ES2382898T3 - Método para aumentar la resistencia contra la roya de la soja en plantas transgénicas - Google Patents
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Abstract
Método para aumentar la resistencia contra la roya de la soja en plantas transgénicas y/o células de planta, caracterizado porque el contenido y/o la actividad de por lo menos una proteína MLO endógena se reduce en comparación con plantas tipo natural o células de planta, respectivamente; en donde por lo menos una proteína MLO endógena tiene una secuencia de aminoácidos con por lo menos 75 % de homología con la secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID NO: 4 o sus partes funcionalmente equivalentes o fragmentos de los mismos, o en donde por lo menos una proteína MLO endógena tiene una secuencia de aminoácidos que es funcionalmente equivalente a la secuencia de aminoácidos de una proteína que tiene por lo menos 75 % de homología con la secuencia de aminoácidos como se describe en SEQ ID NO: 4 o fragmentos de los mismos.
Description
Método para aumentar la resistencia contra la roya de la soja en plantas transgénicas
Antecedentes de la invención
La presente invención se relaciona con un método para aumentar la resistencia contra la roya de la soja en plantas transgénicas y/o células de planta, así como también con el uso de una molécula de ácido nucleico para la producción de estas plantas y/o células de planta. En estas plantas, el contenido y/o la actividad de por lo menos una proteína MLO se altera en comparación con las plantas tipo natural. Adicionalmente, la solicitud se relaciona con plantas transgénicas y/o células de plantas que tienen una resistencia aumentada contra la roya de la soja y con vectores de expresión que comprenden una secuencia que es idéntica, homóloga o complementaria a una secuencia que codifica un MLO funcional o no funcional o fragmentos de los mismos.
Las plantas se confrontan permanentemente con microbios patogénicos. Las enfermedades de la planta provocadas por diversos patógenos, tales como virus, bacterias y hongos, de una parte pueden conducir a pérdidas sustanciales de cultivo en el crecimiento de plantas cultivadas, con consecuencias económicas, pero de otra parte también poseen una amenaza a la seguridad alimenticia de los seres humanos. Se han utilizado fungicidas químicos desde el último siglo para el control de enfermedades provocadas por hongos. Aunque el uso de estos agentes conduce a una reducción en el grado de enfermedades de planta, hasta ahora no se puede descartar que estos compuestos puedan tener efectos perjudiciales en los seres humanos, en animales y el medio ambiente. Con el fin de reducir el uso de pesticidas tradicionales a un mínimo, es por lo tanto importante examinar la defensa natural del patógeno de diversas plantas a diferentes patógenos, y para hacer además de los métodos de siembra clásicos, el uso sistémico de ingeniería genética, tal como al introducir genes de resistencia externos, o al manipular la expresión del gen endógeno en plantas para la producción de plantas resistentes a los patógenos.
La resistencia significa de manera general la capacidad de una planta para evitar, o por lo menos reducir la infestación y colonización por un patógeno perjudicial. Se pueden discernir diferentes mecanismos en la resistencia que ocurre en forma natural, con la que las plantas se defienden de la colonización por organismos fitopatogénicos. Estas interacciones específicas entre el patógeno y el anfitrión determinan el curso de la infección (Schopfer and Brennicke (1999) Pflanzenphysiologie, Springer Verlag, Berlin- Heidelberg, Alemaina).
Con respecto a la resistencia específica de la raza, también llamada resistencia del anfitrión, se hace una diferenciación entre las interacciones compatibles e incompatibles. En la interacción compatible, ocurre una interacción entre un patógeno virulento y una planta susceptible. El patógeno sobrevive, y se puede construir en las estructuras de reproducción, mientras muere el anfitrión. De otra parte ocurre una interacción incompatible cuando el patógeno infecta la planta pero se inhibe en el cultivo antes o después del desarrollo débil de los síntomas. En el último caso, la planta es resistente al patógeno respectivo (Schopfer and Brennick, vide supra). En las interacciones compatible e incompatible ocurre una reacción específica y defensiva del anfitrión al patógeno.
Sin embargo, en la naturaleza, esta resistencia al anfitrión se supera frecuentemente debido al desarrollo evolutivo rápido de los patógenos (Neu et al. (2003) American Cytopathol. Society, MPMI 16 No. 7: 626-633). En contraste con esto, la resistencia del no anfitrión ofrece protección permanente, amplia y fuerte de los fitopatógenos. La resistencia del no anfitrión significa el fenómeno que un patógeno puede inducir una enfermedad en una cierta especie de planta, pero no en otras especies de planta (Heath (2002) Can. J. Plant Pathol. 24: 259-264).
A pesar de estas características interesantes, hasta ahora solo se han entendido pobremente las bases genéticas y biológicas para la resistencia del no anfitrión. Existen indicaciones que la resistencia al no anfitrión se induce por agentes no específicos, y también que las proteínas del patógeno individual induce la reacción de la resistencia del no anfitrión (Heath (1981) Phytopathology 71: 1121-1123; Heath (2001) Physiol. Mol. Plant Pathol. 58: 53-54; Kamoun et al. (1998) Plant Cell 10: 1413-1425; Lauge et al. (2000) Plant J. 23: 735-745; Whalen et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6743-6747). El fenómeno de resistencia de no anfitrión también se puede basar en las propiedades estructurales o químicas de las especies de la planta, tales como el grosor de la cutícula o la presencia de sustancias inhibidoras.
A pesar de la resistencia con base en las barreras físicas desarrolladas, el sistema de defensa de no anfitrión más efectivo de la planta se representa por el reconocimiento de las estructura microbianas moleculares conservadas, también llamadas PAMP (patrones moleculares asociados con patógenos). El reconocimiento de los PAMP por un receptor PAMP activa una cascada de señalización que conduce a la activación de una multitud de mecanismos de resistencia, que incluyen fortificación de la pared celular, secreción de compuestos tóxicos y muerte celular programada. Aquellos mecanismos de defensa son suficientes para detener efectivamente los intentos de ataque de la mayor parte de microbios. Esta respuesta inmune innata es una parte integral del grupo durable y genéticamente complejo de mecanismos de defensa de resistencia del no anfitrión.
Solo unas pocas especies de patógenos parecen tener mecanismos específicos involucrados para eludir o para bloquear el sistema de defensa básico de las especies individuales de planta, y, como una consecuencia, ha llegado a tener patógenos de estas especies. Es concebible que la dirección y la manipulación de las proteínas anfitrionas particulares es una etapa clave de este sabotaje de defensa específico de las especies.
Moho polvoriento es una enfermedad fúngica común de muchas plantas monocotiledóneas y plantas dicotiledóneas como remolacha, diversos cereales, cohombro, lechuga, zanahoria, guisantes, tomate, fresa, manzana, uvas etc. los hongos Moho polvoriento (Erysiphales) pertenecen a la división de Ascomycota. Blumeria graminis es el hongo que provoca moho polvoriento en los pastos. El hongo moho polvoriento de la cebada (Blumeria graminis f.sp. hordei, Bgh) es un patógeno biotrófico obligado que ataca las células epidérmicas de la cebada (Hordeum vulgare L.). Después del contacto de la espera con la cutícula de la hoja de cebada, se forma un apresorio. La siguiente etapa y la etapa crucial de invasión fúngica es la penetración de la pared celular seguido por el establecimiento de una estructura de carga intracelular especializada llamada "haustorio" que no destruye la integridad de la membrana de plasma.
En la cebada monocotiledónea, la presencia de isoformas de la familia de las proteínas MLO localizadas en la membrana de plasma heptahelicoidal se requiere para la penetración exitosa de la pared celular del anfitrión por el hongo moho polvoriento. La ausencia de estas proteínas MLO, provocada por variaciones genéticas naturales o lesiones inducidas en los genes mlo respectivos, resulta en falla de las esporas fúngicas para penetrar la pared celular de la planta. Todos los genotipos de la cebada que carecen de un gen funcional mlo son resistentes a todos los aislados conocidos del moho polvoriento de cebada. Adicionalmente, la resistencia mlo heredada recesivamente es extremamente durable bajo condiciones de campo. Se ha utilizado mutación MLO en la mayor parte de variedades de cebada de primavera en Europa durante los últimos 25 años.
La proteína MLO es una proteína localizada en la membrana de plasma integral y contiene siete dominios de transmembrana hidrófobos. El terminal C citoplásmico tiene una hélice a amfifílica que sirve como un dominio de unión calmodulina, que es necesario para la actividad completa de la proteína MLO. La unión de calmodulina dependiente de calcio a este dominio de péptido se muestra in vitro e in vivo y contribuye a cerca de la mitad de la actividad que confiere susceptibilidad del mlo (Kim M.C. Nature. 2002 Mar 28; 416(6879):447-51).
El gen ror2 (requerido para resistencia 2 mlo) que, cuando muta, suprime la resistencia mediada por mlo, se encuentra que codifica una sintaxina residente de la membrana de plasma, una proteína que pertenece a la superfamilia de las proteínas SNARE. La carencia del ROR2 tipo natural compromete parcialmente la resistencia a la penetración en genotipos mlo, lo que sugiere que se requiere actividad de sintaxina para resistencia efectiva mlo (Freialdenhoven A. Plant Cell. 1996 Jan; 8(1):5-14). Ambos MLO y ROR2 parece que se acumulan focalmente en los sitios de intento de penetración de la pared celular fúngica. Así, parece que MLO y ROR2 forman un microdominio activado por el patógeno novedoso en sitios de estrés biótico (Bhat R.A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005 Feb 22; 102(8): 3135-40). En estas regiones subcelulares, la interacción entre MLO y la calmodulina detectora de calcio citoplásmica aumenta transitoriamente durante la invasión exitosa de la célula anfitriona fúngica (Bhat R.A., vide supra). Más aún, se sugiere una interacción física directa entre MLO y ROR2. La intensidad de esta interacción se disminuye drásticamente entre un único subconjunto de proteínas mutantes mlo de sustitución de aminoácidos y el ROR2 tipo natural así como también entre el MLO tipo natural y la variante de cebada codificada por el mutante de cebada ror2. El MLO puede modular los procesos asociados con el transporte de vesícula y la proteína SNARE dependiente de la membrana de plasma. En conclusión, los hongos moho polvoriento parecen corromper específicamente MLO para modular los procesos asociados con vesícula en la periferia celular de la planta para patogenia exitosa.
Este mecanismo de MLO parece ser conservado en las plantas. La planta dicotiledónea Arabidopsis thaliana contiene 15 homólogos de cebada MLO, llamados AtMlo1-AtMlo15. La inactivación de AtMlo2 confiere resistencia al hongo moho polvoriento Erysiphe chichoracearum y Golvinomyces orontii. Estos datos indican que el mecanismo de infección moho polvoriento se conserva entre las plantas monocotiledóneas y las plantas dicotiledóneas.
Se considera que es plausible que cada especie de patógeno involucrada por sus propios medios específicos suprima y supere los mecanismos de defensa del anfitrión general o especializado. Los fenotipos de resistencia mediados por mlo parecen ser altamente específicos para hongos moho polvoriento (Ascomycota - Pezizomycotina -Leotiomycetes - Erysiphales). En la actualidad se sabe de la literatura que la mutación MLO no confiere resistencia a ningún patógeno diferente a hongo moho polvoriento.
Por ejemplo, la mutación MLO no confiere ninguna resistencia a otros hongos de la división de Ascomycota, que se relacionan cercanamente con hongos moho polvoriento. No se observa efecto de mlo después de inoculación de la cebada con los hongos (Gaeumannomyces graminis: Ascomycota - Pezizomycotina - Sordariomycetes -Sordariomycetes incertae sedis - Magnaporthaceae; Jorgensen J.H. Induced Mutations Against Plant Diseases, Proc. Symp. Wien, 1977. Wien: Int. Atomic Energy Agency, pp. 533-547). Comparado con las plantas tipo natural mlo, los mutantes de cebada mlo no difieren en el fenotipo de infección en un rango de otros fitopatógenos, como por ejemplo roya de la hoja de cebada (Puccinia striiformis; Basidomycota - Urediniomycetes - Urediniomycetidae Uredinales - Pucciniaceae) o roya lineal (Puccinia hordei; Basidomycota - Urediniomycetes - Urediniomycetidae -Uredinales - Pucciniaceae).
Más aún la mutación MLO es responsable de una susceptibilidad mejorada de la cebada al hongo añublo del arroz hemibiotrófico Magnaporthe grisea (Ascomycota-Pezizomycotina - Sordariomycetes - Sordariomycetes incertae sedis - Magnaporthaceae; Jarosch B. Mol. Plant-Microbe Interact. 12 (6): 508-514, 1999) y al hongo necrotrófico Bipolaris sorokiniana (Ascomycota - Pezizomycotina -Dothideomycetes - Pleosporales - Pleosporaceae). En resumen, además del hongo moho polvoriento, no se conocen patógenos que sean negativamente influenciados por la mutación MLO.
La roya de la soja (SR), también conocida como roya de la soja Asiática (Basidiomycota - Urediniomycetes -Urediniomycetidae - Uredinales - Phakopsoraceae), es una enfermedad que afecta las sojas y otras legumbres. Esta se provoca por dos tipos de hongos, Phakopsora pachyrhizi y Phakopsora meibomiae, el último es el patógeno más débil de los dos.
El proceso de infección de roya de la soja inicia cuando las uredioesporas germinan para producir un único tubo germinal, forma apresorios e infecta siempre mediante penetración cuticular directa. La penetración inicia con la formación de un cono apresórico que es continúo con la pared celular de la hifa de penetración. La hifa de penetración ingresa a la célula epidérmica, la atraviesa y alcanza el tipo celular del mesófilo en donde se forma el primer septo, separando la hifa de penetración de la hifa primaria. El primer haustorio es visible entre 24 y 48 horas después de inoculación. El haustorio se forma en el mesófilo y las células epidérmicas.
Bajo condiciones óptimas le toma a las esporas entre 6-7 días para que maduren. Luego, después de la infección de plantas de soja saludables, se producen nuevas esporas durante aproximadamente 10 días. Estas nuevas esporas pueden reinfectar la misma planta o se llevan a otras plantas susceptibles. La roya de la soja provoca lesiones en cotiledóneas, tallos, peciolos, hojas, y vainas de soja y otras plantas anfitrionas. Los efectos principales en la planta de soja son la destrucción del tejido fotosintético que a su vez provoca desfoliación prematura, maduración temprana, y reducción de producción severa a través de la reducción en el número de vainas y semillas, y peso de semilla reducido.
Actualmente no existe resistencia a la roya de la soja en ninguno de los cultivos de soja comerciales de los Estados Unidos. Se conoce la resistencia específica a P. pachyrhizi, y se han identificado cuatro genes dominantes únicos como Rpp1, Rpp2, Rpp3, y Rpp4. Esta condición de los cuatro genes da resistencia a un conjunto limitado de aislados de roya. La resistencia del gen único no ha sido durable, y la utilidad de los genes únicos se pierde tan pronto después que se identifican las fuentes.
El objeto de la presente invención es proporcionar un método para aumentar la resistencia contra la roya de la soja en plantas transgénicas y/o células de planta. Este objetivo se logra mediante la materia objeto de la reivindicación principal. Las características de las otras reivindicaciones independientes sirven para resolver esto y los objetivos adicionales se muestran en la descripción. Las realizaciones preferidas de la invención se definen por las características de las sub-reivindicaciones.
Descripción detallada de la invención
De forma sorprendente, los inventores encuentran una influencia de una mutación MLO en la reacción de resistencia contra la roya de la soja. Este fenotipo de interacción no se espera totalmente debido a diversas razones:
- 1.
- Con la excepción de la resistencia del moho polvoriento, no se ha descrito otro fenotipo de resistencia hasta ahora que se base en la influencia MLO, es decir la sobreexpresión MLO o infraexpresión MLO. Para los hongos Magnaporthe grisea y Bipolaris sorokiniana, aún se ha observado una susceptibilidad mejorada en los mutantes mlo.
- 2.
- El fenotipo de cebada mlo no es distinguible de las plantas tipo natural después de infección con otros hongos de Roya que se relacionan cercanamente a la roya de la soja. Es decir roya lineal (Puccinia hordei, Basidiomycota; Urediniomycetes; Urediniomycetidae; Uredinales; Pucciniaceae) y roya de la hoja de cebada (Puccinia striiformis, Basidiomycota; Urediniomycetes; Urediniomycetidae; Uredinales; Pucciniaceae).
- 3.
- Adicionalmente, el MLO no influencia otros hongos patogénicos que utilizan procesos de infección similares a la roya de la soja, por ejemplo penetración directa de las células epidérmicas y/o el crecimiento intercelular en el mesófilo. Por ejemplo los hongos añublo del arroz Magnaporthe oryzae también penetran directamente la epidermis para crecer dentro de la hoja.
- 4.
- Finalmente, el hongo moho polvoriento es de la división de Ascomycota, mientras que la roya de la soja asiática es de la división de Basidomycota.
Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención se relaciona con un método para aumentar la resistencia contra la roya de la soja en plantas transgénicas y/o células de planta, caracterizado porque el contenido y/o la actividad de por lo menos una proteína MLO se reduce en comparación con plantas tipo natural o células de planta, respectivamente; en donde por lo menos una proteína MLO endógena tiene una secuencia de aminoácidos con por lo menos 75 % de homología con la secuencia de aminoácidos como se describe en SEQ ID NO: 4 o sus partes funcionalmente equivalentes o fragmentos de los mismos, o en donde por lo menos una proteína MLO endógena tiene una secuencia de aminoácidos que es funcionalmente equivalente a la secuencia de aminoácidos de una proteína que tiene por lo menos 75 % de homología, con la secuencia de aminoácidos como se describe en SEQ ID NO: 4 o fragmentos de los mismos.
