FR3055549A1 - POLYSACCHARIDE SULFATE EXTRACTED FROM A RED ALGAE FOR ITS USE AS ANTICOAGULANT - Google Patents
POLYSACCHARIDE SULFATE EXTRACTED FROM A RED ALGAE FOR ITS USE AS ANTICOAGULANT Download PDFInfo
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Abstract
La présente demande concerne un polysaccharide sulfaté extrait d'une algue rouge ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, dans lequel le taux de sulfate est inférieur ou égal à 20% en masse du polysaccharide, pour son utilisation en tant qu'anticoagulant, ainsi qu'une composition pharmaceutique le comprenant.The present application relates to a sulphated polysaccharide extracted from a red alga or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein the sulphate level is less than or equal to 20% by weight of the polysaccharide, for its use as an anticoagulant, as well as a pharmaceutical composition comprising it.
Description
Titulaire(s) : UNIVERSITE BLAISE PASCAL-CLERMONT-FERRAND II SIGMA CLERMONT,CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE,UNIVERSITE DE LA ROCHELLE, UNIVERSITE D'ANTSIRANANA.Holder (s): UNIVERSITE BLAISE PASCAL-CLERMONT-FERRAND II SIGMA CLERMONT, NATIONAL CENTER FOR SCIENTIFIC RESEARCH, UNIVERSITY OF LA ROCHELLE, UNIVERSITY OF ANTSIRANANA.
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Mandataire(s) : PONTET ALLANO & ASSOCIES.Agent (s): PONTET ALLANO & ASSOCIES.
POLYSACCHARIDE SULFATE EXTRAIT D'UNE ALGUE ROUGE POUR SON UTILISATION EN TANT OU'ANTICOAGULANT.POLYSACCHARIDE SULFATE EXTRACT FROM A RED ALGAE FOR ITS USE AS ANTICOAGULANT.
La présente demande concerne un polysaccharide sulfaté extrait d'une algue rouge ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, dans lequel le taux de sulfate est inférieur ou égal à 20% en masse du polysaccharide, pour son utilisation en tant qu'anticoagulant, ainsi qu'une composition pharmaceutique le comprenant.The present application relates to a sulfated polysaccharide extracted from a red alga or a pharmaceutically acceptable salt thereof, in which the sulfate level is less than or equal to 20% by mass of the polysaccharide, for its use as an anticoagulant, as well as a pharmaceutical composition comprising it.
FR 3 055 549 - A1FR 3 055 549 - A1
ii
Polysaccharide sulfaté extrait d’une algue rouge pour son utilisation en tant qu’anticoagulantSulfated polysaccharide extracted from a red alga for use as an anticoagulant
La présente invention a pour objet un polysaccharide sulfaté extrait d’une algue rouge pour son utilisation en tant qu’anticoagulant.The present invention relates to a sulfated polysaccharide extracted from a red alga for its use as an anticoagulant.
La coagulation sanguine est réalisée selon des étapes en cascade impliquant différentes proenzymes et procofacteurs présents dans le sang qui sont convertis, par l'intermédiaire d'enzymes protéolytiques, en leur forme activée. Cette succession d'étapes ou cascade de la coagulation est effectuée selon trois systèmes de la coagulation, appelés respectivement, voie extrinsèque de la coagulation, voie intrinsèque de la coagulation et voie commune, conduisant à la transformation de la prothrombine (Fil) en thrombine (Fila).Blood coagulation is carried out in cascading steps involving different proenzymes and procofactors present in the blood which are converted, via proteolytic enzymes, into their activated form. This succession of stages or cascade of coagulation is carried out according to three systems of coagulation, called respectively, extrinsic way of coagulation, intrinsic way of coagulation and common way, leading to the transformation of prothrombin (Fil) into thrombin ( Fila).
La voie extrinsèque implique l'intervention du facteur VII présent dans le sang. Toutefois, celui-ci requiert une activation (facteur VIla) pour initier cette cascade de coagulation. Le facteur VIla présente une faible activité enzymatique jusqu'à ce qu'il se complexe aux facteurs tissulaires de nature phospholipidique libérés après lésion tissulaire. Le facteur Vlla ainsi complexé transforme le facteur X (FX) en facteur Xa (FXa) en présence d'ions calcium. Le facteur Xa à son tour transforme la prothrombine en thrombine, laquelle active le facteur V (Facteur Va). La thrombine active également le facteur XIII (facteur XIIla). La thrombine, en présence de calcium, de facteurs tissulaires, de facteur Va, agit sur le fibrinogène en le transformant en fibrine. La présence de facteur Xllla permet la formation d'un caillot de fibrine à réseau maillé solide et adhérent qui est progressivement et lentement résorbé avec l'installation du tissu cicatriciel de consolidation, auquel le réseau sert de trame. Cette fibrine réticulée est insoluble et n'est pas attaquable par les enzymes fibrinolytiques, au moins durant le temps de mise en place du tissu cicatriciel.The extrinsic route involves the intervention of factor VII present in the blood. However, this requires activation (factor VIla) to initiate this coagulation cascade. Factor VIla exhibits weak enzymatic activity until it complexes with tissue factors of a phospholipid nature released after tissue damage. Factor VIIa thus complexed transforms factor X (FX) into factor Xa (FXa) in the presence of calcium ions. Factor Xa in turn turns prothrombin into thrombin, which activates factor V (Factor Va). Thrombin also activates factor XIII (factor XIIla). Thrombin, in the presence of calcium, tissue factors, factor Va, acts on fibrinogen by transforming it into fibrin. The presence of factor Xllla allows the formation of a fibrin clot with a solid and adherent mesh network which is gradually and slowly absorbed with the installation of the scar tissue for consolidation, which the network serves as a frame. This crosslinked fibrin is insoluble and cannot be attacked by fibrinolytic enzymes, at least during the time of establishment of the scar tissue.
La voie intrinsèque de la coagulation implique également le facteur Vlla (FVIIa). Cette voie comprend une cascade de réactions aboutissant à l'activation de la thrombine par l'intermédiaire du facteur XII (FXII). Celui-ci active le facteur XI (Facteur Xla - FXIa) qui active le facteur IX (facteur IXa - FIXa) en présence de facteurs tissulaires phospholipidiques (FT). Le facteur IXa participe à l'activation du facteur X en facteur Xa en présence de facteur Villa, des facteurs tissulaires et d'ions calcium. Ceci conduit ensuite à la transformation de la prothrombine (Fil) en thrombine (Fila).The intrinsic coagulation pathway also involves factor Vlla (FVIIa). This pathway includes a cascade of reactions leading to activation of thrombin via factor XII (FXII). This activates factor XI (Factor Xla - FXIa) which activates factor IX (factor IXa - FIXa) in the presence of phospholipid tissue factors (FT). Factor IXa participates in the activation of factor X into factor Xa in the presence of factor Villa, tissue factors and calcium ions. This then leads to the transformation of prothrombin (Fil) into thrombin (Fila).
La voie intrinsèque de la coagulation implique le facteur Xa (FXa). Le facteur Xa adsorbé à la surface des phospholipides d'origine tissulaire et plaquettaire va, en présence du facteur Va, constituer la prothrombinase. Le facteur Va provient du facteur V activé par la thrombine (Fil). La prothrombinase est donc un complexe enzymatique faisant intervenir le FXa, le FVa, le calcium et des phospholipides. Il existe donc une similitude avec le complexe activateur du FX. La prothrombinase permet la formation de thrombine (Fila) à partir de prothrombine (Fil). Il en résulte donc que les facteurs X et II sont les facteurs essentiels de la cascade de la coagulation, dans la mesure où ces deux facteurs de la coagulation conduisent à la formation du caillot de fibrine.The intrinsic way of coagulation involves factor Xa (FXa). Factor Xa adsorbed on the surface of phospholipids of tissue and platelet origin will, in the presence of factor Va, constitute prothrombinase. Factor Va comes from factor V activated by thrombin (Fil). Prothrombinase is therefore an enzymatic complex involving FXa, FVa, calcium and phospholipids. There is therefore a similarity with the activator complex of FX. Prothrombinase allows the formation of thrombin (Fila) from prothrombin (Fil). It therefore follows that factors X and II are the essential factors of the coagulation cascade, insofar as these two coagulation factors lead to the formation of the fibrin clot.
La thrombose vasculaire se définit par l’obstruction d’une veine ou d’une artère par un thrombus (ou caillot). On distingue deux types de thrombose :Vascular thrombosis is defined by the obstruction of a vein or artery by a thrombus (or clot). There are two types of thrombosis:
la thrombose veineuse ou phlébite : elle peut être superficielle affectant une veine de surface ou profonde, affectant une veine profonde, notamment au niveau de la cuisse.venous thrombosis or phlebitis: it can be superficial affecting a surface vein or deep, affecting a deep vein, especially in the thigh.
la thrombose artérielle obstruant une artère, qui se révèle plus grave si l’artère en cause est la seule à irriguer une zone précise du corps.arterial thrombosis blocking an artery, which is more serious if the artery in question is the only one to supply a specific area of the body.
Le traitement principalement utilisé pour éviter les risques de thromboses vasculaires, consiste en l’administration d’anticoagulants.The treatment mainly used to avoid the risks of vascular thromboses, consists of the administration of anticoagulants.
Un anticoagulant est une substance synthétique ou naturelle ayant la propriété d'inhiber la coagulabilité naturelle du sang. L’anticoagulant a donc pour mission d’éviter la formation de caillot de fibrine en inhibant un ou plusieurs facteurs de la cascade de la coagulation. Les anticoagulants disponibles sur le marché aujourd’hui sont scindés en deux grandes catégories : les anticoagulants oraux et les anticoagulants injectables. Parmi les anticoagulants oraux, on trouve notamment les antivitamines K (AVK), les inhibiteurs directs de la thrombine (anti-lla) et les inhibiteurs directs du facteur Xa. Les antivitamines K actuellement sur le marché sous forme orales sont les coumariniques et les dérivés de l’indanedione. Les coumariniques regroupent l’acénocoumarol, commercialisé sous le nom de Sintrom® et Minisintrom® et la warfarine commercialisée sous le nom de Coumadine®. Les dérivés de l’indanedione comprennent notamment la fluindione, commercialisée sous le nom de Previscan®. Ces antivitamines K sont indiquées dans la prévention des complications thrombo-emboliques des cardiopathies emboligènes et des infarctus du myocarde compliqués, ainsi que dans le traitement de thromboses veineuses profondes et des embolies pulmonaires, ainsi que dans la prévention de leurs récidives. Toutefois, ces anticoagulants oraux présentent de nombreux effets secondaires, comme notamment des risques d’hémorragies cérébrales, abdominales et intra-articulaires, des troubles digestifs, des risques de nécroses cutanées et d’éruptions cutanées allergiques.An anticoagulant is a synthetic or natural substance with the property of inhibiting the natural coagulability of the blood. The purpose of the anticoagulant is therefore to prevent the formation of a fibrin clot by inhibiting one or more factors of the coagulation cascade. Anticoagulants available on the market today are divided into two main categories: oral anticoagulants and injectable anticoagulants. Among the oral anticoagulants, there are in particular the antivitamins K (AVK), the direct inhibitors of thrombin (anti-lla) and the direct inhibitors of factor Xa. The antivitamins K currently on the market in oral form are the coumarins and the derivatives of indanedione. Coumarins include acenocoumarol, sold under the name of Sintrom® and Minisintrom®, and warfarin, sold under the name of Coumadine®. Indanedione derivatives include fluindione, sold under the name Previscan®. These antivitamins K are indicated in the prevention of thromboembolic complications of embologenic heart disease and complicated myocardial infarction, as well as in the treatment of deep venous thrombosis and pulmonary embolism, as well as in the prevention of their recurrences. However, these oral anticoagulants have many side effects, including risks of cerebral, abdominal and intra-articular hemorrhages, digestive disorders, risks of skin necrosis and allergic rashes.
