FR2958942A1 - INHIBITORS OF ACCUMULATION OF SPRD TRANSCRIPTS AT S. AUREUS - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne notamment un inhibiteur de l'accumulation des transcrits SprD et un procédé pour la sélection ou l'identification in vitro ou ex vivo de composés pour la prévention et/ou le traitement d'une infection staphylococcique.The invention particularly relates to an inhibitor of the accumulation of transcripts SprD and a method for the selection or in vitro or ex vivo identification of compounds for the prevention and / or treatment of a staphylococcal infection.
Description
INHIBITEURS DE L'ACCUMULATION DE TRANSCRITS SPRD CHEZ S. AUREUS La présente invention est relative à des inhibiteurs de l'accumulation et/ou de la transcription de petits ARN situés et exprimés à partir du génome de bactéries (notamment Staphylocoques dorés), appelés Spr pour « small pathogenicity island rNAs » et à leur applications notamment pour la détection, la prévention et/ou le traitement d'une infection staphylococcique. La présente invention concerne également une méthode de sélection ou d'identification de composés utiles pour la prévention et/ou le traitement d'une infection staphylococcique, lesdits composés étant capables de complexer avec les transcrits sprD et/ou d'inhiber la transcription du gène sprD. Les infections staphylococciques sont très répandues dans le monde aussi bien communautaire qu'hospitalier, affectant aussi bien l'homme que les 15 animaux. Les bactéries du genre Staphylococcus ont été découvertes par Louis Pasteur en 1880. À ce jour, une vingtaine d'espèces ont été identifiées. Parmi celles-ci, les plus rencontrées en pathologie humaine et/ou animale sont Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus hyicus, 20 Staphylococcus intermedius et Staphylococcus aureus. Ces espèces commensales sont dites pathogènes opportunistes puisqu'elles peuvent entraîner des infections dans des conditions particulières. Ainsi, Staphylococcus epidermidis peut être responsable d'infections de la peau, nasales et aussi d'endocardites et d'infections localisées chez les patients 25 immunodéprimés. Staphylococcus saprophyticus a été identifiée comme responsable de certaines infections urinaires. Staphylococcus hyicus et Staphylococcus intermedius peuvent être responsables d'infections diverses chez l'animal telles que la dermite exsudative du porcelet (S. hyicus) ou encore la furonculose du chien (S. intermedius). The present invention relates to inhibitors of the accumulation and / or transcription of small RNA located and expressed from the genome of bacteria (in particular Golden Staphylococci), called Spr. for "small pathogenicity island rNAs" and their applications in particular for the detection, prevention and / or treatment of a staphylococcal infection. The present invention also relates to a method for the selection or identification of compounds useful for the prevention and / or treatment of a staphylococcal infection, said compounds being capable of complexing with the transcripts SprD and / or of inhibiting the transcription of the gene DPRS. Staphylococcal infections are widespread in both the community and hospital settings, affecting both humans and animals. The bacteria of the genus Staphylococcus were discovered by Louis Pasteur in 1880. To date, about twenty species have been identified. Of these, the most commonly encountered in human and / or animal pathology are Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus intermedius and Staphylococcus aureus. These commensal species are called opportunistic pathogens since they can cause infections under particular conditions. Thus, Staphylococcus epidermidis may be responsible for skin infections, nasal infections and also endocarditis and localized infections in immunocompromised patients. Staphylococcus saprophyticus has been identified as responsible for some urinary tract infections. Staphylococcus hyicus and Staphylococcus intermedius may be responsible for various infections in animals such as exudative piglet dermatitis (S. hyicus) or furunculosis of the dog (S. intermedius).
L'espèce la plus pathogène des bactéries du genre Staphylococcus est Staphylococcus aureus (S. aureus). S. aureus est un membre de la flore commensale humaine chez une fraction de la population. Cependant, si des barrières mucosales sont franchies ou si les défenses immunes de l'hôte sont altérées, S.aureus peut devenir un pathogène opportuniste et l'une des principales causes des infections nosocomiales et des infections acquises en communauté chez l'homme et les animaux (Lowy, 1998). La pathogenèse de la maladie associée à S.aureus débute habituellement par une infection locale (par exemple, infection d'une blessure, furoncle, cellulite), puis peut se poursuivre par une diffusion systémique (bactériémie), puis par des infections métastatiques (par exemple endocardite, ostéomyélite et arthrite septique). S. aureus est également l'un des agents pathogènes isolés le plus fréquemment lors de mammites bovines aussi bien aux Etats-Unis qu'en Europe. Les vaches atteintes présentent alors une chute de production laitière qui entraîne de lourdes conséquences économiques sur les exploitations agricoles. L'étude des mécanismes moléculaires permettant à l'infection staphylococcique de se mettre en place et de perdurer dans l'organisme colonisé a permis de montrer qu'une des causes principales de succès des infections staphylococciques, en particulier à S. aureus, est leur capacité à produire un grand nombre de facteurs de virulence. Certains de ces facteurs sont exportés à la surface des cellules et d'autres sont excrétés. Ainsi, par exemple, S. aureus est capable de contourner les défenses de l'hôte par la production de pièges de la réponse immunitaire de l'hôte infecté telles que la protéine SpA (« Staphylococcal protein A », Moks et al., 1986) et la protéine Sbi (« S. aureus IgG binding protein » Zhang L, Jacobsson K, Vasi J, Lindberg M and Frykberg L (1998) A second IgG-binding protein in Staphylococcus aureus. Microbiology 145: 985-991). Jusqu'à présent, le traitement le plus répandu à une infection staphylococcique est à base d'antibiotiques tels que les pénicillines (pénicilline G, méthicilline, oxacilline céphalosporines) les macrolides et les tétracyclines. The most pathogenic species of Staphylococcus bacteria is Staphylococcus aureus (S. aureus). S. aureus is a member of human commensal flora in a fraction of the population. However, if mucosal barriers are breached or the host's immune defenses are altered, S.aureus can become an opportunistic pathogen and one of the leading causes of nosocomial infections and community-acquired infections in humans and humans. animals (Lowy, 1998). The pathogenesis of S.aureus-associated disease usually begins with a local infection (eg, infection of a wound, boil, cellulitis), then can be followed by systemic spread (bacteremia), followed by metastatic infections (by example endocarditis, osteomyelitis and septic arthritis). S. aureus is also one of the pathogens most frequently isolated from bovine mastitis in both the United States and Europe. Affected cows then have a drop in milk production which has serious economic consequences for farms. The study of the molecular mechanisms allowing staphylococcal infection to develop and persist in the colonized organism has shown that one of the main causes of success of staphylococcal infections, in particular S. aureus, is their ability to produce a large number of virulence factors. Some of these factors are exported to the cell surface and others are excreted. Thus, for example, S. aureus is able to bypass the defenses of the host by producing traps of the immune response of the infected host such as the SpA protein ("Staphylococcal protein A", Moks et al., 1986 and Sbi protein ("S. aureus IgG binding protein" Zhang L, Jacobsson K, Vasi J, Lindberg M and Frykberg L (1998) A second IgG-binding protein in Staphylococcus aureus, Microbiology 145: 985-991). So far, the most common treatment for staphylococcal infection is antibiotics such as penicillins (penicillin G, methicillin, oxacillin cephalosporins), macrolides and tetracyclines.
Cependant, avec l'utilisation répandue des antibiotiques, la diffusion de souches de bactéries du genre Staphylococcus, en particulier S. aureus, fortement résistantes aux antibiotiques, notamment à la méthicilline (SARM), a considérablement augmenté ces dernières années et constitue un défi clinique et épidémiologique mondial, notamment dans les hôpitaux. Dans une optique de traitement mais également de prévention d'infection staphylococcique, il existe un besoin, tant chez l'homme que chez l'animal de disposer de nouvelles classes d'agents antistaphylococcique comme alternatives aux antibiotiques et de nouveaux outils diagnostiques. However, with the widespread use of antibiotics, the spread of strains of bacteria of the genus Staphylococcus, particularly S. aureus, highly resistant to antibiotics, especially methicillin (MRSA), has increased significantly in recent years and is a clinical challenge and epidemiological, especially in hospitals. With a view to treatment but also to preventing staphylococcal infection, there is a need in both humans and animals to have new classes of antistaphylococcal agents as alternatives to antibiotics and new diagnostic tools.
Les inventeurs ont à présent mis en évidence que l'ARN SprD a un rôle majeur dans la virulence de Staphylococcus aureus. Ils ont notamment montré que la délétion du gène SprD, dans au moins trois souches différentes de Staphylococcus aureus (les souches N315 (agr-), Newman (agr+) et RN1 (agr+)), est responsable de la diminution voire de la perte de virulence par les bactéries sur un modèle d'infection septicémique. Ils ont en outre montré par des expériences de complémentation que la virulence des bactéries délétées du gène SprD peut être au moins partiellement rétablie lorsqu'un vecteur exprimant le transcrit SprD est introduit dans les bactéries mutantes. Ainsi, ces résultats des travaux de recherche menés par les inventeurs indiquent que la virulence des souches bactériennes exprimant le gène sprD, notamment les souches appartenant au genre Staphylococcus et tout particulièrement à l'espèce Staphylococcus aureus, peut être diminuée voire supprimée par l'inhibition ou la suppression des effets de l'ARN sprD. L'inhibition ou la suppression des effets de l'ARN SprD sur la virulence des 25 bactéries Staphylcoccus aureus pourra être obtenue par : - l'inhibition de la transcription du gène SprD en agissant sur la séquence transcrite du gène (délétion de tout ou partie de la séquence transcrite, mutagènèse dirigée pour modifier la reconnaissance par la machinerie de transcription) ou via des molécules empêchant la transcription du gène en se fixant sur sa séquence promotrice bloquant l'initiation de la transcription du gène sprd. - les inhibiteurs de l'activité des transcrits SprD, notamment les inhibiteurs susceptibles d'empêcher la reconnaissance entre le transcrit SprD et ses cibles. - la mutagénèse dirigée du gène SprD pour modifier la reconnaisance entre le transcrit SprD et sa cible. - les agents affectant la stabilité des transcrits SprD et/ou les inhibiteurs de l'accumulation des transcrits SprD. On entend par « bactéries du genre Staphylococcus » au sens de la présente 10 invention, l'ensemble des souches bactériennes du genre Staphylococcus. En particulier, les bactéries du genre Staphylococcus selon l'invention sont choisies dans le groupe comprenant les souches bactériennes du genre Staphylococcus dont le génome contient un gène codant un ARN comprenant la séquence SEQ ID N°l ou une séquence homologue de la séquence SEQ ID N°l et 15 les fragments de celles-ci . Ces souches peuvent être aisément identifiées par l'Homme du Métier, par exemple, par des techniques de criblage de banques (d'ADN génomique ou d'ADNc de bactéries du genre Staphylococcus) à l'aide de sondes ou d'amorces spécifiques d'une séquence appartenant à des souches bactériennes du genre 20 Staphylococcus telle que définies ci-dessus. De telles sondes ou amorces peuvent être sélectionnées à partir des séquences de polynucléotides selon l'invention. Tout particulièrement, les bactéries du genre Staphylococcus selon l'invention sont des souches de Staphylococcus aureus. Selon un premier aspect, l'invention a pour objet, un inhibiteur de 25 l'accumulation des transcrits sprD (tels que les inhibiteurs de la stabilité des transcrits sprD) et/ou de la transcription du gène sprD. L'expression « inhibiteur de l'accumulation des transcrits sprD » est utilisée ici pour désigner une molécule capable d'induire une diminution d'au moins 20 %, en particulier d'au moins 35 % et tout particulièrement d'au moins 50 % du taux de transcrits d'un gène accumulés en particulier dans le temps dans une souche bactérienne exprimant sprD, par rapport au taux de transcrits accumulés, en particulier dans le temps dans ladite souche bactérienne exprimant sprD en l'absence de ladite molécule. L'inhibition de l'accumulation de transcrits peut être déterminée par des techniques bien connues de l'Homme du Métier telles que par « Northern Blot », utilisant au moins une sonde spécifique dudit transcrit ou par « RT-PCR » utilisant au moins deux amorces spécifiques dudit transcrit, notamment en étudiant l'accumulation du taux de transcrit dans une souche bactérienne en culture exprimant sprD. En particulier, l'inhibition de l'accumulation des transcrits peut être déterminée par la technique telle que décrite au point I.2 des exemples ci-après (« Isolation de l'ARN et Northern Blots ») et dont les résultats sont présentés sur la figure lA. De manière préférentielle, un tel inhibiteur comprend un polynucléotide 15 isolé dont la séquence comprend une séquence choisie dans le groupe comprenant - la séquence SEQ ID N°4, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°4 et les fragments de celles-ci ; et - la séquence SEQ ID N°5 ; et - une séquence d'ADN pouvant être transcrite en séquence