FI96966B - Ilmentämiskasetti hirudiinivariantin tuottamiseksi hiivassa, sitä sisältävä plasmidi, sillä transformoitu hiivasolu ja menetelmä hirudiinivariantin valmistamiseksi hiivasolun avulla - Google Patents
Ilmentämiskasetti hirudiinivariantin tuottamiseksi hiivassa, sitä sisältävä plasmidi, sillä transformoitu hiivasolu ja menetelmä hirudiinivariantin valmistamiseksi hiivasolun avulla Download PDFInfo
- Publication number
- FI96966B FI96966B FI873068A FI873068A FI96966B FI 96966 B FI96966 B FI 96966B FI 873068 A FI873068 A FI 873068A FI 873068 A FI873068 A FI 873068A FI 96966 B FI96966 B FI 96966B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- yeast
- hirudin
- gene
- plasmid
- sequence
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Botany (AREA)
- Virology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
96966
Ilmentämiskasetti hirudiinivariantin tuottamiseksi hiivassa, sitä sisältävä plasmidi, sillä transformoitu hiivasolu ja menetelmä hirudiinivariantin valmistamiseksi hiivasolun avulla 5
Keksintö kosekee ilmentämiskasettia hirudiinivariantin tuottamiseksi hiivassa, sitä sisältävää plasmidia, sillä transformoitua hiivasolua ja menetelmää hirudiinivariantin valmistamiseksi hiivasolun avulla.
10 Keksintö koskee FI-patenttihakemukseen 865303 teh tyjä parannuksia. Kuvataan iilimadon (H. medicinalis) hi-rudiinin aktiivisuutta omaavan proteiinin ilmentämiskasettia.
FI-patenttihakemuksessa 865303 esitetään menetelmä, 15 joka mahdollistaa hirudiinin tuottamisen eritettynä aktii visessa muodossa kasvatusympäristöön hiivassa, kuten S. cerevisiae.
Keksintö koskee uusia vektoreita, jotka varmistavat hirudiinin, erityisesti HVl:n tuottamisen parhaimmissa 20 olosuhteissa.
Erityisesti keksintö koskee toiminnallista DNA-fra-gmenttia eli ilmentämiskasettia hirudiinivariantin tuottamiseksi hiivassa, jolle ilmentämiskasetille on tunnusomaista, että se sisältää: 25 a) ensimmäisen DNA-fragmentin, joka koodaa hirudii nivariantin HV1 prekursoria, jolloin prekursori sisältää hirudiinivariantin, kuten kuviossa 10 esitetyn hirudiinva-riantin, ja enemmän kuin kaksi aminohappoa käsittävän lisäalueen, joka on peptidisidoksella liittynyt hirudiini-30 variantin N-päähän ja joka sisältää yhden ainoan yscF-pro- : teinaasin tunnistaman pilkkomiskohdan, joka on dipeptidi
Lys-Arg, kuten kuviossa 7 on esitetty, ja joka muodostaa em. lisäalueen C-pään, b) toisen DNA-fragmentin, joka koodaa leader-pepti-35 diä, joka on α-tekijän pre-pro-prekursorin pre-pro- tai 2 9ύ:·ίό pro-fragmentti, jolloin toinen DNA-fragmentti on liittynyt oikeassa lukuvaiheessa ensimmäisen DNA-fragmentin 5-pää-hän, ja c) asianmukaiset säätelyalueet em. DNA-fragmenttien 5 ilmentämiseksi, kuten PGK-geenipromoottori.
Ilmentämiskasetit eli DNA-fragmentit, jotka mahdollistavat hirudiinivariantin tuottamisen hiivassa sisältävät siten vähintään sekvenssin:
10 - str - Lex * scl '9«eni H
jolloin geeni H on hirudiinia tai sen varianttia koodattava geeni, geenin H ollessa keksinnön mukaisesti edullisesti HV1 koodittava geeni, mahdollisesti geeniä H voi 15 seurata hiivan lopetussekvenssi, esimerkiksi PGK-geenin lopetussekvenssi, - on DNA-sekvenssi, jossa on geenin H transkriptiota hiivassa varmistava signaali, - Lm on geenituotteen erittymiselle tarpeellinen 20 leader-sekvenssi, - SC| on DNA-sekvenssi, joka koodittaa proteinaasin yscF pilkkomiskohdan, joka esiintyy sekvenssissä vain kerran ja joka sijaitsee hirudiiniprekursorissa välittömästi H-geenin yläpuolella, lisäksi Sd-geeni H -elementti voi 25 olla toistettuna usean kerran.
