FR2657885A1 - Anticorps capables de reconnaitre specifiquement un antigene du stratum corneum de l'epiderme humain, leur preparation et leur application, notamme comme vecteurs de drogues. - Google Patents
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Abstract
Anticorps, notamment anticorps monoclonaux, capables de reconnaître spécifiquement un antigène caractéristique du stratum corneum, en particulier du stratum corneum de l'épiderme humain non pathologique; leur procédé de préparation; et leur application notamment comme vecteurs de drogue, la drogue étant par exemple un agent de traitement d'affections liées aux troubles de la kératinisation tels que l'ichtyose, le psoriasis ou l'eczéma.
Description
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La présente invention a pour objet des anticorps monoclonaux qui sont capables de reconnaître un site antigénique présent au niveau du stratum corneum de l'épiderme humain, leur préparation et leur application. On sait que l'épiderme comprend une membrane basale sur laquelle repose une couche de cellules basales prolifératives et des couches de cellules suprabasales, comprenant le stratum spinosum et le stratum granulosum, couches de cellules en voie de différenciation qui se kératinisent progressivement et finissent par former à la surface de la peau une couche cornée (stratum corneum) composée par des cellules mortes entièrement kératinisées: les cornéocytes Les cornéocytes sont formés principalement de filaments de kératine qui sont entourés par une membrane très résistante appelée enveloppe cornée Cette enveloppe cornée est formée par des protéines précurseurs liées par des liaisons covalentes sous
l'action d'une enzyme spécifique, la transglutaminase.
Pour pouvoir étudier les maladies de la peau (par exemple psoriasis, acné, verrues, papillomes, cancers, etc) il est nécessaire de mieux connaître la différenciation des cellules normales de l'épiderme, encore appelées kératinocytes Pour procéder à de telles études, il est nécessaire de disposer de différents marqueurs de la différenciation
terminale des kératinocytes.
On a maintenant découvert qu'il est possible d'obtenir des anticorps capables de reconnaître spécifiquement, sur une coupe d'épiderme normal humain, un site antigénique propre au stratum corneum ("normal"
signifiant ici "non pathologique").
La présente invention a donc pour objet de tels anticorps, qui sont capables de se fixer, sur une coupe d'épiderme humain non pathologique, uniquement au niveau du stratum corneum Ces anticorps ne reconnaissent pas, notamment, les cellules basales et suprabasales de
l'épiderme normal humain.
Parmi les anticorps de l'invention, on citera notamment ceux qui possèdent en outre au moins l'une des propriétés suivantes: ils reconnaissent le stratum corneum de l'épiderme humain atteint de troubles de la kératinisation tels que l'ichtyose ou le vieillissement cutané photoinduit, ces troubles pouvant présenter en outre une composante inflammatoire comme dans le cas du psoriasis ou de l'eczéma; par immunomarquage en microscopie électronique, ils donnent un marquage discontinu dans l'espace intercornéocytaire du stratum corneum de l'épiderme, par exemple de l'épiderme non pathologique humain; ils reconnaissent les tissus épithéliaux kératinisés humains, -2- ils reconnaissent le stratum corneum de l'épiderme d'au moins un
mammifère autre que l'homme.
Parmi les anticorps de l'invention, on citera notamment ceux qui reconnaissent un antigène spécifique du stratum corneum de l'épiderme normal humain, ledit antigène étant celui qui est reconnu par l'anticorps
monoclonal BC 21 qui sera décrit ci-après.
Les anticorps reconnaissant l'antigène reconnu par l'anticorps BC 21 peuvent être sélectionnés facilement, par de simples expériences de
routine, par exemple par des tests de compétition.
Les anticorps de l'invention peuvent être des anticorps
polyclonaux ou, de préférence, des anticorps monoclonaux.
Ces anticorps sont des marqueurs de la différenciation terminale
des kératinocytes.
L'invention s'étend également aux anticorps définis précédemment et modifiés par marquage avec un agent traceur selon les méthodes classiques de préparation de tels anticorps marqués Par exemple, le
traceur peut être un traceur radioactif, fluorescent ou enzymatique.
Le marquage avec un traceur radioactif peut être obtenu par couplage avec un isotope radioactif tel que de l'iode ou de l'indium Le
couplage d'un anticorps avec un agent traceur radioactif est connu en soi.
