FR2614423A3 - Dosages - Google Patents
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Abstract
DISPOSITIF D'ESSAI ANALYTIQUE UTILISABLE PAR EXEMPLE POUR LE DIAGNOSTIC DE LA GROSSESSE, COMPRENANT UN BOITIER CREUX 500 CONSTRUIT EN UNE MATIERE SOLIDE IMPERMEABLE A L'HUMIDITE, TELLE QU'UNE MATIERE PLASTIQUE, CONTENANT UN SUPPORT POREUX SEC 510 QUI COMMUNIQUE INDIRECTEMENT AVEC L'EXTERIEUR DU BOITIER PAR UN ELEMENT RECEPTEUR D'ECHANTILLON ABSORBANT 506 QUI FAIT SAILLIE HORS DU BOITIER, DE TELLE SORTE QU'UN ECHANTILLON D'ESSAI LIQUIDE PEUT ETRE APPLIQUE SUR L'ELEMENT RECEPTEUR ET PENETRER A PARTIR DE CELUI-CI DANS LE SUPPORT POREUX, LE SUPPORT CONTENANT DANS UNE PREMIERE ZONE UN REACTIF DE LIAISON SPECIFIQUE MARQUE PEUT SE DEPLACER LIBREMENT DANS LE SUPPORT POREUX LORSQU'IL EST A L'ETAT HUMIDE, ET DANS UNE SECONDE ZONE SPATIALEMENT DISTINCTE DE LA PREMIERE ZONE, UN REACTIF DE LIAISON SPECIFIQUE NON MARQUE POUR LA MEME SUBSTANCE A DETECTER, LEQUEL REACTIF NON MARQUE EST IMMOBILISE DE MANIERE PERMANENTE SUR LA MATIERE DE SUPPORT ET N'EST DONC PAS MOBILE A L'ETAT HUMIDE, LES DEUX ZONES ETANT DISPOSEES DE TELLE SORTE QUE L'ECHANTILLON DE LIQUIDE APPLIQUE SUR LE SUPPORT POREUX PUISSE PENETRER EN PASSANT PAR LA PREMIERE ZONE DANS LA SECONDE ZONE, ET LE DISPOSITIF CONTENANT DES MOYENS, TELS QU'UNE OUVERTURE 508 DANS LE BOITIER, PERMETTANT D'OBSERVER LE DEGRE (EVENTUEL) AUQUEL LE REACTIF MARQUE SE LIE DANS LA SECONDE ZONE. LE DISPOSITIF COMPREND DE PREFERENCE UN CAPUCHON SEPARABLE POUR L'ELEMENT ABSORBANT FAISANT SAILLIE.
Description
DOSAGES
La présente invention concerne des dosages mettant en jeu une liaison spécifique, en particulier des dosages immunologiques. L'invention concerne en particulier des dispositifs analytiques qui conviennent pour l'utilisation à domicile, en clinique ou en cabinet médical et qui sont destinés à donner un résultat analytique qui est rapide et qui exige un degré minimum d'habileté et d'implication de l'utilisateur. L'utilisation à domicile de dispositifs d'essai pour tester la grossesse et la période féconde (ovulation) est aujourd'hui banale, et il existe dans le commerce des dispositifs et kits d'essais très divers. Les dispositifs du commerce exigent tous sans exception que l'utilisateur effectue une succession d'opérations avant que le résultat ne soit observable. Ces opérations exigent nécessairement du temps et introduisent une possibilité d'erreur. Un des buts de la présente invention est de fournir un dispositif d'essai qui soit aisément utilisable par une personne non entraînée et qui exige simplement, de préférence, qu'une partie du dispositif soit mise en contact avec l'échantillon (par exemple un courant d'urine dans le cas de l'essai de grossesse ou d'ovulation) et qu'ensuite aucune action ne soit exigée de l'utilisateur
avant qu'un résultat analytique puisse être observé.
Idéalement, le résultat analytique doit être observable dans les quelques minutes qui suivent l'application de
l'échantillon, par exemple en 10 minutes ou moins.
L'utilisation de bandes d'essai imprégnées de réactif dans des dosages par liaison spécifique, tels que
les dosages immunologiques, a été précédemment proposée.
Dans ces techniques, on applique un échantillon sur une partie de la bande d'essai et on le laisse pénétrer dans la matière de la bande, habituellement à l'aide d'un solvant d'élution tel que l'eau. En opérant ainsi, l'échantillon progresse dans et à travers une zone de la bande d'essai dans laquelle un réactif de liaison spécifique pour une substance à détecter soupçonnée d'être dans l'échantillon est immobilisé. La substance à détecter présente dans l'échantillon peut donc se lier dans la zone spécifiée. Le degré auquel la substance à détecter se lie dans cette zone peut être déterminé à l'aide de réactifs marqués qui peuvent aussi être incorporés à la bande d'essai ou appliqués ultérieurement à celle-ci. Des exemples de proposition intérieure utilisant ces principes sont donnés dans Thyroid Diagnostics Inc (GB 1589234), Boots-Celltech Diagnostics Limited (Ep 0225054), Syntex (USA) Inc (EP 0183442), et
Behringwerke AG EP 0186799.
La présente invention concerne l'adaptation et l'amélioration des techniques connues, telles que celles dont il est question dans les publications ci-dessus, pour
fournir des dispositifs d'essai diagnostic particu-
lièrement appropriés pour l'utilisation à domicile, qui sont rapides et commodes à utiliser et qui n'exigent de l'utilisateur qu'un nombre d'actions aussi faible que possible. L'invention fournit un dispositif pour l'utilisation dans le dosage d'une substance à analyser, comprenant une matière en phase solide poreuse portant dans une première zone un réactif marqué qui est retenu dans la première zone alors que la matière poreuse est à l'état sec, mais est libre de migrer à travers la matière poreuse lorsque la matière poreuse est humidifiée, par exemple par l'application d'un échantillon liquide aqueux soupçonné de contenir la substance à analyser, la matière poreuse portant dans une seconde zone, qui est spacialement distincte de la première zone, un réactif de liaison spécifique non marqué ayant une spécificité pour la substance à analyser, et qui est capable de participer avec le réactif marqué soit à une réaction "sandwich", soit à une réaction "de compétition", le réactif de liaison spécifique non marqué-étant solidement immobilisé sur la matière poreuse de telle sorte qu'il ne soit pas libre de migrer lorsque la matière poreuse est à l'état humide. L'invention fournit aussi une méthode analytique dans laquelle un dispositif tel que décrit dans le paragraphe ci-dessus est mis en contact avec un échantillon liquide aqueux soupçonné de contenir la substance à détecter, de telle sorte que l'échantillon pénètre par capillarité à travers la matière en phase solide poreuse en passant dans la première zone, dans la seconde zone, et que le réctif marqué migre avec celui-ci de la première zone à la seconde zone, la présence de la substance à détecter dans l'échantillon étant déterminée
en observant'le degré (éventuel) auquel le réactif marqué.
se lie dans la seconde zone.
Dans un mode de réalisation de l'invention, le réactif marqué est un partenaire de liaison spécifique de la substance à détecter. Le réactif marqué, la substance à détecter (si elle est présente) et le réactif de liaison spécifique non marqué immobilisé coopèrent dans une réaction "sandwich". Ceci conduit à la liaison du réactif marqué dans la seconde zone si la substance à détecter est présente dans l'échantillon. Les deux réactifs de liaison doivent avoir des spécificités pour des déterminants
antigéniques différents de la substance & détecter.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le réactif marqué est soit la substance à détecter elle-même qui a été conjuguée avec un marquage, soit un analogue de la substance à détecter, c'est-à-dire une entité chimique ayant des caractéristiques de liaison spécifiques identiques à celles de la substance à détecter, et qui a été lui aussi conjugué avec un marquage. Dans ce dernier cas, il est préférable que les propriétés de l'analogue de la substance à détecter qui influent sur sa solubilité ou sa dispersibilité dans un échantillon liquide aqueux et sur sa capacité de migrer à travers la matière en phase solide poreuse humide soit identique à celle de la substance à détecter elle-même, ou au moins très semblable. Dans ce second mode de réalisation, la substance à détecter marquée ou l'analogue de la substance à détecter migrera à travers la matière en phase solide poreuse dans la seconde zone et se liera avec le réactif immobilisé. La substance à détecter éventuellement présente dans l'échantillon entrera en compétition avec le réactif marqué dans cette réaction de liaison. Cette compétion conduira à une réduction de la quantité de liaison du réactif marqué dans la seconde zone, et à une diminution consécutive de l'intensité du signal observé dans la seconde zone par comparaison avec le signal qui est observé en l'absence de la substance à détecter dans l'échantillon. Un mode de réalisation préféré important de l'invention est le choix de la nitrocelulose comme matière de support. Celle-ci présente sur les bandes classiques, telles que le papier, cet avantage considérable qu'elle possède une capacité naturelle dese lier avec les protéines sans exiger de sensibilisation préalable. Des - réactifs de liaison spécifiques, tels que les immunoglobulines, peuvent être appliqués directement sur la nitrocellulose et immobilisés sur celle-ci. Aucun traitement chimique qui pourrait interférer avec l'activité de liaison spécifique essentielle du réactif, n'est nécessaire. Les sites de liaison non utilisés sur la nitrocellulose peuvent ensuite être bloqués en utilisant des matières simples, telles Que l'alcool polyvinylique. En outre, la nitrocellulose est facile à se procurer dans une gamme de tailles de pores, et ceci facilite le choix d'une matière de support répondant à des exigences particulières, telles que le
débit de l'échantillon.
Un autre mode de réalisation préféré important de l'invention est l'utilisation de "marques directes" fixées sur l'un des réactifs de liaison spécifiques. Des marques directes telles que des sols d'or et des sols de colorants sont déjà connues en soi. Elles peuvent être utilisées pour produire un résultat analytique instantané sans qu'il soit nécessaire d'ajouter d'autres réactifs pour développer un signal détectable. Elles sont robustes et stables et peuvent par conséquent être utilisées aisément
dans un dispositif analytique qui est stocké à l'état sec.