SEQ ID 20 N°4, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité et les fragments de celles-ci ; la séquence SEQ ID N°5 et la séquence SEQ ID N°4, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°4 et les fragments de celles-ci ayant la capacité de s'hybrider spécifiquement avec la séquence SEQ ID 25 N°2 et de modifier négativement la stabilité des transcrits SprD. On entend par « polynucléotide » au sens de la présente invention, un polymère composé de plusieurs nucléotides liés par des liaisons phosphodiesters, tel que l'ADN (Acide DésoxyriboNucléique) et l'ARN (Acide RiboNucléique). L'ADN présente l'avantage d'être plus stable que l'ARN. The inventors have now demonstrated that the SprD RNA has a major role in the virulence of Staphylococcus aureus. In particular, they showed that the deletion of the SprD gene in at least three different strains of Staphylococcus aureus (strains N315 (agr-), Newman (agr +) and RN1 (agr +)) is responsible for the decrease or even the loss of virulence by bacteria on a model of septicemic infection. They have furthermore shown by complementation experiments that the virulence of the deleted bacteria of the SprD gene can be at least partially restored when a vector expressing the SprD transcript is introduced into the mutant bacteria. Thus, these results of the research work carried out by the inventors indicate that the virulence of the bacterial strains expressing the SprD gene, in particular strains belonging to the genus Staphylococcus and more particularly to the species Staphylococcus aureus, can be reduced or even eliminated by inhibition. or removing the effects of the sprD RNA. Inhibition or suppression of the effects of SprD RNA on the virulence of Staphylococcus aureus bacteria can be obtained by: inhibiting the transcription of the SprD gene by acting on the transcribed sequence of the gene (deletion of all or part of transcribed sequence, mutagenesis directed to modify the recognition by the transcription machinery) or via molecules preventing transcription of the gene by binding to its promoter sequence blocking the transcription initiation of the sprd gene. inhibitors of the activity of the SprD transcripts, in particular the inhibitors capable of preventing recognition between the SprD transcript and its targets. - Directed mutagenesis of the SprD gene to modify the recognition between the SprD transcript and its target. agents affecting the stability of the SprD transcripts and / or the inhibitors of the accumulation of the SprD transcripts. The term "bacteria of the genus Staphylococcus" in the sense of the present invention, the set of bacterial strains of the genus Staphylococcus. In particular, the bacteria of the genus Staphylococcus according to the invention are chosen from the group comprising bacterial strains of the genus Staphylococcus whose genome contains a gene encoding an RNA comprising the sequence SEQ ID No. 1 or a sequence homologous to the sequence SEQ ID No. 1 and the fragments thereof. These strains can be easily identified by those skilled in the art, for example, by screening techniques of libraries (genomic DNA or cDNA of bacteria of the genus Staphylococcus) using probes or primers specific to a sequence belonging to bacterial strains of the genus Staphylococcus as defined above. Such probes or primers can be selected from the polynucleotide sequences according to the invention. In particular, the bacteria of the genus Staphylococcus according to the invention are strains of Staphylococcus aureus. According to a first aspect, the subject of the invention is an inhibitor of the accumulation of transcripts SprD (such as the inhibitors of the stability of transcripts SprD) and / or the transcription of the gene SprD. The expression "inhibitor of the accumulation of transcripts SprD" is used here to designate a molecule capable of inducing a decrease of at least 20%, in particular of at least 35% and especially of at least 50%. the level of transcripts of a gene accumulated in particular over time in a bacterial strain expressing sprD, relative to the level of accumulated transcripts, particularly over time in said bacterial strain expressing sprD in the absence of said molecule. The inhibition of the accumulation of transcripts can be determined by techniques well known to those skilled in the art such as by "Northern Blot", using at least one specific probe of said transcript or "RT-PCR" using at least two specific primers of said transcript, in particular by studying the accumulation of the level of transcript in a bacterial strain in culture expressing sprD. In particular, the inhibition of the accumulation of transcripts can be determined by the technique as described in point I.2 of the examples below ("RNA isolation and Northern blots") and whose results are presented on Figure lA. Preferably, such an inhibitor comprises an isolated polynucleotide whose sequence comprises a sequence chosen from the group comprising the sequence SEQ ID No. 4, the derived sequences having at least 70% identity with the sequence SEQ ID No. 4 and the fragments thereof; and the sequence SEQ ID No. 5; and a sequence of transcribable DNA sequence SEQ ID No. 4, the derived sequences having at least 70% identity and fragments thereof; the sequence SEQ ID No. 5 and the sequence SEQ ID No. 4, the derived sequences having at least 70% identity with the sequence SEQ ID No. 4 and the fragments thereof having the ability to hybridize specifically with the sequence SEQ ID No. 2 and negatively modify the stability of the transcripts SprD. For the purposes of the present invention, the term "polynucleotide" is intended to mean a polymer composed of several nucleotides linked by phosphodiester bonds, such as DNA (deoxyribonucleic acid) and RNA (ribonucleic acid). DNA has the advantage of being more stable than RNA.
Le terme « identité » se réfère à l'identité existant entre deux séquences de polynucléotides. L'identité peut être déterminée par la comparaison des nucléotides présents à une position dans chacune des séquences de polynucléotide alignées dans ce but. Lorsque, à une position donnée un nucléotide est identifié comme identique sur les deux séquences alignées, lesdites séquences sont dites identiques à cette position. Le pourcentage d'identité entre deux séquences de polynucléotides est fonction du nombre de nucléotides identiques aux différentes positions sur les deux séquences de nucléotides alignées. Différents programmes peuvent être utilisés afin d'aligner des séquences de polynucléotides et calculer ainsi le pourcentage d'identité existant entre ces séquences, tels que FASTA ou BLAST. On entend par « séquence dérivée d'une deuxième séquence », une séquence ayant au moins 70 % d'identité, de préférence au moins 80 % d'identité et tout préférentiellement au moins 90 %, en particulier au moins 95 %, 97 % et tout particulièrement 99% d'identité avec une deuxième séquence. La capacité d'hybridation spécifique d'une première séquence de polynucléotide avec une deuxième séquence de polynucléotide peut être déterminée in vitro, par des tests bien connus de l'Homme du Métier. À titre d'exemple, on peut citer le test décrit dans C. Pichon & B. Felden (2005 ; avec l'exemple de l'ARN régulateur SprA et sa cible ARNm SA2216), qui comprend les étapes suivantes : - une première séquence de polynucléotide est marquée radioactivement, purifiée et des quantités croissantes d'une deuxième séquence de polynucléotide non marquée sont ajoutées et analysées par gel d'électrophorèse en conditions natives. L'obtention d'un retard de migration sur ce gel implique la formation d'un complexe entre ces deux séquences de polynucléotides, par hybridation ; - l'effet de l'ajout d'un excès de 100 à 2000 fois, en rapports molaires, d'une troisième séquence de polynucléotide (par exemple un mélange d'ARN de transfert) sur la formation dudit complexe entre les deux premières séquences, est analysé ; - l'effet de l'ajout d'un excès de 100 à 2000 fois, en rapports molaires, de la première séquence de polynucléotide non marqué sur la formation dudit complexe entre les deux premières séquences, est analysé ; - l'hybridation entre les deux premières séquences de polynucléotides sera considérée comme spécifique si (i) ledit complexe préformé entre les deux premières séquences de polynucléotide reste stable en présence de cet excès de troisième séquence de polynucléotide (ex : ARNt) et si (ii) ledit complexe préformé est déstabilisé en présence de faibles quantités de la première séquence de polynucléotide non marquée. The term "identity" refers to the identity between two polynucleotide sequences. The identity can be determined by comparing the nucleotides present at one position in each of the polynucleotide sequences aligned for that purpose. When, at a given position, a nucleotide is identified as identical on the two aligned sequences, said sequences are said to be identical at this position. The percentage identity between two polynucleotide sequences is a function of the number of identical nucleotides at the different positions on the two aligned nucleotide sequences. Different programs can be used to align polynucleotide sequences and thus calculate the percentage identity between these sequences, such as FASTA or BLAST. By "sequence derived from a second sequence" is meant a sequence having at least 70% identity, preferably at least 80% identity and most preferably at least 90%, in particular at least 95%, 97% and especially 99% identity with a second sequence. The specific hybridization ability of a first polynucleotide sequence with a second polynucleotide sequence can be determined in vitro by tests well known to those skilled in the art. By way of example, mention may be made of the test described in C. Pichon & B. Felden (2005, with the example of the SprA regulatory RNA and its SA2216 mRNA target), which comprises the following steps: a first sequence polynucleotide is radioactively labeled, purified and increasing amounts of a second unlabeled polynucleotide sequence are added and analyzed by electrophoresis gel under native conditions. Obtaining a migration delay on this gel involves the formation of a complex between these two polynucleotide sequences, by hybridization; the effect of adding an excess of 100 to 2000 times, in molar ratios, of a third polynucleotide sequence (for example a transfer RNA mixture) on the formation of said complex between the first two sequences , is analyzed; the effect of adding an excess of 100 to 2000 times, in molar ratios, of the first unlabeled polynucleotide sequence on the formation of said complex between the first two sequences is analyzed; the hybridization between the first two polynucleotide sequences will be considered specific if (i) said complex preformed between the first two polynucleotide sequences remains stable in the presence of this excess of the third polynucleotide sequence (ex: tRNA) and if (ii ) said preformed complex is destabilized in the presence of small amounts of the first unlabeled polynucleotide sequence.
L'Homme du Métier pourra aisément déterminer les séquences dérivées et les fragments du premier polynucléotide isolé selon l'invention qui ont la capacité de s'hybrider spécifiquement à la séquence ID N°2, en mettant en oeuvre un test d'hybridation spécifique tel que décrit ci-dessus. En particulier, les séquences dérivées et les fragments du premier polynucléotide isolé selon l'invention qui ont la capacité de s'hybrider spécifiquement à la séquence ID N°2 ont en outre la capacité d'inhiber l'accumulation des transcrits sprD et/ou d'inhiber la transcription du gène sprD. En particulier, les polynucléotides isolés selon la présente invention peuvent être capables de s'hybrider spécifiquement à l'ARN SprD et d'induire la dégradation de l'ARN SprD par un mécanisme de dégradation lié au recrutement de ribonucléases sur le duplex ARN-ARN, l'exemple décrit expérimentalement chez S. dorés étant la ribonucléase III (pour la dégradation des cibles ARNm de l'ARNIII). Dans ce cas, l'ARN SprD est donc dégradé et ne peut donc plus produire ses effets. De tels polynucléotides sont donc particulièrement utiles pour la prévention et/ou le traitement d'infections staphylococciques, en particulier de souches résistantes aux antibiotiques. En outre, les polynucléotides selon l'invention présentent l'avantage contrairement à des traitements putatifs, d'avoir une action ciblée sur les bactéries du genre Staphylococcus optimisant ainsi leur action et limitant les risques d'effets secondaires. Those skilled in the art can easily determine the derived sequences and fragments of the first isolated polynucleotide according to the invention which have the capacity to hybridise specifically to the sequence ID No. 2, by implementing a specific hybridization test such as as described above. In particular, the derived sequences and the fragments of the first isolated polynucleotide according to the invention which have the capacity to hybridise specifically to the sequence ID No. 2 also have the capacity to inhibit the accumulation of transcripts SprD and / or to inhibit the transcription of the gene sprD. In particular, the polynucleotides isolated according to the present invention may be able to hybridize specifically to the SprD RNA and to induce the degradation of the SprD RNA by a degradation mechanism related to the recruitment of ribonucleases on the RNA-RNA duplex. , the example described experimentally in S. dorés being ribonuclease III (for the degradation of mRNA mRNA targets). In this case, the SprD RNA is therefore degraded and can no longer produce its effects. Such polynucleotides are therefore particularly useful for the prevention and / or treatment of staphylococcal infections, particularly antibiotic-resistant strains. In addition, the polynucleotides according to the invention have the advantage unlike putative treatments, to have a targeted action on bacteria of the genus Staphylococcus thus optimizing their action and limiting the risk of side effects.
