FR2806095A1 - Sequences polynucleotidiques purifiees de plantes et de levure codant pour des proteines qui interagissent avec les produits du genome des geminivirus - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet des séquences polynucléotidiques purifiées de plante codant des protéines qui interagissent avec les produits du génome du géminivirus et leur utilisation pour la préparation de plantes génétiquement modifiées résistantes au géminivirus.

Description

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SEQUENCES POLYNUCLEOTIDIQUES PURIFIEES DE PLANTES ET DE LEVURE CODANT POUR DES PROTEINES QUI INTERAGISSENT AVEC LES PRODUITS DU GENOME DES GEMINIVIRUS.

La présente invention concerne des séquences polynucléotidiques purifiées de plantes et de levure codant pour des protéines qui interagissent avec les produits du génome des géminivirus et qui sont susceptibles d'être nécessaires à l'infection des plantes par ce virus.

L'invention concerne aussi la préparation de plantes génétiquement modifiées pour résister au géminivirus, famille des Geminiviridae, et plus particulièrement au virus de l'enroulement jaunissant des feuilles de la tomate, aussi désigné TYLCV pour tomato yellow leaf curl virus .

TYLCV appartient au genre Begomovirus et est transmis par la mouche blanche Bemisia tabacs. Les géminivirus sont responsables de nombreuses maladies de la tomate et le TYLCV pose un problème économique grave puisqu'il entraîne jusqu'à 100 % de perte de rendement dans de nombreuses régions tropicales et subtropicales. Ce virus s'est maintenant répandu dans le bassin Méditerranéen, dont l'Italie et l'Espagne, où la perte de rendement au champ peut atteindre 80%, ainsi qu'en Amérique dont récemment la Floride où il menace l'industrie de la tomate. Les moyens de lutte contre la mouche blanche Bemisia tabaci ne se sont pour l'instant pas avérés efficaces.

On a proposé dans l'art antérieur des cultivars tolérants obtenus par amélioration classique et montrant des symptômes atténués ou retardés, mais pas de cultivars résistants. On a également proposé dans l'art antérieur des plantes transgéniques résistantes aux infections par les géminivirus basées sur l'introduction et/ou l'expression dans les plantes de séquences virales. On peut citer notamment les constructions génétiques comprenant des gènes

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de géminivirus proposées dans les demandes de brevet internationales PCT publiées sous les numéros W097/42316 et W097/39110.

L'introduction de séquences virales dans le génome de la tomate soulève cependant un certain nombre de problèmes notamment du fait des risques de recombinaison ou d'hétéroencapsidation.

La présente invention vise précisément à pallier cet inconvénient en proposant des gènes de plantes dont les produits interagissent avec une ou plusieurs protéines du TYLCV. Ces gènes sont donc particulièrement utiles pour contrôler l'infection virale chez une plante sans y introduire de gènes viraux.

Cela fait un siècle que les virus ont été reconnus pour la première fois comme des entités pathogènes. Depuis, des efforts considérables ont été entrepris pour comprendre leur biologie : comment ils pénètrent dans la cellule, et une fois à l'intérieur, comment ils exploitent les processus de l'hôte pour se répliquer et envahir l'organisme. Il est parfaitement établi maintenant que la réplication virale dans la cellule infectée nécessite la participation de facteurs cellulaires. C'est particulièrement le cas des virus possédant des petits génomes qui codent seulement pour quelques protéines. Les virus animaux à ADN associés aux tumeurs, par exemple, exploitent la machinerie cellulaire pour accomplir leurs processus de transcription et de réplication. De plus, une ou plusieurs protéines codées par ces virus sont capables d'empiéter sur la physiologie de la cellule infectée afin de créer un environnement cellulaire approprié à la réplication virale. Un exemple typique est celui des oncoprotéines de ces virus, comme l'antigène T du SV40, la protéine ElA des adénovirus ou la protéine E7 des virus du papillome humains, qui activent le cycle

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cellulaire dans la cellule infectée en interférant avec la voie du rétinoblastome, une tumeur de l'oeil qui affecte les jeunes enfants.

La situation semble être analogue dans le cas des Geminiviridae, une famille unique de virus végétaux à ADN dont les particules se présentent sous la forme de deux sphéroïdes jumelés et dont le génome consiste en une ou deux petites molécules d'ADN monocaténaires circulaires (Lazarowitz, 1992). Le TYLCV appartient au genre Begomovirus bien qu'il ne possède qu'un seul composant génomique (Kheyr-Pour & coll., 1991 ; Navot & coll., 1991).

La figure 1 en annexe représente le génome du TYLCV, lequel contient six phases ouvertes de lecture (ORF) qui se recouvrent partiellement (Kheyr-Pour & coll., 1991) - deux sur le brin du virion (+), le gène de la capside CP et un gène nécessaire au développement d'une infection systémique dans l'hôte, V2 (Wartig & coll., 1997), et - quatre sur le brin complémentaire (-), le gène Cl (Rep) nécessaire à la réplication, le gène C2 considéré comme codant pour un activateur de transcription des gènes situés sur le brin (+) du virion (Noris & coll., 1996) et probablement impliqué dans le mouvement du virus (Wartig & coll., 1997), le gène C3 qui favorise l'accumulation d'ADN viral, et enfin le gène C4 qui intervient dans le mouvement du virus (Fig. 1) (Jupin & coll., 1994). Ces ORF sont séparés par une région intergénique (IR) de 300 nucléotides qui contient les éléments clés pour la réplication et la transcription du génome viral (Lazarowitz, 1992).

Pour comprendre les mécanismes moléculaires qui régissent les processus biologiques de la réplication et du mouvement des virus, il est nécessaire d'identifier, non seulement les acteurs de ces processus, mais aussi les

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interactions qui les régulent. Par exemple, la réplication de l'ADN des géminivirus a lieu dans le noyau des cellules infectées et, en raison de l'absence d'enzymes de réplication codées par le génome viral, nécessite les fonctions de la phase S du cycle cellulaire. Or la majorité des cellules de la feuille d'une plante sont complètement différenciées et ont quitté le cycle de division cellulaire et il n'est plus possible d'y détecter les enzymes de réplication de l'ADN ou l'antigène de prolifération nucléaire de la cellule (PCNA) qui s'associe avec certaines polymérases d'ADN et favorise leur processivité. Lorsque les géminivirus infectent ces cellules différenciées, la protéine Rep induit l'expression de protéines cellulaires associées à la phase S du cycle cellulaire, telles que le PCNA (Nagar & coll., 1995). La protéine Rep des géminivirus est donc capable de réactiver la machinerie de réplication de l'hôte au profit de la réplication de l'ADN viral.

