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FR2734841A1 - Gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant ce gene resistantes aux herbicides - Google Patents

Gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant ce gene resistantes aux herbicides Download PDF

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FR2734841A1
FR2734841A1 FR9513570A FR9513570A FR2734841A1 FR 2734841 A1 FR2734841 A1 FR 2734841A1 FR 9513570 A FR9513570 A FR 9513570A FR 9513570 A FR9513570 A FR 9513570A FR 2734841 A1 FR2734841 A1 FR 2734841A1
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gene
hppd
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plant
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Anne Rolland
Michel Matringe
Ken Pallett
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Bayer CropScience SA
Original Assignee
Rhone Poulenc Agrochimie SA
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Abstract

Gène de l'hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase et obtention de plantes contenant ce gène, résistantes aux herbicides. 1. Gène de l'hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase 2. Isolement à partir de Pseudomonas sp. 3. Utilisation pour l'obtention de plantes résistantes aux herbicides.

Description

Gène de l'hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase et obtention de plantes contenant ce
gène résistantes aux herbicides.
La présente invention concerne le gène de l'hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase (HPPD), un gène chimère contenant ce gène comme séquence codante et son utilisation pour 1' obtention de plantes résistantes à certains herbicides.
On connait certains herbicides tel que l'isoxaflutol, herbicide sélectif du mais, de la famille des isoxazoles ou encore la sulcotrione de la famille des tricétones. Cependant aucun gène de résistance à de tels herbicides n' a été décrit.
L'hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase est une enzyme qui catalyse la réaction de transformation du para-hydroxy phénylpyruvate en homogentisate.
Par ailleurs la séquence en acides aminés de l'hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase issue de Pseudomonas sp. P.J. 874 a été décrite, sans qu'il y ait une description de son rôle dans la résistance des plantes aux herbicides (RüETSCHI et col:
Eur. J. Biochem. 205,459466, 1992). Ce document ne donne pas de description du gène de la protéine.
I1 a maintenant été découvert la séquence d'un gène de ce type et qu'un tel gène
pouvait, une fois incorporé dans des cellules végétales, fournir des plantes présentant une
résistance intéressante à certains herbicides récents, tels que ceux de la famille des
isoxazoles ou de celle des tricétones.
La présente invention a donc pour objet un gène de résistance à un herbicide,
caractérisé en ce qu'il exprime l'hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase (HPPD). Celui-ci
peut être d'origine quelconque mais est de préférence d'origine bactérienne, telle que
notamment le genre Pseudomonas ou encore d'origine végétale.
L'invention comprend également un procédé d'isolement du gène ci-dessus, caractérisé
en ce que:
-on choisit, comme amorces, quelques oligonucléotides issus de la séquence en
acides aminés d'une HPPD,
- à partir de ces amorces, on synthétise des fragments d'amplification par PCR
- on isole le gène par création et criblage d'une banque génomique et
- on clone le gène.
De préférence on utilise des amorces issues de la séquence de 1'HPPD d'une bactérie
du genre Pseudomonas. De manière particulièrement préférée, elles sont issues de
Pseudomonas fluorescens.
Ce gène peut être utilisé dans un procédé pour la transformation des plantes comme
gène marqueur ou comme séquence codante permettant de conférer à la plante une résistance à certains herbicides. Il peut également être utilisé en association avec d'autres gènes marqueurs et/ou séquence codante pour une propriété agronomique.
La transformation des cellules végétales peut être obtenu par tout moyen connu approprié. Une série de méthodes consiste à bombarder des cellules ou des protoplates avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN.
Une autre série de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans la plante d'un gène chimère inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens ou Ri d'Agrobacterium rhizogenes.
La présente invention a encore pour objet un gène chimère comprenant, dans le sens de la transcription, au moins une séquence de régulation promotrice, une séquence codante hétérologue qui exprime l'hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase et au moins une séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation.
Comme séquence de régulation promotrice on peut utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un promoteur d'origine bactérienne, virale ou végétale tel que, par exemple, celui d'un gène de la petite sous-unité de ribulose-biscarboxylase (RuBisCO) ou de celui d'un gène de l'a tubuline (Demande européennne EP n" 0 652 286), ou encore d'un gène de virus de plante tel que, par exemple, celui de la mosaique du choux fleur (CAMV 19S ou 35S), mais tout promoteur convenable connu peut être utilisé. De préférence on a recours à une séquence de régulation promotrice qui favorise la surexpression de la séquence codante, tel que par exemple, celle comprenant au moins un promoteur d'histone tel que décrit dans la demande européenne EP 0507698.
Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de trancription "enhancer", comme par exemple l'activateur de translation du virus etch du tabac (TEV) décrit dans la demande
W087/07644, ou des peptides de transit, soit simples, soit doubles, et dans ce cas éventuellement séparés par une séquence intermédiaire, c'est à dire comprenant, dans le sens de la transcription, une séquence codant pour un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, une partie de séquence de la partie mature N terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, puis une séquence codant pour un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale.constituée d'une partie de séquence de la partie mature N terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, tels que décrit dans la demande européenne n" 0 508 909.
Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, on peut utiliser toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le terminateur nos d'Agrobacterium tumefaciens, ou encore d'origine végétale, comme par exemple un terminateur d'histone tel que décrit dans la demande européenne EP n" 0 633 317.
La présente invention a encore pour objet les cellules végétales, de plantes monocotylédones ou dicotylédones, notamment des cultures, transformées selon l'un des procédés décrits ci-dessus et contenant dans leur génome une quantité efficace d'un gène exprimant l'hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase (HPPD). On a observé que des plantes transformées de cette façon présentent une résistance importante à certains herbicides récents tels que ceux de la famille des isoxazoles et notamment du 4-[4-CF3-2 (méthylsulfoyl) benzoyl]-5-cyclopropyl isoxazole, ou encore de celle des tricétones, comme par exemple la sulcotrione.
L'invention a enfin pour objet un procédé de désherbage de plantes, notamment de cultures, à l'aide d'un herbicide de ce type, caractérisé en ce qu'on applique cet herbicide sur des plantes transformées selon l'invention.
Les différents aspects de l'invention seront mieux compris à l'aide des exemples expérimentaux ci-dessous.
Exemple 1: Isolement du gène de l'HPPD de P. fluorescens A32 .
A partir de la séquence en acides aminés de l'HPPD de Pseudomonas sp. P.J. 874 ( publié par Rüetschi U. et al. 1992. Eur. J. Biochem. 205: 459-466), on déduit la séquence de différents oligonucléotides pour amplifier par PCR une partie de la séquence codante de l'HPPD de P. fluorescens A32 (isolée par McKellar, R.C. 1982. J. Appl Bacteriol. 53:305316). Un fragment d'amplification du gène de cette HPPD a été utilisé pour cribler une banque génomique partielle de P. fluorescens A32 et ainsi isoler le gène codant pour cette enzyme.
A) Préparation de l'ADN génomique de P. fluorescens A32.
La bactérie a été cultivée dans 40 ml de milieu minnimum M63 (KH2PO4 13,6gui, (NH4)2SO4 2go1, MgS04 0,2go, FeSO4 0,005 g/I pH7 plus L-tyrosine lOmM comme seule source de carbone) à 28"C pendant 48 heures.
Après lavage, les cellules sont repnses dans 1 ml de tampon de lyse (tris HCl 100 mM pH 8,3, NaCI 1,4 IM et EDTA 10 mM) et incubées 10 minutes à 65"C. Après un traitement au phénol/chloroforme (24/1) et un traitement au chloroforme, les acides nucléiques sont précipités par addition d'un volume d'isopropanol puis repris dans 300 ul d'eau stérile et traités à la RNAse 10 llg/ml final. 1'ADN est de nouveau traité au phénol/chloroforme, chloroforme et reprécipité par addition de 1/10 de volume d'acétate de sodium 3M pH5 et 2 volumes d'éthanol. l'ADN est ensuite repris dans de l'eau stérile et dosé.
B) Choix des oligonucléotides et synthèses.
A partir de la séquence en acides aminés de l'HPPD de Pseudomonas sp. P.J. 874 on choisit cinq oligonucléotides, deux dirigés dans le sens NH2 terminal de la protéine vers le
COOH terminal de la protéine et trois dirigés dans le sens inverse (voir SEQ. ID N0 1 . Le choix a été dicté par les deux règles suivantes:
-une extrémité 3' de l'oligonucléotide stable, c'est à dire au moins deux bases sans ambiguité.
-une dégénérescence la plus faible possible.
Les oligonucléotides choisis ont les séquences suivantes: P1: 5'TA(C/T)GA(G/A)AA(C/T)CCIATGGG3'
P2: 5'GA(G/A)ACIGGICCIATGGA3'
P3: 5'AA(C/T)TGCATIA(G/A)(G/A)AA(C/T)TC(C/T)TC3'
P4: 5'AAIGCIAC(G/A)TG(C/T)TG(T/G/A)ATICC3'
P5: 5'GC(C/T)TT(A/G)AA(A/G)TTICC(C/T)TCICC3'
Ils ont été synthétisés sur le synthétiseur "Cyclone plus DNA Synthesizer" de marque
MILLPORE.
Avec ces cinq oligonucléotides par PCR les fragments d'amplification que l'on doit obtenir théoriquement d'après la sséquence SEQ ID N 1 ont les tailles suivantes:
avec les amorces P1 et P3 -------- > environ 690 bp
avec les amorces P1 et P4 -------- > environ 720 bp
avec les amorces Pi et P5 -------- > environ 1000 bp
avec les amorces P2 et P3 -------- > environ 390 bp
avec les amorces P2 et P4 -------- > environ 420 bp
avec les amorces P2 et P5 -------- > environ 700 bp
C) Amplification d'une partie codante de l'HPPD de P. fluorescens A32.
Les amplifications ont été faites sur un appareil PCR PERKIN ELMER 9600 et avec la Taq polymérase PERKIN ELMER avec son tampon dans les conditions standards, c'est à dire pour 501l1 de réaction il y a les dNTP à 200 M, les primers à 20 M, la Taq polymérase 2,5 unités et 1' ADN de P. fluorescens A32 2,5 tig.
Le programme d'amplification utilisé est, 5 min à 95 C puis 35 cycles < 45 sec 95 C, 45 sec 49 C, 1 min 72"C > suivis de 5 min à 72"C.