Tämänkaltainen ilmentämisfragmentti mahdollistaa yksiselitteisen, toiminnallisen ja oikean proteiinin saannin.
EP-patenttijulkaisussa 168 342 on kuvattu desulfa-30 tohirudiinin ekspressiota hiivassa Saccharomyces cerevi- : siae. Esitetyn desulfatohirudiinin sekvenssi (kaava 1, sivu 5) poikkeaa kuitenkin tässä kuvatun HIVl-variantin sekvenssistä (kuvio 10), joka alkaa ATGrlla ja jonka loppupäässä on 40 emästä enemmän. Vaikka nämä viimeiset 40 35 emästä alkavat TGA:11a (lopetuskodoni), niillä saattaa olla vaikutusta transkriptioon.
3 96966 EP-patenttijulkaisussa 168 342 ei myöskään kuvata hirudiinin erittymistä ja kypsymistä aktiiviseksi proteiiniksi. EP-patenttijulkaisussa 168 342 kuvatun keksinnön keksijät joutuvat ensin rikkomaan solut, jotta he voisivat 5 ottaa hirudiinin talteen. Sitten heidän täytyy poistaa kaikki ei-proteiiniaineosat ja puhdistaa sekä seulota jäännös proteiininsa löytämiseksi. Esillä oleva keksinnön mukaisesti hirudiini erittyy solun ulkopuolelle leadersek-venssin ansiosta ja muodostaa kypsyän proteiinin pilkko-10 miskohdassa tapahtuvan pilkkomisen ansiosta. Hyvin harvat hiivaproteiinit erittyvät solun ulkopuolelle, joten hirudiinin talteenotto on helppoa ja tehokasta.
FI-patenttihakemuksessa 865303 esitetyllä konstruktiolla S. cerevisiae tuottaa hirudiinia prekursorimuo-15 dossa, jossa on kaksi proteinaasin yscF pilkkomiskohtaa, geenin KEX2 tuotteena (1). Entsyymin yscF endopeptidaasi-aktiivisuus on tarpeellinen tämän hirudiiniprekursorin maturaatiolle. Silti vasta toisessa, kauempana NH2-päästä olevassa, kohdassa pilkkoutuminen vapauttaa aktiivisen hi-20 rudiinin; toisaalta, kun pilkkoutuminen tapahtuu ensimmäisessä eikä toisessa pilkkoutumiskohdassa, erittyy pitempi muoto, joka eroaa hirudiinistä siten, että NH2-päässä on ylimääräisiä aminohappojäännöksiä. Tämä ei-toivottu muoto voi kontaminoida toiminnallisen ja oikean hirudiinin puh-^ 25 distuksen eri vaiheissa, mikä vaikeuttaa puhdistusmenetel mää ja johtaa puhtaan hirudiinin alennettuun saantoon.
Esillä olevan keksinnön mukaisesti syntetisoidaan hiivassa hirudiinin prekursori, jossa on vain yksi yscF-proteinaasin pilkkomiskohta, jolloin sen maturaatio hiru-30 diiniksi johtaa vain halutun muodon erittymiseen.
; Lex-sekvensseistä mainittakoon erityisesti ns. pre- pro-sekvenssi, joka aikaansaa hiivan alfa-sukupuolifero-monin erittymisen.
Erittymisen esimerkkisysteemiksi on tässä valittu 35 alfa-feromonin erittyminen, ts. yllä esitetyssä sekvens- 4 Q(' , Λ,/ , sissä Lex edeltää hiivan alfa-sukupuoliferomonigeeniä, mutta muitakin systeemejä voisi käyttää (esimerkiksi Killer-proteiinin systeemiä) (4).