Leur libération par contact avec un échantillon aqueux peut être modulée, par exemple par l'utilisation de vernis
solubles.
Un aspect important de l'invention est le choix de caractéristiques techniques qui permettent d'utiliser un réactif de liaison spécifique marqué directement dans un dispositif analytique basé sur un support, par exemple basé sur un format de bande, pour donner un résultat rapide et clair. Idéalement, le résultat de l'essai doit être discernable à l'oeil, et pour facilier l'obtention de ce résultat, il est nécessaire que la marque directe se concentre dans la zone de détection. Pour y parvenir, le réactif marqué directement doit être transportable aisément et rapidement par le liquide de développement. En outre, il est préférable que la totalité du liquide échantillon de développement soit envoyé à travers une zone de détection relativement petite pour augmenter la probabilité d'obtention d'un résultat observable. Un autre aspect important de l'invention est l'utilisation d'un réactif de liaison spécifique directement marqué sur une matière de support comprenant de la nitrocellulose. La nitrocellulose a de préférence une taille de pore d'au moins 1 micron. Elle a de préférence une taille de pore non supérieure à environ 20 microns. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, la marque directe est une particule de latex colorée de forme sphérique ou quasi sphérique, ayant un diamètre maximum non supérieur à environ 0,5 micron. Un intervalle de taille idéal pour ces particules est
d'environ 0,05 à environ 0,5 micron.
Dans un autre mode de réalisation de la présente invention, la matière en phase solide poreuse est liée à un élément récepteur poreux sur lequel l'échantillon liquide peut être appliqué et à partir duquel l'échantillon peut pénétrer dans la matière en phase solide poreuse. La matière en phase solide poreuse est de préférence contenue dans un boitier ou réceptacle imperméable à l'humidité et l'élément récepteur poreux auquel la matière en phase solide poreuse est lié, s'étend hors du réceptacle et peut se comporter comme un moyen pour permettre à un échantillon liquide d'entrer dans le réceptacle et de pénétrer dans la matière en phase solide poreuse. Le réceptacle doit être muni de moyens, par exemple d'ouvertures disposées de manière appropriée, qui permettent à la seconde zone de la matière en phase solide poreuse (portant le réactif de liaison spécifique non marqué immobilisé) d'être observable de l'extérieur du réceptacle de telle sorte que l'on puisse observer le résultat de l'essai. Si on le désire, le réceptacle peut aussi être muni d'autres moyens qui permettent d'observer une autre zone de la matière en phase solide poreuse de l'extérieur du réceptacle, laquelle autre zone contient des réactifs de contrôle qui permettent d'indiquer si la procédure d'essai a été achevée. Le réceptacle est de préférence muni d'un capuchon ou d'une enveloppe protectrice séparables qui peuvent protéger l'élément récepteur poreux faisant saillie au cours du stockage avant l'utilisation. Si on le désire, le capuchon ou l'enveloppe protectrice peuvent être remis en place sur l'élément récepteur poreux faisant saillie après application de l'échantillon, pendant que la procédure
d'essai est en cours d'exécution.
Un autre mode de réalisation important de l'invention est un dispositif de détection de la grossesse comprenant un boîtier allongé creux contenant un support de nitrocellulose poreux sec qui communique indirectement avec l'extérieur du boîtier par un élément récepteur de l'urine spongieux qui fait saillie hors du bottier et qui peut se comporter comme un réservoir d'o l'urine est libérée dans le support poreux, le support contenant dans une première zone un anticorps anti-hCG hautement spécifique portant une marque "directe" colorée, l'anticorps marqué pouvant se déplacer librement dans le support poreux lorsqu'il est à l'état humide, et dans une seconde zone'spatialement distincte de la première zone, un anticorps anti-hCG non marqué hautement spécifique qui est immobilisé de manière permanente sur la matière de support et n'est donc pas mobile à l'état humide, les anticorps marqués et non-marqués ayant des spécificités pour des déterminants antigéniques de la hCG différents, les deux zones étant disposées de telle sorte qu'un échantillon d'urine appliqué sur le support poreux puisse pénétrer en passant par la première zone dans la seconde zone, et le boîtier étant construit en une matière opaque ou translucide comportant au moins une ouverture à travers laquelle le résultat analytique peut être observe, en même temps qu'un couvercle pouvant être retiré et remis en place pour l'élément spongieux récepteur de l'urine formant saillie. Un dispositif d'essai de l'ovulation, pratiquement identique à celui qui vient d'être défini, excepté que la substance à détecter est la LH, est une
alternative importante.
L'élément poreux récepteur de l'échantillon peut être constitué de n'importe quelle matière spongieuse, poreuse ou fibreuse, capable d'absorber rapidement du
liquide. La porosité de la matière peut être unidirection-
nelle (c'est-à-dire avec des pores ou fibres orientés en totalité ou en majeure partie parallèlement à un axe de l'élément) ou multidirectionnelle (omnidirectionnelle, de
sorte que l'élément a une structure en éponge amorphe).
Des matières plastiques poreuses, telles que le polypropylène, lepolyvéthvlène (de préférence de masse moléculaire très élevée), le fluorure de polyvinylidène,
l'éthylène-acétate de vinyle, l'acrylonitrile et le poly-
tétrafluoréthylène peuvent être utilisés. Il peut être
avantageux de prétraiter l'élément par un agent tensio-
actif au cours de sa fabrication, car ceci peut réduire l'hydrophobicité éventuelle inhérente à l'élément, et par conséquent, augmenter sa capacité de fixer et de délivrer un échantillon humide de manière rapide et efficace. Les éléments poreux recevant l'échantillon peuvent aussi être constitués d'un papier ou d'autres matières cellulosiques, telles que la nitrocellulose. Les matières qui sont actuellement utilisées dans les becs des stylos à pointe de fibre sont particulièrement appropriées, et ces matières peuvent être façonnées ou extrudées dans des longueurs et des sections différentes appropriées au contexte de l'invention. La matière comprenant l'élément récepteur poreux doit de préférence être choisie de telle sorte que l'élément poreux puisse être saturé de liquide aqueux en quelques secondes. La matière reste de préférence résistante lorsqu'elle est humide, et pour cette raison, le papier et les matières similaires sont moins préférés dans tous les modes de réalisation dans lesquels l'élément récepteur poreux fait saillie hors d'un réceptacle. Le liquide doit ensuite pénétrer librement de l'élément récepteur d'échantillon poreux dans la matière
en phase solide poreuse.
Si elle est présente, la zone de "contrôle" peut être conçue simplement pour transmettre à l'utilisateur un signal isolé indiquant que le dispositif a fonctionné. Par exemple, la zone de contrôle peut être chargée d'un anticorps qui se liera à l'anticorps marqué provenant de la première zone, par exemple un anticorps "anti-souris", si le corps marqué est un corps qui a été obtenu en utilisant un hybridome de murin, pour confirmer que l'échantillon a pénétré dans la bande d'essai. La zone de contrôle peut aussi contenir un réactif anhydre qui, lorsqu'il est humidifié, produit un changement de couleur ou une formation de couleur, par exemple du sulfate de cuivre anhydre qui virera au bleu lorsqu'il est humidifié par un échantillon aqueux. Une autre solution est que la zone de contrôle contienne la substance à détecter immobilisée qui réagira avec le réactif marqué en excès provenant de 'la première zone. Comme le but de la zone de contrôle est d'indiquer à l'utilisateur que l'essai a été effectué, la zone de contrôle doit être située en aval de la seconde zone dans laquelle le résultat d'essai désiré est enregistré. Un indicateur de contrôle positif indique donc à l'utilisateur que l'échantillon a pénétré sur la
distance voulue à travers le dispositif d'essai.
La marque peut être n'importe quelle entité dont la présence peut être aisément détectée. Lb marque est de préférence une marque directe, c'està-dire une entité qui, à l'état naturel, est aisément visible soit à l'oeil nu, soit à l'aide d'un filtre optique et/ou d'une simulation appliquée, par exemple d'une lumière UV pour provoquer la fluorescence. Par exemple, de minuscules particules colorées, telles que des sols de colorants, des sols métalliques (par exemple d'or), et des particules de latex (polymère coloré) sont très appropriées. La concentration de la marque dans une zone ou un volume réduits doit donner lieu à un signal aisément détectable, par exemple à une surface fortement colorée. Ceci peut être évaluée à l'oeil, ou au moyen d'instruments, si on le désire. Des marques indirectes, telles que des enzymes, par exemple une phosphatase alcaline et une peroxydase de raifort, peuvent être utilisées, mais celles-ci exigent habituellement l'addition d'un ou plusieurs réactifs de développement tels que des substrats avant qu'un signal visible puisse être détecté. Par conséquent, celles-ci sont moins préférées. Ces réactifs supplémentaires peuvent être incorporés à la matière en phase solide poreuse ou à l'élément recevant l'échantillon, s'il est présent, de telle sorte qu'il se dissolve ou de disperse dans l'échantillon liquide aqueux. Les réactifs de développement peuvent aussi être ajoutés à l'échantillon avant le contact avec la matière poreuse, ou bien la matière poreuse peut être exposée aux réactifs de développement après que la réaction de liaison a été effectuée. Dans tous les modes de réalisation de l'invention, il est essentiel que le réactif marqué de la première zone migre avec l'échantillon liquide au fur et à mesure que
celui-ci progresse de la première zone à la seconde zone.
Le courant d'échantillon continue de préférence au-delà de la seconde zone, et une quantité suffisante d'échantillon est appliquée à la matière poreuse pour que ceci puisse se produire et que tout excès de réactif marqué provenant de la première zone qui ne participe à aucune réaction de liaison dans la seconde zone soit balayé de la seconde zone par cet écoulement qui se poursuit. Si on le désire un "puits" absorbant peut être prévu & l'extrémité la plus éloignée du matériau de support. Le puits absorbant peut comprendre par exemple un papier chromatographique Whatman 3MM et doit fournit une capacité d'absorption suffisante pour permettre à tout conjugué non lié éventuellement
présent d'être éliminé par lavage de la seconde zone.
Comme alternative à ce puits, il peut être suffisant d'avoir une longueur de matériau poreux en phase solide
qui s'étende au-delà de la seconde zone.
