FR2775690A1 - Anticorps monoclonal et utilisations pour detecter des antigenes de la proteine core de vhc - Google Patents
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
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- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1081—Togaviridae, e.g. flavivirus, rubella virus, hog cholera virus
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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-
- G—PHYSICS
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Abstract
L'invention concerne un anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel d'anticorps monoclonal, susceptible de se lier spécifiquement, à un composé antigénique de la protéine Core du virus de l'hépatite C, ledit composé antigénique ayant une séquence peptidique et comprenant au moins un déterminant antigénique défini par une seule des séquences suivantes : celle commençant à l'acide aminé 18 et se terminant à l'acide aminé 25 de ladite protéine Core, celle commençant à l'acide aminé 29 et se terminant à l'acide aminé 36 de ladite protéine, et celle commençant à l'acide aminé 57 et se terminant à l'acide aminé 64 de ladite protéine. L'invention concerne en outre l'utilisation dudit anticorps dans un procédé pour détecter et/ ou quantifier des antigènes de la protéine Core du VHC, dans un échantillon biologique, dans un réactif et un kit de détection.
Description
La présente invention concerne l'obtention d'anticorps dirigés contre des déterminants antigéniques de l'extrémité N-terminale de la protéine Core du virus de l'hépatite C (VHC), et l'utilisation de ceux-ci notamment pour le diagnostic de la maladie à un stade précoce, et pour le suivi de la charge virale, chez les malades chroniques.
Conformément au document EP-O 569 309, au nom de la Demanderesse, on connaît un peptide s'étendant depuis l'acide aminé en position 2 jusqu'à l'acide aminé en position 45 de l'extrémité N-terminale de la protéine Core du VHC, protéine dont la séquence est identifiée par
SEQ ID NO: 1. Ce peptide détermine une région immunodominante qui suffit, à elle-seule, pour obtenir les mêmes sensibilité et spécificité en terme de détection des anticorps dirigés contre le VHC, qu'avec la protéine Core dans son entier.
SEQ ID NO: 1. Ce peptide détermine une région immunodominante qui suffit, à elle-seule, pour obtenir les mêmes sensibilité et spécificité en terme de détection des anticorps dirigés contre le VHC, qu'avec la protéine Core dans son entier.
A la suite de ces travaux, la Demanderesse a maintenant déterminé des anticorps capables de reconnaître l'antigène naturel de la protéine Core du VHC.
Selon la présente invention, on a obtenu des anticorps monoclonaux ou fragments fonctionnels d'anticorps monoclonaux, susceptibles de se lier spécifiquement, pour former un complexe immun, à un composé antigénique de la protéine Core du virus de l'hépatite C, dont l'antigénicité ne résulte que de la présence, dans sa séquence peptidique, d'un ou plusieurs déterminants antigéniques identiques, que la Demanderesse a caractérisés.
Lesdits déterminants antigéniques sont définis par l'une quelconque des séquences suivantes : celle commençant à l'acide aminé 18 et se terminant à l'acide aminé 25 de ladite protéine Core, celle commençant à l'acide aminé 29 et se terminant à l'acide aminé 36 de ladite protéine, et celle commençant à l'acide aminé 57 et se terminant à l'acide aminé 64 de ladite protéine.
Des composés antigéniques répondant à la définition énoncée ci-dessus sont notamment ceux dont la séquence peptidique comprend une séquence choisie parmi
SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4, et de préférence ceux dont la séquence peptidique est choisie parmi SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 et
SEQ ID NO: 8.
SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4, et de préférence ceux dont la séquence peptidique est choisie parmi SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 et
SEQ ID NO: 8.
Par fragment fonctionnel d'un anticorps, on entend toute partie d'un anticorps comprenant ou consistant en au moins un site de combinaison antigénique, permettant audit fragment de se lier à au moins un déterminant antigénique d'un composé antigénique. A titre d'exemple, on peut citer le fragment F(ab)2 d'un anticorps.
Un anticorps monoclonal de l'invention peut en particulier être obtenu par fusion entre la lignée de myélomes SP2/O-Agl-14 et des splénocytes murins de l'espèce Balb/c et de la souche JYco, immunisés par une protéine recombinante de la protéine Core du VHC.
