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FR2647809A1 - Amorces oligonucleotidiques pour l'amplification du genome des retrovirus du type hiv-1, hiv-2 et siv, et leurs applications au diagnostic in vitro des infections dues a ces virus - Google Patents

Amorces oligonucleotidiques pour l'amplification du genome des retrovirus du type hiv-1, hiv-2 et siv, et leurs applications au diagnostic in vitro des infections dues a ces virus Download PDF

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FR2647809A1
FR2647809A1 FR8907354A FR8907354A FR2647809A1 FR 2647809 A1 FR2647809 A1 FR 2647809A1 FR 8907354 A FR8907354 A FR 8907354A FR 8907354 A FR8907354 A FR 8907354A FR 2647809 A1 FR2647809 A1 FR 2647809A1
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Institut Pasteur
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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Institut Pasteur
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Abstract

La présente invention concerne des séquences nucléotidiques dérivées des génomes des virus du type HIV-1, ou des génomes des virus du type HIV-2, ou des virus du type SIV, et leurs applications, notamment en tant qu'amorces oligonucléotidiques pour la mise en oeuvre de méthode de diagnostic in vitro de l'infection d'un individu par un virus du type HIV-1 et/ou HIV-2.

Description

AMORCES OLIGONUCLEOTIDIQUES POUR L'AMPLIFICATION DU GENONE DES RETROVIRUS DU TYPE HIV-1, HIV-2 ET SIV,
ET LEURS APPLICATIONS AU DIAGNOSTIC IN-VITRO DES
INFECTIONS DUES A CES VIRUS.
La présente invention est relative à des séquences oligonucléotidiques utilisables pour la mise en oeuvre de techniques d'amplification de séquences nucléiques spécifiques de rétrovirus d'immunodéficience humaine du type HIV ou de rétrovirus d'immunodéficience du singe du type SIV.
L'invention concerne en particulier l'application de ces amorces à des méthodes de diagnostic in vitro chez l'homme de l'infection d'un individu par un rétrovirus du type HIV (actuellement HIV-1 et/ou
HIV-2).
L'isolement et la caractérisation de rétrovirus regroupes sous les désignations HIV-1 et HIV-2 ont été décrits dans les demandes de brevet européen n 85/905.513.9 et n 87/400.151.4 respectivement. Ces rétrovirus ont été isolés chez plusieurs malades présentant des symptômes d'une lymphadénopathie ou d'un
Syndrome d'Immunodeficience Acquise (SIDA).
Les rétrovirus du type HIV-2 comme les rétrovirus du type HIV-1, se caractérisent par un tropisme pour les lymphocytes T4 humains et par un effet cytopathogène à l'égard de ces lymphocytes lorsqu'ils s'y multiplient, pour alors causer soit des polyadénopathies généralisées et persistantes, soit un
SIDA.
Un autre rétrovirus, dénommé SIV-1, cette dénomination remplaçant la dénomination antérieurement connue STLV-III, a été isolé chez le singe macaque rhésus (M.D. DANIEL et al. Science, 228, 1201 (1985)
N.L. LETWIN et al, Science, 230, 71 (1985) sous l'appellation "STLV-IIImac").
Un autre rétrovirus, désigné "STLV-IIIA > ", (ou SIVA > ) a été isolé chez des singes verts sauvages. Mais contrairement aux virus présents chez le singe macaque rhésus, la présence de STLV-IIIAz ne semble pas induire une maladie du type SIDA chez le singe vert d'Afrique.
Pour la commodité du langage, ces virus ne seront plus désignés dans ce qui suit que par l'expression SIV (l'expression SIV est l'abréviation anglaise de "Simian
Immunodeficency Virus" (Virus d'immunodéficience du singe) éventuellement suivie d'une abréviation désignant l'espèce de singe dont ils sont issus par exemple "MAC" pour le macaque" ou "AGM" pour le singe vert d'Afrique (abréviation de "African Green Mon)cey").
Une souche du rétrovirus SIV-lMac à été déposée à la C.N.C.M le 7 février 1986 sous le n I-521.
La poursuite de l'étude des rétrovirus HIV-1 et
HIV-2 a également conduit à l'obtention de séquences d'ADN complémentaires (ADNc) des ARN de leur génome. La séquence nucléotidique complète d'un ADNc d'un rétrovirus représentatif de la classe HIV-2 (HIV-2 ROD) a été déposée le 21/02/1986 à la C.N.C.M. sous le n' I-522, sous le nom de référence LAV-2 ROD.
De même, la séquence nucléotidique complète d'un
ADNc d'un rétrovirus représentatif de la classe HIV-1 est decrite par WAIN -HOBSON, SONIGO, COLE, DANOS et
ALIZON dans CEll (janvier 1985).
Egalement pour la commodité du langage, les virus du type HIV-1 et HIV-2 seront parfois désignés dans ce qui suit par l'expression HIV.
Les méthodes de diagnostic in vitro des infections par des virus du type HIV-1 ou HIV-2 existant actuellement, font appel à la détection d'anticorps
ANTI-HIV-1 ou anti-HIV-2 éventuellement présents dans un prélèvement biologique (biopsie) ou dans un fluide biologique, notamment dans un sérum obtenu, à partir du patient à l'étude, par mise en contact de ce fluide biologique avec des extraits ou antigènes d'HIV-l ou d'HIV-2, dans des conditions permettant la production d'une réaction immunologique éventuelle de ces ces extraits ou antigènes avec ces anticorps.