Parmi les anticoagulants injectables, on trouve notamment les héparines standards non fractionnées et les héparines de faibles masses moléculaires. L'héparine est un polysaccharide sulfaté constitué d'unités de glucosamine et d'acides uroniques liées en 1-4, dans lesquelles les groupes sulfates sont présents sur la fonction aminée de la glucosamine et/ou sur des fonctions alcools de la glucosamine et de l'acide uronique. Ce polysaccharide, dont les propriétés anticoagulantes sont bien connues, est actuellement largement utilisé dans le traitement des accidents thrombotiques. L'héparine présente toutefois des effets secondaires très importants (saignements, risques de thrombopénies immuno-allergiques) et elle est très peu efficace en thrombose artérielle. De plus, l'origine animale de ce produit est susceptible d'entraîner un risque potentiel de contamination par des agents infectieux non conventionnels. Des techniques de dépolymérisations chimique ou enzymatique ont permis d'obtenir, à partir d'héparine Non Fractionnée (HNF), dont la masse moléculaire est d'environ 15 kDa, des chaînes polysaccharidiques de faibles masses moléculaires, à savoir de masses moléculaire comprise entre 2 et 10 kDa, nommées Héparines de faibles masses moléculaires ou « Héparines de Bas Poids Moléculaire» (HBPM). De nombreuses HBPM sont actuellement sur le marché notamment : Enoxaparine sodique, commercialisée notamment sous le nom de Lovenox®, Dalteparine sodique, commercialisée notamment sous le nom de Fragmine®, Nadroparine sodique, commercialisée notamment sous le nom de Fraxiparine® ou de Fraxodi®, Tinzaparine, commercialisée notamment sous le nom d’Innohep®, Reviparine, Parnaparine, etc.Among the injectable anticoagulants, there are in particular standard unfractionated heparins and heparins of low molecular weights. Heparin is a sulfated polysaccharide consisting of units of glucosamine and uronic acids linked in 1-4, in which the sulfate groups are present on the amino function of glucosamine and / or on alcohol functions of glucosamine and uronic acid. This polysaccharide, whose anticoagulant properties are well known, is currently widely used in the treatment of thrombotic accidents. Heparin however has very significant side effects (bleeding, risks of immuno-allergic thrombocytopenia) and it is very ineffective in arterial thrombosis. In addition, the animal origin of this product is likely to involve a potential risk of contamination by unconventional infectious agents. Chemical or enzymatic depolymerization techniques have made it possible to obtain polysaccharide chains of low molecular weights, namely molecular weights, between non-fractionated heparin (HNF), whose molecular mass is approximately 15 kDa. 2 and 10 kDa, called low molecular weight heparins or "low molecular weight heparins" (LMWH). Many LMWHs are currently on the market, in particular: Enoxaparin sodium, marketed in particular under the name of Lovenox®, Dalteparin sodium, marketed in particular under the name of Fragmine®, Nadroparin sodium, marketed in particular under the name of Fraxiparine® or Fraxodi®, Tinzaparin, marketed in particular under the name of Innohep®, Reviparin, Parnaparin, etc.
Des études cliniques ont montré que, dans la prophylaxie des accidents thrombo-emboliques veineux, les héparines de faibles masses moléculaires possèdent une efficacité identique, sinon supérieure, à celle de l'héparine non fractionnée. Toutefois, les héparines de faible masse moléculaire (HBPM) n'abolissent pas le risque hémorragique et peuvent entraîner, au même titre que l'héparine non fractionnée, quoique avec une moindre fréquence, une thrombopénie immuno-allergique et de l’ostéoporose. De plus, les héparines sont extraites industriellement d'intestin de porc (Europe) ou de poumon de bœuf. Les abats d'autres mammifères d'élevage peuvent être utilisés comme sources secondaires. Du fait de son origine animale, les risques sanitaires ne peuvent pas être exclus.Clinical studies have shown that, in the prophylaxis of venous thromboembolic events, heparins with low molecular weights have the same efficacy, if not greater, than that of unfractionated heparin. However, low molecular weight heparins (LMWH) do not eliminate the risk of bleeding and can, like unfractionated heparin, although with less frequency, lead to immunoallergic thrombocytopenia and osteoporosis. In addition, heparins are industrially extracted from pork (European) intestines or beef lungs. Offal from other farmed mammals can be used as secondary sources. Due to its animal origin, health risks cannot be excluded.
Par conséquent, il apparaît nécessaire de disposer de nouveaux anticoagulants d’origine naturelle et non animale, susceptibles d’être administrés par voie orale et/ou injectable, et capables de prévenir et/ou de traiter efficacement les thromboses vasculaires tout en diminuant les risques d’effets secondaires et en éliminant les risques de contamination.Consequently, it appears necessary to have new anticoagulants of natural and non-animal origin, capable of being administered orally and / or injectable, and capable of effectively preventing and / or treating vascular thromboses while reducing the risks. side effects and eliminating the risk of contamination.
Les inventeurs ont ainsi montré de manière surprenante que les polysaccharides sulfatés extraits d’algues rouges, et en particulier extraits à partir de l’algue marine rouge de l’espèceThe inventors have thus surprisingly shown that the sulfated polysaccharides extracted from red algae, and in particular extracted from the red marine algae of the species
Haliptilon subulatum avaient une activité anticoagulante similaire à l’héparine standard non fractionnée, voire même supérieure à l’héparine standard non fractionnée et aux héparines de faibles masses moléculaires.Haliptilon subulatum had anticoagulant activity similar to or even superior to standard unfractionated heparin and even superior to standard unfractionated heparin and low molecular weight heparins.
La demande internationale WO2014/76261 décrit une composition comprenant au moins un polysaccharide sulfaté et au moins un ingrédient alimentaire pour le traitement ou la prévention d’une infection provoquée par au moins une microsporidie chez l’Homme ou l’animal. Ces polysaccharides sulfatés sont extraits d’algues vertes, brunes, rouges et de cyanobactéries.International application WO2014 / 76261 describes a composition comprising at least one sulfated polysaccharide and at least one food ingredient for the treatment or prevention of an infection caused by at least one microsporidia in humans or animals. These sulfated polysaccharides are extracted from green, brown, red algae and cyanobacteria.
La demande internationale WO 01/15654 décrit un polysaccharide sulfaté de masse molaire inférieure ou égale à 10 kDa, susceptible d'être obtenu par dépolymérisation radicalaire d'un fucane issu de Phéophycées, pour l'obtention d'un médicament actif contre la thrombose artérielle et contre la resténose artérielle. Ce polysaccharide sulfaté est extrait d’algues brunes.International application WO 01/15654 describes a sulfated polysaccharide with a molar mass less than or equal to 10 kDa, capable of being obtained by radical depolymerization of a fucan originating from Pheophyceae, for obtaining a drug active against arterial thrombosis and against arterial restenosis. This sulfated polysaccharide is extracted from brown algae.
Aucun de ces documents ne concerne de polysaccharides sulfatés extraits d’algues rouges pour la prévention et/ou le traitement des thromboses vasculaires, ni même la prévention et/ou le traitement des ischémies, des embolies pulmonaires, de l’angor instable, de l’infarctus du myocarde. De plus, aucun de ces documents ne concerne la prévention de l’anticoagulation des circuits de circulation extracorporelle et/ou d’épuration extra-rénale.None of these documents relates to sulfated polysaccharides extracted from red algae for the prevention and / or treatment of vascular thrombosis, or even the prevention and / or treatment of ischemia, pulmonary embolism, unstable angina, myocardial infarction. Furthermore, none of these documents concerns the prevention of anticoagulation of the extracorporeal circulation circuits and / or extra-renal purification.
Ainsi, l’invention porte donc sur un nouvel anticoagulant à base de polysaccharide sulfaté extrait d’une algue rouge ou d’un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci.Thus, the invention therefore relates to a new anticoagulant based on sulfated polysaccharide extracted from a red alga or from a pharmaceutically acceptable salt thereof.
Les polysaccharides issus des algues rouges sont construits sur la base d’un enchaînement linéaires d’unités 3-/3-galactopyranose et 4-a-galactopyranose alternant régulièrement. L’unité /3-galactopyranose est toujours de configuration d, alors que l’unité agalactopyranose est de configuration d chez les carraghénanes et L chez les agarocolloïdes. Par ailleurs, une partie des résidus 4-a-galactopyranoses peut exister sous la forme de 3,6anhydrogalactopyranose. La forme 3,6-anhydrogalactopyranose est obtenue par une élimination de l'ester sulfate porté par le carbone 6 de l'unité α-galactose liée en 4, sous l'action de galactose-6-sulfurylases lors de la biosynthèse ou d’un traitement alcalin.The polysaccharides from red algae are built on the basis of a linear sequence of 3- / 3-galactopyranose and 4-a-galactopyranose units alternating regularly. The / 3-galactopyranose unit is always d configuration, while the agalactopyranose unit is d configuration in carrageenans and L in agarocolloids. Furthermore, part of the 4-a-galactopyranoses residues may exist in the form of 3,6anhydrogalactopyranose. The 3,6-anhydrogalactopyranose form is obtained by eliminating the sulfate ester carried by carbon 6 of the α-galactose unit linked in 4, under the action of galactose-6-sulfurylases during biosynthesis or alkaline treatment.
L’invention a donc pour objet un polysaccharide sulfaté extrait à partir d’une algue rouge ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, dans lequel le taux de sulfate dudit polysaccharide est inférieur ou égal à 20% en masse du polysaccharide, pour son utilisation en tant qu’anticoagulant.The subject of the invention is therefore a sulfated polysaccharide extracted from a red alga or a pharmaceutically acceptable salt thereof, in which the sulphate content of said polysaccharide is less than or equal to 20% by mass of the polysaccharide, for its use as an anticoagulant.
II est connu que le taux de sulfatation ainsi que la distribution des sulfates sur les polysaccharides peuvent avoir un effet critique sur l’interaction entre les protéases, les inhibiteurs et les activateurs de la cascade de la coagulation, et notamment sur l’activité proou anticoagulante des polysaccharides (voir Fonseca et al, Thrombosis and Haemostasis, 2008, vol 99(3), pages 539-45).It is known that the rate of sulfation as well as the distribution of sulfates on polysaccharides can have a critical effect on the interaction between proteases, inhibitors and activators of the coagulation cascade, and in particular on the pro or anticoagulant activity. polysaccharides (see Fonseca et al, Thrombosis and Haemostasis, 2008, vol 99 (3), pages 539-45).
Les inventeurs ont donc montré de manière surprenante que les polysaccharides extraits à partir d’une algue rouge et ayant un taux de sulfate inférieur ou égal à 20% présentent une activité anticoagulante similaire à l’héparine standard non fractionnée, voire même supérieure à l’héparine standard non fractionnée et aux héparines de faibles masses moléculaires,The inventors have therefore surprisingly shown that the polysaccharides extracted from a red alga and having a sulphate content less than or equal to 20% have an anticoagulant activity similar to standard unfractionated heparin, or even greater than standard unfractionated heparin and low molecular weight heparins,
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le polysaccharide sulfaté est extrait à partir d’une algue rouge, avantageusement à partir d’une algue marine rouge, avantageusement une algue marine rouge de la classe des Florideophyceaea, encore plus avantageusement d’une algue marine rouge de l’espèce Haliptilon subulatum.In a particular embodiment of the invention, the sulfated polysaccharide is extracted from a red alga, advantageously from a red seaweed, advantageously a red seaweed from the Floridaophyceaea class, even more advantageously from a red seaweed of the species Haliptilon subulatum.