La présence ou l'intensité du signal provenant de la marque qui se lie dans la seconde zone peut fournir une mesure qualitative ou quantitave de la substance à détecter dans l'échantillon. Plusieurs zones de détection disposées en séries sur la matière poreuse en phase solide, à travers lesquelles l'échantillon liquide aqueux peut passer progressivement, peuvent aussi être utilisées pour réaliser une mesure qualitative ou quantitative de la substance à détecter dans l'échantillon. Plusieurs zones de détection disposées en séries sur la matière poreuse en phase solide, à travers lesquelles l'échantillon liquide aqueux peut passer successivement, peuvent aussi être utilisées pour réaliser une mesure quantitative de la substance à analyser, ou peuvent être chargées individuellement de divers agents de liaison spécifiques
pour réaliser un essai multi-substances à analyser.
Le réactif de liaison particulier immobilisé dans la seconde zone est de préférence un anticorps hautement spécifique, et mieux encore, un anticorps monoclonal. Dans le mode de réalisation de l'invention mettant en jeu une réaction sandwich, le réactif marqué est également de préférence un anticorps hautement spécifique, et mieux
encore un anticorps monoclonal.
La matière de support est sous la forme d'une bande ou d'une feuille sur laquelle les réactifs sont appliqués dans des zones spatialement distinctes, et l'on fait passer l'échantillon liquide à travers la feuille ou la
bande d'un côté ou d'une extrémité & l'autre.
Si on le désire, un dispositif conforme à l'invention peut comprendre deux corps séparés de matière poreuse en phase solide ou davantage, par exemple des bandes ou feuilles séparées, portant chacune des réactifs mobiles et immobilisés. Ces corps séparés peuvent être disposés en parallèle, par exemple, de telle sorte qu'une application unique d'échantillon liquide au dispositif amorce simultanément un écoulement d'échantillon dans les corps séparés. Les résultats analytiques séparés qui peuvent être obtenus de cette manière peuvent être utilisés comme résultats témoins, ou, si l'on utilise des réactifs différents sur les divers supports, on peut effectuer une détermination simultanée de plusieurs substances à détecter dans un échantillon unique. On peut encore appliquer individuellement des échantillons multiples sur une rangée de supports et les analyser simultanément. La matière comprenant la phase solide poreuse est de préférence de la nitrocellulose. Celle-ci présente l'avantage que l'anticorps de la seconde zone peut être
immobilisé solidement sans traitement chimique préalable.
Si la matière poreuse en phase solide comprend du papier, par exemple, l'immobilisation de l'anticorps dans la seconde zone doit être effectuée par couplage chimique, en utilisant par exemple du CNBr, du carbonyldiimidazole ou
du chlorure de trésyle.
Après l'application de l'anticorps à la zone de détection, le reste de la matière poreuse en phase solide doit être traité pour bloquer tous les sites de liaison restant éventuellement ailleurs. Le blocage peut être réalisé par traitement par une protéine (par exemple de la sérum albumine de bovin ou de la protéine de lait), ou par de l'alcool polyvinylique ou de l'éthanolamine, ou
n'importe quelle association de ces agents, par exemple.
Le réactif marqué pour la première zone peut ensuite être répandu sur le support sec, et il deviendra mobile dans le support lorsqu'il sera dans un état humide. Entre chacun
de ces divers stades du procédé (sensibilisation, appli-
cation de réactifs non marqués, blocage et application du réactif marqué), la matière poreuse en phase solide doit
être séchée.
Pour aider à la libre mobilité du réactif marqué lorsque le support poreux est humecté de l'échantillon, il est préférable que le réactif marqué soit applique sur le support sous la forme d'une couche superficielle, plutôt que d'imprégner l'épaisseur du support. Ceci peut réduire au minimum l'interaction entre la matière du support et le réactif marqué. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le support est prétraité par un vernis dans la région sur laquelle le réactif marqué doit être appliqué. Le vernis peut être réalisé, par exemple, en déposant une solution aqueuse de sucre ou de cellulose, par exemple de saccharose ou de lactose, sur le support, dans la partie intéressée, et en chauffant. Le réactif marqué peut alors être appliqué sur la partie vernie. Le
reste de la matière de support ne doit pas être verni.
La matière poreuse en phase solide est de préférence une feuille de nitrocellulose ayant une taille de pore d'au moins environ 1 micron, de préférence de plus de microns, et mieux encore d'environ 8 à 12 microns. Une feuille de nitrocellulose très appropriée ayant une taille de pore nominale allant jusqu'à 12 microns environ est
vendue par la société Schleicher et Schuell GmbH.
La feuille de nitrocellulose est de préférence "renforcée', par exemple par une feuille de matière
plastique, pour augmenter sa résistance à la manipulation.
Celle-ci peut être fabriquée aisément en formant une couche mince de nitrocellulose sur une feuille de matière de renfort. La taille de pore réelle de la nitrocellulose lorsqu'elle est renforcée de cette manière tendra a être plus faible que celle de la matière non renforcée correspondante. On peut aussi prendre fortement en sandwich une feuille de nitrocellulose préformée entre deux feuilles de support de matière solide, par exemple des feuilles de
matière plastique.
Il est préférable que le débit d'un échantillon aqueux à travers la matière poreuse en phase solide soit tel que dans la matière non traitée, le liquide aqueux migre avec un débit de 1 cm en pas plus de deux minutes, mais des débits plus lents peuvent être utilisés si on le désire. La séparation spatiale entre les zones, et les caractéristiques de débit de la matière de support poreuse, peuvent être choisies pour permettre des temps de réaction adéquats au cours desquels la liaison spécifique nécessaire peut se produire, et pour permettre au réactif marqué présent dans la première zone de se dissoudre ou de se disperser dans l'échantillon liquide et de migrer à travers le support. Une autre manière de maitriser ces paramètres consiste à incorporer des modificateurs de viscosité (par exemple des sucres et des celluloses modifiées) à l'échantillon pour ralentir la migration du réactif. Le réactif immobilisé présent dans la seconde zone imprègne de préférence toute l'épaisseur du support dans la seconde zone (par exemple toute l'épaisseur de la feuille ou de la bande si.le support est sous cette forme). Une telle imprégnation peut augmenter le degré auquel le réactif immobilisé peut capturer une substance à détecter éventuellement présente dans l'échantillon migrant. Les réactifs peuvent être appliqués à la matière de support de diverses manière. Diverses techniques d'impression" ont été précédemment proposées pour l'application de réactifs liquides sur des supports, par exemple des micro-seringues, des plumes utilisant des o10 pompes doseuses, une impression directe et une impression par jets d'encre, et l'on peut utiliser dans le contexte de la présente invention l'une quelconque de ces techniques. Pour faciliter sa fabrication, le support (par exemple la feuille) peut être traité par des réactifs, puis divisé en portions plus petites (par exemple en petites bandes étroites renfermant les zones contenant le réactif nécessaires) pour donner plusieurs unités de
support identiques.
A titre d'exemple uniquement, on décrira à présent en détail certains modes de réalisation préférés de
l'invention en se référant aux dessins annexés.
Mode de réalisation 1 Les figures 1 et 2 représentent une bande typique de matière poreuse en phase solide destinée à être utilisée dans un essai de dosage conforme à l'invention, et
illustre les principes de base de l'invention.
Dans la figure 1, la bande d'essai de dosage 10 est représentée sous la forme d'une bande rectangulaire ayant
(aux fins de cette description) son axe longitudinal en position verticale. Une bande étroite ou zone 12 s'étendant sur toute la
largeur de la bande est adjacente à l'extrémité inférieure 11 de la bande 10. Une petite région 13 de la bande 10 est située verticalement audessous de la zone 12. Au-dessus de la zone 12 se trouve une seconde zone 14 à une certaine distance sur la bande 10, et s'étendant elle aussi sur toute la largeur de la bande. La région 15 de la bande 10 entre les zones 12 et 14 peut avoir n'importe quelle hauteur pour autant que les deux zones sont séparées. Une autre région 16 de la bande s'étend au-dessus de la zone 14, et au sommet 17 de la bande se trouve un tampon poreux 18 fixé solidement à la bande 10 de telle sorte que le tampon 18 puisse jouer le rôle de "puits" pour tout échantillon liquide qui peut
monter par capillarité dans la bande 10.
La zone 12 est chargée d'un premier anticorps portant une marque visible ("directe") (par exemple des particules de latex colorées, un sol de colorants ou un sol d'or). Ce réactif peut migrer librement & travers la bande en présence d'un échantillon de liquide. Dans la zone 14, la bande est imprégnée d'un second anticorps présentant une spécificité pour un déterminant antigénique différent sur la même,substance à détecter que le premier anticorps. Le second anticorps est solidement immobilisé
sur la bande.
La figure 2 illustre ce qui se produit lorsque la
bande d'essai est utilisée dans une procédure analytique.
L'extrémité inférieure 11 de la bande sèche est mise en contact avec un échantillon de liquide (non représenté), qui peut contenir la substance à déterminer. La capillarité fait monter le fluide à travers la bande, et celui-ci atteint finalement le tampon 18. En opérant ainsi, l'échantillon traverse la zone 12 et l'anticorps marqué se dissoudra ou se dispersera dans l'échantillon et migrera avec lui à travers la bande. Lorsqu'il migre en direction de la zone 14, l'anticorps marqué peut se lier à toute substance à détecter présente dans l'échantillon. En atteingnant la zone 14, toute molécule de substance à détecter présente doit se lier au second anticorps, immobilisant ainsi le "sandwich" marqué ainsi produit. Si une concentration importante de la substance à déterminer est présente dans l'échantillon de liquide, il se produira en peu de temps une nette accumulation de la marque
visible dans la zone 14.
Comme exemple d'une analyse à laquelle se mode de réalisation peut être appliqué, la substance à détecter peut être hCG, les réactifs des zones 12 et 14 peuvent être des anticorps monoclonaux pour hCG qui peuvent participer à une réaction "sandwich" avec hCG, et la marque peut être un colorant particulaire, un sol d'or ou
des particules de latex colorées.
