FR2718152A1 - Procédé de sélection de cellules eucaryotes transformées et cellules obtenues. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé d'obtention de cellules ou amas de cellules eucaryotes, animales ou végétales, résistantes à la streptothricine ou à ses analogues comprenant les étapes suivantes: - transformation desdites cellules eucaryotes par un plasmide contenant une séquence d'ADN exogène codant pour une streptothricine acétyl transférase (SAT) comportant la séquence d'ADN codant pour ladite streptothricine acétyl transférase (ADN-SAT) située en orientation convenable et une ou plusieurs séquences d'ADN codant pour les éléments contrôlant l'expression de ladite séquence d'ADN-SAT dans lesdites cellules, et - sélection des cellules résistantes à la streptothricine ou à ses analogues après transformation.

Description

La présente invention concerne, notamment, un nouveau procédé pour sélectionner des cellules eucaryotes, particulièrement animales ou végétales transformées.

Cette invention concerne l'utilisation de gènes codant pour des protéines capables d'inactiver les streptothricines dans la sélection de tissus végétaux transformés, en particulier des streptothricine-acétyle transférases.

Les streptothricines isolées de Streptomyces lavendulae sont des agents antimicrobiens. Elles sont constituées de trois régions représentées par de la gulosamine, de la streptolidine et par une chaîne peptidique de B-lysines. La longueur de cette chaîne est variable de 1 à 7 résidus et caractérise le type de streptothricine A, B, C, etc. (Khoklov et
Shutova, 1972; Carter et al., 1952). Cette classe d'antibiotique possède à la fois une action bactériostatique et bactéricide, aussi bien sur les bactéries grampositives que gram-négatives, en particulier les entérobactéries. Ce type d'antibiotique se fixe sur la sous unité 30s des ribosomes entraînant une inhibition des synthèses protéiques.

Suite à l'utilisation de la streptothricine dans l'alimentation du bétail, il a été isolé des souches d'Escherichia coli résistantes à cet antibiotique. I1 a été démontré que dans la plupart des cas, cette résistance à la streptothricine était portée par des plasmides de différents groupes de compatibilité, qui codaient pour une acétyl-transférase spécifique appelée streptothricine acétyle transférase (SAT). La streptothricine acétylée sur le groupement amine des résidus lysines est inactive.

Deux gènes satl et sat2 ont été caractérisés (Tietze et al., 1988).

Ils proviennent respectivement des transposons Tn1825 et Tn1826 apparentés au transposon Tn7. La séquence nucléotidique de ces deux gènes a été déterminée (Heim et al., 1989; Tietze et Brevet, 1990). Un très haut degré d'homologie est trouvé entre ces deux séquences.

Dans le cadre de la présente invention, on a pu mettre en évidence l'existence d'un gène sat3 qui code aussi pour une streptothricine acétyle transférase mais ne présente sensiblement pas d'homologie avec les gènes satl ou sat2.

Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé d'obtention de cellules eucaryotes, isolées ou non, résistantes à la streptothricine ou à ses analogues comprenant les étapes suivantes - transformation desdites cellules eucaryotes à l'aide d'un vecteur
d'expression d'une séquence d'ADN codant pour une streptothricine
acétyl transférase (SAT) comportant la séquence d'ADN codant pour
ladite streptothricine acétyl transférase (ADN-SAT) située en
orientation convenable et une ou plusieurs séquences d'ADN codant
pour les éléments contrôlant l'expression de ladite séquence d'ADN
SAT dans lesdites cellules, et - sélection des cellules résistantes à la streptothricine ou à ses
analogues après transformation.

Par "vecteur d'expression", on entend désigner tout système permettant l'incorporation et l'expression de la séquence d'ADN codant pour un SAT, il pourra s'agir de système autoréplicatif, type plasmide, ou intégratif, type virus ou ADN nu.

Parmi les techniques de transformation utilisables pour la mise en oeuvre de la présente invention, on utilisera avantageusement, pour les cellules végétales, la technique dite "d'Agro-infection" utilisant une bactérie Agrobacterium rhizogenes possédant un vecteur binaire ou un vecteur de co-intégration, ou la technique dite de bombardement d'ADN" ou "biolistique", et pour les cellules animales, on utilisera avantageusement des séquences d'un rétrovirus.

