FR2604436A1 - Clonage des genes bioa, biod, biof de bacillus sphaericus, vecteurs et cellules transformes et procede de preparation de la biotine - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENTION CONCERNE NOTAMMENT UNE SEQUENCE D'ADN CORRESPONDANT A L'UN DES GENES SUIVANTS DE LA CHAINE DE BIOSYNTHESE DE LA BIOTINE CHEZ LES BACTERIES : GENE BIOA, GENE BIOD ET GENE BIOF. DES VECTEURS COMPORTANT CES SEQUENCES PERMETTENT DE TRANSFORMER D'AUTRES MICROORGANISMES AFIN D'AMELIORER LA PRODUCTION DE BIOTINE.
Description
La présente invention concerne la préparation de la biotine par fermentation en utilisant la technique des ADN recombinants.
La biotine est une vitamine nécessaire pour l'homme, les animaux, les plantes et pour certains microorganismes.
Elle a été isolée du jaune d'oeuf et on en trouve dans la levure de bière, les céréales, différents organes, sous forme libre ou combinée à des protéines.
Cette vitamine a été notamment proposée comme régulateur du métabolisme cutané, notamment dans le traitement des dermites séborrhéiques chez l'homme,
Outre les différentes sources qui ont été rappelées précédemment, la biotine est synthétisée par certains microorganismes, en particulier des microorganismes du genre Bacillus tel que Bacillus sphaericus.
Outre les différentes sources qui ont été rappelées précédemment, la biotine est synthétisée par certains microorganismes, en particulier des microorganismes du genre Bacillus tel que Bacillus sphaericus.
La figure 1 schématise la chaîne de biosynthèse de la biotine à partir de l'acide pimélique dans ce type de microorganisme. Cette chaîne de biosynthèse comprend 5 étapes enzymatiques différentes dans lesquelles les gènes mis en oeuvre sont dénommés successivement bioC, bioF, bioA, bioD et bioB.
L'étude systématique de la production de la biotine à partir de l'acide pimélique au cours de fermentations industrielles a montré que certains microorganismes, particulièrement ceux appartenant au genre
Bacillus sphaericus, hyperproduisent des vitamères de la biotine de même que la biotine (on appellera ci-après "vitamères" les différents intermédiaires conduisant à la biotine).
Bacillus sphaericus, hyperproduisent des vitamères de la biotine de même que la biotine (on appellera ci-après "vitamères" les différents intermédiaires conduisant à la biotine).
Pour ces bactéries, parmi les précurseurs de la biotine, le DTB (desthiobiotine) représente le composant prédominant qui est produit en quantité beaucoup plus grande que la molécule finale : la biotine.
Il existe un fort contrôle de transcription réprimant la synthèse de la biotine qui dépend de la quantité de biotine présente dans le milieu de culture ; cette répression intervient dans E. coli de même que dans
Bacillus sphaericus.
Bacillus sphaericus.
Mais aucune inhibition par "feed back" ne régule la biosynthèse de la biotine dans E. coli et jamais un tel contrôle n'a été décrit dans
Bacillus sphaericus.
Bacillus sphaericus.
L'explication complète de la production d'une très grande quantité de DTB (pour une quantité faible de biotine) à partir de l'acide pimélique dans Bacillus sphaericus nécessite encore une étude de biologie moléculaire très importante sur l'organisation et la régulation de la voie de biosynthèse de la biotine dans cette bactérie.
Les études préliminaires de certaines des enzymes biosynthétiques extraites et semi-purifiées à partir de souches de B. sphaericus produisant le DTB ne révèlent pas de différences marquantes avec les enzymes de la biotine bien connues dans E. coli.
Néanmoins, la production de biotine par fermentation industrielle de telles souches de Bacillus sphaericus (IFO 3525, NCIB 9370) pourrait devenir compétitive avec les procédés chimiques existants si le rendement en biotine était amélioré. De façon à atteindre ce but, il serait intéressant d'obtenir une hyperexpression constitutive de tous les gènes biosynthétiques de la biotine dns C Sç3UCheS.
On a, bien entendu, décrit la sélection de souches de E. coli déréprimées, soit par leur résistance aux analogues de la biotine tels que- l'alpha-déhydrobiotine, soit par sélection de mutants hyper sécréteurs de biotine. I1 a également été décrit des mutations "cis dominantes" qui agissent de façon plélotrope sur la synthèse de tous les gènes de la biotine organisés en un un opéron bipolaire. Des mutations agissant en trans ont également été mentionnées, bien que, en plus de leur pouvoir d'abolir le contrôle de la transcription des gènes de la biotine, ells ont souvent des propriétés plélotropes qui peuvent se répercuter sur la physiologie générale de la cellule.
Ces méthodes de sélection microbiologique traditionnelle peuvent aussi être appliquées aux souches de Bacillus sphaericus produisant du DTB, si l'on émet l'hypothèse que le -contrôle moléculaire de la biosynthèse de la biotine et l'organisation générale des gènes de la biotine sont les mêmes que dans E. coli.
Au-delà de toutes ces hypothèses, I'utilisation de souches mutantes dans des fermentations industrielles importantes et en culture continue nécessite la sélection de mutants présentant un très faible taux de réversion, ce qui représente une tâche difficile étant donné l'absence actuelle de méthodes d'analyse génétique fine chez Bacillus sphaericus.
Une autre approche pourrait consister à cloner tous les gènes de la chaîne de biosynthèse de la biotine à partir d'une souche de Bacillus sphaericus produisant du DTB, puis à modifier, in vitro, la région de contrôle en 5' de façon à supprimer le contrôle de transcription.
En outre, le clonage et la manipulation in vitro de ces gènes permettraient l'étude de leur organisation générale et l'amélioration de leur transcription in vivo, par des techniques de génie génétique qui sont connues, impliquant en particulier l'utilisation de promoteurs forts, connus pour être fonctionnels dans les souches de Bacillus sphaericus.
La réintroduction de tous ces gènes hyperexprimés et qui ne seraient plus régulés par la biotine (mais qui seraient régulés de façon inductible en utilisant, par exemple, une induction par une augmentation de température ou par un substrat peu onéreux) dans la souche originale de
Bacillus sphaericus pourrait alors être mise en oeuvre en utilisant les techniques connues de transformation, de transduction ou de conjugaisonmobilisation.
Bacillus sphaericus pourrait alors être mise en oeuvre en utilisant les techniques connues de transformation, de transduction ou de conjugaisonmobilisation.
On peut également envisager l'introduction de ces gènes dans des différents microorganismes qui sont connus pour être acceptables dans l'industrie alimentaire et qui sont perméables à l'acide pimélique, par exemple Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae ou des souches de
Pseudomonas.
Pseudomonas.
Enfin, la stabilisation de ces informations génétiques dans les microorganismes pourrait être réalisée par une intégration dirigée dans les chromosomes ou par une autosélection de plasmides tel que cela est décrit, par exemple, dans le brevet français nO 84 12598.
Le clonage et la caractérisation du gène bioB de Bacillus sphaericus ont déjà été décrits dans les brevets JP-A-166 992/85 du 29 juillet 1985, 3P-A-66 532/86 du 25 mars 1986 et JP-A-95 724/86 du 24 avril 1986.
Plus particulièrement, la présente invention concerne les séquences d'ADN codant pour l'enzyme produit de l'un des gènes suivants de la chaîne de biosynthèse de la biotine chez les bactéries - gène bioA - gène bioD, et - gène bioF.
Ces séquences d'ADN selon l'invention sont liées sous forme de "cluster" avec le gène bioB qui avait été précédemment identifié et l'ensemble couvre donc la plus grande partie de la chaîne de biosynthèse de la biotine.
Bien que les séquences d'ADN mentionnées précédemment puissent être d'origine diverse, on préferera utiliser les séquences provenant d'une souche de Bacillus, en particulier d'une souche de Bacillus sphaericus.
Comme cela a été indiqué précédemment, il est particulièrement intéressant que ces séquences d'ADN soient dépourvues des séquences naturelles assurant le contrôle de la transcription des enzymes de la voie de biosynthèse de la biotine chez la bactérie d'origine afin d'abolir la régulation naturelle due à la biotine et de placer ces séquences d'ADN sous le contrôle d'éléments choisis, qui assureront leur transcription efficace dans la souche hôte.
L'invention concerne, en particulier, to;Jt ou partie des séquences qui sont représentées dans les figures 4 à 8 et qui codent pour l'un des gènes mentionnés précédemment.
Les séquences d'ADN selon la présente invention peuvent être utilisées de différentes façons.
Tout d'abord, ces séquences peuvent être introduites dans un vecteur plasmidique présentant ou non une origine de réplication efficace dans la cellule hôte.
Lorsque le vecteur plasmidique est non réplicable, il comporte de préférence des séquences d'ADN permettant son intégration chromosomique dans la souche hôte ; pour ce faire, ces séquences doivent être homologues de séquences déjà présentes dans le génome de la souche à transformer. Ces séquences homologues peuvent etre naturelles, c'est-à-dire se trouver dans le chromosome, ou bien y avoir été introduites par un plasmide d'intégration, ce dernier type de plasmide comportant en général un gène de résistance à un antibiotique et un gène marqueur sous la dépendance d'un promoteur de la souche à transformer.
Dans le cadre de la présente invention, le vecteur plasmidique d'intégration est plus particulièrement le plasmide pTG475 qui sera décrit ci-après et qui comporte notamment un promoteur inductible.
Lorsque le vecteur comporte une origine de réplication autonome, les séquences d'ADN codant pour les enzymes mentionnées précédemment seront, de préférence, flanquées d'éléments de contrôle assurant leur expression dans la souche hôte ; il s'agira en particulier, à l'extrémité 5', d'un promoteur fort, efficace dans ladite souche et éventuellement d'autres éléments tels qu'une séquence de terminaison lorsque la souche hôte sera une levure ou tout autre microorganisme où une telle séquence est nécessaire.
La présente invention concerne également les cellules transformées par les plasmides vecteurs selon l'invention. Parmi ces cellules, il faut citer plus particulièrement les bactéries, notamment des genres Bacillus,
Escherichia ou Pseudomonas, mais également les levures, en particulier du genre Saccharomyces.
Escherichia ou Pseudomonas, mais également les levures, en particulier du genre Saccharomyces.
Enfin, la présente invention concerne un procédé de préparation de la biotine dans lequel on fait fermenter un milieu de croissance contenant au moins de l'acide pimélique, ou l'un des vitamères de la biotine, par des cellules telles qu'elles ont été décrites précédemment, qui soient perméables soit à l'acide pimélique, soit auxdits vitamères de la biotine et en ce qu'on récupère la biotine produite.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaitront à la lecture des exemples ci-après décrits en se référant aux figures sur lesquélles la figure 1 représente la chaîne de biosynthèse de la biotine, la figure 2 schématise le plasmide pTG1400, . la figure 3 schématise le plasmide pTG475, .la figure 4 représente la séquence non codante en amont de la séquence
LORF nO 1, . la figure 5 représente la séquence LORF nb I correspondant au gène bioD, la figure 6 représente la séquence LORF nO 2 correspondant au gène bioA, la figure 7 représente la séquence LORF nO 3 correspondant au gène Y, .la figure 8 représente la séquence LORF n 4 correspondant au gène bioB, . la figure 9 schématise l'étude de complémentation de pTGl400, . la figure 10 schématise l'étude de complémentation entre différents
plasmides, . la figure 11 schématise la structure du plasmide pTG1418, la figure 12 schématise l'essai de complémentation de pTG1418.
LORF nO 1, . la figure 5 représente la séquence LORF nb I correspondant au gène bioD, la figure 6 représente la séquence LORF nO 2 correspondant au gène bioA, la figure 7 représente la séquence LORF nO 3 correspondant au gène Y, .la figure 8 représente la séquence LORF n 4 correspondant au gène bioB, . la figure 9 schématise l'étude de complémentation de pTGl400, . la figure 10 schématise l'étude de complémentation entre différents
plasmides, . la figure 11 schématise la structure du plasmide pTG1418, la figure 12 schématise l'essai de complémentation de pTG1418.
EXEMPLE 1
Clonage par complémentation des gènes bioA et bioD de Bacillus sphaericus IFO 3525 et mise en évidence de leur liaison avec bioB
a) Dans E. coli
Bacillus sphaericus IFO 3525 est mis en culture dans 200 ml de milieu de culture PAB (DIFCO Bacto antibiotique, milieu 3, 17,5 g/l) à 37 C pendant 17 heures. Les bactéries sont récupérées par centrifugation et l'ADN total est alors extrait à partir des cellules par la méthode de Saito (Saito et al. BBA 1963, 72, 619-629). Une quantité de 450 g d'ADN pur est obtenue.
Clonage par complémentation des gènes bioA et bioD de Bacillus sphaericus IFO 3525 et mise en évidence de leur liaison avec bioB
a) Dans E. coli
Bacillus sphaericus IFO 3525 est mis en culture dans 200 ml de milieu de culture PAB (DIFCO Bacto antibiotique, milieu 3, 17,5 g/l) à 37 C pendant 17 heures. Les bactéries sont récupérées par centrifugation et l'ADN total est alors extrait à partir des cellules par la méthode de Saito (Saito et al. BBA 1963, 72, 619-629). Une quantité de 450 g d'ADN pur est obtenue.
20 pg de l'ADN total sont mis en restriction totale avec Hindlil (3 U/jig d'ADN). pBR322 est traité avec la phosphatase alcaline après avoir été complètement digéré par HindlII.
Les plasmides recombinants hybrides sont obtenus en mélangeant l'ADN génomique digéré par Hindlil (2 lig) et pBR322 traité comme précédemment (I pg) avec 2 unités de ligase T4 (Boehringer Mannheim)
dans 50 l du tampon réactionnel contenant NaCI 30 mM, Tris HCI pH 7,5
30 mM, MgCl2 10 mM, EDTA pH 8 0,2 mM, DTT 2 mM, ATP pH 7 0,5 mM et
BSA 0,1 mg/ml. L'incubation est effectuée à 140C pendant 16 heures. Des
aliquotes du mélange de ligation sont alors ajoutées dans une expérience de
transformation (Cohen et al. (1972) PNAS 69, 2110-2114) en utilisant la
souche E. coli C600 r K m K + et en sélectionnant les souches pour leur
résistance à l'ampicilline (100 pg/ml > sur milieu LB.
dans 50 l du tampon réactionnel contenant NaCI 30 mM, Tris HCI pH 7,5
30 mM, MgCl2 10 mM, EDTA pH 8 0,2 mM, DTT 2 mM, ATP pH 7 0,5 mM et
BSA 0,1 mg/ml. L'incubation est effectuée à 140C pendant 16 heures. Des
aliquotes du mélange de ligation sont alors ajoutées dans une expérience de
transformation (Cohen et al. (1972) PNAS 69, 2110-2114) en utilisant la
souche E. coli C600 r K m K + et en sélectionnant les souches pour leur
résistance à l'ampicilline (100 pg/ml > sur milieu LB.
4 "pools" différents d'ADN plasmidique sont alors extraits,
chacun correspondant à une moyenne de 104 clones individuels sur les
boîtes de transformation.
chacun correspondant à une moyenne de 104 clones individuels sur les
boîtes de transformation.
Différents mutants bio de E. coli sont alors transformés avec ces
"pools" d'ADN et les transformés sont sélectionnés soit en présence
d'ampicilline (100 pg/ml) sur milieu LB soit pour la résistance à cet
antibiotique et pour la prototrophie pour la biotine en même temps (milieu
LB + ampicilline 100 Pg/ml + avidine 0,2 U/ml).
"pools" d'ADN et les transformés sont sélectionnés soit en présence
d'ampicilline (100 pg/ml) sur milieu LB soit pour la résistance à cet
antibiotique et pour la prototrophie pour la biotine en même temps (milieu
LB + ampicilline 100 Pg/ml + avidine 0,2 U/ml).
Les résultats observés sont rassemblés dans le tableau 1
Tableau 1
Génotype de la souche Sélection Amp. Sélection sur milieu Amp
de E. coli Transformants/g d'ADN + avidine 0,2 U/ml
transformants/pa d'ADN
C268* #bioA, his > 103 3 (pool n 4)
(pour chaque pool) 1 (pool n 1)
C173* ssbioD, his > 103 2 (pool n 4)
(pour chaque pool)
* : Cleary et Campbell (1972) J. Bacteriol. 112, 830.
Tableau 1
Génotype de la souche Sélection Amp. Sélection sur milieu Amp
de E. coli Transformants/g d'ADN + avidine 0,2 U/ml
transformants/pa d'ADN
C268* #bioA, his > 103 3 (pool n 4)
(pour chaque pool) 1 (pool n 1)
C173* ssbioD, his > 103 2 (pool n 4)
(pour chaque pool)
* : Cleary et Campbell (1972) J. Bacteriol. 112, 830.
Les plasmides sont isolés à partir des clones sélectionnés sur
ampicilline + avidine et analysés en utilisant des enzymes de restriction.
ampicilline + avidine et analysés en utilisant des enzymes de restriction.
Trois plasmides (2 provenant de la souche C268 et 1 de la souche C173)
contiennent un insert Hindlil de 4,3 kb avec un site BgllI et 2 sites Spahi et sans site BamHI, Sall, Pstl, EcoRV, Pull, Aval.
contiennent un insert Hindlil de 4,3 kb avec un site BgllI et 2 sites Spahi et sans site BamHI, Sall, Pstl, EcoRV, Pull, Aval.
Avec l'un de ces plasmides, dénommé pTGl400, et dont la carte de restriction est représentée à la figure 2, il est possible de retransformer en sélectionnant pour la résistance à l'ampicilline et la prototrophie pour la biotine, aussi bien les souches C268 (dbioA), C173 ZbioD), R877 (bioDI9) (Cleary et Campbell, 1972) ou C162 (bioB) avec une fréquence moyenne correspondant à celle obtenue pour la sélection avec l'ampicilline seule (plus de 103 par p8 d'ADN). Aucune complémentation de l'auxotrophie pour la biotine des souches R878 (bioC23) ou R901 (bbioA-D) (Cleary et
Campbell, 1972) ne peut etre obtenue en utilisant pTGl400.
Campbell, 1972) ne peut etre obtenue en utilisant pTGl400.
b) Dans Bacillus subtilis
La complémentation des mutants bio de Bacillus subtilis pourrait se révéler difficile car il est connu que des délétions peuvent se produire avec une fréquence très importante dans les inserts étrangers clonés dans les plasmides réplicatifs usuels de Bacillus subtilis. C'est pourquoi il a été développé une nouvelle stratégie basée sur des essais de complémentation à l'aide d'un plasmide non réplicatif. L'intégration de plasmides non réplicatifs dans l'ADN génomique de Bacillus subtilis intervient avec une fréquence assez élevée (environ 104 transformants/lJg d'ADN), en utilisant des cellules naturellement compétentes de Bacillus subtilis, si des régions homologues existent entre l'ADN génomique et le plasmide.
La complémentation des mutants bio de Bacillus subtilis pourrait se révéler difficile car il est connu que des délétions peuvent se produire avec une fréquence très importante dans les inserts étrangers clonés dans les plasmides réplicatifs usuels de Bacillus subtilis. C'est pourquoi il a été développé une nouvelle stratégie basée sur des essais de complémentation à l'aide d'un plasmide non réplicatif. L'intégration de plasmides non réplicatifs dans l'ADN génomique de Bacillus subtilis intervient avec une fréquence assez élevée (environ 104 transformants/lJg d'ADN), en utilisant des cellules naturellement compétentes de Bacillus subtilis, si des régions homologues existent entre l'ADN génomique et le plasmide.
La première étape consiste à intégrer le plasmide pTG475 dont la structure est indiquée à la figure 3 dans différents mutants bio de
Bacillus subtilis.
Bacillus subtilis.
Le plasmide pTG475 contient le gène XylE qui code pour l'enzyme C2 3 oxygénase (Zukowski et al. (1983) PNAS USA, 80, 1101-1105), qui peut être utilisé comme marqueur chromogénique (jaune) et qui est exprimé sous le contrôle du promoteur inductible du gène de la levane sucrase de Bacillus subtilis. Ce plasmide comporte également un gène CAT conférant la résistance au chloramphénicol ; les gènes CAT et XylE sont insérés dans pBR322.
Ce plasmide est intégré dans le chromosome des souches suivantes de Bacillus subtilis : . souche bioA : JKB 3173 (bioA 173, aro G932 ; CH Pai (1975)
J. Bacteriol. 121, 1-8), souche bioB : BGSC1A92 (bioB 141, aro G932 Sac A 321, Arg A2
CH Pai (197S) J. Bacteriol. 121, 1-8, .souche bioll2 :JKB 3112 (bio 112;CH Pai (1975) J. Bacteriol. 121, 1-8), par la technique de transformation des cellules compétentes de R.J.
J. Bacteriol. 121, 1-8), souche bioB : BGSC1A92 (bioB 141, aro G932 Sac A 321, Arg A2
CH Pai (197S) J. Bacteriol. 121, 1-8, .souche bioll2 :JKB 3112 (bio 112;CH Pai (1975) J. Bacteriol. 121, 1-8), par la technique de transformation des cellules compétentes de R.J.
Boyland (1972) J. Bacteriol. 110, 281-290, la sélection étant effectuée sur
TBAB (DIFCO Blood tryptose agar base)) plus chloramphénicol 3 pg/ml.
TBAB (DIFCO Blood tryptose agar base)) plus chloramphénicol 3 pg/ml.
Différents contrôles sont effectués sur les clones transformés
ils virent au jaune lorsqu'on induit avec le sucrose, et en outre un contrôle par hybridation Southern pour les souches bioA, bioB et bioll2 montre que l'intégration de pTG475 par recombinaison simple dans le promoteur du gène de la levane sucrase a eu lieu. Ces souches transformées de Bacillus subtilis sont appelées bioA TG1, bioB TG2 et biol 12 TG3. Le plasmide pTG475 ayant apporté des séquences de pBR322 dans le génome de Bacillus subtilis, il devient possible d'intégrer, par recombinaison homologue, tout plasmide étranger comportant ces mêmes séquences.
ils virent au jaune lorsqu'on induit avec le sucrose, et en outre un contrôle par hybridation Southern pour les souches bioA, bioB et bioll2 montre que l'intégration de pTG475 par recombinaison simple dans le promoteur du gène de la levane sucrase a eu lieu. Ces souches transformées de Bacillus subtilis sont appelées bioA TG1, bioB TG2 et biol 12 TG3. Le plasmide pTG475 ayant apporté des séquences de pBR322 dans le génome de Bacillus subtilis, il devient possible d'intégrer, par recombinaison homologue, tout plasmide étranger comportant ces mêmes séquences.
Dans une deuxième étape, le plasmide pTG1400, préalablement cloné par complémentation dans E. coli, a été utilisé pour transformer les souches de Bacillus subtilis bioA TGl, bioB TC2 et bioll2 TG3. La sélection est effectuée sur milieu LB + avidine 0,2 U/ml + chloramphénicol 10 pg/ml.
On observe qu'il est possible de sélectionner, à une très haute fréquence, des transformants prototrophes pour la biotine à partir de souches bioA TGl et bioB TG2 mais pas avec la souche bioll2 TC3.
pTG1400 ne complémente donc pas la mutation bioll2.
c) Caractérisation finale de l'insert Hindlil de pTG1400
Des expériences d'hybridation Southern ont été effectuées de façon à détecter le même fragment Hindlil dans 1'ADN génomique de
Bacillus sphaericus IFO 3525, correspondant à l'insert de pTG1400.
Des expériences d'hybridation Southern ont été effectuées de façon à détecter le même fragment Hindlil dans 1'ADN génomique de
Bacillus sphaericus IFO 3525, correspondant à l'insert de pTG1400.
Dans des conditions d'hybridation drastiques (50 % de formamide, 0,6 % de solution de Denhardt, 0,1 % SDS, 3xSSC à 420C) et en utilisant un plasmide pTG1400 marqué au 32p par incorporation de nucléotides radioactifs par polymérisation in vitro ( "nick translation") (2,5.1 07 cpm/ug d'ADN), une seule bande Hindlil de 4,3 kb a pu être visualisée dans ltADN génomique de Bacillus sphaericus IFO 3525 après 6 heures d'autoradiographie à -800C. Il a été vérifié que dans ces conditions d'hybridation
pBR322 ne donnait pas de réaction croisée avec l'ADN génomique de
Bacillus sphaericus IFO 3525.Dans les mêmes conditions, aucune réaction positive, avec pTG1400 comme sonde, n'a pu être détectée dans l'ADN génomique de Bacillus subtilis BGSC1A289 traité par Hindili ou dans l'ADN génomique de E. coli C600 traité avec Hindlil.
pBR322 ne donnait pas de réaction croisée avec l'ADN génomique de
Bacillus sphaericus IFO 3525.Dans les mêmes conditions, aucune réaction positive, avec pTG1400 comme sonde, n'a pu être détectée dans l'ADN génomique de Bacillus subtilis BGSC1A289 traité par Hindili ou dans l'ADN génomique de E. coli C600 traité avec Hindlil.
La séquence d'ADN totale du fragment Hindlil de 4,3 kb a été analysée en utilisant la méthode "Shotgun", c'est-à-dire le clonage systématique des fragments obtenus par sonication, les "délétions cyclones" ou les élongations avec oligonucléotides-primers.
Pour la méthode "Shotgun", le plasmide pTG1400 a été découpé par traitement aux ultrasons. Après traitement des segments d'ADN avec l'ADN polymérase du phage T4, les fragments aux extrémités franches sont mis à migrer sur un gel d'agarose à bas point de fusion et des fragments d'environ 300 pb sont isolés.
Le clonage de ces fragments a été réalisé dans des vecteurs M13 digérés par 5mai et traités à la phosphatase,
Les plages blanches qui ne donnent pas d'hybridation croisée avec pBR322 sont triées et i00 clones sont séquences. Les résultats ont été analysés par ordinateur.
Les plages blanches qui ne donnent pas d'hybridation croisée avec pBR322 sont triées et i00 clones sont séquences. Les résultats ont été analysés par ordinateur.
Un procédé récent pour l'obtention d'une série de clones se chevauchant (le système cyclone) a été utilisé pour le séquençage de 1'ADN (R.M.K. Dale, B.A. Mc Clure, J.P. Houchins (1985) Plasmid 13, 31-40). Cette méthode a été poursuivie en parallèle avec la méthode "Shotgun", de façon à confirmer les résultats. En outre, cette méthode produit des plasmides délétés définis contenant des groupes de gènes bio ou des gènes bio isolés.
La séquence complète du fragment HindIII de pTC1400 est représentée aux figures 4, 5, 6, 7 et 8.
L'analyse par ordinateur de cette séquence révèle que le fragment a la capacité de coder pour quatre longs cadres de lecture ouverts (LORF). Les sites possibles d'initiation de la traduction et les régions Shine et Dalgarno sont soulignées. Une région palindromique est soulignée à l'extrémité 3' de la séquence qui pourrait représenter un site de terminaison de transcription.
L'analyse de complémentation détaillée montre que la première région LORF (figure 9) (avec 3 sites d'initiation de traduction possibles) correspond au gène bioD.
Des expériences connues sous le nom de " maxicellules" ont été réalisées avec la souche de E. coli CSR 603 (recAl, phr-l, uvrA6, thr-l, leu-6, thi-l, argE3, lacs1, galK2, aral4, xyll5, mtll, proA2, str-31, tsx-33, supE44, F-, lambda ) ; elles montrent que cette région code pour un polypeptide avec d'un poids moléculaire apparent d'environ 25 kd.
La seconde région LORF (figure 6) (avec 4 sites d'initiation de traduction possibles) correspond au gène bioA. Une expérience en "maxicellules" de E. coli CSR603 révèle un polypeptide d'un poids moléculaire apparent d'environ 40 kd qui correspond au produit du gène bioA.
Il n'a pas été possible de déterminer la fonction de la troisième séquence LORF, appelée gène Y (figure 7). Une très grande hydrophobicité et la présence d'une séquence signal probable dans la région codante suggèrent que ce LORF, si il est transcrit et traduit, code pour une protéine ayant une interaction avec la membrane. Le fait que ce gène Y soit en "cluster" avec les autres gènes bio (A, D et B) suggère qu'il code pour une autre fonction impliquée dans le métabolisme de la biotine.
La quatrième région LORF (figure 8) (avec 3 sites d'initiation de la traduction possibles) a déjà été identifiée, il s'agit d'une région codant pour le gène bioB. Il est démontré ici que ce gène est lié en "cluster" avec les gènes bioA et bioD.
Une analyse de complémentation avec des plasmides contenant des régions sous-clonées de l'insert Hindlil de 4,3 kb de pTG1400 montre clairement, comme cela est représenté à la figure 9, que la première région
LORF correspond au produit du gèneD et que la seconde région LORF correspond au produit du gène A.
LORF correspond au produit du gèneD et que la seconde région LORF correspond au produit du gène A.
EXEMPLE 2
Clonage par complémentation du gène bioF de Bacillus sphaericus IFO 3525
La banque d'ADN génomique Hindlil de Bacillus sphaericus IFO 3525 décrite précédemment a été utilisée pour transformer un mutant de E.
Clonage par complémentation du gène bioF de Bacillus sphaericus IFO 3525
La banque d'ADN génomique Hindlil de Bacillus sphaericus IFO 3525 décrite précédemment a été utilisée pour transformer un mutant de E.
coli, bioF 12, en suivant la méthodologie décrite précédemment.
Les résultats obtenus sont rassemblés au tableau 2
Tableau 2
Génotype de la souche Sélection Amp. Sélection sur milieu
de E. coli Amp.+ avidine 0,2 U/ml
Transformants/ g d'ADN Transformants/ug d'ADN
R874* bioF 12, his > 104 2 (pool n 1)
(pour chaque pool) 2 (pool n 3)
4 (pool n 4) * Cleary et Campbell (1972) J. Bacteriol. 112, 830
Les plasmides sont isolés à partir des clones sélectionnés sur milieu contenant de l'ampicilline et de l'avidine ':: analysés en utilisant des enzymes de restriction.
Tableau 2
Génotype de la souche Sélection Amp. Sélection sur milieu
de E. coli Amp.+ avidine 0,2 U/ml
Transformants/ g d'ADN Transformants/ug d'ADN
R874* bioF 12, his > 104 2 (pool n 1)
(pour chaque pool) 2 (pool n 3)
4 (pool n 4) * Cleary et Campbell (1972) J. Bacteriol. 112, 830
Les plasmides sont isolés à partir des clones sélectionnés sur milieu contenant de l'ampicilline et de l'avidine ':: analysés en utilisant des enzymes de restriction.
Deux de ces plasmides contiennent deux inserts Hindili d'environ 4,5 et 0,6 kb avec des sites Sphl, Kpnl, HpaI, NdeI, Aval, Clapi, Bgl, XmnI,
Pvull, Scal, Stul et sans site Bill, Xbal, 5mai, Pstl, Sali, NruI, BamHI, Pvul, EcoRI, HindII, EcoRV, FspI, Apax, Ball, Aatil..
Pvull, Scal, Stul et sans site Bill, Xbal, 5mai, Pstl, Sali, NruI, BamHI, Pvul, EcoRI, HindII, EcoRV, FspI, Apax, Ball, Aatil..
Avec l'un de ces plasmides, pTG1418, il a été possible de retransformer en sélectionnant pour la résistance à l'ampicilline et la prototrophie pour la biotine, la souche R874 de E. coli (bioF12, his) avec une fréquence moyenne correspondant à celle obtenue pour la sélection des clones sur ampicilline (plus de 104/pg d'ADN).
Des expériences de sous-clonage ont montré que seul le fragment HindIII de 4,5 kb code pour la fonction KAPA synthétase assurant la complémentation de la mutation bioF12 de la souche R874 de E. coli.
Des expériences de "Southern" ont été effèctuées de façon à détecter le fragment Hindi!! de 4,5 kb dans l'ADN génomique de Bacillus sphaericus IFO 3525 en comparaison avec l'insert de 4,S kb de pic1418. En utilisant des conditions d'hybridation très drastiques (50 % de formamide, 3xSSC, 0,1 % SDS, 0,6 % de solution de Denhardt, 429C) et en utilisant
M13TG1425 (phage M13 contenant l'insert Hindi!! de 4,5 kb marqué au 32p par incorporation de nucléotides radioactifs par polymérisation in vitro ("nick translation)" avec 2.106 cpm/pg d'ADN), une bande Hindi!! dtenviron 4,5 kb peut être visualisée dans l'ADN génomique de Bacillus sphaericus
IFO 3525 après 7 heures d'autoradiographie à -80"C.
M13TG1425 (phage M13 contenant l'insert Hindi!! de 4,5 kb marqué au 32p par incorporation de nucléotides radioactifs par polymérisation in vitro ("nick translation)" avec 2.106 cpm/pg d'ADN), une bande Hindi!! dtenviron 4,5 kb peut être visualisée dans l'ADN génomique de Bacillus sphaericus
IFO 3525 après 7 heures d'autoradiographie à -80"C.
Dans les mêmes conditions, aucune réaction positive ne peut être détectée, ni sur l'ADN génomique de Bacillus subtilis BGSClA289 traité par Hindi!! ni sur l'ADN génomique de E. coli C600 traité par Hindi!!.
Aucune réaction croisée ne peut être détectée entre 1' insert de pTG1400 et les inserts de pTG1418, ni avec un fragment Spahi de 8,3 kb de pTG1406 chevauchant l'extrémité 3' de pTG1400, ni avec un fragment MboI de 8,2 kb de pSBOl chevauchant l'extrémité 5' de pTG1400 (voir figure 10).
La carte de restriction des inserts de pTG1418 a été analysée et est indiquée à la figure il.
Les études de complémentation et l'analyse "Southern" démontrent que le gène bioF de Bacillus sphaericus IFO 3525 n'est pas lié aux gènes bioA, bioD et bioB du même microorganisme (figure 12).
Dépôt des souches représentatives de l'invention
Les souches de E. coli C600 pTG1400 et R874 pTG1418 ont été déposées à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'institut Pasteur, 28 rue du Docteur-Roux - 75724 Paris Cédex 15, le 26 septembre 1986 sous les nO 1-608 et 1-609.
Les souches de E. coli C600 pTG1400 et R874 pTG1418 ont été déposées à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'institut Pasteur, 28 rue du Docteur-Roux - 75724 Paris Cédex 15, le 26 septembre 1986 sous les nO 1-608 et 1-609.
REFERENCES
P.P. Cleary et A. Campbell (1972) J. Bacteriol. 112, 830-839.
P.P. Cleary et A. Campbell (1972) J. Bacteriol. 112, 830-839.
M.M. Zukowski, D.F. Gaffney, D. Speck, M. Kauffmann, A. Findeli,
A. Wisecup et J.P. Lecocq (1983) PNAS USA 80, 1101-1105.
A. Wisecup et J.P. Lecocq (1983) PNAS USA 80, 1101-1105.
C.H. Pai (1975) 3. Bacteriol. 121, 1-8.
R.J. Boyland, N.H. Mendelson, D. Brooks et F.E. Young (1972) J. Bacteriol.
110, 281-290.
R.M.K. Dale, B.A. Mc Clure, J.P. Houchins (1986) Plasmid 13, 31-40.
S.N. Cohen, A.C.Y. Cheng, L. Hsu (1972) PNAS USA 69, 2110-2114.
H. Saito et K.I. Miura (1963) BBA 72, 619-629.
Claims (24)
1) Séquences d'ADN codant pour l'enzyme produit de l'un des gènes suivants de la chaîne de biosynthèse de la biotine chez les bactéries - gène bioA, - gène bioD et - gène bioF.
2) Séquence d'ADN selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle code pour les enzymes produits des gène D, gène A et gène B.
3) Séquence d'ADN selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce qu'elle code pour les enzymes produits des gène D, gène
A, gène B et gène F.
4) - Séquence d'ADN selon l'une des revendications I à 3, caractérisée en ce qu'elle provient d'une souche de Bacillus.
5) Séquence d'ADN selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'il s'agit du gène bioA, gène bioD ou gène bioF qui provient d'une souche de Bacillus sphaericus.
6) Séquences d'ADN selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisées en ce qu'elles sont dépourvues des séquences naturelles assurant le contrôle de la transcription des enzymes de la voie de biosynthèse de la biotine chez la bactérie d'origine.
7) Séquence d'ADN selon l'une des revendications I à 5, caractérisée en ce qu'elle correspond à tout ou partie de la séquence décrite aux figures 4 à 8.
8) Vecteur plasmidique comportant au moins une séquence selon l'une des revendications 1 à 7.
9) Vecteur selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur non réplicable qui comporte les séquences d'ADN permettant son intégration dans un chromosome dans la souche hôte.
10) Vecteur selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comporte au moins une séquence homologue d'une séquence présente dans le génome de la souche à transformer et assurant l'intégration.
11) Vecteur selon la revendication 10, caractérisé en ce que la séquence homologue est une séquence génomique naturelle.
12) Vecteur selon la revendication 10, caractérisé en ce que la séquence homologue est une séquence qui a été intégrée dans le génome grâce à un vecteur plasmidique d'intégration.
13) Vecteur selon la revendication 12, caractérisé en ce que le vecteur plasmidique spécifique comporte au moins un gène de résistance à un antibiotique et un gène marqueur sous la dépendance d'un promoteur de la souche à transformer.
14) Vecteur selon la revendication 13, caractérisé en ce que le promoteur est un promoteur inductible.
15) Vecteur selon la revendication 14, caractérisé en ce que le vecteur plasmidique d'intégration est le plasmide pTG475.
16) Vecteur selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comporte une origine de réplication autonome.
17) Vecteur selon la revendication 16, caractérisé en ce que 'il s'agit d'une origine de réplication autonome dans une souche de Bacillus ou une souche d'Escherichia.
18) Vecteur selon l'une des revendications 16 et 17, caractérisé en ce que les séquences d'ADN codant pour les enzymes de la chaîne de biosynthèse de la biotine sont flanquées d'éléments assurant leur expi ession dans la souche hôte.
19) Vecteur selon la revendication 18, caractérisé en ce que parmi les éléments assurant leur expression figure un promoteur et un terminateur efficaces dans la souche hôte.
20) Cellules transformées par un vecteur selon l'une des revendications 8 à 19.
21) Cellule selon la revendication 20, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une bactérie choisie parmi les genres Bacillus, Escherichia ou
Pseudomonas.
22) Cellule selon la revendication 20, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une levure du genre Saccharomyces.
23) Cellule selon la revendication 21, caractérisée en ce que la bactérie est choisie parmi Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis et
Escherichia coli.
24) Procédé de préparation de biotine caractérisé en ce qu'on fait fermenter un milieu de culture contenant au moins de l'acide pimélique ou l'un des vitamères de la biotine par des cellu!es selon l'une des revendications 20 à 23, perméables à l'acide pimélique ou au dit vitamère de la biotine et en ce qu'on récupère la biotine formée.
Priority Applications (7)
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|---|---|---|---|
| FR8613603A FR2604436B1 (fr) | 1986-09-30 | 1986-09-30 | Clonage des genes bioa, biod, biof de bacillus sphaericus, vecteurs et cellules transformes et procede de preparation de la biotine |
| AU78908/87A AU616380B2 (en) | 1986-09-30 | 1987-09-23 | Cloning of the bioA, bioD, bioF, bioC, and bioH genes of Bacillus sphaericus, vectors and transformed cells and method for preparing biotin |
| CN87107807.4A CN1031111A (zh) | 1986-09-30 | 1987-09-28 | 圆球杆菌的bioA，bioD，bioF，bioC，bioH基因的克隆、载体和转化细胞以及生物素的制备方法 |
| EP87402157A EP0266240A1 (fr) | 1986-09-30 | 1987-09-28 | Clonage des gènes bioA, bioD, bioF, bioC, bioH de Bacillus sphaericus, vecteurs et cellules transformées et procédé de préparation de la biotine |
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| US07/102,740 US5096823A (en) | 1986-09-30 | 1987-09-30 | Cloning of the bioa, biod, biof, bioc and bioh genes of bacillus spraericus, vectors and transformed cells |
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| FR8613603A FR2604436B1 (fr) | 1986-09-30 | 1986-09-30 | Clonage des genes bioa, biod, biof de bacillus sphaericus, vecteurs et cellules transformes et procede de preparation de la biotine |
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| FR2604436B1 FR2604436B1 (fr) | 1989-07-21 |
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| FR8613603A Expired FR2604436B1 (fr) | 1986-09-30 | 1986-09-30 | Clonage des genes bioa, biod, biof de bacillus sphaericus, vecteurs et cellules transformes et procede de preparation de la biotine |
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| FR (1) | FR2604436B1 (fr) |
Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| JPS61149091A (ja) * | 1984-12-24 | 1986-07-07 | Nippon Soda Co Ltd | ビオチン合成酵素をコ−ドする二重鎖ｄｎａ、それを含む微生物及びビオチンの製造法 |
| WO1987001391A1 (fr) * | 1985-08-26 | 1987-03-12 | Amgen | Systeme de synthese de la biotine |
-
1986
- 1986-09-30 FR FR8613603A patent/FR2604436B1/fr not_active Expired
-
1987
- 1987-09-30 JP JP62247775A patent/JPS63173591A/ja active Pending
- 1987-09-30 KR KR870011002A patent/KR880004093A/ko not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61149091A (ja) * | 1984-12-24 | 1986-07-07 | Nippon Soda Co Ltd | ビオチン合成酵素をコ−ドする二重鎖ｄｎａ、それを含む微生物及びビオチンの製造法 |
| WO1987001391A1 (fr) * | 1985-08-26 | 1987-03-12 | Amgen | Systeme de synthese de la biotine |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| AGRIC. BIOL. CHEM., vol. 45, no. 9, 1981, pages 1983-1989; Y.IZUMI et al.: "Characterization of biotin biosynthetic enzymes of Bacillus sphaericus: a dethiobiotin producing bacterium" * |
| CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 106, no. 3, 19 janvier 1987, page 209, résumé no. 14236a, Columbus, Ohio, US; & JP-A-61 149 091 (NIPPON SODA CO., LTD) 07-07-1986 * |
| CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 90, no. 9, 26 février 1979, page 250, résumé no. 69004e, Columbus, Ohio, US; G. COHEN et al.: "Isolation and characterization of a ColE1 plasmid containing the entire bio gene cluster of Escherichia coli K12", & MOL. GEN. GENET. 1978, 166(3), 305-12 * |
| CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 93, no. 7, 18 août 1980, page 480, résumé no. 65744k, Columbus, Ohio, US; A. MUKHERJEE et al.: "Construction and characterization of a recombinant plasmid containing the entire biotin genes of E. coli K12", & PLASMIDS TRANSPOSONS, ÄPROC. ANNU. SYMP. SCI. BASIS MED.Ü, 4th 1979 (Pub. 1980), 379-86 * |
| GENE, vol. 1, 1977, pages 331-345, Elsevier/North-Holland Biomedical Press, Amsterdam, NL; C.K. DAS GUPTA et al.: "Isolation and characterization of the biotin genes of Escherichia coli K-12" * |
| J. MOL. BIOL., vol. 148, 1981, pages 63-76, Academic Press Inc. Ltd, Londres, GB; A. SANCAR et al.: "Identification of the uvr B gene product" * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2604436B1 (fr) | 1989-07-21 |
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| KR880004093A (ko) | 1988-06-01 |
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