La protéine recombinante utilisée pour obtenir l'anticorps monoclonal est préférentiellement choisie parmi la C22-GST120 constituée par la séquence commençant à l'acide aminé 1 et se terminant à l'acide aminé 120 de la protéine Core couplée, à l'extrémité N-terminale, à la glutathione S-transférase < GST), et la C22-120-Histidine constituée par la séquence commençant à l'acide aminé 1 et se terminant à l'acide aminé 120 de la protéine Core couplée, à l'extrémité N-terminale, à une séquence de 6 résidus histidine.
L'invention a aussi pour objet les applications des anticorps ou fragments définis ci-dessus.
Ainsi un anticorps ou un fragment d'anticorps présente une utilité pour détecter et/ou quantifier des antigènes de la protéine Core du VHC, dans un échantillon biologique. Conformément à une telle application, on utilise au moins undit anticorps et/ou fragment, et avantageusement au moins deux anticorps et/ou fragments, susceptibles de se lier spécifiquement à des déterminants antigéniques respectivement différents.
L'invention concerne aussi un procédé pour détecter et/ou quantifier des antigènes de la protéine
Core du VHC, dans un échantillon biologique, selon lequel
- on dispose d'un premier et d'un second anticorps et/ou fragments de l'invention, le premier anticorps ou fragment étant susceptible de se lier à un premier composé antigénique comprenant un premier déterminant antigénique ou plus, le second anticorps ou fragment étant susceptible de se lier à un second composé antigénique comprenant un second déterminant antigénique ou plus, et ledit premier déterminant antigénique étant différent du second déterminant antigénique,
- on met l'échantillon biologique en contact avec les premier et second anticorps et/ou fragments précités, et
- on détecte, directement ou indirectement, la formation des complexes immuns formés respectivement entre le premier anticorps ou fragment et le premier déterminant antigénique d'une part, et entre le second anticorps ou fragment et le second déterminant antigénique d'autre part.
Core du VHC, dans un échantillon biologique, selon lequel
- on dispose d'un premier et d'un second anticorps et/ou fragments de l'invention, le premier anticorps ou fragment étant susceptible de se lier à un premier composé antigénique comprenant un premier déterminant antigénique ou plus, le second anticorps ou fragment étant susceptible de se lier à un second composé antigénique comprenant un second déterminant antigénique ou plus, et ledit premier déterminant antigénique étant différent du second déterminant antigénique,
- on met l'échantillon biologique en contact avec les premier et second anticorps et/ou fragments précités, et
- on détecte, directement ou indirectement, la formation des complexes immuns formés respectivement entre le premier anticorps ou fragment et le premier déterminant antigénique d'une part, et entre le second anticorps ou fragment et le second déterminant antigénique d'autre part.
Avantageusement, on traite l'échantillon biologique par un agent dénaturant, avant la détection, et de préférence, avant sa mise en contact avec les premier et second anticorps et/ou fragments. Cet agent dénaturant pourra notamment être un détergent, une solution acide.
Selon la technique de détection employée, notamment immunoenzymatique, le premier anticorps ou fragment peut être fixé sur un support solide et/ou le second anticorps ou fragment peut être marqué.
Comme cela sera illustré dans l'Exemple ci-après, on utilisera avantageusement la technique "sandwich" dans laquelle le premier anticorps ou fragment est fixé sur un support solide et le second anticorps ou fragment est marqué.
Divers supports et marqueurs peuvent être envisagés selon l'invention. Ils sont bien connus de l'homme du métier.
A titre d'exemple, le support peut être sous la forme d'une plaque, telle qu'une plaque de microtitration, d'une feuille, d'un cône, d'un puits, d'une barrette, par exemple de polystyrène, ou d'un copolymère à base de styrène, d'un tube de verre ou analogue.
Le marqueur peut être toute molécule biologique ou chimique, et peut par exemple être choisi parmi les isotopes radioactifs, des enzymes, en particulier des enzymes susceptibles d'agir sur un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent (notamment une peroxydase ou une phosphatase alcaline), des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de bases nucléotidiques, et des ligands tels que la biotine.
De préférence, le support solide est une plaque de microtitration, et le marqueur est la biotine.
La Demanderesse a déterminé des couples préférés d'anticorps pour mettre en pratique le procédé de détection de l'invention.