Bien que la description ci-dessus se réfère à une
réaction "sandwich", il apparaitra aisément au lecteur spécialiste que celle-ci peut être remplacée si on le désire par une réaction de la forme "compétition", le réactif marqué présent dans la zone 12 étant la substance
à détecter ou un analogue de la substance à détecter.
Un essai basé sur les principes ci-dessus peut être utilisé pour déterminer une grande variété de substances à détecter en choisissant des réactifs de liaison spécifiques appropriés. Les substances à détecter peuvent
par exemple être des protéines, des haptènes, des immuno-
globulines, des hormones, des polynucléotides, des stéroides, des médicaments, des agents infectieux (par exemple d'origine bactérienne ou virale) tels que Streptoccus, Neisseria et Chlamydia. Des essais sandwich peuvent par exemple être effectués pour des substances à détecter telles que hCG, LH et des agents infectieux, tandis que des essais de compétition peuvent par exemple être effectués pour des substances à détecter telles que
E-3-G et P-3-G.
La détermination de la présence (éventuelle) de plusieurs substances à détecter dans l'échantillon peut avoir une utilisé clinique importante. Par exemple, le rapport des taux d'apolipoprotéines A1 et B peut indiquer une sensibilité à l'insuffisance coronarienne. De même, le t. rapport des taux d'hémoglobine glycatée (glycated) (HbA) à l'hémoglobine non glycatée (HbAo) ou totale (Hb) peut aider au traitement du diabète. En outre, il est possible de concevoir des essais pour mesurer simultanément deux stéroide, par exemple E-3-G et P-3-G. A titre d'exemple,
un essai pour deux substances à détecter pour les apolipo-
protéines A1 et B peut être préparé en déposant, en tant que zones spatialement distinctes, un anticorps spécifique de l'apolipoprotéine A1 sur la totalité d'une première zone et en déposant un second anticorps spécifique de l'apolipoprotéine B, sur la totalité de la seconde zone d'une matrice de support poreux. Après l'application des deux anticorps sur chacune de leurs zones respectives par une technique d'application appropriée (par exemple impression par jet d'encre, pompe doseuse et plume, ou pinceau à air), le reste de la matière poreuse doit être traité par un réactif, par exemple la sérum albumine de bovin, l'alcool polyvinylique ou l'éthanolamine,. pour bloquer les sites de liaison restant éventuellement ailleurs. Un troisième et un quatrième réactifs, portant une marque, peuvent alors être répandus sur le support sec dans une ou plusieurs zones au voisinage d'une extrémité de la bande, en laissant la bande séchée entre les applications des deux réactifs sur la même zone. Le réactif 3 et le réactif 4 peuvent comprendre des conjugués de l'anticorps anti-apolipoprotéine A1 et de l'anticorps antiapolipoprotéine B, respectivement. Ces deux conjugués deviendront mobiles dans et sur le support lorsqu'il sera à l'état humide. Les réactifs 3 et 4 peuvent migrer avec le courant de solvant lorsqu'on applique un échantillon
aqueux à la première extrémité de la bande de suppor.
Pendant qu'il migre en direction des zones plus loin le long de la bande, le réactif 3 peut lier l'apolipoprotéine A1 éventuellement présente dans l'échantillon et le réactif 4 peut lier l'apolipoprotéine B éventuellement 19' présente dans l'échantillon. Lorsqu'elles atteignent la première zone du second anticorps (zone de l'anticorps
anti-apolipoprotéine A1), les molécules d'anti-apolipo-
protéine A1 doivent se lier au second anticorps, immobilisant le "sandwich" marqué ainsi produit. Aucune molécule d'apolipoprotéine B marquée ne se liera à cette première zone. Lorsqu'elles atteignent la seconde zone du second anticorps (zone de l'anticorps antiapolipoprotéine B), les molécules d'apolipoprotéine B éventuellement présentes se lieront au second anticorps (anticorps en phase solide), immobilisant le "sandwich" marqué ainsi produit. Aucune molécule d'apolipoprotéine A1 marquée ne se liera à la seconde zone. Une accumulation de chacune des marques directes peut se produire sur les deux zones ou sur l'une d'entre elles à un degré plus ou moins élevé, conduisant à un signal visible à l'une ou l'autre des zones d'anticorps en phase solide ou aux deux. Un excès de conjugué non lié (des deux réactifs 3 et 4) peut passer librement sur les deux zones d'anticorps et sera éliminé
par lavage à l'extrémité la plus éloignée de la bande.
Le développement d'une couleur quantifiable dans les deux zones de second anticorps peut être établi par une forme appropriée d'instrumentation, donnant un rapport de
densité de couleur entre les deux sites.
La détermination de la présence de plus de deux substances à détecter (c'est-à-dire de substances à détecter multiples) dans n'importe quel échantillon peut avoir une utilité clinique importante. Par exemple, la détection de la présence de divers sérotypes différents d'une bactérie ou la détection de la présence de marqueurs sérologiques solubles chez l'homme peut être utile. A titre d'exemple, un essai de substances à détecter multiples pour la détection de la présence de sérotypes différents de Streptococcus peut être préparé pour les groupes A, B, C et D. Un cocktail d'anticorps monoclonaux, chacun étant spécifique de divers sérotypes de groupe pathologiquement importants, ou un antisérum polyclonal contre un groupe particulier de Streptococcus, peut être répandu sur la bande de supports poreux sous la forme d'une ligne s'étendant sur la largeur de la bande sur une longueur de zone d'environ 1 mm. Des lignes multiples peuvent être déposées dans des zones spatialement séparées, chaque zone contenant un ou plusieurs constituants immuno chimiquement réactifs, capables de lier la substance à détecter intéressante. Après l'application des zones multiples par une technique d'application appropriée (par exemple impression par jet d'encre, pompe doseuse et plume, brosse & air), le reste de la matière poreuse doit être traité par un réactif (par exemple la sérum albumine de bovin, l'alcool polyvinylique, l'éthanolamine) pour bloquer les sites de liaison restant éventuellement ailleurs. Des conjugués de marquage, par exemple un sol de colorants, et chacun des constituant immuno chimiquement réactifs spécifiques de chaque groupe bactérien peuvent alors être répandus soit sur une zone unique à l'extrémité inférieure de la bande la plus rapprochée de la zone d'application de l'échantillon, soit sous la forme d'une série de zone séparées. Les figures 3, 4 et 5 des dessins annexés représentent un dispositif complet utilisant une bande poreuse telle qu'elle vient d'être décrite ci-dessus. La figure 3 représente le dispositif complet vu de devant, la figure 4 montre le même dispositif en coupe partielle pour révéler les détails de l'intérieur de la bande, et la
figure 5 représente le côté inférieur du dispositif.
Dans la figure 3, le dispositif comprend un corps rectangulaire plat 30 dont la face frontale 31 est percée d'un trou ou d'une fenêtre 32 qui révèle la bande d'essai poreuse 10 présente dans le corps. La région de la bande d'essai 10 visible à travers la fenêtre 32 contient une
zone horizontale étroite 14.
Dans la figure 4, le dispositif comprend une bande d'essai rectangulaire sèche 10 fabriquée à partir d'un matériau poreux qui s'étend de l'extrémité inférieure 33 du corps 30 à l'intérieur du corps entre l'avant 31 et l'arrière 34 du corps. Au voisinage de l'extrémité inférieure 11 de la bande 10 se trouve une zone horizontale 12 portant un réactif de liaison spécifique marqué pour une substance à détecter, le réactif de liaison étant mobile dans la bande d'essai à l'état humide. Plus haut sur la bande d'essai, se trouve la zone horizontale étroite 14 qui est visible à travers la fenêtre 32. Au sommet 17 de la bande d'essai 10 se trouve un "puits" poreux 18 qui peut absorber tout échantillon
liquide qui est monté jusqu'en haut de la bande.
Dans la figure 5, le bord inférieur 35 du corps 30 est percé d'une ouverture latérale dans laquelle se trouve
l'extrémité inférieure 11 de la bande.
En fonctionnement, l'extrémité inférieure 33 du corps 30 est plongée dans un échantillon liquide (par exemple de l'urine) de telle sorte que l'échantillon de liquide peut être absorbé par l'extrémité inférieure 11 de la bande d'essai 20 et monte par capillarité au sommet 17 de la bande d'essai et dans le puits 18. En opérant ainsi, l'échantillon de liquide progresse en passant par la zone 12 vers la zone 14. Des réactions de liaison spécifiques telles que décrites ci-dessus se produisent, et le résultat de l'essai est visible à l'utilisateur par la
fenêtre 32.
Mode de réalisation 2 Les figures 6 et 7 des dessins annexés illustrent un autre dispositif d'essai conforme à l'invention. La figure 6 représente le dispositif complet vu de devant, et la figure 7 représente le même dispositif en coupe partielle pour révéler des détails de la bande d'essai poreuse
contenue à l'intérieur du corps du dispositif.
Sur la figure 6, le dispositif comprend un corps allongé 200 se terminant à son extrémité inférieure 201 dans un petit réceptacle 202 qui en fait partie intégrante, lequel peut contenir un volume déterminé d'un échantillon de liquide, par exemple d'urine. La face frontale 203 du corps 200 est percée de deux petites ouvertures ou fenêtres carrées 204 et 205 placées l'une
au-dessus de l'autre.
Sur la figure 7, la partie allongée du corps 200 est creuse et contient une bande d'essai 206 occupant presque toute la hauteur du corps. Cette bande d'essai est d'une construction similaire à celle décrite à propos du mode de réalisation 1, et elle contient au voisinage de son extrémité inférieure 207 une zone horizontale 208 portant un réactif de liaison spécifique marqué qui peut migrer librement dans la bande à l'état humide. Deux zones circulaires 209 et 210 sont adjacentes aux fenêtres 204 et 205 et sont visibles à travers celles-ci. La bande se termine à son extrémité supérieure 211 dans un puits poreux 212. A l'extrémité inférieure 201 du dispositif, le réceptacle 202 communique avec le corps creux par une
ouverture latérale 213.