La dépendance des géminivirus envers les protéines de l'hôte est analogue à la situation des virus animaux à ADN associés aux tumeurs, comme le SV40. Celui-ci crée un environnement cellulaire favorable à la réplication de l'ADN viral grâce à l'interaction d'une oncoprotéine codée par le génome viral avec la protéine du rétinoblastome (Rb), intervenant dans la régulation des cycles cellulaires. La protéine Rep des géminivirus forme de la même manière un complexe stable avec une protéine Rb de plante (Xie & coll., 1995). La séquestration de la protéine Rb de l'hôte par la protéine Rep du virus confirme le rôle de cette dernière dans la régulation du cycle cellulaire de l'hôte. Plus récemment, d'autres facteurs cellulaires interagissant avec la protéine Rep des géminivirus, les protéines GRAB, ont été également identifiés (Xie & coll., 1999). Bien que la fonction de ces protéines GRAB n'ait pas encore été élucidée, ces résultats

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illustrent l'importance et la complexité des interactions virus-hôte nécessaires à l'accomplissement du cycle viral.

Une observation particulièrement intéressante est que la surexpression de la protéine Rb ou des protéines GRAB dans la cellule végétale inhibe la réplication virale (Xie & coll., 1995, Xie & coll., 1999). L'identification des facteurs cellulaires qui interagissent avec le produit du génome viral ouvre donc de nouvelles opportunités de lutte contre les maladies virales.

Comme indiqué précédemment, la présente invention a pour objet des gènes de plantes et de levure dont les produits sont capables d'interagir avec une ou plusieurs protéines du TYLCV et qui sont donc particulièrement utiles pour développer de nouvelles stratégies pour rendre les plantes résistantes à l'infection virale.

En effet, les travaux réalisés dans le cadre de la présente invention ont permis d'identifier des protéines de la levure Schizosaccharomyces pombe et des plantes Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana et Lycopersicon esculentum qui interagissent avec l'une au moins des six protéines du génome du TYLCV : Rep,C2, C3, C4, CP et V2.

L'invention a donc pour objet une séquence polynucléotidique purifiée de plante ou de levure codant pour une protéine qui interagit avec l'un au moins des six produits du génome d'un géminivirus nécessaire à l'infection d'une plante par ce virus.

Des exemples de séquences polynucléotidiques utiles selon l'invention sont constituées par tout ou partie des gènes ou fragments de gènes rapportés dans le tableau de la figure 2 en annexe qui se réfère à la liste de séquences en annexe et aux numéros d'accès dans Genbank s'ils existent.

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Une première série de séquences polynucléotidiques codant une protéine nécessaire à une ou plusieurs des six protéines du génome d'un géminivirus pour permettre l'infection virale, selon l'invention, sont constituées par tout ou partie d'un gène choisi dans le groupe comprenant les gènes gip3-C2, gip6-C2, gip7-C3, gip8-C3, gip9-C3, gipll-C3, gipl2-C4, gipl4-CP, gipl5-CP, gip16-V2, gipl8-V2, gipl9-V2, gip21-V2 et gip22-V2.

Le fragment de gène gip3-C2 de A. thaliana code pour la protéine GIP3-C2 qui interagit avec la protéine C2 du TYLCV. SEQ ID NO:5 représente une séquence nucléotidique de A. thaliana comprenant la partie codante du fragment de gène gip3-C2 suivie de la portion 3' non codante. SEQ ID NO:6 représente la séquence en acides aminés du fragment de protéine GIP3-C2.

Le fragment de gène gip6-C2 de N. benthamiana code pour la protéine GIP6-C2 qui interagit avec la protéine C2 du TYLCV. La SEQ ID N0:11 représente une séquence nucléotidique de N. benthamiana comprenant la partie codante du fragment de gène gip6-C2 suivie de la portion 3' non codante. SEQ ID N0:12 représente la séquence en acides aminés du fragment de protéine GIP6-C2.

Le gène gip7-C3 de L. esculentum code pour la protéine PCNA-tom qui interagit avec la protéine C3 du TYLCV. SEQ ID N0:13 représente une séquence nucléotidique de L. esculentum comprenant la partie codante du gène gip7C3 suivie de la portion 3' non codante. SEQ ID N0:14 représente la séquence en acides aminés de la protéine PCNA-tom de L. esculentum.

Le fragment de gène gip 8-C3 code pour la protéine PCNA-ara de A. thaliana qui interagit avec la protéine C3 du TYLCV. SEQ ID N0:15 représente une séquence nucléotidique de A. thaliana comprenant la partie codante du gène gip8-C3 suivie de la portion 3' non codante. La SEQ

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ID N0:16 représente la séquence en acides aminés de la protéine PCNA-ara de A. thaliana.

Le fragment de gène gip9-C3 de A. thaliana code pour un fragment de la sous-unité delta du coatomer qui interagit avec la protéine C3 du TYLCV. SEQ ID N0:17 représente une séquence nucléotidique de A. thaliana comprenant la partie codante du fragment de gène gip9-C3 suivie de la portion 3' non codante. SEQ ID N0:18 représente la séquence en acides aminés du fragment de la sous-unité delta du coatomer de A. thaliana.

Le fragment de gène gipll-C3 de N. benthamiana code pour le fragment de protéine DNAJ qui interagit avec la protéine C3 du TYLCV. SEQ ID N0:21 représente une séquence nucléotidique de N. benthamiana comprenant la partie codante du fragment de gène gipll-C3 suivie de la portion 3' non codante. SEQ ID N0:22 représente la séquence en acides aminés du fragment de protéine DNAJ de N. benthamiana.

Le fragment de gène gipl2-C4 de A. thaliana code pour le fragment de protéine GIP12-C4 qui interagit avec la protéine C4 du TYLCV. SEQ ID N0:23 représente une séquence nucléotidique de A. thaliana comprenant la partie codante du fragment de gène gipl2-C4 suivie de la portion 3' non codante. SEQ ID N0:24 représente la séquence en acides aminés du fragment de protéine GIP12-C4 de A. thaliana.