Il est important de préciser que parmi les séquences codant pour la streptothricine acétyl transférase on préfèrera tout particulièrement les séquences choisies parmi a) les gènes satl, sat2 et sat3, b) les séquences d'ADN qui s'hybrident avec lesdits gènes et qui codent
pour une protéine ayant une activité SAT, et c) les séquences d'ADN qui sont obtenues par dégénérescence à partir
des séquences a) et b) et qui codent pour une protéine ayant une
activité SAT.

La séquence de sat3 est représentée à la figure 1,
La séquence de satl figure notamment dans Heim et al, 1989,
La séquence de sat2 figure notamment dans Tietze et Brevet, 1990.

Les séquences ADN-SAT sont placées sous le contrôle d'au moins un promoteur fonctionnel dans la cellule transformée, l'utilisation de tels promoteurs feront l'objet d'exemples, il s'agit là néanmoins d'éléments qui sont connus par l'homme de métier pour les cellules eucaryotes, qu'il s'agisse de cellules animales ou de cellules de végétaux
On peut également prévoir des processus mettant en oeuvre des transposons.

La présente invention est, en particulier, destinée à être appliquée à des cellules végétales, c'est pourquoi les vecteurs mis en oeuvre sont plus particulièrement des vecteurs dérivés d'Agrobactenum, notamment dérivés d'A. tumefaciens ou d'A. rhizogenes , s'agissant là également d'une technologie connue par l'homme de métier.

La présente invention concerne également l'utilisation des gènes codant pour ces streptothricines acétyl transférases à titre de marqueurs sélectifs de cellules eucaryotes transformées, isolées ou non, différenciées ou non, se présentant, par exemple, sous forme de suspension cellulaire, d'agrégats cellulaires, d'embryons, de tissus ou de plantes.

Toutefois, il est bien entendu que l'expression de la streptothricine acétyl transférase n'est qu'un élément de sélection, que dans la plupart des cas la construction génétique utilisée pour la transformation comportera, en outre, un ensemble de séquences d'ADN permettant à la cellule transformée et aux tissus, organes ou plantes transformés qui en seraient issus, d'exprimer un caractère d'intérêt, notamment, dans le cas des cellules végétales, un caractère d'intérêt agronomique.

Il n'est, bien entendu, pas possible de faire une liste exhaustive des caractères d'intérêt qui peuvent être portés par les vecteurs, on citera simplement la résistance à certains insectes dans la lutte contre les rongeurs de culture, la résistance à certains herbicides afin de faciliter par exemple le désherbage de certaines cultures, également la résistance à certains types de maladie tels que les maladies fongiques, ou conditions climatiques, on pourra également citer des caractères tels que l'augmentation de la teneur dans certains principes actifs ou produits du métabolisme secondaire, ou bien la possibilité pour certaines plantes de pouvoir se passer de certains apports comme par exemple les apports azotés, ou encore l'amélioration des propriétés technologiques ou alimentaires de certaines plantes.

La présente invention concerne également les cellules obtenues par le procédé selon l'invention et les cultures de tissus ou les plantes régénérées à partir de ces cellules.

La présente invention concerne également une séquence d'ADN codant pour la streptothricine acétyl transférase (ADN-SAT) choisie parmi: a) la séquence sat3 indiquée à la figure 1, b) les séquences d'ADN qui s'hybrident avec ledit gène et codent pour
une protéine ayant une activité SAT, c) les séquences d'ADN qui sont obtenues par dégénérescence à partir
des séquences a) et b) et qui codent pour une protéine ayant une
activité SAT.

Il faut remarquer que la comparaison de cette séquence sat3 avec celle de satl et sa t2 ne montre aucune homologie. Ceci confirme le résultat de tests précédemment réalisés ne mettant en évidence aucune hybridation entre la séquence sat3 d'une part et les séquences satl et sat2 d'autre part. Le gène sat3 code pour une protéine de 180 acides aminés ayant un poids moléculaire de 20 335 daltons. L'activité acétyl-transférase de ces trois gènes est spécifique de la streptothricine et est inactive sur d'autres antibiotiques comme le chloramphénicol, la gentamycine, la kanamycine et les néomycines (Tschape et al., 1984).

