le milieu est précipité dans 7 volumes d’éthanol 96° (à 4°C) sous agitation (500 Tr/min) pendant 2 heures. Le précipité est récupéré par filtration sur verre fritté (porosité 1 ou 2, plus précisément 100 à 160 pm ou 40 à 100 pm respectivement) ou centrifugation (10000 g, 30 minutes) à température ambiante puis lavé avec de l’acétone (50 mL). Ensuite, le précipité est récupéré par filtration sur verre fritté (porosité 2, plus précisément 40 à 100 pm) ou centrifugation (10000 g, 30 minutes) à température ambiante puis séché à l’étuve à 50°C durant une nuit. Finalement, le précipité est broyé (au Blender) afin d’obtenir une fine poudre de polysaccharides de faible masse moléculaire extraits dl Haliptiion subulatum.

Le rendement en polysaccharides de faible masse moléculaire ainsi obtenu est de l’ordre de 70% par rapport à la masse sèche de poudre de polysaccharides de haute masses moléculaires et 14 % par rapport à la masse sèche de poudre d’algue Haliptilum subulatum utilisée.

Exemple 3 : Détermination des masses moléculaires des polysaccharides de haute (PSHM) et de faible (PSFM) masse moléculaire.

Les polysaccharides de haute et faible masse moléculaire sont préparés selon des conditions décrites préalablement (exemples 1 et 2). Les masses moléculaires des polysaccharides sulfatés sont déterminées selon le protocole ci-après : a) Solubilisation de la poudre de polysaccharides à hauteur de 0,5 à 10 g/L dans une solution aqueuse de qualité ultrapure à une température allant de 4°C à 60°C et sous agitation pendant 30 minutes à 48 heures ; b) Filtration des échantillons sur membrane de porosité 0,45 pm ; c) Injection et analyse par chromatographie d’exclusion stérique couplée à la diffusion de la lumière (SEC/MALLS) ; d) La technique permet d’accéder aux masses molaires moyennes en nombre (Mn) et en poids (Mw) et renseigne également sur la forme et la dimension des chaînes et la polydispersité (Ip).

Tableau 1 : Récapitulatif des masses moléculaires moyennes en poids et en nombre observées pour PSHM et PSFM.

Mn (g/mol) Mw (g/mol) Ip (Mw/Mn) PSHM 133300 213500 Ë6 PSFM 12840 36640 2,8

Il ressort de cet exemple que la masse moléculaire des polysaccharides de haute masse moléculaire est de l’ordre de 214 kDa et que la masse moléculaire des polysaccharides de faible masse moléculaire est de l’ordre de 37 kDa.

Exemple 4 : Détermination du taux de sulfates et de résidus 3,6- anhydrogalactopyranoses des polysaccharides de l’invention 1. Détermination du taux de sulfates

Dosage par turbidimétrie (BaCI?/gélatine)

Les ions sulfates libérés lors de l’hydrolyse des polysaccharides vont former, en présence de chlorure de baryum (BaCI2, 2H2O) et de gélatine un précipité de sulfate de baryum dont l’apparition est mesurée à 550 nm, dans décrit dans la publication de Dodgson & Price (Dodgson & Price, 1962, Biochemical Journal 84 : 106-110). 150 mg de gélatine sont dissous dans 50 mL d’eau milli-Q à 70°C. Après refroidissement 16 h à 4°C, la solution de gélatine est additionnée de 0,5 g de BaCI2. 120 mg de polysaccharide lyophilisé sont hydrolysés par 3 mL d’HCI 2 M pendant 2 h à 100°C. Le mélange est centrifugé à 13 000 g pendant 30 min. 1 mL de surnageant est mélangé à 9 mL d’eau milli-Q, 1 mL d’HCI 0,5 M et 0,5 mL de réactif BaCI2/gélatine. Après 30 min à température ambiante, le mélange est agité et l’absorbance est lue immédiatement à 550 nm. La gamme étalon est réalisée à l’aide d’une solution mère de K2SO4 à 3 mg/mL.