Dans un mode de réalisation particulier, le polysaccharide sulfaté selon l’invention, dans lequel le taux de sulfate dudit polysaccharide est inférieur ou égal à 20% en poids masse du polysaccharide, répond à la formule (I) :In a particular embodiment, the sulphated polysaccharide according to the invention, in which the sulphate content of said polysaccharide is less than or equal to 20% by weight by weight of the polysaccharide, corresponds to formula (I):
[(unité A)-(unité B)]n (l), dans laquelle :[(unit A) - (unit B)] n (l), in which:
- l’unité A est un 3-/3-D-galactopyranose, dans lequel les fonctions hydroxyles libres sont substituées par un ou plusieurs groupements choisis parmi XA2, Xa4, Xa6, l’unité B est choisie dans le groupe constitué du résidu B1 et du résidu B2 :the unit A is a 3- / 3-D-galactopyranose, in which the free hydroxyl functions are substituted by one or more groups chosen from X A 2, Xa4, Xa6, unit B is chosen from the group consisting of residue B1 and residue B2:
- le résidu B1 étant un 4-a-D/L-galactopyranose, dans lequel les fonctions hydroxyles libres sont substituées par un ou plusieurs groupements choisis parmi, XB2, Xb3 etXB6 et,the residue B1 being a 4-aD / L-galactopyranose, in which the free hydroxyl functions are substituted by one or more groups chosen from, X B2 , Xb3 and X B6 and,
- le résidu B2 étant un 4-a-3,6-anhydrogalactopyranose, dans lequel les fonctions hydroxyles libres du 4-a-3,6-anhydrogalactopyranose sont substituées par un groupement XB2 et,the residue B2 being a 4-a-3,6-anhydrogalactopyranose, in which the free hydroxyl functions of the 4-a-3,6-anhydrogalactopyranose are substituted by a group X B2 and,
- les résidus B1 et B2 étant distribués de manière aléatoire dans le polysaccharide et le résidu B2 représentant au plus 5% en masse du polysaccharide,the residues B1 and B2 being randomly distributed in the polysaccharide and the residue B2 representing at most 5% by mass of the polysaccharide,
- l’unité A est reliée à l’unité B par une liaison O-glycosidique entre le carbone en position 1 de l’unité A et le carbone en position 4 de l’unité B et,unit A is linked to unit B by an O-glycosidic bond between the carbon in position 1 of unit A and the carbon in position 4 of unit B and,
- l’unité B est reliée à l’unité A par une liaison O-glycosidique entre le carbone en position 1 de l’unité B et le carbone en position 3 de l’unité A,the unit B is connected to the unit A by an O-glycosidic bond between the carbon in position 1 of the unit B and the carbon in position 3 of the unit A,
- XA2, Xa4, Xa6, Xb2, Xb3 et Xb6 sont choisis indépendamment les uns des autres et indépendamment pour chaque unité A et/ou B dans le groupe comprenant :- X A 2, Xa4, Xa6, Xb2, Xb3 and Xb6 are chosen independently of each other and independently for each unit A and / or B in the group comprising:
- un atome d’hydrogène;- a hydrogen atom;
- un groupement sulfate,- a sulfate group,
- un groupement pyruvate (-COO-CO-CH3), ledit groupement pyruvate étant lié au groupement XA4 par son carbone en position 1 et au groupement XA6 par son carbone en position 3;- A pyruvate group (-COO-CO-CH 3 ), said pyruvate group being linked to the group X A4 by its carbon in position 1 and to the group X A 6 by its carbon in position 3;
- une unité saccharidique liée à l’unité A ou B par une liaison de type Oglycosidique en position 1 (Ci) de l’unité saccharidique, l’unité saccharidique étant choisie parmi un galactose (ou T-galactose), un xylose (ou T-xylose), un arabinose (ou T-arabinose) et un acide glucuronique (ou T- acide glucuronique); eta saccharide unit linked to unit A or B by an Oglycoside type bond in position 1 (Ci) of the saccharide unit, the saccharide unit being chosen from a galactose (or T-galactose), a xylose (or T-xylose), an arabinose (or T-arabinose) and a glucuronic acid (or T-glucuronic acid); and
- un groupe (Ci-C6) alcoxyle, un groupe (Ci-C6) alkylcarbonyle, un groupe (C1C6) alkoxycarbonyle, un groupe (Ci-C6) acyloxy, un groupement issu d’un diacide, un groupement phosphate ;- a (Ci-C 6 ) alkoxyl group, a (Ci-C 6 ) alkylcarbonyl group, a (C1C 6 ) alkoxycarbonyl group, a (Ci-C 6 ) acyloxy group, a group derived from a diacid, a phosphate group ;
- un groupement -CH2Xa, dans lequel Xa représente un atome d’hydrogène, un groupe hydroxy, un groupe (Ci-C6) alcoxyle, un groupe (Ci-C6) acyloxy, un groupement sulfate ;- A group -CH 2 Xa, in which Xa represents a hydrogen atom, a hydroxy group, a (Ci-C 6 ) alkoxyl group, a (Ci-C 6 ) acyloxy group, a sulphate group;
- n est un entier compris entre 10 et 3000.- n is an integer between 10 and 3000.
Les formules (la) et (lb) ci-dessous illustrent respectivement les motifs (unité A) - (résidu B1) et (unité A) - (résidu B2) :The formulas (la) and (lb) below illustrate the patterns (unit A) - (residue B1) and (unit A) - (residue B2) respectively:
(la)(the)
Au sens de la présente invention, on entend par « polysaccharide » aussi bien un polysaccharide de haute masse moléculaire ou un polysaccharide de faible masse moléculaire. Par «polysaccharide de haute masse moléculaire», on entend un polysaccharide ayant une masse moléculaire comprise entre 100 et 1 000 kDa. Par «polysaccharide de faible masse moléculaire», on entend un polysaccharide ayant une masse moléculaire comprise entre 5 et 100 kDa.For the purposes of the present invention, the term “polysaccharide” means both a high molecular weight polysaccharide or a low molecular weight polysaccharide. By “high molecular weight polysaccharide” is meant a polysaccharide having a molecular weight between 100 and 1000 kDa. By "low molecular weight polysaccharide" is meant a polysaccharide having a molecular weight between 5 and 100 kDa.
Au sens de la présente invention, « n » représente un nombre entier compris entre 10 et 3000, avantageusement compris entre 10 et 2000, avantageusement compris entre 10 et à 1000, avantageusement compris entre 10 et 900, avantageusement compris entre 10 et 800 avantageusement compris entre 10 et 700. De manière avantageuse, « n » est compris entreFor the purposes of the present invention, "n" represents an integer between 10 and 3000, advantageously between 10 and 2000, advantageously between 10 and 1000, advantageously between 10 and 900, advantageously between 10 and 800 advantageously included between 10 and 700. Advantageously, "n" is between
10 et 700, avantageusement entre 50 et 700, de manière plus avantageuse entre 70 et 650.10 and 700, advantageously between 50 and 700, more advantageously between 70 and 650.
Au sens de la présente invention, on entend par « T-unité saccharidique », une unité saccharidique liée à l’unité A ou l’unité B par une liaison de type O-glycosidique en position 1 (Ci) de l’unité saccharidique. Ainsi, on entend respectivement par « T-galactose », «T20 xylose », « T-arabinose » et « T-acide glucuronique », un galactose lié à l’unité A ou B par une liaison de type O-glycosidique en position 1 (Ci) du galactose, un xylose lié à l’unité A ou B par une liaison de type O-glycosidique en position 1 (Ci) du xylose, un arabinose lié à l’unité A ou B par une liaison de type O-glycosidique en position 1 (Ci) de l’arabinose et un acide glucuronique lié à l’unité A ou B par une liaison de type O-glycosidique en position 1 (Ci) de l’acide glucuronique.For the purposes of the present invention, the term “saccharide T-unit” means a saccharide unit linked to unit A or unit B by an O-glycosidic bond in position 1 (Ci) of the saccharide unit. . Thus, “T-galactose”, “T20 xylose”, “T-arabinose” and “T-glucuronic acid” respectively mean a galactose linked to unit A or B by an O-glycosidic bond in position. 1 (Ci) of galactose, a xylose linked to unit A or B by an O-glycosidic bond in position 1 (Ci) of xylose, an arabinose linked to unit A or B by a type O bond -glycoside in position 1 (Ci) of arabinose and a glucuronic acid linked to unit A or B by an O-glycosidic type bond in position 1 (Ci) of glucuronic acid.
Au sens de la présente invention, on entend par groupe (Ci-C6) alcoxyle ou (Ci-C6) alkoxyle ou (Ci-C6) alkyloxy, les groupes -OR-, R étant un groupe alkyle en Ci-C6, c’est-à-dire une chaîne droite ou ramifiée comprenant de 1 à 6 atomes de carbone. A titre d’exemples d’alkyles, on peut citer les groupes méthyle, éthyle, propyle, butyle, isobutyle, tert-butyle, pentyle, isopentyle, tert-pentyle, hexyle et isohexyle. On peut citer à titre d’exemples de (Cr C6) alcoxyles, les groupes méthoxy (OCH3), éthoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, tert-butoxy, pentoxy, isopentoxy, tert-pentoxy, hexoxy, isohexoxy.For the purposes of the present invention, the term (Ci-C 6 ) alkoxyl or (Ci-C 6 ) alkoxyl or (Ci-C 6 ) alkyloxy group means the groups -OR-, R being a C1-C alkyl group 6 , that is to say a straight or branched chain comprising from 1 to 6 carbon atoms. Examples of alkyls that may be mentioned include methyl, ethyl, propyl, butyl, isobutyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, tert-pentyl, hexyl and isohexyl groups. Examples of (Cr C 6 ) alkoxyls that may be mentioned include the methoxy (OCH 3 ), ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, tert-butoxy, pentoxy, isopentoxy, tert-pentoxy, hexoxy, isohexoxy groups.
Au sens de la présente invention on entend par groupe (Ci_C6) alkylcarbonyle, les groupes -COR, R étant un groupe alkyle en Ci-C6tel que défini précédemment. On peut citer à titre d’exemples les groupes methylcarbonyle, ethylcarbonyle, n-propylcarbonyle, isopropylcarbonyle, n-butylcarbonyle, iso-butylcarbonyle, sec-butylcarbonyle, tertbutylcarbonyle, n-pentylcarbonyle, iso-pentylcarbonyle, neo-pentylcarbonyle, tertpentylcarbonyle n-hexylcarbonyle, iso-hexylcarbonyle.Within the meaning of the present invention group by means (Ci_C 6) alkylcarbonyl, the -COR group, R being an alkyl group Ci-C 6 as defined above. Examples that may be mentioned include methylcarbonyl, ethylcarbonyl, n-propylcarbonyl, isopropylcarbonyl, n-butylcarbonyl, iso-butylcarbonyl, sec-butylcarbonyl, tertbutylcarbonyl, n-pentylcarbonyl, iso-pentylcarbonyl, neo-pentylcarbonyl, tertpentylcarbonyl , iso-hexylcarbonyl.
Au sens de la présente invention, on entend par groupe (Ci.C6) alkoxycarbonyle, les groupes COOR, R étant un groupe alkyle en Ci-C6tel que défini précédemment. On peut citer à titre d’exemples les groupes méthoxycarbonyle (-COOCH3), éthoxycarbonyle, propoxycarbonyle, isopropoxycarbonyle, butoxycarbonyle, isobutoxycarbonyle, tert-butoxycarbonyle, pentoxycarbonyle, isopentoxycarbonyle, tert-pentoxycarbonyle, hexoxycarbonyle, isohexoxycarbonyle.Within the meaning of the present invention group by means (Ci.C 6) alkoxycarbonyl, the group COOR, R being an alkyl group Ci-C 6 as defined above. Mention may be made, as examples, of the methoxycarbonyl (-COOCH 3 ), ethoxycarbonyl, propoxycarbonyl, isopropoxycarbonyl, butoxycarbonyl, isobutoxycarbonyl, tert-butoxycarbonyl, pentoxycarbonyl, isopentoxycarbonyl, tert-pentoxycarbonyl, hexoxycarbonyl groups.
Au sens de la présente invention, on entend par groupe (Ci.C6) acyloxy, les groupes -OCOR où R est un groupe alkyle en Ci-C6 tel que défini précédemment. On peut citer à titre d’exemple les groupes acétyloxy (-OCOCH3), propionyloxy.Within the meaning of the present invention group by means (Ci.C 6) acyloxy, the -OCOR groups wherein R is an alkyl group C-6 as defined above. By way of example, mention may be made of acetyloxy (-OCOCH 3 ) and propionyloxy groups.
Au sens de la présente invention, on entend par groupement issu d’un diacide, un groupement répondant à la formule -COO -(CH2)P-COOH, où p est compris entre 0 et 4. On peut citer à titre d’exemple de diacide dont sont issus ces groupements : les groupes oxalate, malonate, succinate, glutarate.For the purposes of the present invention, the term “group derived from a diacid” means a group corresponding to the formula -COO - (CH 2 ) P -COOH, where p is between 0 and 4. Mention may be made, as example of a diacid from which these groups come: the oxalate, malonate, succinate, glutarate groups.
Au sens de l'invention, on entend par « groupement sulfate », un groupement du type (SO3H) ou de type -SO3'. Au sens de l'invention, on entend par « groupement phosphate », un groupement du type (-PO3H2).For the purposes of the invention, the term “sulphate group” means a group of the (SO 3 H) type or of the —SO 3 ′ type. For the purposes of the invention, the term “phosphate group” is intended to mean a group of the (-PO 3 H 2 ) type.
Dans un mode de réalisation avantageux, les groupements XA2, Xa4, Xa6, Xb2, Xb3 et Xb6 sont choisis indépendamment les uns des autres et indépendamment pour chaque unité A et/ou B dans le groupe comprenant :In an advantageous embodiment, the groups X A2 , Xa4, Xa6, Xb2, Xb3 and Xb6 are chosen independently of each other and independently for each unit A and / or B in the group comprising:
- un atome d’hydrogène,- a hydrogen atom,
- un groupement sulfate,- a sulfate group,
- un groupement pyruvate, ledit groupement pyruvate étant lié au groupement XA4 par son carbone en position 2 et au groupement XA6 par son carbone en position 2,a pyruvate group, said pyruvate group being linked to the group X A 4 by its carbon in position 2 and to the group X A 6 by its carbon in position 2,
- une unité saccharidique liée à l’unité A ou B par une liaison de type O-glycosidique en position 1 (Ci) de l’unité saccharidique et choisie parmi un T-galactose, un Txylose, un T-arabinose et un T-acide glucuronique.a saccharide unit linked to unit A or B by an O-glycosidic bond in position 1 (Ci) of the saccharide unit and chosen from a T-galactose, a Txylose, a T-arabinose and a T- glucuronic acid.