La présente invention concerne également les vecteurs de clonage et d'expression des séquences d'ADN-SAT ainsi que les vecteurs plasmidiques, les vecteurs d'intégration, les cellules eucaryotes transformées, isolées ou non, différenciées ou non, et les plantes, obtenus par la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention.

D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples ci-après.

Un des intérêts des streptothricines est qu'un grand nombre de cellules procaryotes et eucaryotes y sont sensibles.

Avant de tester l'efficacité de la construction précédemment décrite, la sensibilité de différents organismes vis à vis de la streptothricine a été recherchée. A titre d'exemple, les concentrations inhibitrices optimales trouvées pour différentes cellules sont données dans le tableau 1.

On appellera concentration inhibitrice optimale, la concentration minimum à partir de laquelle la division cellulaire est complètement abolie.

L'expérimentateur averti saura que cette concentration optimale varie selon les cellules concernées et le mode de culture, et qu'elle devra être déterminée avant de procéder à la transformation de nouvelles cellules.

Tableau 1: Concentration inhibitrice optimale de la streptothricine oour différentes cellules et tissus

<tb> <SEP> Cellules <SEP> Concentration <SEP> en <SEP> mg/l
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 100
<tb> Agrobacterium <SEP> tum <SEP> efaciens <SEP> 100
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisia <SEP> e <SEP> 100
<tb> <SEP> Schizosaccharomyces <SEP> pombe <SEP> 50
<tb> <SEP> Nicotiana <SEP> tabacum <SEP> (disques <SEP> foliaires) <SEP> 100
<tb> <SEP> Daucus <SEP> carota <SEP> ("hairy <SEP> root" <SEP> 100
<tb> <SEP> Lotus <SEP> corniculatus <SEP> (germination <SEP> de <SEP> graines <SEP> 100
<tb> Arabidopsis <SEP> thaliana <SEP> (culture <SEP> de <SEP> racine <SEP> in <SEP> 25
<tb> vitro)
<tb> Vigne <SEP> (culture <SEP> de <SEP> cellules <SEP> en <SEP> suspension) <SEP> 10
<tb> Cellules <SEP> mammaires <SEP> de <SEP> souris <SEP> HC1 <SEP> l(culture <SEP> in <SEP> 100
<tb> vitro)
<tb> Cellules <SEP> d'ovaire <SEP> de <SEP> hamster <SEP> CHO <SEP> (culture <SEP> in <SEP> 100
<tb> vitro)
<tb>
Les expériences qui suivent sont fournies à titre d'exemple pour mieux comprendre l'utilisation de l'invention présente. Il doit être compris que ces exemples sont fournis pour illustrer l'intérêt d'un tel marqueur de sélection, mais ne peuvent en aucun cas être considérés comme seuls cas possibles de l'utilisation de ce marqueur.

Sur les figures annexées, - la figure 1 représente un fragment d'ADN contenant le gène sat3, - la figure 2 représente le fragment BgllI-BglII de la construction
pJBJ 106 utilisée pour les transformations décrites dans les exemples
ci-après.