De telles méthodes de diagnostic risquent d'être faussement négatives, en particulier dans le cas d'une infection récente d'un individu par les virus du type
HIV.
Les techniques d'amplification génique sont d'un appoint considérable pour la mise au point de méthodes de diagnostic in vitro particulièrement sensibles de maladies virales. Parmi ces techniques d'amplification génique, on peut citer la technique PCR (Polymérase
Chain Reaction) telle que décrite dans les demandes de brevet européen n 86/302.298.4 du 27/03/1986 et n 87/300.203.4 du 09/01/1987, ou encore la technique dite "Qssreplicase" décrite dans Biotechnology, vol.6, page 1197 (octobre 1988) et celle procédant à l'aide d'une
ARN polymérase (T7RNA polymérase) décrite dans la demande de brevet international n W089/01050. Ces techniques permettent d'améliorer la sensibilité de détection des acides nucléiques des virus, et nécessitent l'utilisation d'amorces de synthèse spécifiques.
Pour la recherche des virus du type HIV, le choix des amorces est problématique. En effet, du fait de la grande variabilité des séquences de nucléotides du génome viral, une amorce conforme å la séquence connue d'un isolat donné d'un virus du type HIV peut faillir à l'amplification de certains variants viraux du type
HIV. D'autre part, même si une amorce est choisie dans une région conservée du génome d'un virus HIV à un autre, son "bon fonctionnement" n'est pas pour autant assuré et peut donner lieu à de mauvais rendements d'amplification.
La présente invention fournit précisément des amorces oligonucléotidiques permettant l'amplification, notamment à des fins diagnostiques, du génome de tous virus du type HIV et SIV, avec de bons rendements.
Les amorces de la présente invention sont å la fois spécifiques des virus du groupe HIV-1 et/ou des virus des groupes HIV-2 et SIV, et sont insensibles aux variations du génome de ces virus.
La présente invention a pour objet des amorces oligonucléotidiques, d'environ 15 à 30 nucléotides, utilisables pour l'amplification génomique des virus du type HIV-1 et/ou du type HIV-2 et SIV.
L'invention concerne toute séquence nucléotidique caractérisée en ce que sa séquence - soit est choisie parmi celles qui sont contenues dans l'une des séquences nucléiques comprises dans les gènes gag, env, nefi, nef2, vifl, vpr, vif2, vpx des génomes des virus HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod, ou SIV-MAC.
- soit (notamment pour les amorces les plus longues) contient l'une des séquences nucléiques susdites issues de HIV-1 Bru, ou HIV-1 Mal, ou HIV-1 Eli ou HIV-2 ROD ou SIVMac , ou contient une séquence nucléique complémentaire de l'une de ces dernières séquences, étant entendu que les nucléotides supplémentaires éventuels qui "débordent" la séquence nucléique du genre en question, du côté des extrémités 3' ou 5', coïncident de préférence avec ceux qui se trouvent placés en deçà des extrémités 5' ou 3' correspondant au sein même de la séquence complète des virus du type
HIV-1, HIV-2 ou de SIV MAC, sus-mentionnés, - soit, si la séquence de cette amorce n'est pas identique à l'une des séquences nucléiques susdites, ou n'est pas complémentaire de l'une de ces séquences, est néanmoins susceptible de s'hybrider avec une séquence nucléique issue des virus HIV-1 Bru,HIV-l Mal,
HIV-1 Eli, et/ou avec une séquence nucléique issue du virus HIV-2 ROD ou SIV MAC sus-mentionnée.
L'hybridation peut s'effectuer à des températures de 60'-55'C, température préconisée pour un optimum de rendement.
La numérotation des nucléotides mentionnés cidessus correspond à celle utilisée dans le manuel de référence "Human Retrovirus and AIDS-1989" édité par le "Los Alamos National Laboratory- New Mexico - USA".
(Les séquences des virus HIV-1 Mal, HIV-1 Eli ont été décrites par MONTAGNIER, SONIGO, WAIN-HOBSON et
ALIZON).
Les amorces sont synthétisées sur synthétiseur commercialisé par Applied Biosystems (méthode phosphoro-amidites).
L'invention concerne plus particulièrement les séquences oligonucléotidiques caractérisées par les enchainements nucléotidiques suivants (représentés dans le sens 5' - 3'; les initiales "S" et "AS" indiquent si l'oligonucléotide est sens ou antisens, c'est-à-dire si l'oligonucléotide est oriente respectivement dans le sens 5' - 3' ou dans le sens 3' - 5') 1 ) séquences communes aux génomes des virus HIV-1,
HIV-2 et SIV (les séries de chiffres espacées d'un trait indiquent-la position des nucléotides sur les génomes, correspondant respectivement aux virus HIV-1
Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 ROD et SIV)
séquences spécifiques du gène gag du génome des virus sus-mentionnés (gène codant pour un groupe d'antigènes spécifiques du nucléoïde de ces virus).