Ainsi, les couples d'anticorps préférés sont ceux qui comprennent à titre de premier anticorps ou fragment, un anticorps ou fragment susceptible de se lier spécifiquement au déterminant antigénique défini par
SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, et à titre de second anticorps ou fragment, un anticorps ou fragment susceptible de se lier spécifiquement au déterminant antigénique défini par SEQ ID NO: 3 ; le premier ou second anticorps ou fragment servant à la capture ou à la détection, de préférence, le premier anticorps ou fragment servant à la capture, le second anticorps ou fragment servant à la détection.
SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, et à titre de second anticorps ou fragment, un anticorps ou fragment susceptible de se lier spécifiquement au déterminant antigénique défini par SEQ ID NO: 3 ; le premier ou second anticorps ou fragment servant à la capture ou à la détection, de préférence, le premier anticorps ou fragment servant à la capture, le second anticorps ou fragment servant à la détection.
D'autres objets de l'invention sont définis ci après
- un réactif pour la détection et/ou quantification des antigènes de la protéine Core du VHC, comprenant au moins deux anticorps et/ou fragments de l'invention, et susceptibles de se lier spécifiquement à des déterminants antigéniques différents ; et
- un kit de détection et/ou quantification des antigènes de la protéine Core du VHC, comprenant un réactif tel que défini ci-dessus, un support et un marqueur ; dans ce kit l'un des anticorps et/ou fragments peut avoir été préalablement fixé sur le support et/ou l'autre avoir été marqué.
- un réactif pour la détection et/ou quantification des antigènes de la protéine Core du VHC, comprenant au moins deux anticorps et/ou fragments de l'invention, et susceptibles de se lier spécifiquement à des déterminants antigéniques différents ; et
- un kit de détection et/ou quantification des antigènes de la protéine Core du VHC, comprenant un réactif tel que défini ci-dessus, un support et un marqueur ; dans ce kit l'un des anticorps et/ou fragments peut avoir été préalablement fixé sur le support et/ou l'autre avoir été marqué.
Les différents objets de l'invention sont illustrés par les exemples 1 à 3 ci-après, à l'appui de l'unique figure qui représente l'influence du traitement d'un échantillon de sérum sur la formation des complexes immuns pour deux couples d'anticorps de l'invention, à savoir le couple d'anticorps constitué d'un premier anticorps reconnaissant SEQ ID NO: 2 et d'un second anticorps reconnaissant SEQ ID NO: 3 (+), et le couple d'anticorps constitué d'un premier anticorps reconnaissant
SEQ ID NO: 4 et d'un second anticorps reconnaissant
SEQ ID NO: 3 (N).
SEQ ID NO: 4 et d'un second anticorps reconnaissant
SEQ ID NO: 3 (N).
EXEMPLE 1: Clonage. expression et Durification des protéines recombinantes Core
L'ARN du VHC a été extrait à partir du sérum d'un patient ayant une hépatite non A non B et 1'ADN complémentaire a été obtenu par RT-PCR d'après Li et al., 1992. L'ADNc d'une partie du gène de la protéine Core située dans la région codante du VHC de génotype la (acides aminés 1-120) a été amplifié par PCR en utilisant des amorces nucléotidiques correspondant respectivement aux extrémités 5' et 3' du gène de la protéine Core 120 plus respectivement les sites BamH1 and EcoR1. Les produits d'amplification ont été ensuite clonés dans les plasmides d'expression pGEX-3 (Pharmacia, France) et pET 21b (Novagen, UK) digérés par les enzymes de restriction BamH1 and EcoR1. Les plasmides résultants, pGEx-Core and pET-Core, codent chacun pour la protéine Core de 120 acides aminés fusionnée soit à la glutathione-Stransférase (GST) (Smith and Johnson, 1988) soit à un peptide composé de 6 résidus histidine. Ces deux protéines recombinantes ont été respectivement appelées C22-GST 120 et M120-His.
L'ARN du VHC a été extrait à partir du sérum d'un patient ayant une hépatite non A non B et 1'ADN complémentaire a été obtenu par RT-PCR d'après Li et al., 1992. L'ADNc d'une partie du gène de la protéine Core située dans la région codante du VHC de génotype la (acides aminés 1-120) a été amplifié par PCR en utilisant des amorces nucléotidiques correspondant respectivement aux extrémités 5' et 3' du gène de la protéine Core 120 plus respectivement les sites BamH1 and EcoR1. Les produits d'amplification ont été ensuite clonés dans les plasmides d'expression pGEX-3 (Pharmacia, France) et pET 21b (Novagen, UK) digérés par les enzymes de restriction BamH1 and EcoR1. Les plasmides résultants, pGEx-Core and pET-Core, codent chacun pour la protéine Core de 120 acides aminés fusionnée soit à la glutathione-Stransférase (GST) (Smith and Johnson, 1988) soit à un peptide composé de 6 résidus histidine. Ces deux protéines recombinantes ont été respectivement appelées C22-GST 120 et M120-His.