Dosage à l’Azure A

La guantité de sulfates a été déterminée par l’utilisation de la méthode de dosage colorimétrigue développée par Jagues et al. (Jagues L.B et al., 1968, Canadian Journal of Physiology and Pharmacology 46, pages : 351-360). En phase agueuse, le chlorure de 3-amino-7-(diméthylamino)phénothizin-5-ium (Azuré A) complexe les sulfates pouvant être présents, notamment au sein des polysaccharides composant les fractions de SPE. Le milieu développe alors une couleur rose-violet absorbant à λ=535 nm, due à la formation d’un chromophore en présence de sulfates. Le dosage est semi-quantitatif et donne un ordre de grandeur (~mg) de la concentration en sulfates d’un échantillon. Dans des cuves en plastique pour spectrophotomètre sont introduits 200 pL de solution à doser. 2 mL de solution aqueuse d’Azure A à 10 mg/L sont ajoutés puis l’échantillon est agité. L’absorbance est mesurée à λ=535 nm.

La quantification des sulfates est déterminée à partir de la gamme d’étalonnage de dextrane sulfate (17 % sulfaté) et correction du degré de sulfatation de ce dernier (17 mg de sulfates pour 100 mg de dextrane sulfate).

Tableau 2. Récapitulatif des taux de sulfates pour PSHM et PSFM.

Taux de sulfates (% m/m) Ecart-type PSHM 13~5 0^09 PSFM 15,7 0,26

Il ressort de cet exemple que le taux de sulfates des polysaccharides de haute masse moléculaire est de l’ordre de 13,5% et que le taux de sulfates des polysaccharides de faible masse moléculaires est de l’ordre de 15,7%. 2. Détermination du taux de résidus 3,6-anhvdrogalactopyranoses

La méthode colorimétrique la plus reproductible pour doser les résidus 3,6-anhydrogalactoses est celle qui emploie un réactif à base de résorcinol (voir Yaphe & Arsenaut, 1965, Analytical Biochemistry 13, pages 143-148). La coloration rose qui se développe au cours de la réaction est suivie à 555 nm. Trois solutions sont nécessaires à la réalisation de ce dosage : (i) une solution d’acétaldehyde préparée en diluant 1 mL d’acétaldehyde dans 100 mL d’eau ultrapure (stable environ 1 mois) ; (ii) une solution de résorcinol préparée par dissolution de 150 mg de résorcinol dans 100 mL d’eau ultrapure (stable 7 jours, à l’abri de la lumière) et (iii) une solution d’HCI 10 M.

Pour le dosage, 50 à 100 pL de la solution de polysaccharide à doser) sont introduits dans des tubes en verre. Le volume est complété à 200 pL à l’aide d’eau milli-Q. Le réactif au résorcinol est préparé de façon extemporanée en ajoutant à 100 mL d’HCI 10 M, 9 mL de la solution de résorcinol et 1 mL de la solution d’acétaldéhyde diluée au 1/25. Ce réactif n’est stable que 3 h à l’abri de la lumière. A 200 μΙ_ de la solution de polysaccharide à doser sont ajoutés 1 mL du réactif au résorcinol. Après agitation, les tubes sont laissés au repos pendant 4 min, puis placés dans un bain-marie à 80°C pendant 10 min. Ils sont ensuite transférés dans un bain de glace pendant 1 min 30. L’absorbance doit être lue dans les 15 min qui suivent à 555 nm. Le D-fructose (solutions de 10 à 70 pg/mL) est utilisé comme standard. En effet, il a été démontré que les courbes d’absorbance à 555 nm en fonction de la concentration en monosaccharide du D-fructose et du le 3,6-anhydrogalactose sont identiques (voir Yaphe & Arsenaut, 1965, Analytical Biochemistry 13, pages 143-148).

Tableau 3. Récapitulatif du taux de résidus 3,6-anhydroçialactopvranoses (anhydroG) pour PSHM.

Taux de (3,6) anhydroG (% m/m) Ecart-type PSHM ï~32 0,013

Il ressort de cet exemple que le taux de 3,6-anhydrogalactopyranose des polysaccharides de haute masse moléculaire est de 1,32 %.

Exemple 5 : Détermination de la composition en monosaccharides et de la structure des polysaccharides selon l’invention 10 mg de polysaccharides sont dissous dans 1 mL d’acide trifluoracétique à 2 M pendant 90 min à 120 °C, avec agitation manuelle toutes les 30 minutes. Les échantillons sont évaporés sous jet d’azote pour éliminer les traces d’acide en excès. 1 mL de méthanol est ajouté, puis l’échantillon est agité au vortex et évaporé sous jet d’azote. Cette étape est répétée 2 fois pour éliminer les traces résiduelles d’acides. La dérivatisation est réalisée via l’utilisation de BSTFA : TMCS (99 : 1). Pour 2 mg de monosaccharides, on ajoute 400 pL de pyridine et 400 pL de N,O-bis(triméthylsilyl) trifluoroacétamide : triméthylchlosylane (BSTFA : TMCS) (99 : 1). Les échantillons sont ensuite mélangés puis placés à température ambiante pendant 2 heures sous agitation (450 rpm).