Dentro del alcance de la presente invención, las células de planta “transgénicas” (o plantas) son células dentro de las que se ha introducido una molécula de ácido nucleico. Esta molécula puede ser una molécula de ADN / cADN o una molécula de ARN, puede ser de hebra doble o de hebra sencilla, y ejemplos de tales moléculas son moléculas o vectores de ARN de hebra doble, por ejemplo plásmidos, cósmidos, virus recombinantes o minicromosomas. La molécula de ácido nucleico puede comprender secuencias que se derivan de las especies de la célula anfitriona o de otro organismo / especie. Adicionalmente, aquellas secuencias pueden ser naturales o modificadas o sintéticas.
De acuerdo con la presente invención, una "planta" puede ser cualquier planta monocotiledónea o dicotiledónea. Es preferiblemente una planta de alimento o alimenticia agrícola monocotiledónea o dicotiledónea. Preferiblemente, la planta monocotiledónea se selecciona del grupo que consiste de Hordeum (cebada), Avena (avena), Triticum (trigo), Secale (centeno), Oryza (arroz), Sorghum (mijo), Zea (maíz), Panicum, Pennisetum, Setaria y similares. Preferiblemente, la planta dicotiledónea se selecciona del grupo que consiste de soja, algodón, colza, tomate, remolacha azucarera, papa, girasol, guisantes, plantas ornamentales, tabaco, trébol (Trifolium spec.), Kudzu (Pueraria lobata), árboles y legumbres tales como Alfalfa. Las plantas agrícolas adicionales pueden incluir frutos (en particular manzanas, peras, cerezas, uvas, frutas cítricas, piñas y bananas), palmas de aceite, te, árboles de cacao y café, tabaco, sisal, así como también plantas medicinales tales como rauwolfia y digitales. Particularmente se favorecen los cereales de trigo, centeno, avena, cebada, arroz, maíz y mijo, remolacha azucarera, colza, soja, tomate, papa y tabaco. Otras plantas agrícolas se pueden tomar de la patente Estadounidense US 6,137,030. La planta más preferida es soja.
Las células de planta de acuerdo con la invención incluyen células de planta diferenciadas y no diferenciadas que incluyen protoplastos que se producen por el método de acuerdo con la invención y que han integrado las moléculas de ácido nucleico descritas en lo siguiente en el genoma de la planta, o que han recibido estas como moléculas de replicación automática.
En el alcance de la presente invención, el patógeno de roya de la soja es Phakopsora pachyrhizi o Phakopsora meibomiae. Preferiblemente, el patógeno es Phakopsora pachyrhizi.
"Resistencia" del patógeno significa disminución o debilitamiento de los síntomas patogénicos de la planta luego de un ataque por un patógeno. Los síntomas pueden ser de diversos tipos, pero comprenden preferiblemente aquellos que conducen directamente o indirectamente a un deterioro de la calidad de la planta, el tamaño de la cosecha, la adecuabilidad para uso como forraje para animales o alimento para el consumo humano, o que obstaculizan la siembra, cultivo, cosecha o procesamiento del cultivo.
De acuerdo con la invención, el término "resistencia aumentada" (contra roya de la soja) se entiende que significa que las plantas transgénicas, o células de planta, de acuerdo con la invención se afectan menos vigorosamente, y/o menos frecuentemente, por la roya de la soja que las plantas tipo natural no transformadas, o células de planta, que se tratan de otra manera en la misma forma (tales como condiciones de clima y cultivo, tipo de patógeno, etc.). De acuerdo con la invención, el término "tipo natural" se entiende como el organismo progenitor no modificado genéticamente respectivo. La eficiencia de penetración así como también el índice de formación de papilas ofrece una posibilidad para cuantificar la reacción de la planta a la infestación del patógeno (ver ejemplos). El término "resistencia aumentada" también comprende lo que se conoce como resistencia de patógeno transitorio, es decir las plantas transgénicas, o células de planta, de acuerdo con la invención tienen una resistencia aumentada de patógeno cuando se compara con el tipo natural respectivo solo durante un periodo limitado.
La inactivación transitoria o resistencia transitoria puede ser ventajosa debido a que es una adición valiosa a otros métodos que permiten la producción de las plantas con resistencia aumentada de roya de la soja, pero que afecta el fenotipo. Las plantas que se producen por un método de acuerdo con la invención y que muestran resistencia transitoria durante el desarrollo de la infección no exhiben ningún cambio significativo del fenotipo, y por lo tanto los métodos de acuerdo con la invención que surgen para resistencia transitoria pueden ayudar, junto con otros métodos, a producir plantas que se caracterizan por mayor endurecimiento y resistencia más estable, sin tener ningún efecto negativo luego de la restricción del fenotipo provocada por los métodos.
La infestación con roya de la soja se reduce preferiblemente mediante por lo menos 10 % o 20 %, más preferiblemente mediante por lo menos 30 % o 40 %, especialmente preferiblemente mediante por lo menos 50 % o 60 %, particularmente preferiblemente mediante por lo menos 70 % o 80 %, y más preferiblemente mediante por lo menos 90 %, 95 % o 100 %, que se manifiesta en una reducción del desarrollo de síntomas patogénicos.
De acuerdo con la presente invención, una "proteína MLO" es una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como se describe en SEQ ID NOs: 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 y 48 5 o una proteína que tiene una secuencia que es esencialmente homóloga a dichas secuencias o una proteína que es funcionalmente equivalente a dichas proteínas MLO.
Las proteínas MLO especificadas por las secuencias mencionadas anteriormente se originan de las siguientes especies de planta: Hordeum vulgare, Glycine max, Oryza sativa, Linum usitatissimum, Triticum aestivum y Arabidopsis thaliana. Sin embargo, muchas otras especies como Zea mays, Saccharum officinarum, Antirrhinum
10 majus, Solanum tuberosum, Gossypium raimondii, Pinus taeda, Aquilegia Formosa, Aquilegia pubescens, Coffea canephora, Lactuca serriola, Lactuca sativa, Zingiber officinale, Fragaria vesca, Helianthus petiolaris, Brassica rapa, Lotus japonicus, Physcomitrella patens, Capsicum annuum, Lycopersicon esculentum y Nicotiana tabacum contiene proteínas MLO que también están comprendidas dentro del alcance de la presente invención. La siguiente Tabla 1 dará un resumen de los resultados de las búsquedas de base de datos en las proteínas MLO:
- Hit_ID
- Organismo Número de Acceso Número de Patente / Número GI
- FastAlert_ N|EP1586645.43647
- Arabidopsis thaliana EP1586645
- FastAlert_ N|JP2005185101.15616
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- No identificado. ADX59361 US2004034888
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- Hit_ID
- Organismo Número de Acceso Número de Patente / Número GI
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- Arabidopsis thaliana NM_129974 18406453
- REFSEQ_ NUCLEOTIDE|NM_190 204
- Oryza sativa (grupo de variedad japónica) NM_190204 34907491
- REFSEQ_ NUCLEOTIDE|NM_197 580
- Oryza sativa (grupo de variedad japónica) NM_197580 37536519
- REFSEQ_ NUCLEOTIDE|NM_201 957
- Arabidopsis thaliana NM_201957 42571224
- REFSEQ_ NUCLEOTIDE|XM_464 475
- Oryza sativa (grupo de variedad japónica) XM_464475 50905972
- REFSEQ_ NUCLEOTIDE|XM_472 638
- Oryza sativa (grupo de variedad japónica) XM_472638 50924555
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- Oryza sativa (grupo de variedad japónica) XM_474381 50929706
- REFSEQ_ NUCLEOTIDE|XM_493 809
- Oryza sativa (grupo de variedad japónica) XM_493809 50948902
- Triticum_aestivum_Trigo_ Apr03|c 55126395
En el alcance de la presente invención, el término "homólogo" se utiliza en referencia a las secuencias de aminoácidos o las secuencias de ácidos nucleicos, que significa que comparten un cierto grado de "homología", es 5 decir "identidad" o "similitud", con otras secuencias de aminoácidos o secuencias de ácidos nucleicos, respectivamente.
Existen muchos algoritmos para determinar este grado de homología o similitud. Preferiblemente la homología se puede determinar por medio del software Lasergene de the company DNA star Inc., Madison, Wisconsin (USA), utilizando el método CLUSTAL (Higgins et al., 1989, Comput. Appl. Biosci., 5 (2), 151). Otros programas que un 10 experto puede utilizar para la comparación de las secuencias y que se basan en algoritmos son, por ejemplo, los algoritmos de Needleman y Wunsch o Smith y Waterman. Los programas útiles adicionales son el programa Pile Aupa (J. Mol. Evolution. (1987), 25, 351-360; Higgins et al., (1989), Cabgos, 5, 151-153) o el programa de Mejor Ajuste y Espacio (Needleman and Wunsch, (1970), J. Mol. Biol., 48, 443-453, así como también Smith and
Waterman (1981), Adv., Appl. Math., 2, 482-489) o los programas del paquete de software GCG del Grupo Genetics Computer (575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711). Las alineaciones de secuencia también se pueden realizar con el programa Clustal W de la página de internet http://www.ebi.ac.uk./ clustalw o con el programa de alineación de Secuencia Blast NCBI de la página de internet http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ o http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi.
La persona experta puede encontrar secuencias de aminoácidos o nucleicas adecuadas en las bases de datos que están disponibles en internet, por ejemplo http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez o http://www.tigr.org. Además de las secuencias MLO conocidas, que se describen en la presente invención, se pueden encontrar secuencias adicionales en aquellas bases de datos en el futuro y se pueden utilizar en el contexto de la presente invención. También, la persona experta está consciente de las técnicas que le permite aislar las secuencias homólogas de otros organismos. Él puede realizar comparaciones de homología (por medio de CLUSTAL, BLAST, NCBI) y luego aislar las secuencias de nucleótido homólogas identificadas de métodos de laboratorio estándar, por ejemplo diseño del cebador, PCR, hibridación o detección de colecciones de cADN con las sondas adecuadas (cf. por ejemplo Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY). La función de las proteínas identificadas luego se puede determinar.
Una secuencia de aminoácidos que es "esencialmente homóloga" (= esencialmente similar) a una secuencia de aminoácidos MLO significa, en el alcance de la presente invención, que la secuencia es por lo menos 40 % o 50 %, preferiblemente por lo menos 55 % o 60 %, más preferiblemente por lo menos 65 % o 70 %, especialmente preferiblemente por lo menos 75 % o 80 %, particularmente preferiblemente por lo menos 85 % o 90 %, y más preferiblemente por lo menos 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % similar a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las proteínas MLO descritas en la SEQ ID NOs: 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 y 48 o sus partes funcionalmente equivalentes o fragmentos. Preferiblemente, la homología se determina sobre la longitud de la secuencia completa de aquellas proteínas. La misma definición aplica análogamente a una secuencia de ácidos nucleicos.
Si algunas las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente solo son secuencias parciales de la proteína MLO de longitud completa (tal como SEQ ID NO: 7), el término "secuencias de aminoácidos esencialmente homólogas" también se refiere a la secuencia de longitud completa o a nuevas partes de la secuencia de longitud completa que se pueden identificar en el futuro.
De acuerdo con la presente invención, una proteína que es "funcionalmente equivalente" a una proteína MLO es una proteína que tiene las mismas funciones celulares, las mismas proteínas de unión y/o las mismas propiedades estructurales como cualquiera de las proteínas MLO que tienen una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID NOs: 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 y 48. Las funciones celulares significa especialmente que son las interacciones de la proteína con sus patrones de unión patogénicos o fisiológicos, es decir en el caso de sus interacciones de las proteínas MLO con calmodulina y/o ROR2. Otro compañero de unión fisiológico posible de la proteína MLO es la familia de la proteína ATPasa. Se descubrirá cualquier otro compañero de interacción posible en el futuro que también significa que se incluye dentro del alcance de la presente invención. Una proteína funcionalmente equivalente puede ser una parte (fragmento) de dichas proteínas MLO, por ejemplo una proteína que tiene eliminaciones o adiciones de aminoácido en el terminal N y/o en el terminal C. También puede ser una proteína que tiene uno o más intercambios de aminoácido, inserciones o eliminaciones que no conducen a funciones celulares alteradas, propiedades de unión y/o propiedades estructurales.
Las mutaciones de punto funcionales, por ejemplo, se logran mediante un intercambio de aminoácido conservador, es decir se intercambia un aminoácido por otro que tiene propiedades fisicoquímicas comparables, tales como hidrofobicidad, hidrofilicidad, aminoácidos cargados positivamente, cargados negativamente etc. Un ejemplo de un intercambio de aminoácido conservador es el reemplazo de valina por alanina (o vice versa). El experto ha mantenido en mente la región en donde se realiza el intercambio, es decir si es una región que es esencial para la interacción de la proteína MLO con sus compañeros de unión. Por ejemplo, el terminal C MLO comprende un sitio de unión calmodulina. Una alineación de secuencia con las secuencias MLO conocidas puede dar una indicación de si es esencial una región para el comportamiento de unión de la proteína. En contraste con un intercambio de aminoácido conservador, la persona experta asumirá que el intercambio de, por ejemplo un aminoácido cargado positivamente por un aminoácido cargado negativamente (por ejemplo lisina -ácido glutámico) conducirá a un cambio funcional o estructural de la proteína MLO. Aplican las mismas consideraciones a la generación de los mutantes de inserción o eliminación funcional de mlo. El experto pondrá atención al hecho de sí los aminoácidos insertados o eliminados o rangos de aminoácido se ubican dentro de una región que es o no esencial para las propiedades de unión de Mlo.
En el contexto de la presente invención, un "fragmento" de un MLO es una parte de una proteína MLO, en donde la proteína original MLO tiene por ejemplo una secuencia de aminoácidos como se describe en SEQ ID NOs: 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 y 48. Usualmente, el fragmento carece de aminoácidos en el terminal N o el terminal C.
En el caso que el fragmento de MLO necesite ser funcional, el fragmento tiene preferiblemente por lo menos 40 % o 50 %, preferiblemente por lo menos 55 % o 60 %, más preferiblemente por lo menos 65 % o 70 %, especialmente preferiblemente por lo menos 75 % o 80 %, particularmente preferiblemente por lo menos 85 % o 90 %, y más preferiblemente por lo menos 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de la longitud de la proteína MLO “completa”.
Algunos de los métodos descritos adelante, sin embargo, no requieren que las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un "fragmento" de una proteína MLO tiene que codificar una proteína funcional. En aquellos casos, el "fragmento" o "parte" del ácido nucleico puede ser tan corto como 20 nucleótidos, en algunos casos aún más corto. Los detalles de la longitud de los fragmentos (aminoácido o ácido nucleico) se describirán adelante.
Preferiblemente, el MLO utilizado para la presente invención es un MLO de planta seleccionado del grupo que consiste de Hordeum vulgare (cebada) MLO, Oryza sativa (arroz) MLO, Arabidopsis thaliana MLO, especialmente preferiblemente AtMlo1, AtMlo2, AtMlo3, AtMlo4, AtMlo5, AtMlo6, AtMlo7, AtMlo8, AtMlo9, AtMlo10, AtMlo11, AtMlo12, AtMlo13, AtMlo14 o AtMlo15, Linum usitatissimum (lino) MLO, Triticum aestivum (trigo) MLO, Glycine max (soja) Mlo, especialmente preferiblemente GmMlol, GmMlo2, GmMlo3.1 o GmMlo3.2, o un MLO que es esencialmente funcionalmente equivalente a una cualquiera de dichas proteínas MLO.
Particularmente preferiblemente, el MLO utilizado para la presente invención es un MLO seleccionado del grupo que consiste de un MLO que tiene una secuencia de aminoácidos como se describe en cualquiera de las SEQ ID NOs: 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 y 48, o un MLO que tiene una secuencia de aminoácidos que es esencialmente funcionalmente equivalente a cualquiera de las secuencias MLO descritas en la SEQ ID NOs: 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 y 48.
En el alcance de la presente invención, el "contenido" de una proteína MLO se considera que es la cantidad de proteína MLO como se puede determinar para el tipo natural de una planta o célula de planta con y/o sin inoculación de patógeno. Diversos métodos que son apropiados para determinar la cantidad de MLO en las células de planta se describirá adelante. Todas aquellas técnicas son métodos de laboratorio de rutina bien conocidos por la persona experta. Los protocolos exactos se pueden aprender de cualquier texto de laboratorio estándar.
La cantidad de ARN MLO (es una indicación indirecta para la cantidad de proteína) se puede determinar por medio de un PCR de Transcriptasa Inversa (RT-PCR): 1. Aislamiento de ARN total. 2. Transcripción inversa para el cADN utilizado Cebador poli-T o Cebador de hexámero aleatorio. 3. PCR con cebadores específicos Mlo utilizando cADN como Plantilla. (O RT-PCR de una etapa utilizando QuiagenKit).
Otra posibilidad para cuantificar la cantidad de ARN MLO es la técnica Northern Blot. Este método se basa en la transferencia de las moléculas de ARN electroforéticamente separadas en un gel en una lámina absorbente, que luego se sumerge en la sonda marcada que hibridará a un ARN de interés para revelar su presencia.
La cantidad de proteína se puede determinar por medio de la técnica Western Blot (inmunotransferencia): Este es un método para detectar la proteína en una muestra dada de homogenato o extracto de tejido. Este utiliza electroforesis el gel para separar las proteínas desnaturalizadas por la masa. Las proteínas luego se transfieren del gel y en una membrana (típicamente nitrocelulosa), cuando se "sondean" utilizando anticuerpos específicos para la proteína.
El teñido inmunohistoquímico también es una herramienta valiosa para detectar antígenos específicos en los tejidos. Con el fin de realizar el procedimiento de teñido estándar, primero la sección de tejido tiene que ser desparafinizado y luego rehidratado antes de aplicar el anticuerpo principal. Los anticuerpos secundarios conjugados mediante enzimas se aplican luego y pueden visualizar teñido específico después de agregar el sustrato específico de enzima. Ocasionalmente, cuando se observa teñido débil o no teñido, se puede requerir un antígeno "desenmascarador" mediante digestión de enzima.