MMyl : TGG CGC CCG AAC AGG GAC
ou T
: S, 636-653, 635-652, 636, 653, 859-876,
834-851
MMy2 : GGC CAG GGG GAA AGA AAA A : S,854-872,864-888,848-872,1160-1184,
1124-1148
MMy3 : TGC CCA TAC AAA ATG TTT TA
ou C T T AS,900-881,916-897,900-881,1212-1193,1176-1157
MMy4 : TGC ATG GCT GCT TGA TG AS,1385-1369, 1419-1403,1385-1369, 1703-1687,1667-1651
séquences spécifiques du gène vpr
MMyl8 : GAT AGA TGG AAC AAG CCC CAG
: S,
MMyl9 : TCC ATT TCT TGC TCT CCT CTG T
: AS, 2M) séquences communes aux génomes des virus HIV-2 et
SIV (les séries de chiffres espacées d'un trait indiquent la position des nucléotides sur les génomes correspondant respectivement aux virus HIV-2 ROD, et 51V-MAC).
séquences spécifiques du gène nef2 (codant pour un facteur négatif de 27 kD)
MMyl2 : AGA GAC TCT TGC GGG CGC GTG
: S, 9165-9185,
MMyl3 : ATA TAC TTA GAA AAG GAA GAA GG
: S, 9542-9564,
MMyl3bis : CCT TCT TCC TTT TCT AAG TAT
AS, 9564-9542,
MMyl4 : AGC TGA GAC AGC AGG GAC TTT CCA
AS, 9956-9933,
séquences spécifiques du gène vif2 (codant pour un facteur d'infectiosité de 23 kD)
MMy20 : TAT GGA GGA GGA AAA GAG ATG GAT AGT
: S, MMy21 : TAG GAC TTA TTT CCC TTG CTT T
: S,
MMy2lbis : AAA GCA AGG GAA ATA AGT GCT A
: AS,
MMy22 : CCC TTG TTC ATC ATG CCA GTA T
: AS,
séquences spécifiques du gène vpx (codant pour une protéine de 12 kD)
MMy23 : ATG TCA GAT CCC AGG GAG A S,
MMy24 : CCT GGA GGG GGA GGA GGA GGA
: AS, 3p) Séquences communes aux génomes des virus HIV-1 Bru,
HIV-1 Mal, et HIV-1 Eli (les séries de chiffres espacées d'un trait indiquent la position des nucléotides sur les génomes correspondant respectivement aux virus HIV-1- Bru, HIV-1 MA1 et HIV-1 Eli).
séquences spécifiques du gene env (codant pour les protéines d'enveloppe)
MMy5 : CCA ATT CCC ATA CAT TAT TGT GCC CC
: S,6905-6930,6903-6928,6860-6885
MMy6 : AAT GGC AGT CTA GCA GAA GAA GA : S,7055-7077,7053-7075,7010-7032
MMy7 : ATC CTC AGG AGG GGA CCC AGA AAT T
: s, 7360-7384, 7349-7373,7306-7330
MMy7bis : AAT TTC TGG GTC CCC TCC TGA GGA T
: AS, 7384-7360,7373-7349,7330-7306
MMy8 : GTG CTT CCT GCT GCT CCC AAG AAC CC
: AS, 7857-7832,7846-7821,7800-7775
séquences spécifiques du gène nefi
MMy9 : ATG GGT GGC AAG TGG TCA AAA AGT AG
ou A
: S,8844-8869
MMyl0 : AAA AGA AAA GGG GGG ACT GGA
: S, 9116-9136,
MMylObis : TCC AGT CCC CCC TTT TCT TTT
: S,9136-9116
MMyll : AAA GTC CCC AGC GGA AAG TCC C AS,9503-9483,
séquences spécifiques du gène vifl
MMyl5 : GAT TAT GGA AAA CAG ATG GCA GGT GAT
: S,
MMyl6 : GCA GAC CAA CTA ATT CAT CTG TA S,
MMyl6bis : TAC AGA TGA ATT AGT TGG TCT GC
: AS,
MMyl7 : CTT AAG CTC CTC TAA AAG CTC TA
: AS,
L'invention a également pour objet les amorces possédant une structure nucléotidique complémentaire de celles des amorces définies ci-dessus.
Elle concerne également les amorces présentant certaines mutations par rapport à celles définies cidessus sans que les propriétés d'hybridation, telles que définies ci-dessus, de ces amorces soient modifiées. Le pourcentage de nucléotides différents de ceux constituant les amorces décrites ci-dessus, sans pour autant affecter les propriétés d'hybridation des amorces de l'invention, peut atteindre 40 %.
D'une manière générale, dans le cas d'une amorce (primer) sens S, un plus grand nombre de mutations seront tolérées du côté 5' que du côté 3' de l'amorce, le côté 3' devant s'hybrider parfaitement avec un brin déterminé d'une séquence nucléique pour permettre l'amplification de cette séquence. Dans le cas d'une amorce anti-sens, la tolérance est permise du côté 3'.
L'invention a également pour objet les amorces telles que définies ci-dessus et comportant une conservation d'au moins 5 bases de chaque côté, la partie médiane comportant des modifications, sans que les propriétés d'hybridation ci-dessus soient modifiées.
Une des caractéristiques des amorces oligonucléotidiques de l'invention est de donner une bande d'amplification nette, dépourvue généralement de bandes aspécifiques. Ce fait est dû à la longueur des amorces pouvant atteindre 27 bases ce qui accroît la spécificité d'hybridation, ainsi qu'aux conditions d'utilisation drastiques qui permettent d'éliminer les associations parasites. La spécificité pour chaque type de virus est fonction, outre du pourcentage d'homologie avec la matrice de référence, de la longueur des amorces, qui peuvent atteindre, pour un rendement acceptable, jusqu'à 40 bases.