Le fragment de gène gipl4-CP de N. benthamiana code pour le fragment de protéine 14-3-3 qui interagit avec la protéine CP du TYLCV. SEQ ID N0:27 représente une séquence nucléotidique de N. benthamiana comprenant la partie codante du fragment de gène gipl4-CP suivie de la portion 3' non codante. SEQ ID N0:28 représente la séquence en acides aminés du fragment de protéine 14-3-3 de N. benthamiana.

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Le fragment de gène gipl5-CP de N. benthamiana code pour la protéine GIP15-CP qui interagit avec la protéine CP du TYLCV. SEQ ID N0:29 représente une séquence nucléotidique de N. benthamiana comprenant la partie codante du fragment de gène gipl5-CP suivie de la portion 3' non codante. SEQ ID N0:30 représente la séquence en acides aminés du fragment de protéine GIP15-CP de N. benthamiana.

Le fragment de gène gip16-V2 de N. benthamiana code pour la protéine GIP16-V2 qui interagit avec la protéine V2 du TYLCV. SEQ ID N0:31 représente une séquence nucléotidique de N. benthamiana comprenant la partie codante du fragment de gène gipl6-V2 suivie de la portion 3' non codante. SEQ ID N0:32 représente la séquence en acides aminés du fragment de protéine GIP16-V2 de N. benthamiana.

Le fragment de gène gip18-V2 de A. thaliana code pour le fragment de protéine GIP18-V2 qui interagit avec la protéine V2 du TYLCV. SEQ ID N0:35 représente une séquence nucléotidique de A. thaliana comprenant la partie codante du fragment de gène gipl8-V2 suivie de la portion 3' non codante. SEQ ID N0:36 représente la séquence en acides aminés du fragment de protéine GIP18-V2 de A. thaliana.

Le fragment de gène gip19-V2 de A. thaliana code pour le fragment de protéine GIP19-V2 qui interagit avec la protéine V2 du TYLCV. SEQ ID N0:37 représente une séquence nucléotidique de A. thaliana comprenant la partie codante du fragment de gène gip19-V2 suivie de la portion 3' non codante. SEQ ID N0:38 représente la séquence en acides aminés du fragment de protéine GIP19-V2 de A. thaliana.

Le fragment de gène gip21-V2 N. benthamiana code pour la protéine GIP21-V2 qui interagit avec le fragment de protéine V2 du TYLCV. SEQ ID N0:41 représente

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une séquence nucléotidique de N. benthamiana comprenant la partie codante du fragment de gène gip21-V2 suivie de la portion 3' non codante. SEQ ID N0:42 représente la séquence en acides aminés du fragment de protéine GIP21-V2 N. benthamiana.

Le fragment de gène gip22-V2 N. benthamiana code pour le fragment de protéine GIP22-V2 qui interagit avec la protéine V2 du TYLCV. SEQ ID N0:43 représente une séquence nucléotidique de N. benthamiana comprenant la partie codante du fragment de gène gip22-V2 suivie de la portion 3' non codante. SEQ ID N0:44 représente la séquence en acides aminés du fragment de protéine GIP22-V2 N. benthamiana.

Il convient de remarquer qu'en ce qui concerne les gènes gip3-C2, gip9-C3, gipl6-V2 et gipl9-V2, les séquences des chromosomes contenant la séquence de ces gènes, interrompus par des introns, se trouvent dans les bases de données (respectivement AB005240, AB005245, AB007651, AC026636 comme indiqué dans le tableau de la figure 2). En conséquence, les travaux réalisés dans le cadre de la présente invention ont permis de définir les ORF de ces gènes qui n'ont donc jamais été décrits dans l'art antérieur.

De même, en ce qui concerne le gène gipl8-V2, la séquence du chromosome contenant la séquence de ce gène se trouve dans les bases de données (AC003027 comme indiqué dans le tableau de la figure 2). Cependant, la prédiction des ORF décrit dans l'art antérieur présente des inexactitudes et la séquence du gène gip18-V2 est différente de la séquence du gène prédit car certaines parties de la séquence sont considérées comme étant des introns alors qu'elles n'en sont pas.

La présente invention a donc pour objet une séquence polynucléotidique purifiée de plante codant une protéine dont la séquence en acides aminés est choisie dans

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le groupe comprenant les séquences en acides aminés représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO: 6, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:18, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:36, SEQ ID N0:38, SEQ ID N0:42 ou SEQ ID N0:44, un fragment ou une séquence substantiellement similaire de celle-ci.

L'invention se rapporte donc tout particulièrement à une séquence polynucléotidique constituée de tout ou partie d'une séquence polynucléotidique choisie parmi celles représentées dans la liste de séquence en annexe sous les numéros SEQ ID NO:5, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:17, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:27, SEQ ID N0:29, SEQ ID N0:31, SEQ ID N0:35, SEQ ID N0:37, SEQ ID N0:41 ou SEQ ID N0:43, une séquence complémentaire ou substantiellement similaire de celle-ci.

Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de la présente invention ont également permis d'identifier des gènes qui bien que déjà décrits dans l'art antérieur, n'avaient jamais été envisagés comme susceptibles de coder pour des protéines capables d'interagir avec les protéines des géminivirus et donc utiles pour rendre des plantes résistantes à ces virus. Une seconde série de séquences polynucléotidiques utiles selon l'invention sont constituées par tout ou partie d'un gène choisi dans le groupe comprenant les gènes SY 0487 (N accession Genbank D89128), T8K22.14 (N* accession Genbank AC004136), ajhl (N accession Genbank AF087413), T26F17.15 (N accession Genbank AC013482), F9Ll.33 (N accession Genbank AC007591), F6H11.170 (N accession Genbank AL021684), F2103.7 (N accession Genbank AC003027), et Cs26 (N accession Genbank AB003041).

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Le gène SY 0487 de S. pombe code pour la protéine similaire à la NDP-hexose pyrophosphorylase de S. cerevisiae qui interagit avec la protéine Rep du TYLCV. SEQ ID NO:1 représente une séquence nucléotidique de S. pombe comprenant la partie codante du gène SY 0487. SEQ ID NO:2 représente la séquence en acides aminés de la protéine de S. pombe similaire à la NDP-hexose pyrophosphorylase de S. cerevisiae.