Le couplage des anticorps avec un fluorochrome (par exemple isothiocyanate de fluorescéine ou de rhodamine), ou avec une enzyme, est également connu L'enzyme est par exemple une peroxydase ou une phosphatase alcaline L'activité enzymatique éventuellement présente sur le réactif, après réalisation d'un test, peut être déterminée selon les méthodes connues avec un substrat approprié permettant par exemple une révélation par colorimétrie, par fluorescence, par luminescence, par potentiométrie, etc. L'invention s'étend en outre aux anticorps tels que définis ci-dessus, marqués ou non, fixés sur un support solide permettant leur utilisation comme agents immunoadsorbants dans des méthodes de chromatographie d'affinité ou comme réactifs dans les méthodes d'analyse fondées sur la réaction antigène-anticorps (techniques radioimmunologiques,
techniques d'immunofluorescence, techniques immunoenzymatiques).
Ledit support solide peut être réalisé avec tout matériau solide, biologique ou synthétique, doué de propriétés adsorbantes ou capable de fixer un agent de couplage Ces matériaux sont connus et décrits dans la littérature Parmi les matériaux solides capables de fixer les anticorps par adsorption, on citera par exemple le polystyrène, le polypropylène, les latex, etc Parmi les matériaux solides utilisables pour fixer les anticorps par covalence à l'aide d'un agent de couplage, on peut citer notamment le dextran, la cellulose, leurs dérivés aminés (diéthylaminoéthyl-cellulose ou diéthylaminoéthyl-dextran), etc. Le support solide peut se présenter par exemple sous forme de disques, de tubes, de baguettes, de billes ou de plaques de microtitration. Les agents de couplage permettant de fixer par covalence les anticorps sur le support solide sont connus Ce sont des dérivés bifonctionnels tels que des dialdéhydes, des quinones, etc. Les anticorps peuvent également ître fixés de façon connue sur des
supports solides minéraux.
L'invention a également pour objet un procédé de préparation des
anticorps tels que définis ci-dessus.
Ce procédé est principalement caractérisé par le fait que l'on immunise un animal vertébré avec des enveloppes cornées purifiées d'épiderme de mammifère, et que l'on prépare ou recueille et purifie, et sélectionne, selon les méthodes connues, des anticorps monoclonaux ou
polyclonaux ayant une ou plusieurs des propriétés indiquées précédemment.
L'épiderme d'o provient l'agent d'immunisation est notamment un épiderme
non pathologique, en particulier un épiderme humain.
Les mammifères dont les enveloppes cornées de l'épiderme peuvent être utilisés comme agents d'immunisation dans le procédé qui vient d'être décrit peuvent être facilement déterminés par des expériences de routine, en effectuant l'immunisation d'animaux à l'aide d'enveloppes cornées purifiées provenant d'un mammifère, et en déterminant si les anticorps produits contiennent des anticorps tels que définis ci-dessus Parmi les mammifères, autres que l'homme, dont les enveloppes cornées de l'épiderme sont utilisables pour l'immunisation, on citera notamment le rat, le lapin et le mini-porc Bien entendu, l'animal vertébré que l'on immunise est d'une espèce différente de celle du mammifère d'o provient l'agent
d'immunisation.
Les enveloppes cornées purifiées utilisées pour l'immunisation peuvent être préparées à partir d'épiderme ou de stratum corneum humain ou animal Pour cela, on traite à plusieurs reprises l'échantillon par incubations successives à 900 C dans des solutions de dodécyl sulfate de sodium (SDS) contenant du b ta-mercaptoéthanol, suivies de plusieurs électrodialyses Ces traitements ont pour effet de solubiliser puis d'éliminer les substances biologiques (lipides et protéines, en particulier la kératine) qui ne sont pas liées de manière covalente à la structure de l'enveloppe cornée Les enveloppes cornées ainsi purifiées sont ensuite
recueillies, lavées et mises en suspension dans du sérum physiologique.