Exemple 1
Première expérience
La construction réunissant les éléments essentiels pour tester l'utilisation du gène sat3 dans la sélection des plantes transgéniques a été réalisée dans le vecteur pK18 (Pridmore, 1987). Dans ce vecteur différents fragments d'ADN ont été clonés séquentiellement. La construction finale porte le nom de pJBJ106. Seul le fragment BgnI-BgflI (4,7 kb), essentiel dans cette étude, est représenté (Fig. 2). En partant de la gauche vers la droite, entre les sites Bglll et Clan, se trouve un fragment BgllI-DraI qui couvre la partie gauche du T-DNA de pRi2659 (plasmide à cucumopine d'A. rhizogenes
NCPPB2659 (Brevet et al. , 1988)). Ce fragment issu de la digestion du plasmide pNlOAA (Brevet et al., 1988) contient la bordure gauche du T-DNA de pRi2659. Les sites Clal, HindIII et EcoRV proviennent de la séquence à clonage multiple (MCS) du plasmide Bluescript KS (Stratagene). La séquence située entre XmnI et Sstl contient la partie terminateur non traduite de la nopaline synthase (nos-ter) isolée sous forme de fragment EcoRI-SstI du plasmide pBil21 (Clontech). Le site EcoRI qui a servi de site de clonage a ensuite été digéré et rempli par l'enzyme Klenow pour donner naissance au site Xmnl. Le fragment Kpnl-BamHI contient la séquence codante du gène sat3. Ce fragment provient du plasmide pJBsat3 construit en clonant un fragment Sspl-HindlI issu du plasmide pIE928 (Tietze et al., 1989) au site unique SmaI de pK18 (Pridmore, 1987). Dans la construction pJBJ106, entre le site BamHI et le Spel est contenue la séquence du promoteur 35S du CAMV extrait du plasmide pBil21 (Clontech) à la suite d'une digestion Hindll-
BamHI. Le segment Spel-EcoRI, qui fait suite, consiste en la partie droite du
T-DNA du plasmide pRi2659 issu du plasmide pMOA9 (Brevet et al., 1988). Ce segment contient le gène entier de la synthèse de la cucumopine, fonctionnel, ainsi que la bordure droite du T-DNA avec ses séquences répétées (Hansen et al., 1992). La portion comprise entre EcoRI et BgllI est une fraction du plasmide vecteur pK18. L'ensemble du fragment compris entre les deux sites extrêmes Bglll à ensuite été ligaturé au segment BgllI-
BgnI de pBinl9 (Bevan, 1981) qui contient l'origine de réplication de ce plasmide à large spectre d'hôte dérivant du plasmide RK2 et qui possède comme marqueur de sélection bactérienne le gène de résistance à la kanamycine. Cette dernière construction porte le nom de pJBJ302.

Le plasmide pJBJ302 a été introduit dans une souche d'A. rhizogenes possédant le plasmide à mannopine pRi8196 (Chilton et al., 1982) par électroporation et les cellules transformées ont été sélectionnées sur milieu riche gélosé additionné de kanamycine (Km) à 100 mg/l. Les transformants ont été repiqués sur milieu synthétique gélosé additionné de mannopine comme seule source de carbone et de kanamycine (100 mg/l).

Un clone a été sélectionné et son contenu plasmidique a été vérifié par électrophorèse en gel d'agarose, après une mini-extraction (sur 5 ml de culture d'une nuit à 28 en milieu riche supplémenté en Km) selon la méthode Kado (Kado et Liu, 1981) mais réalisée à 37 pour minimiser des cassures du plasmide Ri. Ce plasmide pRi8196 sert à la fois comme donneur de T-DNA induisant la formation de racines de type hairy root", et fournit les fonctions VIRs nécessaires au transfert du T-DNA construit porté par le vecteur binaire. Une bactérie portant ces deux plasmides est capable, lorsqu'elle est inoculée à une plante, de provoquer la différenciation de racines doublement transformées, contenant à la fois le T-DNA de hairy root" et celui d'intérêt porté par le second plasmide. Ce clone a servi à inoculer des disques de carotte (Petit et al., 1983). Après deux à trois semaines des racines de type "hairy root" apparaissent. Elles ont été excisées du disque de carotte et mises en culture à 25 à l'obscurité sur du milieu MS saccharose (à 30 g/l) (Murashige et Skoog, 1962) gélosé ne contenant pas d'hormone de croissance mais additionné de céphalosporine (250 mg/l) pour inhiber toute croissance bactérienne. Sur ce milieu, les racines ont une croissance de 2 à 5 mm en 24 heures et elles présentent de nombreuses ramifications. On sait que ces racines constituent des clones cellulaires (David et al., 1984). Des racines (1,5 cm environ de longueur) ont été transplantées sur milieu MS saccharose solide additionné ou non de streptothricine (100 mg/l). Les racines ne contenant que le T-DNA de pRi8196 ont montré une faible croissance en 24 heures et se sont arrêtées de pousser. Replacées sur du milieu dépourvu de streptothricine leur croissance n'a pas repris, montrant l'effet irréversible de l'antibiotique.

Par contre, certaines racines ont montré une croissance importante aussi bien sur milieu additionné de streptothricine que dépourvu de cet antibiotique. Ces racines ont été considérées comme ayant intégré la construction contenant le gène sat3. Pratiquement 70 % à 80 % des racines se sont révélées capables de pousser en présence de streptothricine. Ce résultat est en bon accord avec des observations précédemment décrites (Petit et al., 1986).