Edullisessa muodossa on mielenkiintoista, että toi-5 minnalliset fragmentit sisältävien plasmidien isäntähiivat voivat olla mitä tahansa sukupuolta ja voidaan lisäksi kasvattaa selektiopaineen puuttuessa.
Näissä olosuhteissa transformoidut hiivat voidaan käyttää teollisesti erityisen käyttökelpoisella tavalla. 10 Tähän tarkoitukseen keksintö esittää edellä esitet tyjä DNA:ta ilmentäviä fragmentteja, joissa sekvenssi S,, sisältää hiivan geenipromoottorin, joka ei ole MF-alfa-geenin promoottori ja joka esimerkiksi voi olla hiivan PGK-geenin promoottori.
15 FI-patenttihakemuksessa 865303 esitetyissä kon- strukteissa hirudiiniprekursorin geeni transkriptoituu MF-alfa-1 -geenin promoottorin avulla. Tämä promoottori toi. mii maksiroaalisesti Mat-alfa -sukupuolta olevassa kannassa. Isännän valinta rajoittuu siksi näihin kantoihin, mikä 20 sulkee pois Mat-a-tyyppiset kannat sekä sukupuolettomat diploidit ja polyploidit kannat. Erityisesti tämä sulkee pois teollisuudessa käytetyt hiivakannat, jotka usein kuuluvat viimeiseksi mainittuun kategoriaan. Vaihdettaessa promoottori saavutetaan hirudiinin itsenäinen ilmentyminen ! 25 riippumatta isäntäkannan sukupuolesta.
Yleisesti nämä DNA-fragmentit sisältyvät plasmidei-hin, joissa on hiivan replikaation aloituskohdan lisäksi esimerkiksi 2 μ-plasmidin replikaation aloituskohta.
Vektoreiden konstruktoinnin helpottamiseksi plasmi-30 dit voivat olla coli-hiiva -sukkulaplasmideja ja ne voivat ; sisältää elementtejä, jotka mahdollistavat ilmentämisen E.
colissa, kuten esimerkiksi pBR322:n replikaatiokohdan sekä selektiomerkin, kuten ampR. Nämä plasmidit sisältävät myös hiivan selektiomarkkerin, esimerkiksi eräiden kemiallisten 35 yhdisteiden resistenssiä koodittavan geenin tai geenin, G h G f- h
g s KJ s Kj \J
joka mahdollistaa auksotrofian komplementoinnin; erityisen edullinen on geeni URA3.
WO-patenttijulkaisussa 86/01224 on esitetty, että määrätyt mutaatiot, jotka plasmidin välityksellä antavat 5 5-FU-resistenssin urat -muodoksi transformoidussa ura3-kannassa, antavat suuremman valinnanvapauden näiden trans, formoitujen kantojen kasvatusolosuhteisiin nähden; erityisesti voitiin käyttää teollisesti käytettyjä kompleksisia alustoja.
10 Tämä keksintö koskee erityisesti HVl-variantin syn teesiä ja erittymistä.
HVl-geeni on jo aikaisemmin syntesoitu kemiallisesti E. colissa ilmentämistä varten (FR-patenttijulkaisu 8413250).
15 Pääosa FR-patenttijulkaisussa 8413250 käytetyistä synteettisistä oligonukleotideistä on säilytetty HVl-pre-kursoria koodittavan sekvenssin konstruoimiseksi, paitsi ne, jotka antavat sekvenssin ylä- ja alapuolelle kiinnitettyjen sekvenssien liittymäkohdat.
20 Eritetyn hirudiinin saaminen edellyttää prekurso- rin, joka sisältää tarvittavan informaation kyseessä olevan peptidin erittymistä ja oikeaa maturaatiota varten käyttäen hiivan normaalia ainevaihduntareittiä. FI-patent-tihakemuksessa 865303 on esitetty, että alfa-tekijän pre-25 kursorin NH2-pään sekvenssi voidaan käyttää hirudiinin Invariantin erittämiseen. Tämä keksintö koskee tämän erit-tymissysteemin soveltamista HVl-varianttiin.