En particulier, les séquences dérivées de la séquence d'ADN pouvant être transcrite en séquence SEQ ID N°4 présente entre 50 et 70 % d'identité avec la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID N°l (ADN SprD). On entend par « séquence complémentaire d'une deuxième séquence » au sens de la présente invention, une séquence dont l'ensemble des nucléotides contigus ont la capacité de former des appariements Watson-Crick de type g-c, c-g, a-u, u-a, a-t, t-a et éventuellement des appariements wobble de type g-u, u-g avec l'ensemble des nucléotides contigus de la deuxième séquence. La présente invention concerne également un polynucléotide isolé 10 comprenant une séquence choisie dans le groupe comprenant : a) la séquence SEQ ID N°4, les séquences dérivées ayant au moins 90 % d'identité,, en particulier au moins 95 %, 97 % et tout particulièrement 99% d'identité avec la séquence SEQ ID N°4 et les fragments d'au moins 5 nucléotides de celles-ci, en particulier la séquence SEQ ID N°8 ; et 15 b) les séquences d'ADN correspondantes, en particulier la séquence SEQ ID N°5 et la séquence SEQ ID N°9 ; lesdites séquences dérivées et lesdits fragments ayant la capacité de s'hybrider spécifiquement avec une séquence correspondant à la séquence SEQ ID N°2 et en particulier ayant en outre la capacité d'inhiber l'accumulation des 20 transcrits sprD et/ou d'inhiber la transcription du gène sprD. On entend notamment par séquence d'ADN correspondant à la séquence d'un ARN, ladite séquence d'ARN dans laquelle les ribonucléotides comprenant une base uracile ont été remplacées par des désoxyribonucléotides comprenant une base thymine. 25 En particulier lesdits fragments peuvent comprendre au moins 5 nucléotides, en particulier au moins 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140 nucléotides . L'accumulation des transcrits sprD peut être déterminée par des tests bien connus de l'Homme du Métier telle que par la technique exemplifiée dans la présente demande (Exemple I.2 « isolation de l'ARN et Northern Blot », figures lA et lB), telle que par Northern blot en utilisant au moins une sonde spécifique dudit transcrit ou par RT-PCR en utilisant aux moins deux amorces spécifiques dudit transcrit notamment en déterminant le taux de transcrits sprD accumulés dans le temps dans une souche bactérienne en culture exprimant sprD, dans des conditions d'expression du gène sprD. On entend par « inhibition de la transcription du gène sprD » une diminution d'au moins 20%, en particulier d'au moins 35 % et tout particulièrement d'au moins 50% du gène sprD. L'inhibition des transcrits sprD peut être déterminée par des tests bien connus de l'Homme du Métier telle que par Northern blot en utilisant au moins une sonde spécifique dudit transcrit ou par RT-PCR en utilisant aux moins deux amorces spécifiques La présente invention concerne également l'utilisation in vitro ou ex vivo d'un polynucléotide isolé comprenant une séquence choisie dans le groupe 15 comprenant : a) la séquence SEQ ID N°4, les séquences dérivées ayant au moins 90 % d'identité, en particulier au moins 95 %, 97 % et tout particulièrement 99% d'identité, avec la séquence SEQ ID N°4 et les fragments d'au moins 5 nucléotides de celles-ci, en particulier la séquence SEQ ID N°8 ; et 20 b) les séquences d'ADN correspondantes, en particulier la séquence SEQ ID N°5 et la séquence SEQ ID N°9 ; lesdites séquences dérivées et lesdits fragments ayant la capacité de s'hybrider spécifiquement avec une séquence correspondant à la séquence SEQ ID N°2 et en particulier ayant en outre la capacité d'inhiber l'accumulation des 25 transcrits sprD et/ou d'inhiber la transcription du gène sprD ; en tant qu'agent inhibiteur de l'accumulation des transcrits sprD et/ou de la transcription du gène sprD. On entend par « agent inhibiteur de la transcription du gène sprD », toute molécule capable d'inhiber d'au moins 20%, en particulier d'au moins 35 % et tout particulièrement d'au moins 50% la transcription du gène sprD, par rapport au taux de transcription du gène sprD en l'absence de ladite molécule. L'inhibition des transcrits sprD peut être déterminée par des tests bien connus de l'Homme du Métier tels qu'exemplifiés ci-dessus. In particular, the sequences derived from the sequence of transcribable DNA sequence SEQ ID No. 4 has between 50 and 70% identity with the sequence complementary to the sequence SEQ ID No. 1 (DNA SprD). The term "sequence complementary to a second sequence" in the sense of the present invention, a sequence whose set of contiguous nucleotides have the ability to form Watson-Crick pairings of gc, cg, au, ua, a- t, ta and possibly gu-type wobble pairings with the set of contiguous nucleotides of the second sequence. The present invention also relates to an isolated polynucleotide comprising a sequence selected from the group consisting of: a) the sequence SEQ ID No. 4, the derived sequences having at least 90% identity, in particular at least 95%, 97% and most preferably 99% identity with the sequence SEQ ID No. 4 and fragments of at least 5 nucleotides thereof, in particular the sequence SEQ ID No. 8; and b) the corresponding DNA sequences, in particular the sequence SEQ ID No. 5 and the sequence SEQ ID No. 9; said derived sequences and said fragments having the ability to hybridize specifically with a sequence corresponding to the sequence SEQ ID No. 2 and in particular having the further ability to inhibit the accumulation of transcripts and / or to inhibit the transcription of the sprD gene. In particular, the term "DNA sequence corresponding to the sequence of an RNA" means said RNA sequence in which the ribonucleotides comprising an uracil base have been replaced by deoxyribonucleotides comprising a thymine base. In particular said fragments may comprise at least 5 nucleotides, in particular at least 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140 nucleotides. The accumulation of transcripts SprD can be determined by tests well known to those skilled in the art such as by the technique exemplified in the present application (Example I.2 "isolation of RNA and Northern Blot", FIGS. 1A and 1B ), such as by Northern blot using at least one specific probe of said transcript or by RT-PCR using at least two specific primers of said transcript, in particular by determining the rate of transcripts sprD accumulated over time in a bacterial strain in culture expressing sprD , under expression conditions of the sprD gene. By "transcriptional inhibition of the sprD gene" is meant a decrease of at least 20%, in particular of at least 35% and more particularly at least 50% of the sprD gene. The inhibition of transcripts SprD can be determined by tests well known to those skilled in the art such as by Northern blot using at least one specific probe of said transcript or by RT-PCR using at least two specific primers. also the in vitro or ex vivo use of an isolated polynucleotide comprising a sequence selected from the group comprising: a) the sequence SEQ ID No. 4, the derived sequences having at least 90% identity, in particular at least 95%, 97% and especially 99% of identity, with the sequence SEQ ID No. 4 and the fragments of at least 5 nucleotides thereof, in particular the sequence SEQ ID No. 8; and b) the corresponding DNA sequences, in particular the sequence SEQ ID No. 5 and the sequence SEQ ID No. 9; said derived sequences and said fragments having the ability to hybridize specifically with a sequence corresponding to the sequence SEQ ID NO: 2 and in particular having the further ability to inhibit the accumulation of transcripts and / or to inhibit transcription of the sprD gene; as an inhibitory agent for the accumulation of transcripts SprD and / or transcription of the gene sprD. The term "transcriptional inhibiting agent of the SprD gene" is intended to mean any molecule capable of inhibiting by at least 20%, in particular at least 35% and especially at least 50%, the transcription of the SprD gene, compared to the transcription rate of the sprD gene in the absence of said molecule. The inhibition of transcripts SprD can be determined by tests well known to those skilled in the art as exemplified above.
L'invention a également pour objet un polynucléotide isolé comprenant à ses extrémités 5' et 3' respectivement les séquences nucléotidiques SEQ ID N°6 et SEQ ID N°7. Ce polynucléotide peut être utile notamment pour déléter totalement le gène sprD du génome de bactérie appartenant au genre Staphylococcus, en particulier dont le génome contient la séquence SEQ ID N°1, en particulier, appartenant à l'espèce Staphylococcus aureus. L'invention a également pour objet un inhibiteur de l'accumulation des transcrits SprD qui comprend un vecteur comprenant les séquences nucléotidiques SEQ ID N°6 et SEQ ID N°7 (séquence de l'ADN génomique en amont du gène sprD et séquence de l'ADN génomique en aval du gène sprD respectivement).Ledit vecteur recombinant (tel que pBT2AsprD) ainsi généré peut être transformé par exemple dans les souches RN4220 puis N315 pour permettre l'intégration du gène ermB dans le génome par recombinaison homologue. La délétion du gène SprD peut être validée par Northern blots, avec absence du transcrit SprD. Les inventeurs ont montré sur un modèle murin de septicémie que les bactéries dans lesquelles le gène sprD est délété perdent leur virulence. La présente invention englobe également les polynucléotides conformes à l'invention, synthétiques, hémi-synthétiques, recombinants et leurs analogues. Les analogues des polynucléotides selon l'invention ont la capacité de s'hybrider spécifiquement ou d'être transcrits en polynucléotides ayant la capacité de s'hybrider spécifiquement avec la séquence SEQ ID N°2. En particulier, les analogues des polynucléotides selon l'invention ont en outre la capacité de réguler négativement l'accumulation de transcrits SprD. On entend par « analogue » au sens de la présente invention, des polynucléotides comprenant au moins une modification chimique au niveau de leur sucre, phosphate, de leur base ou de leurs extrémités 5' et 3' ; ladite modification pouvant être réalisée par synthèse chimique ou enzymatique. En effet, les polynucléotides selon l'invention peuvent comprendre au moins une modification chimique destinée notamment à augmenter leur stabilité, leur résistance à la dégradation par les endo et exonucléases, favoriser leur capacité à entrer dans une cellule d'intérêt et/ou dans le cas du premier polynucléotide selon l'invention à augmenter sa capacité à réguler négativement l'accumulation de transcrits SprD. L'augmentation de la capacité du premier polynucléotide (SEQ ID N°4) selon l'invention à réguler négativement l'accumulation de transcrits SprD peut être obtenu, par exemple, par une modification chimique permettant l'augmentation de la formation et/ou de la stabilité d'un complexe entre le premier polynucléotide selon l'invention et la séquence SEQ ID N°2, par hybridation spécifique. Ainsi, les polynucléotides selon l'invention peuvent comprendre des nucléotides modifiés au niveau de leur sucre, phosphate, de leur base et/ou peuvent présenter des modifications, notamment post-transcriptionnelles, aux niveaux de leurs extrémités 5' et 3'. De tels nucléotides modifiés peuvent être choisis dans le groupe comprenant : les 2'-O-methylnucléotides, les 2'-O-methoxyethylnucléotides, les déoxynucléotides tels que les 2'-déoxynucléotides et les 2'-deoxy-2'-fluoronucléotides, les nucléotides à liaisons peptidiques, des fluorochromes, des éléments radioactifs. Les polynucléotides selon l'invention peuvent également comprendre en outre, à leurs extrémités 5' et/ou 3' des éléments structuraux (tels que des hélices d'ARN ou d'ADN stables) renforçant leur stabilité et/ou leur résistance aux dégradations. The subject of the invention is also an isolated polynucleotide comprising at its 5 'and 3' ends respectively the nucleotide sequences SEQ ID No. 6 and SEQ ID No. 7. This polynucleotide may be useful in particular for completely deleting the gene sprD genome of bacteria belonging to the genus Staphylococcus, in particular whose genome contains the sequence SEQ ID No. 1, in particular, belonging to the species Staphylococcus aureus. The subject of the invention is also an inhibitor of the accumulation of transcripts SprD which comprises a vector comprising the nucleotide sequences SEQ ID No. 6 and SEQ ID No. 7 (sequence of the genomic DNA upstream of the sprD gene and sequence of the genomic DNA downstream of the gene sprD respectively) .This recombinant vector (such as pBT2AsprD) thus generated can be transformed for example in strains RN4220 and then N315 to allow integration of the ermB gene in the genome by homologous recombination. The deletion of the SprD gene can be validated by Northern blots, with absence of the SprD transcript. The inventors have shown on a mouse model of septicemia that the bacteria in which the gene sprD is deleted lose their virulence. The present invention also encompasses the polynucleotides according to the invention, synthetic, semisynthetic, recombinant and their analogues. The analogs of the polynucleotides according to the invention have the capacity to hybridize specifically or to be transcribed into polynucleotides having the capacity to hybridize specifically with the sequence SEQ ID No. 2. In particular, the analogs of the polynucleotides according to the invention also have the capacity to negatively regulate the accumulation of transcripts SprD. For the purposes of the present invention, the term "analogue" means polynucleotides comprising at least one chemical modification at the level of their sugar, phosphate, their base or their 5 'and 3' ends; said modification can be carried out by chemical or enzymatic synthesis. Indeed, the polynucleotides according to the invention may comprise at least one chemical modification intended in particular to increase their stability, their resistance to degradation by the endo and exonucleases, to promote their ability to enter a cell of interest and / or in the case of the first polynucleotide according to the invention to increase its ability to negatively regulate the accumulation of transcripts SprD. The increase of the capacity of the first polynucleotide (SEQ ID No. 4) according to the invention to negatively regulate the accumulation of transcripts SprD can be obtained, for example, by a chemical modification allowing the increase of the formation and / or the stability of a complex between the first polynucleotide according to the invention and the sequence SEQ ID No. 2, by specific hybridization. Thus, the polynucleotides according to the invention may comprise modified nucleotides in terms of their sugar, phosphate, base and / or may have modifications, in particular post-transcriptionally, at their 5 'and 3' ends. Such modified nucleotides may be selected from the group consisting of: 2'-O-methylnucleotides, 2'-O-methoxyethylnucleotides, deoxynucleotides such as 2'-deoxynucleotides and 2'-deoxy-2'-fluoronucleotides, nucleotides with peptide bonds, fluorochromes, radioactive elements. The polynucleotides according to the invention may also further comprise, at their 5 'and / or 3' ends, structural elements (such as stable RNA or DNA helices) reinforcing their stability and / or their resistance to degradation.