La "actividad" de una proteína MLO significa su capacidad para realizar su función celular, especialmente la interacción con sus patrones de unión patogénicos o fisiológicos, más especialmente con ROR2 y/o calmodulina. La interacción de MLO con Calmodulina y/o Ror2 se puede detectar utilizando métodos de interacción de proteínaproteína estándar. Se muestra que la calmodulina interactúa con MLO en el sistema de dos híbridos de levadura (división-ubiquitina) (ver Kim M.C. Journal of Biological Chemistry. 277(22):19304-19314, 2002 May 31; y Kim M.C. Nature. 416(6879):447-450, 2002 Mar 28). Adicionalmente se muestra la interacción del experimento GSTdesplegable (ver Kim M.C. Nature. 416(6879):447-450, 2002 Mar 28). La interacción de la sintaxina ROR2 y MLO se muestra por FRET (ver Bhat R.A. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102(8): 3135-3140, 2005 Feb 22).
Otros métodos para detectar las interacciones de proteína-proteína también se puede aplicar a MLO y sus patrones de interacción. El sistema de división-ubiquitina es un sistema apropiado para encontrar nuevos patrones de interacción (como se describe en Kim et al. 2002, vide supra), pero también se puede utilizar una transformación transitoria basada (alto rendimiento) en detección FRET o Complementación de Bi-Fluorescencia (BiFC). En ambos casos el cebo MLO se fusiona a una proteína fluorescente (YFP f.l. para FRET y la mitad del terminal N o C de YFP para BiFC). Para la presa, una colección de cADN se fusiona a CFP (FRET) o la mitad de complementariedad de YFP (BiFC). Cebo y presa se co-expresan transitoriamente en células de epidermis o protoplastos. La fluorescencia se mide por CLSM o fotómetro de fluorescencia.
También se describe que cuando el contenido y/o la actividad de una proteína MLO se altera dentro de una planta o una célula de planta, se puede reducir o aumentar en comparación con el tipo natural. El aumento del contenido de MLO se puede lograr mediante un aumento de la cantidad de MLO endógeno (es decir el MLO que es o mediante la introducción de una cantidad adicional de MLO en las plantas o células de planta. La reducción del contenido MLO en las plantas o células de planta de acuerdo con la invención se logra de manera general en la reducción de la cantidad de MLO endógeno. De acuerdo con lo anterior, el aumento de la actividad MLO se puede lograr por un aumento de la actividad de MLO endógeno y/o la introducción de una cantidad adicional de MLO funcional. Se puede lograr una reducción de la actividad MLO mediante la reducción de la actividad del MLO endógeno. De forma similar, una reducción de la actividad MLO también puede significar que la actividad del MLO endógeno no se modifica, pero su interacción con los patrones de unión fisiológicos o patogénicos se inhibe, por ejemplo por medio de la expresión de un MLO no funcional o de un anticuerpo anti-MLO o un inhibidor MLO. En otras palabras, la interacción de una proteína MLO con sus compañeros de unión se suprime esencialmente y/o se evita sustancialmente. De acuerdo con lo anterior, una realización preferida de la presente invención está dirigida a un método para aumentar la resistencia contra la roya de la soja en plantas transgénicas y/o células de planta, caracterizado porque el contenido y/o la actividad de por lo menos una proteína MLO endógena se reduce en comparación con el tipo natural.
La reducción del contenido y/o actividad de MLO en una planta transgénica o célula de planta de acuerdo con la invención es preferiblemente por lo menos 10 %, 15%, 20 % o 25 %, más preferiblemente por lo menos 30 %, 35 %, 40 % o 45 %, especialmente preferiblemente por lo menos 50 %, 55 %, 60 % o 65 %, particularmente preferiblemente por lo menos 70 %, 75 %, 80 % o 85 %, y más preferiblemente por lo menos 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %.
La reducción del contenido y/o la actividad de una proteína MLO se puede lograr mediante diferentes medios. Un método preferido es la transferencia de por lo menos una molécula de ácido nucleico que comprende por lo menos una secuencia que es idéntica, homóloga o complementaria a la secuencia o secuencias que codifican el MLO endógeno o fragmentos del mismo a las células de planta.
De acuerdo con la presente invención, una "molécula de ácido nucleico" puede ser una molécula de ADN, por ejemplo que comprende una secuencia genómica o una secuencia de cADN, o una molécula de ARN. La molécula puede ser de hebra sencilla o de hebra doble. Ejemplos de tales moléculas son moléculas o vectores de ARN de hebra doble, por ejemplo plásmidos, cósmidos, virus recombinantes o minicromosomas. La molécula de ácido nucleico puede comprender secuencias que se derivan de las especies de la célula anfitriona o de otro organismo / especie. Adicionalmente, aquellas secuencias pueden ser naturales o modificadas o sintéticas.
La "transferencia" de una molécula de ácido nucleico en una planta o célula de planta se puede realizar mediante diferentes métodos. Preferiblemente, la transferencia ocurre por medio de transformación, transfección (estable o transitoria), inyección, métodos biolísticos y/o electroporación, especialmente cuando la molécula de ácido nucleico es ADN. El ADN por ejemplo puede estar presente en la forma de un vector o una "construcción de terminador de gen promotor" lineal sin una estructura principal del vector común. Cuando la molécula es un ARN de hebra doble, la transferencia se puede realizar por medio de métodos biolísticos. El experto está familiarizada con aquellos métodos y será fácilmente capaz de identificar el mejor método de transferencia para sus requerimientos actuales. Algunos de los métodos de transferencia se describirán en detalle (ver adelante).
Una secuencia de ácidos nucleicos que es "idéntica" a una secuencia que codifica una proteína MLO (o fragmentos de la misma) significa que es idéntica sobre una cierta región, preferiblemente sobre la región completa de una de las secuencias.
Una secuencia de ácidos nucleicos que es "homóloga" a una secuencia que codifica una proteína MLO (o fragmentos de la misma) significa, en el alcance de la presente invención, que la secuencia es por lo menos 40 % o 50 %, preferiblemente por lo menos 55% o 60 %, más preferiblemente por lo menos 65 % o 70 %, especialmente preferiblemente por lo menos 75 % o 80 %, particularmente preferiblemente por lo menos 85 % o 90 %, y más preferiblemente por lo menos 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % similar a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica cualquiera de las proteínas MLO descritas en la SEQ ID NOs: 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 y 48 o sus partes funcionalmente equivalentes o fragmentos. Preferiblemente, la homología se determina sobre la longitud de la secuencia completa de las moléculas de ácido nucleico. El MLO que codifica las secuencias de ácidos nucleicos se puede deducir fácilmente de dichas secuencias de aminoácidos por cualquier persona experta. Algunas de las secuencias de ácidos nucleicos codificantes respectivas se describen en la SEQ ID NOs: 1, 3, 5,6, 8, 10, 12, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 y 47. Aquellas secuencias por supuesto no son limitantes. El experto también adaptará las secuencias de ácidos nucleicos al uso de codón preferido de la célula anfitriona.
La siguiente Tabla 2 da una visión general de las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos mencionadas anteriormente:
- SEQ ID NO:
- Organismo Nombre Ácido nucleico /aminoácido Comentario Número de acceso NCBI
- 1
- Hordeum vulgare HvMlo HvMlo na aa tn, longitud completa tn, longitud completa P93766
- 2
- 3
- Glycine max Oryza sativa Linum usitatissimum GmMlo 1 na longitud completa
- 4
- GmlMlo 1 aa longitud completa
- 5
- GmMlo2 na genómico parcial
- 6
- GmMlo2 na EST, parcial
- 7
- GmMlo2 aa EST
- 8
- GmMlo3.1 na longitud completa
- 9
- GmMlo3.1 aa longitud completa
- 10
- GmMlo3.2 na EST
- 11 12
- GmMlo3.2 OsMlo aa na predicha parcial
- 13
- OsMlo na genómico
- 14 15
- OsMlo LuMlo aa na 049914
- 16
- LuMlo aa CAA06487
- 17
- Triticum aestivum TaMlo na
- 18
- TaMlo aa AAS93630
- 19
- Arabidopsis thaliana AtMlo1 na
- 20
- AtMlo1 aa 049621
- 21
- AtMlo2 na
- 22
- AtMlo2 aa Q9SXB6
- 23
- AtMlo3 na
- 24
- AtMlo3 aa Q94KB9
(continuación)
- SEQ ID NO:
- Organismo Nombre Ácido nucleico /aminoácido Comentario Número de acceso NCBI
- 25
- AtMlo4 na
- 26
- AtMlo4 aa 023693
- 27
- AtMlo5 na
- 28
- AtMlo5 aa 022815
- 29
- AtMlo6 AtMlo6 na aa Q94KB7
- 30
- 31
- AtMlo7 na
- 32
- AtMlo7 aa 022752
- 33
- AtMlo8 na
- 34
- AtMlo8 aa 022757
- 35
- AtMlo9 AtMlo9 na aa Q94KB4
- 36
- 37
- AtMlo10 na
- 38
- AtMlo10 aa Q9FKY5
- 39
- AtMlo11 na
- 40
- AtMlo11 aa Q9FI00
- 41
- AtMlo12 na
- 42
- AtMlo12 aa 080961
- 43
- AtMlo13 na
- 44
- AtMlo13 aa Q94KB2
- 45
- AtMlo14 na
- 46
- AtMlo14 aa Q94KB1
- 47
- AtMlo15 na
- 48
- AtMlo15 aa NP_973686
De acuerdo con una realización preferida de la invención, una parte de la molécula de ácido nucleico transferida es por lo menos 50 %, más preferiblemente por lo menos 60 %, especialmente preferiblemente por lo menos 70 %, particularmente preferiblemente por lo menos 80 %, también particularmente preferiblemente por lo menos 90 %, y más preferiblemente por lo menos 95 % homóloga a la secuencia que codifica el MLO endógeno o fragmentos del mismo.
Una secuencia de ácidos nucleicos que es "complementaria" a una secuencia que codifica una proteína MLO (o fragmentos de la misma) significa, en el alcance de la presente invención, que la secuencia puede hibridar bajo condiciones rigurosas con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína MLO (o fragmentos de la misma) debido a enlaces de hidrógeno entre las bases complementarias. Esta hibridación ha sido específica. El experto en la técnica sabe que las dos secuencias no necesitan tener 100 % de complementariedad con el fin de hibridar entre sí. Aquí, una secuencia de ácidos nucleicos "complementaria" es por lo menos 40 % o 50 %, preferiblemente por lo menos 55 % o 60 %, más preferiblemente por lo menos 65 % o 70 %, especialmente preferiblemente por lo menos 75 % o 80 %, particularmente preferiblemente por lo menos 85 % o 90 %, y más preferiblemente por lo menos 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % complementaria a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica cualquiera de las proteínas MLO descritas en la SEQ ID NOs: 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 y 48 o sus partes funcionalmente equivalentes o fragmentos.
En el contexto de esta invención el término "hibridación bajo condiciones rigurosas" significa que la hibridación se realiza in vitro bajo condiciones rigurosas suficientes para asegurar una hibridación específica. La hibridación exigente in vitro se conoce por el experto en la técnica, y se puede encontrar en la literatura (por ejemplo Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY). El término "hibridación específica" se refiere al hecho que la molécula se une preferiblemente a ciertas secuencias de ácidos nucleicos, la secuencia objetivo, bajo condiciones rigurosas, si la secuencia objetivo es parte de una mezcla compleja de, por ejemplo, moléculas de ADN o ARN, pero no se une, o por lo menos a un grado considerablemente menor, a otras secuencias.
Las condiciones rigurosas dependen de las condiciones. Las secuencias más largas hibridan específicamente a temperaturas mayores. En general, las condiciones rigurosas se seleccionan de tal manera que la temperatura de hibridación es aproximadamente 5° C por encima del punto de fusión (Tm) para la secuencia específica en una resistencia iónica definida y un valor de pH definido. Tm es la temperatura (a un valor de pH definido, una resistencia iónica definida y una concentración de ácido nucleico definida) en el que 50 % de las moléculas complementarias a la secuencia objetivo hibridan a la secuencia objetivo en el estado de equilibrio. Típicamente, las condiciones rigurosas son aquellas en las que la concentración de sal es por lo menos aproximadamente 0.01 a 1.0 M de concentración del ión de sodio (o la concentración de otra sal) a un pH de entre 7.0 y 8.3 y la temperatura es por lo menos 30° C para las moléculas cortas (es decir por ejemplo 10 a 50 nucleótidos). Adicionalmente, las condiciones rigurosas comprenden la adición de agentes, tales como formamida, que desestabiliza los híbridos. Un ejemplo no limitante, preferido para las condiciones de hibridación exigentes son hibridaciones en 6 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45° C, seguido por una o más etapas de lavado en 0.2 x SSC, 0.1 % de SDS de 50 a 65° C. Los rangos de temperatura, por ejemplo, bajo condiciones de hibridación estándar dependiendo del tipo de ácido nucleico, entre 42° C y 58° C en un regulador acuoso en una concentración de 0.1 a 5 x SSC (pH 7.2).
Si un solvente orgánico, por ejemplo 50 % de formamida, está presente en el regulador mencionado anteriormente, la temperatura bajo condiciones estándar es aproximadamente 42° C. Preferiblemente, las condiciones de hibridación para los híbridos de ADN:ADN son por ejemplo 0.1 x SSC y 20° C a 45° C, preferiblemente 30° C a 45°
C. Preferiblemente, las condiciones de hibridación para los híbridos ADN:ARN son por ejemplo 0.1 x SSC y 30° C a 55° C, preferiblemente entre 45° C a 55° C. Las temperaturas de hibridación mencionadas anteriormente se determinan por ejemplo para un ácido nucleico que tiene una longitud de aproximadamente 100 pares base y un contenido G/C de 50 % en la ausencia de formamida. El experto en la técnica sabe cómo las condiciones de hibridación requeridas se pueden determinar utilizando los textos mencionados anteriormente, o los siguientes textos: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), Hames und Higgins (publisher) 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (publisher) 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
La hibridación típica y los reguladores de lavado, por ejemplo tienen la siguiente composición (este ejemplo no es limitante):
Solución de prehibridación: 0.5 % de SDS 5x SSC 50 mM NaPO4, pH 6.8
0.1 % de pirofosfato Na 5x de solución de Denhardt 100 μg/ml de esperma de salmón
Solución de hibridación: Solución de prehibridación 1x106 cpm/ml de sonda (5-10 min 95° C)
20x SSC: 3 M NaCl 0,3 M citrato de sodio ad pH 7 con HCI
50x de reactivo de Denhardt: 5 g de Ficoll 5 g de povidona 5g de albúmina de suero bovino ad 500 ml A. dest.
Un método típico para hibridación es como sigue (este ejemplo no es limitante): Opcional: 30 min de transferencia de lavado en 1 x SSC/ 0.1 % de SDS a 65° C Prehibridación: Por lo menos 2 hrs a 50-55° C Hibridación: Durante la noche a 55-60°C
- temp.:
- 05 min 2x SSC/ 0.1% SDS hibridación
- lavado
- 30 min
- 2x SSC/ 0.1% SDS temp. hibridación
- 30 min
- 1x SSC/ 0.1% SDS temp. hibridación
- 45 min
- 0.2x SSC/ 0.1% SDS 65°C
- 5 min
- 0.1xSSC Temperatura ambiente
El experto en la técnica sabe que las soluciones específicas y el protocolo mostrado puede o se debe modificar dependiendo de la aplicación.
También se describe que una parte de la molécula de ácido nucleico transferida es por lo menos 50 %,
5 preferiblemente por lo menos 60 %, más preferiblemente por lo menos 70 %, especialmente preferiblemente por lo menos 80 %, particularmente preferiblemente por lo menos 90 %, y más preferiblemente por lo menos 95 % de complementariedad a la secuencia que codifica el MLO endógeno o fragmentos del mismo.
También se describe que la parte de la molécula de ácido nucleico transferida que es idéntica, homóloga o complementaria a las secuencias que codifican el MLO endógeno o fragmentos del mismo comprende 20 a 1000 nucleótidos, preferiblemente 20 a 750 nucleótidos, más preferiblemente 20 a 500 nucleótidos, especialmente preferiblemente 20 a 250 nucleótidos, particularmente preferiblemente 20 a 150 nucleótidos, también particularmente preferiblemente 20 a 100 nucleótidos y más preferiblemente aproximadamente 20 a 50 nucleótidos.
La reducción del contenido y/o la actividad del por lo menos un MLO endógeno se puede lograr mediante diferentes métodos, por ejemplo mediante interferencia de ARN (ARNi), una construcción anticodificante, una construcción de
15 co-supresión, inactivación del gen post-transcripcional (PTGS), una construcción P de ribonucleasa, recombinación homóloga, una construcción de ribozima o inactivación del gen inducido por el virus (VIGS). Los métodos se explicarán adelante.
Una resistencia aumentada contra la roya de la soja en plantas transgénicas o células de planta tienen un contenido / actividad de MLO reducido que se puede lograr, por ejemplo, mediante el proceso de "inactivación". Durante este proceso, un ácido nucleico que codicia por lo menos un MLO o fragmentos de los mismos y/o un ácido nucleico que es complementario a este se transfiere a una célula de planta. Con el fin de asegurar que la célula de planta es transgénica para el ácido nucleico transferido, usualmente el ácido nucleico que se va a transferir es parte de un vector, por ejemplo un plásmido, que es capaz de replicar establemente dentro de la célula o que asegura la integración del ácido nucleico transferido dentro del genoma de la planta.