-3- Pour préparer les anticorps polyclonaux, on recueille les anticorps du sérum des animaux immunisés et on les purifie, de façon connue en soi, par exemple par chromatographie d'affinité, pour ne retenir que les anticorps qui reconnaissent le stratum corneum et qui ne reconnaissent pas les cellules basales et suprabasales soit de l'épiderme ayant servi à préparer les enveloppes cornées utilisées comme agent d'immunisation, soit d'un épiderme normal humain, ou pour ne retenir que les anticorps ayant en
outre les autres propriétés énoncées ci-dessus.
Pour préparer les anticorps monoclonaux, on prélève selon les techniques usuelles les lymphocytes de l'animal immunisé, on procède ensuite par exemple à une fusion cellulaire, selon les méthodes connues, avec des lymphocytes cultivables in vitro, et on sélectionne, de façon connue en soi, les clones de cellules hybrides sécrétant des anticorps ayant les caractéristiques énumérées ci-dessus dans la définition des
anticorps de l'invention.
L'invention s'étend aux lignées cellulaires hybrides capables de
sécréter ces anticorps.
L'invention s'étend notamment à la lignée cellulaire hybride CIRD BC 21 déposée auprès de la European Collection of Animal Cell Culture sous le N O 89091901, ainsi qu'à l'anticorps monoclonal (appelé ici anticorps
BC 21) sécrété par cette lignée cellulaire.
L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'anticorps monoclonaux, tels que définis précédemment, par culture des lignées cellulaires hybrides décrites ci-dessus et séparation des anticorps
produits dans le milieu de culture, ou encore dans des ascites.
Si désiré, on peut encore fixer lesdits anticorps sur un support solide et/ou les faire réagir avec un marqueur radioactif, fluorescent ou enzymatique. L'invention a également pour objet l'utilisation des anticorps monoclonaux, tels que définis ci-dessus, comme réactifs dans les techniques
immunologiques basées sur la réaction antigène-anticorps.
Ces techniques, telles que l'immunofluorescence directe ou indirecte, les techniques immunoenzymatiques, les techniques
radioimmunologiques, etc, sont connues et ne seront pas décrites ici.
Les anticorps de l'invention peuvent être utilisés notamment comme biocapteurs dans les techniques qui emploient des sondes biologiques pour la détection de molécules portant le déterminant antigénique contre lequel
l'anticorps est dirigé.
Les anticorps de l'invention peuvent être utilisés par exemple comme réactifs d'étude de la différenciation normale ou pathologique des -4-
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cellules de l'épiderme, notamment de l'épiderme humain Ils sont utilisables en particulier, en médecine humaine, dans le diagnostic des
maladies dermatologiques, et aussi des maladies des épithéliums internes.
En particulier, les anticorps selon l'invention qui reconnaissent les tissus épithéliaux kératinisés peuvent être utilisés pour déterminer si des
épithéliums internes sont kératinisés.
Les anticorps de l'invention sont notamment utilisables dans
toutes les techniques d'imagerie médicale utilisant des anticorps.
Les anticorps de l'invention peuvent aussi être utilisés notamment comme réactifs pour la quantification du stratum corneum de l'épiderme, par exemple pour étudier la variation d'épaisseur du stratum corneum sous l'influence d'un médicament, et pour vérifier ainsi l'efficacité du médicament Les anticorps qui reconnaissent le stratum corneum de façon spécifique chez un mammifère tel que par exemple le rat, le lapin, le miniporc, etc présentent l'avantage de permettre de choisir ce mammifère
comme modèle animal pour une telle étude.
Les anticorps de l'invention peuvent être utilisés également dans la préparation de médicaments, comme vecteurs de drogues, notamment des drogues utilisées dans le traitement des affections liées aux désordres de la kératinisation, telles que l'ichtyose ou le vieillessement photoinduit, ou liées aux désordres de la kératinisation avec composante inflammatoire comme dans le cas du psoriasis ou de l'eczéma Par exemple, les anticorps de l'invention qui reconnaissent les tissus cutanés atteints de psoriasis peuvent être utilisés comme vecteurs de drogues employées dans le
traitement du psoriasis, notamment des antimitotiques.
Les anticorps de l'invention peuvent être par exemple couplés par liaison covalente à des vecteurs colloïdaux tels que des liposomes (voir par exemple Wright et Huang, Advanced Drug Delivery Reviews 3, 343-389, 1989) ou des microsphères polymériques, contenant une substance biologiquement active ou un agent de diagnostic, afin d'être utilisés comme
immunoréactifs, ou comme agents thérapeutiques.