Les polynucléotides selon l'invention peuvent être obtenus par des méthodes bien connues de l'Homme du Métier telles que par des techniques de criblage de banques (d'ADN génomique ou d'ADNc de bactéries du genre Staphylococcus) par des sondes ou des amorces spécifiques desdits polynucléotides (sélectionnés par exemple à partir des séquences de polynucléotides selon l'invention), mais également, par synthèses chimiques (Beaucage SL., 2008) ou par réactions enzymatiques (Sherlin LD et al., 2001). L'invention a également pour objet une cassette d'expression comprenant une séquence d'ADN telle que définie au point b) ci-dessus, ladite séquence 5 d'ADN correspondant aux séquences suivantes : a) SEQ ID N°4, les séquences dérivées ayant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°4 et les fragments d'au moins 5 nucléotides de celles-ci, en particulier la séquence SEQ ID N°8 En particulier, la présente invention concerne une cassette d'expression 10 comprenant la séquence d'ADN de séquence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°9. L'invention a également pour objet une cassette d'expression comprenant une séquence d'ADN selon l'invention pouvant être transcrite en séquence SEQ ID N°4. On entend par « cassette d'expression » au sens de la présente invention, 15 une cassette comprenant un promoteur et une région de terminaison de la transcription dans laquelle une séquence d'ADN d'intérêt est liée de manière opérationnelle au promoteur afin de permettre la transcription de ladite séquence d'ADN. Il peut s'agir de tout promoteur ou séquence dérivée, inductible ou non, 20 permettant la transcription d'un polynucléotide selon l'invention. En particulier, le promoteur est choisi parmi les promoteurs permettant la transcription d'un polynucléotide selon l'invention dans au moins une souche bactérienne du genre Staphylococcus. À titre d'exemple de tels promoteurs, on peut citer le promoteur du bactériophage T7 (Milligan JF et al., 1989) ou des promoteurs naturels 25 constitutifs. L'invention a également pour objet un vecteur recombinant comprenant un polynucléotide isolé choisi parmi le groupe de polynucléotides selon l'invention ou une cassette d'expression selon l'invention. The polynucleotides according to the invention can be obtained by methods well known to those skilled in the art, such as by screening methods of libraries (genomic DNA or cDNA of bacteria of the genus Staphylococcus) by probes or primers. specific of said polynucleotides (selected for example from the polynucleotide sequences according to the invention), but also, by chemical syntheses (Beaucage SL., 2008) or by enzymatic reactions (Sherlin LD et al., 2001). The invention also relates to an expression cassette comprising a DNA sequence as defined in point b) above, said DNA sequence corresponding to the following sequences: a) SEQ ID No. 4, the sequences derivatives having at least 90% identity with the sequence SEQ ID No. 4 and the fragments of at least 5 nucleotides thereof, in particular the sequence SEQ ID No. 8 In particular, the present invention relates to a cassette of expression comprising the DNA sequence of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 9. The subject of the invention is also an expression cassette comprising a DNA sequence according to the invention that can be transcribed in sequence SEQ ID No. 4. By "expression cassette" in the sense of the present invention is meant a cassette comprising a promoter and a transcription termination region in which a DNA sequence of interest is operably linked to the promoter to enable transcription of said DNA sequence. It can be any promoter or derived sequence, inducible or not, permitting the transcription of a polynucleotide according to the invention. In particular, the promoter is chosen from promoters allowing the transcription of a polynucleotide according to the invention in at least one bacterial strain of the genus Staphylococcus. Examples of such promoters include the bacteriophage T7 promoter (Milligan JF et al., 1989) or constitutive natural promoters. The subject of the invention is also a recombinant vector comprising an isolated polynucleotide chosen from the group of polynucleotides according to the invention or an expression cassette according to the invention.
Les vecteurs utilisables peuvent être des vecteurs viraux, tels que des bactériophages, ou non viraux, tels que des vecteurs plasmidiques. À titre d'exemples de vecteurs plasmidiques utilisables selon l'invention, on peut citer l'ensemble des vecteurs dérivés de pCN décrits dans Charpentier et al. (2004). Certains de ces vecteurs, par exemple pCN51, permettent la transcription d'une séquence d'ADN d'intérêt en ARN par l'utilisation d'un promoteur inductible au Cadmium. En particulier, le vecteur plasmidique peut être choisi dans le groupe comprenant les plasmides pCN35 et pCN38 décrits dans Charpentier et al. (2004). The vectors that may be used may be viral vectors, such as bacteriophages, or non-viral vectors, such as plasmid vectors. As examples of plasmid vectors that can be used according to the invention, mention may be made of all the pCN-derived vectors described in Charpentier et al. (2004). Some of these vectors, for example pCN51, allow the transcription of a DNA sequence of interest into RNA through the use of a cadmium inducible promoter. In particular, the plasmid vector may be chosen from the group comprising the plasmids pCN35 and pCN38 described in Charpentier et al. (2004).
Ces plasmides présentent l'avantage d'être maintenus et ainsi de permettre l'expression de polynucléotides selon l'invention, dans des bactéries transformées du genre Staphylococcus. Le plasmide pBT2 (Bruckner, 1997, FEMS Microbiol Lett. 151: 1-8) pourra être mis en oeuvre pour la délétion de tout ou partie du gène SprD par 15 recombinaison homologue. En particulier, le vecteur selon l'invention est un bactériophage. De préférence, ledit bactériophage est capable d'infecter au moins une souche bactérienne du genre Staphylococcus. On entend par « bactériophage capable d'infecter une souche bactérienne du genre Staphylococcus », tout virus 20 de bactéries capable d'introduire une partie de son matériel génétique dans le génome d'une souche bactérienne du genre Staphylococcus (prophage) ou de permettre l'expression transitoire de ce matériel génétique dans la bactérie réceptrice sans intégration chromosomique. Les bactéries du genre Staphylococcus sont infectées par trois types de 25 phages : lytiques obligatoires, tempérés et chroniques (Nicholas H. Mann, 2008). L'ensemble de ces phages est utilisable en tant que vecteur selon l'invention. Dans le cadre de la prévention et/ou du traitement d'infection staphylococcique, les phages utilisables comme vecteur selon l'invention sont de préférence à large spectre et capable d'infecter le plus grand nombre possible de souches bactériennes du genre Staphylococcus responsables d'infections chez l'homme et/ou l'animal. À titre d'exemple de tels bactériophages, on peut citer le phage lytique obligatoire X812, les phages K et 4)MR11. L'utilisation de bactériophages comme vecteur selon l'invention présente l'avantage d'optimiser la prévention et/ou le traitement d'une infection staphylococcique ou d'un trouble lié à au moins une bactérie du genre Staphylococcus. En outre, l'utilisation de bactériophage comme vecteur selon l'invention présente l'avantage que le bactériophage utilisé soit potentiellement efficace contre différentes souches bactériennes du genre Staphylococcus, même celles résistantes aux antibiotiques (Nicholas H. Mann, 2008) et de ne pas présenter d'effets secondaires, notamment en étant dénués d'effets néfastes sur les cellules eucaryotes de l'hôte infecté. Selon un autre aspect, l'invention a pour objet une cellule hôte transformée par une cassette d'expression selon l'invention ou un vecteur selon l'invention. La cellule hôte peut être en particulier un procaryote tel que E. coli notamment la souche DH5a et avantageusement un bactériophage tel que décrit ci-dessus. L'invention a également pour objet une composition comprenant au moins un composant choisi dans le groupe comprenant un inhibiteur de l'accumulation des transcrits SprD selon l'invention, une cassette d'expression selon l'invention, un vecteur selon l'invention et une cellule hôte selon l'invention. Avantageusement, ladite composition selon l'invention est une composition pharmaceutique. L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un vecteur pharmaceutiquement acceptable et au moins un composant choisi dans le groupe comprenant un polynucléotide isolé selon l'invention, une cassette d'expression selon l'invention, un vecteur selon l'invention et une cellule hôte selon l'invention. These plasmids have the advantage of being maintained and thus allow the expression of polynucleotides according to the invention in transformed bacteria of the genus Staphylococcus. Plasmid pBT2 (Bruckner, 1997, FEMS Microbiol Lett 151: 1-8) may be used for the deletion of all or part of the SprD gene by homologous recombination. In particular, the vector according to the invention is a bacteriophage. Preferably, said bacteriophage is capable of infecting at least one bacterial strain of the genus Staphylococcus. The term "bacteriophage capable of infecting a bacterial strain of the genus Staphylococcus" means any bacterial virus capable of introducing part of its genetic material into the genome of a bacterial strain of the genus Staphylococcus (prophage) or allowing transient expression of this genetic material in the recipient bacterium without chromosomal integration. Staphylococcus bacteria are infected with three types of phage: obligate, temperate and chronic phages (Nicholas H. Mann, 2008). All of these phages can be used as a vector according to the invention. In the context of the prevention and / or treatment of staphylococcal infection, the phages that can be used as vectors according to the invention are preferably broad-spectrum and capable of infecting as many as possible bacterial strains of the genus Staphylococcus responsible for infections in humans and / or animals. By way of example of such bacteriophages, mention may be made of the obligate lytic phage X812, phages K and 4) MR11. The use of bacteriophages as a vector according to the invention has the advantage of optimizing the prevention and / or treatment of a staphylococcal infection or a disorder related to at least one bacterium of the genus Staphylococcus. In addition, the use of bacteriophage as a vector according to the invention has the advantage that the bacteriophage used is potentially effective against various bacterial strains of the genus Staphylococcus, even those resistant to antibiotics (Nicholas H. Mann, 2008) and not have side effects, including being devoid of adverse effects on the eukaryotic cells of the infected host. According to another aspect, the subject of the invention is a host cell transformed by an expression cassette according to the invention or a vector according to the invention. The host cell may be in particular a prokaryotic such as E. coli including strain DH5a and advantageously a bacteriophage as described above. The subject of the invention is also a composition comprising at least one component chosen from the group comprising an inhibitor of the accumulation of the SprD transcripts according to the invention, an expression cassette according to the invention, a vector according to the invention and a host cell according to the invention. Advantageously, said composition according to the invention is a pharmaceutical composition. The subject of the invention is also a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable vector and at least one component selected from the group comprising an isolated polynucleotide according to the invention, an expression cassette according to the invention, a vector according to the invention and a host cell according to the invention.
Les vecteurs pharmaceutiquement acceptables utilisables dans les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être des vecteurs bien connus de l'Homme du Métier. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention présentent l'avantage contrairement aux médicaments putatifs d'avoir une action ciblée sur les bactéries du genre Staphylococcus, y compris les souches résistantes aux antibiotiques, optimisant ainsi leur action et limitant les risques d'effets secondaires. En particulier, lesdits composants sont présents dans la composition pharmaceutique selon l'invention en quantités thérapeutiques (quantités actives et non toxiques). De telles quantités thérapeutiques peuvent être déterminées par l'Homme du Métier par des tests de routine comprenant l'évaluation de l'effet de l'administration desdits composants susmentionnés sur des pathologies et/ou des troubles que l'on cherche à prévenir et/ou à traiter par l'administration de ladite composition pharmaceutique selon l'invention, par exemple une infection staphylococcique et sur la toxicité. Par exemple, de tels tests peuvent être mis en oeuvre en analysant de manière quantitative et qualitative l'effet de l'administration de différentes quantités desdits composants susmentionnés sur un ensemble de marqueurs (biologiques et/ou cliniques) caractéristiques de ces pathologies et/ ou de ces troubles, ainsi que par comptage bactériens dans des échantillons de prélèvements biologiques. En outre, l'index thérapeutique de la composition pharmaceutique selon l'invention peut être déterminé par des tests bien connus de l'Homme du Métier. Les inhibiteurs selon l'invention peuvent être administrés directement, de préférence à l'aide d'un véhicule pharmaceutiquement acceptable approprié permettant de faciliter leur entrée dans la cellule d'intérêt et/ou de les protéger de leur dégradation chimique ou enzymatiques. À titre d'exemples de tels véhicules pharmaceutiquement utilisables, on peut citer des microsphères, des liposomes, des nanoparticules. The pharmaceutically acceptable vectors that can be used in the pharmaceutical compositions according to the invention can be well-known vectors of the person skilled in the art. The pharmaceutical compositions according to the invention have the advantage unlike putative drugs to have a targeted action on bacteria of the genus Staphylococcus, including strains resistant to antibiotics, optimizing their action and limiting the risk of side effects. In particular, said components are present in the pharmaceutical composition according to the invention in therapeutic amounts (active and non-toxic amounts). Such therapeutic amounts may be determined by those skilled in the art by routine tests comprising the evaluation of the effect of the administration of said components mentioned above on pathologies and / or disorders that one seeks to prevent and / or to be treated by the administration of said pharmaceutical composition according to the invention, for example a staphylococcal infection and on toxicity. For example, such tests can be implemented by quantitatively and qualitatively analyzing the effect of the administration of different amounts of said aforementioned components on a set of markers (biological and / or clinical) characteristic of these pathologies and / or of these disorders, as well as by bacterial counting in samples of biological samples. In addition, the therapeutic index of the pharmaceutical composition according to the invention can be determined by tests well known to those skilled in the art. The inhibitors according to the invention can be administered directly, preferably using a suitable pharmaceutically acceptable vehicle to facilitate their entry into the cell of interest and / or to protect them from their chemical or enzymatic degradation. Examples of such pharmaceutically usable vehicles include microspheres, liposomes, nanoparticles.