Dans un mode de réalisation plus avantageux,In a more advantageous embodiment,
- Xa2, Xb2 et XB3Sont choisis parmi un atome d’hydrogène et un groupement sulfate;- Xa2, Xb2 and XB3 are chosen from a hydrogen atom and a sulfate group;
- XA4 est choisi parmi un atome d’hydrogène, un groupement sulfate et un groupement pyruvate, ledit groupement pyruvate étant lié au groupement XA4 par son carbone en position 2 et au groupement XA6 par son carbone en position 2; - X A4 is chosen from a hydrogen atom, a sulfate group and a pyruvate group, said pyruvate group being linked to the group X A4 by its carbon in position 2 and to the group X A6 by its carbon in position 2 ;
- XA6 est choisi parmi un atome d’hydrogène, un groupement sulfate, une unité saccharidique T-galactose liée à l’unité A par une liaison de type O-glycosidique, une unité saccharidique T-xylose liée à l’unité A par une liaison de type O-glycosidique, une unité saccharidique T-arabinose liée à l’unité A par une liaison de type O-glycosidique et une unité saccharidique T-acide glucuronique liée à l’unité A par une liaison de type O-glycosidique, et- X A6 is chosen from a hydrogen atom, a sulphate group, a T-galactose saccharide unit linked to unit A by an O-glycosidic type bond, a T-xylose saccharide unit linked to unit A by an O-glycosidic type bond, a T-arabinose saccharide unit linked to unit A by an O-glycosidic type link and a T-glucuronic acid saccharide unit linked to unit A by an O-glycosidic type link , and
- XB6 est choisi parmi un atome d’hydrogène, un groupement sulfate, une unité saccharidique T-galactose liée par une liaison de type O-glycosidique au résidu B1, une unité saccharidique T-xylose liée par une liaison de type O-glycosidique au résidu B1, une unité saccharidique T-arabinose liée par une liaison de type O-glycosidique au résidu B1, et une unité saccharidique T-acide glucuronique liée par une liaison de type O-glycosidique au résidu B1.- X B 6 is chosen from a hydrogen atom, a sulphate group, a T-galactose saccharide unit linked by an O-glycosidic bond to the residue B1, a T-xylose saccharide unit linked by an O- bond glycosidic to residue B1, a T-arabinose saccharide unit linked by an O-glycosidic bond to residue B1, and a T-glucuronic acid saccharide unit linked by an O-glycosidic bond to residue B1.
On entend par « sel pharmaceutiquement acceptable » tout sel d’addition avec un acide minéral ou organique par action d’un tel acide au sein d’un solvant organique ou aqueux tel qu’un alcool, une cétone, un éther, et qui soit acceptable d’un point de vue pharmaceutique. A titre d’exemple de tels sels, on peut citer les sels suivants : un sel sodique de type SO3Na, un sel potassique de type SO3K, le benzènesulfonate, le bromhydrate, le chlorhydrate, le citrate, éthanesulfonate, le fumarate, le gluconate, l’iodate, l’iséthionate, le maléate, méthanesulfonate, le méthylène-bis-b-oxynaphtoate, le nitrate, l’oxalate, le palmoate, le phosphate, le salicylate, le sulfate, le tartrate, le théophyllinacétate et le p-toluènesulfonate. Dans un mode de réalisation avantageux, le sel pharmaceutiquement acceptable est un sel sodique (SO3Na) ou un sel potassique (SO3K).The term “pharmaceutically acceptable salt” means any addition salt with a mineral or organic acid by the action of such an acid within an organic or aqueous solvent such as an alcohol, a ketone, an ether, and which is acceptable from a pharmaceutical point of view. Examples of such salts that may be mentioned are the following salts: a sodium salt of the SO 3 Na type, a potassium salt of the SO 3 K type, benzenesulfonate, hydrobromide, hydrochloride, citrate, ethanesulfonate, fumarate , gluconate, iodate, isethionate, maleate, methanesulfonate, methylene-bis-b-oxynaphtoate, nitrate, oxalate, palmoate, phosphate, salicylate, sulfate, tartrate, theophyllinacetate and p-toluenesulfonate. In an advantageous embodiment, the pharmaceutically acceptable salt is a sodium salt (SO 3 Na) or a potassium salt (SO 3 K).
ίοίο
Les polysaccharides sulfatés de la présente invention présentent de nombreux avantages par rapport aux héparines disponibles sur le marché. En particulier, les polysaccharides sulfatés selon l’invention présentent une activité identique ou supérieure à l’héparine standard non fractionnée ou aux héparines de faibles masses moléculaires de type Lovenox® sur des modèles de thrombose. A faibles concentrations, les polysaccharides sulfatés selon l’invention ont une activité similaire à l’héparine standard non fractionnée et une activité meilleure que les héparines de faibles masses moléculaires de type Lovenox® sur les voies endogène et exogène de la cascade de la coagulation, permettant ainsi de prévenir et de traiter les risques associés à la thrombose vasculaire. De plus, ces polysaccharides sulfatés sont obtenus à partir d'algues, contrairement aux héparines disponibles sur le marché, qui elles sont obtenues à partir d’animaux, réduisant ainsi les coûts de production et les risques de contamination virale et/ou par prion.The sulfated polysaccharides of the present invention have many advantages over the heparins available on the market. In particular, the sulfated polysaccharides according to the invention have the same or greater activity than standard unfractionated heparin or to low molecular weight heparins of the Lovenox® type in thrombosis models. At low concentrations, the sulfated polysaccharides according to the invention have an activity similar to standard unfractionated heparin and an activity better than low molecular weight heparins of the Lovenox® type on the endogenous and exogenous pathways of the coagulation cascade, thus preventing and treating the risks associated with vascular thrombosis. In addition, these sulfated polysaccharides are obtained from algae, unlike the heparins available on the market, which are obtained from animals, thereby reducing production costs and the risks of viral and / or prion contamination.
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le polysaccharide sulfaté possède une masse moléculaire inférieure ou égale à 1000 kDa. De manière avantageuse, le polysaccharide sulfaté selon l’invention possède une masse moléculaire inférieure ou égale à 450 kDa, avantageusement inférieure ou égale à 400 kDa, avantageusement inférieure ou égale à 350 kDa, avantageusement inférieure ou égal à 300 kDa, avantageusement inférieure ou égale à 250 kDa, avantageusement inférieure ou égale à 200 kDa. De manière avantageuse, le polysaccharide sulfaté selon l’invention possède une masse moléculaire comprise entre 10 kDa et 500 kDa, avantageusement comprise entre 10 kDa et 400 kDa, avantageusement comprise entre 10 kDa et 300 kDa, avantageusement compris entre 10 kDa et 250 kDa.In a particular embodiment of the invention, the sulfated polysaccharide has a molecular mass less than or equal to 1000 kDa. Advantageously, the sulfated polysaccharide according to the invention has a molecular mass less than or equal to 450 kDa, advantageously less than or equal to 400 kDa, advantageously less than or equal to 350 kDa, advantageously less than or equal to 300 kDa, advantageously less than or equal at 250 kDa, advantageously less than or equal to 200 kDa. Advantageously, the sulfated polysaccharide according to the invention has a molecular mass between 10 kDa and 500 kDa, advantageously between 10 kDa and 400 kDa, advantageously between 10 kDa and 300 kDa, advantageously between 10 kDa and 250 kDa.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l’invention, le polysaccharide sulfaté présente un taux de sulfates inférieur ou égal à 20% en masse du polysaccharide. De manière avantageuse, le taux de sulfates du polysaccharide sulfaté est inférieur ou égal à 19%, avantageusement inférieur ou égal à 18%, avantageusement inférieur ou égal à 17%, avantageusement inférieur ou égal à 16%. De manière avantageuse, le taux de sulfates du polysaccharide sulfaté est compris entre 5% et 20%, avantageusement entre 6% et 20%, avantageusement entre 7% et 19%, avantageusement entre 8% et 19%, avantageusement entre 9% et 18%, avantageusement entre 10% et 16%, avantageusement entre 13% et 16%.In another particular embodiment of the invention, the sulphated polysaccharide has a sulphate level less than or equal to 20% by mass of the polysaccharide. Advantageously, the level of sulphates in the sulphated polysaccharide is less than or equal to 19%, advantageously less than or equal to 18%, advantageously less than or equal to 17%, advantageously less than or equal to 16%. Advantageously, the level of sulphates in the sulphated polysaccharide is between 5% and 20%, advantageously between 6% and 20%, advantageously between 7% and 19%, advantageously between 8% and 19%, advantageously between 9% and 18 %, advantageously between 10% and 16%, advantageously between 13% and 16%.
Dans un autre mode de réalisation de l’invention, le polysaccharide sulfaté possède un taux de résidus 3,6-anhydrogalactopyranose (ou résidu B2) inférieur ou égal à 5% en masse du polysaccharide. Dans un mode de réalisation avantageuse, le polysaccharide sulfaté possède un taux de résidus 3,6-anhydrogalactopyranose (ou résidu B2) inférieur ou égal à 4%, avantageusement inférieur ou égal à 3%, avantageusement inférieur ou égal à 2%, avantageusement inférieur ou égal à 1,5%. De manière encore plus avantageuse, le polysaccharide sulfaté possède un taux de résidus 3,6-anhydrogalactopyranose (ou résidu B2) inférieur ou égal à 1,4%.In another embodiment of the invention, the sulfated polysaccharide has a level of 3,6-anhydrogalactopyranose residues (or residue B2) of less than or equal to 5% by mass of the polysaccharide. In an advantageous embodiment, the sulfated polysaccharide has a level of 3,6-anhydrogalactopyranose residues (or residue B2) less than or equal to 4%, advantageously less than or equal to 3%, advantageously less than or equal to 2%, advantageously less or equal to 1.5%. Even more advantageously, the sulfated polysaccharide has a content of 3,6-anhydrogalactopyranose residues (or residue B2) less than or equal to 1.4%.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l’invention, le polysaccharide sulfaté est d’origine naturelle.In another particular embodiment of the invention, the sulfated polysaccharide is of natural origin.
Un autre objet de l’invention concerne une composition pharmaceutique pour son utilisation en tant qu’anticoagulant comprenant au moins un polysaccharide sulfaté extrait à partir d’une algue rouge ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, dans lequel le taux de sulfate dudit polysaccharide est inférieur ou égal à 20% en poids du polysaccharide, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci tel que défini précédemment.Another subject of the invention relates to a pharmaceutical composition for its use as an anticoagulant comprising at least one sulfated polysaccharide extracted from a red alga or a pharmaceutically acceptable salt thereof, in which the level of sulfate of said polysaccharide is less than or equal to 20% by weight of the polysaccharide, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as defined above.
Dans un mode de réalisation particulier, cette composition pharmaceutique comprend au moins un polysaccharide sulfaté selon l’invention, en association avec un ou plusieurs autres agents choisis parmi les excipients pharmaceutiquement acceptables, les agents actifs et les ingrédients alimentaires.In a particular embodiment, this pharmaceutical composition comprises at least one sulfated polysaccharide according to the invention, in combination with one or more other agents chosen from pharmaceutically acceptable excipients, active agents and food ingredients.
Conformément à la présente invention, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme liquide, en particulier sous forme de solution ou de suspension ou sous forme de gel ou sous forme de poudre.In accordance with the present invention, the pharmaceutical composition can be in liquid form, in particular in the form of a solution or suspension or in the form of a gel or in the form of powder.
Par « excipient pharmaceutiquement acceptable », on entend toute substance autre que la substance active, destinée à apporter une consistance, un goût, une couleur à un médicament, tout en évitant toute interaction avec le principe actif. L’excipient pharmaceutiquement acceptable selon l’invention sera choisi selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaité, parmi les excipients habituels qui sont connus de l'homme du métier, en vue d’être administré à l’Homme ou aux animaux.By “pharmaceutically acceptable excipient” is meant any substance other than the active substance, intended to bring a consistency, a taste, a color to a medicament, while avoiding any interaction with the active principle. The pharmaceutically acceptable excipient according to the invention will be chosen according to the pharmaceutical form and the desired mode of administration, from the usual excipients which are known to those skilled in the art, with a view to being administered to humans or animals .
Par « agents actifs », on entend toute substance autre que la substance active et ayant un effet thérapeutique. On peut notamment citer à titre d’exemples les anticoagulants, les antibiotiques, les anti-thrombotiques, les anticancéreux, les anti-inflammatoires, les antihistaminiques, les médicaments cardiovasculaires, les antihypertenseurs, la présente liste n’étant pas limitative.By "active agents" is meant any substance other than the active substance and having a therapeutic effect. Mention may in particular be made, as examples, of anticoagulants, antibiotics, anti-thrombotics, anticancer agents, anti-inflammatories, antihistamines, cardiovascular drugs, antihypertensives, the present list not being limiting.
Par « ingrédients alimentaires », on entend toute substance autre que la substance active destinée à être utiliser dans une composition alimentaire à destination de l’Homme ou de l’animal. Cet ingrédient alimentaire répond notamment aux conditions de sécurité et de nontoxicité liées à une telle utilisation. A titre d’exemple, on peut notamment citer le sucre, en particulier le saccharose, le miel, les agents protéiques alimentaires, comme notamment le gluten, les protéines de soja, les protéines de blé, les vitamines, les oligonutriments comme le fer, le calcium, le magnésium, la présente liste n’étant pas limitative.By "food ingredients" is meant any substance other than the active substance intended to be used in a food composition intended for humans or animals. This food ingredient in particular meets the safety and nontoxicity conditions linked to such use. By way of example, mention may in particular be made of sugar, in particular sucrose, honey, food protein agents, such as in particular gluten, soy proteins, wheat proteins, vitamins, oligonutrients such as iron, calcium, magnesium, this list is not exhaustive.