L'invention s'étend également aux amorces telles que décrites ci-dessus liées au niveau de leur extrémité 5' å un promoteur pour la mise en oeuvre d'une méthode d'amplification génomique par synthèse de multiple copies d'ADN ou d'ARN telle que décrite dans la demande de brevet européenne n 88/307.102.9 du 01/08/1988.
L'invention a notamment pour objet l'utilisation des amorces décrites ci-dessus pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro de l'infection potentielle d'un individu par un virus du type HIV-1 et/ou HIV-2.
Cette méthode de diagnostic in vitro de l'invention est réalisée à partir d'un échantillon biologique (notamment un fluide biologique tel que le sérum) obtenu å partir d'un patient à l'étude, et comprend principalement les étapes suivantes - une étape d'extraction de l'acide nucléique à détecter appartenant au génome du virus du type HIV-1 et/ou HIV-2 éventuellement présent dans l'échantillon biologique sus-mentionné, et,le cas échéant, une étape de traitement à l'aide d'une transcriptase inverse dudit acide nucléique si ce dernier est sous forme d'ARN afin d'obtenir un acide nucléique double brin, - un cycle comprenant les étapes suivantes
dénaturation de l'acide nucléique double brin & détecter , ce qui conduit à la formation d'un acide nucléique simple brin,
hybridation de chacun des brins d'acide nucléique, obtenus lors de l'étape de dénaturation précédente, avec au moins une amorce selon l'invention, par mise en contact des brins sus-mentionnés avec au moins un couple d'amorces selon l'invention dans les conditions d'hybridation définies ci-dessus,
élongation des amorces le long des brins sur lesquels elles sont hybridées en présence d'un agent de polymérisation et de quatre nucléosides triphosphate (dNTP) différents, ce qui conduit à la formation d'un plus grand nombre d'acide nucléique double brin à détecter qu'à l'étape de dénaturation précédente, ce cycle étant répété un nombre de fois déterminé pour obtenir ladite séquence nucléique à détecter éventuellement présente dans l'échantillon biologique dans une proportion suffisante pour permettre sa détection, - une étape de détection de la présence éventuelle de l'acide nucléique appartenant au génome du virus du type HIV-1 et/ou HIV-2 dans l'échantillon biologique.
La méthode de diagnostic in vitro de l'invention peut être réalisée soit & partir de 1'ARN viral, soit & partir de 1'ADN complémentaire, épisomial ou intégré.
En effet, les génomes des virus HIV et SIV se présentent sous forme d'ARN ou d'ADN en fonction de la localisation du virus dans l'organisme.
Lorsque le virus est situé à l'intérieur des cellules de l'organisme, notamment à l'intérieur des cellules sanguines, son ARN est recopié en ADN par une transcriptase inverse. En revanche, le génome des virus du type HIV en milieu extracellulaire, notamment dans le sang, demeure sous forme d'ARN.
L'étape d'extraction de 1'ADN viral contenu dans les cellules de l'échantillon biologique préconisée par les inventeurs - outre la méthode classique au phénol chloroforme - présente les étapes suivantes suspension du culot cellulaire dans 0,5 ml d'eau pyrolisée dans un Potter gros piston, broyage des cellules dit par "aller et retour", adjonction Triton X100 pour 1 concentration finale de 0,1 %, dénaturation à la chaleur durant 15 minutes å 100'C, centrifugation pour éliminer les débris cellulaires,
précipitation de 1'ADN durant la nuit à -20iC par adjonction de 2,5 volumes d'éthanol absolu et de 10 % du volume final d'acétate de sodium 1 Molaire. L'ADN est ensuite récupéré puis resuspendu dans l'eau après avoir été lavé par de l'éthanol à 709.
L'étape d'extraction de 1'ARN viral est généralement effectuée de manière classique connue de l'Homme de l'art.
Après extraction de 1'ARN, une étape supplémentaire de transformation de 1'ARN, monobrin en
ADN double brin est nécessaire à effectuer lorsque le diagnostic in vitro de l'invention est réalisé & partir d'échantillons biologiques contenant les virus du type
HIV-1 et/ou HIV-2 dont les génomes sont sous forme d'ARN.
Cette transformation de 1'ARN en ADN est réalisée par traitement de 1'ARN obtenu après extraction de l'échantillon biologique, notamment du sérum, dans un milieu approprié à l'aide d'une transcriptase inverse.
L'invention a plus particulièrement pour objet une méthode de diagnostic in vitro telle que définie cidessus, dans laquelle l'étape de rétro-transcription de 1'ARN viral est réalisée de la manière suivante - 10 Mg d'ARN extrait resuspendu dans de l'eau est mis en présence du couple d'amorces à la concentration de 0,8 pM chacun, dans un volume final de 40 1.
L'ensemble est dénaturé à 100-C durant 10 minutes puis plongé dans de l'eau glacée, - l'on rajoute 10 p1 du mélange suivant : Ctl du tampon "10 X buffer" décrit ci-dessous + 1 unité de reverse-transcriptase + 1 unité de Taq-polymérase + 1 Cil du mélange des 4 dNTP à 25 mM chacun + de l'eau
Q.S.P. 10 p1. Le volume final est donc de 50 p1.
