FR2550803A1

FR2550803A1 - Procede microbien de conversion de steroides hydroxyles

Info

Publication number: FR2550803A1
Application number: FR8412711A
Authority: FR
Inventors: Robert John Park; Noel William Dunn; John Alton Ide
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 1983-08-12
Filing date: 1984-08-10
Publication date: 1985-02-22
Also published as: FR2550803B1

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UN PROCEDE MICROBIEN DE CONVERSION DE COMPOSES STEROIDIQUES POSSEDANT AU MOINS UN GROUPE HYDROXYLE, DONT L'UN EST EN POSITION 3, EN DES COMPOSES QUI PRESENTENT UN INTERET COMME INTERMEDIAIRES DANS LA PRODUCTION DE PRODUITS PHARMACEUTIQUES STEROIDIQUES DE FORMULES GENERALES I, II OU III (CF DESSIN DANS BOPI) (CF DESSIN DANS BOPI) DANS LESQUELLES R, R ET R SONT L'HYDROGENE OU UN GROUPE HYDROXYLE, A LA CONDITION QUE: A.R, R ET R NE SOIENT PAS SIMULTANEMENT UN GROUPE HYDROXYLE; B.R ET R NE SOIENT PAS SIMULTANEMENT UN GROUPE HYDROXYLE. LE PROCEDE UTILISE UN MUTANT D'UNE SOUCHE DE TYPE SAUVAGE D'UNE BACTERIE GRAM-NEGATIVE OBTENU PAR UNE TECHNIQUE DE MUTAGENESE PAR TRANSPOSON ET QUI EST CULTIVE DANS UN MILIEU DE CULTURE AQUEUX EN PESENCE D'UN ACIDE BILIAIRE CONTENANT UN GROUPE 3-HYDROXYLE DE MANIERE A PRODUIRE UN OU DES COMPOSES DE FORMULES GENERALES I, II OU III.

Description

L'invention est un procéde microbien pour la conversion de composés stéroldiques possédant au moins un groupe hydroxyle dont l'un est en position 3, tel que dans les acides biliaires, en des composés qui présentent un in térêt en tant qu'intermédiaires dans la production de produits pharmaceutaques stéroldiques, répondant aux formules génerales I, Il ou III

dans lesquelles R1, R2 et R3 sont lihydrogene ou un groupe hydroxyle, a condition que (i) R1, R2 et -R3 ne soient pas simultanément un groupe
hydroxyle ;; (ii) R3 et R1 ne soient pas simultanément un groupe hy-
droxyle
Jusqu'à maintenant les médicaments corticosté- roldiques et stéroïdiques similaires sont synthétisés par des procédés en grande partie chimiques, longs et coûteux.

Des matériaux dérivant de la bile animale, tels que les acides choliques et desoxycholiques, peuvent être utilisés comme composés de depart dans ces procédés.

Une étude de la littérature montre que des 1,4 andostadiène-3,17-diones hydroxylées telles que celles de formule générale I, des acides 3-oxo-1,4-prégnadiène-20 carboxyliques hydroxylés de formule générale II et des 9,10-seco-1,3,5(10)-androstatríene-9,17-diones hydroxylées de formule générale III, peuvent être produits par fermentation aérobie des acides biliaires trouvés -dans la vésicule biliaire du bétail, des moutons et des porcs.

C'est ainsi que Barnes et al., Tetrahedron 32, pp. 89-93, (1976), ont soumis 10 g d'acide désoxycholique à une fermentation aérobie avec Pseudomonas NC1B 10590 et ont obte nu 600 mg de 12 ss -hydroxy-1,4-androstadiène-3,17-dione (appelée ci-après 12 p -hydroxy ADD), 14 mg de 12 d -hy droxy-1,4-androstadiène-3,17-dione (appelee ci-apres 12 α - hydroxy ADD) et 657 mg d'acide 12 i -hydroxy-3-oxo-1,4- prégnadiène-20-carboxylique (appelé ci-après acide 12 - hydroxy OPDC) sous forme de son ester méthylique.De même, Leppik (Tetrahedron 37, pp. 1747-1751 (1981)), à partir de la fermentation de 30 g d'acide désoxycholique par Pseudomonas MR108 (Pseudomonas sp. ATCC 31753) a obtenu 61 mg de 3,12 -dihydroxy-9 , 10-seco-1, 3,5(10) -androstatriène-9 17-dione (appelée ci-après 12 ss -hydroxy sécophénol).

Les composés possédant la formule générale men tionnée ci-dessus représentent un intérêt considérable en tant qu'intermédiaires pour la production de certains médicaments steroldiques, en particulie-r les corticostéroides anti-inflammatoires également des médicaments pour la régulation artificielle de l'ovulation et de la fertilité chez l'homme, le mouton et le bétail et d'autres animaux, tel que décrit dans les demandes de brevets australiens 66689/82 et 66864/81 et de stéroïdes anabolisants et d'analogues de la vitamine A.

Cependant, avant que la technique antérieure de-- crite ci-dessus. pour la préparation de ces composés, puisse être utilisée pour remplacer les procédés synthétiques chimiques existant, des rendements beaucoup plus élevés en ces composés sont exigés. Un procédé qui permet d'obtenir de meilleurs rendements, consiste à bloquer le cheminement de dégradation stéroidique des micro-organismes utilisés, de manière à empêcher toute altération du ou des composés requis. Dans la technique antérieure pour la produc tion d'intermédiaires pour des médicaments steroldiques à partir de stérols végétaux et animaux, on a essayé avec succès de limiter sélectivement la dégradation de ces stérols par les microorganismes, en utilisant des moyens tels que ceux décrits par exemple dans le brevet US 4 320 195.

Mais rien dans cette technique ne peut apprendre comment produire des composés tels que ceux répondant aux formules générales ci-dessus, avec des rendements industriels. Dans la demande de brevet européen BE 82-102356.1, Bahn et al.

proposent une technique qui consiste à faire fermenter avec succès de l'acide desoxycholique et d'autres acides biliaires avec des mutants défectifs de divers microorganismes gram-positifs obtenus par des procédés de mutagénèse chimiques ou impliquant une irradiation. Cependant, dans l'exemple cité, une souche de mutant defectif DSM 1444 a converti 100 g d'acide désoxycholique en 96 heures dans 5 litres de milieu pour donner 45 g de 12-oxo BNC (un mélange d'acides prégnane carboxyliques mono- et di-insatures) et 25 g de 12 A -hydroxy BNC (de nouveau un mélange d'acides prégnante carboxyliques mono- et di-insaturés). Bien que ces rendements soient excellents, le mélange de produits obtenu n'est pas désirable pour un procédé de préparation d'intermédiai- res pour médicaments stéroidiques.

Dans la demande de brevet européen BE 83-400341.0,
Bunno et al. enseignent qu'une souche de Pseudomonas putida D 4014 peut etre mutée par des techniques chimiques ou de radiation pour donner une souche de mutant défectif D40 14-A10999, qui donne des rendements plus élevés en 12 4 - hydroxy ADD à partir de 11 acide désoxycholique, alors que la souche parente D4014 donne un rendement de 42 % en 12 o - hydroxy ADD, comme trouve dans la première technique décrite dans le brevet australien 531753 à partir de la fermentation d'acides biliaires mixtes en utilisant Pseudomonas sp.

ATCC 31752, donc une souche de Pseudomonas putida (M.G.

Smith et Park, R. J. Applied and Environmental Microbiology, 48, Juillet 1984). L'utilisation de mutants défectifs de microorganismes gram-negatifs obtenus par les procédés ci dessus, conduit souvent à des problèmes de réversion en un comportement de type sauvage qui les rend inutilisables dans des processus industriels. Voir par exemple Cargile et McChesney (Applied Microbiology 27, pp. 991-4, 1974) et
Maxwell et al. dans la demande de brevet européen BE 84-98 750, qui indiquent qu'une réversion spontanée de mutants défectifs de Pseudomonas spp. comprenant des souches de P.

putida, augmente à des densités de cellules élevées, comme r cela se produit dans des cuves de fermentation. Maxwell et al. affirment que des mutants défectifs de Pseudomonas putida, par exemple ATCC 31916, requièrent des conditions spéciales non appliquées dans la technique de Bunno et al., pour éviter une réversion spontanée rapide en un comportement e type sauvage. Une telle réversion devrait s'exprimer de manière plus importante lorsqu'on utilise des concentrations en substrat élevées, car la bioconversion en le produit exige des périodes de temps plus longues et tout produit de réversion spontanée a une plus grand opportunité à proliférer, conduisant à une diminution indésirable des rendements.La technique propose par Bunno et al. indique qu'une telle réversion peut se produire dans leur exemple de conversion de l'acide désoxycholique en 12 ck-hydroxy
ADD à une concentration en substrat de 20 g/litre (exemple 2). C'est ainsi que 2 g d'acide désoxycholique étaient convertis en 0,46 g de produit en 6 jours, ce qui représente environ 30 % du rendement théorique ; au contraire, dans leurs exemples I et 3, pour 5 g/litre d'acide désoxycholique, ils obtenaient des rendements voisins de 90 % du rendement théorique, en 28 heures. Ces rendements en produit plus faibles que dans leur exemple 3 devraient rendre ce procédé peu intéresaant pour une production industrielle de 12 -hydroxy ADD utilisable comme intermédiaire pour des m6- dicaments stéroIdiques.

L'invention a pour but de permettre la production de dérivés stéroidiques répondant aux formules I à III cidessus avec des rendements industriellement utilisables et améliorés, par une bio-conversion partielle de substrats steroldiques, en particulier des acides biliaires.Ce but est obtenu par la construction de microorganismes mutants stables pendant la période de temps requise pour la fermentation du substrat pour produire les dits drivés ste- roldiques, les mutants étant obtenus à partir de souches de type sauvage appropriées Le microorganisme de départ préféré est une souche de Pseudomonas tolérant vis-à-vis des acides biliaires, qui est caractérisée par son aptitude à utiliser des substrats d'acides biliaires contenant un groupe 3-hydroxy, qui pensent également comporter des groupes 6- ou 7- et/ou 12-hydroxyle, comme seules sources de carbone et d'énergie. D'autres microorganismes appropriés peuvent également être utilisés.C'est ainsi que comme autres microorganismes, on citera des bactéries gram-né- yatives telles que Escherichia, Enterobacter et Reromonas.

Le procédé de l'invention implique l'isolement ou la construction d'un mutant du microorganisme de départ qui peut produire des taux élevés des dits dérivés stéroIdiques ré- pondant aux formules générales ci-dessus à partir d'un ma- tériel biliaire, en raison d'une déficience en la ou les enzymes nécessaires à la degradation de ces composés.

La construction du mutant peut être effectuée par une technique de manipulation génétique telle qu'une mutagénèse par transposon, ou par d'autres techniques ap- propriées. Une autre opération dans le procédé de l'invention comprend la culture des dits mutants dans un milieu de culture aqueux dans des conditions adéquates, en presence d'un acide biliaire contenant au moins un groupe 3-hydroxyle et de préférence également des groupes 6- et 7- et/ ou 12-hydroxyle, ou de bile non-fractionnée, qui se traduit par l'accumulation de ces composés. Après quoi, le produit peut être isolé.Le rendement en les composés cherchés doit être de préférence d'au moins 50 % en poids du rendement théoriquement possible, par rapport à la quantité de substrat stéroldique utilisé.

Dans le procédé de l'invention, on peut introduire au stade de culture d'autres ingrédients tels que des agents tampons pour ajuster le pH, des sels minéraux et des sources d'azote et de carbone pour la production de biomasse de la souche de mutant. Cependant, la source de carbone peut ne pas être nécessaire lorsque le -substrat stéroidique est de la bile non-fractionnée. Dans la présente description, le terme "bile non-fractionnée" désigne de la bile animale dont les constituants principaux tels que les acides biliaires, les lipides, les protéines et les pigments n'ont pas été séparés, mais il n'exclut pas une bile concentrée par évaporation ou autre élimination d'eau.

Les procédés de la technique antérieure pour la production d'intermédiaires pour des médicaments stérosdi- ques avec un rendement industriel en utilisant des mutants, ont recours à des mutants des genres tels que Myocobacteria, Arthrobacter, Nocardia, etc., pour la production de substances telles que la 9 d -hydroxy-4-androstène-3,17- dione (brevet US 4 035 236) ou l'acide 3-oxo-prégn-4-ène- 20-carboxylique (brevet US 4 320 195) à partir de substances stéroldiques de la classe des stérols.Un problAme inhersent à ces procédés est l'insolubilité relative des substrats stérordiques, qui nécessite l'utilisation d'agents de dispersion et de taux de substrat relativement faibles, avec les vitesses de croissance et de transformation de ces genres de microorganismes mutants, relativement faibles.

D'autre part, l'invention présente le très grand avantage que les substrats, les acides biliaires et/ou la bile nonfractionnée, sont très solubles dans l'eau, de sorte qu'on peut utiliser de plus fortes concentrations de substrat sans agents dispersants aux valeurs de pH utilisées dans le procédé décrit. Les microorganismes mutants du genre
Pseudomonas croissent beaucoup plus rapidement et transforment les substrats beaucoup plus rapidement que les microorganismes de la technique antérieure.

Un autre avantage de l'invention est que les procédés de la technique antérieure utilisant des stérols exigent l'utilisation de milieux complexes contenant des sources de carbone, d'azote et parfois de co-facteurs coûteux.

Dans l'invention, l'utilisation de milieux complexes n'est pas nécessaire. C'est ainsi que dans le cas de la bile nonfractionnée les seuls ingrédients supplémentaires recommandés sont des agents de régulation du pH et une faible quantité de source d'azote, mais ils ne sont pas essentiels.

Dans le procédé de l'invention, la transformation sélective des acides biliaires peut être effectuée dans le milieu de culture pendant ou après la croissance de l'organisme mutant. Le composé biliaire peut être ajouté en une seule fois, par portions ou en continu et le procédé peut ere mis en oeuvre en discontinu, semi-discontinu ou continu. La concentration préferée, mais non limitative, des acides biliaires dans la culture, est de l'ordre de 0,1 à 100 g/litre.Avant l'inoculation, le microorganisme mutant peut croître dans tout milieu de-développement approprié, puis être inoculé dans le milieu de transformation On peut utiliser des substances nutritives supplémentaires ou d'au- tres sources de carbone et d'énergie, si nécessaire. Comae sources de carbone et d'énergie préférées, on citera le glucose, le glycérol, l'extrait de levure, des acides gras et similaires, alors que comme sources d'azote, on.préfêre les sels d'ammonium, la liqueur d'infusion de mais, la farine de soja, la farine de graines de coton, la farine de poisson et similaires. N'importe quelle température de culture peut etre appliquée. On peut utiliser des températures entre 10 et 45 C, mais de préférence entre 25 et 300 C.

Des temps de culture appropriés sont mis en évidence à la lecture des exemples ci-dessous.

Un moment approprié pour la récolte peut être choisi en surveillant un ou plusieurs des paramètres tels que la densité des cellules microbiennes, l'absorption de lumière W d'un filtrat de culture, le taux d'oxygène dissous, l'oxygène dans les gaz évacués de la cuve-de culture ou l'analyse chromatographique du filtrat de culture.

Les produits de transformation peuvent être récu- prés de diverses manières, tel que par adsorption sur une résine échangeuse d'anions et élution ultérieure, ou par extraction du milieu de culture avec un solvant organique approprié non-miscible a l'eau et cristallisation ultérieure. Cependant, selon un procédé préféré, les cellules bac atériennes indésirées sont séparées- par centrifugation, la liqueur est filtrée goutte à goutte sur une colonne de perles de polymère poreuses, puis lavée avec de l'eau pour éliminer les composés inorganiques, et les produits de transformation sont recueillis par traitement de la colonne avec du méthanol ou de l'éthanol.Les produits de transformation peuvent également être séparés avec les cellules bactériennes, puis récupérés par extraction avec un solvant approprié, tel que l'méthanol ou l'éthanol-eau dans le procédé préféré.

Comme composés préférés préparés par le procédé de l'invention, on citera les suivants la 12 ç -hydroxyl-1,4-androstadiène-3,17-dione, la 12 ss -hydroxyl-1,4-androstadiène-3,17-dione, la 7 O1 , 12 d -dihydroxy-1,4-androstadiène-3, 17-dione, la 7 α , 12 ss -hydroxyl-1,4-androstadiène-3,17-dione, la 7 α -hydroxy-1,4-androstadiène-3,17-dione, la 6 d -hydroxy-1,4-androstadiène-3,17-dione, l'acide 12 d-hydroxy-3-oxo-1,4-prEgnadiène-20-carboxylique, 11 acide 7 i -hydroxy-3-oxo-1,4-prégnadiène-20-carboxylique, l'acide 6 d -hydroxy-3-oxo-1,4-prégnadíene-20-carboxylique, l'acide 7 , 12 α-dihydroxy-3-oxo-1, 4-prégnadienne-20-car- boxylique, l'acide 6 α,7α -dihydroxy-3-oxo-1,4-prégnadiène-20-carbo- xylique, l'acide 3-oxo-1,4-prégnadiène-20-carboxylique, la 3,12-dihydroxy-9,10-séco-1,3,5(10)-androstatriene-9,17- dione, la 3,7-dihydroxy-9,10-seco-1,3,5(10)-androstatriene-9,17- dione, la 3,6-dihydroxy-9,10-séco-1,3,5(10)-androstatriene-9,17- dione, la 3,7,12-trihydroxy-9,10-séco-1,3,5(10)-androstatriène-9, 1 7-dione, la 3, 6,7-trihydroxy-9,10-séco-1,3,5 (1O)-androstatriène-9, 17-dione, la 3-hydroxy-9, 10-séco-1,3,5(10)-androstatriène-9,17- dione, plus commodément ci-apris ADD désigne -1,4-androstadidne-3,1,-dione, acide OPDC désigne l'acide -3-oxo-1,4-prégnadiène-20-carboxylique et sécophénol desi- gne des composés possédant le radical 3-hydroxy-9,10-séco- 1,3,5(10)-androstatriène-9,17-dione).

Les exemples non-limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention.

Exemple 1
Isolement des mutants Ps5-16, PS5-18 et S5-22 à partir de
Pseudomonas putida ATCC 31752 et du mutant PS8-10 à partir de Pseudomonas sp. MR119
On transfère un plasmide transmissible codant pour le transposon Tn5 de résistance à la kanamycine dans
P. putida ATCC 31752 en utilisant une modification du mode opératoire de filtration décrit par Lai, Panopoulos et
Shaffer, Phytopathology 67, 1044-50 (1977). On trouve des plasmides transmissibles appropriés dans E. coli 1830 (pJB4JI) et E. coli 1041 (pSUP1011). Le plasmide se suicide en pénétrant dans ATCC 31752.La sélection pour la rétention du transposon Tn5 dans ATCC 31752 se fait en déposant le mélange forme sur des milieux de composition sui- vantes K2HP04 7g
KH2PO4 3 g
(NH4)2804 2 g
Succinate de sodium 1,62 g
Eau desionisee 1 litre, et on stérilise la solution en chauffant à 121O C pendant 20 minutes. Puis on ajoute 0,15 g de kanamycine avant le dépit sur les plaques, comme c'est le cas avec un melange d'éléments à l'état de traces.

Ce mode opératoire a pour but d'obtenir l'insertion de Tn5 dans le génome de ATCC 31752, de manière à pouvoir inactiver par mutagénèse par transposon, les enzymes impliquées dans le dégradation des composés stérol dit ques de formules générales I à III ci-dessus. On transfère des transconjugants obtenus, tel qu'indiqué, par croissance sur le milieu ci-dessus, et on les depose en petits tas sur des plaques d'un milieu de meme composition que ci-dessus, si ce n'est qu'on remplace le succinate de sodium par 2 g d'acide cholique.Parmi les 1012 clones vérifiés, 2 sont trouvés avoir un bloc génétique au site de trans for- mation 12 g-hydroxy--+ 12 /-hydroxy et 3 au site d'hyroxylation 9 i . On a trouve que ceux-ci accumulaient des produits de formule générale I. On obtient en outre 5 souches qui sont bloques sur le site de dégradation de sécophénol et accumulent des composés de formule générale III. On effectue une expérience similaire en utilisant le type sauvage Pseudomonas sp. MR119 et on obtient 2 mutants qui sont bloqués sur le site de dégradation de l'acide BPDC et accumulent des composes de formule générale II.

L'un des mutants montrant un blocage au site de transformation 12 α -- > 12 ss est appelé PS5-16 et celui montrant un blocage au site d'hydroxylation 9 a est appelé Ps5-18. L'un des mutants de MR119 montrant un blocage au site de transformation de l'acide OPDC est appelé PS8-10 et celui des mutants de ATCC 31752 montrant un blocage au site de transformation de sécophénol est appelé PS5-22.

PS5-16 et PS5-18, PS8-10 et PS5-22 croissent phénotypiquement lentement sur les acides coliques de désoxycholiques, comme seules sources de carbone, mais ils sont incapables de croître sur le 7 α, ,12 ss ss-dihydroxy ADD. L'accumulation des produits de 12 g -hydroxy ADn par PS5-16 à partir des substrats appropriés est vérifiée dans les exemples ulté- rieurs, de même qu'on met en évidence l'accumulation de divers produits de 12 / -hydroxy ADD par PS5-18 et des acides OPDC de formule générale II par PS8-10 et des sécophe- nols stéroïdiques de formule générale III par PS5-22.

Exemple 2
Transformation de l'acide cholique en 7 α, 12α -dihydroxy
ADD par le mutant PS5-16
La composition du milieu utilisé est, par litre
K2HP04 3,5 g
KH2PO4 1,5 g
(NH4)2S04 2,0 g
Glycérol 2,0 g
Eau ordinaire 2 litres et on ajuste à un pH de 7,0 avant de stériliser en chauffant à 1210 C pendant 20 minutes.

On ensemence 400 ml du milieu ci-dessus avec PS515, on laisse croltre pendant 24 heures, puis on utilise le milieu pour inoculer 12 litres du même milieu (milieu de fermentation). On ajoute 2 ml d'un silicone comme antimous- se et on laisse croître la culture inoculée avec aération pendant 24 heures, puis on ajoute 24 g de cholate de sodium.

On poursuit la fermentation pendant encore 26 heures dans les mêmes conditions de croissance. Après cette période de fermentation, on refroidit brusquement le mélange a 5 C et on centrifuge pour obtenir une phase liquide surnageante claire avec des cellules bactériennes et un produit prXci- pité. On fait passer la liqueur surnageante sur un lit d'adsorbant nonionique A polymère approprié, un copolymère polystyrène-divinylbenzène (l'Amberlite XAD-2 est un adsorbant préféré), pour adsorber le produit.On lave ensuite le lit d'adsorbant avec de l'eau désionisée pour éliminer es matières inorganiques indésirables et on recueille le produit par lavage de l'adsorbant avec du méthanol ou de l'éthanol. On mélange celui-ci avec le produit obtenu par extraction de la phase solide provenant de la centrifugation, avec du méthanol ou de l'méthanol aqueux à 70 l, chaud. On concentre les extraits réunis par évaporation de la plus grande partie du méthanol ou de méthanol sur un bain de vapeur d'eau et au refroidissement on obtient un bon rendement (jusqu't 17 g) de 7α ,12α -dihydroxy ADD brut.Celui-ci peut être purifié par recristallisation dans du méthanol ou de l'éthanol aqueux.

Exemple 3
Transformation de l'acide désox chou ue en 12 A-hydroxy
ADD par Ps5-16
En remplaçant le cholate de sodium par le désoxycholate de sodium, dans les conditions décrites dans l'Exemple 2, on obtient 15,9 g de 12 < -hydroxy ADD avec un bon rendement.

Exemple 4
Transformation des acides biliaires de bile de bétail et de mouton par PS5-16
On utilise le milieu décrit dans l'Exemple 2, si ce n'est qu'on remplace le glycérol et le cholate de sodium par de la bile mixte de bétail et de mouton concentrée < a 70 % poids/poids de solides), à raison de 10 g/litre.Autrement, la fermentation est effectuée de la manière décr- te dans l'Exemple 2, si ce n'est qu'on n'ajoute pas d'acides biliaires après 24 heures et que la fermentation est terminée en 26 heures On recueille les produits comme dans 1'Exemple 2, avec un bon rendement atteignant 76 g de 70(, 12 A-dihydroxy ADD et 5,5 g de 12 -hydroxy ADD On peut séparer ces produits par chromatographie sur une colonne de gel de silice avec des mélanges de n-butanol et de chlorure de méthylène comme éluants. L'élut comprenant 1 8 de n-butanol dans du chlorure de méthylène ne contient que le 12 α;-hydroxy ADD, alors que l'éluat avec 20 % de butanol dans du chlorure de méthylbne ne contient que le 7d t 12 α-dihydroxy ADD. Les produits recueillis par chromatographie sur gel de silice peuvent être encore purifiés par recristallisation dans de l'éthanol aqueux.

Exemple 5
Transformation de concentrations plus élevées d'acides cho- liques et désoxycholique en des composés hydroxy-ADD par
PS5-16
En ajoutant une plus grande quantité d'acide cholique ou d'acide désoxycholique que dans les modes opératoires décrits dans les Exemples 2 et 3 respectivement, soit 20 g/litre, on obtient un meilleur rendement en produits par litre de liquide de rermentation. Dans cet exemple, on ajoute le cholate de sodium ou le désoxycholate de sodium par portions, ou en continu, de 24 à 36 heures après le debut de la fermentation.

On utilise les 400 ml dtinoculum préparés comme dans l'Exemple 2 pour inoculer 4 litres du même milieu (de fermentation) qu'on laisse croître avec une aération de 125 ml d'air/litre de milieu. Lorsqu'on utilise du désoxycholate de sodium, on ajoute 80 g de désoxycholate de sodium et 60 heures plus tard, lorsque tout le 6soxycho late est totalement utilisé après 4 heures au maximum, déterminé par exemple par une analyse par chromatographie en phase liquide haute pression, et que seul un produit est présent, on stérilise le mélange de fermentation, on refroidit et on centrifuge On traite le liquide surnageant comme dans l'Exemple 2 pour obtenir 21,5 g de produit, qui apparaît être du 12 i-hydroxy-ADD presque pur, alors que le résidu contenant les cellules bactériennes est extrait avec de L'méthanol ou du méthanol et l'extrait évaporé, pour donner 27,9 g de produit. Celui-ci apparaît être du 12 α-hydroxy ADD presque pur. On purifie les deux produits en 12 $-hydroxy ADD pur par une autre cristallisation dans du méthanol ou de l'éthanol aqueux. On obtient un rendement semblable en 7α,12α-dihydroxy-ADD lorsqu'on utilise du cholate de sodium ExemE
Transformation de l'acide cholique en 7,12 9-dihydroxy
ADD par PS5-18
En remplaçant PS5-16 par PS5-18 dans les conditions décrites dans l'Exemple 3, on Qbtient un rendement élevé (16,9 g) de 12 -hydroxy ADD correspondant, qu'on purifie encore par recristallisation dans du méthanol ou de méthanol aqueux.

Exemple 7
Transformation de l'acide désoxycholique en 12 ss-hydroxy
ADD par le mutant Ps5-18
En remplaçant PS5-16 par PS5-18 dans les conditions décrites dans l'Exemple 3, on obtient un rendement élevé (17,5 g) de 12ss-hydroxy ADD correspondant.

Exemple 8
Transformation de l'acide chénodésoxycholique en 7α-hydro- xy ADD par le mutant PS5-18
En remplaçant l'acide cholique par l'acide chéno désoxycholique dans les conditions décrites dans l'Exemple 6, on obtient un rendement élevé (15,6 g) de 7d -hydroxy
ADD correspondant.

Exemple 9
Transformation de l'acide hyodésoxycholique en 6oC-hydroxy
ADD par le mutant Ps5-13
En remplaçant l'acide hyodésoxycholique par l'a- cide cholique dans les conditions décrites dans l'Exemple 6, on obtient un rendement élevé (15,8 g) de 6 -hydroxy
ADD correspondant.

Exemple 10
Transformation d'acides biliaires de bile de bétail et de mouton par Ps5-18
En remplaçant PS5-16 par PS5-18 dans les conditions décrites dans l'Exemple 4, on obtient des rendements élevés d'un mélange de 7α,12α-hydroxy ADD et de 12ss-hy- droxy ADD, qui peuvent être séparés de la même manière que les produits de l'Exemple 4.

Exemple 11
Transformation de l'acide lithocholigue en ADD par PS5-18
En remplaçant l'acide cholique par l'acide litho cholique dans les conditions décrites dans l'Exemple 6, on obtient un rendement élevé de ADD (15 g) correspondant.

Exemple 12
Transformation de concentrations plus élevées d'acides bi liai.res en comeosés d'hydroxy ADD par PS5-18
En remplagant PS5-16 par PS5-18 comme dans l'exem- ple 5 et en utilisant l'acide biliaire approprié à la concentration indiquée dans cet Exemple, tout en suivant les modes opératoires décrits, on obtient un rendement beaucoup plus élevé de produits par litre de liquide de fermentation.

Exemple 13
Transformation de l'acide cholique en 7α, 12ss-dihydroxy sécophénol par Ps5-22
En remplaçant PS5-16 par PS5-22 dans les conditions décrites dans l'Exemple 2, si ce n, est qu'on ajoute 100 mg de L-tryptophane par litre de milieu, on obtient un rendement élevé (14,4 g > de 7α,12ss-dihydroxy sécophé- nol correspondant.

Exemple 14
Transformation de l'acide désoxycholique en 12-hydroxy sécophénol par le mutant Ps5-22
En remplaçant PS5-16 par PS5-22 dans les conditions décrites dans Exemple 3, si ce n'est qu'on ajoute 100 mg de L-tryptophane par litre de milieu; on obtient un rendement élevé de 12ss-hydroxy sécophénol (16,5 g) correspondant.

Exemple 15
Transformation de l'acide chénodésoxycholique en 7α-hydro- xy sécophénol par le mutant PS5-22
En remplaçant PS5-18 par PS5-22 dans les conditions décrites dans l'Exemple 8, si ce n'est qu'on ajoute 100 mg de L-tryptophane par litre dans le milieu, on ob tient un rendement élevé (14,8 g) de 7o < -hydroxy sécophénol correspondant.

Exemple 16
Transformation de l'acide lithocholique en sécophénol par
PS5-22
En remplaçant PS5-18 par PS5-22 dans les conditions décrites dans l'Exemple 11, si ce ntest qu'on ajoute 100 mg de L-tryptophane par litre de milieu, on obtient un rendement élevé (16,0 g) de sécophénol correspondant.