En fonctionnement, un échantillon de liquide est appliqué à l'extrémité inférieure du dispositif et un volume déterminé de l'échantillon remplit le réceptacle 202. Du réceptacle 202, l'échantillon de liquide monte par capillarité à travers la bande d'essai 206 et transporte le réactif marqué de la zone 208 vers les deux zones circulaires 209 et 210. Il se produit une série de réactions de liaison spécifiques telles que décrites & propos du mode de réalisation 1. Dans ce mode de réalisation, la seconde zone circulaire 210 peut servir de témoin (en donnant lieu, par exemple, à un signal coloré, que l'échantillon contienne ou non la substance à déterminer) et la détermination de la substance à déterminer s'effectue dans la première zone circulaire 209. L'utilisateur peut déterminer si la substance à détecter est présente dans l'échantillon en comparant le
signal produit dans les deux zones.
Par exemple, si l'essai est utilisé pour déterminer la présence de hCG dans l'urine au cours d'un essai de grossesse, la zone témoin circulaire 210 peut contenir de 1'HCG immobilisée qui liera un anticorps marqué qui est transporté vers le haut depuis la zone 208 par l'échantillon de liquide migrant. Le même anticorps marqué peut entrer dans une réaction "sandwich" avec l'hCG présente dans l'échantillon et être lié dans la première zone circulaire 209 par un autre anticorps anti-hCG spécifique qui y est immobilisé. Si on le désire, la zone "témoin" peut être simplement destinée à transporter un signal indépendant indiquant à l'utilisateur que le dispositif a fonctionné. Par exemple, la seconde zone circulaire peut être chargée d'un anticorps qui se liera à l'anticorps marqué provenant de la zone 208, par exemple un anticorps "anti-souris" si l'anticorps marqué est un anticorps qui a été obtenu en utilisant un hybridome de murin, pour confirmer que l'échantillon a pénétré dans la
bande d'essai.
Mode de réalisation 3 La figure 8 des dessins annexés représente une vue isométrique d'un dispositif d'essai conforme à l'invention, et la figure 9 représente une élévation latérale en coupe du dispositif représenté dans la figure 8. Sur la figure 8, le dispositif comprend un réceptacle ou boîtier'500 de forme rectangulaire allongée ayant à une extrémité 501 une partie 502 de section transversale réduite.. Un capuchon 503 peut être fixé sur la partie 502 et peut buter contre l'épaulement 504 à l'extrémité 501 du réceptacle. Le capuchon 503 est montré séparé du réceptacle 500. Un élément poreux 506 s'étend au-delà de l'extrémité 505 de la partie 502. Lorsque le capuchon 503 est adapté sur la partie 502 du réceptacle, il recouvre l'élément poreux 506. La phase supérieure 507
du réceptacle 500 est percée de 12 ouvertures 508 et 509.
Sur la figure 2, on peut voir que le réceptacle 500 est de construction creuse. Un élément poreux 506 s'étend dans le réceptacle 500 et vient au contact d'une bande de matière de support poreuse 510. L'élément poreux 506 et la bande 510 se recouvrent pour garantir qu'il existe un contact adéquat entre les deux matières et qu'un échantillon de liquide appliqué sur l'élément 506 peut pénétrer dans l'élément 506 et progresser dans la bande 510. La bande 510 s'étend plus loin dans le réceptacle 500. La bande 510 est "renforcée" par une bande de support 511 formée d'une matière plastique transparente, imperméable à l'humidité. La bande 510 s'étend au-delà des ouvertures 508 et 509. Dans le réceptacle 500, des moyens sont constitués par les nervures 510 et 513 pour maintenir solidement en place la bande 510. A cet égard, les détails de construction interne du réceptacle ne sont pas un aspect important de l'invention pour autant que la bande est maintenue solidement en place dans le réceptacle, et que l'élément poreux 506 est solidement retenu dans le réceptacle et qu'un contact perméable fluide adéquat est maintenu entre l'élément 506 et la bande 510. La bande de renfort transparente 511 se trouve entre la bande 510 et les ouvertures 508 et 509, et elle peut se comporter comme une protection hermétique contre la pénétration d'humidité de l'extérieur du réceptacle 500 par ces ouvertures. Si on le désire, l'espace résiduel 514 dans le réceptacle peut contenir une matière absorbant l'humidité, telle que du gel de silice, pour aider & maintenir la bande 510 à l'état sec au cours du stockage. Les zones contenant des réactifs dans la bande 510 ne sont pas représentées sur la figure 8, mais la première zone contenant le réactif marqué qui est mobile lorsque la bande est humectée se trouvera dans la région entre l'élément poreux 506 et
l'ouverture 508. La seconde zone contenant le réactif non -
marqué immobilisé se trouvera dans la région exposée à travers l'ouverture 508 pour que lorsque le dispositif a été utilisé dans un essai, le résultat puisse être observé à travers l'ouverture 508. L'ouverture 509 constitue un moyen grâce auquel une zone témoin contenant d'autres réactifs qui peuvent permettre une perméation adéquate de
l'échantillon à travers la bande peut être observée.
En fonctionnement, le capuchon protecteur 503 est retiré du support et l'élément 506 est exposé à un échantillon liquide, par exemple en le plaçant dans un courant d'urine dans le cas d'un essai de grossesse. Après avoir exposé l'élément 506 à l'échantillon de liquide pendant un temps suffisant pour s'assurer que l'élément 506 est saturé de l'échantillon, le capuchon 503 peut être remis en place et le dispositif être mis de côté par l'utilisateur pendant un temps approprié (par exemple 2 ou 3 min.), pendant que l'échantillon pénètre dans la bande d'essai 510 pour donner le résulat analytique. Après le temps approprié, l'utilisateur peut observer la bande d'essai à travers les ouvertures 508 et 509 et peut s'assurer que le dosage est terminé en observant la zone témoin à travers l'ouverture 509, et il peut s'assurer du résultat de l'essai en observant la seconde zone à travers
l'ouverture 508.
Au cours de la fabrication, le dispositif peut aisément être assemblé, par exemple à partir de matière plastique, le réceptacle 500 étant moulé en deux parties (par exemple les moitiés supérieures et inférieures 515 et
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516) qui peuvent être fixées solidement l'une à l'autre (par exemple par soudage par ultrason) après que l'élément et la bande d'essai ont été placés dans l'une des moitiés, puis prises en sandwich entre les deux moitiés. L'acte de formation de cette construction sandwich peut être utilisé pour "plisser" l'élément poreux et la bande d'essai ensemble pour assurer un contact adéquat entre eux. Le capuchon 503 peut être moulé sous la forme d'un article complet séparé. Si on le désire, les ouvertures 508 et 509 peuvent être munies de pièces d'insertion transparentes qui peuvent assurer une plus grande sécurité contre la pénétration d'humidité étrangère de l'extérieur du réceptacle. En réalisant une adaptation hermétique entre l'extrémité 505 du réceptacle 500 et l'élément poreux faisant saillie 506, l'application de l'échantillon sur l'élément faisant saillie ne conduira à ce que l'échantillon pénètre directement dans le dispositif et court-circuite l'élément 506. L'élément 506 constitue donc la seule voie d'accès pour l'échantillon vers la bande présente dans le réceptacle, et il peut délivrer l'échantillon à la bande d'une manière contrôlée. Le dispositif dans son ensemble combine par conséquent les
fonctions d'échantillonneur et d'analyseur.
En utilisant les matières de bande d'essai et les réactifs tels que décrits ci-après, on peut fabriquer un dispositif conforme aux figures 8 et 9 qui est éminemment approprié à, l'utilisation comme nécessaire d'essai de grossesse ou comme nécessaire de la période de fécondité pour l'utilisation à domicile ou en clinique. Il suffit que l'utilisateur applique un échantillon d'urine sur l'élément poreux exposé, puis (après avoir éventuellement remis en place le capuchon) observe le résultat de l'essai
à travers l'ouverture 508 au bout de quelques minutes.
Bien qu'il soit décrit en se référant particulière-
ment aux essais de grossesse et aux essais de période de fécondité, on notera que le dispositif tel qu'il vient d'être décrit, peut être utilisé pour déterminer la présence d'une grande variété de substances à détecter si des réactifs appropriés sont incorporés à la bande d'essai. On notera en outre que l'ouverture 509 est superflue et peut être omise si la bande d'essai ne contient pas de moyen de contrôle. En outre, la forme générale du réceptacle et du capuchon, en ce qui concerne leur longueur, leur section transversale et leurs autres caractéristiques physiques, peut être sujette à des variations considérables sans que l'on s'écarte de
l'esprit de l'invention.
Une option supplémentaire est l'omission du réactif marqué de la bande d'essai, ce réactif étant ajouté à l'échantillon avant l'application de l'échantillon sur le dispositif d'essai. Le réactif marqué peut aussi être
contenu dans l'élément poreux faisant saillie 506.
La figure 10 des dessins annexes montre une vue agrandie de l'élément récepteur poreux et de la bande d'essai dans le dispositif illustré sur les figures 8 et 9. L'élément récepteur poreux 506 est lié à la bande d'essai poreuse 510, renforcée par la feuille de matière plastique transparente 511, de telle sorte que du liquide peut s'écouler dans la direction indiquée par les flèches à travers l'élément récepteur poreux et dans la bande poreuse. La' zone d'essai 517 contient le réactif de liaison spécifique immobilisé, et la zone témoin 518 contient un réactif destiné à indiquer que l'échantillon a pénétré sur une distance suffisante le long de la bande d'essai. Une partie de la surface de la bande d'essai opposée à la bande de renfort 511 et adjacente à l'élément récepteur poreux 506, porte un vernis 519 sur lequel est déposé une couche 520 de réactif de liaison spécifique marqué. L'épaisseur de ces deux couches telles que représentées sur la figure 10 est exégérément grossie à titre de simple illustration. On notera que dans la pratique, le vernis peut ne pas former une véritable couche superficielle et que la matière du vernis pénétrera dans une certaine mesure dans l'épaisseur de la bande. De même, le réactif marqué ultérieurement appliqué peut également pénétrer dans la bande. Cependant, l'objectif essentiel de la réduction de toute interaction entre le réactif marqué et la matière de support formant la bande sera atteint. Un échantillon aqueux déposé dans l'élément récepteur 506 peut s'écouler de celui-ci selon la longueur de la bande 510 et se faisant, il dissoudra le vernis 519 et mobilisera le réactif marqué, et il entraînera le réactif marqué le long de la bande et à travers la zone 517. Mode de réalisation 4 Les figures 11 et 12 illustrent un autre mode de réalisation de l'invention, que l'on voit en plan sur la figure 11 et en coupe sur la figure 12, la section transversale étant une élévation sur la ligne A de la
figure 11.