La substance biologiquement active est par exemple un agent
antimitotique tel que le méthotrexate.
Ces liposomes ou microsphères contenant des anticorps capables de reconnaître les tissus cutanés atteints de psoriasis peuvent être utilisés par exemple comme médicament, en médecine humaine, dans le traitement du psoriasis Dans ce cas les liposomes ou microsphères sont appliqués par
voie topique.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
EXEMPLE 1
OBTENTION D'ANTICORPS MONOCLONAUX
1) Préparation des enveloppes cornées utilisées comme antigène: De l'épiderme humain ou du stratum corneum sont incubés pendant 10 minutes à 90 C dans une solution A ( 2 % SDS, O,1 % DTE, 0,01 % azide de sodium) Pendant l'incubation la suspension d'enveloppes cornées est soumise à trois reprises à une agitation forte au vortex L'échantillon est ensuite centrifugé pendant 10 minutes à 4000 g et le culot obtenu est remis en suspension dans la solution A L'ensemble de cette opération est répété
4 fois.
Le culot d'enveloppes cornées obtenu après la dernière centrifugation est mis en suspension dans une solution B ( 62,5 m H Tris-H Cl p H 6,8, 2 % SDS, 5 % bêta-mercaptoéthanol, 10 % glycérol, 0,025 % bleu de bromophénol) Puis il est incubé pendant 10 minutes à 90 C et transféré dans un sac à dialyse (Spectrapor 6/132542, commercialisé par Spectrum Industries) Le sac est ensuite immergé dans une cuve d'électrotransfert (Transblot, commercialisé par Biorad) contenant une solution tampon C (Glycine 200 m M, Tris 25 m M, 0,1 % SDS) Une tension de 20 Volts est
appliquée pendant 24 heures à 4 C.
Les enveloppes cornées sont ensuite récupérées et lavées par centrifugation dans la solution C Le culot obtenu est à nouveau mis en
suspension dans la solution tampon B L'électrodialyse est répétée 3 fois.
Après la dernière électrodialyse le culot est remis en suspension dans de l'eau distillée La suspension est centrifugée 5 minutes à 4000 g Cette opération est répétée 3 fois puis le culot est mis en suspension dans du sérum physiologique à une concentration de 1 mg/ml de protéine déterminée
par le dosage de Lowry et al (J Biol Chem 1951, 193, 265-275).
SDS signifie: dodécyl sulfate de sodium DTE signifie: dithioérythritol 2) Immunisation: Des souris femelles Balb/c de 8 à 11 semaines sont immunisées par voie intrapéritonéale avec 1 mg d'enveloppes cornées préparées comme -6- ci-dessus Trois rappels identiques sont effectués à intervalles de 3
semaines La rate des animaux est prélevée 3 jours après le dernier rappel.
3) Culture des cellules de myélome de souris SP 2/0: On utilise une lignée de cellules SP 2/0 (Shulman et K Mhler, Nature, 276, 269, 1978) incapables de survivre dans un milieu contenant de
l'azasérine et de l'hypoxanthine (Buttin et al, Curr Top Microbiol.
Immunol 81, 27, 1978) Les cellules sont cultivées dans un milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DME) contenant 4,5 g/1 de glucose, 1,2 g/l de bicarbonate de sodium, 1 m M de pyruvate de sodium, 2 m M glutamine, (soit un milieu DME complet), additionné de 10 % de sérum foetal de veau décomplémenté ( 10 minutes à 56 C) Après décongélation, les cellules SP 2/0 doivent être cultivées à des concentrations de 2 x 10 à 8 x 10 /ml
jusqu'à ce qu'elles aient atteint un temps de doublement de 12 à 15 heures.
La congélation de ces cellules se fait à une concentration de 5 x 10 /ml dans 95 % de sérum foetal de veau et 5 % de DMSO (diméthyl sulfoxyde) 4) Préparation des cellules SP 2/0 Des cellules SP 2/0 en croissance exponentielle à une concentration de 105 à 2 x 105 cellules par ml sont centrifugées à 800 rpm (rotations par minute) pendant 5 minutes et remises en suspension
dans du DME complet sans sérum à raison de 10 cellules/ml.