Keksintö koskee siten erityisesti toiminnallista DNA-fragmenttia, joka mahdollistaa hirudiinin tuottamista 30 hiivassa ja joka sisältää vähintään: - HVl-geenin, - DNA-sekvenssin (S*), jossa on HVl-geenin transkription hiivassa mahdollistava signaali.
Tämä toiminnallinen fragmentti integroituna plas-35 midiin tai hiivan, edullisesti Saccharomyces-lajin, kro- 9 6 > 6 6 6 mosomiin, voi mahdollistaa hirudiinin erittymisen edellä mainitun hiivan transformoinnin jälkeen joko aktiivisessa muodossa tai inaktiivisena prekursorina, josta voidaan aktivoimalla regeneroida hirudiini.
5 Nämä toiminnalliset fragmentit edustavat edullises ti seuraavaa rakennetta: - str - Lex - Scl - geeni H - 10 - jossa H-geeni on HV1 koodittava geeni; halutessa H-geeniä seuraa hiivan lopetussekvenssi, kuten esimerkiksi PGK-geenin lopetussekvenssi, -S,, on DNA-sekvenssi, jossa on H-geenin transkription hiivassa mahdollistava signaali, 15 - Lex on geenituotteen erittymiselle tarpeellinen leader-sekvenssi, - Scl on DNA-sekvenssi, joka koodittaa pilkkomiskoh-dan, jossa halutessa 3'-päässä on kodoni ATG tai kaksi Lys-Arg koodittavaa kodonia tai viisi Ser-Leu-Asp-Lys-Arg 20 koodittavaa kodonia ennen H-geeniä, - lisäksi Scl-geeni H -elementti voi olla toistettuna useaan kerään.
Esimerkkinä Lex-sekvenssistä mainittakoon hiivan sukupuoli-alfa-feromoni ja S^-sekvenssistä mainittakoon MF-25 alfa-geenin promoottori sekä myöskin PGK-geenin, mutta muutkin sekvenssit voidaan käyttää, erityiseksi esimerkiksi on valittu alfa-feromonin erittymissysteemi, ts. edellä mainitussa L^-sekvenssi on hiivan sukupuoli-alfa-feromonin geeni, mutta muitakin systeemejä voidaan käyttää (esimer-30 kiksi Killer-proteiinin systeemiä) (4).
Hirudiinin erittymisen ohjaamiseksi viljely-ympäristöön vastaava geeni integroidaan hiivan vektoriin tai plasmidiin, joka sisältää yllä esitetyn toiminnallisen fragmentin sekä vähintään yhden hiivan replikaation aloi-35 tuskohdan. Plasmidi sisältää edullisesti seuraavat elementit: 9 6 >· 6 o 7 - hiivan 2 μ-plasmidin replikaation aloituskohdan, - ura3-geenin, - E. colin replikaation aloituskohdan sekä anti-bioottiresistenssimerkin, 5 - MF-alfa-geenin 5'-alueen, joka sisältää trans kription promoottorin, leader-sekvenssin ja alfa-tekijän prekursorin pre-pro-sekvenssin, jolloin tämä sekvenssi on liitettynä HVl-hirudiinia koodittavan sekvenssin yläpuolelle samaan lukuvaiheistukseen, 10 - hiivan PGK-geenin transkription lopetuskohdan, joka on sijoitettuna hirudiinigeenin jälkeen.
Yleisesti ottaen keksinnön mukaiset ilmentämiskase-tit voivat integroitua hiivaan, erityisesti Saccharomyces-hiivaan, joko autonomisesti replikoituvaan plasmidiin tai 15 hiivan kromosomiin.
Kun plasmidi on autonominen se sisältää elementtejä, jotka takaavat sen replikaation, ts. replikaation aloituskohdan, kuten 2 μ-plasmidin replikaation aloitus-kohdan. Lisäksi plasmidissa voi olla selektioelementtejä, 20 kuten URA3-geeni tai LEU2-geeni, jotka mahdollistavat hii vojen ura3- ja leu2-komplementaation. Nämä plasmidit voivat lisäksi sisältää bakteereissa tapahtuvan replikaation mahdollistavia elementtejä, jolloin plasmidin täytyy olla sukkulaplasmidi, kuten esimerkiksi pBR322-plasmidin repli-25 kaation aloituskohdan, geenimerkin kuten AmpR ja/tai muita alan asiantuntijalle tunnettuja elementtejä.