Cette réaction s'effectue en deux étapes
- a) lere étape : fabricaton de l'ADNc par action de la réverse transcriptase à 42iC durant 13 minutes,
- b) 2ème étape : amplification génique classique: on chauffe à 95iC durant 3 minutes pour détruire la réverse-transcriptase et permettre ltétape de déshybridation/hybridation, puis on démarre le cycle décrit précédemment pour l'amplification génique.
Ces - conditions originales font partie de l'invention.
Une des caractéristiques des oligonucléotides présentés est de donner une bande d'amplification nette, dépourvue généralement de bandes aspécifiques.
Ce fait est du & la longueur des primers pouvant atteindre 27 bases en ce qui nous concerne - qui accroît la spécificité d'hybridation, ainsi qu'aux conditions d'utilisation drastiques qui permettent d'éliminer les associations parasites. La spécificité pour chaque type de virus est une fonction, outre le pourcentage d'homologie avec la matrice de référence, de la longueur des amorces, qui peuvent atteindre, pour un rendement acceptable, jusqu'à 40 bases. Cela permet donc de couvrir un certain nombre de variants.
Ces conditions particulières font parties intégrantes des applications que nous préconisons, et, par conséquent de notre dépôt - hybridation : les primers doivent etre mis en présence de 1'ADN-matrice pour la lere étape de dénaturation-réassociation ; chauffage, durant 10 minutes à 100-C puis plonger les tubes dans de l'eau contenant de la glace. Les oligonucléotides doivent être utilisés à une concentration finale de 0,8 M chaque.
- amplification : le tampon d'amplification, généralement désigné sous le nom de "10 X buffer", que nous préconisons est un tampon de notre fabrication qui fait partie de ce présent dépôt. Sa composition est la suivante : Tris-HCl, pH 8,9 : 50 mM : (NH4)2 SO4 : 15 mM 1 MgC12 : 5 mM ss-mercapto-éthanol : 10 mM gélatine : 0,25 mg/ml.
La nature des cycles d'amplification fait partie des conditions optimisées pour un rendement maximum des oligonucléotides et font partie du présent dépôt : 30 & 40 cycles composés de
94C durant 10 secondes (dénaturation),
. 60 C durant 1 minute 30 (hybridation),
. 78 C durant 1 minute 30 (élongation).
Le tout sera suivi par un cycle unique à 78*C durant 15 minutes.
La concentration optimale d'ADN est de 100 à 300 ng pour de 1'ADN génomique extrait de cellules (de patients ou en culture, de mammifères ou autres).
Le tampon d'hybridation optimal (désigné "10 x buffer") utilisé dans l'étape d'hybridation du cycle comprend : Tris-HCl, pH = 8,9 : 50 mM ; (NH4)2 SO4 ; 15 mM ; MgCl2 ; 5 mM ; ss-mercapto-éthanol : 10 mM gélatine : 0,25 mg/ml.
L'utilisation de plusieurs couples d'amorces différents (ou coktails de couples) de l'invention permet soit la détection croisée de plusieurs types de virus du type
HIV et/ou SIV, soit la détection simultanée de plusieurs gènes d'un meme virus du type HIV et/ou SIV.
A titre d'exemple de couples d'amorces préférés utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer les couples d'amorces suivants -MMyl-MMy4 (650 bases), MMy2-MMy4 (538 bases), MMyl
MMy3 (265 bases), MMyl8-MMyl9 (275 bases), pour le diagnostic in vitro de l'infection par HIV-1 et/ou
HIV-2 - MMy5-MMy8 (953 bases), MMy6-MMy8 (803 bases), MMy7
MMy8 (498 bases), MMyS-MMy7bis (480 bases), MMy6
MMy7bis (330 bases), MMy9-MMyll (660 bases), MMy9
MMylObis (292 bases), MMyl5-MMyl7 (600 bases), MMyl5
MMyl6bis (335 bases), MMyl6-MMyl7 (290 bases), pour le diagnostic in vitro de l'infection d'un individu par
HIV-1, - MMy20-MMy22 (655 bases), MMy20-MMy2lbis (350 bases), MMy21-MMy22 (325 bases), MMy23-MMy24 (230 bases),
MMyl2-MMyl4 (791 bases), MMyl2-MMyl3bis (600 bases), pour le diagnostic in vitro de l'infection d'un individu par HIV-2,
L'agent de polymérisation utilisé dans l'étape d'élongation du cycle est une ADN polymérase, notamment la Taq polymérase.
D'une manière générale, le cycle de la méthode de diagnostic in vitro de l'invention est répété entre 30 et 40 fois.
Pour la méthode de diagnostic gène par gène de l'invention, on utilise les couples MMyl-MMy4, MMy2
MMy4, MMyl-MMy3 pour le gène gag, MMyl8-MMyl9 pour le gène vpr, MMys-MMy8, MMy6-MMy8, MMy7-MMy8, MMy5
MMy7bis, MMy6-MMy7bis, pour le gène env, MMy9-MMyll,
MMy9-MMylObis pour le gène nefl, MMylS-MMyl7, MMyl5
MMyl6bis, MMyl6-MMyl7, pour le gène vifl, MMy20-MMy22, MMy20-MMy21bis, MMy21-MMy22 pour vif 2, MMy23-MMy24 pour vpx, MMyl2-MMyl4, MMyl2-MMyl3bis pour nef2.