25 Preferiblemente la inactivación de mlo se realiza por medio del método RNAi. En este método, se transfiere un vector a una célula de planta que comprende los siguientes elementos en la orientación 5’-3’: una secuencia promotora que es funcionalmente activa en las plantas, ligado operativamente a una secuencia anticodificante que es complementaria a la secuencia que codifica por lo menos un MLO o fragmentos de los mismos (o un homólogo de esta secuencia anticodificante), en donde la secuencia tiene secuencias exón 3’ en su extremo 3’ que se pueden reconocer por el spliceosoma, ligado operativamente a un intrón, ligado operativamente a una secuencia codificante que es idéntica o homóloga a la secuencia que codifica por lo menos un MLO o fragmentos de los mismos, en donde la secuencia tiene secuencias exón 5’ en su extremo 5’ que se pueden reconocer por el spliceosoma, y opcionalmente, ligado operativamente a una secuencia de terminación que es funcionalmente active en las plantas. Por supuesto, la posición de la secuencia codificante y anticodificante se puede intercambiar. Es obvio para la
35 persona experta que en este caso, el sitio de división respectivo 3’ y el sitio de división 5’ necesitan ser adaptados.
Cuando aquellos vectores se transfieren establemente a las células de planta, la transcripción conduce a la generación de un premARN que contiene un primer exón que comprende la secuencia anticodificante, un intrón, y un segundo exón que comprende la secuencia codificante. El intrón luego se retira por medio de los procesos de división, que resulta en una molécula de ARN continuo que tiene regiones que son complementarias entre sí. Esta molécula desarrollará una estructura de hebra doble (Smith et al., 2000, Nature, 407:319-320).
Aquellas moléculas RNS de doble hebra que son capaces de inactivar específicamente el MLO mRNA por medio de la inducción del sistema PTGS (activación del gen post transcripcional). Como una consecuencia, la proteína MLO no se puede expresar en ninguna forma. La elección de las secuencias codificante y anticodificante permite determinar qué tipo de mlo se debe suprimir. El experto es capaz de identificar las secuencias que son
45 características para la proteína. El sabe adicionalmente que una multitud de proteínas MLO se puede inactivar cuando se utilizan muchas secuencias características correspondientes.
Este método de ARNi puede comprender las siguientes etapas:
a) Construcción de un vector que comprende las siguientes secuencias de ácidos nucleicos en la orientación 5’-3’:
- -
- una secuencia promotora que es funcionalmente activa en las plantas,
- -
- ligar operativamente una secuencia anticodificante que es complementaria a la secuencia que codifica por lo menos un MLO o fragmentos de los mismos, o un homólogo de esta secuencia anticodificante, en donde la secuencia tiene las secuencias de exón 3’ en su extremo 3’ que se pueden reconocer por el spliceosoma,
- -
- ligar operativamente un intrón,
- -
- ligar operativamente una secuencia codificante que es idéntica o homóloga a la secuencia que codifica por lo menos un MLO o fragmentos de los mismos, en donde la secuencia tiene secuencias exón 5’ en su extremo 5’ que se pueden reconocer el spliceosoma,
- -
- opcionalmente, ligar operativamente una secuencia de terminación que es funcionalmente activa en las plantas,
b) transferencia del vector de la etapa a) a una célula de planta y opcionalmente la integración dentro del genoma de la planta.
La persona experta sabe que vectores para seleccionar para la implementación del método de ARNi o el método PTGS. Aquellos vectores por ejemplo se pueden construir en una forma permitir las secuencias codificante y anticodificante para ser transcritas de cualquier promotor apropiado, para hibridar dentro de la célula y para inducir el sistema PTGS (Tuschl, 2002, Nat. Biotechnol. 20, 446-448; Miyagishi et al., 2002, Nat. Biotechnol., 20, 497-500; Lee et al., 2002, Nat. Biotechnol., 20, 500-505). Otros vectores combinan la secuencia codificante y anticodificante por medio de una secuencia "bucle" y se transcriben de cualquier promotor apropiado. El retroplegado del bucle le permite a la secuencia codificante y anticodificante hibridar, para formar ARN de hebra doble y para inducir el sistema PTGS (Tuschl, 2002, vide supra; Paul et al., 2002, Nat. Biotechnol., 20, 505-508; Paddison P.J. Genes Dev. 2002 Apr 15; 16(8):948-58; Brummelkamp et al., 2002, Science, 296, 550-553).
En otro método de ARNi, las moléculas de ARN de doble hebra pre-sintetizadas que comprenden las secuencias codificante y anticodificante mencionadas anteriormente se transfieren directamente en las células de planta, por ejemplo por medio de métodos biolísticos. De acuerdo con lo anterior, este método de ARNi puede comprender las siguientes etapas:
a) Construcción de una molécula de ARN de doble hebra que tiene una longitud de 15 a 100 nucleótidos, preferiblemente de 20 a 75 nucleótidos, más preferiblemente de 20 a 50 nucleótidos, especialmente preferiblemente de 20 a 40 nucleótidos, particularmente preferiblemente de 20 a 30 nucleótidos y más preferiblemente de 20 a 25 o 21, 22 o 23 nucleótidos, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que tiene una hebra codificante que es idéntica u homóloga a un fragmento de las secuencias que codifican por lo menos un MLO endógeno,
b) transferencia de la molécula de la etapa a) a una célula de planta.
También se describe que los vectores que se utilizan para la transferencia de ácidos nucleicos comprenden, en la orientación 5’-3’: una secuencia promotora, una secuencia codificante que es idéntica u homóloga a la secuencia que codifica por lo menos un MLO endógeno o fragmentos del mismo, en donde la secuencia tiene regiones autocomplementarias, y opcionalmente una secuencia de terminación. La transcripción de aquellos vectores en la célula de planta resulta en la generación de las moléculas de ARN que contienen las regiones de secuencia que son capaces de hibridar consigo mismas. Esto puede conducir a la formación de moléculas de ARN de hebra doble dentro de la célula, que puede inducir el sistema PTGS y que resulta en la degradación específica de mARN mlo. Este método para la inactivación de las proteínas de planta, así llamado cosupresión, requiere que el mARN del MLO que se va a suprimir contiene regiones que son complementarias entre sí. Tales regiones se pueden identificar mediante la persona experta por una inspección visual de la secuencia de ADN codificante respectiva o por medio de programas de secuencia como DNAStar de DNAStar Inc., Madison, USA.
Este método de cosupresión puede comprender las siguientes etapas:
a) Construcción de un vector que comprende las siguientes secuencias de ácidos nucleicos en la orientación 5’-3’:
- -
- una secuencia promotora que es funcionalmente activa en las plantas,
- -
- ligar operativamente una secuencia codificante que es idéntica u homóloga a la secuencia que codifica por lo menos un MLO endógeno o fragmentos del mismo, en donde la secuencia tiene regiones auto-complementarias,
- -
- opcionalmente, ligar operativamente una secuencia de terminación que es funcionalmente activa en las plantas,
b) transferencia del vector de la etapa a) a una célula de planta y opcionalmente la integración dentro del genoma de la planta.
También se describe que los vectores que se utilizan para la transferencia de los ácidos nucleicos comprenden, en la orientación 5’-3’: una secuencia promotora, ligar operativamente una secuencia anticodificante que es complementaria a la secuencia que codifica por lo menos un MLO endógeno o fragmentos del mismo (o un homólogo de esta secuencia anticodificante), y opcionalmente una secuencia de terminación. La transcripción de aquellos vectores de las células de planta resulta en la generación de una molécula de ARN, la secuencia que es complementaria al mARN que codifica un MLO o partes del mismo. La hibridación de la secuencia anticodificante con las secuencias de mARN endógeno de mlo in vivo que luego conducir a la supresión de la expresión de MLO en
5 las células de planta.
Este método anticodificante puede comprender las siguientes etapas:
a) construcción de un vector que comprende las siguientes secuencias de ácidos nucleicos en la orientación 5’-3’:
- -
- una secuencia promotora que es funcionalmente activa en plantas,
- -
- ligar operativamente una secuencia anticodificante que es complementaria a la secuencia que codifica por lo 10 menos un MLO endógeno o fragmentos del mismo, o un homólogo de esta secuencia anticodificante,
- -
- opcionalmente, ligar operativamente una secuencia de terminación que es funcionalmente activa en las plantas,
b) transferencia del vector de la etapa a) a una célula de planta y opcionalmente la integración dentro del genoma de la planta.
También se describe que los vectores que se utilizan para la transferencia de los ácidos nucleicos comprenden en la
15 orientación 5’-3’: una secuencia promotora, ligar operativamente una secuencia de ADN que codifica una ribozima que reconoce específicamente el mARN del por lo menos un MLO, y opcionalmente una secuencia de terminación. Se conoce bien por la persona experta cómo producir ribozimas que tienen una actividad de endonucleasa que está dirigida contra un mARN específico. En detalle, este método por ejemplo se describe en Steinecke P et al. (EMBO J. 1992 Apr; 11(4):1525-30). En el contexto de la presente invención, el término "ribozima" también comprende
20 aquellas secuencias de ARN que incluyen además de las secuencias líderes en sí mismas de ribosima que son complementarias al mARN del MLO o fragmentos de los mismos y que por lo tanto son capaces de guiar la ribozima específica de mARN aún más eficientemente para el sustrato de mARN.
Este método de ribozima puede comprender las siguientes etapas:
a) construcción de un vector que comprende las siguientes secuencias de ácidos nucleicos en la orientación 5’-3’:
25 -una secuencia promotora que es funcionalmente activa en plantas,
- -
- ligar operativamente una secuencia de ADN que codifica una ribozima que reconoce específicamente el mARN del por lo menos un MLO endógeno,
- -
- opcionalmente, ligar operativamente una secuencia de terminación que es funcionalmente activa en plantas,
b) transferencia del vector de la etapa a) a una célula de planta y opcionalmente la integración dentro del genoma de 30 la planta.
Otra alternativa para aumentar la resistencia contra la roya de la soja en plantas transgénicas o células de planta es la transferencia de ácidos nucleicos por medio de vectores que comprenden en la orientación 5’-3’: una secuencia promotora, ligar operativamente una secuencia anticodificante de ADN que es complementaria a la secuencia que codifica el mARN del por lo menos un MLO o fragmentos de los mismos, ligar operativamente una secuencia que 35 codifica una ribonucleasa P (ARNsa P), y opcionalmente, ligar operativamente una secuencia de terminación. La transcripción de estos vectores en la célula resulta en las moléculas de ARN que incluyen una secuencia líder (la secuencia anticodificante), que guía el ARNsa P al MLO mARN, después de lo cual ocurre la degradación del mARN mediante el ARNsa P (ver Patente Estadounidense 5,168,053). Preferiblemente, la secuencia líder comprende 10 a 15 nucleótidos que son complementarias a la secuencia de ADN del MLO, y una secuencia de nucleótido 3’-NCCA,
40 en donde el N es preferiblemente una purina. Los transcriptos de la secuencia líder externa que une el mARN objetivo por medio de la formación de pares base, que permite la degradación del mARN por el ARNsa P en el nucleótido 5’ de la región pareada. Este mARN degradado no se puede traducir en una proteína funcional.
Este método de ARNsa P puede comprender las siguientes etapas:
a) construcción de a vector que comprende las siguientes secuencias de ácidos nucleicos en la orientación 5’-3’:
45 -una secuencia promotora que es funcionalmente activa en plantas,
- -
- ligar operativamente una secuencia de ADN que es complementaria a la secuencia que codifica el mARN del por lo menos un MLO o fragmentos de los mismos,
- -
- ligar operativamente una secuencia que codifica una ribonucleasa P,
- -
- opcionalmente, ligar operativamente una secuencia de terminación que es funcionalmente activa en las plantas,
5 b) transferencia del vector de la etapa a) a una célula de planta y opcionalmente la integración dentro del genoma de la planta.
Adicionalmente, se pueden utilizar vectores para el método de acuerdo con la invención, que comprenden la siguiente secuencia en la orientación 5’-3’: una secuencia de ADN que es idéntica o homóloga a la secuencia que codifica el extremo 5’ del por lo menos un MLO endógeno, una secuencia promotora, ligar operativamente una 10 secuencia de ADN que codifica un gen de resistencia o reportero, opcionalmente una secuencia de terminación, y una secuencia de ADN que es idéntica u homóloga a la secuencia que codifica el extremo 3’ del por lo menos un MLO endógeno. Aquellos vectores se pueden utilizar con el fin de inducir una inactivación específica del MLO de interés por medio de recombinación homóloga. La secuencia del gen de resistencia o reportero se inserta en aquellas células de planta en las que ha ocurrido la recombinación homóloga, de tal manera que no se puede 15 producir mARN mlo funcional en la célula. Las células de planta en las que ha ocurrido la recombinación se pueden identificar mediante la selección de la resistencia o el gen reportero. El experto sabe cómo producir aquellos vectores para inactivación génica por medio de la recombinación homóloga, cuyos elementos se tienen que comprometer (promotores, mejoradores, secuencias de flanqueo) y cómo identificar las células de planta respectivas. Usualmente, se utilizan genes de resistencia antibiótica como genes de resistencia (Amp, Kan etc.). Por
20 supuesto, se pueden utilizar todos los otros genes de resistencia posibles que permiten la selección la selección de las células en las que ha ocurrido la recombinación. Además de los genes de resistencia clásicos, se pueden utilizar otros genes indicadores para la detección y/o selección de las plantas y células de planta en las que ha ocurrido la recombinación homóloga, tales como GUS, GFP etc.
Este método de recombinación homóloga puede comprender las siguientes etapas:
25 a) construcción de un vector que comprende las siguientes secuencias de ácidos nucleicos en la orientación 5’-3’:
- -
- una secuencia de ADN que es idéntica o homóloga a la secuencia que codifica el extremo 5’ de por lo menos un MLO endógeno,
- -
- una secuencia promotora que es funcionalmente activa en plantas,
- -
- ligar operativamente una secuencia de ADN que codifica un gen de resistencia o reportero,
30 -opcionalmente, ligar operativamente una secuencia de terminación que es funcionalmente activa en las plantas,
- -
- una secuencia de ADN que es idéntica o homóloga a la secuencia que codifica el extremo 3’ de por lo menos un MLO endógeno,
b) transferencia del vector de la etapa a) a una célula de planta y opcionalmente la integración dentro del genoma de la planta.
35 De acuerdo con la presente invención, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un MLO o fragmentos de los mismos pueden tener la secuencia de ADN de codificación completa para MLO o la secuencia de mARN completa o fragmentos de los mismos. Debido a que algunos de los métodos mencionados anteriormente para la producción de plantas transgénicas, se dirige a una reducción significativa de la expresión de mlo, se basan en una hibridación específica de un mARN mlo endógeno y las secuencias que se generan durante la transcripción de los
40 vectores mencionados anteriormente (por ejemplo la estrategia anticodificante), la persona experta sabe que los ácidos nucleicos transferidos no han contenido necesariamente la secuencia completa que codifica el MLO, independiente de si es una secuencia codificante o una secuencia anticodificante. De hecho, las regiones relativamente cortas de las secuencias que codifican el MLO son suficientes para una hibridación específica y una inactivación eficiente.
45 Aquellas secuencias de los vectores que corresponden a las regiones de secuencia del MLO mARN y que se transcriben para generar moléculas de ARN de hebra doble que pueden tener una longitud de aproximadamente 25 nucleótidos, preferiblemente 21, 22 o 23 nucleótidos. Las secuencias que se transfieren por la estrategia anticodificante comprenden usualmente entre 20 y 1000 nucleótidos, preferiblemente entre 20 y 800 nucleótidos, más preferiblemente entre 400 y 800 nucleótidos, especialmente preferiblemente entre 500 y 750 nucleótidos. Pero
50 también es posible utilizar secuencias que comprendan entre 20 y 500, entre 20 y 300, entre 20 y 150, entre 20 y 100 o entre 20 y 50 nucleótidos. El experto sabe que para el ARNi o el método PTGS, los ARN codificante y anticodificante que se utilizan para la generación de moléculas de ARN de hebra doble que también pueden comprender aproximadamente 21, 22 o 23 nucleótidos con una característica 3’ sobresaliente (Tuschl, 2002, Nat. Biotechnol. 20, 446-448).
Cuando los ácidos nucleicos se transfieren a las células de planta, y la transcripción de aquellas secuencias en la célula resulta en secuencias que son complementarias al MLO mRNA (por ejemplo utilizando la estrategia anticodificante), aquellas secuencias transferidas no necesitan ser 100 % complementarias al mARN. Será suficiente si las secuencias son por lo menos 50 %, preferiblemente por lo menos 60 %, más preferiblemente por lo menos 70 %, especialmente preferiblemente por lo menos 80 %, particularmente por lo menos 90 % y más preferiblemente por lo menos 95 % complementarias. Las diferencias pueden ser el resultado de las inserciones, eliminaciones y/o sustituciones, preferiblemente sustituciones. El experto sin embargo sabe que con la complementariedad reducida, se aumentará la probabilidad de inactivar diversos mARN mlo.
En general, solo se pueden utilizar aquellas secuencias complementarias para la presente invención que son capaces de hibridar específicamente con regiones del MLO mRNA. Las secuencias que hibridan in vivo con las regiones de ARN de las proteínas diferentes a MLO y que provocan su inactivación no son adecuadas para la presente invención. Dependiendo de la secuencia seleccionada y en el grado de complementariedad, una multitud de proteína MLO o se inactivarán solo unas pocas proteínas MLO. También es posible que se inhiba la expresión de solo un mlo específico. La longitud de las secuencias complementarias está preferiblemente entre 20 y 1000 nucleótidos, más preferiblemente entre 20 y 750 nucleótidos, especialmente entre 20 y 500 nucleótidos, particularmente preferiblemente entre 20 y 300 nucleótidos y más preferiblemente entre 20 y 150,20 y 75 o 20 y 50 nucleótidos. También es posible que las secuencias solo comprendan aproximadamente 20 o 25 nucleótidos.