5) Préparation des splénocytes: On prépare de façon classique les splénocytes des souris immunisées, et on les met en suspension dans un milieu DMEM (Dulbecco's modified essential medium) complet sans sérum Pour comptage, 50 pl de la suspension sont prélevés et mélangés à 50 p 1 de bleu trypan à 0,2 % et à 400 p 1 de tampon PBS (phosphate buffered saline) Au bout de 30 secondes, un aliquot est disposé dans une cellule de Buerker La suspension est centrifugée à 800 rpm pendant 5 minutes et ajustée à 10 cellules viables/ml. 6) Fusion (jour 0): La technique utilisée est dérivée de la technique de "fusion en masse" de Juy et al (J Immunol 129, 1153, 1982) Dans un tube de polypropylène de 50 ml, les cellules de myélome et les splénocytes sont -7- mélangés dans une proportion de 1 cellule de myélome pour 4 splénocytes et centrifugés à 800 rpm pendant 5 minutes Le surnageant est pipetté et on rajoute 1 ml de DME complet sans sérum au culot qui est ensuite remis en suspension (Galfré et al, Nature 266, 550, 1977) On rajoute au culot 100 Mi, pour 10 splénocytes, de polyéthylène glycol 4000 (PEG 4000) dilué à
% dans le DME contenant 5 X de DMSO Le DMSO doit être ajouté extem-
poranément La solution de PEG est ajoutée goutte à goutte pendant 1 minute en agitant lentement le tube de façon continue Après 1 minute de repos à température ambiante, 1 ml de DME complet contenant 10 % de sérum foetal de veau (SVF) est ajouté en 1 minute; le tube est laissé au repos pendant 1 minute Ensuite, 15 ml de milieu complet contenant le sérum foetal de veau sont ajoutés goutte à goutte (environ 1 ml par minute) en agitant lentement La suspension obtenue est prélevée avec une pipette de 25 ml et répartie dans une boîte de culture de 150 mm de diamètre qui est incubée à l'étuve à 370 C pendant 6 heures Les cellules sont centrifugées à 800 rpm pendant 5 minutes et sont reprises dans du milieu sélectif à raison de 1 ml de milieu sélectif pour 2,5 x 10 splénocytes de départ Le milieu sélectif est composé comme suit: DME complet contenant 10 5 X azasérine, 5 X hypoxanthine et 2 pg/m I d'insuline La suspension est ensuite
répartie dans des plaques de culture à 24 puits à raison de 0,5 ml/puits.
Dans ces conditions, des clones d'hybridomes apparaissent entre le
jour 5 et le jour 7 On rajoute 0,2 ml/puits de milieu sélectif au jour 6.
7) Repérage des hybridomes produisant des anticorps recherchés Quand les hybridomes recouvrent un tiers de la surface des puits, le surnageant de culture est testé par immunofluorescence indirecte sur des
coupes d'épiderme humain selon la technique décrite ci-après.
8) Repiquage des puits sélectionnés: Quand les puits sont au deux tiers confluents, leur contenu est transféré dans des plaques à 12 puits A préconfluence les hybridomes sont clonés selon la technique décrite ciaprès Dans le même temps, ils sont amplifiés jusqu'à obtenir un flacon T 25 ( 25 cm 2) confluent Ces cellules
sont ensuite congelées dans le milieu de congélation décrit plus haut.
Pour le clonage, on utilise la technique de dilution limite Dans une plaque à 96 puits, on ensemence 1 cellule/puits On ensemence aussi une plaque avec une concentration théorique de 0,3 cellule/puits Les surnageants des puits sont testés par immunofluorescence indirecte, les 8-
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clones réagissant avec tout ou partie de l'épiderme sont ensuite cultivés et amplifiés dans du milieu sélectif ne contenant pas d'azasérine Après
une semaine de culture, ils sont ensuite cultivés dans du DME complet.
Le clonage est répété une fois dans les mêmes conditions.
On sélectionne, selon les techniques décrites à l'exemple 2, les
clones sécrétant des anticorps reconnaissant l'épiderme normal humain.