I1 est à noter que grâce à leur disposition sur le génome, les primers servant à l'amplification peuvent etre combinés de telle façon qu'ils peuvent être utilisés comme sonde, soit après marquage au 32p par kination, soit pour l'utilisation dans la technique des sondes froides pour vérifier la spécificité de la bande d'amplification observée lors d'une analyse par "Southern transfert". En plus de la combinaison classique des amorces pour qu'un 3ème oligonucléotide puisse servir de sonde interne spécifique, il est à noter le cas particulier des gènes vifl/vpr et vif2/vpx dû au chevauchement de ces gènes, ce qui permet une détection croisée. En outre, lors d'une analyse par séquençage de 1'ADN amplifié, ces oligonucléotides peuvent etre utilisés comme amorce spécifique pour la
DNA-polymérase permettant un double séquençage dans chaque sens, donc une double lecture des séquences, levant ainsi des ambiguïtés éventuelles d'interprétation.
L'invention a également pour objet les amorces, telles que définies ci-dessus, marquées, notamment de manière radioactive ou enzymatique, ainsi que leur utilisation en tant que sondes nucléotidiques, notamment dans le cadre de la méthode de diagnostic in vitro telle que décrite ci-dessus.
Les amorces de l'invention sont également utilisables pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro de l'infection de singes (macaque, singe de mangabeys ou singe vert) par le virus du type
SIV, cette méthode reprenant les principales caractéristiques de celle décrite ci-dessus.
L'invention a également pour objet des kits de diagnostic pour la mise en oeuvre des méthodes de diagnostic in vitro sus-mentionnées. A titre d'exemple, un kit de diagnostic de la présente invention comprend - au moins un couple d'amorces oligonucléotidiques selon l'invention, chaque couple comprenant une amorce s'hybridant à l'un des brins de la séquence d'acide nucléique å détecter, et une amorce s'hybridant avec le brin complémentaire de ce dernier dans les conditions définies ci-dessus, - des réactifs appropriés å la mise en oeuvre du cycle d'opérations d'amplification, notamment de 1'ADN polymérase, et quatre nucléotides triphosphate différents, et le milieu réactionnel dénommé "10 X buffer" décrit ci-dessus.
- une (ou plusieurs) sonde marquée capable de s'hybrider avec la (ou les) séquence d'acide nucléique amplifiée à détecter.
L'invention concerne aussi l'utilisation des amorces indiquées ci-dessus pour la mise en oeuvre d'un procédé de synthèse de protéines codées par les séquences nucléiques amplifiées.
L'invention a également pour objet l'utilisation des amorces oligonucléotidiques anti-sens en tant qu'agents antiviraux, notamment dans la lutte contre le
SIDA, ainsi que des compositions pharmaceutiques contenant ces amorces anti-sens en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
L'invention concerne également les compositions immunogènes consistant en produits de traduction des séquences nucléotidiques selon l'invention et les produits de traduction des séquences nucléotidiques amplifiées à partir des amorces définies selon l'invention.

Claims (20)

REVENDICATIONS
1. Séquence nucléotidique caractérisée en ce que sa séquence - soit est choisie parmi celles qui sont contenues dans l'une des séquences nucléiques comprises dans les genes gag et vpr des virus HIV-1, HIV-2 et SIV, ou dans les gènes nef2, vif2 et vpx des virus HIV-2, et SIV, ou dans les gènes env, nefl et vifl des virus HIV-1, - soit (notamment pour les amorces les plus longues) contient l'une des séquences nucléiques susdites issues de HIV-1 ou HIV-2 ou SIV, ou contient une séquence nucléique complémentaire de l'une de ces dernières séquences, étant entendu que les nucléotides supplémentaires éventuels qui "débordent" la séquence nucléique du genre en question, du côté des extrémités 3' ou 5', coincident de préférence avec ceux qui se trouvent placés en deç & des extrémités 3' ou 5' correspondant au sein même de la séquence complète des virus du type HIV-1, HIV-2 ou de SIV, sus-mentionnés, - soit, si la séquence de cette amorce n'est pas identique & l'une des séquences nucléiques susdites, ou n'est pas complémentaire de l'une de ces séquences, est néanmoins susceptible de s'hybrider avec une séquence nucléique issue des virus HIV-1, et/ou avec une séquence nucléique issue des virus HIV-2 ou SIV sus-mentionnée.
2. Séquence nucléotidique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est comprise dans les genes des virus HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, et/ou des virus HIV-2 ROD, et/ou des virus SIV MAC
3. Séquences selon la revendication 1 ou la revendication 2, contenues dans le gène gag des virus
HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 ELi, HIV-2 ROD et SIV-MAC, ces séquences etant caractérisées par les enchainement nucléotidiques suivants
MMyl : TGG CGC CCG AAC AGG GAC
ou T
: S, 636-653, 635-652, 636, 653, 859-876, 834-851
MMy2 : GGC CAG GGG GAA AGA AAA A
: S,854-872,864-888,848-872,1160-1184, 1124-1148
MMy3 : TGC CCA TAC AAA ATG TTT TA
ou C T T AS,900-881,916-897,900-881,1212-1193,1176-1157
MMy4 : TGC ATG GCT GCT TGA TG AS,1385-1369,1419-1403,1385-1369,1703-1687,1667-1651
4. Séquences selon la revendication 1 ou la revendication 2 contenues dans le gène vpr des virus
HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 ROD et SIV-MAC, ces séquences etant caractérisées par les enchaînements nucléotidiques suivants
MMyl8 : GAT AGA TGG AAC AAG CCC CAG
: S,
MMyl9 : TCC ATT TCT TGC TCT CCT CTG T
: AS.