Le gène T8K22.14 code pour la protéine putative de liaison au TBP qui interagit avec la protéine C2 du TYLCV. SEQ ID NO:3 représente une séquence nucléotidique de A. thaliana comprenant la partie codante du gène T8K22.14 suivie de la portion 3' non codante. SEQ ID NO:4 représente la séquence en acides aminés de la protéine putative de liaison au TBP.

Le gène ajhl code pour la protéine AJH1 qui interagit avec la protéine C2 du TYLCV. SEQ ID NO:7 représente une séquence nucléotidique de A. thaliana comprenant la partie codante du gène ajhl suivie de la portion 3' non codante. SEQ ID NO:8 représente la séquence en acides aminés de la protéine AJH1.

Le fragment de gène T26F17.15 de A . thal i ana code pour la protéine T26F17.15 qui interagit avec la protéine C2 du TYLCV. SEQ ID NO:9 représente une séquence nucléotidique de A. thaliana comprenant la partie codante du fragment de gène gip5-C2 suivie de la portion 3' non codante. SEQ ID N0:10 représente la séquence en acides aminés du fragment de protéine T26F17.15.

Le gène F9L1.33 code pour la protéine de la famille des glyoxalases qui interagit avec la protéine C3 du TYLCV. SEQ ID N0:19 représente une séquence nucléotidique de A. thaliana comprenant la partie codante du gène F9Ll.33 suivie de la portion 3' non codante. SEQ ID N0:20 représente la séquence en acides aminés de la protéine de la famille des glyoxalases.

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Le gène F6H11.170 code pour la protéine de type récepteur kinase qui interagit avec la protéine C4 du TYLCV. SEQ ID N0:25 représente une séquence nucléotidique de A. thaliana comprenant la partie codante du gène F6H11.170 suivie de la portion 3' non codante. SEQ ID N0:26 représente la séquence en acides aminés de la protéine de type récepteur kinase.

Le gène F2103.7 code pour la protéine hypothétique qui interagit avec la protéine V2 du TYLCV.

SEQ ID N0:33 représente une séquence nucléotidique de A. thaliana comprenant la partie codante du gène F2103. 7 suivie de la portion 3' non codante. SEQ ID N0:34 représente la séquence en acides aminés de la protéine hypothétique.

Le gène Cs26 code pour la protéine oacétylsérine (thiol) lyase qui interagit avec la protéine V2 du TYLCV. SEQ ID N0:39 représente une séquence nucléotidique de A. thaliana comprenant la partie codante du gène Cs26 suivie de la portion 3' non codante. SEQ ID N0:40 représente la séquence en acides aminés de la protéine o-acétylsérine (thiol) lyase.

La présente invention a donc pour objet une séquence polynucléotidique purifiée de plante ou de levure codant une protéine dont la séquence en acides aminés est choisie dans le groupe comprenant les séquences en acides aminés représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8, SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:26, SEQ ID N0:34 ou SEQ ID N0:40, un fragment ou une séquence substantiellement similaire de celle-ci.

L'invention se rapporte donc tout particulièrement à une séquence polynucléotidique constituée de tout ou partie d'une séquence polynucléotidique choisie parmi celles représentées dans la liste de séquence en annexe sous les numéros SEQ ID NO:1,

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SEQ ID N0:3, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:33 ou SEQ ID N0:39, une séquence complémentaire ou substantiellement similaire de celle-ci.

On entend par substantiellement similaire d'une protéine ou d'un fragment de protéine, une séquence en acides aminés présentant une ou plusieurs modifications telles que la substitution, la délétion ou l'insertion d'un ou plusieurs acides aminés qui n'affectent pas les propriétés fonctionnelles de la protéine ou du fragment de protéine dont elle dérive.

On entend aussi par substantiellement similaire d'une séquence polynucléotidique selon l'invention, une séquence présentant une ou plusieurs modifications de nucléotides qui conduisent à la substitution d'un ou plusieurs acides aminés sans affecter les propriétés fonctionnelles de la protéine ou du fragment de protéine codée par la séquence polynucléotidique dont elle dérive. Les altérations d'un gène qui résultent dans l'expression d'un acide aminé chimiquement équivalent à un site donné, mais qui n'affectent pas les propriétés fonctionnelles de la protéine codée par le gène, sont bien connues par l'homme de métier. Par exemple, un codon codant pour l'acide aminé alanine, un acide aminé hydrophobe, peut être substitué par un codon codant pour un autre résidu moins hydrophobe, comme la glycine, ou un autre résidu plus hydrophobe, comme la valine, la leucine ou l'isoleucine. Pareillement, des modifications qui résultent dans la substitution d'un résidu négativement chargé par un autre, comme l'acide aspartique pour l'acide glutamique, ou un résidu positivement chargé par un autre, comme la lysine pour l'arginine, sont présumées produire une protéine fonctionnellement équivalente. En outre, l'homme de métier sait que les séquences polynucléotidiques objet de la présente invention peuvent également être définies par leur

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capacité à s'hybrider, sous des conditions stringentes (0,1X SSC, 0,1% SDS, 65 C), avec les séquences de référence données dans la liste de séquences en annexe. De manière avantageuse, les séquences substantiellement similaires objets de la présente invention sont celles qui partagent au moins 80% d'identité avec les séquences de référence données dans la liste de séquences en annexe, de préférence au moins 90% d'identité, plus préférentiellement au moins 95% d'identité.

On entend aussi par substantiellement similaire , une séquence polynucléotidique présentant une ou plusieurs modifications de nucléotides qui n'affectent en rien la capacité de la séquence polynucléotidique ainsi modifiée d'altérer l'expression de gènes par la technique des antisens ou de la co-expression. On entend aussi par séquence polynucléotidique de plante ou de levure modifiée, une séquence polynucléotidique antisens. Il est bien connu de l'homme de métier que la suppression par antisens ou la co-suppression de l'expression de gènes peut être réalisée en utilisant une séquence nucléotidique représentant seulement une portion de l'entièreté d'un gène codant, ainsi que par une séquence nucléotidique partageant moins de 100 % d'identité avec le gène dont l'expression doit être modifiée.

L'invention concerne également une molécule d'acide nucléique comprenant au moins une séquence polynucléotidique telle que définie ci-dessus. Il s'agit de molécules d'acide nucléique recombinant comprenant au moins une séquence polynucléotidique purifiée de plante ou de levure codant une protéine dont la séquence en acides aminés est choisie dans le groupe comprenant les séquences en acides aminés représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros :

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- SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:18, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:36, SEQ ID N0:38, SEQ ID N0:42 ou SEQ ID N0:44, ou - SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO : 2 0 , SEQ ID NO : 2 6 , SEQ ID NO:34 ou SEQ ID N0:40, un fragment ou une séquence substantiellement similaire de celles-ci.