Keksintö koskee myös keksinnön mukaisella ilmentä-miskasetilla transformoitua hiivaa, joko plasmidin välityksellä tai integroituna kromosomeihin, erityisesti Sacc-30 haromyces-kantoja ja erityisesti S. cerevisiae-kantoja, . jotka ovat Mat-a-sukupuolta edustavia tai diploideja tai polyploideja kantoja, mutta erityisesti ura+ -muotoon keksinnön mukaisen plasmidin avulla transformoituja ura+ -hiivakantoja, jotka ovat muuttuneet resistenteiksi 5-35 fluoriurasiilille, jolloin nämä kannat voidaan viljellä teollisella alustalla.
8 96> to
Kun promoottori on feromoni-alfa-geenin promoottori, hiiva voi edullisesti olla sukupuolityyppiä Mat-alfa. Käytetään esimerkiksi genotyypiltään ura3- tai leu2- olevaa kantaa tai muuta, joka komplementoidaan plasmidilla, 5 jolloin varmistetaan plasmidin pysyminen hiivassa käyttäen sopivaa selektiopainetta.
Lopuksi keksintö koskee menetelmää hirudiinivarian-tin valmistamistamiseksi viljelemällä edellä esitetty transformoitu hiiva viljelyalustalla ja ottamalla viljely-10 alustaan tuotettu hirudiini talteen toiminnallisessa muodossa tai hirudiinin prekursorina, jota voidaan maturoida in vitro tai in vivo.
Vaikka onkin mahdollista tuottaa hirudiinia viljelemällä edellä esitettyjä transformoituja kantoja muokatulla 15 viljelyalustalla, jolloin hirudiini kerääntyy soluihin, on kuitenkin edullisempaa saattaa hirudiini eritetyksi vilje-lyalustaan joko aktiivisessa muodossa tai in vitro muokattavissa olevan prekursorin muodossa.
Tämä maturaatio voidaan suorittaa useammassa vai-20 heessa. Voi olla tarpeellista ensin pilkkoa pois määrättyjä elementtejä, jotka johtuvat Lex-sekvenssin kääntämisestä, jolloin pilkkoutuminen tapahtuu Scl-sekvenssiä vastaavalla tasolla. Toiminnallista hirudiinia voi edeltää me-tioniini, joka voidaan selektiivisesti pilkkoa pois syano-25 geenibromidilla. Tämä menetelmä on käyttökelpoinen, koska hirudiinia koodittava sekvenssi ei sisällä metioniinia.
On myöskin mahdollista, että N-päässä esiintyy di-peptidi Lys-Arg, joka pilkotaan pois COOH-kohdasta spesifisen endopeptidaasin avulla, tämä entsyymi on aktiivinen 30 erittymisprosessin aikana, jolloin voidaan suoraan saada . aktiivinen proteiini ympäristöön. Mutta joissakin tapauk sissa voi tulla tarpeelliseksi suorittaa entsymaattinen pilkkominen vasta erittymisen jälkeen lisäämällä spesifistä entsyymiä.
g 9 6 v 6 ö
Joissakin tapauksissa, varsinkin syanogeenibromidi-käsittelyn jälkeen, proteiinin renaturaatio voi olla tarpeen, jotta disulfidisillat palautuvat. Tämän aikaansaamiseksi peptidi denaturoidaan esimerkiksi guanidiinikloo-5 rihydraatilla, jonka jälkeen renaturoidaan pelkistetyn ja hapetetun glutationin läsnä ollessa.
Keksinnön mukaisesti saatu hirudiini voidaan käyttää trombiiniinhibiittorina, hyytymistä estävänä lääkkeenä, laboratoriotuotteena koagulaation estäjänä ja/tai di-10 agnostisena aineena käyttäen leimattua tuotetta.
