FR2712603A1 - Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique. - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne des adénovirus recombinants comportant une séquence d'ADN codant pour la thymidine kinase sous le controle de signaux d'expression hétérologues, leur préparation, et leur utilisation pour le traitement et/ou la prévention des cancers.
Description
VIRUS RECOMBINANTS, PREPARATION ET UTILISATION
EN THERAPIE GENIQUE
La présente invention concerne des vecteurs recombinants d'origine virale et leur utilisation pour le traitement des cancers. Plus particulièrement, elle concerne des adénovirus recombinants comportant une séquence d'ADN codant pour la thymidine kinase sous le contrôle de signaux d'expression hétérologues. L'inventicn concerne également la préparation de ces vecteurs, les compositions iarmaoeques les contenant et leur utilisation en thérapie génique.
EN THERAPIE GENIQUE
La présente invention concerne des vecteurs recombinants d'origine virale et leur utilisation pour le traitement des cancers. Plus particulièrement, elle concerne des adénovirus recombinants comportant une séquence d'ADN codant pour la thymidine kinase sous le contrôle de signaux d'expression hétérologues. L'inventicn concerne également la préparation de ces vecteurs, les compositions iarmaoeques les contenant et leur utilisation en thérapie génique.
La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une anomalie (mutation, expression aberrante, etc) par introduction d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette information génétique peut être introduite soit in vitro dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans l'organisme, soit directement in vivo dans le tissu approprié. Différerrtes techniques ont été décrites pour l'introduction de cette information génétique, parti lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des complexes dlADN et de DEAE-dextan (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et at,
PNAS 84 (1987) 7413), l'emploi de liposomes (Fraley et al., J.BioLChem. 255 (1980) 10431), etc. Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative prometteuse à ces techniques physiques de transfection. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires. En particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS, etc), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovirus.
PNAS 84 (1987) 7413), l'emploi de liposomes (Fraley et al., J.BioLChem. 255 (1980) 10431), etc. Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative prometteuse à ces techniques physiques de transfection. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires. En particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS, etc), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovirus.
De nombreuses applications de la thérapie génique sont en cours d'étude, telles que les maladies génétiques (myopathie, mucoviscidose, SCID, etc), les pathologies du système nerveux central (alzheimer, Parkinson, etc), les maladies cardiovasculaires (hémophilie, athérosclérose), le SIDA ou les cancers.
La présente invention concerne un adénovirus recombinant capable d'induire, en présence d'agents thérapeutiques, la mort sélective des cellules infectées. Les adénovirus de l'invention peuvent être utilisés pour la destruction sélective de cellules cancerees, infectées par des virus (HIV, hépatite), etc. Plus particulièrement, elle concerne des adénovirus recombinants comprenant une séquence d'ADN codant pour la thymidine kinase sous le contrôle.
La thymidine kinase du virus de l'herpès simplex est capable de phosphoryler les analogues de nucléosides tels que l'acyclovir et le ganciclovir. Ces molécules modifiées peuvent être incorporées dans une chaine d'ADN en cours d'élongabon, ce qui a pour conséquence l'arrêt de la synthèse d'ADN, entrainant la mort de la cellule (Nishiyama et al., J. Gen. Virol. 45 (1979)227; F.L. Moolten, Cancer Res. 46 (1986) 5276). Cette stratégie permet ainsi d'éliminer spéafiquement les cellules exprimant je gène suicide. De plus, la synthèse d'ADN étant la cible de la toxicité, seules les cellules en cours de division sont affectées.