Algunos de los métodos mencionados anteriormente también se pueden realizar con las secuencias que no son parte de la región codificante del MLO mARN o que no son complementarias. Por ejemplo puede ser suficiente que aquellas secuencias derivadas de la región no traducida 5’ o 3’, si aquellas secuencias reguladoras son características para el mARN del MLO respectivo. Aquellas secuencias se pueden utilizar especialmente cuando se induce la inactivación por medio de construcciones de ARN de hebra doble o cuando la traducción de un mARN se inhibe por las construcciones anticodificantes. Por lo tanto, en el contexto de la invención, el término "mARN" no solo comprende las regiones codificantes, sino también las regiones reguladoras que ocurren en un pre-mARN o en el mARN maduro y que son características para el MLO mARN. Lo mismo aplica para la secuencia de ADN, por ejemplo para las secuencias no transcritas, las secuencias promotoras, las secuencias de activación en la dirección 5’, intrones, etc.
Si se utilizan los vectores aquella transcripción resulta en la generación de las moléculas de ARN que tienen una secuencia líder y una ARNsa P, la secuencia líder ha sido suficientemente complementaria con el fin de reconocer específicamente el MLO mARN. Las condiciones permiten a la persona experta seleccionar que parte del MLO mARN se reconoce por la secuencia líder. Preferiblemente las secuencias líderes comprenden aproximadamente 20 nucleótidos, estas sin embargo no deben ser más cortas de aproximadamente 15 nucleótidos. Puede ser suficiente tener una complementariedad de 100 % de la secuencia líder, 12 nucleótidos. Por supuesto, la secuencia líder puede comprender hasta aproximadamente 100 nucleótidos o aún más, debido a que esto aumentará la especificidad para el mARN respectivo.
En el contexto de la presente invención, las "secuencias codificantes" (o las hebras codificantes) son aquellas secuencias que corresponden a la hebra codificante de los genes MLO o fragmentos de los mismos. Aquellas secuencias no necesitan ser necesariamente 100 % idénticas con las secuencias que codifican el MLO de interés. Será suficiente que las secuencias sean similares (homólogas) suficientemente para la secuencias que codifican los MLO que su expresión en las células de planta resulta en una inactivación específica y eficiente del MLO, por ejemplo por medio de interferencia o co-supresión de ARN. Será suficiente si aquellas secuencias son por lo menos 50 %, preferiblemente por lo menos 60 %, más preferiblemente por lo menos 70 %, especialmente preferiblemente por lo menos 80 %, particularmente por lo menos 90 % y más preferiblemente por lo menos 95 % homólogas. Las diferencias pueden ser el resultado de inserciones, eliminaciones, adiciones y/o sustituciones. Cuando las secuencias tienen aquellos grados de identidad, que se llaman usualmente homólogos (ver anterior). El experto sin embargo sabe que con la identidad u homología reducida, se aumentará la probabilidad para inactivar diversos mARN mlo. Las secuencias que tiene un muy bajo grado de similitud u homología, es decir las secuencias que también inactivarán otras proteínas MLO, no son suficientemente específicas y por lo tanto no son adecuadas para la presente invención.
De acuerdo con lo anterior, las "secuencias anticodificantes" (o hebras anticodificantes) son aquellas secuencias que corresponden a la hebra de ADN no codificante de los genes del MLO de interés. Aquellas secuencias no necesitan ser necesariamente 100% idénticas con la secuencia de las hebras de ADN no codificantes de los genes de interés, pero pueden tener los grados mencionados anteriormente de homología. Por ejemplo, la secuencia anticodificante puede ser por lo menos 40 % o 50 %, preferiblemente por lo menos 55 % o 60 %, más preferiblemente por lo menos 65 % o 70 %, especialmente preferiblemente por lo menos 75 % o 80 %, particularmente preferiblemente por lo menos 85 % o 90 %, y más preferiblemente por lo menos 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % homóloga a la hebra mlo no codificante (o complementaria a la hebra codificante). Como se mencionó anteriormente, es suficiente que aquellas secuencias anticodificantes son capaces de hibridar específicamente con el mARN mlo respectivo. La hibridación tiene lugar in vivo bajo condiciones celulares o in vitro. La hibridación de una secuencia anticodificante con una secuencia de mARN endógena usualmente tiene lugar in vivo bajo condiciones celulares.
Los términos "codificante" y "anticodificante" son bien conocidos por el experto en la técnica. El experto en la técnica para inactivar los genes en plantas sabe a partir de la literatura qué tan grandes tienen que ser las moléculas de ácido nucleico, que se utilizan para inactivar, y qué grado de homología o complementariedad han exhibido en relación con las secuencias de interés. En el contexto de la presente invención, no se puede utilizar una secuencia anticodificante que no hibride específicamente con las secuencias codificantes de mlo, es decir que también hibride con las secuencias codificantes de otras proteínas.
La estrategia anticodificante se puede acoplar con un método de ribozima. Las ribozimas son secuencias de ARN catalíticamente activas que, se acoplan a las secuencias anticodificantes, que dividen catalíticamente sus secuencias objetivo (Tanner et al., (1999) FEMS Microbiol Rev. 23 (3), 257-75). Esto puede aumentar la eficiencia de una estrategia anticodificante.
Otros métodos para reducir la expresión de mlo particularmente en plantas comprenden la sobreexpresión de las secuencias de ácidos nucleicos mlo o sus homólogos, lo que resulta en cosupresión (Jorgensen et al., (1996) Plant Mol. Biol. 31 (5), 957-973) o la inducción de la degradación de ARN específico por medio de un sistema de expresión vírico (amplicon) (Angell et al., (1999) Plant J. 20 (3), 357-362). Aquellos métodos también se denominan como PTGS (ver anterior).
Otros métodos son la introducción de mutaciones no codificantes en el gen endógeno por medio de la transferencia de oligonucleótidos de ARN/ADN en la planta (Zhu et al., (2000) Nat. Biotechnol. 18 (5), 555-558) o la generación de mutantes transgénicos por medio de mutagenia de T-ADN (Koncz et al., (1992) Plant Mol. Biol. 20 (5) 963-976) o recombinación homóloga (Hohn et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 8321-8323).
Adicionalmente una represión de gen (pero también la sobreexpresión del gen) también se puede realizar por medio de factores de unión de ADN específicos, por ejemplo factores del tipo de factores de transcripción de dedo de zinc. También, se pueden introducir factores dentro de una célula que inhibe la proteína objetivo. Los factores de unión de proteína pueden ser por ejemplo aptámeros (Famulok et al., (1999) Curr Top Microbiol Immunol. 243, 123-36). Estos se expresan por medio de la sobreexpresión basado en el vector, y su diseño y selección se puede realizar fácilmente por la persona experta.
Se puede encontrar un repaso general sobre los métodos mencionados anteriormente, por ejemplo, en Waterhouse et al., (2001), Nature 411, 834-842; Tuschl (2002), Nat. Biotechnol. 20, 446-448; Paddison et al., (2002), Genes Dev., 16, 948-958; Brummelkamp et al., (2002), Science 296, 550-553.
Otro aspecto de la presente invención es un método para aumentar la resistencia contra la roya de la soja en plantas transgénicas y/o células de planta, en donde el contenido y/o la actividad de por lo menos un MLO endógeno se reduce mediante la expresión de por lo menos un MLO no funcional o un fragmento del mismo que tiene por lo menos una mutación de punto, eliminación y/o inserción. Las proteínas MLO no funcionales se han perdido completamente a un grado muy importante su capacidad para interactuar con los patrones de unión patogénicos o fisiológicos. Aquellos mutantes no funcionales pueden comprender una o más inserciones de aminoácido, eliminaciones o mutaciones de punto. Estos son útiles para la producción de plantas transgénicas o células de planta en las que el contenido de la proteína MLO endógena no se altera, pero la actividad del MLO endógeno se bloquea por medio de la sobreexpresión de dichos mutantes MLO no funcionales. Adicionalmente, aquellas plantas resistentes tienen la ventaja de exhibir un fenotipo esencialmente normal.
Las proteínas MLO no funcionales o mutantes tienen esencialmente el ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos como sus contrapartes funcionales. Sin embargo, estas comprenden una o más inserciones, eliminaciones o mutaciones de punto de nucleótidos o aminoácidos, que provocan una reducción dramática de la capacidad de la proteína MLO mutada para interactuar con sus patrones de unión. El experto tiene una serie de métodos a la mano que le permite insertar mutaciones de punto, eliminaciones o inserciones dentro de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las proteínas MLO funcional o no funcional (Sambrook (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Coldspring Harbour Laboratory Press; "PCR technology: Principle and Applications for DNA Amplification", H. Ehrlich, id, Stockton Press). La eficiencia de unión reducida de aquellos mutantes MLO a los patrones de unión fisiológicos y/o patogénicos en comparación con las proteínas MLO tipo natural (no mutadas) está preferiblemente en el rango sobre 1 % a 90 %, más preferiblemente sobre 1 % a 70 %, especialmente preferiblemente sobre 1 % a 50 %, particularmente preferiblemente sobre 1 % a 30 %, y más preferiblemente sobre 1 % a 10 %.
Aunque los mutantes MLO no funcionales muestran una o más mutaciones de punto, eliminaciones y/o inserciones, el término MLO "no funcional" (también llamado MLO inactivo) no comprende proteínas que no tienen la homología de secuencia esencial a las proteínas MLO funcionales como se describe en la SEQ ID NOs: 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 y 48.
5 Preferiblemente, por lo menos una mutación de punto, eliminación y/o inserción del MLO no funcional evita la función celular de MLO, y especialmente inhibe la interacción de MLO con sus patrones de unión patogénicos o fisiológicos, especialmente con ROR2 y/o calmodulina.
El mutante MLO no funcional se expresa o se sobreexpresa en las plantas transgénicas de acuerdo con la invención que no tiene que ser necesariamente el mismo MLO que el MLO endógeno de la célula anfitriona, pero también se puede derivar de otro organismo / especie. La característica importante del mutante MLO no funcional es su competición con la actividad del MLO endógeno. Por supuesto, un alto grado de homología de secuencia entre aquellas dos proteínas favorecerá una alta actividad competitiva del MLO no funcional.
También se describe que el MLO no funcional es un MLO dominante negativo. El "método dominante negativo" puede comprender las siguientes etapas:
15 a) Construcción de a vector que comprende las siguientes secuencias de ácidos nucleicos en la orientación 5’-3’:
- -
- una secuencia promotora que es funcionalmente activa en plantas,
- -
- ligar operativamente una secuencia de ADN que codifica un mutante negativo dominante del por lo menos un MLO endógeno,
- -
- opcionalmente, ligar operativamente una secuencia de terminación que es funcionalmente activa en las plantas,
b) transferencia del vector de la etapa a) a una célula de planta y opcionalmente la integración dentro del genoma de la planta.
El experto en la técnica puede identificar mutantes negativos dominantes por medio de métodos de rutina. El puede, por ejemplo, introducir mutaciones en una secuencia MLO tipo natural y desarrolla los ensayos de unión in vitro de los mutantes obtenidos con los patrones de unión tales como ROR2 o calmodulina. En la misma forma, la persona
25 experta puede probar si los mutantes no funcionales MLO compiten con sus contrapartes tipo natural en términos de interacción con los patrones de unión conocidos.
Un "mutante dominante negativo", en el alcance de la presente invención, es cada mutante (inserción, eliminación, mutación de punto) que es capaz de inhibir la interacción de un MLO con sus patrones de unión patogénicos o fisiológicos, tales como ROR2 y/o calmodulina.
Las plantas transgénicas o células de planta que tienen una resistencia aumentada contra la roya de la soja también se puede producir por un método que se caracteriza porque el contenido y/o la actividad de por lo menos un MLO endógeno se reduce mediante la expresión de por lo menos un anticuerpo recombinante que es específico para por lo menos un MLO endógeno y que evita la función celular del MLO, y que inhibe especialmente la interacción del MLO con sus patrones de unión patogénicos o fisiológicos, especialmente con Ror2 y/o calmodulina.
35 La persona experta conoce a partir de la literatura como aquellos anticuerpos, que son por ejemplo específicos para un cierto dominio MLO, se pueden producir, aislar e identificar. De acuerdo con la presente invención, el término "anticuerpo recombinante" comprende todas las formas diferentes y tipos de anticuerpos, tales como se describe en Skerra A. (Curr Opin Immunol. 1993 Apr; 5(2):256-62). Ejemplos son fragmentos Fab, fragmentos Fv, anticuerpos scFv, homodímeros scFv, cadenas VH etc. Se da una revisión por Conrad U. and Fiedler U. (Plant Mol Biol. 1998 Sep; 38(1-2):101-9). Los protocolos estándar para la producción de anticuerpos monoclonales, policlonales o recombinantes se pueden encontrar en: "Guide to Protein Purification", Meth. Enzymol. 182, pp. 663-679 (1990), M.
P. Deutscher, ed. La expresión de los anticuerpos también se describe en Fiedler et al., (1997) Immunotechnology 3, 205-216 y Maynard and Georgiou (2000) Annu. Rev. Biomed. Eng. 2, 339-76.
Se prefieren en la presente invención anticuerpos scFv que consisten de la región variable de una cadena ligera y la
45 región variable de una cadena pesada, se fusiona entre sí mediante un péptido ligador flexible (ver, por ejemplo Breitling et al. (1999) Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, New York). Los anticuerpos ScFv tienen la misma especificidad y actividad de antígeno como anticuerpos "normales", pero no necesitan ser ensamblados a partir de cadenas sencillas.
Usualmente, la producción de un anticuerpo recombinante inicia con estirpes celulares de hibridoma que expresan anticuerpos monoclonales. Los cADN que codifican la cadena ligera y la cadena pesada se aíslan, y en una siguiente etapa las regiones codificantes para las regiones variables de la cadena ligera y la cadena pesada se fusionan a una molécula. Otro método para obtener anticuerpos recombinantes se basa en la detección de colecciones de anticuerpo recombinante, así llamadas colecciones de exhibición de fago (ver Hoogenboom et al. (2000) Immunology Today 21, 371-378; Winter et al. (1994) Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455; De Wildt et al. (2000)
5 Nat. Biotechnol. 18, 989-994). Este método permite el enriquecimiento, selección y aislamiento del anticuerpo deseado contra una proteína MLO.
Un método de expresión de un anticuerpo anti-MLO puede comprender las siguientes etapas:
a) construcción de un vector que comprende las siguientes secuencias de ácidos nucleicos en la orientación 5’-3’:
- -
- una secuencia promotora que es funcionalmente activa en plantas,
10 -ligar operativamente una secuencia de ADN que codifica un anticuerpo recombinante que es específico para por lo menos un MLO endógeno y que evita la función celular de Mlo,
- -
- opcionalmente, ligar operativamente una secuencia de terminación que es funcionalmente activa en las plantas,
b) transferencia del vector de la etapa a) a una célula de planta y opcionalmente la integración dentro del genoma de la planta.
15 Las plantas transgénicas o células de planta que tienen una resistencia aumentada contra la roya de la soja también se pueden producir por un método que se caracteriza porque el contenido y/o la actividad de por lo menos un MLO endógeno se reduce mediante la expresión de por lo menos un inhibidor MLO que evita la función celular de por lo menos un MLO, y que inhibe especialmente la interacción del MLO con sus patrones de unión patogénicos o fisiológicos, especialmente con ROR2 y/o calmodulina. Estos inhibidores pueden ser por ejemplo péptidos para
20 unión en los bolsillos de unión respectivos de la interacción de las proteínas MLO con los componentes o factores de unión fisiológicos. Este método semeja la estrategia del anticuerpo, en que un inhibidor de una proteína MLO, se expresa o se sobreexpresa en la célula de planta, bloqueará la actividad MLO (por ejemplo estéricamente) mediante la unión al MLO. Un método para la expresión de un inhibidor MLO puede comprender las siguientes etapas:
a) construcción de un vector que comprende las siguientes secuencias de ácidos nucleicos en la orientación 5’-3’:
25 -una secuencia promotora que es funcionalmente activa en plantas,
- -
- ligar operativamente una secuencia de ADN que codifica un inhibidor MLO que evita la función celular de MLO,
- -
- opcionalmente, ligar operativamente una secuencia de terminación que es funcionalmente activa en las plantas,
b) transferencia del vector de la etapa a) a una célula de planta y opcionalmente la integración dentro del genoma de la planta.
30 Además de la transferencia de una molécula de ácido nucleico, se pueden utilizar otros métodos para aumentar la resistencia contra la roya de la soja en plantas transgénicas o células de planta que tienen un contenido y/o actividad reducida de por lo menos un MLO endógeno. Por ejemplo, el contenido y/o actividad de MLO se puede reducir mediante mutagenia, preferiblemente mediante mutagenia química o mutagenia inducida por radiación. La mutagenia, por ejemplo se puede realizar por medio de metano sulfonato de etilo (EMS), radiación gamma y/o
35 radiación rápida de neutrón.
Las mutaciones inducidas también pueden ser provocadas por otros químicos como Nitrosoguanidina (NTG), análogos base (por ejemplo BrdU), químicos simples (por ejemplo ácidos), agentes alquilatantes (por ejemplo N-etilN-nitrosourea, ENU), agentes metilantes (EMS), hidrocarburos policíclicos (por ejemplo benzpirenos), agentes intercaladores de ADN (por ejemplo bromuro de etidio), entrecruzadores de ADN (por ejemplo platino), radicales de 40 oxígeno, o mediante radiación UV (no ionizante) o radiación ionizante. Los agentes alquilatantes pueden mutar el ADN replicante y no replicante. En contraste, un análogo base solo puede mutar el ADN cuando se incorpora el análogo en la replicación del ADN. Cada una de estas clases de mutágenos químicos tiene ciertos efectos que conducen a transiciones, transversiones, o eliminaciones. La radiación UV excita electrones a un nivel de energía mayor. El ADN absorba una forma de luz ultravioleta. Dos bases de nucleótido en citosina y timidina de ADN son
45 más vulnerables a la excitación que puede cambiar las propiedades de par base. La luz UV puede inducir bases de timina adyacentes en una hebra de ADN para vinculación entre sí, como un dímero voluminoso.