Lesdites séquences polynucléotidiques purifiées de plante entrant dans la constitution des molécules d'acide nucléique de l'invention sont constituées de tout ou partie d'une séquence polynucléotidique choisie parmi celles représentées dans la liste de séquence en annexe sous les numéros .

- SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:17, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:23, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:35, SEQ ID N0:37, SEQ ID N0:41 ou SEQ ID N0:43, ou - SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:33 ou SEQ ID N0:39, une séquence complémentaire ou substantiellement similaire de celles-ci.

Des molécules d'acide nucléique recombinant selon l'invention sontnotamment des gènes chimères ou des cassettes d'expression comprenant ladite séquence polynucléotidique placé sous le contrôle d'éléments de régulation en position 5' et/ou 3' de celle-ci pouvant fonctionner dans un organisme hôte, en particulier dans les cellules végétales.

Des éléments de régulation en position 5' et 3' entrant dans la composition des molécules d'acide nucléique recombinant selon l'invention, dont l'utilisation est fonction de l'organisme hôte sont bien connus de l'homme de

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métier. Ils comprennent notamment des séquences promotrices, des activateurs de transcription, des séquences terminatrices, y compris des codons start et stop. Les moyens et méthodes pour identifier et sélectionner les éléments de régulation sont bien connus de l' homme de métier.

Comme séquence de régulation promotrice dans les plantes, on peut utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes, par exemple un promoteur d'origine bactérienne, virale ou végétale tel que, par exemple, le promoteur 35S du virus de la mosaïque du choux-fleur (CaMV), ou un promoteur inductible par les pathogènes comme le PR-la du tabac, tout promoteur convenable connu pouvant être utilisé.

Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, tels que des activateurs de transcription ( enhancer ), comme, par exemple, l'activateur du virus de la mosaïque du tabac (TMV) décrit dans le brevet US 5,891,665.

Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, on peut utiliser toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme, par exemple, le terminateur nos d'Agrobacterium tumefaciens, ou encore d'origine végétale, comme, par exemple, un terminateur d'histone tel que décrit dans le brevet EP 633 317.

La séquence polynucléotidique peut être également associée dans la molécule d'acide nucléique de l'invention à un marqueur de sélection adapté à l'organisme hôte transformé. De tels marqueurs de sélection sont bien connus de l'homme de métier. Il pourra s'agir d'un gène de résistance aux antibiotiques, ou encore un gène de tolérance aux herbicides pour les plantes. De tels gènes de

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tolérance aux herbicides sont notamment décrits dans les brevets EP 115 673, EP 337 899, WO 96/38567 ou WO 97/04103.

La présente invention concerne également un vecteur de clonage ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte constituant ou contenant au moins une molécule d'acide nucléique recombinant défini ci-dessus. De tels vecteurs de transformation en fonction de l'organisme hôte à transformer sont bien connus de l'homme de métier et largement décrits dans la littérature. Les vecteurs selon l'invention peuvent être utilisés pour transformer tout type d'hôte cellulaire comme des organismes mono ou pluricellulaires, inférieurs ou supérieur, en particulier de cellules végétales ou de plantes. Pour la transformation des cellules végétales ou des plantes, il s'agira notamment d'un virus contenant ses propres éléments de réplication et d'expression. De manière préférentielle, le vecteur de transformation des cellules végétales ou des plantes selon l'invention est un plasmide.

Comme indiqué précédemment, les séquences polynucléotidiques de l'invention sont utiles pour préparer des plantes résistantes aux géminivirus. En effet, ces séquences polynucléotidiques codent pour des protéines qui sont nécessaires aux six protéines du génomes du géminivirus pour infecter la plante. En conséquence, ces séquences polynucléotidiques permettent de préparer des acides nucléiques modifiés, qui une fois intégrés de manière stable dans le génome de la plante, vont s'opposer à l'interaction des protéines codées par les séquences polynucléotidiques de l'invention avec les six produits du génome du géminivirus et ainsi empêcher la multiplication virale.

L'invention concerne donc une plante génétiquement modifiée résistante aux géminivirus possédant de manière stable dans son génome au moins un acide

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nucléique modifié comprenant ou constitué par une séquence polynucléotidique de l'invention codant une protéine nécessaire à une ou plusieurs des six protéines du génome qui est modifiée pour : - bloquer l'expression de ladite protéine de plante nécessaire à une ou plusieurs des six protéines du génome d'un géminivirus, - exprimer une protéine de plante modifiée, et dont la modification par rapport à la protéine naturelle modifie ou supprime l'interaction avec l'une au moins des six protéines virales.

L'invention est remarquable en ce qu'elle permet de préparer des plantes transgéniques : - soit, n'exprimant plus une protéine de plante nécessaire à une ou plusieurs des six protéines du génome d'un géminivirus pour permettre l'infection virale, - soit, exprimant une protéine de plante modifiée, et dont la modification par rapport à la protéine naturelle modifie ou supprime l'interaction avec l'une au moins des six protéines virale et empêche ainsi la multiplication du virus.

On entend par protéine de plante modifiée , une protéine qui, par rapport à la protéine naturelle, est : - sur-exprimée grâce à un promoteur particulier ou du fait d'un nombre important de copies de la séquence polynucléotidique codant ladite protéine, - modifiée au niveau d'un ou plusieurs de ces acides aminés de façon à ce que même si l'interaction avec une protéine virale est conservée, la protéine modifiée n'est plus fonctionnelle pour l'infection virale ; avantageusement la protéine ainsi modifiée est sur-exprimée de façon à ce que ce soit la protéine modifiée qui interagisse avec la protéine virale plutôt que la protéine naturelle,

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- modifiée au niveau d'un ou de plusieurs de ces acides aminés de façon à ce que l'interaction avec une protéine virale soit supprimée, - tronquée, il s'agit alors d'un fragment de la protéine naturelle qui, même si l'interaction avec une protéine virale est conservée, n'est plus fonctionnelle pour l'infection virale ; avantageusement la protéine ainsi modifiée est sur-exprimée de façon à ce que ce soit la protéine modifiée qui interagisse avec la protéine virale plutôt que la protéine naturelle.