L'utiiisation thérapeutique du gène de la thymidine kinase a d4jà été envisagée dans l'art antérieur. Ainsi, la demande WO 93,02556 décrit l'utilisation de cellules prélevées dans la tumeur, modifiées génétiquement ex vivo par introduction du gène de la thymidine kinase, puis réacirnintrées au patient Toutefois, cette approche impose des étapes de chirurgie, et de plus, la stabilité du gène toxique dans la cellule transformée ex vivo n'est pas démontrée. De même, la demande WO 93,04167 décrit le traitement de certaines tumeurs par implantation au voisinage des tumeurs, de cellules productrices de rétrovirus contenant le gène TK. Les cellules productrices greffées sont sensées produire des rétrovirus capables d'infecter les cellules tumorales et de les sensibiliser au ganciclovir. Toutefois, cette technique io3plique l'implantation de cellules productrices de rétrovirus, ce qui (1) nécessite une étape de chirurgie lourde et délicate, (2) pose des problèmes d'immunogénicité liés à la présence de ces cellules, (3) pose des problèmes d'effets secondaires liés à d'éventuels produits de sécrétion de ces cellules productrices implantées, et (4) rend très difficile le contrôle de la quantité de particules virales produites par ces cellules après l'impîantatioeL
La présente invention apporte une solution avantageuse à ces problèmes. Elle fournit en effet des vecteurs viraux utilisables directement en thérapie génique, pour diriger l'expression de la thymidine kinase dans des cellules cibles La présente invention permet donc d'éviter l'utilisation de cellules productrices dont les nombreux inconvénients ont été mentionnés ci-dessus. Elle permet également de contrôler la quantité de virus administrée et donc de thymidine kinase produite, et autre ainsi un meilleur contrôle du traitement. Par ailleurs, les adénovirus de Invention présentent l'avantage de ne pas s'intégrer au génome des cellules qu'ils infectent, de s'y maintenir de manière très stable ce qui limite considérablement les risques de diffsion aux cellules voisines, et d'avoir un spectre d'hôte très large, ce qui offre de nombreuses applications thérapeutiques. De plus, des adènovirus recombinants peuvent être obtenus avec des titres élevés, ce qui permet de travailler à des multiplicités d'infection élevées. De plus, l'emploi de signaux d'expression hétérologues permet d'optimiser pour chaque application thérapeutique, et donc, pour chaque type cellulaire concerné, les niveaux et les conditions d'expression de la thymidine kinase.
La présente invention apporte une solution avantageuse à ces problèmes. Elle fournit en effet des vecteurs viraux utilisables directement en thérapie génique, pour diriger l'expression de la thymidine kinase dans des cellules cibles La présente invention permet donc d'éviter l'utilisation de cellules productrices dont les nombreux inconvénients ont été mentionnés ci-dessus. Elle permet également de contrôler la quantité de virus administrée et donc de thymidine kinase produite, et autre ainsi un meilleur contrôle du traitement. Par ailleurs, les adénovirus de Invention présentent l'avantage de ne pas s'intégrer au génome des cellules qu'ils infectent, de s'y maintenir de manière très stable ce qui limite considérablement les risques de diffsion aux cellules voisines, et d'avoir un spectre d'hôte très large, ce qui offre de nombreuses applications thérapeutiques. De plus, des adènovirus recombinants peuvent être obtenus avec des titres élevés, ce qui permet de travailler à des multiplicités d'infection élevées. De plus, l'emploi de signaux d'expression hétérologues permet d'optimiser pour chaque application thérapeutique, et donc, pour chaque type cellulaire concerné, les niveaux et les conditions d'expression de la thymidine kinase.
Un premier objet de Invention réside donc dans un adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADN codant pour la thymidine kinase sous le controle de signaux d'expression hétérologues.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un tel adénovirus recombinant défectif pour la préparation d'une composition pliarmacetique destinée au traitement ou à la prévention des cancers et/ou des maladies virales.
Les adénovirus défectifs selon l'invention sont des adénovirus incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement le génome des adénovirus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée.
Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues nonfonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par le gène inséré.
Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales.
n existe différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu. Néanmoins, ces virus ne sont pas pathogènes pour l'hornme, et notamment les sujets non immuno-déprimés. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou
Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande FR 93 05954). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple: Maul, Beard et aL, Vmlogy 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple: SAV).
n existe différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu. Néanmoins, ces virus ne sont pas pathogènes pour l'hornme, et notamment les sujets non immuno-déprimés. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou
Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande FR 93 05954). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple: Maul, Beard et aL, Vmlogy 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple: SAV).
De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR800) par exemple].