Les protéines recombinantes ont été ensuite exprimées dans la souche B1 21(DE3) d'Escherichia coli après induction par ss-D-thiogalactopyranoside (IPTG,
Gibco-BRL).
Gibco-BRL).
La protéine C22-GST 120 a été ensuite purifiée sur une colonne Gluthatione Sepharose 4B (Pharmacia, France) tandis que la protéine M120-His a été purifiée par chromatographie d'affinité par métal-chelate (Ni-NTA
Resin, Quiagen, France).
Resin, Quiagen, France).
L'homogénéité des protéines purifiées a été caractérisée par SDS-PAGE et leur immunoréactivité analysée par Western blot à l'aide d'un lot de sérums positifs vis-à-vis de VHC, d'un sérum polyclonal anti-GST de lapin ou anticorps anti hexa-histidine (Dianova,
France).
France).
EXEMPLE 2 : Préparation d'anticorPs de l'invention
Des souris femelles Balb/c de la souche JYco âgées de 4 à 6 semaines (IFFA Credo, Les Oncins, l'Arbresle,
France) ont été immunisées par voie intrapéritonéale avec 10 Ag de la protéine recombinante C22-GST 120 émulsifiée avec un volume égal d'adjuvant complet de Freund. Six injections d'immunogène ont été ensuite effectuées toutes les deux semaines en utilisant de l'adjuvant incomplet de
Freund. Quatre jours après la dernière injection, les cellules spléniques des souris récupérées et fusionnées avec des cellules du myélome de souris Sp2/O-Agl-14 suivant la technique de Kohler et Milstein (1975, 1976).
Des souris femelles Balb/c de la souche JYco âgées de 4 à 6 semaines (IFFA Credo, Les Oncins, l'Arbresle,
France) ont été immunisées par voie intrapéritonéale avec 10 Ag de la protéine recombinante C22-GST 120 émulsifiée avec un volume égal d'adjuvant complet de Freund. Six injections d'immunogène ont été ensuite effectuées toutes les deux semaines en utilisant de l'adjuvant incomplet de
Freund. Quatre jours après la dernière injection, les cellules spléniques des souris récupérées et fusionnées avec des cellules du myélome de souris Sp2/O-Agl-14 suivant la technique de Kohler et Milstein (1975, 1976).
Douze à quatorze jours plus tard, les surnageants de culture ont été analysés par un test ELISA où l'antigène ayant servi pour l'immunisation des souris est déposé au fond des puits. Les colonies positives sont sous clonées deux fois par dilution limitante.
Les ascites ont été obtenus à partir de souris dans lesquelles ont été successivement injectés par voie intrapéritonéale 0,5 ml de Pristane puis 106 hybridomes.
Les immunoglobulines G ont été ensuite purifiées sur une colonne de ProteinA-Sepharose 4FF suivant le protocole fourni par le fabricant (Pharmacia, France).
Les anticorps monoclonaux purifiés ont été biotinylés à l'aide de Sulfo-NHS-LC-Biotin (Merck,
Rockford, Illinois) suivant la méthode de Gretch et al.
Rockford, Illinois) suivant la méthode de Gretch et al.
EXEMPLE 3 : Détection d'antigènes de la protéine
Core du vHC dans un échantillon biologique
Le premier anticorps monoclonal est déposé sur la phase solide à la concentration finale de 5 pg/ml en PBS et incubé une nuit à 40C. Les plaques sont encore lavées 3 fois avec du PBS-T puis un conjugué avidine-peroxydase (Jackson ImmunoResearch Laboratories) est ensuite ajouté à la dilution 1:5000 en PBS-T- sérum de chèvre et laissé pendant une heure à 370C. Après avoir lavé une dernière fois les plaques avec du PBS-T, la réaction colorimétrique est obtenue en utilisant le kit commercial de bioMérieux (Color kit) qui contient de l'ortho-phénylène-diamine de l'eau oxygénée. Après 10 min d'incubation, la réaction est stoppée avec de l'acide sulfurique est les plaques sont lues à 492 nm avec un lecteur de plaque d'ELISA. Les valeurs sont exprimées par la moyenne de points expérimentaux effectués en triple.