Sur la figure 11, le dispositif d'essai comprend un boitier rectangulaire plat 600 percé d'une ouverture rectangulaire centrale 601, adjacente à l'extrémité gauche 602, et deux autres ouvertures 603 et 604 adjacentes au milieu du dispositif, et disposées de telle sorte que les ouvertures 601, 603 et 604 soient sur l'axe longitudinal central du dispositf correspondant à la ligne A. Bien que ces trois ouvertures soient toutes représentées comme rectangulaires, leur forme effective n'est pas déterminante. En ce qui concerne la section transversale représentée sur la figure 12, le dispositif est creux et contient a l'intérieur un élément récepteur d'échantillon poreux adjacent à l'extrémite 602 et situé juste au-dessous de l'ouverture 601. Une bande d'essai de construction similaire à celle décrite à propos du mode de réalisation 4, comprenant une bandeporeuse 606 renforcée par une feuille de matière plastique transparente 607 est également contenue dans le bottier 600 et s'étend de l'élément récepteur creux 602 avec lequel le support poreux est en contact perméable liquide, jusqu'à l'extrémité opposée du boitier. La feuille de renfort transparente 607 est fermement en contact avec la face interne supérieure 608 du boîtier 600 et constitue une protection hermétique contre les ouvertures 603 et 604 pour éviter la pénétration d'humidité ou d'échantillons dans le boîtier. Bien que non représentée sur les dessins, la bande d'essai poreuse 606 contiendra un réactif de liaison spécifique marqué, et une zone d'essai et une zone témoin placées de manière appropriée par rapport aux ouvertures 603 et 604, d'une manière analogue à celle
décrite dans le mode de réalisation 3.
En fonctionnement, un échantillon aqueux peut être appliqué par l'ouverture 601, par exemple au moyen d'une
seringue, pour saturer l'élément récepteur poreux 605.
Puis l'échantillon aqueux peut pénétrer dans la bande d'essai, et au bout d'un temps approprié, le résultat de l'essai peut être observé à travers les ouvertures 603 et 604. Mode de réalisation 5 Un autre mode de réalisation de l'invention est
représenté sup les figures 13 et 14 des dessins annexés.
La figure 13 représente un dispositif comprenant un boîtier rectangulaire 700 dont la surface supérieure 701 est percée d'une ouverture rectangulaire 702. Une paroi d'extrémité 703 du dispositif 700 est percée d'une ouverture 704 à travers laquelle un élément d'essai poreux communique avec l'extérieur du dispositif. L'ouverture 707 est située à la surface 701, en un point relativement
éloigné de l'extrémité 703 contenant l'ouverture 704.
La figure 14 représente une vue en coupe partielle du dispositif de la figure 13. Le dispositif creux contient une bande d'essai poreuse 705, s'étendant sur presque toute la longueur du boîtier 700 à partir de l'ouverture 704. La bande d'essai 705 contient une première zone 706 contenant un réactif de liaison spécifique marqué, et une autre zone 707, éloignée de l'ouverture 704, contenant un réactif' spécifique immobilisé. La zone 706 est située juste au-dessous de l'ouverture 702 et peut donc être observée de l'extérieur du boitier. Au-dessous de la bande 705 et d'une zone adjacente 707, se trouve un élément. pouvant être écrasé 708 contenant un ou plusieurs substrats ou réactifs. qui peuvent être utiliséspour produire un signal détectable lorsqu'ils sont libérés dans la zone 707, si le réactif marqué provenant de 706 s'est lié dans la zone 707 après l'utilisation du dispositif. La libération des réactifs de l'élément 708 peut être effectuée en appliquant une pression sur l'extérieur du boitier en ce point, pour
écraser l'élément et en exprimer le réactif.
En fonctionnement, le premier élément d'essai peut être exposé à un échantillon aqueux, par exemple en plongeant l'extrémité 703 du boîtier 700 dans un récipient contenant l'échantillon. L'échantillon de liquide pénétrera alors dans la longueur de la bande d'essai 705, entrainant lé réactif marqué de la zone 706 et traversant la zone 707 o le réactif marqué devient lié, par exemple par une réaction "sandwich" mettant en jeu une substance à détecter dans l'échantillon. Lorsque l'échantillon a traversé la bande d'essai, le réactif peut être libéré de l'élément pouvant être écrasé 708 et le résultat de
l'essai être observé par l'ouverture 702.
A titre d'exemple seulement, on décrira à présent certaines matières de bande d'essai, certains réactifs et
certains procédés pour leur production préférés.
1. Choix d'une matière conductrice du liquide Des exemples représentatifs de matières conduisant les liquides comprennent le papier, des membranes de nitrocellulose et de nylon. Des caractéristiques essentielles de la matière sont sa capacité de lier les protéines; la vitesse de conduction du liquide; et, si nécessaire après un prétraitement, sa capacité de permettre le passage d'anticorps marqués le long de la bande. S'il s'agit d'une marque directe, il peut être souhaitable que la matière permette l'écoulement de particules d'une taille allant jusqu'à quelques microns (habituellement moins de 0,5 p). De exemples des débits obtenus avec diverses matières sont donnés ci-dessous: taille des Temps pour un pores écoulement de mm (min.) Nitrocellulose Schleicher + Schuell (non renforcée) 3 1 3,40
5 J 3,30
8 p 3,00 12 j 2,20 Renforcée de polyester 8 j (nominale) 3,40 Nitrocellulose Pall Whatman 5 19,20 "Immunodyne" (nylon) 3 4,00
3,20
La vitesse d'une procédure d'essai sera déterminée par le débit, de la matière utilisée, et bien que l'on puisse utiliser n'importe laquelle des matières ci-dessus, certaines d'entre elles donneront des essais plus rapides
que d'autres.
La nitrocellulose a l'avantage de ne pas exiger d'activation et elle immobilisera fortement les protéines par absorption. L"'immunodyne" est préactivée et n'exige pas de traitement chimique. Des papiers tels que le papier Whatman 3MM, exige une activation chimique, par exemple avec du carbonyldiimidazole, pour immobiliser avec succès l'anticorps. 2. Marques Préparation de marques Un choix de marques qui peuvent être utilisées sont
décrites ci-dessous. Cette liste n'est pas exhaustive.
A) Préparation d'un sol d'or Les sols d'or peuvent se préparer pour l'utilisation dans un essai immunologique à partir d'un or colloidal du commerce, et d'une préparation d'anticorps telle qu'une
gonadotrophine chorionique humaine anti-alpha.
Par exemple, l'or colloidal G20 (taille de particule nm, fourni par la société Janssen Life Sciences Products) est ajusté à pH 7 avec du K2CO3 0, 1M filtré à 0,22 p, et on en introduit 20 ml dans un becher de verre
propre. On ajoute au sol d'or 200 1il d'anticorps hCG anti-
alpha préparé dans un tampon borax 2mM à pH 9 à 1 mg/ml, et filtré à 0,22 a, et on agite le mélange en continu pendant 2 min. On utilise du K2CO3 0, 1M pour ajuster le pH du mélange anticorps-sol d'or à 9, et l'on ajoute 2 ml de
BSA à 10 % (P/V).
On purifie le mélange anticorps-or dans une série de trois stades de centrifugation à 12000 g, pendant 30 min., et à 4 C, seule la partie lâche du culot de centrifugation étant remise en suspension pour une utilisation ultérieure. Le culot final est remis en suspension dans de
la BSA à 1 % (P/V) dans du Tris 20mM, NaCl 150 mM, pH 8,2.
B) Préparation d'un sol de colorants On peut préparer des sols de colorants à partir de colorants hydrophobes du commerce tels que le Bleu Foron SRP (Sandoz) et le Bleu Resolin BBLS (Bayer). On disperse g de colorant dans 1 litre d'eau distillée en mélangeant sur un agitateur magnétique pendant 2 à 3 min. Le fractionnement de la dispersion de colorant peut être effectué au moyen d'un stade de centrifugation initial à 1500 g pendant 10 min. à la température ambiante pour éliminer les particules de sol les plus grandes sous la forme d'un culot solide, le liquide surnageant (suspension A) étant conservé pour une autre centrifugation. La suspension A est centrifugée à 3000 g pendant min. à la température ambiante, le liquide surnageant étant jeté et le culot étant remis en suspension dans 500 ml d'eau distillée. Ces opérations sont répétées trois fois supplémentaires, le culot final étant remis en
suspension dans 100 ml d'eau distillée.
Les spectres des sols de colorants préparés comme il a été décrit cidessus peuvent être mesurés, ils donnent des valeurs de lambdamax d'environ 657 nm pour le Bleu Foron, et 690 nm pour le Bleu Resolin. L'absorbance à lambda-max, pour un trajet de 1 cm, est utilisée comme mesure arbitraire de la concentration en sol de colorant; C) Particules colorées on trouve dans le commerce des particules de latex
(polymère) pour l'utilisation dans des essais immuno-
logiques. Celles-ci peuvent être à base de toute une série de polymères synthétiques tels que le polystyrène, le polyvinyltoluène, le polystyrèneacide acrylique et la polyacroléine. Les monomères utilisés sont normalement insolubles dans l'eau, et sont émulsionnés dans un agent tensioactif aqueux, de telle sorte qu'il se forme des mycelles de monomères qui sont ensuite amenés à se polymériser par addition d'un agent d'amorçage à l'émulsion. Il se forme ces particules de polymères
pratiquement sphériques.
Des particules de latex colorées peuvent être produites soit par incorporation d'un colorant approprié,
tel que l'anthraquinone, à l'émulsion avant la polyméri-
sation, soit par coloration des particules préformées.