De préférence, on utilise dans le cadre de rinvention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
Comme indiqué ci-dessus, les adénovirus de l'invention portent une séquence d'ADN codant pour la thymidine kinase. ll s'agit de préférence du gène de la tlwmidine kinase du virus de l'herpès simplex (HSV-tk). Plus préférentiellement encore, on utilise dans le cadre de la présente invention le gène de la thymidine kinase du virus de herpès simplex humain (hTK HSV-1). La séquence de ce gène a été décrite dans la littérature (voir notamment McKnight et al., Nucleic Acid. Res. 8 (1980) 5931). Cette séquence est placée sous le contrôle de signaux d'expression hétérologues permettant son expression dans les cellules infectées. Au sens de la présente invention, on entend par signaux d'expression hétérologues des signaux différents de ceux naturellement responsables de l'expression d'un gène TK. ll peut s'agir en particulier de séquences responsables de l'expression d'autres protéines, ou de séquences synthétiques.
Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux.
Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du gnome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, y compns radénovirus utilisé. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs E1A, MLP, CMV, RSV, etc. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, etc. Par ailleurs, lorsque la séquence d'ADN codant pour la thymidine kinase ne comporte pas de séquences d'expression, elle peut être insérée dans le génome du virus défectif en aval d'une telle séquence.
Dans un premier mode particulier de réalisation particulier de l'invtion, on utilise de préférence le promoteur RSV, qui permet une expression durable et importante de la thymidine kinase dans les cellules du système nerveux, notamment central.
Dans un autre mode de réalisation particulier de rinvention, on utilise des signaux d'expression actifs spécifiquement dans les cellules tumorales. De cette façon, le gène utilisé n'est expimé et ne produit son effet que lorsque le virus a etfectivement infecté une cellule tumorale. Plus préférentiellement, il s'agit de signaux d'exssion induits par ou actifs en présence de virus responsables ou associés à des tumeurs.
Encore plus préférentiellement, on utilise dans le cadre de la présente invention un signal d'expression inductible par le virus d'Epstein-Barr (EBV), ou par le virus du papillome.
Le virus d'Epstein-Barr (EBV) est associé à deux types de cancers humains. le lymphome de Burkitt et le cancer du nasopharynx. L'utilisation d'un adénovirus recombinant comprenant un gène toxique sous le contrôle d'un promoteur inductible par l'EBV permet avantageusement d'exprimer spécifiquement ce gène toxique dans les cellules tumorales du nasopharynx Dans les biopsies de cancers du nasopharynx, un seul antigène nucléaire est régulièrement présent, EBNA1, qui est impliqué dans la maintenace du génome viral dans les cellules infectées par rEBV en phase latente, et qui transactive le promoteur viral BCR2. Un objet particulier de l'invention réside donc dans l'utilisation, pour l'expression spécifique d'un gène dans les cellules de cancers du nasopharynx, drune séquence répondant à EBNA1 (EBNA1-RE: EBNA1 "responsive element"). En particulier, l'invention concerne un adénovirus comprenant comme signal d'expression un promoteur chimère comprenant une séquence répondant à EBNA1 fusionnée en amont d'un autre promoteur viral, le promoteur du gène de la terminale protéine 1 (TP1). Les exemples décrits dans la présente demande montrent bien que ce promoteur chimère est inductible par EBNA1.
Les virus du papillome (notamment le virus HPV 16 et 18) sont resposables de 90 to des cancers du cervix chez la femme et ont été identifiés dans des lésîoes épithéliales pré-cancéreuses (Riou et al., Lancet 335 (1990) 117). Le produit du gène
E6 conduit à la formation de tumeurs en diminuant fortement la quantité de p53 sauvage, un anti-oncogène, dans les cellules HPV-positives (Wrede et al., Mol.
E6 conduit à la formation de tumeurs en diminuant fortement la quantité de p53 sauvage, un anti-oncogène, dans les cellules HPV-positives (Wrede et al., Mol.
Carcinog. 4 (1991) 171). L'utilisation d'un adénovirus recombinant comprenant un gène toxique sous le contrôle d'un promoteur inducflbie par le HPV (par exemple la protéine E6) permet avantageusement d'exprimer spécifiquement ce gène toxique dans les cellules tumorales correspondantes.
En outre, ces séquences promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, etc.
I1 peut encore s'agir de signaux d'expression inactifs dans les cellules normales et actifs dans les cellules tumorales. En particulier, on peut utiliser dans le cadre de la présente invention le promoteur de Fcr-foetoprotéine (Alpert E., dans Hepatocellular carcinoma, Okuda & Peters (eds), New York, 1976, 353) ou de rIGF-II (Sussenbach et al., Growth Regulation 2 (1992) 1), qui sont actifs chez l'adulte uniquement dans les hépatocarcinomes.