Pour vérifier que les racines poussant en présence de streptothricine contenaient bien la construction, des analyses, par électrophorèse sur papier, du contenu en opines des racines, ont été réalisées (Petit et al., 1986). Les racines incapables de pousser sur la streptothricine ne contenaient que la mannopine, marqueur du T-DNA de pRi8106, alors que toutes les racines capables de pousser sur streptothricine (20 racines indépendantes analysées) contenaient à la fois de la mannopine et de la cucumopine, cette dernière étant un marqueur contenu dans la construction. Ce résultat indique que les racines résistantes à la streptothricine ont intégré la construction. Pour confirmer que ces racines synthétisant de la cucumopine possédaient bien le gène sat3, une analyse d'ADN génomique extrait des racines a été entreprise par la technique de
PCR ("Polymerase Chain Reaction"). Deux oligonucléotides ont été synthétisés. L'un de 20 bases possède la séquence 5' TCAATGCGTGAATTGGTCAT-3' située à la position 233-252 sur la séquence, l'autre de 18 bases posséde la séquence 5'-GGATGCAGGCCACGATAC-3' située à la position 720-703 sur la séquence (Fig. 1). L'utilisation de ces oligonucléotides dans une réaction PCR permet d'amplifier une séquence d'ADN de 488 paires de base couvrant la presque totalité du gène sat3 qui peut être mis en évidence après une électrophorèse, du mélange soumis à la réaction de PCR, sur gel d'agarose. L'ADN génomique de racine a été extrait en broyant 1 cm de racine dans 0,1 ml d'eau distillée stérile dans des tubes de type Eppendorf et les tubes ont été incubés 5 minutes dans un bain marie bouillant. Après centrifugation 1 sl de surnageant a été ajouté à 50 ctl du mélange réactionnel classique pour PCR L'ADN recherché a été amplifié au cours de 30 cycles (1 cycle comprend les incubations suivantes : 1 min. à 94 , 1 min à 55" et 1,5 min à 72"). Les résultats ont montré que seuls les ADNs génomiques extraits de racines synthétisant de la cucumopine, permettaient d'obtenir l'amplification d'un fragment de 488 paires de base confirmant la présence du gène sat3.

En conclusion, les racines capables de pousser sur 100 mg/l de streptothricine se sont révélées être des racines réellement transformées par la construction.

Exemple 2
Deuxième Expérience
Le plasmide pJBJ3O2 a été introduit dans la souche d'A. tumefaciens LBAL contenant le plasmide pA14404 (Ooms et al., 1982). Ce plasmide désarmé fournit les fonctions VIRs nécessaires au transfert de tout
T-DNA. les bactéries transformées ont été sélectionnées sur milieu riche gélosé additionné de kanamycine. Les clones obtenus ont été analysés comme dans la première expérience et un clone sélectionné a été utilisé pour inoculer des disques foliaires de Nicotiana ta bac um va.. Xanthi selon la méthode de Horsch et al., 1985. 24 heures après l'inoculation, les disques ont été transférés sur du milieu solide MS additionné de 6-benzyl-aminopurine (BAP) (1 mg/l), d'acide acétique-naphtalène (NAA) (0,1 mg/l), de céphalosporine (250 mg/l) et de streptothricine (100 mg/l) pour obtenir des plantules issues des cellules transformées. Après quatre semaines des plantules sont apparues. Elles ont été transplantées sur milieu MS contenant de la streptothricine. Leurs racines se sont développées. Après trois semaines, les plantes ont été bouturées individuellement sur du milieu MS solide en pot Magenta pour obtenir un développement des plantes. Un disque de feuille d'un centimètre de diamètre a été prélevé sur chaque plante afin de rechercher son contenu en cucumopine par électrophorèse (Petit et al., 1986). Sur 50 plantes analysées, 46 ont nettement montré la présence de cucumopine, ce qui représente un pourcentage de 92 %. Les quatre plantes apparemment négatives peuvent représenter des faux positifs ou des plantes dans lesquelles la cucumopine synthase est trop faiblement exprimée. De toute façon, une proportion de 10 % de plantes faussement positives serait parfaitement acceptable et refléterait ce qui est souvent observé avec la plupart des marqueurs de sélection utilisés pour sélectionner des tissus transformés. Pour confirmer que les plantes contenant de la cucumopine avaient également intégré le gène sat3, leur
ADN génomique a été extrait (Edwards et al., 1991) et analysé par la technique de PCR comme dans la première expérience. L'ADN extrait de tabac normal ne donne aucun signal alors qu'avec les ADNs extraits de plantes synthétisant de la cucumopine, il a toujours été trouvé l'amplification d'un fragment d'ADN de 488 paires de base, confirmant la présence du gène sat3.