On évapore sous jet d’azote les échantillons, puis les résidus triméthylsilyl-O-glycosides sont repris par 500 pL de dichlorométhane. A cette étape, il est possible de diluer plus ou moins l’échantillon. Les standards (L-Rha, l-Fuc, L-Ara, D-Xyl, D-Man, D-Gal, d-GIc, d-GIcA, D-GalA) sont préparés dans les mêmes conditions, à au moins trois concentrations différentes.

Les dérivés triméthylsilylés sont analysés par chromatographie phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse, sur une colonne OPTIMA-1MS (30 m, 0,32 mm, 0,25 pm) avec un débit d’hélium de 2,3 mL/min (jusqu’à 3 mL/min). La pression d’hélium est fixée à 8,8 psi soit 60673,9 Pa et le ratio d’injection à 25 : 1 (ou 50 : 1). La montée de température est de 8°C/min jusqu’à 100°C, pendant 3 min. On programme une autre montée en température de 8°C/min jusqu’à 200°C, maintenue pendant 1 min. On termine par une montée en température de 5°C/min jusqu’à 250°C. L’ionisation est réalisée par Impact Electronique (El, 70 eV), la température de la trappe est fixée à 150 °C et les ions ciblés entre 40 et 800 m/z.

Tableau 4. Composition en monosaccharides de l’échantillon PSHM.

Monosaccharides (mol %)* "Gaî Ârâ Xÿl GIcA GÏc "94/î Ü5Ï Ü88 Ü5Ï ÜÔ * Composition en monosaccharides estimées par CG/SM-IE. Gai: Galactose; Ara: Arabinose; Xyl: Xylose; GIcA: Acide glucuronique, GIc: Glucose.

Exemple 6 : Effet du polysaccharide sulfaté de haute masse moléculaire (PSHM) selon l’invention sur la formation de pseudotubes dans une co-culture HMVEC+NHDF

Les effets du polysaccharide sulfaté de haute masse moléculaire (PSHM) sur la formation de pseudotubes ont été étudiés dans une co-culture de cellules endothéliales dermiques humaines (HMVEC) et de fibroblastes dermiques humains normaux (NHDF), en condition basale ou stimulée par du VEGF (analyse par immunomarquage in situ).

Culture et traitement

Les cellules HMVEC et NHDF en co-culture ont été ensemencées en plaques 96 puits et cultivées pendant 24 heures en milieu de culture.

Le milieu de culture utilisé est le suivant : EBM-2 (Endothélial cell basal medium 2) supplémenté en sérum de veau foetal (SVF) 5%, rhEGF, rhFGF, R3 IGF-1, hydrocortisone, vitamine C, gentamycine, DM EM complémenté avec L-glutamine 2mM, pénicilline 50U/ml, stretomycine 50pg/ml et SVF 10%.

Le milieu a ensuite été remplacé par du milieu d'essai contenant ou non (témoin) le composé à tester et/ou la référence inductrice VEGF testée à 100 ng/ml ; le composé a été testé en parallèle en condition basale et stimulée (en absence et en présence de VEGF).

Le milieu d’essai utilisé est le suivant : EBM-2 (Endothélial cell basal medium 2) supplémenté en rhEGF, rhFGF, R3 IGF-1, hydrocortisone, vitamine C, gentamycine, DM EM complémenté avec L-glutamine 2mM, pénicilline 50U/ml, stretomycine 50pg/ml et SVF 1%.

Les cellules ont ensuite été incubées pendant 7 jours avec renouvellement du traitement après 72 heures d'incubation. Toutes les conditions expérimentales ont été réalisées en triplicata (n=3).

Immunomarouage in situ des pseudotubes

Après incubation, le milieu de culture a été éliminé et les cellules ont été rincées, fixées et perméabilisées. Les cellules ont ensuite été marquées avec l'anticorps primaire anti-VWF (Von Willebrand Factor). Cet anticorps a été révélé par un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome (GAR-Alexa 488). En parallèle, les noyaux des cellules ont été colorés par le Hoechst 33258 (bis-benzimide).