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homihe du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'ADN hétérologue. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %). Des stratégies de consbuction de vecteurs dérivés des adénovirus ont également été décrites dans les demandes n FR 93 05954 et
FR 93 08596.
FR 93 08596.
Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.
La présente invention concerne également une composition comprenant un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs tels que décrits précédemment. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule aimaceu- tiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une i-tion directe dans une tumeur à traiter. n peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. L'injection directe dans la tueur à traiter est avantageuse car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés.
Les doses d'adénovirus recombinant défectif utilisées pour rinjection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adé recombinants selon l'invention sont formulés et administr sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfulml, et de préférence 106 à 1010 pfu/mL Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux dune solution de virus, et est détenniné par infection d'une culture cellulaire appfopriée, et mesure, après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution vire sont bien documentées dans la littérature.
La présente invention offre ainsi un moyen très efficace pour le traitement ou la prévention des cancers. Elle est tout particulièrement adaptée au traitement des cancers du nasopharynx, des tumeurs cérébrales (neuroblastomes, glioblastames, etc) et des hépatocarcinomes.
Concernant les tumeurs cérébrales, les vecteurs adénoviraux selon rinvention présentent des avantages importants, liés notamment à leur très haute efficacité d'infection des cellules nerveuses, permettant de réaliser des infections à partir de faibles volumes de suspension virale. De plus, l'infection par les adénovirus de l'invention est très localisée au site d'injection, ce qui évite les risques de diffusion aux cellules voies.
En outre, ce traitement peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel que les ovins, les bovins, les animaux domestiques (chiens, chats, etc), les chevaux, les poissons, etc.
La présente invention seraplus complètement décrite à raide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légende des figures
Figure 1: Représentation du vecteur pONT-tk
Figure 2: Représentation du vecteur pRSV-tk
Techniques genérales de biologie moleculaire
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, éioethoésse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de méthanol ou de risopropanol, la transformation dans Esclierichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis
T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in
Molecular Biology", John Wiley & Sons, New Yods, 1987].
Figure 1: Représentation du vecteur pONT-tk
Figure 2: Représentation du vecteur pRSV-tk
Techniques genérales de biologie moleculaire
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, éioethoésse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de méthanol ou de risopropanol, la transformation dans Esclierichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis
T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in
Molecular Biology", John Wiley & Sons, New Yods, 1987].
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratones).
Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophosèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénoVchloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de 1'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fourisseur.
Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de RADON Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Tayloe et aL [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Ameiam
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [Eolymérase-catalyzed chais Beaction, Saiki RK. et al., Science 230 (1985) 13501354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. EnzynL 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Liner Cetus) selon les specifications du fabricant.
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [Eolymérase-catalyzed chais Beaction, Saiki RK. et al., Science 230 (1985) 13501354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. EnzynL 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Liner Cetus) selon les specifications du fabricant.
La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.
Exemples
Exemple 1. Construction du vecteur Ad-ONT-tk portant le gène tk sou le contrôle d'un promoteur chimère EBNA1-RE/TP1 (figure 1).
Exemple 1. Construction du vecteur Ad-ONT-tk portant le gène tk sou le contrôle d'un promoteur chimère EBNA1-RE/TP1 (figure 1).
Cet exemple décrit la construction d'un adénovirus recombinant comrenant le gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex (tk) sous le contrôle d'un promoteur spécifiquement actif dans les cellules infectées par le virus EBV (promoteur chimère EBNA1-RESI E'1).
1.1. Construction du plasmide p7tkl
Cet exemple décrit la construction du plasmide p7tkl contenant la phase ouverte de lecture du gène tk de 1131 pales de bases (ATG 114116 et codon stop
TGA 1242-1244), insérée dans un multisite de clonage.
Cet exemple décrit la construction du plasmide p7tkl contenant la phase ouverte de lecture du gène tk de 1131 pales de bases (ATG 114116 et codon stop
TGA 1242-1244), insérée dans un multisite de clonage.
Le fragment BgE-NcoI contenant le gène de la thymidine kinase (tk) du virus herpès simplex type 1 a été isolé à partir du plasmide pHSV-106 (commercialisé par Gibco BRL), réparé par l'action du fragment kienow puis inséré au site SmaI du plasmide pGEM7zf(+) (commercialisé par Promega). Les sites SmaI et Bgm sont détruits lors de cette étape, le site NcoI est conservé.