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, les compositions pharmaceutiques comprenant le polysaccharide sulfaté peuvent être administrées par voie orale, sublinguale, sous-cutanée, parentérale, intramusculaire, intraveineuse, topique, locale, intratrachéale, intranasale, oculaire, intrapéritonéale, par diffusion endopariétale, transdermique ou rectale, ou par toute autre voie d’administration. Les formes d'administration appropriées comprennent les formes par voie orale telles que les comprimés, les gélules molles ou dures, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale, buccale, intratrachéale, intraoculaire, intranasale, par inhalation, les formes d'administration topique, transdermique, sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse, les formes d'administration rectale et les implants. Pour l'application topique, on peut utiliser les composés selon l'invention dans des crèmes, des émulsions huile dans l’eau ou eau dans l’huile, des gels, des pommades, des patches, des solutions ou des lotions.In a particular embodiment of the invention, the pharmaceutical compositions comprising the sulfated polysaccharide can be administered by oral, sublingual, subcutaneous, parenteral, intramuscular, intravenous, topical, local, intratracheal, intranasal, ocular, intraperitoneal, endoparietal, transdermal or rectal diffusion, or by any other route of administration. Suitable administration forms include oral forms such as tablets, soft or hard capsules, powders, granules and oral solutions or suspensions, sublingual, buccal, intratracheal, intraocular, intranasal administration forms. by inhalation, topical, transdermal, subcutaneous, intramuscular or intravenous administration forms, rectal administration forms and implants. For topical application, the compounds according to the invention can be used in creams, oil in water or water in oil emulsions, gels, ointments, patches, solutions or lotions.
Selon l'invention, la composition pharmaceutique comprenant au moins un polysaccharide sulfaté est particulièrement utile pour prévenir, réduire et traiter les thromboses vasculaires.According to the invention, the pharmaceutical composition comprising at least one sulfated polysaccharide is particularly useful for preventing, reducing and treating vascular thromboses.
Le terme « prévenir » ou «prévention » ou « prophylaxie » ou « traitement préventif » ou « traitement prophylactique » comprend aussi bien un traitement aboutissant à la prévention d'une maladie qu'un traitement réduisant et/ou retardant l'incidence d'une maladie ou le risque qu'elle survienne.The term "prevent" or "prevention" or "prophylaxis" or "preventive treatment" or "prophylactic treatment" includes both treatment leading to the prevention of a disease as well as treatment reducing and / or delaying the incidence of an illness or the risk of it occurring.
Le terme «traiter » ou « traitement » ou « traitement curatif » est défini par un traitement aboutissant à une guérison ou un traitement allégeant, améliorant et/ou éliminant, réduisant et/ou stabilisant les symptômes d'une maladie ou la souffrance qu'elle provoque.The term "treat" or "treatment" or "curative treatment" is defined by a treatment leading to a cure or a treatment which alleviates, improves and / or eliminates, reduces and / or stabilizes the symptoms of an illness or the suffering that she provokes.
Par « thromboses vasculaires », on entend les thromboses artérielles et les thromboses veineuses profondes ou non. Ainsi, la composition pharmaceutique comprenant au moins un polysaccharide sulfaté selon l’invention est particulièrement utile pour prévenir, réduire et traiter les thromboses artérielles, les thromboses veineuses profondes ou non.By "vascular thromboses" is meant arterial thromboses and deep or non-venous thromboses. Thus, the pharmaceutical composition comprising at least one sulfated polysaccharide according to the invention is particularly useful for preventing, reducing and treating arterial thromboses, deep venous thromboses or not.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique comprenant le polysaccharide sulfaté peut être administrée au patient à une dose journalière comprise entre 50 et 1000 mg, de préférence comprise entre 100 et 1000 mg pour prévenir, réduire et traiter les thromboses vasculaires, en particulier pour prévenir, réduire et traiter les thromboses artérielles, des thromboses veineuses profondes ou non. Dans un mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique comprenant le polysaccharide sulfaté est administrée au patient à une dose de préférence comprise entre 100 et 950 mg, de préférence comprise entre 100 à 900 mg, de préférence comprise entre 100 à 850 mg, de préférence comprise entre 100 à 800 mg, de préférence comprise entre 100 à 750 mg, de préférence comprise entre 100 à 700 mg, de préférence comprise entre 100 à 650 mg, de préférence comprise entre 100 à 600 mg pour prévenir, réduire et traiter les thromboses vasculaires, en particulier pour prévenir, réduire et traiter les thromboses artérielles, des thromboses veineuses profondes ou non. Dans un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique comprenant le polysaccharide sulfaté est administrée au patient à une dose journalière comprise entre 200 à 600 mg pour prévenir, réduire et traiter les thromboses vasculaires, en particulier pour prévenir, réduire et traiter les thromboses artérielles, des thromboses veineuses profondes ou non. II est toutefois bien entendu que l'Homme de l'art adaptera ces doses en fonction de l'âge, du poids et de la pathologie du patient, notamment en fonction du risque thrombogène.In a particular embodiment, the pharmaceutical composition comprising the sulfated polysaccharide can be administered to the patient at a daily dose of between 50 and 1000 mg, preferably between 100 and 1000 mg, to prevent, reduce and treat vascular thromboses, in particular to prevent, reduce and treat arterial thrombosis, deep vein thrombosis or not. In a particular embodiment, the pharmaceutical composition comprising the sulfated polysaccharide is administered to the patient at a dose preferably of between 100 and 950 mg, preferably of between 100 to 900 mg, preferably of between 100 to 850 mg, preferably between 100 and 800 mg, preferably between 100 and 750 mg, preferably between 100 and 700 mg, preferably between 100 and 650 mg, preferably between 100 and 600 mg to prevent, reduce and treat thrombosis vascular, in particular to prevent, reduce and treat arterial thromboses, deep venous thromboses or not. In a preferred embodiment, the pharmaceutical composition comprising the sulfated polysaccharide is administered to the patient at a daily dose of between 200 and 600 mg to prevent, reduce and treat vascular thromboses, in particular to prevent, reduce and treat arterial thromboses, deep vein thrombosis or not. It is however understood that a person skilled in the art will adapt these doses as a function of the patient's age, weight and pathology, in particular as a function of the thrombogenic risk.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l’invention, la composition pharmaceutique comprenant au moins un polysaccharide sulfaté est particulièrement utile pour prévenir, réduire et traiter les ischémies, les embolies pulmonaires, l’angor instable et l’infarctus du myocarde.In another particular embodiment of the invention, the pharmaceutical composition comprising at least one sulfated polysaccharide is particularly useful for preventing, reducing and treating ischemia, pulmonary embolism, unstable angina and myocardial infarction.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l’invention, la composition pharmaceutique comprenant au moins un polysaccharide sulfaté est particulièrement utile pour prévenir la coagulation dans les circuits de circulation extracorporelle et/ou d’épuration extra-rénale.In another particular embodiment of the invention, the pharmaceutical composition comprising at least one sulfated polysaccharide is particularly useful for preventing coagulation in the circuits of extracorporeal circulation and / or extra-renal purification.
Un autre aspect de l’invention concerne une méthode de traitement des thromboses vasculaires comprenant l’administration à un patient souffrant de thromboses vasculaires d’une composition pharmaceutique comprenant au moins un polysaccharide sulfaté extrait d’une algue rouge marine.Another aspect of the invention relates to a method of treating vascular thromboses comprising administering to a patient suffering from vascular thromboses a pharmaceutical composition comprising at least one sulfated polysaccharide extracted from a red seaweed.
Un autre aspect de l’invention concerne une méthode de traitement des ischémies, des embolies pulmonaires, de l’angor instable et de l’infarctus du myocarde, comprenant l’administration à un patient en nécessitant, d’une composition pharmaceutique comprenant au moins un polysaccharide sulfaté extrait d’une algue rouge.Another aspect of the invention relates to a method of treating ischemia, pulmonary embolism, unstable angina and myocardial infarction, comprising administering to a patient in need, a pharmaceutical composition comprising at least a sulfated polysaccharide extracted from a red alga.
Un autre aspect de l’invention concerne une méthode de prévention de la coagulation dans les circuits de circulation extracorporelle et/ou d’épuration extra-rénale, comprenant l’administration dans le circuit de circulation extracorporelle et/ou d’épuration extra-rénale, d’une composition pharmaceutique comprenant au moins un polysaccharide sulfaté extrait d’une algue rouge.Another aspect of the invention relates to a method of preventing coagulation in the circuits of extracorporeal circulation and / or extra-renal purification, comprising the administration in the circuit of extracorporeal circulation and / or extra-renal purification. , of a pharmaceutical composition comprising at least one sulfated polysaccharide extracted from a red alga.
Par « administration », on entend tout acte permettant de faire absorber au patient ou d’introduire dans le circuit de circulation extracorporelle et/ou d’épuration extra-rénale, la composition pharmaceutique selon l’invention par n’importe quelle voie, forme ou mode d’administration.By “administration” is meant any act allowing the patient to absorb or introduce into the extracorporeal circulation and / or extra-renal purification circuit, the pharmaceutical composition according to the invention by any route, form or method of administration.
Un autre aspect de la présente invention concerne un procédé d’obtention du polysaccharide sulfaté. Le polysaccharide sulfaté selon l’invention peut être obtenu par des procédés bien connus de l’Homme du métier. En particulier, l’extraction d‘un polysaccharide sulfaté de haute masse moléculaire peut notamment être obtenu par un procédé comprenant les étapes décrites ci-après :Another aspect of the present invention relates to a process for obtaining the sulfated polysaccharide. The sulfated polysaccharide according to the invention can be obtained by methods well known to those skilled in the art. In particular, the extraction of a sulfated polysaccharide of high molecular mass can in particular be obtained by a process comprising the steps described below:
a) Dispersion dans l’eau d’une poudre d’algue rouge, en particulier une poudre d’ Haliptilon subulatum préalablement séchée ;a) Dispersion in water of a red algae powder, in particular a previously dried powder of Haliptilon subulatum;
b) Précipitation par au moins un solvant polaire des polysaccharides de hautes masses moléculaires;b) Precipitation by at least one polar solvent of the polysaccharides of high molecular masses;
c) Séchage du précipité contenant les polysaccharides de hautes masses moléculaires.c) Drying of the precipitate containing the high molecular weight polysaccharides.
Dans un mode de réalisation particulier, l’étape b) de précipitation alcoolique est réalisée en utilisant de l’éthanol ou de l’isopropanol. Dans un mode de réalisation particulier, l’étape de séchage du précipité (étape c) peut être réalisée par lyophilisation ou à l’aide d’une étuve, notamment à une température comprise entre 40°C et 75°C, avantageusement 50°C pendant une nuit. La méthode d’obtention selon l’invention peut être renouvelée plusieurs fois afin d’obtenir un degré de pureté du polysaccharide satisfaisant.In a particular embodiment, step b) of alcoholic precipitation is carried out using ethanol or isopropanol. In a particular embodiment, the step of drying the precipitate (step c) can be carried out by lyophilization or using an oven, in particular at a temperature of between 40 ° C. and 75 ° C., advantageously 50 °. C overnight. The production method according to the invention can be repeated several times in order to obtain a satisfactory degree of purity of the polysaccharide.
Le procédé d’extraction selon la présente invention permet l’obtention de polysaccharides sous forme d’une fine poudre blanc crème avec un rendement de production de l’ordre de 10-20% par rapport à la masse sèche de poudre d’algue Haliptilum subulatum utilisée.The extraction process according to the present invention makes it possible to obtain polysaccharides in the form of a fine creamy white powder with a production yield of the order of 10-20% relative to the dry mass of Haliptilum algae powder. subulatum used.
Dans un autre mode de réalisation particulier, les polysaccharides sulfatés de faibles masses moléculaires sont préparés par dégradation acide de polysaccharides de hautes masses moléculaires. Les polysaccharides sulfatés de faible masse moléculaire peuvent également être obtenus par des techniques de dépolymérisation bien connues de l’Homme du métier, telles que les dépolymérisations radicalaire ou enzymatique.In another particular embodiment, the sulfated polysaccharides of low molecular weights are prepared by acid degradation of polysaccharides of high molecular weights. Low molecular weight sulfated polysaccharides can also be obtained by depolymerization techniques well known to those skilled in the art, such as radical or enzymatic depolymerizations.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé d’extraction d’un polysaccharide sulfaté de faible masse moléculaire à partir d’algue Haliptilon subulatum comprend les étapes suivantes :In a particular embodiment, the process for extracting a sulfated polysaccharide of low molecular mass from the alga Haliptilon subulatum comprises the following steps:
a) Dispersion de la poudre de polysaccharides de haute masse moléculaire dans une solution aqueuse à pH acide, en particulier un pH compris entre 0 et 6,5 ;a) Dispersion of the high molecular weight polysaccharide powder in an aqueous solution at acidic pH, in particular a pH between 0 and 6.5;
b) Précipitation par au moins un solvant polaire des polysaccharides de faible masse moléculaire;b) Precipitation by at least one polar solvent of low molecular weight polysaccharides;
c) Séchage du précipité contenant les polysaccharides de faibles masses moléculaires.c) Drying of the precipitate containing the low molecular weight polysaccharides.