Les inhibiteurs selon l'invention peuvent également être administrés via un vecteur tel qu'avantageusement un bactériophage comme décrit ci-dessus. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être administrées par différentes voies compatibles avec l'effet recherché et de préférence par voie orale, parentérale, sous-cutanée, topique, intra-oculaire, sublinguale et tout préférentiellement intra-oculaire. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être administrées en une ou plusieurs fois ou en libération continue. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent se présenter sous différentes formes bien connues de l'Homme du Métier et adaptées aux voies et modes d'administration utilisés. En particulier lorsque les compositions pharmaceutiques sont administrées à des animaux, elles peuvent être incluses dans des compositions alimentaires (par exemple sous forme de poudres ou de granulés). Inhibitors according to the invention can also be administered via a vector such as advantageously a bacteriophage as described above. The pharmaceutical compositions according to the invention may be administered by different routes compatible with the desired effect and preferably orally, parenterally, subcutaneously, topically, intraocularly, sublingually and most preferably intraocularly. The pharmaceutical compositions according to the invention can be administered in one or more times or in continuous release. The pharmaceutical compositions according to the invention can be in various forms well known to those skilled in the art and adapted to the routes and modes of administration used. In particular, when the pharmaceutical compositions are administered to animals, they may be included in food compositions (for example in the form of powders or granules).
Selon un autre aspect, l'invention a également pour objet un inhibiteur de l'accumulation des transcrits SprD selon l'invention, ou une cassette d'expression selon l'invention, ou un vecteur selon l'invention ou une cellule hôte selon l'invention, pour son application en tant que médicament pour la prévention et/ou le traitement d'une infection staphylococcique. According to another aspect, the subject of the invention is also an inhibitor of the accumulation of the SprD transcripts according to the invention, or an expression cassette according to the invention, or a vector according to the invention or a host cell according to the invention. invention for its application as a medicament for the prevention and / or treatment of a staphylococcal infection.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un composant choisi dans le groupe comprenant un inhibiteur de l'accumulation des transcrits SprD selon l'invention, une cassette d'expression selon l'invention, un vecteur selon l'invention, une cellule hôte selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement d'une infection staphylococcique. L'invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un composant choisi dans le groupe comprenant un polynucléotide isolé selon l'invention, une cassette d'expression selon l'invention, un vecteur selon l'invention, une cellule hôte selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement d'une infection staphylococcique. L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique selon l'invention pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement d'une infection staphylococcique. L'invention a également pour objet une méthode de prévention et/ou de traitement d'une infection staphylococcique comprenant l'administration à un sujet d'une quantité thérapeutique d'au moins un composant choisi dans le groupe comprenant un polynucléotide isolé selon l'invention, une cassette d'expression selon l'invention, un vecteur selon l'invention, une cellule hôte selon l'invention, La quantité thérapeutique peut être aisément déterminée par des tests bien connus de l'Homme du Métier Les infections staphylococciques comprennent l'ensemble des infections dont sont responsables les bactéries du genre Staphylococcus. Ces infections comprennent l'ensemble des pathologies et/ou des troubles pouvant être améliorés et/ou évités par la réduction de l'accumulation et/ou par la réduction de la transcription des transcrits sprD. En particulier, les infections staphylococciques comprennent les infections à Staphylococcus aureus parmi lesquelles on peut citer les folliculites superficielles ou profondes (tels que les furoncles, l'anthrax et le sycosis staphylococcique), le syndrome staphylococcique des enfants ébouillantés, les infections de blessures, un furoncle, une bactériémie, une endocardite, une ostéomyélite ou encore une arthrite septique. Selon un autre aspect, l'invention a également pour objet un produit contenant : - au moins un composant choisi dans le groupe comprenant un polynucléotide isolé selon l'invention, une cassette d'expression selon l'invention, un vecteur selon l'invention, une cellule hôte selon l'invention; et - au moins un autre agent antistaphylococcique, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée et/ou étalée dans le temps, pour la prévention et/ou le traitement d'une infection staphylococcique. On entend par « agent antistaphylococcique » au sens de la présente invention, un agent destiné à lutter contre au moins une souche bactérienne du genre Staphylococcus, en particulier contre au moins une souche bactérienne du genre Staphylococcus choisie dans le groupe comprenant les souches bactériennes du genre Staphylococcus dont le génome contient :un gène codant un ARN comprenant la séquence SEQ ID N°l ou une séquence homologue de la séquence SEQ ID N°l et les fragments de celles-ci, et tout particulièrement un agent destiné à lutter contre au moins une souche de Staphylococcus aureus. Ledit agent antistaphylococcique peut être choisi dans le groupe comprenant : des antibiotiques destinés à prévenir et/ou à traiter des infections 15 locales tels que l'acide fusidique, la mupirocine ; des antibiotiques destinés à prévenir et/ou traiter des infections systémiques tels que la rifampicine, les fluoroquinolones, l'acide fusidique, le trimethoprime-sulfaméthoxazole, les glycopeptides ; et 20 des bactériophages tels que 0812, K et 4MR11. Les produits de combinaison selon l'invention comprenant un autre agent antistaphylococcique présentent les avantages d'optimiser la prévention et/ou le traitement d'une infection staphylococcique et de pouvoir réduire la quantité thérapeutique de chaque composant. 25 La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention d'une souche bactérienne non virulente ou dont la virulence (pathogénécité) est diminuée, en particulier non virulente, ladite souche appartenant au genre Staphylococcus, en particulier à l'espèce Staphylococcus aureus, ledit procédé comprenant une étape de délétion totale ou partielle du gène sprD dans le génome d'une souche bactérienne du genre Staphylococcus, en particulier une délétion totale du gène sprD. La délétion totale ou partielle du gène sprD peut être réalisée par recombinaison homologue, de préférence par l'introduction dans ladite souche d'un polynucléotide isolé comprenant à ses extrémités 5' et 3' respectivement les séquences nucléotidiques SEQ ID N°6 et SEQ ID N°7. Une telle introduction peut être réalisée par exemple par electroporation. La présente invention concerne également un procédé pour la sélection ou l'identification in vitro ou ex vivo de composés pour la prévention et/ou le 10 traitement d'une infection staphylococcique, comprenant les étapes suivantes ; a) l'introduction ou la mise en contact d'un composé test dans ou avec une souche bactérienne exprimant le gène sprD ou avec des transcrits sprD ; b) La détermination de la capacité du composé test à complexer, en particulier à s'hybrider, avec les transcrits sprD ; et/ou 15 c) la détermination de la capacité du composé test à inhiber la transcription du gène sprD ; et éventuellement en outre d) la sélection des composés capables de complexer avec les transcrits sprD et/ou d'inhiber la transcription du gène sprD ; et éventuellement en outre e) la mise en contact ou l'introduction du composé test sélectionné à 20 l'étape d) avec ou dans une souche bactérienne virulente appartenant au genre Staphylococcus ; f) la détermination de la capacité du composé test à diminuer ou à supprimer la virulence de ladite souche ; et éventuellement en outre g) la sélection des composés tests capables de diminuer ou supprimer 25 la virulence de ladite souche. On entend par « composé capable de complexer » avec des transcrits sprD, tout composé capable de former un complexe avec les transcrits sprD, en particulier capable de s'hybrider avec lesdits transcrits. Lesdits composés peuvent être notamment des protéines, des polynucléotides tels qu'une molécule d'ADN ou une molécule d'ARN. En particulier, ledit composé peut être un ARN antisens, un siRNA, un shRNA, LNA, PNA. La capacité d'un composé à former un complexe, en particulier à s'hybrider avec les transcrits sprD peut être déterminée par toute technique bien connue de l'Homme du Métier, telle que par la détection du complexe susceptible d'être formé entre ledit composé et les transcrits sprD. A titre d'exemple de telle technique, on peut citer les techniques de retard sur gel, northern-blot, RT-PCR. On entend par « composé capable d'inhiber la transcription du gène sprD », toute molécule capable d'inhiber d'au moins 20%, en particulier d'au moins 35 % et tout particulièrement d'au moins 50% la transcription du gène sprD, par rapport au taux de transcription du gène sprD en l'absence dudit composé. L'inhibition des transcrits sprD peut être déterminée par des tests bien connus de l'Homme du Métier telle que par Northern blot en utilisant au moins une sonde spécifique dudit transcrit sprD ou par RT-PCR en utilisant aux moins deux amorces spécifiques dudit transcrit sprD. La capacité du composé test à diminuer ou à supprimer la virulence d'une souche peut-être déterminée en utilisant des techniques bien connues de l'Homme du Métier et notamment par la technique telle que décrite au point I.3 des exemples ci-après, en utilisant un modèle murin par exemple de spéticémie intraveineuse. Par exmple, il est possible d'inoculer à des souris une suspension bactérienne comprenant une souche virulente du genre Staphylococcus dans laquelle a été introduite ledit composé test et en observant l'état (notamment survie ou non) des souris dans le temps en comparaison avec des souris inoculée avec une composition non pathogène comme témoin. L'introduction du composé test dans une souche bactérienne peut être effectué par toute technique classiquement connue de l'Homme du Métier telle que par transformation, transfection, par exemple par un electroporateur. The subject of the invention is also the use of a component chosen from the group comprising an inhibitor of the accumulation of the SprD transcripts according to the invention, an expression cassette according to the invention, a vector according to the invention, a host cell according to the invention, for the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of a staphylococcal infection. The subject of the invention is also the use of at least one component selected from the group comprising an isolated polynucleotide according to the invention, an expression cassette according to the invention, a vector according to the invention, a host cell according to the invention for the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of a staphylococcal infection. The invention also relates to a pharmaceutical composition according to the invention for its use for the prevention and / or treatment of a staphylococcal infection. The invention also relates to a method for preventing and / or treating a staphylococcal infection comprising administering to a subject a therapeutic amount of at least one component selected from the group comprising an isolated polynucleotide according to the invention. According to the invention, an expression cassette according to the invention, a vector according to the invention, a host cell according to the invention, the therapeutic amount can be easily determined by tests well known to those skilled in the art. Staphylococcal infections include set of infections which are responsible for bacteria of the genus Staphylococcus. These infections include all pathologies and / or disorders that can be improved and / or avoided by reducing the accumulation and / or reducing the transcription of transcripts SprD. In particular, staphylococcal infections include Staphylococcus aureus infections including superficial or deep folliculitis (such as boils, anthrax and staphylococcal sycosis), staphylococcal syndrome of scalded children, wound infections, furuncle, bacteremia, endocarditis, osteomyelitis or septic arthritis. According to another aspect, the subject of the invention is also a product containing: at least one component selected from the group comprising an isolated polynucleotide according to the invention, an expression cassette according to the invention, a vector according to the invention a host cell according to the invention; and at least one other antistaphylococcal agent, as a combination product for simultaneous, separate and / or spreading use for the prevention and / or treatment of a staphylococcal infection. The term "antistaphylococcal agent" in the sense of the present invention, an agent for controlling at least one bacterial strain of the genus Staphylococcus, in particular against at least one bacterial strain of the genus Staphylococcus selected from the group comprising bacterial strains of the genus Staphylococcus whose genome contains: a gene encoding an RNA comprising the sequence SEQ ID No. 1 or a sequence homologous to the sequence SEQ ID No. 1 and the fragments thereof, and most particularly an agent intended to combat at least a strain of Staphylococcus aureus. The antistaphylococcal agent may be selected from the group consisting of: antibiotics for preventing and / or treating local infections such as fusidic acid, mupirocin; antibiotics for preventing and / or treating systemic infections such as rifampicin, fluoroquinolones, fusidic acid, trimethoprim-sulfamethoxazole, glycopeptides; and bacteriophages such as 0812, K and 4MR11. The combination products according to the invention comprising another antistaphylococcal agent have the advantages of optimizing the prevention and / or treatment of a staphylococcal infection and of being able to reduce the therapeutic amount of each component. The subject of the present invention is also a process for obtaining a non-virulent bacterial strain or one whose virulence (pathogenecity) is reduced, in particular non-virulent, said strain belonging to the genus Staphylococcus, in particular to the species Staphylococcus aureus. , said method comprising a step of total or partial deletion of the sprD gene in the genome of a bacterial strain of the genus Staphylococcus, in particular a total deletion of the sprD gene. The total or partial deletion of the sprD gene may be carried out by homologous recombination, preferably by the introduction into said strain of an isolated polynucleotide comprising at its 5 'and 3' ends respectively the nucleotide sequences SEQ ID No. 6 and SEQ ID # 7. Such an introduction can be carried out for example by electroporation. The present invention also relates to a method for in vitro or ex vivo selection or identification of compounds for the prevention and / or treatment of a staphylococcal infection, comprising the following steps; a) introducing or bringing into contact a test compound in or with a bacterial strain expressing the sprD gene or with transcripts SprD; b) Determining the ability of the test compound to complex, in particular to hybridize, with the transcripts SprD; and / or c) determining the ability of the test compound to inhibit transcription of the sprD gene; and optionally additionally d) the selection of compounds capable of complexing with the transcripts SprD and / or of inhibiting the transcription of the gene sprD; and optionally further e) contacting or introducing the test compound selected in step d) with or into a virulent bacterial strain belonging to the genus Staphylococcus; f) determining the ability of the test compound to decrease or eliminate the virulence of said strain; and optionally further g) selecting the test compounds capable of decreasing or eliminating the virulence of said strain. The term "compound capable of complexing" with transcripts SprD, any compound capable of forming a complex with the transcripts SprD, in particular able to hybridize with said transcripts. Said compounds can be in particular proteins, polynucleotides such as a DNA molecule or an RNA molecule. In particular, said compound may be antisense RNA, siRNA, shRNA, LNA, PNA. The ability of a compound to form a complex, in particular to hybridize with the transcripts SprD can be determined by any technique well known to those skilled in the art, such as by the detection of the complex that may be formed between said compound and transcripts sprD. As an example of such a technique, mention may be made of gel retardation techniques, Northern blotting, RT-PCR. The term "compound capable of inhibiting the transcription of the gene SprD" means any molecule capable of inhibiting by at least 20%, in particular by at least 35% and especially at least 50%, the transcription of the gene. sprD, relative to the transcription rate of the sprD gene in the absence of said compound. The inhibition of transcripts SprD can be determined by tests well known to those skilled in the art such as by Northern blot using at least one probe specific for said transcript or by RT-PCR using at least two specific primers of said transcript. . The ability of the test compound to reduce or eliminate the virulence of a strain can be determined using techniques well known to those skilled in the art and in particular by the technique as described in point I.3 of the examples below. , using a mouse model for example intravenous spicemia. For example, it is possible to inoculate in mice a bacterial suspension comprising a virulent strain of the genus Staphylococcus into which said test compound has been introduced and by observing the state (in particular survival or otherwise) of the mice over time in comparison with mice inoculated with a non-pathogenic composition as a control. The introduction of the test compound into a bacterial strain can be carried out by any technique conventionally known to a person skilled in the art, such as by transformation, transfection, for example by an electroporator.