Core du vHC dans un échantillon biologique
Le premier anticorps monoclonal est déposé sur la phase solide à la concentration finale de 5 pg/ml en PBS et incubé une nuit à 40C. Les plaques sont encore lavées 3 fois avec du PBS-T puis un conjugué avidine-peroxydase (Jackson ImmunoResearch Laboratories) est ensuite ajouté à la dilution 1:5000 en PBS-T- sérum de chèvre et laissé pendant une heure à 370C. Après avoir lavé une dernière fois les plaques avec du PBS-T, la réaction colorimétrique est obtenue en utilisant le kit commercial de bioMérieux (Color kit) qui contient de l'ortho-phénylène-diamine de l'eau oxygénée. Après 10 min d'incubation, la réaction est stoppée avec de l'acide sulfurique est les plaques sont lues à 492 nm avec un lecteur de plaque d'ELISA. Les valeurs sont exprimées par la moyenne de points expérimentaux effectués en triple.
La protéine M120-His purifiée (50 pg/ml) a été utilisée dans une gamme étalon pour quantifier l'antigène
Core dans les sérums de malades VHC. Différentes dilutions (de 500ng/ml à 0,5pg/ml) de la protéine ont été effectuées dans du sérum humain négatif et traitées de la même façon que les sérums de patient VHC à tester. La protéine C22 120GST a été aussi testée et a donné des résultats comparables.
Core dans les sérums de malades VHC. Différentes dilutions (de 500ng/ml à 0,5pg/ml) de la protéine ont été effectuées dans du sérum humain négatif et traitées de la même façon que les sérums de patient VHC à tester. La protéine C22 120GST a été aussi testée et a donné des résultats comparables.
Ainsi que le montre la figure, les traitements chimiques effectués sur les sérums affectent peu la sensibilité de détection du couple utilisant l'anticorps dirigé contre la séquence SEQ ID NO: 2 pour la capture de l'antigène tandis qu'ils affectent fortement la sensibilité de détection du couple utilisant l'anticorps dirigé contre la séquence SEQ ID NO: 4 pour la capture de l'antigène.
Ainsi le traitement de 5 sérums virémiques par du
Triton x100 à la concentration finale de 1%, et acidification à pH 4, suivis d'une neutralisation après 45 min. a permis une détection d'antigène Core dont les qualités sont montrées dans le tableau suivant.
Triton x100 à la concentration finale de 1%, et acidification à pH 4, suivis d'une neutralisation après 45 min. a permis une détection d'antigène Core dont les qualités sont montrées dans le tableau suivant.
Tableau
<tb> S. <SEP> virémi <SEP> ues <SEP> <SEP> Core <SEP> / <SEP> ml <SEP> sérum
<tb> <SEP> sérum <SEP> 1 <SEP> | <SEP> 2,2 <SEP> ng/ml <SEP>
<tb> <SEP> sérum <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> ng/ml
<tb> <SEP> sérum <SEP> 3 <SEP> 2 <SEP> ng/ml
<tb> <SEP> sérum <SEP> 4 <SEP> 20 <SEP> pg/ml
<tb> <SEP> sérum <SEP> 5 <SEP> 92 <SEP> pg/ml <SEP>
<tb>
LI8TAGE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: BIO MERIEUX
(B) RUE: Chemin de l'Orme
(C) VILLE: MARCY L'ETOILE
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 69280
(ii) TITRE DE L'INVENTION: Anticorps monoclonal et utilisations pour détecter des antigènes de la protéine Core du VHc
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 8 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:1
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 191 résidus d'acide aminé
(B) TYPE: acides aminés
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine Core du VHC
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:1 protéine Core (dont la séquence est notamment décrite dans EP 0 569 309) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 8 résidus d'acide aminé
(B) TYPE: acides aminés
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide de l'extrémité N-terminale de la protéine Core du VHC (18-25)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro
1 5 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 8 résidus d'acide aminé
(B) TYPE: acides aminés
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide de l'extrémité N-terminale de la protéine Core du vHC (29-36)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu
1 5 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 8 résidus d'acide aminé
(B) TYPE: acides aminés
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide de l'extrémité N-terminale de la protéine Core du vHC (57-64)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile
1 5 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 44 résidus d'acide aminé
(B) TYPE: acides aminés
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide de l'extrémité N-terminale de la protéine Core du vHC (2-45)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg
1 5 10 15
Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly
20 25 30
Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly
35 40 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 résidus d'acide aminé
(B) TYPE: acides aminés
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide de l'extrémité N-terminale de la protéine Core du VHC (2-21)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg
1 5 10 15
Arg Pro Gln Asp
20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 résidus d'acide aminé
(B) TYPE: acides aminés
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide de l'extrémité N-terminale de la protéine Core du VHC (22-45)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu
1 5 10
Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly
20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 44 résidus d'acide aminé
(B) TYPE: acides aminés
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide de l'extrémité N-terminale de la protéine Core du VHC (38-81)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser
1 5 10 15
Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg
20 25 30
Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr
35 40
BIBLIOGRAPHIE
- Kohler, G, and C. Milstein. 1975. Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature, 256: 495-497.