Des protéines de plantes modifiées sont exprimées dans une plante génétiquement modifiée selon l'invention grâce à la séquence polynucléotidique de plante modifiée par rapport à la séquence polynucléotidique naturelle. On entend ainsi par séquence polynucléotidique de plante modifiée, une séquence polynucléotidique qui, par rapport à la séquence polynucléotidique présente une ou plusieurs modifications de nucléotides ou bien est constitué par un fragment de la séquence polynucléotidique naturelle qui code pour une protéine modifiée.

L'invention envisage aussi à titre de séquence polynucléotidique de plante modifiée, de courtes fractions du gène que l'on veut altérer. Ces courtes fractions nucléotidiques sont utiles pour réaliser des interventions géniques sans apport de gène extérieur, par des techniques du type de la chiméraplastie, afin de réaliser une mutation très précise et efficace dans un gène. Ces séquences ont une structure particulière qui active leur intégration à la bonne place.

L'invention envisage aussi à titre de séquence polynucléotidique modifiée des séquences antisens capable de bloquer la transcription ou la traduction de la séquence polynucléotidique naturelle et donc l'expression des protéines de plante interagissant avec les six produits du génome du géminivirus.

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Les exemples de séquences polynucléotidiques ou de protéines modifiées ci-dessus sont donnés à titre non limitatif, car l'homme du métier est capable de réaliser d'autres modifications à partir des séquences polynucléotidiques données ci-après permettant d'empêcher l'infection virale. L'homme du métier est capable à partir de techniques de biologie moléculaire décrites dans la littérature de préparer des plantes transgéniques et de tester leur résistance aux virus.

Ainsi, dans certains modes de réalisation avantageux de l'invention, la séquence polynucléotidique de plante modifiée est placée sous le contrôle d'un promoteur permanent ou inductible.

On entend par plante au sens de la présente invention tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme la tomate, le maïs, le blé, le colza, le soja, le riz, la canne à sucre, la betterave, le coton, etc....

On entend par plantes génétiquement modifiés au sens de la présente invention, une plante transgénique obtenue par transformation, avec au moins une molécule d'acide nucléique comprenant une séquence polynucléotidique comme définie précédemment, ou la descendance d'une telle plante si cette dernière contient les dites molécules d'acide nucléique dans ses semences.

L'invention concerne aussi un procédé de préparation d'une plante transgénique résistante aux géminivirus consistant : - à transformer une cellule végétale avec au moins un acide nucléique comprenant ou constitué par une séquence polynucléotidique modifiée définie ci-dessus,

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- à régénérer une plante à partir de ladite cellule transformée.

Il existe plusieurs techniques de transformation et de régénération de plantes décrites dans la littérature, notamment dans les demandes de brevet ciaprès auxquels l'homme du métier pourra se référer : US 4,459,355, US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267 159, EP 604 662, EP 672 752, US 4, 945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US 5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, W091/02071 et W095/06128.

On peut citer plus particulièrement les méthodes consistant à bombarder des cellules, des protoplastes ou des tissus avec des particules auxquelles sont accrochées les molécules d'acide nucléique. D'autres méthodes consistent à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un plasmide Ti d'A. tumefaciens ou Ri d'Agrobacterium rhizogenes dans lequel est inséré une molécule d'acide nucléique recombinant. D'autres méthodes encore peuvent être utilisées, telles que la microinjection ou l'électroporation, ou encore la transformation au moyen de PEG. L'une ou l'autre de ces techniques peut être plus ou moins adaptée à la nature de l'organisme hôte, en particulier de la cellule végétale ou de la plante.

L'invention concerne également les plantes transformées issues de la culture et/ou du croisement des plantes régénérées ci-dessus, ainsi que les graines desdites plantes transformées résistantes aux maladies causées par les virus, préférentiellement résistantes aux maladies causées par les géminivirus.

L'invention se rapporte donc aussi à une cellule végétale transformée dans le génome de laquelle est

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incorporée de façon stable un acide nucléique modifié défini précédemment.

On entend plus particulièrement par cellule végétale , toute cellule issue ou à l'origine d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plantes, ou des semences.

Les travaux réalisés dans le cadre de la présente invention ont donc permis d'identifier de nouveaux gènes codant pour des protéines susceptibles d'interagir avec l'une au moins des six protéines des génimivirus. Il s'agit comme indiqué précédemment des séquences constituées par tout ou partie d'un gène choisi dans le groupe comprenant les gènes gip3-C2, gip6-C2, gip7-C3, gip8-C3, gip9-C3, gipll-C3, gipl2-C4, gipl4-CP, gipl5-CP, gipl6-V2, gipl8-V2, gipl9-V2, gip21-V2 et gip22-V2. L'invention s'intéresse plus particulièrement aux protéines ou fragments des protéines codées par ces gènes. L'invention a donc tout spécifiquement pour objet une protéine susceptible d'interagir avec l'une au moins des six protéines des génimivirus, caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par une séquence en acides aminés choisie parmi les séquences représentées dans la liste de séquence en annexe sous les numéros SEQ ID NO:6, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:18, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID N0:42 ou SEQ ID N0:44, un fragment ou une séquence substantiellement similaire de celles-ci.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples ci-après concernant le gène gipl-Rep de S. pombe dont le produit

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interagit avec la protéine Rep du TYLCV et son utilisation pour la transformation de tomate.

Exemple 1. Isolement du gène gipl-Rep de S. pombe dont le produit interagit avec la protéine Rep du TYLCV.

Grâce à la méthode du double-hybride en levure (Fields et Song, 1989 ), une banque de cDNA de S. pombe a été criblée avec la protéine Rep du TYLCV fusionnée au domaine de liaison à l'ADN de GAL4. Deux clones de levure, appelés GIPl-Rep.ll et GIPl-Rep.13, ont été capables de former des colonies sur milieu de sélection et ont donné lieu à un résultat positif lors de l'essai LacZ. L'analyse de la séquence de ces deux clones ont montré qu'ils étaient identiques à l'exception de l'extrémité 3' noncodante. Le gène gipl-Rep, contenu dans les deux clones GIP1-Rep.l1 et GIPl-Rep.13, est un homologue du gène PSA1 de la levure Saccharomyces cerevisiae. Ce gène semble être impliqué dans la régulation du cycle cellulaire chez S. cerevisiae (Benton & coll., 1996). L'expression du gène PSA1 est à son maximum juste avant l'entrée dans la phase S du cycle cellulaire (Benton & coll., 1996).