On entend par souche virulente du genre Staphylococcus, une souche pathogène, notamment qui exprime le gène sprD, en particulier de séquence SEQ ID N°1. Ledit procédé selon l'invention présente l'avantage de permettre la sélection ou l'identification de composés pour la prévention et/ou le traitement d'une infection staphylococcique qui contrairement aux médicaments putatifs permettent d'avoir une action ciblée sur les bactéries du genre Staphylococcus, y compris les souches résistantes aux antibiotiques, optimisant ainsi leur action et limitant les risques d'effets secondaires. The term "virulent strain of the genus Staphylococcus" is intended to mean a pathogenic strain, in particular which expresses the SprD gene, in particular of sequence SEQ ID No. 1. Said method according to the invention has the advantage of allowing the selection or the identification of compounds for the prevention and / or the treatment of a staphylococcal infection which unlike the putative drugs allow to have a targeted action on the bacteria of the genus Staphylococcus, including strains resistant to antibiotics, optimizing their action and limiting the risk of side effects.
La présente invention concerne également un procédé pour la sélection ou l'identification in vitro ou ex vivo de composés capables d'inhiber l'accumulation des transcrits sprD et/ou la transcription du gène sprD, comprenant les étapes suivantes ; i) l'introduction ou la mise en contact d'un composé test dans ou avec 15 une souche bactérienne exprimant le gène sprD ou avec des transcrits sprD ; ii) La détermination de la capacité du composé test à complexer, en particulier à s'hybrider, avec les transcrits sprD ; et/ou iii) la détermination de la capacité du composé test à inhiber la transcription du gène sprD ; et éventuellement 20 iv) la sélection des composés capables de complexer avec les transcrits sprD et/ou d'inhiber la transcription du gène sprD ; et éventuellement v) la mise en contact ou l'introduction du composé test sélectionné à l'étape d) avec ou dans une souche bactérienne virulente appartenant au genre Staphylococcus ; 25 vi) la détermination de la capacité du composé test à diminuer ou à supprimer la virulence de ladite souche ; et éventuellement vii) la sélection des composés tests capables de diminuer ou supprimer la virulence de ladite souche. The present invention also relates to a method for the in vitro or ex vivo selection or identification of compounds capable of inhibiting the accumulation of transcripts SprD and / or the transcription of the gene sprD, comprising the following steps; i) introducing or bringing into contact a test compound in or with a bacterial strain expressing the sprD gene or with sprD transcripts; ii) Determining the ability of the test compound to complex, in particular to hybridize, with the transcripts SprD; and / or iii) determining the ability of the test compound to inhibit transcription of the sprD gene; and optionally iv) selecting compounds capable of complexing with the transcripts and / or inhibiting the transcription of the sprD gene; and optionally v) contacting or introducing the test compound selected in step d) with or into a virulent bacterial strain belonging to the genus Staphylococcus; Vi) determining the ability of the test compound to decrease or eliminate the virulence of said strain; and optionally vii) selecting the test compounds capable of reducing or eliminating the virulence of said strain.
Ladite souche bactérienne exprimant le gène sprD dans les étapes a) et i) des procédés selon l'invention peut être notamment une souche appartenant au genre Staphylococcus dont le génome comprend le gène sprD notamment de séquence SEQ ID N°1, de préférence une souche appartenant à l'espèce Staphylococcus aureus. Ladite souche bactérienne exprimant le gène sprD dans les étapes a) et i) des procédés selon l'invention peut être également une souche bactérienne n'appartenant pas au genre Staphylococcus et par exemple qui a été transformée avec le gène sprD, notamment de séquence SEQ ID N°1. La présente invention concerne également un composé susceptible d'être obtenu par au moins l'un des procédés de sélection ou d'identification selon l'invention, en particulier en tant que médicament et tout particulièrement pour la prévention et/ou le traitement d'une infection staphylococcique. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront au regard des exemples qui suivent. Said bacterial strain expressing the gene sprD in steps a) and i) processes according to the invention can be in particular a strain belonging to the genus Staphylococcus whose genome comprises the gene sprD in particular of sequence SEQ ID No. 1, preferably a strain belonging to the species Staphylococcus aureus. Said bacterial strain expressing the gene sprD in steps a) and i) processes according to the invention may also be a bacterial strain not belonging to the genus Staphylococcus and for example that has been transformed with the gene sprD, in particular of sequence SEQ ID N ° 1. The present invention also relates to a compound obtainable by at least one of the selection or identification methods according to the invention, in particular as a medicament and particularly for the prevention and / or treatment of Staphylococcal infection Other advantages and features of the invention will become apparent from the following examples.
Ces exemples sont donnés à titre illustratif et non limitatif. La Figure lA représente l'accumulation du transcrit SprD à différentes phases de croissance pour une culture de S. aureus N315 (agr-) et pour une culture de S. aureus RN1 (agr+). L'accumulation de l'ARNr 5S est utilisée comme témoin de charge. Pour la culture de S. aureus N315 (agr-) les ARN totaux ont été extraits lorsque la DO à 600 nm est égale 0,25 ; 0,7 ; 1,8 ; 4,5 ; 8,9 ; 12 ; 20 et 21. Pour la culture de S. aureus RN1 (agr+) les ARN totaux ont été extraits lorsque la DO à 600 nm est égale à 0,2 ; 0,7 ; 1,1 ; 4,0 ; 8,8 ; 14,3 et 17,2. Cinq µg d'ARN totaux est chargé par puit. La sonde utilisée est une sonde spécifique du transcrit SprD. These examples are given for illustrative and not limiting. Figure 1A shows the accumulation of the SprD transcript at different growth phases for a culture of S. aureus N315 (agr-) and for a culture of S. aureus RN1 (agr +). The accumulation of 5S rRNA is used as a charge control. For culturing S. aureus N315 (agr-) the total RNAs were extracted when the OD at 600 nm equals 0.25; 0.7; 1.8; 4.5; 8.9; 12; 20 and 21. For culture of S. aureus RN1 (agr +) the total RNAs were extracted when the OD at 600 nm equals 0.2; 0.7; 1.1; 4.0; 8.8; 14.3 and 17.2. Five μg of total RNA is loaded per well. The probe used is a specific probe of the transcript SprD.
La Figure 1B illustre l'accumulation du transcrit SprD pour une culture de S. aureus N315 (agr-), pour une culture de S. aureus RN1 (agr+), pour une culture de S. aureus N315 (agr-) délétée du gène SprD, pour une culture de S. aureus RN1 (agr+) délétée du gène SprD et pour une culture de S. aureus N315 (agrdélétée du gène SprD complémentée. L'accumulation de l'ARNr 5S est utilisée comme témoin de charge. Cinq µg d'ARN totaux est chargé par puits. La sonde utilisée est une sonde spécifique du transcrit SprD. La Figure 2(A-B) illustre : Figure 2A : la virulence d'une culture de S. aureus N315 (agr-), la virulence d'une culture de S. aureus N315 (agr-) délétée du gène SprD et la virulence d'une culture de S. aureus N315 (agr-) délétée du gène sprD complémentée. Ce graphique donne le pourcentage d'animaux vivants en fonction du temps écoulé à partir de l'infection des animaux par une culture de S. aureus N315 (agr-), culture de S. aureus N315 (agr-) délétée du gène sprD ou une culture de S. aureus N315 (agr-) délétée du gène SprD complémentée. Figure 2B : la virulence d'une culture de S. aureus RN1 (agr+) et la virulence d'une culture de S. aureus R N1 (agr+) délétée du gène sprD. Ce graphique donne le pourcentage d'animaux vivants en fonction du temps écoulé à partir de l'infection des animaux par une culture de S. aureus RN1 (agr+) ou culture de S. aureus R N1 (agr+) délétée du gène sprD. La figure 3 représente les résultats du comptage bactérien réalisé sur les reins prélevés chez des animaux infectés par une culture de S. aureus N315 (agr-), une culture de S. aureus N315 (agr-) délétée du gène sprD ou une culture de S. aureus N315 (agr-) délétée du gène sprD complémentée. Le prélèvement des reins et le comptage bactérien sont réalisés 6 jours après l'infection des animaux. FIG. 1B illustrates the accumulation of the SprD transcript for a culture of S. aureus N315 (agr-), for a culture of S. aureus RN1 (agr +), for a culture of S. aureus N315 (agr-) deleted from the gene SprD, for a culture of S. aureus RN1 (agr +) deleted from the SprD gene and for a culture of S. aureus N315 (aggregated with the complemented SprD gene) The accumulation of 5S rRNA is used as a load control. total RNA is loaded per well The probe used is a specific probe of the SprD transcript Figure 2 (AB) illustrates: Figure 2A: the virulence of a culture of S. aureus N315 (agr-), the virulence of a culture of S. aureus N315 (agr-) deleted from the SprD gene and the virulence of a culture of S. aureus N315 (agr-) deleted complemented sprD gene.This graph gives the percentage of live animals according to the elapsed time from infection of animals by culture of S. aureus N315 (agr-), culture of S. aureus N315 (agr-) deleted ee of the sprD gene or a culture of S. aureus N315 (agr-) deleted from the complemented SprD gene. Figure 2B: the virulence of a culture of S. aureus RN1 (agr +) and the virulence of a culture of S. aureus R N1 (agr +) deleted from the gene sprD. This graph gives the percentage of live animals as a function of the time elapsed from the infection of the animals by a culture of S. aureus RN1 (agr +) or culture of S. aureus R N1 (agr +) deleted from the gene sprD. FIG. 3 represents the results of the bacterial count carried out on the kidneys taken from animals infected by a culture of S. aureus N315 (agr-), a culture of S. aureus N315 (agr-) deleted from the sprD gene or a culture of S. aureus N315 (agr-) deleted from complemented sprD gene. Kidney removal and bacterial counts are performed 6 days after infection of the animals.