Parmi les clones retenus (catégorie A), on a sélectionné ceux qui reconnaissent spécifiquement (sous-catégorie B) le stratum corneum de
l'épiderme normal humain.
On a observé que parmi les clones de la catégorie A, au moins 5 % environ (généralement de 5 à 10 % environ) font partie de la sous-catégorie B. Un clone (CIRD BC 21) obtenu dans ces conditions a été déposé auprès de la European Collection of Animal Cell Culture sous le numéro
indiqué précédemment.
9) Croissance des hybridomes en ascite La croissance en liquide d'ascite des hybridomes obtenus est effectuée par injection intrapéritonéale de 107 cellules issues d'un même clone à des souris BALB/c âgées de 8 semaines, préalablement sensibilisées
par injection intra-péritonéale de 0,5 ml de pristane ( 2,6,10,14-
tétraméthyl pentadécane).
10) Identification de la classe d'immunoglobulines sécrétées La classe des immunoglobulines sécrétées dans le surnageant de myélome a été établie par double diffusion en agar avec des réactifs spécifiques des chaînes lourdes des immunoglobulines (Serotec Ltd,
Bicester, Grande-Bretagne).
L'immunoglobuline sécrétée par le clone CIRD BC 21 est une Ig M.
EXEMPLE 2
SPECIFICITE TISSULAIRE DE L'ANTICORPS SECRETE PAR LA LIGNEE CIRD BC 21
1) Immunofluorescence La spécificité tissulaire des anticorps présents dans les surnageants de myélome et dans les liquides d'ascite a été étudiée selon la technique d'immunofluorescence indirecte sur des coupes d'environ 5 pm de
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divers tissus congelés et inclus dans un milieu d'inclusion (Tissue-Tek).
Les lames séchées sur lesquelles se trouvent les tissus sont rincées pendant 10 minutes dans un bain de tampon phosphate PBS, puis incubées pendant 30 minutes en atmosphère humide, en présence des anticorps monoclonaux obtenus Un rinçage de 10 minutes est effectué Une deuxième incubation de 30 minutes est réalisée en présence d'anticorps anti-Ig M de souris couplés au FITC (isothiocyanate de fluorescéine commercialisé par Cappel) Après rinçage dans les mêmes conditions que précédemment les coupes sont montées entre lame et lamelle dans le milieu de montage
(glycérol 90 %, PBS 10 % contenant 1 % de para-phénylènediamine, p H 8).
Des tissus épithéliaux d'origines variées ont été utilisés afin d'étudier la spécificité d'espèce des anticorps Différents tissus épithéliaux d'origine humaine ont été utilisés pour étudier leur spécificité tissulaire Des tissus pathologiques humains ont aussi été utilisés pour évaluer la valeur diagnostique des anticorps De plus la réactivité des anticorps a été étudiée avec des kératinocytes cultivés en culture classique (Rheinwald et Green, Cell, 6, 331, 1975) ou en culture émergée sur derme mort (Regnier et al, Front matrix biol, 9, 4, 1981) ou
sur lattices de collagène (Lenoir et al, Dev Biol, 130, 610, 1988).
2) Immunomicroscopie électronique Des coupes d'environ 10 gm d'épiderme congelé et inclus dans un milieu d'inclusion (Tissue-Tek) sont incubées en présence de l'anticorps monoclonal comme précédemment Après rinçage, les coupes sont incubées avec le kit Vectastain ABC (Vector lab) La fixation du tissu est réalisée selon la technique de Graham et Karnovski (J Histochem Cytochem, 14, 291, 1966) Les coupes ultrafines, déshydratées dans des solutions aqueuses d'éthanol de concentrations variées, contenant de 70 % à 100 % d'alcool (volume/volume), puis incluses dans le milieu d'inclusion EPON 812, sont
observées avec un microscope électronique à transmission JEOL 1200 EX.
3) Résultats Les résultats d'immunofluorescence obtenus sont résumés dans les tableaux suivants:
TABLEAU I
SPECIFICITE TISSULAIRE CHEZ L'HOMME DE L'ANTICORPS SECRETE
PAR LA LIGNEE CIRD BC 21
Tissus testés (par immunofluorescence indirecte sur sections de
tissus congelés).
t Peau Oesophage Cornée Vagin Langue Amnios Duodénum f Céef(*) Vagi I-/+ (**) +***
::: (*)
* Diverses localisations: sein, ventre, front, prépuce Dans tous les
cas, l'anticorps se fixe uniquement au niveau du stratum corneum.