La formation des pseudotubes a été observée à l'aide d'un microscope NIKON Diaphot 300 (Objectif x4). Les images numériques (1 photo par puits) ont été enregistrées avec une caméra NIKON DS-Ril et le logiciel NIS-Elements 4.13.04. Le marquage a été quantifié par mesure de la surface totale des pseudotubes à l'aide du logiciel Image J. Les résultats du marquage sont présentés en Figure 1. Résultats

La formation de pseudotubes dans la co-culture de cellules endothéliales (HMVEC) et de fibroblastes dermiques (NHDF) après 7 jours d'incubation a été mesurée par analyse d'images suite à un immunomarquage par un anticorps anti-vWF, le vWF étant spécifiquement exprimé par les cellules HMVEC.

Le pourcentage de stimulation est calculé selon la formule suivante :

Le pourcentage d’inhibition est calculé selon la formule suivante :

Tableau 5. Effet du polysaccharide sulfaté PSHM selon l’invention sur la formation des pseudotubes - Condition basale.

(1): Seuil de significativité statistique ns : > 0,05, Non significatif * : 0,01 à 0,05, Significatif ** : 0,001 à 0,01, Très significatif *** : < 0,001, Extrêmement significatif esm : erreur standard de la moyenne

Les comparaisons intergroupes ont été réalisées à l’aide du test t de Student bilatéral non apparié.

Tableau 6. Effet du polysaccharide sulfaté PSHM selon l’invention sur la formation des pseudotubes - Condition stimulée par le VEGF

(1): Seuil de significativité statistique ns : > 0,05, Non significatif * : 0,01 à 0,05, Significatif ** : 0,001 à 0,01, Très significatif *** : < 0,001, Extrêmement significatif esm : erreur standard de la moyenne

Les comparaisons intergroupes ont été réalisées à l’aide du test t de Student bilatéral non apparié.

En condition basale, seul un marquage diffus et faible pouvait être observé, indiquant une absence d'organisation des cellules endothéliales. Le traitement par la référence VEGF (100 ng/ml) a clairement conduit à une organisation des cellules endothéliales en pseudotubes.

Testé en condition basale, le composé PSHM, à 10 pg/ml, n'a pas présenté d'effet significatif par rapport à la condition témoin non stimulé et n'a donc pas induit la formation de pseudotubes dans la co-culture HMVEC i NHDF.

Testé en condition stimulée, le composé PSHM, à 10 pg/ml, a inhibé de façon nette et significative la formation de pseudotubes induite par le VEGF (77% d'inhibition).

Exemple 7 : Analyse transcriptomique complète des effets du polysaccharide sulfaté PSHM L’analyse transcriptomique complète des effets du polysaccharide sulfaté PSHM a été réalisée sur des kératinocytes épidermiques humains normaux (NHEK) et sur des fibroblastes dermiques humains normaux (NHDF) à deux temps d’incubation : 4 heures et 24 heures.

Composé testé

Composé testé : Polysaccharide sulfaté PSHM Concentrations testées :

o 0,1 mg/mL sur les NHEK o 3 mg/mL sur les NHDF

Cultures et traitements

Les kératinocytes ont été ensemencés en plaques 24 puits et les fibroblastes en plaques 12 puits, puis cultivés en milieu de culture pendant 48 heures.

Le milieu de culture utilisé est le suivant :

Keratinocyte-SFM complémenté en EGF (epidermal growth factor) 0,25ng/ml, extrait pituitaire (EP) 25pg/ml et gentamycine 25pg/ml.

Le milieu de culture a ensuite été remplacé par du milieu d'essai et les cellules ont été cultivées pendant 24 heures supplémentaires. Le milieu d’essai utilisé est le suivant : Keratinocyte-SFM complémenté en gentamycine 25pg/ml.

Les cellules ont ensuite été traitées ou non (témoin) par le composé à tester et incubées pendant 4 ou 24 heures. Toutes les expériences ont été réalisées en triplicata (n=3). A la fin de l'incubation, les surnageants de culture ont été éliminés et les tapis cellulaires ont été rincés avec une solution de « phosphate buffered saline » (PBS). Les plaques ont été immédiatement congelées à sec à -80°C.

Extraction d’ARN

Avant l'extraction, les réplicats de culture ont été poolés. L'ARN total de chaque échantillon a été extrait à l'aide du kit NucleoSpin® RNA Plus (Macherey-Nagel) selon le protocole préconisé par le fournisseur.