Dans ces conditions, tous les fragments d'amplification obtenus ont une taille compatible avec les tailles théoriques données au-dessus, ce qui est une bonne indication de la spécificité des amplifications.
Les fragments d'amplifications obtenus avec les jeux d'amorces P1/P4, P1/P5 et P2/P4 sont ligués dans pBSII SK(-) après digestion de ce plasmide par Eco RV et traitement à la terminal transférase en présence de ddTTP comme décrit dans HOLTON T.A. and
GRAHAM M.W. 1991. N.A.R. vol 19, n 5 pi 156.
Un clone de chacun des trois types est séquencé partiellement; ceci permet de confirmer qu'on a bien amplifié dans les trois cas une partie de la région codante de l'HPPD de P. fluorescens A32. Le fragment P l/P4 est retenu comme sonde pour cribler une banque génomique partielle de P. fluorescens A32 et isoler le gène complet de l'HPPD.
D) Isolement du gène.
Par Southern on montre qu'un fragment de 7 Kbp après digestion de l'ADN de P.
fluorescens A32 par l'enzyme de restriction BamHI s'hybride avec la sonde HPPD P1/P4.
On a donc fait digérer 400cl d'ADN de P. fluorescens A32 par l'enzyme de restriction
BamHI et purifier surgel d'agarose les fragments d'ADN faisant environ 7Kbp.
Ces fragments sont ligués dans pBSII SK(-), lui-même digéré par Barn HI et déphosphorylé par traitement à la phosphatase alcaline. Après transformation dans E. coli
DHlOb, la banque génomique partielle est criblée avec la sonde HPPD P1/P4.
Un clone positif a été isolé et appelé pRP A. Sa carte simplifiée est donnée figure 1
Sur cette carte est indiqué la position de la partie codante du gène HPPD. Elle est composée de 1077 nucléotides qui codent pour 358 acides aminés (voir SEQ ID N" 2 ).
L'HPPD de P. fluorescens A32 présente une bonne homologie en acides aminés avec celle de Pseudomonas sp. strain P.J. 874, il y a en effet 92% d'identité entre ces deux protéines ( voir SEQ ID N" 3 ).
Exemple 2: Construction de deux gènes chimères.
Pour conférer la résistance de plantes aux herbicides inhibant l'HPPD, on construit deux gènes chimères:
Le premier consiste à mettre la partie codante du gène de l'HPPD de P. fluorescens
A32 sous le controle du promoteur double histone (Brevet européennne N" 0 507 698)
suivi du Tobacco etch virus translational enhancer (TEV) (pRTL-GUS (Carrington and
Freed, 1990; J. Virol. 64: 1590-1597)) avec le terminateur du gène de la nopaline synthase.
L'HPPD sera alors localisée dans le cytoplasme.
Le deuxiéme sera identique au premier, à ceci près qu'entre activateur de trancription
TEV et la partie codante de l'HPPD, on intercale le peptide de transit optimisé (OTP)
(Demande européennne EP n" 0 508 909). L'HPPD sera alors localisée dans le chloroplaste.
A) Construction du vecteur pRPA-RD-153:
- pRPA-RD-ll: Un dérivé de pBS-II SK(-) (Stratagene catalog &num;212206) contenant le
site de polyadenylation de la nopaline synthase (NOS polyA) ( Demande européennne EP
n" 0 652 286) est cloné entre les sites Kpnl et Sall. Le site KpnI est transformé en un site
NotI par traitement avec la T4 ADN polymerase I en presence de 150 pM
dedeoxynucleotide triphoshates puis ligation avec un linker NotI (Stratagene catalog
&num;1029). Ainsi on obtient une cassettte de clonage NOS polyA.
- pRPA-RD-127: Un dérivé de pRPA-BL-466 (Demande européennne EP n 0 337 899) cloné dans pRPA-RD- 11 créant une cassette d'expression du gène oxy et contenant le promoteur de la petite sous unité de la ribulose-biscarboxylase:
"promoteur (SSU) - oxy gene - NOS polyA"
Pour créer ce plasmide, pRPA-BL-466 a été digéré avec XbaI et HindIII pour isoler un fragment de 1.9 kbp contenant le promoteur SSU et le gène oxy qui a été ligué dans le plasmide pRPA-RD- 11 digéré avec des enzymes compatibles.
- pRPA-RD- 132: C'est un dérivé de pRPA-BL-488 (Demande européennne EP n 0 507 698) cloné dans pRPA-RD-127 avec création d'une cassette d'expression du gène oxy avec le promoteur double histone:
"promoteur double histone - oxy gene - NOS polyA
Pour fabriquer ce plasmide, pRPA-BL-466 est digéré par HindIII, traité par la Klenow puis redigéré avec NcoI. Le fragment de 1.35 kbp purifié contenant le promoteur double histone H3A748 est ligué avec le plasmide pRPA-RD-127 qui avait été digéré par XbaI, traité Klenow et redigéré par NcoI.
- pRPA-RD-153: C'est un derivé de pRPA-RD-132 contenant l'activateur de translation du virus etch du tabac (TEV). pRTL-GUS (Carrington and Freed, 1990; J.