En conclusion, la sélection de tabacs transgéniques en utilisant le marqueur de sélection sat3 s'est révélée très efficace dans au moins 90 % des cas.

Exemple 3
Troisième Expérience
La souche d'A. tumefaciens utilisée dans la seconde expérience (souche LBA4404 contenant le plasmide pJBJ302) a été utilisée pour transformer des racines d'Arabidopsis thaliana selon la méthode de
Valvekens et al., (1988) mais en utilisant de la streptothricine comme agent sélectif à la place de la kanamycine. Deux concentrations d'antibiotique, 25 mg/l et 40 mg/l, ont été testées en parallèle. Après trois semaines, les plantules vertes sont apparues et ont été transplantées sur milieu GM (Vanvekens et al., 1988) supplémenté en streptothricine (25 ou 40 mg/l) pour leur permettre de se développer individuellement. L'analyse du contenu en opine de ces plantules a été entreprise. Sur 10 plantules ayant poussé sur 25 mg/l de streptothricine, 5 ont montré la présence de cucumopine alors que 14 sur 15 plantules ayant poussé sur 40 mg/i d'antibiotique, se sont révélées contenir de la cucumopine. Ce résultat souligne l'importance d'utiliser une concentration d'antibiotique optimale pour obtenir une haute probabilité de sélectionner uniquement ou au moins majoritairement, des plantes transformées. Avec 40 mg/l de streptothricine, 93 % des plantes obtenues avaient intégré la construction. Pour vérifier que ces plantes possédaient bien le gène sat3, leur ADN génomique a été extrait et a servi de matrice dans des réactions de PCR comme dans la première expérience. L'ADN de toutes les plantes synthétisant de la cucumopine a permis d'amplifier le fragment d'ADN type du gène sat3 de 488 paires de base alors que l'ADN des plantes non transformées n'a donné aucun signal.

Ces résultats confirment qu'il est important de déterminer la concentration optimale de streptothricine pour chaque type de cellules que l'on veut transformer et qu'il est possible d'utiliser, dans ces conditions, le gène sat3 pour sélectionner des tissus transformés avec une haute fréquence.

Exemple 4
Quatrième exDérience
Des disques foliaires d'un centimètre de diamètre, découpés stérilement à l'aide d'un emporte-pièce métallique, ont été prélevés soit sur des tabacs normaux, soit sur des tabacs transformés par le gène sat3, cultivés in vitro. Ces disques ont été placés dans des boîtes de Pétri contenant du milieu MS20 gélosé supplémenté en NAA (1 g/l) pour induire la formation de racines. Un lot de boîtes de Pétri avait été additionné de streptothricine (100 mg/l). Les disques foliaires ont été incubés à 24 sous 16 heures de lumière par jour. Après quinze jours des racines sont apparues à partir des disques de tabacs normaux et transgéniques sur le milieu dépourvu de streptothricine. Par contre sur le milieu contenant l'antibiotique, seuls les disques de tabacs transgéniques ont donné naissance à des racines alors que les disques de tabacs normaux ne présentaient aucun développement cellulaire ou racinaire.

Ce résultat montre que l'expression de la résistance à la streptothricine se maintient au cours du développement de la plante et qu'il est très aisé de faire, a postériori, la distinction entre des plantes contenant le gène sat3 et celles qui en sont dépourvues.

Exemple 5
Cellules de levure et cellules de mammifères
D'autres expériences ayant pour objet de vérifier l'efficacité du gène sat3 pour la sélection de cellules transformées de la levure
Schizosaccharomyces pombe ont été entreprises, suivant un protocole classique de transformation avec la construction décrite dans la figure 2 dans laquelle le gène sat3 est placé sous le contrôle du promoteur de L'ART 355 du virus de la mosaïque du chou-fleur, dont on sait qu'il est actif dans cette levure. Ces expériences ont permis de montrer l'efficacité du gène sat3 dans Schizosaccharomyces pombe. La transformation a été réalisée en utilisant la technique de Ito et al (1983).