Erityisesti HV1 voidaan käyttää farmaseuttisissa koostumuksissa, yksinään tai yhdistettynä muihin aktiivisiin aineosiin tai in vitro- tai in vivo -testeissä ja diagnostiikassa. Viimeksi mainitussa tapauksessa voi olla 15 mielekästä leimata molekyyli esimerkiksi radioaktiivisella, fluoresoivalla, entsymaattisella tai muunlaisella merkkiaineella.
Seuraavat esimerkit kuvaavat keksinnön muut ominaisuudet ja edut.
20 Liitteenä olevissa kuvioissa kuvio 1 esittää M13TG897-faagin konstruktion ja rakenteen, kuvio 2 esittää M13TG897-faagin ja M13TGl827-faagin DNA:n in vitro mutageneesin: 25 a) mutageneesin oligonukleotidisekvenssi, b) M13GT897-faagin DNA:n oligonukleotidin kanssa hybridisoituva osasekvenssi, c) mutatoitunut sekvenssi, kuvio 3 esittää plasmidin pTG883 konstruktion, 30 kuvio 4 esittää plasmidin pTG892 konstruktion, : kuvio 5 esittää faagin M13TG889 konstruktion, kuvio 6 esittää plasmidien pTG1828 ja pTG1833 rakenteet , kuvio 7 esittää eri plasmidien sisältämiä sekvens-35 sejä vastaavan hirudiiniprekursorin rakenteen; esitetään 10 9696b a) lähempänä NH2-päätä olevan (lys arg) -pilkkoutumiskohdan ja b) toiminnallisen HV2-hirudiinin (NH2-Ile-Thr- jne.) 1iittymiskohdan.
kuvio 8 esittää HVi:tä koodittavan DNA-sekvenssin 5 synteesissä käytettyjen oligonukleotidien sekvenssit ja restriktiokohdat, kuviot 9 ja 10 esittävät syntetisoidun HVl:tä koodittavan DNA-sekvenssin restriktiokartan ja sekvenssin kääntämisen aminohapoiksi.
10 FI-patenttihakemuksessa 865303 esitettyjä plasmide- ja ja käytettyjä strategioita ei ole toistettu tässä julkaisussa.
Esimerkki 1
Plasmidi pTG897 sisältää hirudiinin prekursorin 15 geneettisen informaation, joka sisältää vain yhden proteiinin yscF pilkkomiskohdan. Maturaatio tässä pilkkomis-kohdassa vapauttaa inaktiivisen hirudiinin. Proteinaasin yscF pilkkomisreaktio vapauttaa NH2-päästään 4 jäännöksellä, Glu Ala Glu Ala, pidennetyn hirudiinimolekyylin. Tätä 20 Glu Ala Glu Ala -sekvenssiä koodittavan DNA-fragmentin de-leetio mahdollistaa oikealla tavalla prosessoidun hirudii-niketjun vapauttamisen. Tämä deleetio suoritettiin käyttämällä in vitro -mutageneesimenetelmää.
Plasmidi pTG897 pilkottiin kaksoisdigestiolla ent-25 syymeillä Pstl-Bglll, hirudiinisekvenssin sisältävä DNA- fragmentti kloonattiin yksisäikeisen faagin M13TG131 rep-likatiiviseen muotoon, jolloin saatiin faagi M13TG897 (kuvio 1) .
Hybridisoitiin seuraavan sekvenssin omaava oligo- 30 nukleotidi: 5'-TCTTTGGATAAAAGAATTACGTATACAGAC-3' faagin M13TG897 genomiseen DNA:hän. Tämän oligonukleotidin 35 ensimmäinen osa (15 emästä) hybridisoituu välittömästi de- 11 96:. 6 o letoitavan sekvenssin yläpuolella oleviin 15 emäkseen ja sen toinen osa välittömästi alapuolella oleviin 15 emäkseen (kuvio 2). Tätä oligonukleotidia käytettiin matriisina faagin M13TG897 genomin vastin, säikeen in vitro -5 synteesissä. Suoritettiin T4 DNA-ligaasikäsittely, jolloin juuri muodostunut säie sulkeutui kovalentisesti, jonka jälkeen transfektoitiin bakteerikanta, esimerkiksi JM103 [(Lac-Pro) SupE Thi EndlA sbcB15 strA rk-mk+/F'TraD36 ProAB+ Lad* LacZ M15] ja analysoitiin transfektion tulok-10 sena saadut faagit DNA-DNA -hybridisäätiön avulla käyttäen koettimena yllä esitettyä oligonukleotidia, leimattuna 32P-leimalla kinasoimalla, alan asiantuntijalle tavanomaisilla menetelmillä (2) . Oikealla tavalla mutatoitu faagi-DNA muodostaa mutageneesioligonukleotidin kanssa hybridikom-15 pieksin, joka voidaan tunnistaa suuremman stabiilisuutensa perusteella, paremman kykynsä perusteella vastustaa ankaria olosuhteita, kun taas ei-mutatoidun faagiDNArn ja oli-gonukleotidin muodostama hybridikompleksi destabiloituu yksisäikeisen DNA-silmukan läsnäolon takia.