Analyse de l’expression différentielle

La quantité et la qualité des ARN ont été évaluées par électrophorèse capillaire (Bioanalyzer 2100, Agilent). La synthèse des ARN anti-sens (ARNa) biotinylés a été réalisée à l'aide du kit « GeneChip 3'IVT Express » (Affymetrix®). Pour chaque échantillon d'ARNa biotinylé un profil électrophorétique a été réalisé (Bioanalyzer 2100, Agilent) avant et après fragmentation. L'hybridation des ARNa marqués et fragmentés sur la puce Affymetrix® U219 chip (36,000 transcripts and variants) a été réalisée sur la station d'hybridation GeneAtlasTM fluidics Affymetrix® hybridization station pendant 20 heures à 45°C. Les puces U219 ont ensuite été scannées à l'aide du GeneAtlasTM Imaging station (Affymetrix® - resolution 2 Inn) afin de générer les données d'intensité de signal.

Traitement des données

Les données d'intensité de signal sont normalisées à l'aide du logiciel Expression Console (Affymetrix), à partir de l'algorithme RMA. Un contrôle qualité du marquage ainsi que de l'hybridation est ensuite réalisé. Résultats obtenus

Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 7.

Tableau 7. Analyse transcriptiomique du PS H M et effets sur le processus de prolifération cellulaire et l’ançiioçienèse

Il ressort de cet exemple que le polysaccharide sulfaté PSHM est capable d’inhiber le processus de prolifération cellulaire et l’angiogenèse à une concentration de 0,1 mg/ml sur les kératinocytes, alors qu’il a plutôt tendance à stimuler le processus de prolifération cellulaire et l’angiogenèse à une concentration de 3 mg/ml sur les fibroblastes.

Ceci en fait un bon principe actif pour la prévention et/ou le traitement des rougeurs.

Claims (10)

1. REVENDICATIONS

   1. Polysaccharide sulfaté extrait d’une aigue rouge de l’espèce Haliptiion subulatum ou un sel de celui-ci pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des maladies inflammatoires chez l’être humain ou ranimai.
2. 2. Polysaccharide sulfaté selon la revendication 1, caractérisé en ce ledit polysaccharide sulfaté est un antagoniste du VEGF.
3. 3. Polysaccharide sulfaté selon l’une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisée en ce que le polysaccharide sulfaté possède une masse moléculaire inférieure ou égaie à 500 kDa.
4. 4. Polysaccharide sulfaté selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le polysaccharide sulfaté possède une masse moléculaire comprise entre 10 kDa et 250 kDa.
5. 5. Composition, comprenant le polysaccharide sulfaté selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, et au moins un excipient pharmaceutiquement ou dermatologiquement ou cosmétiquement acceptable.
6. 6. Composition selon l’une des revendications 1 à 5, comprenant en outre au moins un autre agent actif, l’agent actif étant notamment choisi parmi des agents antirougeurs, des décongestionnants, des antibactériens, des antiseptiques et des antimicrobiens, des anti-inflammatoires, des agents anti-irritants et ou apaisants, des agents cicatrisants et/ou restructurant de la barrière cutanée, des antioxydants, des agents hydratants et/ou émollients, des agents anti-âge, des filtres et écrans solaires minéraux ou organiques et des actifs protecteurs solaires.
7. 7. Composition selon l’une des revendications 5 à 6, caractérisée en ce qu’elle est sous une forme adaptée pour son administration par voie orale, topique, injectable ou sous forme de compléments et/ou produits alimentaires.
8. 8. Composition selon l’une des revendications 5 à 7, caractérisée en ce que ia composition est une composition cosmétique ou une composition dermatologique.
9. 9. Composition dermatologique selon ia revendication 8 pour son utilisation dans ia prévention et/ou le traitement des maladies inflammatoires, notamment au niveau de ia peau.
10. 10, Composition dermatologique selon la revendication 9, caractérisée en ce que ia maiadie inflammatoire est choisie dans le groupe comprenant : le psoriasis, la dermatite atopique, ia rosacée, ia couperose, l’acné, les verrues vulgaires, les maladies cutanée bulleuses, l’eczéma de contact, les cancers de la peau, les rougeurs, les érythèmes, les télangiectasies, les inflammations de la peau liées à une exposition aux UV, telles que la photo-irritation, ia photo-sensibilisation, ie photo-vieillissement, la photo-carcinogénèse, les insuffisances veineuses lymphatiques ou syndrome de jambes lourdes.