Los inventores encuentran que el MLO inactivado en cebada confiere resistencia aumentada contra la roya de la soja. Sin embargo, es concebible que también ocurre un efecto de resistencia positivo por medio de MLO. Esto significa que en una sobreexpresión de MLO, el MLO se deriva por ejemplo de cebada o Arabidopsis, también puede conducir a resistencia aumentada, especialmente de soja. Existen ejemplos de proteínas que confieren resistencia en una interacción sin anfitrión (como en el actual caso: roya de la soja -cebada), aunque en el caso de una interacción de anfitrión (soja - roya de la soja), aquellas proteínas confieren susceptibilidad. Por ejemplo, en interacciones susceptibles de la mayor parte de proteínas Avr fúngicas son factores de patogenicidad, pero en plantas resistentes al anfitrión se reconoce la proteína Avr por las proteínas de planta R. Lo que significa que las proteínas Avr tienen diferentes "funciones" en interacciones resistentes y compatibles.
Por lo tanto, una sobreexpresión de MLO también puede conferir resistencia en la soja. Por lo tanto, otro aspecto de la presente solicitud está dirigida a un método para aumentar la resistencia contra la roya de la soja en plantas transgénicas y/o células de planta, caracterizado porque el contenido y/o la actividad de por lo menos un MLO se aumenta en comparación con el tipo natural.
El aumento es preferiblemente por lo menos 10 % o 20 %, también preferiblemente por lo menos 30 % o 40 %, más preferiblemente por lo menos 50 % o 60 %, también más preferiblemente por lo menos 70 % o 80 %, especialmente preferiblemente por lo menos 90 %, 95% o 100 %, particularmente preferiblemente por lo menos por un factor de 2 o 5, también particularmente preferiblemente por lo menos por un factor de 10 o 50, y más preferiblemente por lo menos por un factor de 100 o 1000.
En una realización preferida de la solicitud, este aumento del contenido y/o la actividad de por lo menos un MLO en comparación con el tipo natural se puede realizar mediante la transferencia de por lo menos una molécula de ácido nucleico que codifica por lo menos un MLO y/o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo y/o un derivado funcionalmente equivalente del mismo a las plantas o células de planta.
En principio, la molécula de ácido nucleico puede codificar cualquier MLO conocido de cualquier organismo (así como también fragmentos y/o derivados funcionalmente equivalentes de los mismos). En el caso que la secuencia MLO es de origen genómico de una célula eucariótica y comprende intrones, y en el caso que la planta anfitriona o célula de planta no es capaz o no puede permitir dividir aquellos intrones, es preferible utilizar la secuencia de cADN correspondiente.
Las siguientes definiciones de los términos "fragmento funcionalmente equivalente" y "derivado funcionalmente equivalente" se refiere al método para aumentar el contenido y/o la actividad de por lo menos un MLO en comparación con el tipo natural. Por lo tanto los fragmentos y mutantes tienen que ser funcionales, en contraste con el método de reducir el contenido y/o la actividad de por lo menos un MLO, en donde los fragmentos o mutantes MLO también pueden ser no funcionales.
En el contexto de la presente invención, una molécula de ácido nucleico que codifica un "fragmento funcionalmente equivalente" de un MLO es un fragmento o parte de un ácido nucleico que codifica una proteína MLO, que tiene por ejemplo una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID NOs: 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 y 48. El fragmento MLO codificado por este ácido nucleico tiene las mismas funciones celulares, las mismas propiedades de unión y/o las mismas propiedades estructurales de cualquiera de las proteínas MLO que tienen una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID NOs: 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 y 48 (ver anterior, definición de "funcionalmente equivalente"). Usualmente, el fragmento carece de los aminoácidos en el terminal N y/o en el terminal C.
Preferiblemente, el fragmento tiene por lo menos 40 % o 50 %, preferiblemente por lo menos 55 % o 60 %, más preferiblemente por lo menos 65 % o 70 %, especialmente preferiblemente por lo menos 75 % o 80 %, particularmente preferiblemente por lo menos 85 % o 90 %, y más preferiblemente por lo menos 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de la longitud de la proteína MLO "completa".
En el contexto de la presente invención, una molécula de ácido nucleico que codifica un "derivado funcionalmente equivalente" de una proteína MLO es un derivado o "homólogo" o "mutante" de un ácido nucleico que codifica una proteína MLO, en donde la proteína MLO tiene por ejemplo una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID NOs: 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 y 48. El derivado MLO codificado por este ácido nucleico tiene las mismas funciones celulares, las mismas propiedades de unión y/o las mismas propiedades estructurales de cualquiera de las proteínas MLO que tienen una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID NOs: 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 y
48. Usualmente, el derivado tiene uno o más intercambios de aminoácido, inserciones o eliminaciones que no conducen a funciones celulares alteradas, propiedades de unión y/o propiedades estructurales.
Preferiblemente, el derivado es por lo menos 40 % o 50 %, preferiblemente por lo menos 55 % o 60 %, más preferiblemente por lo menos 65 % o 70 %, especialmente preferiblemente por lo menos 75 % o 80 %, particularmente preferiblemente por lo menos 85 % o 90 %, y más preferiblemente por lo menos 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % similar a la proteína MLO "completa".
En una realización preferida de la solicitud, una secuencia de ácidos nucleicos que codifican por lo menos una proteína MLO y/o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo y/o un derivado funcionalmente equivalente del mismo se transfiere a una planta o célula de planta. Esta transferencia conduce a un aumento de la expresión o la actividad de MLO en comparación con el tipo natural y por lo tanto a un aumento de la resistencia contra la roya
5 de la soja en las células transgénicas. El uso de vectores que comprenden aquellas secuencias de ácidos nucleicos así como también las secuencias de terminación promotora y opcional son bien conocidos por el experto. Tal método comprende típicamente las siguientes etapas:
a) Construcción de un vector que comprende las siguientes secuencias de ácidos nucleicos en la orientación 5’-3’:
- -
- una secuencia promotora que es funcionalmente activa en plantas,
10 -ligar operativamente una secuencia de ADN que codifica por lo menos un MLO y/o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo y/o un derivado funcionalmente equivalente del mismo,
- -
- opcionalmente, ligar operativamente una secuencia de terminación que es funcionalmente activa en las plantas,
b) transferencia del vector de la etapa a) a una célula de planta y opcionalmente la integración dentro del genoma de la planta.
15 La persona experta sabe cómo transferir un vector de la etapa a) a las células de planta y cuyas características del vector necesita ser integrado dentro del genoma de la planta. Si el contenido de MLO en las plantas transgénicas o células de planta se aumenta por medio de la transferencia de una molécula de ácido nucleico que codifica un MLO de un organismo diferente, es preferible que la secuencia de aminoácidos se vuelva a traducir de acuerdo con el código genético en una secuencia de ácidos que puede comprender principalmente codones que se utilizan
20 preferiblemente por el organismo anfitrión debido a su "uso de codón". El uso del codón se puede determinar por medio de análisis basado en ordenador de otros genes conocidos del organismo anfitrión respectivo.
El aumento del contenido y/o la actividad de por lo menos un MLO endógeno también se puede realizar al influenciar la transcripción, la traducción y/o las modificaciones post-traduccionales del MLO endógeno. Esto significa por ejemplo que la expresión del gen del MLO endógeno se aumenta o se inhiben los mecanismos reguladores en el
25 nivel de transcripción, traducción o se apagan las proteínas (por ejemplo modificaciones post-traduccionales).
Por ejemplo se puede lograr un aumento de la expresión de gen al influenciar la secuencia promotora del gen MLO endógeno. Tal modificación, que conduce preferiblemente a una mejora de la expresión del MLO endógeno, se puede lograr mediante la eliminación o inserción de las secuencias de ADN. La modificación de la secuencia promotora conduce usualmente a una modificación de la cantidad del Mlo expresado y posteriormente a una
30 modificación de la actividad MLO que se puede determinar en una célula de planta.
Adicionalmente, una expresión modificada o aumentada de la expresión de por lo menos un gen MLO endógeno se puede lograr cuando una proteína reguladora que no ocurre en la célula o planta transformada interactúa con el promotor del gen MLO endógeno. Tal regulador puede ser una proteína quimérica que contiene un dominio de unión de ADN y un dominio de activación de transcripción, como se describe por ejemplo en la WO 96/06166.
35 Otra posibilidad para aumentar el contenido y/o la actividad de un Mlo endógeno se basa en la regulación por aumento de los factores de transcripción que se implican en la transcripción de los genes Mlo endógenos, por ejemplo por medio de la sobreexpresión de aquellos factores de transcripción. Los métodos para regular por aumento son bien conocidos por el experto.
Un aumento del MLO endógeno también se puede lograr cuando se influencian las modificaciones post
40 traduccionales Mlo. Por ejemplo, la actividad de las enzimas como quinasas o fosfatasas que están implicadas en este proceso se puede regular por medio de procedimientos como sobreexpresión o "inactivación de gen".
Finalmente la expresión del Mlo endógeno se puede regular por medio de la expresión de aptámeros que se unen específicamente a las secuencias promotoras de Mlo. Dependiendo de sí los aptámeros se unen para estimular o represar las regiones promotoras, se aumenta el contenido y por lo tanto también la actividad del Mlo endógeno.
45 También se describe que el vector que se transfiere a una planta o célula de planta comprende adicionalmente las secuencias reguladoras y/o funcionales además de la secuencia promotora y la secuencia de terminación opcional. Más preferiblemente, aquellas secuencias reguladoras y/o funcionales son secuencias que permiten una propagación del vector en las bacterias y/o permite una replicación transitoria y/o permanente en las células de planta y/o se seleccionan del grupo que consiste de mejoradores, señales de replicación y marcadores de selección.
Los vectores descritos también pueden incluir por ejemplo otros elementos mejoradores como elementos reguladores. Además estos pueden contener genes de resistencia, señales de replicación y otras regiones de ADN que permiten la propagación de los vectores en bacterias tales como E.coli. Los elementos reguladores también incluyen secuencias que llevan la estabilización aproximada de los vectores en las células anfitrionas. En particular, estos elementos reguladores incluyen las secuencias que permite la integración estable del vector dentro del genoma del anfitrión de planta o una replicación automática del vector en las células de planta. El experto en la técnica está familiarizado con este tipo de elementos reguladores.
Las así llamadas secuencias de terminación significa que las secuencias que aseguran que la transcripción o traducción se terminan apropiadamente. Si los ácidos nucleicos transferidos se van a traducir, son típicamente codones de parada y secuencias reguladoras correspondientes; si los ácidos nucleicos transferidos solo se transcriben, estos son de manera general polisecuencias.
Preferiblemente, el vector se selecciona del grupo que consiste de plásmidos, cósmidos, virus (recombinantes) y otros vectores actuales conocidos en el campo de tecnología génica, con los que las moléculas de ácido nucleico se pueden transferir a las plantas o células de planta. El término "vector" también comprende las así llamadas minocromosomas que son fragmentos de ADN lineales o circulares que contienen secuencias centrómero de la planta respectiva además del transgen. Los minicromosomas son estables en el núcleo y se pasan en las células hijas durante la división celular. Estos se transfieren mediante métodos estándar de transformación. Más preferiblemente, el vector se selecciona del grupo que consiste de pBR322, vectores pUC, vectores M13mp o vectores que se derivan del plásmido Ti o el plásmido Ri de agrobacterias.
Con el fin de preparar la introducción de los genes externos en plantas mayores o células de los mismos, está disponible un gran número de vectores de clonación que contienen una señal de replicación para E.coli y un gen marcador para la selección de células bacterianas transformadas. Ejemplos de tales vectores son pBR322, series pUC, series M13mp, pACYC184, etc. La secuencia requerida se puede introducir dentro del vector en un sitio de restricción apropiado. El plásmido obtenido se utiliza para la transformación de células E.coli. Las células E.coli transformadas se cultivan en un medio apropiado, y finalmente se cosechan y se lisan. El plásmido se recupera. Como un método de análisis para caracterizar el ADN de plásmido obtenido, se utilizan de manera general los métodos tales como análisis de restricción, electroforesis en gel y otros métodos biológicos bioquímicos/moleculares. Luego de cada manipulación el ADN de plásmido se puede dividir y los fragmentos de ADN obtenidos se pueden combinar con otras secuencias de ADN. Cada secuencia de ADN de plásmido se puede clonar en el mismo u otros plásmidos. Los métodos de clonación estándar se pueden tomar de Sambrook et al., 2001 (Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Las secuencias de ácidos nucleicos que se van a transferir están preferiblemente bajo el control de promotores que son funcionales en las plantas. En una realización preferida de la presente invención, las secuencias promotoras se seleccionan del grupo que consiste de promotores constitutivos, preferiblemente el promotor 35S, el promotor de actina o el promotor de ubiquitina, los promotores específicos de tejido, preferiblemente el promotor fosfoenolpiruvato o el promotor de fructosa-1,6-bisfosfatasa, promotores específicos de hoja, promotores específicos de epidermis, promotores específicos de desarrollo, promotores específicos ligeros, promotores específicos de lesión
o promotores inducidos por patógeno, especialmente promotores inducidos por hongos.
Los promotores pueden ser constitutivos, inducibles, promotores específicos de desarrollo o de tejido. Más aún, estos también pueden ser promotores específicos de patógeno. En esta forma por ejemplo se pueden producir plantas transgénicas que, bajo circunstancias normales, expresa las proteínas MLO, pero si es atacado por un patógeno, se afecta primero inactivación de los genes para las proteínas MLO por medio del promotor específico de patógeno en la células .
Típicamente, el promotor constitutivo 35S se utilizará como un promotor para los vectores. Más aún, otros promotores, por supuesto, se pueden utilizar, que se obtienen de diferentes fuentes, tales como plantas o virus de planta u hongos, y que son adecuados para la expresión de los genes en las plantas. La elección del promotor y de otras secuencias reguladoras determina el patrón de expresión local y temporal y también la inactivación de las proteínas MLO en las plantas transgénicas.
Además de los promotores constitutivos adicionales, tales como el promotor de actina (McElroy et al., 1990, Plant Cell, 2:163) y el promotor ubiquitina (Binet et al., 1991, Plant Science, 79:87), también se pueden considerar los promotores específicos de tejido de carboxilasa de piruvato fosfoenol de maíz (Hudspeth et al., 1989, Plant Mol. Biol., 12:579) o de la fructosa 1,6-bisfosfatasa de papa (WO 98/18940), que determinan la expresión específica de hoja. También se pueden utilizar promotores inducidos por lesión, inducidos por luz o inducidos por patógenos (especialmente inducidos por hongos), promotores específicos de hoja, específicos de epidermis y dependientes de desarrollo o secuencias de control (Xu et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22:573; Logemann et al., 1989, Plant Cell, 1:151; Stockhaus et al., 1989, Plant Cell, 1:805; Puente et al., 1996, EMBO J., 15:3732; Gough et al., 1995, Mol. Gen. Genet., 247:323). Un resumen de las secuencias de control utilizables se puede encontrar, por ejemplo en Zuo et al., 2000, Curr. Opin. Biotech., 11:146.
Los promotores apropiados también incluyen promotores que garantiza una expresión únicamente en los tejidos fotosintéticamente activos, por ejemplo el promotor ST-LS1 (Stockhaus et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7943-7947; Stockhaus et al. (1989) EMBO J. 8:2445-2451). También se pueden utilizar promotores que sean activos durante la transformación de la planta, la regeneración de la planta o etapas específicas de estos procesos, tales como promotores específicos de división celular tales como el promotor Histon H3 (Kapros et al. (1993) InVitro Cell Cev. Biol. Plant 29:27-32) o el sistema represor Tet químicamente inducible (Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237). Otros promotores adecuados se pueden tomar de la literatura, por ejemplo Ward (1993, Plant Mol. Biol. 22:361-366). Los mismo aplica para promotores específicos de tejido o específicos de célula e inducibles, tales como promotores específicos de meristema, que también se han descrito en la literatura y están de forma adecuada dentro de la estructura principal de la invención.
Otros promotores inducibles incluyen promotores inducibles de patógeno tales como el promotor codificante de virión ACMV (Hong et al., 1996, Virology, 220:119-227) que se induce por el producto de gen AC2. Los promotores inducidos por el hongo también son especialmente adecuados para la presente invención. Más aún, son adecuados todos los promotores de tales proteínas que se inducen en los tejidos infestados por patógeno, tales como liasa de fenilalanina amonio, sintasa chalcona, glicoproteína rica en hidroxiprolina, extensina, proteínas relacionadas con patogenia (por ejemplo PR-1a) e inhibidores de proteasa inducibles por herida (US 6,013,864). Adicionalmente, los promotores específicos de hoja, tales como promotores del tejido fotosintético (por ejemplo promotor CAP, promotor RBCS, promotor GAPA, promotor GAPB, promotor ST-LS1 etc.) son especialmente adecuados para la presente invención.
Más aún, la persona promedio experta en la técnica es capaz de aislar los promotores adecuados adicionales por medio de métodos de rutina. El experto en la técnica, con la ayuda de los métodos establecidos de biología molecular, por ejemplo experimentos de hibridación o estudios de unión de proteína de ADN, así puede identificar los elementos de ácido nucleicos reguladores específicos de hoja. Al hacer esto, por ejemplo en una primera etapa el ARN poli(A) +- completo se aísla del tejido de hoja del organismo requerido del que se aíslan las secuencias reguladoras, y se genera una colección de cADN. En una segunda etapa, y con la ayuda de clones de cADN que se basan en las moléculas de ARN poli(A) +- de un no tejido de hoja, aquellos clones, las moléculas de ARN poli (A) +correspondientes las cuales solo se acumulan en el tejido de la hoja, se identifican de la primera colección por medio de hibridación. Finalmente, con la ayuda de estos cADN identificados en esta forma, los promotores aislados se equipan con elementos reguladores específicos de hoja. Otros métodos basados en PCR están disponibles para el experto en la técnica para el aislamiento de promotores específicos de hoja apropiados.