** Les zones kératinisées sont positives tandis que les zones non
kératinisées sont négatives.
***Les cellules épithéliales sont négatives tandis que les cellules à
mucus sont positives.
: marquage important : marquage absent
TABLEAU II
SPECIFICITE D'ESPECE DE L'ANTICORPS SECRETE
PAR LA LIGNEE CIRD BC 21
Espèces testées (par immunofluorescence indirecte sur section de tissus congelés) Souris a) Rata) lapin a), b) Miniporca) (race G 5 ttingen) _ ++*+ -I+ -+F Ii
a) épiderme: l'anticorps se fixe uniquement au niveau du stratum corneum.
b) lèvre de lapin: la zone externe orthokératotique est positive tandis
que la zone interne parakératotique est négative.
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TABLEAU III
PATHOLOGIE CUTANEE: ABSENCE OU PRESENCE DE REACTIVITE DE
L'ANTICORPS SECRETE PAR LA LIGNEE CIRD BC 21
Psoriasis Ichtyose Carcinomes Carcinomes vulgaire spinocellulaires basocellulaires ( 5)a ( 1) ( 4) ( 4) I 11 Hl _ _
a) Le chiffre entre parenthèses représente le nombre de sujets étudiés.
TABLEAU IV
REACTIVITE DE L'ANTICORPS BC 21 AVEC LES KERATINOCYTES EN CULTURE
Culture classique Culture sur derme Culture sur lattice
_-1: | 1:
En résumé, avec la peau humaine normale, psoriasique ou atteinte d'ichtyose vulgaire, l'anticorps sécrété par la lignée CIRD BC 21 réagit exclusivement avec le stratum corneum Il ne réagit cependant pas avec les zones internes entièrement différenciées ou "globes cornés" des carcinomes spino-cellulaires Cet anticorps ne réagit pas avec des
épithelia stratifiés non kératinisés ou avec des épithélia simples.
Cependant, un marquage spécifique des cellules à mucus du duodénum a été observé L'anticorps réagit aussi avec le stratum corneum d'autres espèces animales. L'anticorps ne réagit pas avec les kératinocytes cultivés de façon classique, mais marque de façon intense le stratum corneum formé quand les kératinocytes sont cultivés sur derme mort ou sur lattice de collagène
dans des conditions d'exposition à l'air.
-13 2657885
Finalement, des immunomarquages en microscopie électronique sur de l'épiderme humain ont révélé la présence d'un marquage spécifique
discontinu situé dans l'espace intercornéocytaire du stratum corneum.
Claims (21)
1 Anticorps caractérisés par le fait qu'ils sont capables de se fixer, sur une coupe d'épiderme humain non pathologique, uniquement au
niveau du stratum corneum.
2 Anticorps selon la revendication 1, caractérisés par le fait qu'ils reconnaissent en outre le stratum corneum de l'épiderme humain atteint de troubles de la kératinisation tels que l'ichtyose, le
vieillissement cutané photoinduit, le psoriasis ou l'eczéma.
3 Anticorps selon l'une quelconque des revendications
précédentes, caractérisés par le fait que par immunomarquage en microscopie électronique, ils donnent un marquage discontinu dans l'espace
intercornéocytaire du stratum corneum.
4 Anticorps selon l'une quelconque des revendications
précédentes, caractérisés par le fait qu'ils reconnaissent en outre des
tissus épithéliaux humains kératinisés.
5 Anticorps selon l'une quelconque des revendications
précédentes, caractérisés par le fait qu'ils reconnaissent un antigène du stratum corneum de l'épiderme normal humain, ledit antigène étant celui qui est reconnu par l'anticorps monoclonal sécrété par la lignée cellulaire hybride déposée auprès de la European Collection of Animal Cell Culture
sous le na 89 091 901.
6 Anticorps selon l'une quelconque des revendications
précédentes, caractérisés par le fait qu'ils reconnaissent en outre le
stratum cornéum de l'épiderme d'au moins un mammifère autre que l'homme.