Dans un mode de réalisation particulier, la solution aqueuse utilisée dans l’étape de dispersion (étape a) est une solution d’acide chlorhydrique (HCl). Dans un mode de réalisation particulier, la solution d’acide chlorhydrique présente une concentration comprise entre 1M et 5M, avantageusement 2M, à une température allant de 50°C à 100°C et sous agitation pendant 30 à 60 minutes. Dans un mode de réalisation particulier, l’étape b) de précipitation alcoolique est réalisée en utilisant de l’éthanol ou de l’isopropanol. Dans un mode de réalisation particulier, l’étape de séchage du précipité (étape c) est réalisée par lyophilisation ou à l’aide d’une étuve, notamment à une température comprise entre 40°C et 75°C, avantageusement 50°C pendant une nuit.In a particular embodiment, the aqueous solution used in the dispersion step (step a) is a hydrochloric acid (HCl) solution. In a particular embodiment, the hydrochloric acid solution has a concentration of between 1M and 5M, advantageously 2M, at a temperature ranging from 50 ° C to 100 ° C and with stirring for 30 to 60 minutes. In a particular embodiment, step b) of alcoholic precipitation is carried out using ethanol or isopropanol. In a particular embodiment, the step of drying the precipitate (step c) is carried out by lyophilization or using an oven, in particular at a temperature between 40 ° C. and 75 ° C., advantageously 50 ° C. overnight.
Les polysaccharides sulfatés extraits à partir d’algues rouges selon l’invention présentent l’avantage de ne pas avoir les problèmes de contamination et de sécurité, contrairement aux héparines disponibles sur le marché qui sont obtenues à partir de porcs. De plus, ces polysaccharides sulfatés offrent un avantage économique. Le rendement approximatif de polysaccharides sulfatés de la présente invention est d'environ 10% à 20% par rapport au poids sec initial d'algues à partir desquelles il a été extrait. Ce rendement élevé signifie réduction du coût final du produit, par rapport aux héparines disponibles sur le marché. En outre, les algues rouges, en particulier de la classe des Florideophyceae, en particulier les espèces Haliptilon subulatum, sont faciles à cultiver ce qui contribue également au faible coût de revient du produit final.The sulfated polysaccharides extracted from red algae according to the invention have the advantage of not having contamination and safety problems, unlike the heparins available on the market which are obtained from pigs. In addition, these sulfated polysaccharides offer an economic advantage. The approximate yield of sulfated polysaccharides of the present invention is about 10% to 20% based on the initial dry weight of algae from which it was extracted. This high yield means a reduction in the final cost of the product compared to the heparins available on the market. In addition, red algae, in particular of the Floridaophyceae class, in particular the Haliptilon subulatum species, are easy to cultivate which also contributes to the low cost price of the final product.
Les figures 1 à 5 et les exemples 1 à 6 qui suivent illustrent l’invention sans toutefois la limiter.Figures 1 to 5 and examples 1 to 6 which follow illustrate the invention without, however, limiting it.
FIGURESFIGURES
Figure 1 : Détermination de l’activité résiduelle du Facteur Xa selon l’exemple 6, exprimée en pourcentage (%) en fonction de la concentration en héparine, en Lovenox®, en polysaccharide sulfaté de haute (PSHM) (213,5 kDa) et faible (PSFM) (36,6 kDa) masse moléculaire selon l’invention (PSHM et PSFM) exprimée en pg/mL.Figure 1: Determination of the residual activity of Factor Xa according to Example 6, expressed as a percentage (%) as a function of the concentration of heparin, Lovenox®, high sulfated polysaccharide (PSHM) (213.5 kDa) and low (PSFM) (36.6 kDa) molecular mass according to the invention (PSHM and PSFM) expressed in pg / mL.
Figure 2 : Détermination de l’activité résiduelle du Facteur lia selon l’exemple 6, exprimée en pourcentage (%) en fonction de la concentration en héparine, en Lovenox®, en polysaccharide sulfaté de haute (PSHM) (213,5 kDa) et faible (PSFM) (36,6 kDa) masse moléculaire selon l’invention exprimée en pg/mL.Figure 2: Determination of the residual activity of Factor IIa according to Example 6, expressed as a percentage (%) as a function of the concentration of heparin, Lovenox®, high sulfated polysaccharide (PSHM) (213.5 kDa) and low (PSFM) (36.6 kDa) molecular mass according to the invention expressed in pg / mL.
Figure 3 : Détermination du temps de Temps de Céphaline activée (aPTT), selon l’exemple 6, exprimée en seconde (s) en fonction de la concentration en héparine en Lovenox®, en carraghénane Iota et en polysaccharide sulfaté de haute (PSHM) (213,5 kDa) et faible (PSFM) (36,6 kDa) masse moléculaire selon l’invention exprimée en pg/mL.Figure 3: Determination of the time of activated partial thromboplastin time (aPTT), according to Example 6, expressed in second (s) according to the heparin concentration in Lovenox®, in carrageenan Iota and in high sulfated polysaccharide (PSHM) (213.5 kDa) and low (PSFM) (36.6 kDa) molecular mass according to the invention expressed in pg / mL.
Figure 4 : Détermination du temps de Temps de Quick (PT), selon l’exemple 6, exprimée en seconde (s) en fonction de la concentration en héparine en Lovenox®, en carraghénane Iota et en polysaccharide sulfaté de haute (PSHM) (213,5 kDa) et faible (PSFM) (36,6 kDa) masse moléculaire selon l’invention exprimée en pg/mL.Figure 4: Determination of the Quick Time (PT) time, according to Example 6, expressed in seconds as a function of the heparin concentration in Lovenox®, in carrageenan Iota and in high sulfated polysaccharide (PSHM) ( 213.5 kDa) and low (PSFM) (36.6 kDa) molecular mass according to the invention expressed in pg / mL.
Figure 5: Détermination du temps de Temps de thrombine (TT), selon l’exemple 6, exprimée en seconde (s) en fonction de la concentration en héparine en Lovenox®, en carraghénane Iota et en polysaccharide sulfaté de haute (PSHM) (213,5 kDa) et faible (PSFM) (36,6 kDa) masse moléculaire selon l’invention exprimée en pg/mL.Figure 5: Determination of the thrombin time (TT) time, according to Example 6, expressed in seconds as a function of the heparin concentration in Lovenox®, in carrageenan Iota and in high sulfated polysaccharide (PSHM) ( 213.5 kDa) and low (PSFM) (36.6 kDa) molecular mass according to the invention expressed in pg / mL.
EXEMPLESEXAMPLES
Exemple 1 : Extraction des polysaccharides de haute masse moléculaire (PSHM)EXAMPLE 1 Extraction of High Molecular Mass Polysaccharides (PSHM)
Par « polysaccharide de haute masse moléculaire» ou « PSHM », on entend un polysaccharide ayant une masse molaire comprise entre 100 et 1000 kDa.By “high molecular weight polysaccharide” or “PSHM”, is meant a polysaccharide having a molar mass of between 100 and 1000 kDa.
L’extraction des polysaccharides de haute masse moléculaire est réalisée en dispersant 100 grammes de poudre d’algue Haliptilon subulatum dans 1 litre d’eau à 90 °C sous vive agitation (500 Tr/min) pendant 4H. Le mélange est ensuite filtré à chaud sur diatomée (100 g) sur un verre fritté (porosité 1, plus précisément 100 à 160 pm). Le filtrat est ensuite centrifugé (10000 g, 30 minutes) à température ambiante pour obtenir l’extrait d’algue enrichi en polysaccharides. L’extrait <5 Haliptilon subulatum est ensuite précipité dans 3 volumes d’éthanol 96° (à 4°C) sous agitation (500 Tr/min) pendant 2 heures.The extraction of high molecular weight polysaccharides is carried out by dispersing 100 grams of Haliptilon subulatum algae powder in 1 liter of water at 90 ° C with vigorous stirring (500 RPM) for 4 hours. The mixture is then filtered hot on a diatom (100 g) on a sintered glass (porosity 1, more precisely 100 to 160 μm). The filtrate is then centrifuged (10,000 g, 30 minutes) at room temperature to obtain the algae extract enriched in polysaccharides. The extract <5 Haliptilon subulatum is then precipitated in 3 volumes of 96 ° ethanol (at 4 ° C) with stirring (500 RPM) for 2 hours.
Le précipité est récupéré par filtration sur verre fritté (porosité 1 ou 2, plus précisément 100 à 160 pm ou 40 à 100 pm respectivement) ou centrifugation (10000 g, 30 minutes) à température ambiante puis lavé avec de l’acétone (50 à 100 mL). Ensuite, le précipité est récupéré par filtration sur verre fritté (porosité 2, plus précisément 40 à 100 pm) ou centrifugation (10000 g, 30 minutes) à température ambiante puis séché à l’étuve à 50°C durant une nuit. Finalement, le précipité est broyé (au Blender) afin d’obtenir une fine poudre de polysaccharides de haute masse moléculaire extraits d’Haliptilon subulatum.The precipitate is recovered by filtration on sintered glass (porosity 1 or 2, more precisely 100 to 160 μm or 40 to 100 μm respectively) or centrifugation (10,000 g, 30 minutes) at room temperature then washed with acetone (50 to 100 mL). Then, the precipitate is recovered by filtration on sintered glass (porosity 2, more precisely 40 to 100 μm) or centrifugation (10,000 g, 30 minutes) at room temperature and then dried in an oven at 50 ° C overnight. Finally, the precipitate is ground (in a blender) in order to obtain a fine powder of high molecular weight polysaccharides extracted from Haliptilon subulatum.
Le rendement en polysaccharides de haute masse moléculaire ainsi obtenu est de l’ordre de 10 à 20% par rapport à la masse sèche de poudre d’algue Haliptilum subulatum utilisée.The yield of high molecular weight polysaccharides thus obtained is of the order of 10 to 20% relative to the dry mass of Haliptilum subulatum algae powder used.
Exemple 2 : Extraction des polysaccharides de faible masse moléculaire (PSFM)Example 2 Extraction of Low Molecular Mass Polysaccharides (PSFM)
Par « polysaccharide de faible masse moléculaire» ou « PSFM », on entend un polysaccharide ayant une masse moléculaire comprise entre 5 et 100 KDa.By “low molecular weight polysaccharide” or “PSFM” is meant a polysaccharide having a molecular weight between 5 and 100 KDa.
La production de polysaccharides de faibles masses moléculaires est réalisée en dispersant 2,5 grammes de poudre de polysaccharides de haute masse moléculaire (extraits d’Haliptilon subulatum) dans 125 mL d’HCI (2M) à 100 °C sous vive agitation (500 Tr/min) pendant 1 heure. Le mélange est ensuite refroidi à température ambiante puis neutralisé avec de la soude (5 M). Le milieu est précipité dans 7 volumes d’éthanol 96° (à 4°C) sous agitation (500 Tr/min) pendant 2 heures. Le précipité est récupéré par filtration sur verre fritté (porosité 1 ou 2, plus précisément 100 à 160 pm ou 40 à 100 pm respectivement) ou centrifugation (10000 g, 30 minutes) à température ambiante puis lavé avec de l’acétone (50 mL). Ensuite, le précipité est récupéré par filtration sur verre fritté (porosité 2, plus précisément 40 à 100 pm) ou centrifugation (10000 g, 30 minutes) à température ambiante puis séché à l’étuve à 50°C durant une nuit. Finalement, le précipité est broyé (au Blender) afin d’obtenir une fine poudre de polysaccharides de faible masse moléculaire extraits d’Haliptilon subulatum.The production of low molecular weight polysaccharides is carried out by dispersing 2.5 grams of high molecular weight polysaccharide powder (extracts of Haliptilon subulatum) in 125 mL of HCl (2M) at 100 ° C with vigorous stirring (500 Tr / min) for 1 hour. The mixture is then cooled to room temperature and then neutralized with sodium hydroxide (5 M). The medium is precipitated from 7 volumes of 96 ° ethanol (at 4 ° C) with stirring (500 rpm) for 2 hours. The precipitate is recovered by filtration on sintered glass (porosity 1 or 2, more precisely 100 to 160 pm or 40 to 100 pm respectively) or centrifugation (10,000 g, 30 minutes) at room temperature then washed with acetone (50 mL ). Then, the precipitate is recovered by filtration on sintered glass (porosity 2, more precisely 40 to 100 μm) or centrifugation (10,000 g, 30 minutes) at room temperature and then dried in an oven at 50 ° C overnight. Finally, the precipitate is ground (in a blender) to obtain a fine powder of low molecular weight polysaccharides extracted from Haliptilon subulatum.