Otra realización utiliza el promotor del gen B33 patatina clase I de papa. Otros promotores favorecidos son aquellos que son particularmente activos en los frutos. Estos incluyen, por ejemplo, el promotor de un gen poligalacturonasa, por ejemplo de tomate, que media la expresión durante la maduración de los frutos de tomate (Nicholass et al.) (1995) Plant Mol. Biol. 28:423-435; este estado de la técnica describe el análisis del promotor/construcciones de fusión GUS), el promotor de una oxidasa ACC, por ejemplo de manzana, que media la madurez y la especificidad del fruto en tomates transgénicos (Atkinson et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38:449-460; este estado de la técnica también describe análisis de expresión de promotor/GUS), o el promotor 2A11 de tomate (van Haaren et al. (1991) Plant Mol. Biol. 17:615-630, también describen las fusiones del promotor/GUS).
También en el caso de promotores específicos de frutos, el experto en la técnica puede tomar otros promotores adecuados a partir de la literatura, o como se describió anteriormente para los promotores específicos de hoja, aislándolos por medio de los métodos de rutina.
El experto en la técnica sabe que el uso de los promotores inducibles permite la producción de plantas y células de planta que solo se expresan transitoriamente, y solo inactivan transitoriamente las secuencias de acuerdo con la invención. Tal expresión transitoria permite la producción de plantas que solo muestran resistencia transitoria al patógeno. Tal resistencia transitoria por ejemplo puede ser deseable si existe un riesgo de contaminación de patógeno y las plantas por lo tanto no necesitan ser resistentes al patógeno solo para una duración particular de tiempo. El experto en la técnica está consciente de otras situaciones en las que es deseable la resistencia transitoria. El experto en la técnica también están consciente que, mediante el uso de vectores que no replican establemente en células de planta y que llevan las secuencias respectivas para la inactivación de las proteínas MLO, el puede lograr expresión transitoria y por lo tanto también inactivación transitoria y resistencia transitoria.
Para la introducción del ADN dentro de una célula anfitriona de planta, existe un número de técnicas bien conocidas disponibles, por las que el experto en la técnica puede determinar el método apropiado en cada caso sin ningún problema. Estas técnicas incluyen la transformación de células de planta con T-ADN al utilizar Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como un agente de transformación, la fusión de protoplastos, la transferencia directa del gen del ADN aislado en protoplastos, la electroporación de ADN, la introducción de ADN por medio del método biolísticos, así como también otras posibilidades. Al hacer esto, se pueden generar transformantes estables y transitorios.
Con la inyección y electroporación del ADN en las células de planta no existen requerimientos especiales per se para los plásmidos utilizados. Lo mismo aplica para la transferencia directa del gen. Se pueden utilizar plásmidos simples, tales como derivados pUC. Si, sin embargo, las plantas completas que se van a regenerar de tales células transformadas, la presencia de un gen marcador seleccionable es necesaria. El experto en la técnica está familiarizado con los marcadores de selección actuales, y el no tendrá problema en seleccionar un marcador apropiado. Los marcadores de selección estándar son aquellos que median la resistencia a una biocida o un antibiótico tales como canamicina, G418, bleomicina, higromicina, metotrexato, glifosato, estreptomicina, sulfonil urea, gentamicina o fosfinotricina y similares, a la célula de planta transformada.
Dependiendo del método de introducción del gen deseado dentro de la célula de planta, se puede requerir otras secuencias de ADN. Por ejemplo, si el plásmido Ti o Ri se utiliza para la transformación de la célula de planta, por lo menos la región de flanco derecho, frecuentemente sin embargo la región de flanco derecho e izquierdo del T-ADN contenido en el plásmido Ti o Ri se puede logar como una región flanco con el gen que se va a introducir.
Si se utilizan agrobacterias para las transformaciones, el ADN que se va a introducir se puede clonar en plásmidos especiales, en un vector intermediario o en un vector binario. Con base en las secuencias que son homólogas a las secuencias en el T-ADn, los vectores intermediarios se pueden integrar en el plásmido Ti o Ri de las agrobacterias mediante recombinación homóloga. Este plásmido también contiene la región vir necesaria para la transferencia del T-ADN. Los vectores intermediarios no pueden replicar en las agrobacterias. Por medio de un plásmido auxiliar, el vector intermediario se puede transferir a Agrobacterium tumefaciens (conjugación). Los vectores binarios pueden replicar en E.coli así como también en agrobacterias. Estos contienen un gen marcador de selección y un ligador o poliligador que se enmarcan por las regiones límite de T-ADN derecha e izquierda. Estas se pueden transformar directamente en las agrobacterias (Holsters et al. (1978), Molecular and General Genetics 163, 181-187). El agrobacterium que sirve como una célula anfitriona debe contener un plásmido que lleva una región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del T-ADN dentro de la célula de planta. El T-ADN también puede estar presente. Este tipo de agrobacterium transformado se utiliza para la transformación de células de planta.
El uso de T-DNA para la transformación de las células de planta se ha investigado intensivamente y se describe suficientemente en la EP 120 515.
Para la transferencia del ADN dentro de la célula de planta, los explantes de la planta se pueden cultivar específicamente para este propósito con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes. A partir del material de planta infectado (por ejemplo, piezas de hoja, segmentos de tallo, raíces, pero también protoplastos o células de planta cultivadas por suspensión) se pueden regenerar las plantas completas en un medio apropiado que puede contener antibióticos o biocidas para la sección de las células transformadas. La regeneración de las plantas tiene lugar de acuerdo con métodos de regeneración estándar y utilizando las soluciones de nutriente comunes. Las plantas y células de planta obtenidas en esta forma se pueden examinar para la presencia del ADN introducido.
El experto en la técnica está familiarizado con otras posibilidades para la introducción del ADN externo utilizando el método biolístico o mediante transformación de protoplasto (ver L. Willmitzer (1993) Transgenic Plants in: Biotechnology, A Multi- Volume Comprehensive Treatise (publicador: H.J. Rehm et al.), volumen 2, 627-659, VCH Weinheim, Alemania).
Mientras que la transformación de plantas dicotiledóneas o sus células por medio de sistemas de vector de plásmido Ti con la ayuda de Agrobacterium tumefaciens se establece bien, nuevos puntos de trabajo al hecho que las plantas monocotiledóneas o sus células también son muy accesibles para transformación por medio de vectores con base en agrobacterias (ver por ejemplo Chan et al. (1993), Plant Mol. Biol. 22, 491-506).
Los sistemas alternativos para la transformación de plantas monocotiledóneas o sus células son la transformación por medio del método biolístico (Wan and Lemaux (1994) Plant Physiol. 104, 37-48; Vasil et al. (1993) Bio/Technology 11, 1553-1558; Ritala et al. (1994) Plant Mol. Bio. 24, 317-325; Spencer et al. (1990), Theor. Appl. Genet. 79, 625-631), transformación de protoplasto, electroporación de células parcialmente permeabilizadas así como también la introducción de ADN por medio de tejidos vítreos.
El crecimiento de células transformadas dentro de la planta en la forma normal (ver también McCormick et al. (1986), Plant Cell Reports 5, 81-84). Las plantas resultantes pueden surgir en la forma normal y se cruza con plantas que tienen la misma disposición genética transformada u otras disposiciones genéticas. Los individuos híbridos resultantes tienen propiedades fenotípicas respectivas.
Deben surgir dos o más generaciones con el fin de asegurar que la característica fenotípica permanece estable y se hereda. Las semillas se deben cosechar también con el fin de asegurar que se mantengan el fenotipo respectivo u otras características.
De forma similar, al utilizar los métodos estándar, las estirpes transgénicas se pueden determinar que son homozigotas para las nuevas moléculas de ácido nucleico y sus características fenotípicas con respecto a una respuesta de patógeno presente o no presente se investiga y se compara con aquella de estirpes hemizigotas.
Por supuesto, se pueden cultivar adicionalmente células de planta que contienen las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención y células de planta (que incluyen protoplastos, callos, cultivos de suspensión y similares).
Los vectores descritos anteriormente se pueden transferir a las células de planta en diversas formas. Si los vectores están en forma lineal o circular depende de la aplicación en cuestión. El experto en la técnica sabe si y cuándo él puede utilizar vectores linearizados o no. Por ejemplo, el experto en la técnica sabe que, para la producción de inactivados específicos de genes para proteínas MLO mediante recombinación homóloga, puede ser suficiente para linearizar los vectores correspondientes e inyectarlos en las plantas o células de planta.
Adicionalmente, también se describe una planta transgénica o célula de planta que tienen una resistencia aumentada contra la roya de la soja, caracterizado porque el contenido y/o la actividad de por lo menos una proteína MLO se altera en comparación con plantas tipo natural o células de planta, respectivamente, Esta planta, por ejemplo, se puede producir mediante uno cualquiera de los métodos que se han descrito anteriormente. Las "plantas transgénicas" y las células de planta transgénicas pueden significar cualquier planta monocotiledónea o dicotiledónea o célula de planta, preferiblemente plantas agrícolas o células de plantas agrícolas. La invención está dirigida adicionalmente a plantas transgénicas de esta planta tales como hojas y retoños, material de propagación transgénico tales como protoplastos, callos, frutos, semillas, tubérculos, rizomas, gérmenes, polen, esquejes, y progenie transgénica de la planta.
De acuerdo con una realización preferida, el contenido y/o la actividad de por lo menos una proteína MLO se reduce en comparación con plantas tipo natural o células de planta.
También se describe que el contenido y/o la actividad de por lo menos una proteína MLO se aumenta en comparación con plantas tipo natural o células de planta.
Se describen adicionales células de planta y plantas en las que los genes endógenos de las proteínas MLO tienen mutaciones, es decir sustituciones, inserciones y/o eliminaciones, que conducen al hecho que las proteínas de MLO endógeno expresadas ya no son capaces, o solo son capaces bajo ciertas circunstancias, de interactuar con sus patrones de unión patológica o celular endógenos. Las plantas o células de planta, que contienen estas copias del gen endógeno para las proteínas MLO que muestran mutaciones, se pueden distinguir mediante resistencia permanente o transitoria aumentada contra la roya de la soja. Tales plantas y células de planta que, a diferencia las plantas y células de planta especificadas anteriormente, no son transgénicas se pueden producir mediante mutagenia convencional.
La modulación de la expresión de las proteínas MLO de planta endógeno por ejemplo puede significar que por medio de mutaciones en los elementos de ADN reguladores de los genes de las proteínas MLO, tales como promotores, mejoradores o de manera general las así llamadas "secuencias activantes en la dirección 5’", la expresión de las proteínas MLO endógenas se regula por disminución.
Dentro de la estructura principal de la presente invención, la modulación de las características de unión de las proteínas MLO significa que los tipos de mutación especificados anteriormente conducen a un cambio de las características de unión de las proteínas de MLO a sus patrones de unión patológicos o celulares endógenos. También es posible una combinación de la modulación de la expresión y las características de unión de las proteínas MLO.
Por ejemplo, las plantas o células de planta pueden tener mutaciones en las secuencias del gen para las proteínas MLO que conducen a la reducción de la expresión de estas proteínas. Otras plantas o células de planta tienen mutaciones que conducen a los mutantes negativos dominantes descritos anteriormente. En ambos casos, se obtienen plantas con resistencia aumentada contra la roya de la soja.
El experto en la técnica es consciente que por ejemplo las plantas y células de planta también se pueden producir mediante mutagenia que, debido a las mutaciones en las secuencias mejoradoras y/o promotoras de los genes para las proteínas MLO de la planta, que muestran una reducción de la expresión de estas proteínas, y al mismo tiempo muestra mutaciones en las regiones codificantes de los genes que codifican las proteínas MLO, que surgen al hecho que permanecen las proteínas de MLO expresadas ya no pueden, o solo a un grado limitado, interactuar con los patrones de unión fúngicos y/o otros patrones de unión celular. Por otra parte, se sobreexpresan las mutaciones respectivas en las secuencias mejoradora y/o promotora y en las secuencias codificantes que pueden tener el efecto que un mutante negativo dominante de las proteínas de MLO de la planta, como se describió anteriormente, que ya no es más, o solo a un grado muy limitado, capaz de interactuar con patrones de interacción fúngica y/o celular normal, y ya que viene la reacción de competición descrita anteriormente.
Preferiblemente, las plantas no transgénicas y las células de planta de acuerdo con la invención, que se distinguen mediante una modulación de las características de expresión y/o de unión de las proteínas de MLO endógeno y tienen resistencia permanente o transitoria contra la roya de la soja, se producen por medio del método así llamado "LABRANZA" (Lesión Local Inducida por el Orientación en los Genomas). Este método se ha descrito en detalle en Colbert et al. (2001, Plant Physiology, 126, 480 - 484), McCallum et al. (2000, Nat. Biotechnol., 18, 455 -457) y McCallum et al. (2000, Plant Physiology, 123, 439 - 442). Se introducen las referencias especificadas anteriormente aquí como la descripción explícita con respecto al método de "LABRANZA".
El método de LABRANZAes una estrategia de los genéticos así llamados inversos que combina la producción de altas frecuencias de mutaciones de punto en colecciones de planta mutagenizadas, por ejemplo por medio de mutagenie química con metano sulfonato de etilo (EMS), con la identificación sistemática rápida de mutaciones en las secuencias objetivo. Primero que todo, la secuencia objetivo se amplifica por medio de PCR en grupos de ADN de poblaciones mutagenizadas M2. Las reacciones de desnaturalización e hibridación de los productos PCR heteroalélicos permiten la formación de heterodúplex, en donde una hebra de ADN se origina del producto PCR mutado y el otro del producto PCR "tipo natural". Un así llamado emparejamiento incorrecto luego tiene lugar en el sitio de la mutación de punto, que se puede identificar por medio de HPLC desnaturalizante (DHPLC, McCallum et al., 2000, Plant Physiol., 123, 439 - 442) o con el sistema de detección de emparejamiento incorrecto de célula (Oleykowsky et al., 1998, Nucl. Acids Res. 26, 4597-4602). La célula es una endonucleasa que reconoce los emparejamientos incorrectos en ADN heterodúplex y divide específicamente el ADN en estos sitios. Los productos de división luego se pueden separar y detectar por medio de electroforesis en gel de secuenciamiento automático (Colbert et al., 2001, vide supra). Luego de la identificación de las mutaciones específicas del gen objetivo en un grupo, se analizan muestras de ADN individuales de acuerdo con lo anterior con el fin de aislar la planta con la mutación. En esta forma, la identificación de las células de planta o plantas mutagenizadas se puede hacer con las plantas y células de plantas de acuerdo con la invención después de la producción de las poblaciones de planta mutagenizadas mediante el uso de las secuencias de cebador dirigida a las proteínas MLO. El método de LABRANZA se puede aplicar de manera general para todas las plantas y las plantas agrícolas y cultivadas especificadas anteriormente son adecuadas para el método de acuerdo con la invención.
Por lo tanto también se describe una planta o célula de planta resistente a la roya de la soja, caracterizado porque se ha producido por el método de LABRANZA y que contiene mutaciones en las secuencias codificantes y/o reguladoras de por lo menos un que codifica una proteína MLO que provoca una alteración en el contenido y/o la actividad de por lo menos una proteína MLO en comparación con plantas tipo natural o células de planta.
Se describe adicionalmente el uso de por lo menos una molécula de ácido nucleico, que comprende:
a) por lo menos una secuencia que es idéntica, homóloga o complementaria a una secuencia que codifica un Mlo endógeno o fragmentos de los mismos,
b) por lo menos una secuencia que codifica un Mlo no funcional o un fragmento del mismo que tiene por lo menos una mutación de punto, eliminación y/o inserción,
c) por lo menos una secuencia que codifica un anticuerpo recombinante que es específico para un Mlo endógeno y que evita la función celular del MLO,
d) por lo menos una secuencia que codifica un inhibidor MLO que evita la función celular de un MLO, y/o
e) por lo menos una secuencia que codifica un MLO y/o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo y/o un derivado funcionalmente equivalente del mismo para aumentar la resistencia contra la roya de la soja en plantas transgénicas y/o células de planta.
También se describe un vector de expresión, que comprende las siguientes secuencias de ácidos nucleicos en la orientación 5’-3’:
a) una secuencia promotora que es funcionalmente activa en las plantas,
b) ligar operativamente una secuencia
- -
- que es idéntica, homóloga o complementaria a una secuencia que codifica un Mlo endógeno o fragmentos de los mismos,
- -
- que codifica un Mlo no funcional o un fragmento del mismo que tiene por lo menos una mutación de punto, eliminación y/o inserción,
- -
- que codifica un anticuerpo recombinante que es específico para un Mlo endógeno y que evita la función celular del MLO,
- -
- que codifica un inhibidor MLO que evita la función celular de un MLO, y/o
- -
- que codifica un MLO y/o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo y/o un derivado funcionalmente 5 equivalente del mismo,
c) opcionalmente, ligar operativamente una secuencia de terminación que es funcionalmente activa en las plantas.
Finalmente, también se describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende por lo menos una secuencia de ácidos nucleicos, seleccionada del grupo que consiste de:
a) una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NOs: 3, 5, 6, 8 o 10 o fragmentos de la misma,
10 b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID NOs: 4, 7, 9 o 11 o fragmentos de las mismas,
c) una secuencia de nucleótido que es esencialmente homóloga a una cualquiera de las secuencias de nucleótido de a) o b),
d) una secuencia de nucleótidos que puede hibridar bajo condiciones rigurosas con una cualquiera de las 15 secuencias de nucleótido de a), b) o c), en donde las secuencias de ácidos nucleicos codifican una proteína MLO.