7 Anticorps selon l'une quelconque des revendications
précédentes, caractérisés par le fait que ce sont des anticorps polyclonaux
purifiés par chromatographie d'affinité.
8 Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 6,
caractérisés par le fait que ce sont des anticorps monoclonaux.
9 Anticorps selon la revendication 8, caractérisé par le fait qu'il s'agit de l'anticorps monoclonal sécrété par la lignée cellulaire hybride déposée auprès de la European Collection of Animal Cell Culture
sous le N 089091901.
Anticorps selon l'une quelconque des revendications
précédentes, caractérisés par le fait qu'ils sont marqués et/ou fixés sur
un support solide.
11 Anticorps tels que définis dans l'une quelconque des
revendications 1 à 9, caractérisés par le fait qu'ils sont couplés à des
vecteurs colloïdaux tels que des liposomes ou des microsphères contenant
une substance biologiquement active ou un agent de diagnostic.
-14- 12 Procédé de préparation des anticorps tels que définis dans
l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait
que l'on immunise un animal vertébré avec des enveloppes cornées purifiées d'épiderme de mammifère, et que l'on prépare, ou recueille et purifie, et sélectionne, selon les méthodes connues, des anticorps monoclonaux ou polyclonaux ayant les propriétés définies dans l'une quelconque des
revendications 1 à 6.
13 Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que pour préparer les anticorps polyclonaux, on recueille les anticorps du sérum des animaux immunisés et on les purifie, de façon connue en soi, pour ne retenir que les anticorps ayant les propriétés définies dans l'une
quelconque des revendications 1 à 7.
14 Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que pour préparer les anticorps monoclonaux, on prélève selon les techniques usuelles, les lymphocytes de l'animal immunisé, on procède selon les méthodes connues à une fusion cellulaire avec des lymphocytes cultivables in vitro, et on sélectionne, de façon connue en soi, les clones de cellules hybrides sécrétant des anticorps ayant les caractéristiques énumérées dans
l'une quelconque des revendications 1 à 6.
15 Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le fait qu'en outre on cultive un tel clone et que l'on sépare les anticorps
produits dans le milieu de culture.
16 Lignées cellulaires caractérisées par le fait qu'elles sécrètent des anticorps tels que définis dans l'une quelconque des
revendications 8 et 9.
17 Lignée cellulaire selon la revendication 16 déposée auprès de
la European Collection of Animal Cell Culture sous le N 089091901.
18 Utilisation d'un anticorps tel que défini dans l'une
quelconque des revendications 1 à 10 comme réactif dans les techniques
immunologiques basées sur la réaction antigène-anticorps.
19 Utilisation selon la revendication 18, dans les techniques d'immunofluorescence, immunoenzymatique, radioimmunologique, dans les techniques de chromatographie d'affinité ou dans les techniques utilisant des sondes biologiques pour la détection de molécules portant le déterminant antigénique du stratum corneum contre lequel l'anticorps est dirigé. Utilisation selon la revendication 18, comme réactif pour la
quantification du stratum corneum de l'épiderme.
-16 2657885
21 Utilisation selon la revendication 18, caractérisée par le fait que l'on utilise ledit anticorps comme réactif dans l'étude de la différenciation normale ou pathologique des cellules de l'épiderme et des
épithéliums internes.
22 Utilisation d'anticorps tels que définis dans l'une quelconque
des revendications 2 à 5, comme vecteurs de drogues dans la préparation
d'un médicament.
23 Utilisation selon la revendication 22, caractérisée par le
fait que l'anticorps est tel que défini dans la revendication 11.
24 Utilisation selon la revendication 22 ou 23, caractérisée par le fait que ladite drogue est une drogue utilisée dans le traitement des
affections liées aux désordres de la kératinisation.
Utilisation selon la revendication 24, caractérisée par le fait que ladite drogue est une drogue utilisée dans le traitement de l'ichtyose, du vieillissement cutané photoinduit, du psoriasis ou de l'eczéma
Priority Applications (6)
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|---|---|---|---|
| FR9001462A FR2657885A1 (fr) | 1990-02-08 | 1990-02-08 | Anticorps capables de reconnaitre specifiquement un antigene du stratum corneum de l'epiderme humain, leur preparation et leur application, notamme comme vecteurs de drogues. |
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