Le rendement en polysaccharides de faibles masses moléculaires ainsi obtenu est de l’ordre de 70% par rapport à la masse sèche de poudre de polysaccharides de hautes masses moléculaires et 14 % par rapport à la masse sèche de poudre d’algue Haliptilum subulatum utilisée.The yield of low molecular weight polysaccharides thus obtained is of the order of 70% relative to the dry mass of high molecular weight polysaccharide powder and 14% relative to the dry mass of Haliptilum subulatum algae powder used.
Exemple 3 : Détermination des masses moléculaires des polysaccharides de hauts (PSHM) et de faibles (PSFM) masse molairesEXAMPLE 3 Determination of the Molecular Masses of Polysaccharides of High (PSHM) and of Low (PSFM) Molar Masses
Les polysaccharides de haute et faible masse moléculaire sont préparés selon des conditions décrites préalablement (exemples 1 et 2). Les masses moléculaires des polysaccharides sulfatés sont déterminées selon le protocole ci-après :The high and low molecular weight polysaccharides are prepared according to conditions described previously (examples 1 and 2). The molecular weights of the sulfated polysaccharides are determined according to the following protocol:
a) Solubilisation de la poudre de polysaccharides à hauteur de 0,5 à 10 g/L dans une solution aqueuse de qualité ultrapure à une température allant de 4°C à 60°C et sous agitation pendant 30 minutes à 48 heures ;a) Solubilization of the polysaccharide powder up to 0.5 to 10 g / L in an aqueous solution of ultrapure quality at a temperature ranging from 4 ° C to 60 ° C and with stirring for 30 minutes to 48 hours;
b) Filtration des échantillons sur membrane de porosité 0,45 pm ;b) Filtration of the samples on a membrane with a porosity of 0.45 μm;
c) Injection et analyse par chromatographie d’exclusion stérique couplée à la diffusion de la lumière (SEC/MALLS) ;c) Injection and analysis by steric exclusion chromatography coupled with light scattering (SEC / MALLS);
d) La technique permet d’accéder aux masses molaires moyennes en nombre (Mn) et en poids (Mw) et renseigne également sur la forme et la dimension des chaînes et la polydispersité (Ip).d) The technique provides access to the average molar masses in number (Mn) and in weight (Mw) and also provides information on the shape and dimension of the chains and the polydispersity (Ip).
Tableau 1 : Récapitulatif des masses moléculaires moyennes en poids et en nombreTable 1: Summary of average molecular weights by weight and number
Il ressort de cet exemple que la masse moléculaire des polysaccharides de hautes masses moléculaire est de l’ordre de 214 kDa et que la masse moléculaire des polysaccharides de faible masse moléculaire est de l’ordre de 37 kDa.It emerges from this example that the molecular mass of high molecular weight polysaccharides is of the order of 214 kDa and that the molecular mass of low molecular weight polysaccharides is of the order of 37 kDa.
Exemple 4 : Détermination du taux de sulfates et de résidus 3,6anhydrogalactopyranoses des polysaccharides de l’inventionEXAMPLE 4 Determination of the Level of Sulfates and 3.6anhydrogalactopyranose Residues of the Polysaccharides of the Invention
1. Détermination du taux de sulfates1. Determination of the sulphate level
Dosage par turbidimétrie (BaCI?/gélatine)Determination by turbidimetry (BaCI? / Gelatin)
Les ions sulfates libérés lors de l’hydrolyse des polysaccharides vont former, en présence de chlorure de baryum (BaCI2, 2H2O) et de gélatine un précipité de sulfate de baryum dont l’apparition est mesurée à 550 nm, comme décrit dans la publication deDodgson & Price (Dodgson & Price, 1962, Biochemical Journal 84 : 106-110).The sulphate ions released during the hydrolysis of the polysaccharides will form, in the presence of barium chloride (BaCI 2 , 2H 2 O) and gelatin, a barium sulphate precipitate whose appearance is measured at 550 nm, as described in the publication of Dodgson & Price (Dodgson & Price, 1962, Biochemical Journal 84: 106-110).
150 mg de gélatine sont dissous dans 50 mL d’eau milli-Q à 70°C. Après refroidissement 16 h à 4°C, la solution de gélatine est additionnée de 0,5 g de BaCI2. 120 mg de polysaccharide lyophilisé sont hydrolysés par 3 mL d’HCI 2 M pendant 2 h à 100°C. Le mélange est centrifugé à 13 000 g pendant 30 min. 1 mL de surnageant est mélangé à 9 mL d’eau milli-Q, 1 mL d’HCI 0,5 M et 0,5 mL de réactif BaCI2/gélatine. Après 30 min à température ambiante, le mélange est agité et l’absorbance est lue immédiatement à 550 nm. La gamme étalon est réalisée à l’aide d’une solution mère de K2SO4 à 3 mg/mL.150 mg of gelatin are dissolved in 50 mL of milli-Q water at 70 ° C. After cooling for 16 h at 4 ° C., the gelatin solution is added with 0.5 g of BaCl 2 . 120 mg of lyophilized polysaccharide are hydrolyzed with 3 ml of 2 M HCl for 2 h at 100 ° C. The mixture is centrifuged at 13,000 g for 30 min. 1 mL of supernatant is mixed with 9 mL of milli-Q water, 1 mL of 0.5 M HCl and 0.5 mL of BaCI 2 reagent / gelatin. After 30 min at room temperature, the mixture is stirred and the absorbance is read immediately at 550 nm. The standard range is carried out using a stock solution of K 2 SO 4 at 3 mg / ml.
Dosage à l’Azure AAzure A dosage
La quantité de sulfates a été déterminée par l’utilisation de la méthode de dosage colorimétrique développée par Jaques et al. (Jaques L.B et al., 1968, Canadian Journal of Physiology and Pharmacology 46, pages : 351-360). En phase aqueuse, le chlorure de 3amino-7-(diméthylamino)phénothizin-5-ium (Azuré A) complexe les sulfates pouvant être présents, notamment au sein des polysaccharides composant les fractions de SPE. Le milieu développe alors une couleur rose-violet absorbant à λ=535 nm, due à la formation d’un chromophore en présence de sulfates. Le dosage est semi-quantitatif et donne un ordre de grandeur (~mg) de la concentration en sulfates d’un échantillon. Dans des cuves en plastique pour spectrophotomètre sont introduits 200 pL de solution à doser. 2 mL de solution aqueuse d’Azure A à 10 mg/L sont ajoutés puis l’échantillon est agité. L’absorbance est mesurée à λ=535 nm.The amount of sulfates was determined using the colorimetric assay method developed by Jaques et al. (Jaques L.B et al., 1968, Canadian Journal of Physiology and Pharmacology 46, pages: 351-360). In the aqueous phase, 3 amino-7- (dimethylamino) phenothizin-5-ium chloride (Azure A) complexes the sulfates which may be present, in particular within the polysaccharides composing the SPE fractions. The medium then develops an absorbent pink-purple color at λ = 535 nm, due to the formation of a chromophore in the presence of sulfates. The assay is semi-quantitative and gives an order of magnitude (~ mg) of the sulphate concentration of a sample. 200 μl of solution to be assayed are placed in plastic tanks for spectrophotometer. 2 mL of 10 mg / L Azure A aqueous solution are added and the sample is stirred. The absorbance is measured at λ = 535 nm.
La quantification des sulfates est déterminée à partir de la gamme d’étalonnage de dextrane sulfate (17 % sulfaté) et correction du degré de sulfatation de ce dernier (17 mg de sulfates pour 100 mg de dextrane sulfate).The quantification of sulfates is determined from the calibration range of dextran sulfate (17% sulfated) and correction of the degree of sulfation of the latter (17 mg of sulfates per 100 mg of dextran sulfate).
Tableau 2. Récapitulatif des taux de sulfates pour PSHM et PSFM.Table 2. Summary of sulphate levels for PSHM and PSFM.
II ressort de cet exemple que le taux de sulfates des polysaccharides de haute masse moléculaire est de l’ordre de 13,5% et que le taux de sulfates des polysaccharides de faible masse moléculaires est de l’ordre de 15,7%.It emerges from this example that the level of sulfates in high molecular weight polysaccharides is around 13.5% and that the level of sulfates in low molecular weight polysaccharides is around 15.7%.
2. Détermination du taux de résidus 3,6-anhvdrogalactopyranose La méthode colorimétrique la plus reproductible pour doser les résidus 3,6anhydrogalactoses est celle qui emploie un réactif à base de résorcinol (voir Yaphe & Arsenaut, 1965, Analytical Biochemistry 13, pages 143-148). La coloration rose qui se développe au cours de la réaction est suivie à 555 nm. Trois solutions sont nécessaires à la réalisation de ce dosage : (i) une solution d’acétaldéhyde préparée en diluant 1 mL d’acétaldéhyde dans 100 mL d’eau ultrapure (stable environ 1 mois) ; (ii) une solution de résorcinol préparée par dissolution de 150 mg de résorcinol dans 100 mL d’eau ultrapure (stable 7 jours, à l’abri de la lumière) et (iii) une solution d’HCI 10 M.2. Determination of the rate of 3,6-anhvdrogalactopyranose residues The most reproducible colorimetric method for determining the 3,6anhydrogalactoses residues is that which uses a reagent based on resorcinol (see Yaphe & Arsenaut, 1965, Analytical Biochemistry 13, pages 143- 148). The pink coloration which develops during the reaction is followed at 555 nm. Three solutions are necessary for carrying out this assay: (i) an acetaldehyde solution prepared by diluting 1 ml of acetaldehyde in 100 ml of ultrapure water (stable for approximately 1 month); (ii) a solution of resorcinol prepared by dissolving 150 mg of resorcinol in 100 ml of ultrapure water (stable 7 days, protected from light) and (iii) a solution of HCl 10 M.
Pour le dosage, 50 à 100 μΙ_ de la solution de polysaccharide à doser) sont introduits dans des tubes en verre. Le volume est complété à 200 pL à l’aide d’eau milli-Q. Le réactif au résorcinol est préparé de façon extemporanée en ajoutant à 100 mL d’HCI 10 M, 9 mL de la solution de résorcinol et 1 mL de la solution d’acétaldéhyde diluée au 1/25. Ce réactif n’est stable que 3 h à l’abri de la lumière.For the assay, 50 to 100 μΙ_ of the polysaccharide solution to be assayed) are introduced into glass tubes. The volume is made up to 200 pL using milli-Q water. The resorcinol reagent is prepared extemporaneously by adding to 100 ml of 10 M HCl, 9 ml of the resorcinol solution and 1 ml of the acetaldehyde solution diluted to 1/25. This reagent is only stable for 3 hours, protected from light.
A 200 pL de la solution de polysaccharide à doser sont ajoutés 1 mL du réactif au résorcinol. Après agitation, les tubes sont laissés au repos pendant 4 min, puis placés dans un bainmarie à 80°C pendant 10 min. Ils sont ensuite transférés dans un bain de glace pendant 1 min 30. L’absorbance doit être lue dans les 15 min qui suivent à 555 nm.To 200 μL of the polysaccharide solution to be assayed are added 1 ml of the resorcinol reagent. After stirring, the tubes are left to stand for 4 min, then placed in a water bath at 80 ° C for 10 min. They are then transferred to an ice bath for 1 minute 30 minutes. The absorbance must be read within 15 minutes at 555 nm.
Le D-fructose (solutions de 10 à 70 pg/mL) est utilisé comme standard. En effet, il a été démontré que les courbes d’absorbance à 555 nm en fonction de la concentration en monosaccharide du D-fructose et du le 3,6-anhydrogalactose sont identiques (voir Yaphe & Arsenaut, 1965, .Analytical Biochemistry 13, pages 143-148).D-fructose (solutions from 10 to 70 pg / mL) is used as standard. Indeed, it has been shown that the absorbance curves at 555 nm as a function of the monosaccharide concentration of D-fructose and of 3,6-anhydrogalactose are identical (see Yaphe & Arsenaut, 1965, .Analytical Biochemistry 13, pages 143-148).
Tableau 3. Récapitulatif du taux de résidus 3,6-anhydroçialactopvranose pour PSHM.Table 3. Summary of the level of 3,6-anhydroçialactopvranose residues for PSHM.
II ressort de cet exemple que le taux de 3,6-anhydrogalactopyranose des polysaccharides de haute masse moléculaire est de 1,32 %.It emerges from this example that the level of 3,6-anhydrogalactopyranose in high molecular weight polysaccharides is 1.32%.