5. Séquences selon la revendication 1 ou la revendication 2, contenues dans le gene nef2 des virus
HIV-2 ROD, et SIV-MAC, ces séquences étant caractérisées par les enchaînements nucléotîdiques suivants
MMyl2 : AGA GAC TCT TGC GGG CGC GTG
: S, 9165-9185,
MMyl3 : ATA TAC TTA GAA AAG GAA GAA GG
: S, 9542-9564,
MMyl3bis : CCT TCT TCC TTT TCT AAG TAT
AS, 9564-9542,
MMyl4 : AGC TGA GAC AGC AGG GAC TTT CCA
AS, 9956-9933,
6. Séquences selon la revendication 1 ou la revendication 2 contenues dans le gène vif2 des virus
HIV-2 ROD et SIV-MAC, ces séquences étant caractérisées par les enchainements nucléotidiques suivants
MMy20 : TAT GGA GGA GGA AAA GAG ATG GAT AGT S, MMy21 : TAG GAC TTA TTT CCC TTG CTT T
: S,
MMy2lbis : AAA GCA AGG GAA ATA AGT GCT A
: AS,
MMy22 : CCC TTG TTC ATC ATG CCA GTA T
: AS,
7. Séquences selon la revendication 1 ou la revendication 2 contenues dans le gène env des virus
HIV-1 Bru, HIV-1 Mal et HIV-1 Eli, ces séquences étant caractérisées par les enchaînements nucléotidiques suivants
MMyS : CCA ATT CCC ATA CAT TAT TGT GCC CC : S,6905-6930,6903-6928,6860-6885
MMy6 : AAT GGC AGT CTA GCA GAA GAA GA
: S,7055-7077,7053-7075,7010-7032
MMy7 : ATC CTC AGG AGG GGA CCC AGA AAT T
: S, 7360-7384, 7349-7373,7306-7330
MMy7bis : AAT TTC TGG GTC CCC TCC TGA GGA T
: AS, 7384-7360,7373-7349,7330-7306
MMy8 : GTG CTT CCT GCT GCT CCC AAG AAC CC
: AS, 7857-7832,7846-7821,7800-7775
8. Séquences selon la revendication 1 ou la revendication 2 contenues dans le gène nefl des virus
HIV-1 Bru, HIV-1 Mal et HIV-1 Eli, ces séquences étant caractérisées par les enchainements nucléotidiques suivants
MMy9 : ATG GGT GGC AAG TGG TCA AAA AGT AG
ou A S,8844-8869
MMyl0 : AAA AGA AAA GGG GGG ACT GGA
: S, 9116-9136,
MMylObis : TCC AGT CCC CCC TTT TCT TTT
: S,9136-9116
MMyll : AAA GTC CCC AGC GGA AAG TCC C
: AS,9503-9483,
9. Séquences selon la revendication 1 ou la revendication 2 contenues dans le gène vifl des virus virus HIV-1 Bru, HIV-1 Mal et HIV-1 Eli, ces séquences étant caractérisées par les enchaînements nucléotidiques suivants
MMyl5 : GAT TAT GGA AAA CAG ATG GCA GGT GAT S,
MMyl6 : GCA GAC CAA CTA ATT CAT CTG TA S,
MMyl6bis : TAC AGA TGA ATT AGT TGG TCT GC
: AS,
MMyl7 : CTT AAG CTC CTC TAA AAG CTC TA
: AS,
10. Procédé d'amplification génique de séquences nucléiques de virus du type HIV-1 et/ou HIV-2, et/ou
SIV, réalisé & partir d'un échantillon biologique, ce procédé comprenant principalement les étapes suivantes: - une étape d'extraction de l'acide nucléique å détecter appartenant au génome du virus du type HIV-1
HIV-2, ou SIV éventuellement présent dans l'échantillon biologique sus-mentionné, et,le cas échéant, une étape de traitement å l'aide d'une transcriptase inverse dudit acide nucléique si ce dernier est sous forme d'ARN, - un cycle comprenant les étapes suivantes
dénaturation de l'acide nucléique double brin å détecter , ce qui conduit å la formation d'un acide nucléique simple brin,
hybridation de chacun des brins d'acide nucléique, obtenus lors de l'étape de dénaturation précédente, avec au moins une amorce selon l'une des revendications 1 à 9, par mise en contact des brins sus-mentionnés avec au moins un couple d'amorces susmentionnées
formation å partir des amorces des ADN complémentaires aux brins sur lesquels elles sont hybridées en présence d'une ADN polymérase et de quatre nucléosides triphosphate (dNTP) différents, ce qui conduit å la formation d'un plus grand nombre d'acides nucléiques double brin å détecter qu' & l'étape de dénaturation précédente, ce cycle étant répété un nombre de fois déterminé pour obtenir ladite séquence nucléique å détecter éventuel lement présente dans l'échantillon biologique dans une proportion suffisante pour permettre sa détection, - une étape de détection de la présence éventuelle de l'acide nucléique appartenant au génome du virus du type HIV-1 et/ou HIV-2 et/ou SIV dans l'échantillon biologique.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'étape d'hybridation est réalisée å 60'C pendant 1 minute 30 secondes dans le tampon décrit dans la revendication 1.
12. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'étape d'extraction de 1'ADN viral comprend les étapes suivantes suspension du culot cellulaire dans 0,5 ml d'eau pyrolisée dans un Potter gros piston, broyage des cellules dit par "aller et retour", adjonction de Triton X100 pour 1 concentration finale de 0,1 %, dénaturation å la chaleur durant 15 minutes à 100il, centrifugation pour éliminer les débris cellulaires, . précipitation de 1'ADN durant la nuit å -20iC par adjonction de 2,5 volumes d'éthanol absolu et de 10 % du volume final d'acétate de sodium 1 Molaire.
13. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'étape de rétro-transcription de 1'ARN viral comprend les étapes suivantes - 10 Hg d'ARN extrait resuspendu dans de l'eau est mis en présence du couple d'amorces å la concentration de 0,8 pM chacun, dans un volume final de 40 1, l'ensemble est dénaturé à 100in durant 10 minutes puis plongé dans de l'eau glacée, - l'on rajoute 10 l du mélange suivant : 5 l du tampon "10 X buffer" (comprenant : Tris-HCl, pH =.8,9 50 mM ; (NH4)2 SO4 ; 15 mM ; MgCl2 , 5 mM ; ss- mercapto-éthanol : 10 mM ; gélatine : 0,25 mg/ml) + 1 unité de reverse-transcriptase + 1 unité de Taqpolymérase + 1 l du mélange des 4 dNTP à 25 mM chacun + de l'eau Q.S.P. 10 p1, la fabricaton de l'ADNc se fait par action de la réverse transcriptase à 42iC durant 13 minutes, puis on chauffe à 95 C durant 3 minutes pour détruire la réverse-transcriptase.
14. -Application de la méthode selon l'une quelconque des revendications 9 à 13 ou diagnostic in vitro de l'infection d'un individu par un virus du type
HIV-1 et/ou HIV-2, ou d'un animal par au moins l'un des trois virus (HIV-1, HIV-2, SIV).
15. Application de la méthode selon l'une quelconque des revendications 9 à 13 & l'amplification de séquences nucléotidiques des génomes des virus du type HIV ou SIV, suivie de la traduction de ces séquences amplifiées, & partir des amorces nucléotidiques selon l'une des revendications 1 à 9, en protéines.
16. Compositions immunogènes comprenant un (ou plusieurs) produit de traduction des séquences nucléiques selon l'une des revendications 1 à 9, et/ou un (ou plusieurs) produit de traduction des séquences nucléotidiques amplifiées par la méthode selon l'une des revendications 9 à 13
17. Tampon d'amplification pour la mise en oeuvre du cycle d'amplification d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisée en ce qu'il est constitué de Tris-HCl, pH 8,9 : 50 mM (NH4)2 SOx : 15 mM ; MgC12 : 5 mM , B-mercapto-éthanol 10 mM ; gélatine : 0,25 mg/ml.
18. Couples d'amorces oligonucléotidiques, pour la mise en oeuvre d'une méthode selon l'une des revendications 9 & 13, suivants
MMyl-MMy4 (fragment amplifié : 650 bases), MMy2-MMy4 (538 bases), MMyl-MMy3 (265 bases), MXyl8-MMyl9 (275 bases), MMy5-MMy8 (953 bases), MMy6-MMy8 (803 bases), MMy7-MMy8 (498 bases), MMyS-MMy7bis (480 bases), MMy6 NMy7bis (330 bases), MMy9-MMyll (660 bases), MMy9
MMylObis (292 bases), MMyl5-MMyl7 (600 bases), MMyl5
MMyl6bis (335 bases), MMyl6-MMyl7 (290 bases), MMy20
MMy22 (655 bases), MMy2O-MMy2lbis (350 bases), MMy21-
MMy22 (325 bases), MMy23-MMy24 (230 bases), MMyl2-MMyl4 (791 bases), MMyl2-MMyl3bis (600 bases).
19. Kit pour la mise en oeuvre d'une méthode selon l'une des revendications 9 d 13 comprenant - au moins un couple d'amorces oligonucléotidiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 ou selon la revendication 18, - des réactifs appropriés å la mise en oeuvre du cycle d'opérations d'amplification, notamment de 1'ADN polymérase, et quatre nucléotides triphosphate différents, et le milieu réactionnel selon la revendication 17, - une (ou plusieurs) sonde marquée capable de s'hybrider avec la (ou les) séquence d'acide nucléique amplifiée å détecter.
20. Composition pour le traitement de maladies virales, notamment du SIDA, comprenant au moins une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 å 9 en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
FR8907354A 1989-06-02 1989-06-02 Amorces oligonucleotidiques pour l'amplification du genome des retrovirus du type hiv-1, hiv-2 et siv, et leurs applications au diagnostic in vitro des infections dues a ces virus Expired - Lifetime FR2647809B1 (fr)

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