Pour une utilisation dans les cellules animales, le gène de résistance à la streptothricine peut être placé sous le contrôle de promoteur permettant une expression ubiquitaire comme celui des gènes précoses du cytomegalo virus humain tCMV) (utilisé dans les expériences décrites), du virus SV40 ou du virus du sarcome de Rous (RSV). 1l peut tout aussi bien être placé sous le contrôle du promoteur d'un gène ne s'exprimant que dans un type cellulaire donné. Des expériences ont été réalisées avec une construction où le gène Sat3 a été placé sous le contrôle du promoteur CMV.

Des cellules mammaires de souris HC 1 1 et des cellules d'ovaire de hamster
CHO ont été transformées avec cette construction par la technique des liposomes décrite par Felgner et al. (1987). Dans les deux cas il a été possible d'obtenir un grand nombre de clones transformés par sélection en présence de streptothricine.

Ces expériences montrent que le gène sat3 peut être utilisé pour sélectionner des cellules transformées de levures et de mammifères.

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Claims (15)

REVENDICATIONS

1. Procédé d'obtention de cellules eucaryotes résistantes à la streptothricine ou à ses analogues comprenant les étapes suivantes - transformation desdites cellules eucaryotes à l'aide d'un vecteur

d'expression d'une séquence d'ADN codant pour une streptothricine

acétyl transférase (SAT) comportant la séquence d'ADN codant pour

ladite streptothricine acétyl transférase (ADN-SAT) située en

orientation convenable et une ou plusieurs séquences d'ADN codant

pour les éléments contrôlant l'expression de ladite séquence d'ADN

SAT dans lesdites cellules, et - sélection des cellules résistantes à la streptothricine ou à ses

analogues après transformation.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence codant pour la streptothricine acétyl transférase est choisie parmi: a) les gènes satl, sat2, sat3, b) les séquences d'ADN qui s'hybrident avec lesdits gènes et qui codent

pour une protéine ayant une activité SAT, et c) les séquences d'ADN qui sont obtenues par dégénérescence à partir

des séquences a) et b) et qui codent pour une protéine ayant une

activité SAT.

3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la séquence d'ADN-SAT est placée sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel dans la cellule transformée.

4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la cellule eucaryote est une cellule végétale.

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le vecteur est dérivé d'Agrobacterium.

6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le vecteur est dérivé d'Agrobacterium tumefaciens ou d'Agrobacterium rhizogen es.

7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le vecteur comprend, en outre, un ensemble de séquences d'ADN permettant à la cellule transformée d'exprimer un caractère d'intérêt.

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le caractère d'intérêt est une fonction présentant un intérêt agronomique pour les cellules végétales.

9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le vecteur est un vecteur d'intégration.

10. Cellule eucaryote obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 9.

11. Plantes obtenues à partir de cellules selon la revendication 10.

12. Utilisation à titre de marqueur sélectif dans la transformation des tissus végétaux et des plantes subséquentes des gènes codant pour une streptothricine acétyl transférase.

13. Séquence d'ADN codant pour la streptothricine acétyl transférase (ADN-SAT) choisie parmi a) la séquence sat3 indiquée à la figure 1, b) les séquences d'ADN qui s'hybrident avec ledit gène et codent pour

une protéine ayant une activité SAT, c) les séquences d'ADN qui sont obtenues par dégénérescence à partir

des séquences a) et b) et qui codent pour une protéine ayant une

activité SAT.

14. Vecteur de clonage et d'expression d'une SAT dans une cellule eucaryote, caractérisé en ce qu'il comporte - la séquence d'ADN codant pour ladite streptothricine acétyl

transférase (ADN-SAT) située en orientation convenable et une ou

plusieurs séquences d'ADN codant pour les éléments contrôlant

l'expression de ladite séquence d'ADN-SAT dans lesdites cellules.

15. Vecteur selon la revendication 14, caractérisé en ce que les éléments contrôlant l'expression sont des éléments de l'organisme hote.