20 Esimerkki 2
Mutatoidun fragmentin siirtäminen uuteen ilmentä- misvektoriin
Plasmidista pTG897 on johdettu plasmidi pTG883 yksinkertaisesti PGK-geenin transkription lopetuskohdan lä-25 heisyydessä olevan Bglll-kohdan suppressiolla.
Tämän aikaansaamiseksi plasmidi pTG876 digeroitiin osittain Bglll-entsyymillä, jonka jälkeen annettiin E. coli DNA-polymeraasin I Klenow-fragmentin vaikuttaa neljän nukleotidin läsnä ollessa ja suljettiin DNA-molekyylit 30 renkaiksi käyttämällä faagin T4 DNA-ligaasia. Plasmidi pTG883 sisältää vain yhden Bglll-kohdan, joka sijaitsee feromonigeenin promoottorin yläpuolella (kuvio 3).
Plasmidi pTG883 (20 μg) linearisoitiin digeroimalla Pglll-entsyymillä, jonka jälkeen suoritettiin digestio 35 Bal31-nukleaasin avulla (1,4 yksikköä, 10 min - Boehringer 12 Q h yj f t\ y u > u o
Mannheim) käyttäen tavanomaisia menetelmiä. Täten käsitelty DNA puhdistettiin fenoliuutolla ja kloroformi-isoamyy-lialkoholiuutolla, jonka jälkeen osa (5 Mg) käsiteltiin Klenow-polymeraasilla, jotta saatiin mahdollisimman paljon 5 vapaita päitä. Täten käsitelty DNA ligatoitiin eifosfory-loituihin BamHI-linkkereihin (5'-CGGATCCCG) T4-faagin li-gaasin läsnä ollessa käyttäen julkaisussa Lathe et ai.
(3) esitettyä menetelmää. Transformoitiin E. coli 1106 ja selektoitiin ampisilliiniresistenssin avulla, jolloin 10 eristettiin plasmidi pTG892, jossa 5'-alue MF-alfa-l-gee-nin vierestä on deletoitu, BamHI-linkkerin sijaitessa yhden emäksen etäisyydellä ATG-sekvenssin yläpuolella seuraavasti: 15 5' - CGGGATCCCCG A ATG AGA TTT ...
Bam-HI-linkkeri MT-alfa,.2 koodittava alue Täten saatu uusi BamHI-Sall -fragmentti kloonattiin M13TG120-faagin BamHI-Sall -kohtien väliin, jolloin saa-20 tiin faagi M13TG889 (kuvio 4). Faagista M13TG889 eristettiin koko alfa-feromonia koodittavan osan sisältävä BamHI-Bglll -fragmentti ja ligatoitiin se plasmidin pTG838 isoon Bglll-fragmenttiin. Ligaation jälkeen saatu plasmidi, pTG892b, sisältää feromonia koodittavaa osaa vastaavan 25 BamHI-Bglll -fragmentin insertoituna PGK-geenin promoottorin Bglll-kohdan taakse.