EXEMPLES 1. Matériels et méthodes 1.1 Souches et plasmides Les souches de S. aureus et les plasmides utilisés dans cette étude sont énumérés dans le tableau 1. Les souches de S. aureus ont été cultivées de manière habituelle à 37 °C dans un bouillon d'infusion de cerveau et de coeur (BHI, Oxoid). Si nécessaire, les inventeurs ont utilisé du chloramphénicol et de l'érythromycine à raison de 10 µg/ml. La souche DH5u d'E. Coli a été utilisée en tant qu'hôte bactérien pour la construction du plasmide. Les souches d'E. Coli ont été cultivées dans un milieu de Luria-Bertani (LB). Dans le plasmide pCN38-sprD, le gène codant pour sprD est exprimé sous le contrôle de son propre promoteur. Pour construire ce plasmide, sprD avec 40 nucléotides en amont et 35 nucléotides en aval a été amplifié par une PCR à partir de l'ARN génomique de la souche N315 de S. aureus en tant que fragment de 217 paires de bases avec des sites de restriction flanquants Pst I et EcoR I. Le produit de la PCR a été cloné entre ces deux sites dans le vecteur pCN38 à faible nombre de copies (Charpentier et al, 2004). EXAMPLES 1. Materials and Methods 1.1 Strains and Plasmids The strains of S. aureus and the plasmids used in this study are listed in Table 1. Strains of S. aureus were grown in the usual manner at 37 ° C. in a broth. Brain and heart infusion (BHI, Oxoid). If necessary, the inventors used chloramphenicol and erythromycin at a rate of 10 μg / ml. The DH5u strain of E. Coli was used as a bacterial host for the construction of the plasmid. Strains of E. Coli were grown in a medium of Luria-Bertani (LB). In plasmid pCN38-SprD, the gene encoding SprD is expressed under the control of its own promoter. To construct this plasmid, sprD with 40 nucleotides upstream and 35 nucleotides downstream was amplified by PCR from genomic RNA of S. aureus strain N315 as a fragment of 217 base pairs with Pst I and EcoR I flanking restriction. The PCR product was cloned between these two sites in the low copy number vector pCN38 (Charpentier et al, 2004).
Dans le plasmide pBT2AsprD, le gène de résistance à l'érythromycine est cloné en 3' d'une séquence nucléotidique de 1010 pb correspondant aux 1010 pb en amont du gène sprD et en 5' d'une séquence nucléotidique de 813 pb correspondant aux 813 pb en aval du gène sprD. Pour construire ce plasmide, le fragment d'ADN de 1010 pb en amont du gène SprD et le fragment d'ADN de 813 pb en aval du gène SprD ont été amplifiés par une PCR à partir de l'ADN génomique de la souche N315 de S. aureus. Les amorces sens et antisens utilisées pour la PCR permettent d'obtenir un amplicon d'environ 1000 pb présentant respectivement à ses extrémités 5' les sites de restriction Xbal. Les amorces utilisées sont les suivantes : Amorce sens : TCGCTCTAGAGAATTCGTGGACAACGTCGTTATATAGCG Amorce antisens : GCCCGGATCCAAGGTAATATTAACATAAAATGGCTAC et un amplicon d'environ 800 pb présentant respectivement à ses extrémités 5' les sites de restrictions EcoRI. Les amorces utilisées sont les suivantes : Amorce sens : GCGGCGCTCGAGTCTATAAATACAATAAGGTATGTCAATTTG Amorce antisens : AGCGGAGCTCGAATTCGAAGGGTGTGTATTGTTATTTACCTA La cassette erythromycine a été amplifiée par PCR avec les amorces suivantes : Amorce sens :GCAATAGTAGCCATTTTATGTTAATATTACCTTGGATCCGGGCCC ACCTAGGAATTGAAT Amorce antisens :ATCAAATTGACATACCTTATTGTATTTATAGACTCGAGCGCCG CGGAAAACTGGT Pour obtenir le fragment d'environ 3kb constitué du 5' sprD/cassette erythromycine/3' sprD, les trois produits de PCR (5' sprD, cassette erythromycine et 3' sprD) obtenus précédemment ont été mélangées et amplifiés avec les amorces suivantes : In the plasmid pBT2AsprD, the erythromycin resistance gene is cloned in 3 'of a nucleotide sequence of 1010 bp corresponding to the 1010 bp upstream of the gene SprD and 5' of a nucleotide sequence of 813 bp corresponding to the 813 pb downstream of the sprD gene. To construct this plasmid, the 1010 bp DNA fragment upstream of the SprD gene and the 813 bp DNA fragment downstream of the SprD gene were amplified by PCR from the genomic DNA of strain N315 from S. aureus. The sense and antisense primers used for the PCR make it possible to obtain an amplicon of approximately 1000 bp respectively presenting at its 5 'ends the Xbal restriction sites. The primers used are the following: sense primer: TCGCTCTAGAGAATTCGTGGACAACGTCGTTATATAGCG Antisense primer: GCCCGGATCCAAGGTAATATTAACATAAAATGGCTAC and an amplicon of approximately 800 bp respectively presenting at its 5 'ends the EcoRI restriction sites. The primers used are: forward primer: reverse primer GCGGCGCTCGAGTCTATAAATACAATAAGGTATGTCAATTTG: erythromycin AGCGGAGCTCGAATTCGAAGGGTGTGTATTGTTATTTACCTA The cassette was amplified by PCR with the following primers: Forward primer: Reverse primer GCAATAGTAGCCATTTTATGTTAATATTACCTTGGATCCGGGCCC ACCTAGGAATTGAAT: ATCAAATTGACATACCTTATTGTATTTATAGACTCGAGCGCCG CGGAAAACTGGT To obtain the fragment of approximately 3kb consisting of 5 ' SprD / Erythromycin cassette / 3 'SprD, the three PCR products (5' SprD, Erythromycin cassette and 3 'SprD) obtained previously were mixed and amplified with the following primers:
Amorce sens : TCGCTCTAGAGAATTCGTGGACAACGTCGTTATATAGCG 15 Amorce antisens : AGCGGAGCTCGAATTCGAAGGGTGTGTATTGTTATTTACCTA Primer meaning: TCGCTCTAGAGAATTCGTGGACAACGTCGTTATATAGCG 15 Antisense primer: AGCGGAGCTCGAATTCGAAGGGTGTGTATTGTTATTTACCTA
Les amplicons obtenus sont clonés dans le vecteur pGEM-T (PROMEGA), ce vecteur est déjà préparé avec une thymidine (T) aux extrémités 3' terminales 20 permettant ainsi de cloner les produits de PCR pour lesquels un A est ajouté par la DNA polymérase pendant la PCR. Après digestion avec les enzymes de restriction Xbal et EcoRI, le fragment digéré et purifié est cloné entre les sites Xbal-EcoRI du vecteur plasmidique pBT2. Le plasmide pBT2AsprD est utilisé pour transformer une souche bactérienne 25 de S. aureus, la souche RN44220, qui est utilisée comme une cellule hôte intermédiaire puisqu'elle va favoriser l'intégration du gène de résistance à l'érythromycine par recombinaison homologue dans le génome de bactéries S. aureus N315 ou RN1, à la place du gène sprD. Le remplacement du gène sprD par la cassette d'expression du gène de 30 résistance à l'érythromycine est testé par PCR pour les colonies sensibles au chloramphénicol (résultats non présentés). La délétion du gène sprD dans ces bactéries est confimée par l'analyse par Northern Blot de l'accumulation du transcrit SprD. The amplicons obtained are cloned in the pGEM-T vector (PROMEGA), this vector is already prepared with a thymidine (T) at the 3 'end ends thus making it possible to clone the PCR products for which an A is added by the DNA polymerase. during the PCR. After digestion with the XbaI and EcoRI restriction enzymes, the digested and purified fragment is cloned between the XbaI-EcoRI sites of the plasmid vector pBT2. Plasmid pBT2AsprD is used to transform a S. aureus bacterial strain, strain RN44220, which is used as an intermediate host cell since it will promote the integration of the erythromycin resistance gene by homologous recombination into the genome of S. aureus N315 or RN1 bacteria, instead of the sprD gene. Replacement of the sprD gene with the erythromycin resistance gene expression cassette is PCR tested for chloramphenicol sensitive colonies (results not shown). The deletion of the SprD gene in these bacteria is confirmed by Northern Blot analysis of the accumulation of the SprD transcript.
Sambrook et al. 1989 Dérivé défectueux de restriction Kreiswirth et al. 1983 de 8325-4 Vecteur à faible nombre de copies (Amer dans E coli et Emr dans S. Charpentier et al. 2004 aureus) pCN38 avec le gène SprD sous le contrôle de son promoteur endogène Vecteur à faible nombre de copies (Amer dans E coli et réplication thermo-sensible et Cm dans S. aureusl pBT2 avec une cassette d'expression du gène de résistance à l'érythromycine cloné entre une région de 1000 pb en amont du gène sprD et une région de 800 pb en aval du gène sprD Tableau 1 Sambrook et al. 1989 Defective Derivative Derivative Kreiswirth et al. 1983 of 8325-4 Low copy number vector (Bitter in E coli and Emr in S. Charpentier et al., 2004 aureus) pCN38 with the SprD gene under the control of its endogenous low copy vector promoter (Bitter in E coli and heat-sensitive replication and Cm in S. aureusl pBT2 with an expression cassette of the erythromycin resistance gene cloned between a 1000 bp region upstream of the sprD gene and a region of 800 bp downstream of the sprD gene Table 1
1.2 Isolation de l'ARN et Northern blots Les ARN totaux ont été préparés à partir des phases de croissance exponentielle (DO600 = 2,0) ou stationnaire (DO600 = 5,0) de diverses souches de S. aureus comme décrit dans Oh et So (2003). Pour l'ARN 5S et d'autres ARN, des Northern blots ont été effectués avec 5 ug d'ARN totaux dénaturés et purifiés sur gel PAGE 8 % dénaturant, comme décrit dans Pichon et Felden (2005). 1.3 Étude de la délétion du gène sprD La virulence de la souche S. aureus N315 (agr-), de la souche S. aureus N315 (agr-) délétée du gène sprD et de la souche S. aureus N315 (agr-) délétée du E. coli DH5î S.aureus RN4220 N315 RN1 1.2 Isolation of RNA and Northern blots Total RNAs were prepared from the exponential (OD600 = 2.0) or stationary (OD600 = 5.0) growth phases of various S. aureus strains as described in Oh and So (2003). For 5S RNA and other RNAs, Northern blots were performed with 5 μg of denaturing PAGE denaturing gel-denatured total RNA as described in Pichon and Felden (2005). 1.3 Study of the deletion of the sprD gene The virulence of the S. aureus strain N315 (agr-), the S. aureus strain N315 (agr-) deleted from the sprD gene and the S. aureus strain N315 (agr-) deleted E. coli DH5I S.aureus RN4220 N315 RN1
Plasmides pCN51pCN38 Plasmids pCN51pCN38
pCN38-sprD pBT2 pBT2AsprD Cette étude pCN38-sprD pBT2 pBT2AsprD This study
(Bruckner, 1997, FEMS Microbiol Lett. 151: 1-8) (Bruckner, 1997, FEMS Microbiol Lett., 151: 1-8)
Cette étude gène sprD complémentée ont été analysées en utilisant un modèle murin de septicémie intraveineuse. Des lots de 10 souris suisses femelles âgées de 6 à 8 semaines (Charles River Laboratories, L'Arbresle, France) ont été inoculés avec 300 gL d'une suspension bactérienne contenant 109 cellules de S. aureus dans 0,9 % de NaCl. Les souris ont été infectées avec la souche S. aureus N315 (agr-), avec la souche S. aureus N315 (agr-) délétée du gène sprD ou avec la souche S. aureus N315 (agr-) délétée du gène SprD complémentée. D'autres souris ont été infectées avec la souche S. aureus RN1 (agr+) ou avec la souche S. aureus RN1 (agr+) délétée du gène sprD. La survie des souris infectées a été analysée pendant 21 jours, et la significativité des différences entre les différents groupes infectés a été analysée par le test U de Mann-Withney. Une différence est considérée comme significative lorsque la valeur P est inférieure à 0,05. Trois autres groupes de 5 souris ont été infectées avec 5 x 109 bactéries. Un groupe de souris a été infecté avec la souche S. aureus N315 (agr-), le deuxième groupe de souris a été infecté avec la souche S. aureus N315 (agr-) délétée du gène sprD et le dernier groupe de souris a été infecté avec la souche S. aureus N315 (agr-) délétée du gène sprD complémentée. Six jours après inoculation, les souris ont été sacrifiées et leurs reins prélevés. Les organes prélevés ont été ensuite homogénéisés, dilués dans une solution de 0,9 % NaCl et étalés sur un mileu agar sand 5 % pour le comptage bactérien. This gene-supplemented sprD study was analyzed using a murine model of intravenous septicemia. Lots of 10 6- to 8-week old Swiss female mice (Charles River Laboratories, L'Arbresle, France) were inoculated with 300 μl of a bacterial suspension containing 109 S. aureus cells in 0.9% NaCl. The mice were infected with S. aureus strain N315 (agr-), with S. aureus strain N315 (agr-) deleted from the sprD gene or with S. aureus strain N315 (agr-) deleted from the complemented SprD gene. Other mice were infected with the S. aureus RN1 strain (agr +) or with the S. aureus RN1 (agr +) strain deleted from the sprD gene. The survival of the infected mice was analyzed for 21 days, and the significance of the differences between the different infected groups was analyzed by the Mann-Withney U test. A difference is considered significant when the P value is less than 0.05. Three other groups of 5 mice were infected with 5 x 109 bacteria. One group of mice was infected with S. aureus strain N315 (agr-), the second group of mice was infected with S. aureus strain N315 (agr-) deleted from the sprD gene and the last group of mice was infected. infected with S. aureus strain N315 (agr-) deleted complemented sprD gene. Six days after inoculation, the mice were sacrificed and their kidneys removed. The organs removed were then homogenized, diluted in a solution of 0.9% NaCl and spread on a medium agar sand 5% for the bacterial count.