Le plasmide obtenu a été désigné p7tkl.
1.2. Construction du plasmide pONT1
Cet exemple décrit la construction d'un plasmide contenant un promoteur chimère constitué d'une séquence néessire à la transactivation par l'antigène EBNA1 et du promoteur TP1 du virus EBV.
Cet exemple décrit la construction d'un plasmide contenant un promoteur chimère constitué d'une séquence néessire à la transactivation par l'antigène EBNA1 et du promoteur TP1 du virus EBV.
Le fragment EcoRI(7315)-SmaI(8191) du virus EBV a été isolé à partir de la souche B958. La séquence complète du virus EBV a été décrite par Baer et aL (Nature 310 (1984) 207). Ce fragmenti contient les séquences ireeessaires à la transactivation par l'antigène nucléaire 1 (EBNA1) (D.Reisman & B. Sugden, 1986,
Molecular and Cellular Biology, vol. 6 pp. 3838-3846). Ce fragment a ensuite été fusionné au fragment NruI(166 241)-PstI(166 559) de rEBV B95-8 (le site PstI a été digéré par la polymérase T4), contenant le promoteur TP1. Le promoteur chimère ainsi obtenu a ensuite été inséré dans le multisite de clonage du plasmide pBluescript II
SK.
Molecular and Cellular Biology, vol. 6 pp. 3838-3846). Ce fragment a ensuite été fusionné au fragment NruI(166 241)-PstI(166 559) de rEBV B95-8 (le site PstI a été digéré par la polymérase T4), contenant le promoteur TP1. Le promoteur chimère ainsi obtenu a ensuite été inséré dans le multisite de clonage du plasmide pBluescript II
SK.
Le plasmide obtenu a été désigné pONTl.
1.3. Construction du plasmide pONTtk
Le plasmide pONTtk comporte le gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex (tk) cloné dans le plasmide p7tkl, sous le contrôle du promoteur chimère EBNA1-RE5P1 cloné dans le plasmide pONT1.
Le plasmide pONTtk comporte le gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex (tk) cloné dans le plasmide p7tkl, sous le contrôle du promoteur chimère EBNA1-RE5P1 cloné dans le plasmide pONT1.
Pour construire ce plasmide, le fragment BamHI-XhoI de pONT1 qui contient le promoteur chimère transactivé par EBNA-1 et EBNA-2, et le fragment
XhoI-ClaI de p7tkl qui contient la phase ouverte de lecture de tk ont été clonés aux sites BamHI (478) et ClaI (4550) du plasmide pAd RSVssgal. Le plasmide pAd.RSVssGal contient, dans l'orientation 5'- > 3',
- le fragment PvuII correspondant à l'extrémité gauche de l'adénovurus Ad5 comprenant: la séquence 1TR, l'origine de réplication, les signaux d'encapsidation et ramplificateur E1A;
- le gène codant pour la frgalactosidase sous le contrôle du promoteur RSV (du virus du sarcome de Rous),
- un second fragment du génome de l'adénovirus Ad5, qui permet la recombinaison homologue entre le plasmide pAd.RSVssGal et l'adénovirus dol 324. Le plasmide pAd.RSVssGal a été décrit par Stratford-Perricaudet et aL (J. Clin. Invest. 90 (1992) 626).
XhoI-ClaI de p7tkl qui contient la phase ouverte de lecture de tk ont été clonés aux sites BamHI (478) et ClaI (4550) du plasmide pAd RSVssgal. Le plasmide pAd.RSVssGal contient, dans l'orientation 5'- > 3',
- le fragment PvuII correspondant à l'extrémité gauche de l'adénovurus Ad5 comprenant: la séquence 1TR, l'origine de réplication, les signaux d'encapsidation et ramplificateur E1A;
- le gène codant pour la frgalactosidase sous le contrôle du promoteur RSV (du virus du sarcome de Rous),
- un second fragment du génome de l'adénovirus Ad5, qui permet la recombinaison homologue entre le plasmide pAd.RSVssGal et l'adénovirus dol 324. Le plasmide pAd.RSVssGal a été décrit par Stratford-Perricaudet et aL (J. Clin. Invest. 90 (1992) 626).
Tous les sites de clonage sont conservés. Le plasmide obtenu a été désigné pONTtk (figure 1).