Exemple 5 : Détermination de la composition en monosaccharides et de la structure des polysaccharides selon l’invention mg de polysaccharides sont dissous dans 1 mL d’acide trifluoracétique à 2 M pendant 90 min à 120 °C, avec agitation manuelle toutes les 30 minutes. Les échantillons sont évaporés sous jet d’azote pour éliminer les traces d’acide en excès. 1 mL de méthanol est ajouté, puis l’échantillon est agité au vortex et évaporé sous jet d’azote. Cette étape est répétée 2 fois pour éliminer les traces résiduelles d’acides. La dérivatisation est réalisée via l’utilisation de BSTFA : TMCS (99 : 1). Pour 2 mg de monosaccharides, on ajoute 400 pL de pyridine et 400 pL de /V,O-bis(triméthylsilyl) trifluoroacétamide : triméthylchlosylane (BSTFA : TMCS) (99 : 1). Les échantillons sont ensuite mélangés puis placés à température ambiante pendant 2 heures sous agitation (450 rpm).Example 5: Determination of the monosaccharide composition and of the structure of the polysaccharides according to the invention mg of polysaccharides are dissolved in 1 ml of 2 M trifluoroacetic acid for 90 min at 120 ° C, with manual stirring every 30 minutes. The samples are evaporated under a nitrogen jet to remove traces of excess acid. 1 mL of methanol is added, then the sample is vortexed and evaporated under a nitrogen jet. This step is repeated 2 times to remove residual traces of acids. Derivatization is achieved through the use of BSTFA: TMCS (99: 1). For 2 mg of monosaccharides, 400 μL of pyridine and 400 μL of / V, O-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide: trimethylchlosylane (BSTFA: TMCS) (99: 1) are added. The samples are then mixed and then placed at room temperature for 2 hours with stirring (450 rpm).
On évapore sous jet d’azote les échantillons, puis les résidus triméthylsilyl-O-glycosides sont repris par 500 pL de dichlorométhane. A cette étape, il est possible de diluer plus ou moins l’échantillon. Les standards (L-Rha, l-Fuc, L-Ara, D-Xyl, D-Man, D-Gal, d-GIc, d-GIcA, D-GalA) sont préparés dans les mêmes conditions, à au moins trois concentrations différentes.The samples are evaporated under a nitrogen jet, then the trimethylsilyl-O-glycosides residues are taken up in 500 μl of dichloromethane. At this stage, it is possible to more or less dilute the sample. The standards (L-Rha, l-Fuc, L-Ara, D-Xyl, D-Man, D-Gal, d-GIc, d-GIcA, D-GalA) are prepared under the same conditions, at least three different concentrations.
Les dérivés triméthylsilylés sont analysés par chromatographie phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse, sur une colonne OPTIMA-1MS (30 m, 0,32 mm, 0,25 pm) avec un débit d’hélium de 2,3 mL/min (jusqu’à 3 mL/min). La pression d’hélium est fixée à 8,8 psi soit 60673,9 Pa et le ratio d’injection à 25: 1 (ou 50 : 1). La montée de température est de 8°C/min jusqu’à 100°C, pendant 3 min. On programme une autre montée en température de 8°C/min jusqu’à 200°C, maintenue pendant 1 min. On termine par une montée en température de 5°C/min jusqu’à 250°C. L’ionisation est réalisée par Impact Electronique (El, 70 eV), la température de la trappe est fixée à 150 °C et les ions ciblés entre 40 et 800 m/z.The trimethylsilylated derivatives are analyzed by gas chromatography coupled to mass spectrometry, on an OPTIMA-1MS column (30 m, 0.32 mm, 0.25 pm) with a helium flow rate of 2.3 mL / min ( up to 3 mL / min). The helium pressure is set at 8.8 psi or 60,673.9 Pa and the injection ratio at 25: 1 (or 50: 1). The temperature rise is from 8 ° C / min to 100 ° C, for 3 min. Another temperature rise is programmed from 8 ° C / min to 200 ° C, maintained for 1 min. We finish with a temperature rise from 5 ° C / min to 250 ° C. Ionization is carried out by Impact Electronique (El, 70 eV), the hatch temperature is set at 150 ° C and the targeted ions between 40 and 800 m / z.
Tableau 4. Composition en monosaccharides de l’échantillon PSHM.Table 4. Composition in monosaccharides of the PSHM sample.
Monosaccharides (mol %)*Monosaccharides (mol%) *
Gaî Ârâ Xÿl GIcA GÏcGaî Ârâ Xÿl GIcA GÏc
94/î Ï)5Ï Ï88 Ï(5Ï ÏÔ * Composition en monosaccharides estimées par CG/SM-IE. Gai: Galactose; Ara: Arabinose; Xyl: Xylose; GIcA: acide glucuronique, GIc: Glucose.94 / î Ï) 5Ï Ï88 Ï (5Ï ÏÔ * Composition in monosaccharides estimated by CG / SM-IE. Gay: Galactose; Macaw: Arabinose; Xyl: Xylose; GIcA: glucuronic acid, GIc: Glucose.
Exemple 6 : Détermination des activités anticoagulantes des polysaccharides selon l’inventionExample 6: Determination of the anticoagulant activities of the polysaccharides according to the invention
L’activité anticoagulante a été étudiée en termes d’inhibition de deux enzymes clés intervenant dans la coagulation : les facteurs Xa et lia, mais également en mesurant le temps de Quick (PT), le temps de thrombine (TT) et le temps de Céphaline activée TCA.The anticoagulant activity was studied in terms of inhibition of two key enzymes involved in coagulation: factors Xa and lia, but also by measuring the Quick time (PT), the thrombin time (TT) and the time of Cephalin activated TCA.
Le test aPTT (Activated Partial Thromboplastin Time) ou Temps de Céphaline Activée TCA mesure le temps de coagulation d'un plasma citraté déplaquetté auquel on ajoute un activateur particulaire des facteurs contacts (silice, kaolin, acide ellagique) et de la céphaline, substitut du facteur III plaquettaire. L’aPTT normal varie suivant les activateurs, les céphalines commerciales et les appareils utilisés, de 30 à 40 s en général. Ce test semiglobal explore la voie endogène de la coagulation (prékallicréine, kininogène de haute masse moléculaire, FXII, FXI, FVIII et FIX) et, dans une moindre mesure, la voie finale commune (FX, FV, Fil, Fl).The aPTT test (Activated Partial Thromboplastin Time) or TCA Activated Cephalin Time measures the coagulation time of a citrated platelet plasma to which is added a particle activator of contact factors (silica, kaolin, ellagic acid) and cephalin, substitute for platelet factor III. Normal aPTT varies between activators, commercial cephalins and the devices used, from 30 to 40 s in general. This semiglobal test explores the endogenous coagulation pathway (prekallikrein, high molecular mass kininogen, FXII, FXI, FVIII and FIX) and, to a lesser extent, the common final pathway (FX, FV, Thr, Fl).
Le test PT (Prothrombin Time) ou temps de Quick mesure le temps de coagulation du plasma décalcifié, recalcifié in vitro en présence de thromboplastine tissulaire. II permet l'exploration globale de la voie exogène de la coagulation (voie du facteur tissulaire) : thromboplastinoformation, thrombinoformation et fibrinoformation. Cela concerne donc le facteur VII et dans une moindre mesure la voie finale commune : FX, FV, Fil, Fl.The PT (Prothrombin Time) or Quick test measures the coagulation time of decalcified plasma, recalcified in vitro in the presence of tissue thromboplastin. It allows the global exploration of the exogenous coagulation pathway (tissue factor pathway): thromboplastinoformation, thrombinoformation and fibrinoformation. This therefore concerns factor VII and, to a lesser extent, the common final route: FX, FV, Fil, Fl.
Le test TT (Thrombin time) ou temps de thrombine mesure le temps de coagulation du plasma décalcifié, recalcifié in vitro en présence de thrombine. II explore la fibrinoformation dans la voie commune de la coagulation, sauf le facteur XIII. Cela correspond à la transformation du fibrinogène en fibrine.The TT (Thrombin time) or thrombin time test measures the coagulation time of decalcified plasma, recalcified in vitro in the presence of thrombin. He explores fibrin training in the common path of coagulation, except factor XIII. This corresponds to the transformation of fibrinogen into fibrin.
Mode opératoire :Procedure:
pL d’échantillons de polysaccharides sulfatés obtenus selon les exemples précédents (de 25 g/L à 25.10'4 g/L) sont ajoutés à 50 pL d’antithrombine III (0,125 pg/pL pour le test anti-Xa et 0,625 pg/pL pour le test anti-lla) et incubés 30 secondes à 37°C dans une plaque 96 puits. Sont ensuite ajoutés 50 pL de facteur Xa ou lia selon le test (concentration finale de 11.25 nKat/mL) avant une deuxième incubation de 30 secondes à 37°C. Pour finir, 50 pL de substrat (CBS 31.39; CH2SO2-d-Leu-Gly-Arg-pNA, AcOH pour le test anti-Xa et CBS 61.50; EtM-SPro-Arg-pNA, AcOH pour le test lia) sont ajoutés dans le puits. Le milieu réactionnel est incubé 5 minutes et l’absorbance est lue à 405 nm toutes les 6 secondes. La vitesse initiale (v,) est calculée comme la pente du segment linéaire de la cinétique (5 premiers points de la courbe). La répétition a été réalisée sur une population n > 5.pL of samples of sulfated polysaccharides obtained according to the previous examples (from 25 g / L to 25.10 ' 4 g / L) are added to 50 pL of antithrombin III (0.125 pg / pL for the anti-Xa test and 0.625 pg / pL for the anti-lla test) and incubated for 30 seconds at 37 ° C in a 96-well plate. 50 μL of factor Xa or lla are then added according to the test (final concentration of 11.25 nKat / ml) before a second 30 second incubation at 37 ° C. Finally, 50 μL of substrate (CBS 31.39; CH 2 SO 2 -d-Leu-Gly-Arg-pNA, AcOH for the anti-Xa test and CBS 61.50; EtM-SPro-Arg-pNA, AcOH for the lia test ) are added to the well. The reaction medium is incubated for 5 minutes and the absorbance is read at 405 nm every 6 seconds. The initial speed (v,) is calculated as the slope of the linear segment of the kinetics (first 5 points of the curve). The repetition was carried out on a population n> 5.
Les contrôles négatif et positif sont respectivement l’eau (dans laquelle les échantillons sont dilués) et l’héparine non dépolymérisée (Héparine, sel de sodium, INTERCHIM, CAS 904108-1, batch 201274, DPmoyen 14,01 KDa, 163 U/mg).The negative and positive controls are respectively water (in which the samples are diluted) and unpolymerized heparin (Heparin, sodium salt, INTERCHIM, CAS 904108-1, batch 201274, average DP 14.01 KDa, 163 U / mg).
Dans cet exemple, l’activité anticoagulante du polysaccharide sulfaté est comparée à celle 5 d’une héparine de faible masse moléculaire disponible sur le marché : Lovenox® et à un carraghénane iota.In this example, the anticoagulant activity of the sulfated polysaccharide is compared to that of a low molecular weight heparin available on the market: Lovenox® and to an iota carrageenan.
L’activité est calculée grâce à la formule suivante :The activity is calculated using the following formula:
Equation 1 : Activité (%) = 100 Vi eauEquation 1: Activity (%) = 100 Vi water
Le coagulomètre STart 4, les réactifs des tests et d'étalonnage, les contrôles positifs et négatifs et le plasma proviennent de l'enseigne Stago Diagnostica. Le mode opératoire des mesures de coagulation se déroule comme suit :The STart 4 coagulometer, the test and calibration reagents, the positive and negative controls and the plasma come from the Stago Diagnostica brand. The procedure for coagulation measurements is as follows:
Temps de Quick (PT) ** Temps de thrombine (TT) *** Temps de Céphaline activée TCA (aPTT)Quick time (PT) ** Thrombin time (TT) *** Activated partial thromboplastin time TCA (aPTT)
Les résultats ainsi obtenus sont présentés aux Figures 1 à 5.The results thus obtained are presented in Figures 1 to 5.
Les résultats de ces tests montrent que le polysaccharide sulfaté (PSHM et/ou PSFM) extrait à partir de l’algue Haliptilon subulatum possède :The results of these tests show that the sulfated polysaccharide (PSHM and / or PSFM) extracted from the alga Haliptilon subulatum has:
Une activité anti-FXa de PSHM à 70pg.mL'1, équivalente à celle de l’héparine ou du Lovenox® (Figure 1).An anti-FXa activity of PSHM at 70pg.mL ' 1 , equivalent to that of heparin or Lovenox® (Figure 1).
Une activité anti-lla de PSHM à 8pg.mL-1, équivalente à celle de l’héparine ou du Lovenox® (Figure 2).An anti-lla activity of PSHM at 8pg.mL-1, equivalent to that of heparin or Lovenox® (Figure 2).
- Une activité sur la voie endogène très proche de celle de l’héparine à faible concentration ainsi qu’une activité améliorée par rapport au Lovenox® (Figure 3).- An activity on the endogenous path very close to that of heparin at low concentration as well as an improved activity compared to Lovenox® (Figure 3).
Une activité sur la voie exogène très proche de celle de l’héparine à faible concentration ainsi qu’une activité améliorée par rapport au Lovenox® (Figure 4).An activity on the exogenous route very close to that of heparin at low concentration as well as an improved activity compared to Lovenox® (Figure 4).
Une activité sur la voie commune (Figure 5).An activity on the common track (Figure 5).
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