Virol. 64: 1590-1597) est digéré avec Ncol and EcoRI et le fragment de 150 bp est ligué dans pRPA-RD-132 digéré avec les mêmes enzymes. Donc on a créé une cassette d'expression contenant le promoteur:
"double histone promoter - TEV -oxy gene - NOS polyA"
B) Construction du vecteur pRPA-RD-185:
pUC19/GECA:Un dérivé de pUC-19 (Gibco catalog &num;15364-011) contenant de nombreux sites de clonage. pUC-19 est digéré avec EcoRI et ligué avec I'oligonucleotide linker 1:
Linker 1: AATTGGGCCA GTCAGGCCGT TTAAACCCTA GGGGGCCCG
CCCGGT CAGTCCGGCA AATTTGGGAT CCCCCGGGC TTAA
Le clone sélectionné contient un site EcoRI suivi du polylinker qui contient les sites suivants: EcoRI, Apal, Avrll, Pmel, Sfil, SacI, Kpnl, Semai, BamHI, Xbal, Sali, PstI, Sphl et
HindIII.
pRPA-RD-185: c'est un dérivé de pUCl9/GECA contenant un polylinker modifié.
pUC19/GECA est digéré par HindlII et ligué avec l'oligonucleotide linker 2:
Linker 2: AGCTTTTAAT TAAGGCGCGC CCTCGAGCCT GGTTCAGGG
AAATTA ATTCCGCGCG GGAGCTCGGA CCAAGTCCC TCGA
Le clone sélectionné contient un site Hindi!! site au milieu du polylinker qui contient maintenant les sites suivants: EcoRI, Apal, AvrII, Pmel, Sfil, Sacl, Kpnl, Smal,
BamHI, Xbal, Sali, Pstl, Sphl, Hindi!!, PacI, Ascl Xhol et EcoNI.
C) Construction du vecteur pRP T:
- pRP O: un dérivé de pRPA-RD-153 contenant une cassette d'expression de l'HPPD, promoteur double histone - TEV - gène HPPD - terminateur Nos. Pour fabriquer pRP O, pRPA-RD153 est digéré par Hind m, traité par la Klenow puis redigéré par NcoI pour enlever le gène oxy et le remplacer par le gène HPPD sorti du plasmide pRP A par digestion BstEII, traitement par la Klenow et redigestion par NcoI.
- pRP R: pour l'obtenir le plasmide pRP O a été digéré par PvuII et SacI, le gène chimère a été purifié puis ligué dans pRPA-RD-185 lui-même digéré par PvuII et SacI.
- pRP T: il a été obtenu par ligation du gène chimère sorti de pRP R après digestion par SacI et Hindllî dans le plasmide pRPA-BL 150 alpha2 digéré par les mêmes enzymes(Demande européennne EP n 0 508 909).
Le gène chimère du vecteur binaire pRP T a donc la structure suivante:
Figure img00070001
<tb> Promoteur <SEP> double <SEP> histone <SEP> TEV <SEP> Région <SEP> codante <SEP> de <SEP> 1'HPPD <SEP> | <SEP> Terminateur <SEP> nos <SEP>
<tb>
D) Construction du vecteur pRP V:
- pRP P: c'est un dérivé de pRPA-RD-7 (Demande européennne EP n 0 652 286) contenant le peptide de transit optimisé suivi du gène de l'HPPD. Il a été obtenu par ligation de la partie codante de 1'HPPD sorti de pRP A par digestion BstEII et NcoI, traitement à la Klenow et du plasmide pRPA-RD-7 lui-même digéré SphI et AccI et traité à la DNAse polymérase T4.
- pRP Q: un dérivé de pRPA-RD-153 contenant une cassette d'expression de 1'HPPD, promoteur double histone - TEV - OTP - gène HPPD - terminateur Nos. Pour le construire le plasmide pRPA-RD-153 est digéré par Sal I, traité par la Klenow puis redigéré par NcoI pour enlever le gène oxy et le remplacer par le gène HPPD sorti du plasmide pRP P par digestion BstEII, traitement par la Klenow et redigestion par Ncot.
- pRP S: pour l'obtenir, le plasmide pRP Q a été digéré par PvuII et SacI pour sortir le gène chimère qui a été ligué dans pRPA-RD-185 lui-même digéré par PvutI et SacI.
- pRP V: il a été obtenu par ligation du gène chimère sorti de pRP S après digestion par SacI et HindIII dans le plasmide pRPA-BL 150 alpha2 (Demande européennne EP n" 0 508 909).
Le gène chimère du vecteur binaire pRP a donc la structure suivante:
Figure img00080001
<tb> Promoteur <SEP> double <SEP> TEV <SEP> OTP <SEP> Région <SEP> codante <SEP> de <SEP> l'HPPD <SEP> Terminateur <SEP> nos
<tb> <SEP> histone
<tb>
Exemple 3: Transformation du tabac industriel PBD6.
Afin de déterminer l'efficacité de ces deux gènes chimériques, ceux-ci ont été transférés dans du tabac industriel PBD6 selon les procédures de transformation et de régénération déjà décrites dans la demande européenne EP n" 0 508 909.
1)Transformation:
Le vecteur est introduit dans la souche non oncogène d'Agrobacterium EHA
101(Hood et al,1987)porteuse du cosmide pTVK 291(Komari et al,1986).La technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh et al(1985).