Dans cette dernière voie, le colorant doit être dissous dans un solvant non miscible à l'eau, tel que le chloroforme, qui est ensuite ajouté à une suspension aqueuse des particules de latex. Les particules fixent le solvant non aqueux et le colorant, et peuvent alors être séchées. Ces particules de latex ont de préférence une
dimension maximale inférieure & environ 0,5 micron.
Les particules de latex peuvent être sensibilisées avec une protéine et en particulier un anticorps, pour donner des réactifs pour l'utilisation dans des essais immunologiques. Par exemple, des perles de polystyrène d'environ 0,3 micron de diamètre (fournies par les Polymer Laboratories) peuvent être sensibilisées avec de la gonadotrophine chorionique humaine anti-alpha, dans le procédé décrit ci-dessous: on dilue 0,5 ml (12,5 mg de matières solides) de suspension avec 1 ml de tampon borate 0,1M, pH 8, 5, dans un flacon d'Eppendorf. On lave ces particules quatre fois dans du tampon borate, chaque lavage consistant en une
centrifugation de 3 min. à 13.000 t/min. dans une micro-
centrifugeuse MSE, à la température ambiante. Le culot final est remis en suspension dans 1 ml de tampon borate, mélangé avec 300 lg d'un anticorps anti-hCG alpha, et l'on bascule la suspension pendant 16 & 20 heures à la
température ambiante. On centrifuge la suspension anti-
corps-latex pendant 5 min. à 13.000 t/min., on jette le liquide surnageant et on remet le culot en suspension dans 1,5 ml de tampon borate contenant 0,5 mg de sérum albumine de bovin. Après basculement pendant 30 min. à la température ambiante, on lave la suspension trois fois dans 5 mg/ml de BSA dans une solution saline tamponnée au
phosphate à pH 7,2, par centrifugation à 13.000 t/min.
pendant 5 min. On remet le culot en suspension dans mg/ml de BSA/glycérol à 5 % (P/v) dans une solution saline tamponnée au phosphate à pH 7,2 et on le stocke à
4'C jusqu'à son utilisation.
(A) Préparation anti-hCG-sol de colorants La protéine peut être couplée.à un sol de colorants dans un procédé mettant en jeu une adsorption passive. La protéine peut par exemple être une préparation d'anticorps
telle qu'une gonadotrophine chorionique humaine anti-
alpha préparée dans une solution saline tamponnée au phosphate à pH 7,4 à 2 mg/ml. On prépare un mélange réactionnel qui contient 100 J1 de solution d'anticorps, 2 ml de sol de colorants, 2 ml de tampon phosphate 0,lM à pH 5,8 et 15,9 ml d'eau distillée. Après avoir agité doucement cette solution, on laisse la préparation pendant min. à la température ambiante. Les sites de liaison en excès peuvent être bloqués par addition, par exemple, de sérum albumine de bovin: on ajoute 4 ml de solution de BSA à 150 mg/ml dans du NaCl 5 mM à pH 7,4, et au bout de min. d'incubation à la température ambiante, on centrifuge la solution à 3000 g pendant 10 min., et on remet le culot en suspension dans 10 ml de dextrane à 0,25 % (P/V)/lactoce à 0,5 % (P/V) dans du tampon phosphate 0, 04M. Pour stocker ce conjugué anticorps-sol de colorants, le mieux est de le stocker sous forme lyophilisée. (B) Préparation LH-sol de colorants En raison de l'homologie de structure entre les sous-unités alpha de l'hCG et la LH, l'anticorps alpha hCG peut être utilisé pour détecter la LH dans un essai immunologique,à réaction croisée. Ainsi, on peut préparer un anticorps marqué pour l'utilisation dans un dosage de LH d'une manière identique à celle décrite dans l'exemple
1, en utilisant un anticorps anti-hCG alpha.
3. Préparation de la bande de réactif Imprégnation par zone des matières conductrices de liquide La matière conductrice de liquide portant une zone limitée de protéine immobilisée, en particulier d'anticorps, peut se préparer, par exemple, comme suit: On peut former une zone de réaction sur une feuille rectangulaire de nitrocellulose de 8 p renforcée de Schleicher et Schuell mesurant 25 cm de long et 20 cm de large en appliquant une ligne de matière d'environ 1 mm de large à des intervalles de 5 cm sur sa longueur et s'étendant sur toute sa largeur de 20 cm. La matière peut
par exemple être une préparation d'anticorps convena-
blement choisis telle qu'une gonadotrophine chorionique humaine anti-bêta d'une affinité Ka de 109 préparée dans une solution saline tamponnée au phosphate à pH 7,4 à 2 mg/ml, convenant pour un dosage immunologique de la gonadotrophine chorionique humaine en utilisant un second anticorps anti-hCG (marqué) dans un format sandwich. Cette solution peut être déposée au moyen d'une micro-seringue commandée par un microprocesseur, qui délivre des volumes précis de réactif à travers une buse, de préférence de 2 mm de diamètre. Après avoir laissé la matière appliquée sécher pendant 1 heure à la température ambiante, on bloque les sites de liaison en excès sur la nitrocellulose avec un composé inerte tel que l'alcool polyvinylique (1 % P/V dans du tampon Tris 20 mM, pH 7,4) pendant 30 min. à la température ambiante, et on rince soigneusement les feuilles avec de l'eau distillée avant de les sécher
pendant 30 min. à 30'C.
Dans un mode de réalisation, la matière conductrice de liquide 'peut alors être découpée en de nombreuses bandes de 5 cm de long et de 1 cm de large, chaque bande portant une zone limitée de l'anticorps immobilisé pour faire office d'immunosorbant sur une partie (par exemple la moitié de sa longueur). Dans cet exemple, la bande d'essai est utilisée avec une marque liquide qui est mélangée à l'échantillon. Dans l'utilisation, cette zone limitée devient alors une zone de réaction d'essai dans laquelle les réactions de dosages immunologiques s'effectuent. Dans un autre mode de réalisation, la marque peut être dispensée/déposée dans/sur une zone limitée avant de découper la matière conductrice de liquide en bandes. A
titre d'exemple, ce réactif peut être un anticorps anti-
hCG conjugué à un sol de colorants ou à un polymère de colorants préparé comme il a été décrit à propos de la préparation du sol de colorants, ce réactif étant retenu dans la zone dans laquelle la matière est à l'état sec, mais qui est libre de migrer à travers la matière de support lorsque la matière est humectée, par exemple par application d'un échantillon de liquide contenant la substance à déterminer. Cette zone de réactif mobile est appliquée par exemple comme suit: on prépare comme il a été décrit précédemment, une feuille de nitrocellulose de 8 p renforcée Schleicher et Schuell, de 25 cm de long et de 20 cm de large, avec des zones d'anticorps immobilisées à des intervalles de 5 cm sur sa longueur. Avant le dépôt d'anticorps marqués par un colorant, on applique au moyen d'une brosse à air, sur le système commandé par microprocesseur, à des intervalles de 6 cm sur la longueur de la feuille, une sous-couche, par
exemple de saccharose à 60 % P/V dans de l'eau distillée.
* Puis, on applique au moyen d'une brosse à air ou d'une micro-seringue, directement sur la sous-couche, plusieurs passes (par exemple trois) d'un anticorps marqué par un colorant préparé dans du méthacel KAM (marque commerciale d'une méthylcellulose de la Dow Chemical Company) à 1 % et 0, 6 % (P/V) d'alcool polyvinylique. On laisse alors les feuilles sécher et on les découpe en bandes de 5 cm de long et de 1 cm de large, pour les utiliser dans le
dispositif terminé.
Des sols d'or ou des marques de polystyrène colorées
peuvent être déposés par un procédé similaire.
En plus de la zone d'essai, on peut effectuer divers choix de zones de contrôle. Par exemple, une zone d'IgG
anti-espèce peut être déposée après la zone d'essai. -
4. Essais sandwich en utilisant un format de bande Une réaction du type sandwich peut être effectuée pour la détection de la gonadotrophine chorionique humaine (hCG) dans un échantillon de liquide. La marque utilisée est de préférence une marque directe qui est aisément lisible à l'oeil nu. Des sols de colorants, des sols d'or ou des particules de latex colorées peuvent être liés à
l'anticorps anti-hCG, comme il a été décrit ci-dessus.
Avec des marques directes, on peut effectuer des essais dans lesquels des échantillons d'urine fraîche sont appliqués directement depuis le courant d'urine, ou en délivrant un volume approprié (par exemple 100 il) à partir d'un récipient en utilisant une pipette sur la mèche absorbante du dispositif d'essai. On laisse écouler chaque échantillon pendant 5 min. dans le dispositif, et on lie la couleur produite dans la zone réactive soit a
l'oeil, soit en utilisant un réflectomètre à lumière.
Des marques indirectes telles que des enzymes, par exemple la phosphatase alcaline, peuvent également être utilisées, mais elles exigent l'addition de substrats pour
produire un point final coloré.
Des essais enzymatiques peuvent être effectués, dans lesquels l'anticorps anti-hCG est conjugué à la phosphatase 'alcaline, en utilisant des techniques classiques, et dilué à 1/100 dans une solution saline tamponnée au phosphate 0,01M, pH 7, contenant du polyéthylèneglycol 6000 à 3 %, 1 % de sérum albumine de bovin (P/V) et 0,02 % de Triton X305 (marque commerciale, vendu par la société Rohm et Haas) avant l'application sur la feuille. Des échantillons d'urine fraiche sont ensuite appliqués, soit directement depuis le courant d'urine, soit en délivrant un volume approprié (par exemple 100 jpl) à partir d'un récipient, en utilisant une pipette, sur la mèche absorbante du dispositif d'essai. On laisse chaque échantillon s'écouler pendant 5 min. avant de mettre un tampon d'une matière gonflant dans les liquides, plongé dans du substrat BCIP (A 1 mg/ml dans du tampon Tris 1M/
HCl, pH 9,8) en contact avec la zone d'anticorps immobile.