1.4. Construction de l'adénovirus recombinant Ad-ONT-tk
Le vecteur pONTtk a été linéansé et cotransfecté avec un vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trans les fonctions codées par les régions El (E1A et E11B) d'adénovirus.
Le vecteur pONTtk a été linéansé et cotransfecté avec un vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trans les fonctions codées par les régions El (E1A et E11B) d'adénovirus.
Plus précisément, l'adénovirus Ad-ONT-tk a été obtenu par recombinaison homologue in vivo entre l'adénovirus mutant Ad-dl1324 ÇTbim1nappaya et al., Cell 31 (1982) 543) et le vecteur pONTtk, selon le protocole suivant: le plasmide pONTtk, linéarisé par XmnI, et l'adénovirus Ad-dl1324, linéarisé par l'enzyme ClaI, ont été co- transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium, pour permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés ont été sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, RADON de l'adénovirus recombinant a été amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titre d'environ 1010 pfu/ml.
Les particules virales sont généralement purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus Ad-ONT-tk peut être conservé à -80 C dans 20 ta de glycéroL
Exemple 2. Construction du vecteur Ad-RSV-TK
Cet exemple décrit la construction d'un adénoviuus recombinant comprenant le gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex (tk) sous le contrôle du promoteur RSV. Cet adénovirus a été construit par recombinaison homologue entre l'adénovirus défectif Ad-dl1324 et le plasmide pRSVtk portant le gène tk sous controle du promoteur RSV.
Exemple 2. Construction du vecteur Ad-RSV-TK
Cet exemple décrit la construction d'un adénoviuus recombinant comprenant le gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex (tk) sous le contrôle du promoteur RSV. Cet adénovirus a été construit par recombinaison homologue entre l'adénovirus défectif Ad-dl1324 et le plasmide pRSVtk portant le gène tk sous controle du promoteur RSV.
2.1. Construction du plasmide pRSVtk
Ce plasmide a été constniit à partir du plasmide pONTtk (exemple 1.3.), par substitution du promoteur transactivable par EBNA1 par le promoteur RSV. Pour cela, le promoteur RSV a été isolé sous forme d'un fragment BamHI-SalI à partir du plasmide pAd.RSV.Bgal (Stratfoid-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626), puis cloné aux sitesBamHI(478) et SalI(1700) du plasmide pONTtk. Le plasmide résultant a été désigné pRSVtk (figure 2).
Ce plasmide a été constniit à partir du plasmide pONTtk (exemple 1.3.), par substitution du promoteur transactivable par EBNA1 par le promoteur RSV. Pour cela, le promoteur RSV a été isolé sous forme d'un fragment BamHI-SalI à partir du plasmide pAd.RSV.Bgal (Stratfoid-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626), puis cloné aux sitesBamHI(478) et SalI(1700) du plasmide pONTtk. Le plasmide résultant a été désigné pRSVtk (figure 2).
2.2. Construction de l'adénovirus Ad-RSV-tk
Cet adénovirus a été construit selon le protocole décrit dans exemple 1.4.
Cet adénovirus a été construit selon le protocole décrit dans exemple 1.4.
L'adénovirus Ad-RSV-tk ainsi obtenu peut être conservé à -800C dans 20 % de glycérol.
Exemple 3. Utilisation de l'adénovlrus Ad-RSV-tk pour la destruction de cellules nerveuses tumorales
L'adénovirus Ad-RSV-tk a été utilisé pour infecter une lignée de cellules tumorales nerveuses (cellules C6 : gliome de rat accessible à rATCC sous le numéro
ATCC CCL 107). L'infection a été réalisée à un titre de 10 pfu/cellule environ. 24 heures après l'infection, les cellules sont traitées en présence de 10-5 M de gancyciovir et le taux de mortalité est déterminé 48 heures après. Les résultats obtenus montrent que 100 % des cellules infectées avec Padénovirus Ad-RSV-tk meurent au bout de 48 heures, alors que, les cellules non infectées ou infectées dans les mêmes conditions avec l'adénovirus Ad-RSV.Bgal survivent. Ces résultats montrent bien que radovirus
Ad-RSV-tk a rendu les cellules du gliome sensibles au gancyclovir.