<tb> <SEP> sérum <SEP> 1 <SEP> | <SEP> 2,2 <SEP> ng/ml <SEP>
<tb> <SEP> sérum <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> ng/ml
<tb> <SEP> sérum <SEP> 3 <SEP> 2 <SEP> ng/ml
<tb> <SEP> sérum <SEP> 4 <SEP> 20 <SEP> pg/ml
<tb> <SEP> sérum <SEP> 5 <SEP> 92 <SEP> pg/ml <SEP>
<tb>
LI8TAGE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: BIO MERIEUX
(B) RUE: Chemin de l'Orme
(C) VILLE: MARCY L'ETOILE
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 69280
(ii) TITRE DE L'INVENTION: Anticorps monoclonal et utilisations pour détecter des antigènes de la protéine Core du VHc
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 8 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:1
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 191 résidus d'acide aminé
(B) TYPE: acides aminés
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine Core du VHC
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:1 protéine Core (dont la séquence est notamment décrite dans EP 0 569 309) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 8 résidus d'acide aminé
(B) TYPE: acides aminés
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide de l'extrémité N-terminale de la protéine Core du VHC (18-25)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro
1 5 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 8 résidus d'acide aminé
(B) TYPE: acides aminés
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide de l'extrémité N-terminale de la protéine Core du vHC (29-36)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu
1 5 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 8 résidus d'acide aminé
(B) TYPE: acides aminés
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide de l'extrémité N-terminale de la protéine Core du vHC (57-64)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile
1 5 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 44 résidus d'acide aminé
(B) TYPE: acides aminés
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide de l'extrémité N-terminale de la protéine Core du vHC (2-45)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg
1 5 10 15
Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly
20 25 30
Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly
35 40 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 résidus d'acide aminé
(B) TYPE: acides aminés
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide de l'extrémité N-terminale de la protéine Core du VHC (2-21)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg
1 5 10 15
Arg Pro Gln Asp
20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 résidus d'acide aminé
(B) TYPE: acides aminés
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide de l'extrémité N-terminale de la protéine Core du VHC (22-45)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu
1 5 10
Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly
20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 44 résidus d'acide aminé
(B) TYPE: acides aminés
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide de l'extrémité N-terminale de la protéine Core du VHC (38-81)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser
1 5 10 15
Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg
20 25 30
Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr
35 40
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The use of biotinylated monoclonal antibodies and steptavidin affinity chromatography to isolate herpes virus hydrophobic proteins or glycoproteins. Anal.
Biochem. 163, 270-277.
Claims (18)
1. Anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel d'anticorps monoclonal, susceptible de se lier spécifiquement, pour former un complexe immun, à un composé antigénique de la protéine Core du virus de l'hépatite C, ledit composé antigénique ayant une séquence peptidique et comprenant au moins un déterminant antigénique défini par une seule des séquences suivantes celle commençant à l'acide aminé 18 et se terminant à l'acide aminé 25 de ladite protéine Core, celle commençant à l'acide aminé 29 et se terminant à l'acide aminé 36 de ladite protéine, et celle commençant à l'acide aminé 57 et se terminant à l'acide aminé 64 de ladite protéine.