2) Régénération:
La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'explants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30g/1 de saccharose ainsi que 200ug/ml de kanamycine.Les explants foliaires sont prélevés sur des plants en serre ou in vitro et transformés selon la technique des disques foliaires(Science
1985,Vol 227,p.1229-1231) en trois étapes successives::la première comprend l'induction des pousses sur un milieu MS additionné de 30g/l de saccharose contenant 0.05mu/1 d'acide naphtylacétique (ANA) et 2 mg/l de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours.Les pousses formées au cours de cette étape sont ensuite développées par culture sur un milieu MS additionné de 30 g/I de saccharose mais ne contenant pas d'hormone, pendant l0jours.Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à teneur moitié en sels, vitamines et sucres et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ 15 jours,les pousses enracinées sont passées en terre.
Exemple 4: Mesure de la résistance du tabac au 4-F4-CF3-2-(méthylsulfovl) benzoyli- 5-cvclopropvl isoxazole.
Au sortir de l'in-vitro, les plantules de tabac transformées ont été acclimatées à la serre (60% d'humidité relative; température: 20"C la nuit et 23"C la jour) pendant cinq semaines puis traitées au 4-[4-CF3-2-(méthylsulfoyl)benzoyl]-5-cyclopropyl isoxazole.
Le tabac témoin, non transformé et traité au 4-[4-CF3-2-(méthylsulfoyl)benzoyl]-5- cyclopropyl isoxazole à des doses allant de 50 à 400 g/ha, développe en environ 72 heures des chloroses, qui s'intensifient pour évoluer vers des nécroses très prononcées en une semaine( couvrant environ 80% des feuilles terminales).
Après transformation ce même tabac, qui surexprime l'HPPD de P. fluorescens, est très bien protégé contre un traitement au 4-[4-CF3-2-(méthylsulfoyl)benzoyl]-5- cyclopropyl isoxazole à la dose de 400 g/ha.
Si l'enzyme surexprimée est dans le cytoplasme, ctest à dire si la transformation a été faite avec le gène porté par le verteur pRP T, alors la plante présente de très légères chloroses toutes localisées sur les feuilles intermédiaires.
Si l'enzyme surexprimée est dans le chloroplaste, c'est à dire si la transformation a été faite avec le gène porté par le verteur pRP V, alors la plante est parfaitement protégée, ne présente aucun symptôme.
Les séquences illustrées sont les suivantes:
SEQ. ID N" 1
Séquence protéique de l?HPPD de Pseudomonas sp. strain P.J. 874 et la séquence nucléotidique théorique de la partie codante correspondante; les cinq oligonucléotides choisis pour faire l'amplification d'une partie de cette région codante sont symbolisés par les cinq fléches.
SEQ. ID N" 2 Séquence du gène de l'HPPD de Pseudomonas fluorescens A32 et séquence déduite de la protéine corresponte.
SEQ. ID N" 3:
Comparaison des séquences en acides aminés de 1' HPPD de P. fluorescens A32 et de l'HPPD de Pseudomonas sp strain P.J. 874 (seuls les acides aminés divergents entre les deux séquences sont indiqués) ainsi que la séquence consensus.
La Figure lreprésente la cartographie du plasmide avec le fragment d'ADN génomique de 7 kb contenant le gène de l'HPPD de
P. fluorescens A32.
Liste de séquences
SEQ. ID N 1
Figure img00100001
<tb> GCNGAYYTNTAYGARAAtCCNATGG <SEP> GNYTNATGGGNTTYGARTTtATHGA <SEP> RYTNGCNWSNCCNACNCCMAAYACN <SEP> 75
<tb> A <SEP> D <SEP> L <SEP> Y <SEP> E <SEP> N <SEP> P <SEP> M <SEP> G <SEP> > <SEP> M <SEP> G <SEP> F <SEP> E <SEP> F <SEP> I <SEP> E <SEP> L <SEP> A <SEP> S <SEP> P <SEP> T <SEP> P <SEP> N <SEP> T
<tb> YTNGARCCNATH <SEP> m <SEP> GARATHATGG <SEP> GNTTYACNAARGTNGCNACNCAYMG <SEP> NWSNAARGAYGTNCAYYTMTAYMGN <SEP> 158