II. Résultats SprD est impliqué dans la virulence des souches bactériennes S.aureus Pour étudier la fonction de sprD chez les bactéries S. aureus N315 (agr-) et RN1 (agr+), le gène sprD a été substitué, par recombinaison homologue, par une cassette d'expression comprenant un gène de résistance à l'érythromycine. Dans les souches mutantes ainsi obtenues (A en Fig. lB), aucun transcrit SprD n'a pu être détecté par Norhern Blot. L'expression de SprD est rétablie dans la souche mutante S. aureus N315 (agr-) délétée par complémentation avec un plasmide capable d'exprimer SprD sous le contrôle de son promoteur endogène (A + SprD en Fig. lB). Des souris ont été infectées avec (Fig. 2A et 2B) : la souche S. aureus N315 (agr-), la souche S. aureus N315 (agr-) délétée du gène SprD, la souche S. aureus N315 (agr-) délétée du gène SprD complémentée, la souche S. aureus RN1 (agr+), la souche S. aureus RN1 (agr+) délétée du gène SprD. II. Results SprD is involved in the virulence of S.aureus bacterial strains To study the function of sprD in S. aureus N315 (agr-) and RN1 (agr +) bacteria, the sprD gene was substituted, by homologous recombination, by a cassette expression comprising an erythromycin resistance gene. In the mutant strains thus obtained (A in Fig. 1B), no SprD transcript could be detected by Norhern Blot. The expression of SprD is restored in the S. aureus N315 mutant strain (agr-) deleted by complementation with a plasmid capable of expressing SprD under the control of its endogenous promoter (A + SprD in Fig. 1B). Mice were infected with (Fig. 2A and 2B): S. aureus strain N315 (agr-), S. aureus strain N315 (agr-) deleted from the SprD gene, S. aureus strain N315 (agr-) deletion of the complemented SprD gene, strain S. aureus RN1 (agr +), S. aureus strain RN1 (agr +) deleted from the SprD gene.
La survie des souris a été étudiée. Les résultats obtenus montrent que les souris inoculées avec la souche S. aureus N315 (agr-) délétée du gène SprD sont tous vivants au 21ème jour post-infection (sprD- en Fig. 2A et 2B) alors que les animaux inoculés avec la souche S. aureus N315 (agr-) (wild-type en Fig. 2A) sont toutes mortes 16 jours après infection. Ainsi, il semble qu'en absence de transcrit sprD, la virulence des bactéries est inhibée voire supprimée. Les résultats montrent également que pour les souris inoculées avec la souche S. aureus N315 (agr-) délétée du gène SprD complémentée, seulement la moitié des animaux survivent 21 jours après l'infection (sprD- complemented en Fig. 2A), indiquant que la virulence peut être rétablie la souche S. aureus N315 (agr-) délétée du gène SprD par transfection d'un vecteur plasmidique capable d'exprimer le gène sprD. Les résultats obtenus montrent égelement que les souris inoculées avec la souche S. aureus RN1 (agr+) délétée du gène SprD (sprD- en Fig. 2B) survivent plus longtemps à une infection par rapport à des souries inoculées avec la souche S. aureus RN1 (agr+) (wild-type en Fig. 2B). Les souris inoculées avec la souche S. aureus RN1 (agr+) (wild-type en Fig. 2B) sont toutes mortes 5 jours après infection tandis que les souris inoculées avec la souche S. aureus RN1 (agr+) délétée du gène SprD (sprD- en Fig. 2B) sont toutes mortes 11 jours après infection. Ces résultats confirment donc qu'en absence de transcrit sprD, la virulence des bactéries est inhibée voire supprimée. The survival of mice has been studied. The results obtained show that the mice inoculated with S. aureus strain N315 (agr-) deleted from the SprD gene are all alive on the 21st day post-infection (sprD- in Fig. 2A and 2B) whereas the animals inoculated with the strain S. aureus N315 (agr-) (wild-type in Fig. 2A) all died 16 days after infection. Thus, it seems that in the absence of transcript SprD, the virulence of bacteria is inhibited or suppressed. The results also show that for mice inoculated with the S. aureus N315 (agr-) deleted complement of the complemented SprD gene, only half of the animals survive 21 days after infection (sprD-complemented in Fig. 2A), indicating that the virulence can be restored S. aureus strain N315 (agr-) deleted from the SprD gene by transfection of a plasmid vector capable of expressing the gene sprD. The results obtained also show that the mice inoculated with the S. aureus RN1 (agr +) strain deleted from the SprD gene (SprD- in Fig. 2B) survive infection longer than mice inoculated with the S. aureus RN1 strain. (agr +) (wild-type in Fig. 2B). Mice inoculated with S. aureus RN1 strain (agr +) (wild-type in Fig. 2B) all died 5 days after infection whereas mice inoculated with S. aureus RN1 strain (agr +) deleted from the SprD gene (SprD - in Fig. 2B) all died 11 days after infection. These results therefore confirm that, in the absence of a SprD transcript, the virulence of the bacteria is inhibited or even eliminated.
D'autres résultats expérimentaux viennent soutenir ces conclusions. Notamment après 6 jours d'infection, les reins des souris infectées ont été prélevés et un comptage bactérien sur ces reins a été réalisé. Le comptage des bactéries viables dans les reins des animaux infectés montre qu'il y a moins de bactéries viables dans les reins prélevés chez des souris infectées avec la souche S. aureus N315 (agr-) délétée du gène sprD (AsprD en Fig. 3), par rapport aux reins prélevés chez des souris infectées avec la souche S. aureus N315 (agr-) (wild-type en Fig. 3) ou chez des souris infectées avec la souche S. aureus N315 (agrdélétée du gène sprD complémentée (AsprD complemented en Fig. 3). Les inventeurs sont ainsi les premiers à avoir mis en évidence le rôle majeur d'un petit ARN non codant, SprD, dans la virulence de S. aureus. Other experimental results support these conclusions. In particular, after 6 days of infection, the kidneys of the infected mice were removed and a bacterial count was performed on these kidneys. The counting of viable bacteria in the kidneys of infected animals shows that there are fewer viable bacteria in the kidneys taken from mice infected with S. aureus strain N315 (agr-) deleted from the sprD gene (AsprD in Fig. 3 ), compared to the kidneys taken from mice infected with the S. aureus strain N315 (agr-) (wild-type in Fig. 3) or in mice infected with the S. aureus strain N315 (aggregated with the complemented sprD gene ( AsprD complemented in Fig. 3), the inventors are thus the first to have demonstrated the major role of a small non-coding RNA, SprD, in the virulence of S. aureus.
Des expériences sont ont été réalisés afin d'étudier l'effet de l'expression d'un ARN antisens de SprD sur sa capacité à inhiber l'accumulation in vivo de l'ARN SprD, sa capacité à diminuer la virulence de différentes souches de Staphylocoques (RN1 et N315) et de déterminer la taille minimale de SprD capable d'inhiber la virulence ainsi que les séquences nécessaires et suffisantes des ARN antisens permettant d'observer une diminution au moins partielle du taux de transcrit SprD in vivo. De manière classique, des plasmides exprimant de manière constitutive ou induite un ARN antisens entier ou tronqué de séquences nucléotidiques plus ou moins étendues sont construits par des techniques connues de l'Homme du métier. Experiments were carried out to study the effect of the expression of an antisense RNA of SprD on its capacity to inhibit the in vivo accumulation of the SprD RNA, its capacity to decrease the virulence of different strains of Staphylococci (RN1 and N315) and determine the minimum size of SprD capable of inhibiting virulence as well as the necessary and sufficient sequences of antisense RNAs to observe at least a partial decrease in the level of SprD transcript in vivo. Conventionally, plasmids constitutively or induced expressing an antisense RNA whole or truncated nucleotide sequences more or less extensive are constructed by techniques known to those skilled in the art.
Des bactéries hôtes de Staphylococcus sont ensuite transformées avec chacune des constructions plasmidiques obtenues. Les bactéries transformées sont sélectionnées et leur capacité à inhiber l'accumulation in vivo de l'ARN SprD, sera vérifiée par Northern blots ainsi que sa capacité à diminuer virulence est testée tel que décrit précédemment. Staphylococcus host bacteria are then transformed with each of the plasmid constructs obtained. The transformed bacteria are selected and their ability to inhibit the in vivo accumulation of the SprD RNA, will be verified by Northern blots as well as its ability to decrease virulence is tested as previously described.
Des lots de souris suisses femelles âgées de 6 à 8 semaines (Charles River Laboratories, L'Arbresle, France) sont inoculés avec 300 gL d'une suspension bactérienne contenant 109 cellules de S. aureus dans 0,9 % de NaCl. Les souris sont infectées avec une souche S. aureus exprimant l'ARN antisens sprD entier, ou une souche S. aureus exprimant l'ARN antisens sprD délété d'un ou plusieurs domaines nucléotidiques ou une souche S. aureus exprimant l'ARN antisens sprD entier ou délété d'un ou plusieurs domaines nucléotidiques complémentée. La survie des souris infectées est analysée pendant 21 jours, et la significativité des différences entre les différents groupes infectés a été analysée par le test U de Mann-Withney. Une différence est considérée comme significative lorsque la valeur P est inférieure à 0,05. Lots of 6- to 8-week old Swiss female mice (Charles River Laboratories, L'Arbresle, France) are inoculated with 300 μl of a bacterial suspension containing 109 S. aureus cells in 0.9% NaCl. The mice are infected with a S. aureus strain expressing the entire antisense RNA sprD, or a S. aureus strain expressing the antisense RNA spD deleted from one or more nucleotide domains or a S. aureus strain expressing antisense RNA sprD. whole or deleted of one or more nucleotide domains complemented. The survival of the infected mice is analyzed for 21 days, and the significance of the differences between the different infected groups was analyzed by the Mann-Withney U test. A difference is considered significant when the P value is less than 0.05.
D'autres groupes de souris sont été infectées avec 5 x 109 bactéries. Un groupe de souris a été infecté avec la souche S. aureus exprimant l'ARN antisens sprD entier, d'autres groupes de souris ont été infectés avec des souches S. aureus exprimant l'ARN antisens sprD délété d'un ou plusieurs domaines nucléotidiques et d'autres groupes de souris ont été infectés avec des souches S. aureus exprimant l'ARN antisens sprD entier ou délété d'un ou plusieurs domaines nucléotidiques complémentées. Six jours après inoculation, les souris ont été sacrifiées et leurs reins prélevés. Les organes prélevés ont été ensuite homogénéisés, dilués dans une solution de 0,9 % NaCl et étalés sur un milieu agar sand 5 % pour le comptage bactérien. Other groups of mice were infected with 5x109 bacteria. One group of mice was infected with the S. aureus strain expressing whole antisense RNA, other groups of mice were infected with S. aureus strains expressing the antisense RNA deleted from one or more nucleotide domains and other groups of mice were infected with S. aureus strains expressing whole or deleted antisense RNA from one or more complemented nucleotide domains. Six days after inoculation, the mice were sacrificed and their kidneys removed. The organs removed were then homogenized, diluted in a solution of 0.9% NaCl and spread on a 5% agar medium for bacterial counting.
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