2. Anticorps ou fragment selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence peptidique du composé antigénique comprend une séquence choisie parmi
SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4.
3. Anticorps ou fragment selon la revendication 2, caractérisé en ce que la séquence peptidique du composé antigénique est choisie parmi SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6,
SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 8.
4. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, susceptible d'être obtenu par fusion entre la lignée de myélomes SP2/O-Agl-14 et des splénocytes murins de l'espèce Balb/c et de la souche
JYco, immunisées par une protéine recombinante de la protéine Core du VHC.
5. Anticorps monoclonal selon la revendication 4, caractérisé en ce que la protéine recombinante est choisie parmi la C22-GST120 constituée par la séquence commençant à l'acide aminé 1 et se terminant à l'acide aminé 120 de la protéine Core couplée, à l'extrémité N-terminale, à la glutathione S-transférase (GST), et la C22-120-Histidine constituée par la séquence commençant à l'acide aminé 1 et se terminant à l'acide aminé 120 de la protéine Core couplée, à l'extrémité N-terminale, à une séquence de 6 résidus histidine.
6. Utilisation d'au moins un anticorps et/ou fragment tel que défini à l'une quelconque des revendications précédentes, pour détecter et/ou quantifier des antigènes de la protéine Core du VHC, dans un échantillon biologique.
7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'on utilise au moins deux anticorps et/ou fragments tels que définis à l'une quelconque des revendications précédentes et susceptibles de se lier spécifiquement à des déterminants antigéniques différents.
8. Procédé pour détecter et/ou quantifier des antigènes de la protéine Core du VHC, dans un échantillon biologique, selon lequel
- on dispose d'un premier et d'un second anticorps et/ou fragments tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 5, le premier anticorps ou fragment étant susceptible de se lier à un premier composé antigénique comprenant un premier déterminant antigénique ou plus, le second anticorps ou fragment étant susceptible de se lier à un second composé antigénique comprenant un second déterminant antigénique ou plus, ledit premier déterminant antigénique étant différent du second déterminant antigénique,
- on met l'échantillon biologique en contact avec les premier et second anticorps et/ou fragments, et
- on détecte, directement ou indirectement, la formation des complexes immuns formés respectivement entre le premier anticorps ou fragment et le premier déterminant antigénique d'une part, et entre le second anticorps ou fragment et le second déterminant antigénique d'autre part.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que, avant la détection, on traite l'échantillon biologique par un agent dénaturant.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on traite l'échantillon avant sa mise en contact avec les premier et second anticorps et/ou fragments.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que le premier anticorps ou fragment est fixé sur un support solide.
12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le second anticorps ou fragment est marqué.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le support solide est une plaque de microtitration, et le marqueur est la biotine.
14. Procédé selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que le premier anticorps ou fragment est susceptible de se lier spécifiquement au déterminant antigénique défini par SEQ ID NO: 4 et le second anticorps ou fragment est susceptible de se lier spécifiquement au déterminant antigénique défini par SEQ ID NO: 3.
15. Procédé selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que le premier anticorps ou fragment est susceptible de se lier spécifiquement au déterminant antigénique défini par SEQ ID NO: 2 et le second anticorps ou fragment est susceptible de se lier spécifiquement au déterminant antigénique défini par SEQ ID NO: 3.
16. Réactif pour la détection et/ou quantification des antigènes de la protéine Core du VHC, comprenant au moins deux anticorps et/ou fragments tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 7 et susceptibles de se lier spécifiquement à des déterminants antigéniques différents.
17. Kit de détection et/ou quantification des antigènes de la protéine Core du VHC, comprenant un réactif selon la revendication 16, un support et un marqueur.
18. Kit selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'un des anticorps et/ou fragments est fixé sur le support et l'autre est marqué.
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| FR9803087A FR2775690B1 (fr) | 1998-03-09 | 1998-03-09 | Anticorps monoclonal et utilisations pour detecter des antigenes de la proteine core de vhc |
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|---|---|---|---|
| FR9803087A FR2775690B1 (fr) | 1998-03-09 | 1998-03-09 | Anticorps monoclonal et utilisations pour detecter des antigenes de la proteine core de vhc |
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| FR9803087A Expired - Fee Related FR2775690B1 (fr) | 1998-03-09 | 1998-03-09 | Anticorps monoclonal et utilisations pour detecter des antigenes de la proteine core de vhc |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |