FR2485037A1

FR2485037A1 - Nouvelle souche bacterienne et ses mutants utiles pour stabiliser le vin, procede d'obtention de ces mutants, composition contenant cette souche ou ses mutants, procede de stabilisation du vin utilisant cette composition et vin ainsi stabilise

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Publication number: FR2485037A1
Application number: FR8112237A
Authority: FR
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1980-06-23
Filing date: 1981-06-22
Publication date: 1981-12-24
Also published as: AU7204981A; PT73242A; ES8300852A1; IT8167859A0; DZ309A1; PT73242B; IT1172245B; CH662819A5; DE3124404A1; ZA814074B; FR2485037B1; ES503277A0

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UNE NOUVELLE SOUCHE BACTERIENNE ET SES MUTANTS POUR STABILISER LE VIN, UN PROCEDE D'OBTENTION DE CES MUTANTS, UNE COMPOSITION CONTENANT CETTE SOUCHE OU SES MUTANTS, UN PROCEDE DE STABILISATION DU VIN UTILISANT CETTE COMPOSITION ET LE VIN AINSI STABILISE; POUR INTRODUIRE UNE FERMENTATION MALOLACTIQUE ENERGIQUE DANS LE VIN, ON AJOUTE APRES LA FERMENTATION PRIMAIRE DE NOUVELLES BACTERIES PRODUCTRICES D'ACIDE LACTIQUE APPELEES B-44-40 ET LEURS MUTANTS ANTIBIO-RESISTANTS APPELES BIO LOGICALS B-44-40; SELON UN MODE DE REALISATION PREFERE, ON PREPARE DES CULTURES DANS UN MILIEU CONTENANT DE L'ACIDE GLUTAMIQUE OU UN ACIDE SEMBLABLE COMME CRYOPROTECTEUR ET ON LES AJOUTE AU VIN SOUS UNE FORME LYOPHILISEE; LES CULTURES INDUISENT UNE FERMENTATION MALOLACTIQUE A DES TEMPERATURES ET DES PH PLUS BAS QUE LES CULTURES PRECEDEMMENT CONNUES.

Description

La présente invention concerne une nouvelle souche bactérienne et ses mutants utiles pour stabiliser le vin, un procédé d'obtention de ces mutants, une composition contenant cette souche ou ses mutants, un procédé de stabilisation du vin utilisant cette composition et le vin ainsi obtenu.

De façon générale l'invention concerne les processus de fermentation ainsi que les ingrédients et composés qui y sont utilisés. Plus particulièrement l'invention concerne une nouvelle composition d'origine microbiologique utile dans les processus de fermentation en particulier dans la production du vin et des procédés pour sa préparation et son emploi en fermentation.

On prépare les vins non mousseux par fermentation des sucres de jus de fruits. Après achèvement de la fermentation primaire, de nombreuses fermentations secondaires peuvent se produire. La plupart de ces fermentations secondaires sont indésirables et altèrent le vin. Toutes sont indésirables lorsqu'elles se produisent après la mise en bouteilles.

La fermentation secondaire la plus courante est la fermentation malolactique dans laquelle des micro-organismes provoquent une conversion de l'acide malique en acide lactique, les sucres étant transformés en acides et en autres composés organiques ou minéraux. I1 faut que la fermentation malolactique soit achevée avant la mise en bouteilles du vin ou empêchée avec un degré de sécurité très élevé. Si elle se produit après la mise en bouteilles, le dégagement de gaz et le développement des bactéries altèrent le produit.

On peut, pour éviter la fermentation malolactique, par exemple, filtrer pour éliminer les organismes qui la provoquent et la favorisent ou pasteuriser le vin pour désactiver les micro-organismes.

Ces deux façons de procéder sont coûteuses, réduisent la qualité du vin, par exemple en lui conférant des saveurs indésirables, et dans certains cas elles échouent. On considère que la fermentation malolactique est très souhaitable dans les vins rouges et dans certains vins blancs. Elle provoque une diminution naturelle de l'acidité et améliore les qualités organoleptiques.

On préfère donc favoriser et assurer l'achèvement de la fermentation malolactique avant la mise en bouteilles par addition au vin de micro-organismes produisant la fermentation malolactique.

On obtient ainsi un produit supérieur et stable.

Les phénomènes de la fermentation malolactique et l'importance de cette fermentation dans la vinification sont- bien connus. Dans de nombreuses régions viticoles, la microflore indigène peut provoquer une fermentation malolactique naturelle. Cependant il est fréquent que les organismes fermenta ires ne démarrent pas rapidement et on risque toujours que des organismes indésirables s'établissent et provoquent des effets secondaires faucheux.

On a dans une certaine mesure effectué une fermentation malolactique contrôlée avant la mise en bouteilles par emploi de cultures ajoutées. Cependant les cultures de micro-organismes que l'on a utilisées à cet effet manquent de certaines caractéristiques notamment la facilité d'emploi et la vigueur de culture. Les cultures précédemment utilisées doivent etre ajoutées au vin à un pH de plus de 3,3 et, pendant et après l'addition, le vin doit être maintenu à une température de 18 à 22 OC. Ces deux conditions peuvent ne pas toujours être possibles à obtenir ou souhaitables pour l'obtention de vins de qualité supérieure.

Dans de nombreux cas, le pH du vin, au moment où on désire induire la fermentation malolactique, est inférieur à 3,3 et il est particulièrement indésirable d'ajuster le pH à ce stade. La température de stockage du vin dans les cuves avant la mise en bouteilles est de préférence bien inférieure à 180 C, par exemple voisine de lO0C. De plus il est évidemment souhaitable en pratique industrielle d'effectuer la fermentation malolactique aussi rapidement que possible pour accroître le débit de production et réduire la durée de stockage.

La demanderesse a isolé une nouvelle bactérie appelée ici Leuconostoc B-44-40 qui, de façon étonnante, induit de façon efficace la fermentation malolactique lorsqu'on l'ajoute au vin. La nouvelle bactérie est plus vigoureuse que les souches bactériennes de Leuconostoc précédemment connues et utilisées à cet effet. De plus elle provoque énergiquement la fermentation malolactique à des températures inférieures à 180C et au moins aussi basses que lO0C et à des pH bas inférieurs à 3,3 par exemple s'abaissant jusqu'à environ 3,0.

De plus on a préparé des mutants antibio-résistants de
Leuconostoc B-44-40 que l'on appelle ci-après Leuconostoc Bio Logicals 44-40, qui sont également efficaces pour induire la fermentation malolactique, dans les memes conditions et qui de plus permettent la surveillance et le contrôle de la qualité du processus fermentaire.

L'invention concerne également ces nouvelles bactéries sous une forme lyophilisée avec comme cryoprotecteur un acide (ou un sel métallique correspondant) choisi parmi l'acide L-glutamique, l'acide DL-glutamique, l'acide L-aspartique, l'acide DL-a-aminopimélique, l'acide a-méthyl L-glutamique, l'acide malonique, l'acide
DL-malique, l'acide L-malique, l'acide a-cétoglutarique, l'acide
N-acétyl L-glutamique, l'acide N-diméthyl L-glutamique, l'acide
N-diméthyl L-aspartique, l'acide L-cystéique, la cystéine, la DLthréonine, l'acétylglycine, l'acide DL-pyrrolidone-5 carboxylique-2, l'acide aminomalonique, l'acide tartronique et la lysine. Parmi ce groupe, on préfère l'acide glutamique.De façon inattendue, ces cryoprotecteurs se sont révélés assurer la viabilité des cultures après lyophilisation, si bien que l'on peut utiliser de façon fiable la composition pour induire la fermentation malolactique par addition au vin, au stade approprié de la vinification. On peut ajouter l'acide glutamique ou un de ses sels tel quel ou le former in situ avant ou pendant la culture du micro-organisme, par exemple par hydrolyse ou réaction chimique d'une matière protéique ou similaires ou par hydrolyse de protéines ou peptides contenant de l'acide glutamique dans le milieu de culture.

La nouvelle souche bactérienne appelée ici Leuconostoc
B-44-40 a été isolée d'échantillons de vin ayant subi ou subissant une fermentation malolactique poussée produisant un vin de bonne qualité sans arrière-goût ni autre signe d'altération. On la cultive et l'isole selon les techniques microbiologiques de culture généralement admises. On fait pousser les cultures mixtes provenant d'un échantillon de vin sur un substrat contenant de l'acide lactique, du glucose ou similaires pour sélectionner et isoler les cultures ayant une croissance rapide. L'identité taxonomique- exacte de la culture n'est pas actuellement certaine par suite des difficultés bien connues de classification et de définitions qui existent dans ce domaine. La souche bactérienne B-44-40 appartient de façon certaine à la famille des bactéries productrices d'acide lactique.Il subsiste une certaine incertitude pour- savoir si on doit considérer qu'elle appartient au genre Leuconostoc species oenos ou au genre Pediococci. Dans tous les cas les réserves concernant la taxonomie des souches bactériennes
B-44-40 et Bio Logicals 44-40 s'appliquent au reste de la présente description.

La description taxonomique de la bactérie B-44-40 va maintenant être effectuée.

Taxonomie.

La bactérie B-44-40 a été classée comme un Leuconostoc oenos à partir des caractéristiques suivantes et de leur similitude avec les caractéristiques de cette souche décrite par Garvie (Garvie,
E. I. Leuconostoc Oenos SP. Nov. J. Gen Microbiol, 48, 431-438 1967).

Coloration de gram : positive
Présence de catalase : négative
Production de gaz à partir du glucose
Production d'acide D-lactique à partir du glucose
Production d'acide L-lactique à partir de L-malate
Catabolisme de l'acide citrique en présence de glucose
Catabolisme du L-malate en présence de glucose
Pas de production de dextrane a partir du saccharose
Production d'ammoniac et d'intermédiaires du cycle de l'urée à partir de l'arginine lors de la fermentation malolactique dans le vin
Production de mannitol à partir du fructose
Croissance sur les composés suivants comme sources uniques de carbone : D-glucose, D-fructose, D-ribose; tréhalose, cellobiose, esculine, salicine, maltose, D-mannose
Pas de culture sur les composés suivants comme sources uniques de carbone :D-désoxyribose, D-xylose, L-arabinose, L-rhamnose, saccharose, lactose, raffinose, glycérol, D-mannitol, acide L-malique, acide citrique, acide fumarique
Morphologie cellulaire : diplocoques (cocci par paires avec une tétrade unique en deux plans, formation de chaînes courtes et agrégats, taille 0,5-0,7 pm, culture et conversion du malate en lactate jusqu'à pH 3 ; pas de culture ou très faible culture à pH 2,9 ; culture et conversion du malate en lactate en présence de S02 libre jusqu'à 25 ppm, S02 total jusqu'a 100 ppm ; pas de culture pour une teneur en S02 libre supérieure 50 ppm et une teneur en S02 total supérieure à 200 ppm ; culture et conversion du malate en lactate pour une concentration en alcool de 16% en volume
Nécessite absolument des acides gras de type oléique.

Un échantillon viable de la souche B-44-40 a été déposé à la souchothèque du National Research Council, Ottawa, Canada où elle a reçu le numéro de référence 2477. Il y est maintenu sous une forme viable. Un autre dépôt a été effectué à llAmerican Type Culture
Collection où il a reçu le numéro de référence ATCC 31688.

Comme décrit plus en détail ci-après, selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on utilise des mutants antibio-résistants de B-44-40. Ces souches ont été appelées Bio Logicals 44-40 et des remarques semblables à celles concernant la souche
B-44-40 s'appliquent à la classification et à la nomenclature de ces mutants. La taxonomie des mutants utiles était essentiellement la même que celle de B-44-40 si ce n'est bien entendu la caractéristique additionnelle de résistance à au moins un antibiotique choisi.

Des échantillons viables de souches antibio-résistantes B-44-40 ont été déposés à l'American Type Culture Collection, où ils sont maintenus sous une forme viable, sous les numéros de référence suivants
résistant à la rifamycine B-44-40, R1-50 - ATCC 31689
résistant à la rifamycine B-44-40, Rl-100 - ATCC 31690
résistant à l'êrythromycine B-44-40, R1-25 - ATCC 31691
résistant à l'érythromycine B-44-40, R2-25 - ATCC 31692
résistant à l'érythromycine B-44-40, R1-40 - ATCC 31693
Les mutants antibio-résistants de B-44-40 appelés
Bio Logicals 44-40 sont préparés à partir de la souche parente
B-44-40 par mutation puis culture des mutants obtenus dans un milieu de culture favorisant la croissance contenant un antibio tique choisi.Par sélections et classages ou dilutions et cultures repétés, on isole et cultive une souche mutante dont la caractéristique d'identification est la viabilité en présence de l'antibiotique choisi.

Les procédés utilisés pour provoquer la mutation de la souche parente sont généralement les procédés classiques connus pour produire cet effet dans les techniques de culture microbiologiques. On peut adopter tout procédé provoquant chez la souche parente une modification chimique ou un clivage et unerecombinaison des chaînes d'ADN'des chromosomes cellulaires, de façon aléatoire ou dirigée. Par exemple on peut soumettre l'échantillon à l'action de la lumière ultraviolette ou de rayons X ou d'autres formes de rayonnements, ou de mutagènes chimiques ou cultiver sélectivement des mutants spontanés.

On peut utiliser pour cultiver et isoler les mutants antibio-résistants pratiquement tout antibiotique connu ou toute combinaison d'antibiotiques. On peut citer comme antibiotiques appropriés utiles dans un tel procédé, les antibiotiques couramment connus et qu'il est facile de se procurer consistant en la rifamycine, la streptovaricine, la streptolydigine, la tétracycline, la chlortétracycline, la gentamycine, l'ampicilline et les antibiotiques aminoglycosidiques tels que la streptomycine, la spectinomycine et d'autres antibiotiques macrolides tels que l'érythromycine et similaires et on préfère particulièrement la rifamycine et l'érythromycine. L'emploi de ces antibiotiques ou d'une de leurs combinaisons permet de produire et d'isoler des mutants différents appelés Bio Logicals 44-40 qui répondent tous à la taxonomie précédemment décrite et qui possèdent de plus la caractéristique d'être viables en présence de l'antibiotique choisi ou de la combinaison d'antibiotiques.

La résistance à un antibiotique spécifique ou à une combinaison d'antibiotiques constitue une caractéristique distinctive des souches Bio Logicals 44-40 qui permet de détecter facilement leur présence dans les liquides fermentés et qui constitue donc un moyen pratique pour le contrôle de la qualité et la surveillance du procédé. Les risques pour qu'un échantillon de vin choisi au hasard contienne une souche de micro-organismes résistant à un antibiotique spécifique par suite de processus naturels, sont
Si faibles (environ 1/107) qu'ils sont en pratique négligeables.Dans le cas d'une souche de micro-organismes résistant A deux antibiotiques spécifiques, les risque sont de façon correspondante plus faibles (1/1014). Donc, si la culture d'un échantillon devin dans un milieu contenant un antibiotique choisi conduit au développement d'un micro-organisme résistant aux antibiotiques, ce développement constitue une preuve de l'addition de ce micro-organisme résistant aux antibiotiques lors de la vinification. Des essais complémentaires pour caractériser la culture sont inutiles. Ceci permet d'effectuer des essais de contrôle de la qualité et des enquêtes concernant ce micro-organisme avec un degré de précision et de certitude rarement observé dans la fermentation des produits naturels.On peut détecter de façon certaine l'emploi du micro-organisme si bien que l'on peut établir qu'il est la cause d'effets spécifiques dans le vin. Les produits naturels fermentés résultent normalement d'une série complexe de processus microbiologiques qui utilisent un grand nombre de micro-organismes différents dont certains sont inconnus et non identifiés si bien qu'il est normalement difficile d'attribuer un effet ou une caractéristique spécifique quelconque du produit à un processus ou à un organisme spécifique quelconque. L'emploi des bactéries résistant aux antibiotiques selon l'invention permet également le marquage des vins, pour assurer des normes de production et l'authenticité.

Les compositions lyophilisées de micro-organismes que l'on a préalablement suggérées ou dont on a proposé l'emploi pour induire la fermentation malolactique avaient une efficacité imprévisible. Bien que certains échantillons de compositions aient donné des résultats satisfaisants (avec moins de vigueur qu'on le souhaiterait et avec les conditions d'emploi malaisées précédemment exposées) d'autres échantillons ayant apparemment la même composition se sont révélés totalement incapables d'amorcer la fermentation malolactique désirée. Ceci semble du à une destruction accidentelle des micro-organismes viables lors de la lyophilisation.

Selon une autre caractéristique de l'invention, on cultive le micro organisme utilisé pour amorcer la fermentation malolactique, pendant au moins une partie de son cycle de culture, dans un milieu contenant de l'acide glutamique ou d'autres molécules apparentées précitées.

De façon inattendue, les résidus d'acide glutamique/glutamate provenant du milieu de culture se comportent comme des cryoprotecteurs si bien que les cultures demeurent sous une forme biologiquement viable prête a l'emploi. Ceci s'applique aux souches B-44-40 et
Bio Logicals 44-40. Par conséquent, les compositions lyophilisées selon l'invention sont fiables et de façon régulière amorcent et provoquent une fermentation malolactique énergique dans une gamme étendue des conditions contrairement aux compositions lyophilisées précédemment connues.

Comme indiqué, le cryoprotecteur constitué d'acide glutamique/glutamate, peut être formé, au moins partiellement, in situ dans la bouillon de fermentation où l'on cultive B-44-40 ou
Bio Logicals 44-40 ou par I'hydrolysg de matières protéinées avant leur addition au milieu de culture. Ceci se produit lorsqu'on utilise, comme substrat de culture des micro-organismes, des protéines, peptides ou hydrolysats protéiques contenant des quantités d'importance raisonnable de précurseurs formant de l'acide glutamique.

il convient de noter a cet égard qu'il n'est pas satisfaisant d'effectuer les cultures en l'absence d'acide glutamique/glutamate puis d'ajouter de l'acide glutamique ou des glutamates au produit obtenu avant la lyophilisation. Cette façon de procéder n'assure pas l'obtention régulière d'une composition lyophilisée viable et efficace. Une molécule semblable à l'acide glutamique ou aux glutamates doit être présente comme résidu d'un milieu de culture pour qu'on obtienne un effet cryoprotecteur efficace régulier. On ne sait pas de façon certaine pourquoi-il en est ainsi.Cependant il semble que la raison de ce phénomène soit liée à la présence dans le cryoprotecteur d'un groupe produisant une liaison hydrogène pour former une relation mutuelle intracellulaire entre les molécules présentes dans le cytoplasme du micro-organisme et les molécules d'acide glutamique ou de glutamate transportées a partir du milieu de culture.

Lorsqu'on utilise la souche parente s-44-40 pour amorcer la fermentation malolactique, l'acide glutamique/glutamate doit bien sur etre présent lors de la culture. Lorsqu'on utilise un mutant Bio Logicals 44-40, l'acide glutamique/glutamate doit être présent lors de la culture du mutant.

On ajoute de préférence le cryoprotecteur au milieu de culture au début du processus de croissance du micro-organisme et sous forme d'acide glutamique. Comme généralement le milieu contient divers sels minéraux pour favoriser la croissance, une quantité importante, sinon la totalité, de l'acide glutamique est transformée en glutamates dans le milieu. Les quantités appropriées d'acide glutamique que l'on ajoute au milieu culture pour obtenir une cryoprotection suffisante du produit final sont comprises entre environ 0,1 et environ 5% (en poids par volume), de préférence entre environ 0,5 et environ 2%.

Avec la condition ci-dessus concernant la présence de glutamate ou d'un autre cryoprotecteur précité, le milieu de culture de B-44-40 et de Bio Logicals 44-40 est généralement classique et peut etre facilement conçu, ajusté et optimalisé par l'homme de l'art. De façon fondamentale, le milieu est un liquide aqueux contenant des sels minéraux tels que le phosphate de potassium et de magnésium et le sulfate de manganese, le sulfate ferreux, etc., un substrat pour le micro-organisme tel que l'acide malique, le glucose, les aminoacides, les vitamines, les acides gras et les substances tampons convenant en biologie pour permettre l'ajustement du pH à une valeur conduisant à la croissance optimale comprise normalement entre 3,0 et 7,0 La substance tampon doit permettre de maintenir un pH constant dans le milieu. On effectue les cultures pratiquement en anaérobiose ou microaérophílie.

Après la culture, on recueille les micro-organismes dans le milieu selon des techniques classiques, par exemple par centrifugation et/ou filtration, puis on lyophilise la masse. On effectue également cette lyophilisation selon des techniques classiques qui consistent à soumettre la masse à des températures basses dans un environnement a faible pression. Le produit obtenu est une substance fluide en poudre ou en particules que l'on peut conserver à sec, de préférence dans des recipients bouches, pendant des durées prolongées, avant de l'ajouter à du vin lors de la vinification.

Les quantités de composition lyophilisée que l'on ajoute au vin pour provoquer la fermentation malolactique n'ont pas de limitation particulière, mais les quantités efficaces sont très faibles. Lorsqu'on les exprime par le nombre des micro-organismes viables, les quantites appropriées peuvent être aussi faibles que 100 organismes viables par ml de vin. Les quantités pratiques sont comprises entre environ 102 et 108 et, de préfé- rence, entre 106 et 10 micro-organismes viables par ml. En d'autres termes, 1 g de composition suffit pour provoquer la fermentation malolactique de 2500 à 25 000 litres de vin.En pratique, on prefère donc melanger la composition lyophilisée avec un support solide inerte convenant en biologie de façon à la diluer et à obtenir des quantites de matière faciles à mesurer pour effectuer l'addition. Des supports appropriés sont la terre de diatomées et d'autres formes d'argiles sans danger, la poudre de cellulose, les silicates, et des matières semblables. Un mélange contenant 1 a 5 % en poids de composition lyophilisée convient et est pratique.

Comme précédemment indiqué, les cultures de l'invention sont plus vigoureuses et agissent dans une gamme de conditions plus étendue pour induire la fermentation malolactique que les micro-organismes précédemment indiqués. En ce qui concerne la vigueur, B-44-40 provoque des conversions du malate nettemment plus rapides dans des conditions semblables que l'un quelconque des micro-organismes connus que sont Lact. Delbruchii, Ped. Cerevisiaes
Lact. Buchneri ; Leu. Oenos ML-34, Leu. Oenos P-6, Lact. Hildigardii et Lact.Prevo ; par exemple, dans des essais comparatifs directs avec Leuconostoc Oenos ML-34, avec un milieu de Rogosa à pH 5,5 à la température ordinaire, B-44-40 produit un nombre maximal de bactéries en quatre jours, tandis que ML-34 produit son nombre maximal de bactéries (nettement moindre) après 13 jours.

L'extension de la gamme des pHsdans laquelle on peut effectuer la fermentation malolactique jusqu'S un pH de 3,0, est un avantage pratique très important. On ne connaît pas d'autres cultures permettant d'effectuer la fermentation malolactique a un pH inferieur à 3,2. Au moment de la mise en bouteilles, lorsqu'il est souhaitable d'effectuer la fermentation malolactique, beaucoup de vins ont un pH inférieur a 3,2. Ces vins peuventaugmenterle pHa mesure qu'ils vieillissent dans la cave, mais il est indésirable d'attendre jusqu ce que ce processus ait commencé pour demarrer la fermentation malolactique, en raison du risque d'effets secondaires indé- sirables resultant d'organismes naturels qui peuvent contaminer le vin.La possibilité de débuter la fermentation malolactique un pH de 3,0 avec les micro-organismes de l'invention est un avantage important qui reduit encore les risques d'altération du vin.

De même, la possibilité d'operer a des temperatures plus basses jusqu'à environ lO0C, avec les micro-organismes de l'invention est un avantage important. C'est une température souhaitable pour les celliers de vinification a laquelle on peut effectuer autant d'opérations de vinification, après la fermenta- tion primaire, qu'on le désire. Les autres micro-organismes connus utilisés pour la fermentation malolactique n'agissent de façon efficace qu'à une tempêrature d'au moins 180C, ce qui est indesirable.

On constate parfois que la composition lyophilisée de micro-organismes de l'invention a des difficultes pour amorcer spontanement la fermentation malolactique dans certains types de vins. La raison de cette difficulté peut Etre-que le vin présente à cet effet un mauvais equilibre des substances nutritives et de l'acidité. Dans ce cas, on peut, pour assurer encore la fermenta- tion malolactique avec la composition, ajouter au départ l'organisme lyophilisé à un bouillon d'ensemencement contenant du milieu GMT ajusté à pH 4-7. Ceci facilite au micro-organisme le retour- de son état lyophilise a un état métabolique d'activite maximale pour l'introduction dans les milieux analogiques sous-optionnels.Après avoir ainsi incube pendant une période de 8 à 72 h, par exemple, une quantité initiale comprise entre environ 1 x 108 et environ 9 1 x 10 cellules bactériennes par millilitre de milieu, on peut ajouter la totalité du bouillon au vin et la fermentation malolactique commence ensuite sans difficulté.

L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants.

EXEMPLE 1 - SELECTION DES SOUCHES
On prepare des souches isolées de façon aléatoire à partir de diverses sources naturelles. On fait tout d'abord passer des échantillons de vin à travers un filtre stérile ayant des pores de 0,65 /um pour éliminer les levures puis à travers un filtre sterile ayant des pores de 0,45 Xum que l'on place sur une botte de milieu de Rogosa (Difco) et qu'on incube à 30"C jusqu'à ce qu'apparaissent des colonies distinctes. Généralement, on n'obtient qu'une souche isolée à partir d'un échantillon, cette souche étant toujours constituée par l'organisme -prédominant. Si possible, on isole. les souches alors que les vins subissent une fermentation malolactique.On opère ainsi pour être sar que les organismes isolés sont les organismes prédominants responsables de la fermentation malolactique.

La bacterie appelée B-44-40 a été ainsi isolee d'un vin California Chardonnay.

EXEMPLE 2 - ENRICHISSEMENT ET SELECTION DES SOUCHES
On mesure la masse cellulaire avec un colorimètre
Klett Summerson. On utilise un filtre rouge n" 66 avec le vin et un filtre vert nO 54 avec les milieux synthetiques. On agite energi- quement les tubes à essai à bouchon vissé mesurant 10 x 100 mm en
Kimex ou en Pyrex contenant 5 ml de vin pour la détermination optique de la masse cellulaire. On cultive les cellules à 220C sauf indication contraire. On introduit toutes les souches sélectionnees comme précédemment décrit dans des tubes à essai dans des conditions variables de concentration en alcool, de pH et de température.

EXEMPLE 3 - ENRICHISSEMENT EN FONCTION DE L'ALCOOL
On remplit des groupes de six tubes (à bouchon vissé mesurant 10 x 100 mm) avec 5 ml d'un échantillon de vin. On ajoute de l'méthanol pur à 95 % dans les tubes pour obtenir des concentrations finales en alcool de 13,0 %, 14,0 %, 14,5 %, 15,0 %, 15,5 % et 16,0 % (en volume). On place chaque micro-organisme dans un ensemble de tubes à essai à une concentration cellulaire initiale comprise entre 5 x 104 et 5 x 105 cellules/millilitre et on mesure la croissance comme précédemment décrit. On choisit les organismes ayant une tolérance élevée vis-à-vis de l'alcool.

Les bactéries B-44-40 se développent bien à des concentrations en alcool de 16 % en volume et sont capables d'effectuer une fermentation malolactique dans tous les vins etudies à cette concentration en alcool.

EXEMPLE 4 - ENRICHISSEMENT EN FONCTION DU pH
Les- conditions pour l'enrichissement en fonction du pH sont les mêmes que pour l'enrichissement en fonction de la concentration en alcool si ce n'est que, dans les divers tubes, le pli et non la teneur en alcool varie. On utilise des pH de 3,0, 3,3 et 3,7. On sélectionne les souches en fonction du développement à un pH bas.

Les bacteries B-44-40 se développent à pH 3,0 et permettent d'effectuer une fermentation malolactique à ce pH. Les bac tueries B-44-40 se développent mieux à un bas pH que les autres souches étudiées.

EXEMPLE 5 - TOLERANCE VIS-A-VIS DE LA TEMPERATURE
Les conditions d'enrichissement en fonction de la température sont les mêmes que les conditions d'enrichissement en fonction de la concentration en alcool si ce n'est que la température et non la concentration en alcool varie. Les températures etu diées sont 100C, 2O0C et 300 C. On sélectionne les souches qui se développent à basse température.

Les bacteries B-44-40 se développent mieux å basse temperature (100C) que toutes les autres souches étudiées et elles permettent d'effectuer une fermentation malolactique a cette tempe- rature.

EXEMPLE 6 - SELECTION EN FONCTION DU EETABOLIStE DU MALATE
Les conditions pour la selection en fonction de la conversion du malate sont celles decrites pour les conditions de croissance normale dans le vin. Après inoculation, on mesure chaque jour la teneur en malate des echantiilons. On determine la teneur en malate par spectrométrie avec les réactifs et les modes operatoires de Boehringer Mannheim. Parmi toutes les souches etudiees, la souche B-44-40 permet l'achèvement d'une fermentation malolactique avant toutes les autres souches.

EXEMPLE 7 - SOUCHES RESISTANT AUX ANTIBIOTIQUES
A des boites de milieu nutritif tel que le milieu de
Rogosa, on ajoute des quantites variables de l'antibiotique Rifampin (rifamycine) ou de llantibiotique érythromycine. La teneur en antibiotique des boites varie de 10 /ug/ml à 100 /ug/ml. Le Rifampin et l'érythromycine sont sous la forme la plus pure dont on dispose.

On cultive les bactéries B-44-40 dans des milieux GMT (décrits ci-après) jusqu'à la densité maximale. On etale sur chaque boîte
8 0,2 ml de liquide de culture (environ 2 x 10 cellules), puis on incube les boites à 30 C jusqu'à ce qu'on puisse observer des colonies séparées. On considère que les colonies qui se développent normalement (par rapport aux bactéries B-44-40 non traitées) sur les boîtes contenant les antibiotiques, résistent à la concentration correspondante en antibiotique. On place les colonies résistantes sur des boites séparées pour effectuer l'isolement. On soumet ces colonies à de nouveaux essais comparatifs avec des bactéries B-44-40 normales ne résistant pas aux antibiotiques, c'est-à-dire-la souche parente, pour s'assurer qu'elles résistent bien aux concentrations en antibiotique indiquées.On obtient les souches suivantes
1. Rif-Rl-50 presente une résistance au Rifampin à
50 /ugJml ; premier isolement ;
2. Rif-RI-100 présente une résistance au Rifampin a
100 /ug/ml ; premier isolement ;
3. Ery-Rl-25 présente une résistance à l'érythromycine
a 25 g/ml ; premier isolement ;
4. Ery-R2-25 présente une résistance à l'erythromycine
à 25 r g/ml ; second isolement ;
5. Ery-Rl-40 présente une resistance à l'érythromycine
à 40 Z g/ml ; premier isolement.

EXEMPLE 8 - PROTECTION CRYOGENIQUE
La survie élevée des bactéries lors de la lyophilisation repose sur l'emploi d'acide glutamique et d'autres composés contenant un groupe formant une liaison hydrogène et deux groupes acides. Plusieurs caracteristiques des processus de culture et de lyophilisation sont essentielles à l'obtention d'une survie élevée des bactéries, à savoir des milieux de culture appropries, le pH des milieux de culture contenant le mélange cryogenique, le pourcentage de mélange cryogénique utilise et la phase de croissance lorsque les cellules sont recueillies etlyophilisées.

On cultive les bactéries B-44-40 dans du milieu
GMT préparé de la façon suivante.

On autoclave ensemble pendant 15-min à 121 C un mélange à 1,0 % d'extrait de levure, 0,25 % de Tween 80, 0,068 % de phosphate monopotassique, 0,057 % de sulfate de magnésium heptahydrate, 0,012 % de sulfate de manganèse monohydraté, 0,003 % de sulfate ferreux heptahydraté et 1 % de citrate de sodium. Après autoclavage, on ajoute 1 % de glucose préalablement stérilise. Le melange cryogenique utilisé est constitué de 1% de glutamate de sodium, 0,1 % de malate et 0,05 OS % de cystéine. On ajoute ce mélange aux milieux après autoclavage sous forme d'un melange stérilise par filtration. On ajuste le pH du mélange obtenu à 4,5 avec de l'acide acétique glacial. On cultive les cellules bactériennes jusqu'à ce qu'on atteigne une densite comprise entre 1 x 109 et 2 x 109 cellules/millilitre et on recueille alors les cellules et on les lyophilise. Avant la lyophilisation on congèle rapidement les cellules à -8O0C et on les place dans l'appareil de lyophilisation à l'état congelé en veillant à ce qu'elles ne se decongèlent pas.

EXEMPLE 9 - ADDITION DE BACTERIES LYOPHILISEESA DU VIN
Pour obtenir les meilleurs résultats, on doit ensemencer le vin pendant ou peu de temps après l'achèvement de la fermentation primaire. Aucun traitement spécial du vin n'est nécessaire. On place la culture bactérienne lyophilisée directement dans le vin et il est recommandé que lrinoculum corresponde à 106 cellules/millilitre.

On associe la culture bactérienne à un dispersant spécial, par exemple de la terre de diatomees, pour faciliter son mélange rapide et homogène dans le vin à traiter.

La préparation des bactéries B-44-40 est conçue de telle sorte qu'on puisse les utiliser dans des vins ayant un pH inférieur à 3,3 et à des temperatures inférieures à 150C. Après inoculation du vin, on peut suivre la teneur en ma la te par simple chromatographie. Lorsque tout le malate a été consomme, on peut separer la lie qui peut s'être accumulée lors de la fermentation secondaire. On peut utiliser comme bactéries B-44-40 ou les souches résistant aux antibiotiques Bio Logicals 44-40. Dans ce dernier cas, si l'utilisateur désire identifier la presence des bactéries dans un vin donne, il peut déterminer le besoin absolu d'acide oleique ou le marqueur de résistance aux antibiotiques de la souche, en plus de l'aspect morphologique.

Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportees par l'homme de l'art aux dispositifs ou procedés qui viennent d'être decrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention.

Claims

REVENDICATIONS

1. Composition pour induire la fermentation malolactique caractérisée en ce qu'elle consiste en la souche de micro-organismes

Leuconostoc B-44-40 ou ses mutants antibio-résistants Bio Logicals 4440, sous une forme biologiquement viable en association avec un support biologiquement acceptable.

2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le support convenant en biologie est constitué par des restes des milieux utilisés pour le développement biologique du micro-organisme.

3. Composition selon la revendication 9 caractérisée en ce que les restes de milieux comprennent de l'acide glutamique et/ou ses sels biologiquement acceptables.

4. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que le micro-organisme et l'acide glutamique et/ou ses sels sont sous une forme lyophilisée, l'acide glutamique et/ou ses sels agissant comme des cryoprotecteursdu micro-organisme lyophilisé pour le maintenir sous une forme biologiquement active.

5. Composition selon la revendication 4 caractérisée en ce que le micro-organisme est une souche de Leuconostoc antibiorésistante Bio Logicals 44-40.

6. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle est en mélange avec un poids au moins égal d'une matière fluide en particules convenant en biologie pour accroître le volume et favoriser la dispersion de la composition dans un milieu aqueux.

7. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que les restes de milieux contiennent un acide qui se comporte comme un cryoprotecteur dans la lyophilisation ultérieure des cellules, cet acide étant choisi parmi l'acide a-cétoglutamique, l'acide Malique, l'acide DL-malique, l'acide L-aspartique, l'acide DL- -ami- nopimélique, l'acide a-méthyl L-glutamique, l'acide malonique, l'acide N-acétyl L-glutamique, l'acide N-diméthyl L-glutamique, l'acide N-diméthyl L-aspartique, l'acide L-cystéique, la cystéine, la DL-thréonine, l'acétylglycine, l'acide DL-pyrrolidone-5 carboxylique-2, l'acide D-glutamique, l'acide DL-glutamique, Itacide

L-glutamique, l'acide aminomalonique, l'acide tartronique et la lysine.

8. Procédé pour préparer de nouvelles bactéries productrices d'acide lactique antibio-résistantes du genre Leuconostoc ou Pediococcus, constituant les souches Bio Logicals 44-40 caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver des bactéries de la souche B-4440 dans un milieu favorisant la croissance dans des conditions essentiellement anaérobies, provoquer la mutation de cette souche B-44-40, cultiver les mutants obtenus en présence d'antibiotique et récupérer une souche mutante antibio-résistante Bio Logicals 44-40 dans le milieu de culture des mutants.

9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on cultive les mutants bactériens de B-44-40 dans un milieu favorisant la croissance contenant de l'acide glutamique et/ou ses sels convenant en biologie.

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comporte un stade de récupération à partir du milieu favorisant la croissance, apres le stade de culture des mutants, d'une souche bactériennebiologiquementviable de Bio Logicals B-44-40 en association avec de l'acide glutamique résiduel et/ou un glutamate et de lyophilisation de la composition récupérée.

11. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comporte de plus un stade ultérieur de mélange intime de la composition lyophilisée sous une forme seche, avec un poids au moins égal d'un support fluide en particules biologiquement acceptable.

12. Nouvelles bactéries productrices diacide lactique biologiquement viables du genre Leuconostoc ou Pediococci constituant les souches Bio Logicals 44-40, ces souches résistant au moins à un antibiotique et étant capablesd'induire la fermentation malolactique dans le vin à des temperatures inférieures à 180C et à un pH infe- rieur à 3,3.

13. Procédé pour traiter du vin pour induire une fermentation malolactique rapide contrlée caractérisé en ce qu'il consiste å ajouter au vin une composition selon l'une quelconque des revendications 1, 4 ou 6.

14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend l'addition d'environ 105 & à micro-organismes viables de la composition par millilitre de vin.

15. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'on effectue l'addition au vin à une température comprise entre 80C et 18"C et à un pH inférieur à 3,3.

16. Vin stabilisé contre la fermentation malolactique caractérisé en ce qu'il contient des bactéries productrices d'acide lactique biologiquement viables du genre Leuconostoc ou Pediococcus constituant une souche Bio Logicals 44-40, cette souche résistant à au moins un antibiotique et étant de plus capable d'induire une fer mentation malolactique dans le vin.