<tb> L <SEP> E <SEP> P <SEP> I <SEP> F <SEP> E <SEP> I <SEP> M <SEP> G <SEP> F <SEP> T <SEP> K <SEP> V <SEP> A <SEP> T <SEP> H <SEP> R <SEP> S <SEP> K <SEP> D <SEP> V <SEP> H <SEP> L <SEP> Y <SEP> R
<tb> CARGGNGCNATHAAWTNATHYTNA <SEP> AYAAYGARCCNCAYWSNGTNGCNWS <SEP> NTAYlTYG(NGCNGARCAYGGN(CN <SEP> 225
<tb> Q <SEP> G <SEP> A <SEP> I <SEP> N <SEP> L <SEP> I <SEP> L <SEP> N <SEP> N <SEP> E <SEP> P <SEP> H <SEP> S <SEP> V <SEP> A <SEP> S <SEP> Y <SEP> F <SEP> A <SEP> A <SEP> E <SEP> H <SEP> G <SEP> P
<tb> WSNGTNT6YGGNATGGCNT <SEP> YM6NG <SEP> TNAARGAYWSNCARAARGCMTAYAA <SEP> RMGNGCMYTNGARYTNGGNGCNCAR <SEP> 388
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<tb> CCNATHCAYATHGARACNGGNCCNA <SEP> TGGARYTNAAYtTNCCNGCNATHAA <SEP> RGGMATHGGNGGNGCNCCMYTNTAY <SEP> 375
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<tb> YTMATHGAYMGNtUYGGNGARGGNW <SEP> SNWSNATHTAYGAYATNGAYHYGT <SEP> NTTYYTNGARGGN6TNGAYMGNCAY <SEP> 456
<tb> K <SEP> I <SEP> D <SEP> R <SEP> F <SEP> G <SEP> E <SEP> G <SEP> S <SEP> S <SEP> I <SEP> Y <SEP> D <SEP> I <SEP> D <SEP> F <SEP> V <SEP> F <SEP> L <SEP> E <SEP> C <SEP> V <SEP> D <SEP> R <SEP> H
<tb> CCNGTNGGNGCNGGMYTMAARATHA <SEP> THGAtCAYYTNACNCAtAAYGTNTA <SEP> YMGN66NMGNAT6GCNTAYTGGGCN <SEP> 5t5
<tb> P <SEP> V <SEP> G <SEP> A <SEP> G <SEP> L <SEP> K <SEP> I <SEP> I <SEP> D <SEP> H <SEP> L <SEP> T <SEP> H <SEP> N <SEP> V <SEP> Y <SEP> R <SEP> G <SEP> R <SEP> M <SEP> A <SEP> Y <SEP> W <SEP> A
<tb> AAYTTYTAYGARAARYTNTTYAAYT <SEP> TY9GNGARATHUGNTAYTTYGAYAT <SEP> HAARGGNGARTAYACNGGNYTMACN
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<tb> WSNAARGCNATGACNGCNCCNGAYG <SEP> GNATGATHMGNATHCCNYTNAAYGA <SEP> RGARWSNwSMAARGGNGCNGGNCAR <SEP> 675
<tb> S <SEP> K <SEP> A <SEP> M <SEP> T <SEP> A <SEP> P <SEP> D <SEP> G <SEP> u <SEP> I <SEP> R <SEP> I <SEP> P <SEP> L <SEP> N <SEP> E <SEP> E <SEP> S <SEP> S <SEP> K <SEP> G <SEP> A <SEP> 6 <SEP> Q
<tb> ATHGARGARTTYYTNAT6CARTTYA <SEP> AYGGNGARGGNATHCARCAYGTNGC <SEP> NmYTwWSNGAYGAYYTNATHAAR <SEP> 75e
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<tb> T <SEP> W <SEP> D <SEP> H <SEP> L <SEP> K <SEP> S <SEP> I <SEP> G <SEP> M <SEP> R <SEP> F <SEP> U <SEP> T <SEP> A <SEP> P <SEP> P <SEP> D <SEP> T <SEP> Y <SEP> Y <SEP> E <SEP> M <SEP> L <SEP> E
<tb> GGNMGNYTNCCNAAYCAYGGNGARC <SEP> CNGTNGGNGARYTNCARGCNMGNGG <SEP> NATHYTNYTNGAYGGNWSNWSNGAR <SEP> 988
<tb> GR <SEP> L <SEP> PNH <SEP> G <SEP> E <SEP> P <SEP> V <SEP> G <SEP> ELQA <SEP> RG <SEP> IL <SEP> L <SEP> DG <SEP> S <SEP> SE
<tb> WSNGGNGAYAARMGNYTNYTNYTNC <SEP> ARATHTTYWSNGARACNYTNAT6GG <SEP> NCCNGTN <SEP> m <SEP> TTYGARTTYATHCAR <SEP> 975
<tb> S <SEP> G <SEP> D <SEP> K <SEP> R <SEP> L <SEP> L <SEP> L <SEP> Q <SEP> I <SEP> F <SEP> S <SEP> E <SEP> T <SEP> L <SEP> M <SEP> G <SEP> P <SEP> V <SEP> F <SEP> F <SEP> E <SEP> F <SEP> I <SEP> Q
<tb> MGNAARGGNGAYGAYGGNTtYGGNG <SEP> ARG6NAAYTTYAARGCNYTNTTYGA <SEP> RwSNATHGARMGNGAYCARGGN <SEP> les
<tb> R <SEP> K <SEP> 6 <SEP> D <SEP> D <SEP> G <SEP> F <SEP> G <SEP> E <SEP> 6 <SEP> N <SEP> F <SEP> K <SEP> A <SEP> L <SEP> F <SEP> E <SEP> S <SEP> I <SEP> E <SEP> R <SEP> D <SEP> Q <SEP> V <SEP> R
<tb> MGNGGNGTNYTNWSNACNGAY <SEP> 171
<tb> RGV <SEP> LSTD
<tb>
SEQ.ID N 2
ATGGCAGATCTATACGAAAACCCAA TGGGCCTGATGGGCTTTGAATTCAT CGAATTCGCGTCGCCGACGCCGGGT 75
M A D L Y E N P M G L M G F E F I E F A S P T P G
ACCCTGGAGCCGATCTTCGAGATCA TGGGCTTCACCAAAGTCGCGACCCA CCGTTCCAAGAACGTGCACCTGTAC 150
T L E P I F E I M G F T K V A T H R S K N V H L Y
CGCCAGGGCGAGATCAACCTGATCC TCAACAACGAGCCCAACAGCATCGC CTCCTACTTTGCGGCCGAACACGGC 225
R Q G E I N L I L N N E P N S I A S Y F A A E H G
CCGTCGGTGTGCGGCATGGCGTTCC GCGTGAAGGACTCGCAAAAGGCCTA CAACCGCGCCCTGGAACTCGGCGCC 3ee
P S V C G M A F R V K D S Q K A Y N R A L E L G A
CAGCCGATCCATATTGACACCGGGC CGATGGAATTGAACCTGCCGGCGAT CAAGGGCATCGGCGGCGCGCCGTTG 375 Q P I H I D T G P M E L N L P A I K G I G G A P L
TACCTGATCGACCGTTTCGGCGAAG GCAGCTCGATCTACGACATCGACTT CGTGTACCTCGAAGGTGTGGAGCGC 450
Y L I D R F G E G S S I Y D I D F V Y L E G V E R
AATCCGGTCGGTGCAGGTCTCAAAG TCATCGACCACCTGACCCACAACGT CTATCGCGGCCGCATGGTCTACTGG 525
N P V G A G L K V I D H L T H N V Y R G R M V Y W
GCCAACTTCTACGAGAAATTGTTCA ACTTCCGTGAAGCGCGTTACTTCGA TATCAAGGGCGAGTACACCGGCCTG 600
A N F Y E K L F N F R E A R Y F D I K G E Y T G L
ACTTCCAAGGCCATGAGTGCGCCGG ACGGCATGATCCGCATCCCGCTGAA CGAAGAGTCGTCCAAGGGCGCGGGG 675
T S K A M S A P D G M I R I P L N E E S S K G A G
CAGATCGAAGAGTTCCTGATGCAGT TCAACGGCGAAGGCATCCAGCACGT GGCGTTCCTCACCGACGACCTGGTC 75e
Q I E E F L M Q F N G E G I Q H V A F L T D D L V
AAGACCTGGGACGCGTTGAAGAAAA TCGGCATGCGCTTCATGACCGCGCC GCCAGACACTTATTACGAAATGCTC 825
K T W D A L K K I G M R F M T A P P D T Y Y E M L
GAAGGCCGCCTGCCTGACCACGGCG AGCCGGTGGATCAACTGCAGGCACG CGGTATCCTGCTGGACGGATCTTCC 900
E G R L P D H G E P V D Q L Q A R G I L L D G S S
GTGGAAGGCGACAAACGCCTGCTGC TGCAGATCTTCTCGGAAACCCTGAT GGGCCCGGTGTTCTTCGAATTCATC 975
V E G D K R L L L Q I F S E T L M G P V F F E F I
CAGCGCAAGGGCGACGATGGGTTTG GCGAGGGCAACTTCAAGGCGCTGTT CGAGTCCATCGAACGTGACCAGGTG 1050
Q R K G D D G F G E G N F K A L F E S I E R D Q V
CGTCGTGGTGTATTGACCGCCGATT AA 177 RRGV LTAD
SEQ. ID N 3
Consensus .ADLYENPMG LMGFEFIE.A SPTP.TLEPI FEIMGFTKVA THRSK.VHLY 50
P. fluorescens M......... ........F. ....G..... .......... .....N.... 50
Pseudomonas sp. -......... ........L. ....N..... .......... .....D.... 49
Consensus RQG.INLILN NEP.S.ASYF AAEHGPSVCG MAFRVKDSQK AY.RALELGA 100
P. fluorescens ...E...... ...N.I.... .......... .......... ..N....... 100
Pseudomonas sp. ...A...... ...H.V.... .......... .......... ..K....... 99
Consensus QPIHI.TGPM ELNLPAIKGI GGAPLYLIDR FGEGSSIYDI DFV.LEGV.R 158
P. fluorescens .....D.... .................... .......... ...Y....E. 150
Pseudomonas sp. .....E.... .......... .......... .......... ...F....D. 149
Consensus .PVGAGLK.I DHLTHNVYRG RM.YWANFYE KLFNFRE.RY FDIKGEYTGL 200
P. fluorescens N.......V. .......... ..V....... .......A.. .......... 200
Pseudomonas sp. H.......I. .......... ..A....... .......I.. .......... 199
Consensus TSKAM.APDG MIRIPLNEES SKGAGQIEEF LMQFNGEGIQ HVAFL.DDL. 250
P. fluorescens .....S.... .......... .......... .......... .....T...V 250
Pseudomonas sp. .....T.... .......... .......... .......... .....S...I 249
Consensus KTWD.LK.IG MRFMTAPPDT YYEMLEGRLP .HGEPV..LQ ARGILLDGSS 300
P. fluorescens ....A..K.. .......... .......... D.....DQ.. .......... 300
Pseudomonas sp. ....H..S.. .......... .......... N.....GE.. .......... 299
Consensus . . GDKRLLLQ IFSETLMGPV FFEFIQRKGD DGFGEGNFKA LFESIERDQV 350
P. fluorescens VE........ .......... .......... .......... .......... 350
Pseudomonas sp. ES........ .......... .......... .......... .......... 349
Consensus RRGVL..D 358
P. fluorescens .....TA. 358
Pseudomonas sp. .....ST. 357
Figure img00130001
<tb> <SEP> Kpnl/Hlndlll
<tb> <SEP> EcoRi
<tb> <SEP> fi0 <SEP> BamHl
<tb> <SEP> a <SEP> 11fl <SEP> < I <SEP> Nco(
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<tb> <SEP> EcoRV
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<tb> <SEP> .EcoRV
<tb> <SEP> Nicol,
<tb> <SEP> EcoRi
<tb> <SEP> / <SEP> \ <SEP> sst
<tb> <SEP> Reglon <SEP> codant <SEP> du <SEP> gène <SEP> de
<tb>
Fig. 1

Claims (21)

    Revendications 1. Gène caractérisé en ce qu'il exprime l'hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase (HPPD).
  1. 2. Gène selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est d'origine bactérienne 3. Gène selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est issu de Pseudomonas sp.
  2. 4. Gène selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il est issu de Pseudomonas
    fluorescens.
  3. 5. Gène selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est d'origine végétale 6. Procédé d'isolement du gène selon la revendication 1, caractérisé en ce que: -on choisit, comme amorces, quelques oligonucléotides issus de la séquence en acides
    aminés d'une HPPD.
    - à partir de ces amorces, on synthétise des fragments d'amplification par PCR - on isole le gène par création et le criblage d'une banque génomique et - on clone le gène.
  4. 7. Procédé d'isolement du gène selon la revendication 6, caractérisé en ce que les amorces
    sont issus de l'HPPD d'une bactérie du genre Pseudomonas.
  5. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'HPPD est issue de
    Pseudomonas fluorescens.
  6. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'HPPD est issue de
    Pseudomonas fluorescens A32.
  7. 10. Gène chimère pour la transformation génétique des plantes comprenant, dans le sens de
    la transcription: - au moins une séquence de régulation promotrice issu d'un gène s'exprimant naturellement
    dans les plantes, - une séquence codante hétérologue, - au moins une séquence de polyadénylation, caractérisé en ce que la séquence codante est un gène qui exprime l'hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase (HPPD.
    il. Gène chimère selon la revendication 10, caractérisée en ce que la séquence de
    régulation promotrice favorise la surexpression de la séquence codante.
  8. 12. Gène chimère selon la revendication 11, caractérisé en ce que la séquence de régulation
    promotrice comprend au moins un promoteur d'histone.
  9. 13. Gène chimère selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisée en ce qu'il comprend,
    entre la séquence de régulation promotrice et la séquence codante, un peptide de transit.
  10. 14. Gène chimère selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'il comprend, entre la
    séquence de régulation promotrice et la séquence codante, un peptide de transit
    optimisé comprenant, dans le sens de la transcription, une séquence codant pour un
    peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale,
    une partie de séquence de la partie mature N terminale d'un gène végétal codant pour
    une enzyme à localisation plastidiale, puis une séquence codant pour un second peptide
    de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale.
  11. 15. Gène chimère selon l'une des revendications 10 à 14, caractérisée en ce qu'il comprend,
    entre la séquence de régulation promotrice et la séquence codante, une séquence de
    activateur de trancription "enhancer" 16. Vecteur utilisable pour la transformation génétique des plantes, caractérisé en ce qu'il
    comprend un gène chimère selon l'une des revendications 10 à 15.
  12. 17. Cellule végétale, caractérisée en ce qu'elle comprend un gène chimère selon l'une des
    revendications 10 à 15.
  13. 18. Plante, caractérisée en ce qu'elle est régénérée à partir de cellules selon la
    revendication 17.
  14. 19. Procédé de transformation de plantes pour les rendre resistantes aux inhibiteurs de
    l'HPPD, caractérisé en ce qu'on introduit dans la cellule végétale un gène selon l'une
    des revendications 1 à 5.
  15. 20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que le transfert est effectué avec
    Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes 21. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que le transfert est effectué par
    apport par bombardement à l'aide de particules chargées de l'ADN.
  16. 22. Utilisation d'un gène selon l'une des revendications 1 à 5 comme marqueur de
    sélection.
  17. 23. Procédé de traitement herbicide sélectif de plantes, caractérisé en ce qu'on applique un
    inhibiteur du gène 1'HPPD à une plante selon la revendication 22.
  18. 24. Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que l'inhibiteur du gène 1'HPPD
    est un isoxazole.
  19. 25. Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que l'isoxazole est le 4-[4-CF3-2
    (méthylsulfoyl)benzoyl]-5-cyclopropyl isoxazole.
  20. 26. Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que l'inhibiteur du gène 1'HPPD
    est une tricétone.
  21. 27. Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce que l'inhibiteur du gène 1'HPPD
    est la sulcotrione.
FR9513570A 1995-06-02 1995-11-10 Gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant ce gene resistantes aux herbicides Expired - Lifetime FR2734841B1 (fr)

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