Après 5 min. supplémentaires, on retire le tampon, et on lit la couleur produite soit à l'oeil, soit en utilisant
un réflectomètre à lumière.
Un mode de réalisation similaire peut être préparé en utilisant l'hormone lutéinisante (LH) à la place de 1'hCG. 5. Essais compétitifs On peut effectuer un essai du type compétitif, par exemple celui de l'oestrone-3glucuronide, un métabolite
urinaire de l'oestrone. Des conjugués d'oestrone-3-
glucuronide et de sérum albumine de bovin sont préparés comme suit: Préparation de BSA oestrone-3-glucuronide La conjugaison de 1'E-3-G et de la BSA peut être réalisée en utilisant un anhydride mixte. Toute la verrerie, les solvants et les réactifs utilisés dans la préparation de l'espèce activée doivent être soigneusement séchés en utilisant une étuve, un dessicateur ou des tamis moléculaires, suivant les besoins, pendant au moins 24 heures.
Des solutions d'E-3-G (2 nM) dans du diméthyl-
formamide sec (DMF) et de la tri-n-butylamine (TnB) (10nM) dans du DMF sec sont équilibrées séparément à 40C. En utilisant de la verrerie prérefroidie, on ajoute de 1'E-3-G dans du DMF (1,25 ml) et du TnB dans du DMF (0,25 ml) à un Reactivial de 5 ml prérefroidi contenant un
agitateur magnétique. On prépare une solution de chloro-
formiate d'isobutyle dans du DMF sec (10 nrM), on en refroidit à 49C une partie aliquote (0,25 ml) et on l'ajoute au Reactivial. On agite pendant 20 min. à 4'C le contenu du Reactivial et on prépare une solution de BSA (1 mg/ml) dans un tampon bicarbonate (0,5 %). Lorsque l'incubation de l'anhydride mixte est terminée, on ajoute le contenu du Reactivial à la solution de BSA (2,5 ml) et on l'agite sur un agitateur magnétique pendant 4 heures à 4'C. On purifie la préparation conjuguée par passage à travers une colonne G-25 Sephadex PD-10 Pharmacia équilibrée avec un tampon Tris, on la fait passer dans un
flacon de stockage en verre ambré et on la stocke à 4'C.
Préparation de BSA - E-3-G sol de colorants On prépare une dispersion de colorants (5 % P/V) avec mélange intime et on en centrifuge des parties aliquotes à 3850 t/min. (1500 g) pendant 10 min. dans une centrifuge de laboratoire. On jette le culot de centrifugation, on conserve le liquide surnageant et on le centrifuge par parties aliquotes à 4850 t/min. (3000 g) pendant 10 min. dans une centrifugeuse de laboratoire. On jette le liquide surnageant et on remet le culot en suspension dans la moitié de son volume initial dans de l'eau distillée. On répète cette opération 4 fois pour laver le culot. On remet finalement le culot en suspension dans de l'eau distillée et on détermine son absorbance à *lambda-max. On mélange des solutions de sol de colorants dans de l'eau distillée et de conjugué E-3-G/BSA dilué dans du tampon phosphate pour donner des concentrations finales de lg/ml de conjugué (par rapport à la teneur en BSA) et une densité optique du sol de colorant extrapolé de 20 au maximum d'absorbance. On fait incuber le mélange réactionnel pendant 15 min. A la température ambiante et on le bloque pendant 15 min. à la température ambiante avec de la BSA dans une solution de NaCl (5 mM, pH 7,4),
ce qui donne une concentration finale en BSA de 25 mg/ml.
On centrifuge le mélange réactionnel à 4850 t/min.
(3000 g) pendant 10 min. dans une centrifugeuse de laboratoire, on jette le liquide surnageant et on remet le culot en suspension dans la moitiéde son volume initial de dextrane (0,25 % P/V)/lactose (0,5 % P/V) phosphate (0,04M, pH 5,8). Préparation de bandes d'essai d'E-3-G On dépose des anticorps anti-E-3-G comme il a été décrit dans l'exemple 3. On dépose la BSA-E-3-G-sol de
colorants sur les bandes comme il a été décrit en 3.
Détermination de l'E-3-G En utilisant les réactifs décrits ci-dessus, on peut dresser une courbe d'étalonnage en faisant passer sur les bandes des échantillons ayant des concentrations connues en E-3-G. La couleur sur la zone immobile peut être lue, par exemple en utilisant un chromamètre Minolta, et la concentration de 1'E-3-G peut être calculée en extrapolant
à partir de la valeur de la réflectance.
L'invention décrite dans le présent mémoire s'étend à toutes ses modifications et variantes telles qu'elles apparaîtront au lecteur spécialiste, et s'étend également à toutes les combinaisons et souscombinaisons des
caractéristiques de cette description et des dessins
annexes.
Claims (17)
1. Dispositif d'essai analytique, caractérisé par le fait qu'il comprend un bottier creux (500) construit en une matière solide imperméable à l'humidité, contenant un support poreux sec (510) qui communique directement ou indirectement avec l'extérieur du bottier, de telle sorte qu'un échantillon d'essai liquide puisse être appliqué sur le support poreux, le support contenant dans une première zone un réactif de liaison spécifique marqué pour une - 10 substance à détecter, lequel réactif de liaison spécifique marqué peut se mouvoir librement dans le support poreux lorsqu'il est à l'état humide, et dans une seconde zone spatialement distincte de la première zone, un réactif de liaison spécifique non marqué pour la même substance à détecter, lequel réactif non marqué est immobilisé de manière permanente sur la matière de support et n'est par conséquent pas mobile dans l'état humide, les deux zones étant disposées de telle sorte que l'échantillon de liquide appliqué sur le support poreux puisse pénétrer en passant par le première zone dans la seconde zone, et le dispositif contenant des moyens permettant d'observer le degré (éventuel) auquel le réactif marqué se lie dans la
seconde zone.
2. Dispositif d'essai selon la revendication 1, caractérisé par le fait que 1l marque sur le premier
réactif de liaison spécifique est une marque directe.
3. Dispositif d'essai selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que le bottier est construit en une matière opaque ou translucide, et est muni au moins d'une ouverture (508) à travers laquelle le résultat
analytique peut être observé.
4. Dispositif d'essai selon l'une quelconque des
revendications précédentes, caractérisé par le fait que le
support poreux (510) communique avec l'extérieur du dispositif par un élément récepteur d'échantillon, absorbant (506), qui fait saillie hors du bottier et qui peut agir comme réservoir pour recevoir l'échantillon
liquide et le libérer dans le support poreux.
5. Dispositif d'essai selon la revendication 4, caractérisé par le fait qu'il contient un couvercle imperméable à l'humidité, pouvant être retiré et remis en place (503) pour l'élément récepteur d'échantillons
absorbant, faisant saillie (506).
6. Dispositif d'essai selon l'une quelconque des
revendications précédentes, caractérisé par le fait que le
boîtier et le couvercle, s'il est présent, sont moulés en
matière plastique.
7. Dispositif d'essai selon l'une quelconque des
revendications précédentes, caractérisé par le fait que le
support poreux comprend une bande ou feuille d'une matière poreuse (510) renforcée d'une couche (511) d'une matière imperméable à l'humidité, transparente, la couche transparente étant en contact avec l'intérieur du boîtier dans une position adjacente à l'ouverture ou aux ouvertures pour empêcher la pénétration d'humidité ou d'échantillons.
8. Dispositif d'essai selon la revendication 7, caractérisé par le fait que la matière de support poreuse
est de la nitrocellulose.
9. Dispositif d'essai selon la revendication 8, caractérisé par le fait que la nitrocellulose a une taille
de pore supérieure à environ 1 micron.
10. Dispositif d'essai selon l'une quelconque des
revendications précédentes, caractérisé par le fait que la
marque comprend des particules de latex colorées ayant une
dimension maximale non supérieure à environ 0,5 micron.
11. Dispositif d'essai selon l'une quelconque des
revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il
contient une zone de contrôle en aval de la seconde zone dans le support poreux, pour indiquer que l'échantillon de liquide a pénétré au-delà de la seconde zone, la zone de contrôle pouvant également être observée de l'extérieur du boîtier.
12. Dispositif d'essai selon l'une quelconque des
revendications précédentes, caractérisé par le fait que la
substance à détecter est l'hCG.
13. Dispositif d'essai selon l'une quelconque des
revendications 1 & 11, caractérisé par le fait que la
substance à détecter est la LH.
14. Bande d'essai utilisable dans un dosage de liaison spécifique, caractérisée par le fait qu'elle comprend une couche (510) de nitrocellulose renforcée
d'une couche (511) de matière solide imperméable à l'eau.
15. Bande d'essai selon la revendication 15, caractérisé par le fait que la couche de renfort comprend
une matière plastique transparente.
16. Dispositif d'essai de grossesse, caractérisé par le fait qu'il comprend un boîtier allongé creux contenant un support de nitrocellulose poreux sec qui communique indirectement avec l'extérieur du boîtier par un élément récepteur d'urine absorbant qui fait saillie hors du boitier et qui peut agir comme un réservoir à partir duquel l'urine est relâchée dans le support poreux, le support contenant dans une première zone un anticorps anti-hCG hautement spécifique portant une marque "directe" colorée, l'anticorps marqué pouvant se mouvoir librement dans le support poreux lorsqu'il est à l'état humide, et dans une seconde zone spatialement distincte de la première zone, un anticorps anti-hCG non marqué hautement spécifique, qui est immobilisé de manière permanente sur la matière de support et qui n'est donc pas mobile dans l'état humide, les anticorps marqués et non marqués ayant des spécificités pour des déterminants antigéniques hCG différents, les deux zones étant disposées de telle sorte qu'un échantillon d'urine appliqué sur le support poreux puisse pénétrer en passant par la première zone dans la seconde zone, et le bottier étant construit en une matière opaque ou translucide, contenant au moins une ouverture à travers laquelle le résultat analytique peut être observe, en même temps qu'un couvercle pouvant être retiré et remis en place pour l'élément récepteur d'urine absorbant
faisant saillie.
17. Dispositif d'essai de l'ovulation, selon la revendication 16, excepté que la substance à détecter est
la LH.
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