La persona experta es consciente del hecho que el término "secuencia de nucleótidos" del ítem a) preferiblemente se refiere a las partes codificantes de la SEQ ID NOs: 3, 5, 6, 8 o 10, es decir las partes que codifican una proteína MLO, y no las partes reguladoras que se ubican usualmente en la dirección 5’ y en la dirección 3’ de la región codificante. Sin embargo, las regiones no traducidas 5’ y 3’ de las SEQ ID NOs: 3, 5, 6, 8 o 10 también se pueden
20 incluir en la molécula de ácido nucleico.
Una "molécula de ácido nucleico aislada" significa una molécula que se separa de la otra molécula de ácido que está presente en la fuente natural del ácido nucleico. Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico aislada no comprende secuencias que flanquean en forma natural el ADN genómico del organismo del que se origina la molécula. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada puede incluir, por ejemplo, menos de
25 aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de las secuencias de ácidos nucleicos que flanquean en forma natural el ADN genómico de la célula de la cual se origina la molécula.
Una "proteína MLO" tiene la actividad biológica que la alteración de su contenido y/o actividad dentro de una planta o célula de planta conduce a la resistencia aumentada de la planta o la célula de planta contra la roya de la soja. La actividad biológica (o "función celular") significa especialmente que son las interacciones de la proteína MLO con sus 30 patrones de unión patogénicos o fisiológicos, es decir preferiblemente sus interacciones con calmodulina y/o ROR2. Por lo tanto, un "fragmento" de una secuencia de nucleótidos que es parte de la molécula de ácido nucleico aislada mencionada anteriormente se limita a aquellos fragmentos que codifican una proteína MLO que tiene esta actividad biológica. Usualmente, los fragmentos carecen de nucleótidos en el extremo 5’ o en el extremo 3’. Preferiblemente el fragmento tiene por lo menos 40 % o 50 %, preferiblemente por lo menos 55 % o 60 %, más preferiblemente por lo
35 menos 65 % o 70 %, especialmente preferiblemente por lo menos 75 % o 80 %, particularmente preferiblemente por lo menos 85 % o 90 %, y más preferiblemente por lo menos 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de la longitud de la secuencia que codifica el MLO "completo".
Una secuencia de nucleótidos que es "esencialmente homóloga" a otra secuencia de nucleótidos significa, en el alcance de la presente invención, que la secuencia es por lo menos 40 % o 50 %, preferiblemente por lo menos 55
40 % o 60 %, más preferiblemente por lo menos 65 % o 70 %, especialmente preferiblemente por lo menos 75 % o 80 %, particularmente preferiblemente por lo menos 85 % o 90 %, y más preferiblemente por lo menos 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % similar a la otra secuencia o fragmentos. Preferiblemente, esta homología se determina sobre la longitud de secuencia completa de la secuencia de nucleótidos.
Por supuesto, las secuencias de nucleótidos que son "esencialmente homólogas" o que puede "hibridar bajo
45 condiciones rigurosas" (ver ítems c) y d) anterior) también necesitan codificar una proteína MLO funcional de acuerdo con la invención, es decir una proteína MLO que tiene una actividad biológica como se describió anteriormente.
Se utiliza mutación mlo5 de cebada mlo en la presente invención. El Mlo5 es un mutante nulo completo que se obtiene mediante el intercambio de Met-1 (ATG) a Ile. La secuencia de la proteína MLO tipo natural se describe en la SEQ ID NO: 2.
Se utilizan el mutante mlo5 y tipo natural del cultivo de cebada "Ingrid". Las semillas se proporcionan por la división APR/HS del BASF AG (Agrarzentrum, Limburgerhof). La siembra se realiza durante 7 días en cabinas de prueba de exposición climática en condiciones controladas, es decir una temperatura de 22° C y un ritmo de día/noche de 12 horas. Las plantas se inoculan con P.pachyrhizi 7 días después de las siembras.
El hongo de la roya de la soja es un aislado natural de Brasil.
Con el fin de obtener el material de espora apropiado para la inoculación, las hojas de soja que se han infectado con la roya de la soja 15-20 días atrás, toman 2-3 días antes de la inoculación y se transfiere a placas agar (1 % de agar en H2O). Las hojas se ponen con su lado superior en el agar, que permite al hongo crecer a través del tejido y producir esporas muy jóvenes. Para la solución de inoculación, las esporas se inactivaron las hojas y se agregan a una solución de Tween-H2O. El conteo de esporas se realiza bajo un microscopio de luz por medio de una cámara de conteo Thoma. Para la inoculación de las plantas, la suspensión de espora se agrega en un matraz de rociado operado por aire comprimido y se aplica uniformemente en las plantas o las hojas hasta que se humecta bien la superficie de la hoja. Para el microscopio, se utiliza una densidad de 10x105 esporas / ml. Las plantas inoculadas se colocan durante 24 horas en una cámara de invernadero con un promedio de 22° C y > 90 % de humedad de aire. Las hojas inoculadas se incuban bajo las mismas condiciones en un plato de Petri cerrado en 0,5% de agar de planta. El siguiente cultivo se realiza en una cámara con un promedio de 25° C y 70 % de humedad de aire.
Para la evaluación del desarrollo del patógeno, las hojas inoculadas de cebada "Ingrid" tipo natural y cebada "Ingrid" mlo5 se tiñen con azul anilina. El mismo protocolo también se puede utilizar para soja.
El teñido de azul de anilina sirve para la detección de sustancias fluorescentes. Durante las reacciones de defensa en las interacciones del anfitrión y las interacciones del no anfitrión, las sustancias tales como fenoles, callos o lignina se acumulan o se producen y se incorporan en la pared celular localmente en las papillas o en la célula completa (reacción hipersensible, HR). Se forman complejos en asociación con azul anilina, que conducen por ejemplo en el caso de callos para fluorescencia amarillo. El material de hoja se transfiere a tubos falcón o platos que contienen la solución II de decoloración (etanol / ácido acético 6/1) y se incuba en un baño de agua a 90° C durante 10-15 minutos. La solución de decoloración II se retira inmediatamente después de esto, y las hojas se lavan 2x con agua. Para el teñido, las hojas se incuban durante 1,5-2 horas en solución de tinción II (0.05 % de azul anilina = azul metilo, 0.067 M hidrogen fosfato di-potasio) y se analiza mediante microscopio inmediatamente después de esto.
Se evalúan los diferentes tipos de interacción (conteo) mediante microscopía. Se utilizan un microscopio BX61 Olympus UV (luz incidente) y un filtro UV Longpath (excitación: 375/15, Divisor de haz: 405 LP). Después de la tinción de azul anilina, las esporas parecen azules bajo luz UV. Las papilas se pueden reconocer por debajo del apresorio fúngico mediante una tinción verde/ amarilla. La reacción hipersensible (HR) se caracteriza por fluorescencia de célula completa.
Los resultados se muestran en la Tabla 3 así como también en la Figura 1.
Se pueden discriminar dos etapas principales de la resistencia de la planta contra el crecimiento fúngico. 1. La formación de una papila como una barrera mecánica en el lado interno de la pared celular bajo apresorio evita la infección de la célula y el crecimiento adicional del hongo. 2. La muerte de la célula infectada, llamada reacción hipersensible (HR), es otro medio de resistencia contra el hongo.
La Figura 1 muestra un aumento significativo del índice de formación de papilas en el mlo5 de cebada "Ingrid" comparado con la tipo natural.
Tabla 3: Estirpes de cebada infectadas con el hongo de roya de la soja
- exp.#
- cebada Esporas Esporas con apresorio con Reacción Formación de formación HR [%]
- Ingrid
- apresorio papilas HR apresorio [%] de papilas
- [%]
- 1
- peso 570 479 181 142 84,0 37,8 29,6
- mlo5
- 606 536 274 92 88,4 51,1 17,2
- 2
- peso 763 688 352 123 90,2 51,2 17,9
- mlo5
- 795 657 445 127 82,6 67,7 19,3
- 3
- peso 638 523 212 74 82,0 40,5 14,1
- mlo5
- 534 470 328 37 88,0 69,8 7,9
- 4
- peso 933 870 358 60 93,2 41,1 6,9
- mlo5
- 894 793 510 26 88,7 64,3 3,3
- 5
- peso 692 643 258 44 92,9 40,1 6,8
- mlo5
- 745 667 476 60 89,5 71,4 9,0
- 6
- peso 491 355 112 162 72,3 31,5 45,6
- mlo5
- 707 500 230 148 70,7 46,0 29,6
- total
- peso 4087 3558 1473 605 87,1 41,4 17,0
- mlo5
- 4281 3623 2263 490 84,6 62,5 13,5
El error estándar para el porcentaje de formación de papilas es 0,02592647 en peso de cebada y 0,04322237 en cebada mlo5. El valor para la prueba T es 0,001735842.
5 DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 Índice de formación de papilas (%) de cebada "Ingrid" tipo natural y cebada "Ingrid" mlo5 mutante después infección con el hongo de roya de soja.
Figura 2a GmMlo1 - secuencias de ácidos nucleicos de Soja (longitud completa) (SEQ ID NO: 3)
GmMlo1 - Secuencias de aminoácidos de soja (longitud completa) (SEQ ID NO: 4)
10 Figure 2b GmMlo2 (genómico) - secuencias de ácidos nucleicos parciales de soja (SEQ ID NO: 5) GmMlo2 (EST) - secuencias de ácidos nucleicos parciales de soja (SEQ ID NO: 6)
GmMlo2 (EST) - Secuencias de aminoácidos parciales de soja (SEQ ID NO: 7)
Figure 2c GmMlo3.1 - Secuencias de ácidos nucleicos de soja (longitud completa) (SEQ ID NO: 8)
GmMlo23.1 - Secuencias de aminoácidos de soja (longitud completa) (SEQ ID NO: 9)
Figure 2d GmMlo3.2 (EST) - Secuencias de ácidos nucleicos de soja (SEQ ID NO: 10)
5 GmMlo3.2 - Secuencias de aminoácidos teóricas de soja (SEQ ID NO: 11)
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<212> ADN
<213> Hordeum vulgare
<400> 1
<210> 2
<211> 533
<212> PRT
<213> Hordeum vulgare
<400> 2
<210> 3
<211> 1650
<212> ADN
<213> Glycine max
<400> 3
<210> 4
<211> 506
<212> PRT
<213> Glycine max 10 <400> 4
<210> 5
<211> 1133
<212> ADN
<213> Glycine max
<400> 5
<210> 6
<211> 458
<212> ADN
<213> Glycine max
<400> 6
<211> 152
<212> PRT
<213> Glycine max
<400> 7
<210> 8
<211> 1905
<212> ADN
<213> Glycine max
<400> 8
<210> 9
<211> 598
<212> PRT
<213> Glycine max
<400> 9
<210> 10
<211> 1179
<212> ADN
<213> Glycine max
<400> 10
<210> 11
<211> 240
<212> PRT
<213> Glycine max
<400> 11
<210> 12
<211> 813
<212> ADN
<213> Oryza sativa
<400> 12
<210> 13
<211> 5277
<212> ADN
<213> Oryza sativa
<400> 13
<210> 14
<211> 540
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 14
<210> 15
<211> 653
<212> ADN
<213> Linum usitatissimum
<400> 15
<210> 16
<211> 217
<212> PRT
<213> Linum usitatissimum
<400> 16
<210> 17
<211> 1239
<212> ADN
<213> Triticum aestivum
<400> 17
<210> 18
<211> 413
<212> PRT
<213> Triticum aestivum
<400> 18
<210> 19
<211> 1934
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 19
<210> 20
<211> 526
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 20
<210> 21
<211> 2148
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 21
<210> 22
<211> 573
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 22
<210> 23
<211> 1587
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 23
<210> 24
<211> 508
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 24
<210> 25
<211> 1971
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 25
<210> 26
<211> 573
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 26
<210> 27
<211> 1666 <212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 27
<210> 28
<211> 501
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 28
<210> 29
<211> 1942
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 29
<210> 30
<211> 583
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 30
<210> 31
<211> 1695
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 31
<210> 32
<211> 542
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 32
<210> 33
<211> 2368
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 33
<210> 34
<211> 593
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 34
<210> 35
<211> 1096
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 35
<210> 36
<211> 460
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 36
<210> 37
<211> 1836
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 37
210> 38
<211> 569
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 38
<210> 39
<211> 2361
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 39
<210> 40
<211> 573
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 40
<210> 41
<211> 1843
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 41
<210> 42
<211> 576
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 42
<210> 43 <211> 1699
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 43
<210> 44
<211> 478
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana 10 <400> 44
<210> 45
<211> 1733
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 45
<210> 46
<211> 554
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 46
<210> 47
<211> 1639
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 47
<210> 48
<211> 497
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 48
Claims (12)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Método para aumentar la resistencia contra la roya de la soja en plantas transgénicas y/o células de planta, caracterizado porque el contenido y/o la actividad de por lo menos una proteína MLO endógena se reduce en comparación con plantas tipo natural o células de planta, respectivamente; en donde por lo menos una proteína MLO endógena tiene una secuencia de aminoácidos con por lo menos 75 % de homología con la secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID NO: 4 o sus partes funcionalmente equivalentes o fragmentos de los mismos, o en donde por lo menos una proteína MLO endógena tiene una secuencia de aminoácidos que es funcionalmente equivalente a la secuencia de aminoácidos de una proteína que tiene por lo menos 75 % de homología con la secuencia de aminoácidos como se describe en SEQ ID NO: 4 o fragmentos de los mismos.
-
- 2.
- Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el contenido y/o la actividad de por lo menos un MLO endógeno se reduce mediante la transferencia de por lo menos una molécula de ácido nucleico que comprende por lo menos una secuencia que es idéntica, homóloga o complementaria a la secuencia o secuencias que codifican el MLO endógeno o fragmentos del mismo a las células de planta.
-
- 3.
- Método de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque una parte de la molécula de ácido nucleico transferida es por lo menos 50 %, preferiblemente por lo menos 60 %, más preferiblemente por lo menos 70 %, especialmente preferiblemente por lo menos 80 %, particularmente preferiblemente por lo menos 90 %, y más preferiblemente por lo menos 95 % homóloga a la secuencia que codifica el MLO endógeno o fragmentos del mismo.
-
- 4.
- Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, caracterizado porque la reducción del contenido y/o la actividad de por lo menos un MLO endógeno se logra mediante interferencia de ARN (ARNi), una construcción anticodificante, una construcción de co-supresión, activación del gen post-transcripcional (PTGS), una construcción P de ribonucleasa, recombinación homóloga, una construcción de ribozima o activación del gen inducido por el virus (VIGS).
-
- 5.
- Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el contenido y/o la actividad de por lo menos un MLO endógeno se reduce mediante la expresión de por lo menos un MLO no funcional o un fragmento del mismo que tiene por lo menos una mutación de punto, eliminación y/o inserción.
-
- 6.
- Método de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque por lo menos una mutación de punto, eliminación y/o inserción del MLO no funcional evita la función celular de MLO, y especialmente inhibe la interacción de MLO con sus patrones de unión patogénicos o fisiológicos, especialmente con Ror2 y/o calmodulina.
-
- 7.
- Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el contenido y/o la actividad de por lo menos un MLO endógeno se reduce mediante la expresión de por lo menos un anticuerpo recombinante que es específico para por lo menos un MLO endógeno y que evita la función celular del MLO, y que inhibe especialmente la interacción del MLO con sus patrones de unión patogénicos o fisiológicos, especialmente con Ror2 y/o calmodulina.
-
- 8.
- Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el contenido y/o la actividad de por lo menos un MLO endógeno se reduce mediante la expresión de por lo menos un inhibidor MLO que evita la función celular de por lo menos un MLO, y que inhibe especialmente la interacción del MLO con sus patrones de unión patogénicos o fisiológicos, especialmente con Ror2 y/o calmodulina.
-
- 9.
- Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el MLO es un MLO de planta seleccionado del grupo que consiste de Hordeum vulgare (cebada) MLO, Oryza sativa (arroz) MLO, Arabidopsis thaliana MLO, preferiblemente AtMlo1, AtMlo2, AtMlo3, AtMlo4, AtMlo5, AtMlo6, AtMlo7, AtMlo8, AtMlo9, AtMlo10, AtMlo11, AtMlo12, AtMlo13, AtMlo14 o AtMlo15, Linum usitatissimum (lino) MLO, Triticum aestivum (trigo) MLO, Glycine max (soja) MLO, preferiblemente GmMlol, GmMlo2, GmMlo3.1 o GmMlo3.2, o un MLO que es esencialmente funcionalmente equivalente a una cualquiera de dichas proteínas MLO.
-
- 10.
- Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el MLO se selecciona del grupo que consiste de un MLO que tiene una secuencia de aminoácidos como se describe en cualquiera de las SEQ ID NOs: 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 y 48, o un MLO que tiene una secuencia de aminoácidos que es esencialmente funcionalmente equivalente a cualquiera de las secuencias MLO descritas en la SEQ ID NOs: 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 y 48.
-
- 11.
- Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las plantas son plantas dicotiledóneas tales como soja, algodón, colza, tomate, remolacha azucarera, papa, girasol, guisantes,
plantas ornamentales, tabaco, trébol (Trifolium spec.), Kudzu (Pueraria lobata), árboles y legumbres tales como Alfalfa, y especialmente soja. -
- 12.
- Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque las plantas son plantas monocotiledóneas tales como Hordeum (cebada), Avena (avena), Triticum (trigo), Secale (centeno), Oryza (arroz), Sorghum (mijo), Zea (maíz), Panicum, Pennisetum, Setaria y similares.
FIGURASFigura 2a Figura 2b Figura 2c Figura 2d
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2007
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