Plusieurs délétions du gène Rep ont été construites et clonées dans le vecteur pAS2. Ces clones ont été utilisés pour tester la capacité des protéines Rep délétées à interagir avec la protéine GIPl-Rep. Ces analyses suggèrent que la région N-terminale de la protéine Rep est essentielle à l'interaction avec GIPl-Rep.

Une analyse de type Southern Blot montre que le gène gipl-Rep est présent en une seule copie chez S. pombe. Une analyse de type Northern Blot, réalisée sur une culture de cellules de S. pombe synchrones, montre que le niveau d'expression du gène gipl-Rep varie durant le cycle

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cellulaire et est à son maximum durant la phase Gl, qui précède la phase S du cycle cellulaire.

Exemple 2. Caractérisation génétique de gip1Rep.

Un fragment du gène gipl-Rep correspondant à la partie codante complète du gène a été clonée dans le vecteur d'expression pREP3x pour donner le plasmide pREP3xGipl. Ce plasmide a été construit pour surexprimer GIPl-Rep à l'aide d'un promoteur dont l'expression est régulée par la présence de thiamine dans le milieu. Des cellules sauvages ainsi que divers mutants du cycle cellulaire ont été transformées par le plasmide pREP3x-Gipl. Les cellules ont été étalées sur milieu minimum et contrôlées par microscopie électronique. Aucun effet de la surexpression du gène gipl-Rep n'a été observé.

Pour réaliser la disruption de gène, un fragment génomique contenant la partie codante du gène gipl-Rep a été utilisé. Ce fragment était encadré de deux sites de restriction PstI qui ont permis de le cloner dans pBS+ pour donner le plasmide pBIG4. Ce dernier a alors été digéré par EcoRV pour libérer la quasi totalité de la phase codante de gip1-Rep qui a été remplacée par un fragment contenant le gène ura4 pour donner le plasmide pBIG45. Le gène ura4 se trouve donc encadré à ses extrémités 5' et 3' de, respectivement, 1380 et 570 nucléotides de la séquence génomique du gène gipl-Rep. Une culture d'une souche diploïde de S. pombe auxotrophe pour l'uracile et la leucine a été transformée avec le fragment de restriction PstI obtenu à partir du plasmide pBIG45 et étalée sur milieu permettant de sélectionner les colonies ura+. Trois colonies indépendantes ont été sélectionnées et leur sporulation a été induite. L'analyse des tétrades réalisée sur un des diploïdes a montré que seulement deux spores de

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la tétrade sont viables. Ces spores ne contiennent pas le gène ura4 car elles sont ura-. Comme pour le gène PAS1 de S. cerevisiae (Benton & coll. ,1996), la disruption du gène gipl-Rep chez S. pombe s'est donc avérée létale. Ces résultats indiquent que gipl-Rep est un gène essentiel.

Pour obtenir un mutant conditionnel, les cellules diploïdes contenant la disruption de gipl-Rep ont été transformées avec le plasmide pREP3x-Gipl, porteur du marqueur leucine, et les colonies leu+ ont été sélectionnées. La sporulation a été induite chez certaines de ces colonies et les spores ont été étalées sur milieu minimum contenant de l'adénine et de l'uracile. Le phénotype des colonies haploïdes a ensuite été analysé.

Toutes les colonies étaient leu+ et environ la moitié étaient ura+ indiquant que la disruption de gipl-Rep était complémentée par l'expression de gipl-Rep depuis le plasmide. Ce résultat a été confirmé en étalant ces cellules sur un milieu avec de la thiamine pour réprimer l'expression de gipl-Rep. Dans ces conditions, les cellules étaient incapables de croître. L'analyse de la culture au microscope a révélé que la plupart des cellules avaient deux noyaux séparés par un septum. Ceci indique que le gène gipl-Rep est essentiel à une étape particulière du cycle cellulaire.

Exemple 3. Création d'un vecteur d'A. tumefaciens contenant la construction du gène codant pour GIPl-Rep.

Le gène gipl-Rep contenu dans le plasmide pACTgipl-Rep est amplifié par PCR. Le fragment d'ADN amplifié est purifié après électrophorèse sur gel d'agarose, il est ensuite digéré par SalI et KpnI et lié dans le plasmide pJC2EN2 digéré par les mêmes enzymes. On obtient ainsi le vecteur pJC2EN2gipl-Rep contenant la

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séquence codant pour GIPl-Rep entourée du promoteur 35S du CaMV et du terminateur OCS. Le fragment d'ADN contenant la cassette d'expression de GIPl-Rep est libéré du vecteur par les enzymes de restriction HindIII et XbaI et purifié. Il est ensuite lié au vecteur pBINPLUS (van Engelen & coll., 1995) digéré par les mêmes enzymes. On obtient ainsi un vecteur d'A. tumefaciens, pBINPLUSgipl-Rep, contenant la séquence codant pour GIPl-Rep qui conduit à l'expression de cette protéine dans la plante.

Exemple 4. Transformation génétique de la tomate.

Le vecteur pBINPLUSgipl-Rep est introduit dans la souche d'A. tumefaciens LBA4404 (Hoekema & coll., 1983).

La technique de transformation est basée sur la procédure de McCormick & coll. (1986) d'une part et celle de Fillati & coll. (1987) d'autre part.

La régénération de la tomate à partir d'explants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30 g/1 de saccharose ainsi que 500 mg/1 de carbenicilline et 75 mg/ml de kanamycine. Lorsque les bourgeons sont bien développés, ils sont mis sur un milieu permettant l'enracinement. Bien enracinées, les plantes sont acclimatées en serre. Les preuves moléculaires de l'intégration de la cassette d'expression de GIPl-Rep sont apportées par les techniques d'hybridation moléculaire de type Southern et Northern, ainsi que par PCR. Toutes les plantes transformées sont ensuite employées dans diverses expérimentations pour vérifier si l'expression de GIPl-Rep les rend résistantes aux agressions virales. Les plantes transformées, ainsi que des plantes-contrôle non transformées, sont, par exemple, infectées avec le virus TYLCV par agroinoculation. Le développement de symptômes et la présence d'ADN viral sont ensuite analysés.