Exemple 17,
Transformation des acides biliaires de bile de bétail et de mouton par PS5-22
En remplaçant PS5-16 par PS5-22 dans les conditions décrites dans l'Exemple 4, si ce n'est qu'on ajoute 100 mg de L-tryptophane par litre de milieu, on obtient des rendements élevés d'un mélange de 7 ss-dihydroxy et de 12 -hydroxy séeophénols, qui peuvent être séparés de la mdme manière que les produits de l'Exemple 4.

Exemple 18
Transformation de concentrations plus élevées d'acides biliaires en composés d'hydroxy sêcophénol parPS5-22
En remplaçant PS5-16 ou PS5-18 par PS5-22 comme dans les Exemples 5 et 12 et en utilisant l'acide biliaire approprié ou un concentré de bile de bétail et de mouton, aux concentrations utilisées dans ces exemples, tout en suivant les modes opératoires décrits, on peut obtenir un rendement beaucoup plus élevé en produits de sécophénol par litre de liquide de fermentation.

Exemple 19
Transformation de l'acide cholique en acide 7α, 12α-dihy- droxy OPDC par le mutant PS8-10
La composition du milieu utilisé, par litre, est la suivante
K2HP04 3,5 g
KH2P04 1,5 g
(NH4)2S04 2,0 g
Glucose 2,0 g
Eau ordinaire 1 litre.

On dissout les phosphates de potassium et le sulfate d'ammonium dans une partie de l'eau ordinaire et on stérilise en chauffant à 121 C pendant 20 minutes et on dissout le glucose dans une autre portion de lveau ordinaire, puis on stériliste séparément de la même manière. On mé- lanye les ingrédients stérilises séparément en utilisant des modes opératoires aseptiques appropries. On ensemence 200 ml du milieu ci-dessus avec pS8-iO, on laisse croxtre pendant 24 heures, puis on utilise pour inoculer 4 litres du même milieu (milieu de fermentation).On ajoute 2 ml d'un silicone comme antimousse et on lasse croître la culture inoculée avec aération pendant 6 heures, puis on ajoute 8 g de cholate de sodium. On poursuit la fermentation pendant encore 20 heures dans les mêmes conditions de crois sanve. Après cette période de fermentation, on refroidit brusquement le mélange à 50 C et on centrifuge pour obtenir une phase liquide surnageante claire avec des cellules bac atériennes et un produit précipité. On fait passer la li- queur suriiageant sur un lit d'adsorbant nonionique polymere approprié, un copolymère polystyrène-divinylbenzêne (l'Am- berlite XAD-2 est un adsorbant préféré), pour adsorber le produit. On lave alors le lit d'adsorbant avec de l'eau désionisée pour éliminer les substances inorganiques indé- sirables et on récupère le produit en lavant l'adsorbant avec du méthanol ou de l'éthanol. On mélange celui-ci avec le produit obtenu par extraction de la phase solide prove nant de la centrifugation avec du méthanol ou de méthanol.

On concentre les extraits réunis par évaporation de la plus grande partie du méthanol ou de l'éthanol au bain de vapeur d'eau et au refroidissement on obtient un bon rendement (jusqu'à 7 g) d'acide 7 ,12 i-dihydroxy OPDC brut. Celui ci peut être purifié par une recristallisation dans du méthanol ou de l'méthanol aqueux.

Exemple 20
Transformation de l'acide désoxycholique en acide 12α- hoxy OPDC par PS8-10
En remplaçant le cholate de sodium par le ddso- xycholate de sodium dans les conditions décrites dans l'Exemple 18, on obtient 6,9 g d'acide 12 g-hydroxy OPDC.

Exemple 21
Transformation de l'acide chénodésoxycholique en acide 7 -hydroxy OPDC par PS8-10
En remplaçant le cholate de sodium par le chino- desoxycholate de sodium dans les conditions décrites dans l'Exemple 18, on obtient l'acide 7 -hydroxy OPDC avec un rendement élevé (5,3 g).

Exemple 22
Transformation des acides biliaires de bile de bétail et de mouton par PS8-10
Le milieu utilisé est celui décrit dans l'exemple 18, si ce n'est que le glucose et le cholate de sodium sont remplacés par de la bile mixte de bétail et de mouton concentrée (à 70 % poids/poids de solide, à raison de 10 g par litre On effectue par ailleurs la fermentation de la manière décrite dans l'Exemple 18, avec l'exception qu'on n'ajoute pas d'acide biliaire après 6 heures et que la fermentation est terminée 20 heures apres le début. On recueille les produits comme dans l'Exemple 2, et on obtient un bon rendement, jusqutà 9 g, d'acide 7 ,12 -dihydroxy OPDC et 3 g d'acide 12 g -hydroxy OPDC.On peut sXparer ces produits par chromatographie de leurs esters méthyliques sur une colonne de gel de silice avec des mélanges d'hexane, d'acétate d'éthyle et d'éthanol comme éluants. L'éluat comprenant 55 % d'acétate d'éthyle dans l'hexane ne contient que l'ester methylique de l'acide 12 α-hydroxy OPDC, alors que l'élut comprenant 5 % d'éthanol dans l'acétate d'éthyle ne contient que l'ester méthylique de l'acide 7 ,12 i- dihydroxy OPDC.Les produits récupérés par chromatographie sur gel de silice peuvent être encore purifiés par recristallisation dans de l'éthanol aqueux
Exemple 23
Transformation des acides biliaires dans de fortes concen trati9ns de bile de bétail et dé mouton par PS8-10
En ajoutant une quantité de bile de bétail et de mouton concentrée plus importante que dans l'Exemple 21, par exemple 50 g/litre, on peut obtenir une concentration beaucoup plus élevée de produits que dans Exemple 21. La seule modification apportée au mode opératoire de l'Exempie 21 est qu'on ne peut recueillir les produits qu'apures 46 heures.

Exemple 24
Transformation de concentrations plus élevées d'acides cho ligue, désoxycholique ou chénodésoxycholique en composés d'hydroxy OPDC par P88-10
En ajoutant une quantité de l'acide biliaire approprio plus important que dans les modes opératoires utilises dans les Exemples 18 à 20 respectivement, par exem- ple 10 g par litre, on peut obtenir un rendement plus grand de produits par litre de liquide de fermentation. Dans cet
Exemple, on ajoute le sel de sodium de l'acide biliaire ap- proprio, stérilisé, par portions ou en continu de 24 a 36 heures après le début de la fermentation.La seule autre modification apportée aux modes opératoires de ces exemples respectifs est qu'on ne peut recueillir les.produits qu'après 56 heures. Le rendement en acide 12α-hydroxy OPDC a partir de 40 g de désoxycholate de sodium est de 30,6 g.

Eu égard à la mise en oeuvre de l'invention, il est evident qu'on peut utiliser divers autres plasmides transmissibles dans l'opération de mutagénèse par transposon, plutôt que le transposon de résistance à la kénamycine
Tn5. C'est ainsi que par exemple, on pourrait utiliser comme transposons de résistance aux dédicaments
(i) le transposon de résistance Tnl concernant
la résistance à la pénicilline ou à la car
bénicilline ;
(ii) le transposon de résistance Tn7 concernant
la résistance a la streptomycine ; et
(iii) le transposon de résistance TnlO concernant
la résistance à la tétracycline.

D'autres transposons ne concernant pas la résistance aux medicaments peuvent également être utilisés, on citera par exemple le Tn501 concernant la résistance au mercure.

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé microbien de conversion de composés stéroîdiques possédant au moins un groupe hydroxyle, dont l'un est en position 3, en des composés qui présentent un intérêt en tant qu'intermédiaires dans la production de produits pharmaceutiques térodiques de formules génerales I, II ou III.

et (iii) on isole le ou les dits composés.

des composes de formules générales I, Il ou III ;

un groupe 3-hydroxyle de manière à produire un ou

aqueux en présence d'un acide biliaire contenant

de formules générales I, Il ou III ;; (ii) on cultive le dit mutant dans un milieu de culture

enzymes impliquées dans la dégradation de composés

souche de type sauvage de manière à inactiver les

transmissible est incorpore dans le génome de la

tagénèse par transposon dans laquelle un plasmide

ce de carbone et d'énergie, par une technique de mu

res contenant un groupe 3-hydroxy comme seule sour

aptitude à utiliser des substrats d'acides biliai

d'une bactérie gram-négative caractérisée par son

droxyle ; caractérise en ce que (i) on construit un mutant d'une souche de type sauvage

dans lesquelles R1, R2 et R3 sont l'hydrogène ou un groupe hydroxyle, à condition que (a) R1, R2 et R3 ne soient pas simultanément un groupe hydroxyle (b) R3 et R1 ne soient pas simultanément un groupe hy

2. Procédé microbien selon la revendication 1, caractérisé en ce que le plasmide transmissible se suicide après la dite incorporation.

3. Procède microbien selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'operation (i) est effectuée en utilisant le dit plasmide transmissible codant pour un transposon de résistance aux médicaments.

4. Procédé microbien selon la revendication 3, caractérisé en ce que le transposon de résistance est le transposon de résistance à la kanamycine Tn5.

5. Procédé microbien selon la revendication 4, caractérisé en ce que le transposon de résistance à la kanamycine Tn5 est incorporé dans des souches de E. coli qui sont unies à des souches de Pseudomonas, après quoi on obtient une sélection des transconjugants intéressants sur un milieu de culture contenant de la kanamycine.

6. Procédé microbien selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on obtient des transconjugants ayant un bloc génétique sur au moins un des sites de transformation 12 A-hydroxy ou 12-hydroxy et sur le site d'hydroxylation 9 d.

7. Procédé microbien selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on obtient des transecnggants ayant un bloc génétique au site de dégradation d'OPDC.

8. Procedé microbien selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on obtient des transconjugants ayant un bloc génétique au site de dégradation de sécophénol.

9. Procédé microbien selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu de culture contient également un acide biliaire possédant des groupes 6- et 7et/ou 12-hydroxyle.

10. Procédé microbien selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu de culture contient également de la bile non-fractionnee.

11. Procédé microbien selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration de l'acide biliaire dans le milieu de culture est de 0,1 à îob litre

12. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'opération d'isolement (ici) consiste à éliminer les cellules bactériennes indésirables par centrifugation et percolation de la liqueur résultante à travers une co- lonne de perles de polymère poreuses ayant un lavage ulte- rieur avec de l'eau et un traitement de la colonne avec du méthanol ou de l'éthanol.

13. Procédé selon la revendication 11, caractéri- se en ce que les produits de transformation se trouvant avec les cellules bactériennes sont récupérés par extrac- tion avec de méthanol ou de l'etharloleau.