L'adénovirus Ad-RSV-tk a été utilisé pour infecter une lignée de cellules tumorales nerveuses (cellules C6 : gliome de rat accessible à rATCC sous le numéro
ATCC CCL 107). L'infection a été réalisée à un titre de 10 pfu/cellule environ. 24 heures après l'infection, les cellules sont traitées en présence de 10-5 M de gancyciovir et le taux de mortalité est déterminé 48 heures après. Les résultats obtenus montrent que 100 % des cellules infectées avec Padénovirus Ad-RSV-tk meurent au bout de 48 heures, alors que, les cellules non infectées ou infectées dans les mêmes conditions avec l'adénovirus Ad-RSV.Bgal survivent. Ces résultats montrent bien que radovirus
Ad-RSV-tk a rendu les cellules du gliome sensibles au gancyclovir.
Claims (19)
1. Adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADN codant pour la thymidine kinase sous le controle de signaux d'expression hétérologues.
2. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est dépourvu des régions de son génome qui sont nécessaires tsa réplication dans la cellule cible.
3. Adénovirus selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il sagit d'un adénovirus humain de type Ad 5 ou canin de type CAV-2.
4. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la séquence d'ADN hétérologue code pour la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex.
5. Adénovirus selon la revendication 4 caractérisé en ce que la séquence d'ADN hétérologue code pour la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex humain
6. Adénovirus selon la revendication 5 caractérisé en ce que les signaux d'expression sont choisis parmi les promoteurs viraux.
7. Adénovirus selon la revendication 6 caractérisé en ce que les signaux d'expression sont choisis parmi les promoteurs E1A, MLP, CMV et RSV.
8. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend un signal d'expression actif spécifiquement dans les cellules tumorales.
9. Adénovirus selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'il comprend un signal d'expression inductible par le virus d'Epstein-Barr (EBV), ou par le virus du papillome.
10. Adénovirus selon la revendication 9 caractérisé en ce que le signal d'expression comprend une séquence répondant à l'antigène EBNA1.
11. Adénovirus selon la revendication 10 caractérisé en ce que le signal d'expression est constitué d'un promoteur chimère comprenant une séquence répondant à EBNA1 fusionnée en amont d'un autre promoteur viral, de préfécece le promoteur du gène de la terminale protéine 1 cri1).
12. Adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADN hétérologue codant pour la thymidine kinase sous le controle du promoteur RSV.
13. Adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADN hétérologue codant pour la thymidine kinase sous le controle du Promoteur EBNA1- RE/1P1.
14. Utilisation d'un adénovirus selon l'une des revendications 1 à 13 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des cancers.
15. Utilisation selon la revendication 14 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la pXvion des cancers du nasopharynx, des tumeurs cérébrales (neuroblastomes, glioblastomes) ou des hépatocarcinomes.
16. Utilisation selon la revendication 14 ou 15 pour la préparation d'une composition pharmaceutique en vue d'une administration directe dans la tumeur à traiter.
17. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs adérLoviruS recombinants défectifs selon l'une des revendications 1 à 13.
18. Composition pharmaceutique selon la revendication 17 caractérisée en ce qu'elle est sous forme injectable.
19. Composition pharmaceutique selon la revendication 17 caractérisée en ce qu'elle comprend entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 1010 pfu/ml adénovirus recombinants défectifs.
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| FR9313772A FR2712603B1 (fr) | 1993-11-18 | 1993-11-18 | Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique. |
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| WO1992005262A1 (fr) * | 1990-09-14 | 1992-04-02 | The John Hopkins University | Procedes et compositions pour la therapie et la potentialisation genetiques de l'immunite antitumorale |
| WO1993019191A1 (fr) * | 1992-03-16 | 1993-09-30 | Centre National De La Recherche Scientifique | Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines pour traitement antitumoral |
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1993
- 1993-11-18 FR FR9313772A patent/FR2712603B1/fr not_active Expired - Fee Related
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1994
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- 1994-11-07 WO PCT/FR1994/001285 patent/WO1995014102A1/fr active Application Filing
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- 1994-11-17 IL IL11168194A patent/IL111681A0/xx unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0415731A2 (fr) * | 1989-08-30 | 1991-03-06 | The Wellcome Foundation Limited | Substances nouvelles pour la thérapie du cancer |
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Also Published As
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| WO1995014102A1 (fr) | 1995-05-26 |
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