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REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES - Benton & coll. (1996) Curr. Genet. 29,106-113.

- Fields et Song (1989) Nature 340,245-246.

- Fillati & coll. (1987) Bio/Technology 5,726-730.

- Hoekema & coll. (1983) Nature 303,179-180.

- Jonsson et Hubscher (1997) BioEssays 19,967-975 - Jupin & coll. (1994) Virology 204,82-90.

- Kelman, Z. (1997) Oncogene 14,629-640 - Kheyr-Pour & coll. (1991) Nuc. Acids Res. 19,6763-6769.

- Lazarowitz, S (1992) Crit. Rev. Plant Sci., 11,327-349.

- McCormick & coll. (1986) Plant Cell Rep. 5,81-84.

- Nagar & coll. (1995) Plant Cell 7,705-719.

- Navot & coll. (1991) Virology 185,151-161.

- Noris & coll. (1996) Virology 217,607-612.

- van Engelen & coll. (1995) Transgenic Res. 4,288-290.

- Wartig & coll. (1997) Virology 228,132-140.

- Xie & coll. (1995) EMBO J. 14,4073-4082.

- Xie & coll. (1999) Plant Mol. Bio. 39,647-656.

Claims (17)

REVENDICATIONS

1) Une séquence polynucléotidique purifiée de plante ou de levure codant pour une protéine qui interagit avec l'un au moins des six produits du génome d'un géminivirus nécessaire à l'infection d'une plante par ce virus.

2) Une séquence polynucléotidique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle code une protéine dont la séquence en acides aminés est choisie dans le groupe comprenant les séquences en acides aminés représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO: 6, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:18, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:28, SEQ ID N0:30, SEQ ID N0:32, SEQ ID N0:36, SEQ ID N0:38, SEQ ID N0:42 ou SEQ ID N0:44, un fragment ou une séquence substantiellement similaire de celle-ci.

3) Une séquence polynucléotidique selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle est constituée de tout ou partie d'une séquence polynucléotidique choisie parmi celles représentées dans la liste de séquence en annexe sous les numéros SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO: 11, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:17, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:27, SEQ ID N0:29, SEQ ID N0:31, SEQ ID N0:35, SEQ ID N0:37, SEQ ID N0:41 ou SEQ ID N0:43, une séquence complémentaire ou substantiellement similaire de celle-ci.

4) Une séquence polynucléotidique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle code une protéine dont la séquence en acides aminés est choisie dans le groupe comprenant les séquences en acides aminés représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID

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NO:10, SEQ ID NO : 2 0 , SEQ ID NO : 2 6 , SEQ ID NO:34 ou SEQ ID N0:40, un fragment ou une séquence substantiellement similaire de celle-ci.

5) Une séquence polynucléotidique selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est constituée de tout ou partie d'une séquence polynucléotidique choisie parmi celles représentées dans la liste de séquence en annexe sous les numéros SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:33 ou SEQ ID N0:39, une séquence complémentaire ou substantiellement similaire de celle-ci.

6) Molécule d'acide nucléique recombinant, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence polynucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.

7) Molécule d'acide nucléique recombinant selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite séquence polynucléotidique est placée sous le contrôle d'éléments de régulation en position 5' et/ou 3' de celle-ci pouvant fonctionner dans un organisme hôte.

8) Molécule d'acide nucléique recombinant selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisée en ce que ladite séquence polynucléotidique est associée dans la molécule d'acide nuclique recombinant à un marqueur de sélection.

9) Vecteur de clonage ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte constituant ou contenant au moins une molécule d'acide nucléique recombinant selon l'une quelconque des revendications 6 à 8.

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10) Un hôte cellulaire transformé par une molécule d'acide nucléique selon l'une des revendications 6 à 8 ou par un vecteur selon la revendication 9.

11) Une plante génétiquement modifiée résistante aux géminivirus possédant de manière stable dans son génome au moins un acide nucléique modifié comprenant ou constitué par une séquence polynucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 qui est modifiée pour : - bloquer l'expression de ladite protéine de plante nécessaire à une ou plusieurs des six protéines du génome d'un géminivirus, ou - exprimer une protéine de plante modifiée, et dont la modification par rapport à ladite protéine modifie ou supprime l'interaction avec l'une au moins des six protéines virales.

12) Une plante génétiquement modifiée résistante aux géminivirus selon la revendication 11, caractérisée en ce que la protéine de plante modifiée est une protéine définie dans l'une des revendications 1 à 5 qui est : - sur-exprimée, - modifiée au niveau d'un ou plusieurs de ces acides aminés de façon à ce que même si l'interaction avec une protéine virale est conservée, la protéine modifiée n'est plus fonctionnelle pour l'infection virale, - tronquée sous la forme d'un fragment de ladite protéine qui, même si l'interaction avec une protéine virale est conservée, n'est plus fonctionnelle pour l'infection virale.

- modifiée au niveau d'un ou plusieurs de ces acides aminés de façon à ce que l'interaction avec une protéine virale soit supprimée,

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13) Une plante génétiquement modifiée résistante aux géminivirus selon la revendication 12, caractérisée en ce que ladite séquence polynucléotidique modifiée est placée sous le contrôle d'un promoteur permanent ou inductible.

14) Une plante génétiquement modifiée résistante aux géminivirus selon la revendication 11, caractérisée en ce que ladite séquence polynucléotidique modifiée est une séquence antisens capable de bloquer la transcription ou la traduction d'une séquence polynucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.

15) Procédé de préparation d'une plante transgénique résistante aux géminivirus, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes consistant : - à transformer une cellule végétale avec au moins un acide nucléique modifié défini dans l'une des revendications 11 à 14, - à régénérer une plante à partir de ladite cellule transformée.

16) Une cellule de plante dans le génome de laquelle est incorporée de façon stable un acide nucléique modifié défini dans l'une des revendications 11 à 14.

17) Une protéine susceptible d'interagir avec l'une au moins des six protéines des génimivirus, caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par une séquence en acides aminés choisie parmi les séquences représentées dans la liste de séquence en annexe sous les numéros SEQ ID NO: 6, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:18, SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:28, SEQ ID N0:30, SEQ ID N0:32, SEQ ID N0:36, SEQ ID

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N0:38, SEQ ID N0:42 ou SEQ ID N0:44, un fragment ou une séquence substantiellement similaire de celles-ci.