Plasmidin pTG892b DNA sisältää yhden ainoan Bglll-kohdan ja yhden ainoan Sali-kohdan, kohdat ympäröivät lyhyen Pstl-kohdan sisältävän sekvenssin. Bglll- ja Sall-30 entsyymien kaksoisdigestiolla, eluoimalla iso fragmentti :* ja ligatoimalla synteettisellä polylinkkerillä, vaihdet tiin tämä lyhyt sekvenssi synteettiseen polylinkkeriin. Tällä seuraavaa sekvenssiä omaavalla polylinkkerillä: 13 5 C ;· 6 6
5'-GATCCAGCTCACATCTGCATGCG
GTCGACTGTAGACGTACGCAGCT-5 on toinen kohesiivinen pää, joka sopii yhteen Bglll-ent-5 syymillä vapautettujen fragmenttien kanssa ja toinen, joka sopii yhteen Sali-entsyymillä vapautettujen fragmenttien kanssa sekä tunnistuskohdat mm. entsyymeille PvuI, Bglll ja SphI.
Täten saatu uusi vektori nimitettiin pTG1819. Tämän 10 vektorin DNA digeroitiin entsyymeillä Sphl ja Pstl. Tämän kaksoisdigestion avulla saatiin kolme fragmenttia: 6,5 kb (kiloemäs) Pstl-PastI -fragmentti, 1,9 kb Pstl-Sphl -fragmentti ja toinen 0,5 kb SphI-PastI -fragmentti.
Kaksi pitempää fragmenttia puhdistettiin ja yhdis-15 tettiin faagista M13TG1827 saadun mutatoitua hirudiinia vastaavan SphI-PastI -fragmentin kanssa, jolloin saatiin uusi ilmentämisvektori: pTG1828 (kuvio 6).
Esimerkki 3
Fragmentin siirtäminen vektoriin pTG881, uusi plas-20 midi pTG1833
Plasmidin pTG881 DNA digeroitiin osittain entsyymillä Pstl, jolloin vapautui 6,1 kb pituinen fragmentti. Tämä fragmentti eristettiin ja digeroitiin täydellisesti Bglll-entsyymillä, jolloin vapautui Pstl-PstI- ja Pstl-* 25 Bglll -fragmentit. Nämä kaksi fragmenttia ligatoitiin pTG1828-plasmidista saatuun 0,62 kb Pstl-Bglll -fragmenttiin. Täten rekonstruoitiin uusi vektori pTG1833, joka eroaa plasmidista pTG897 vain siten, että siitä on dele-toitu Glu Ala Glu Ala koodittava sekvenssi. Täten muodos-30 tuneen prekursorin rakenne esitetään kuviossa 7. Plasmidi . pTG1833 sisältää E. colin replikaation aloituskohdan, am- pisilliiniresistenssigeenin, S. cerevisiae -geenin Leu2, replikaation S. cerevisiaessä mahdollistavan 2 μ-plasmidin fragmentin, pre-pro-koodittavan MF-alfa,-geenin pro. moot-35 torin sekä hirudiinigeenin (kuvio 6).
14 9ύ>·υΟ
Esimerkki 4
Hiivan transformaatio plasmidien pTG1828 ja pTG1833 avulla
Transformoitiin S. cerevisiae -kanta TGYlsp4 (Mat-5 alfa ura3-251-373-328 his3-ll-15) plasmideilla pTG1818, pTG1828 ja pTG1833. Taulukossa 1 esitetyt tulokset osoittavat, että pTG1818 ja pTG1833 aikaansaavat hirudiinin erittymisen samalla aktiivisuustasolla. Sitä vastoin TGYlsp4 pTG1828 erittää hirudiinia puolta pienemmällä ak-10 tiivisuudella verrattuna kahteen muuhun kantaan. Kontrollina sisällytettiin kanta TGYlsp4 pTG881, jossa ei ole hirudiinin geneettistä informaatiota. Verrattiin myös plasmideilla pTG1828 tai pTG1833 transformoitujen S. cerevisiae -kantojen (mat a) TGY14-1 ja TGY14-2 erittyvän hi-15 rudiinin tuotantoa (taulukko 2) . Tässä huomataan taas, että TGY14-2-kannan tapauksessa (sukupuolityyppiä Mat-al-fa) plasmidi pTG1833 indusoi paremman hirudiinin erittymisen verrattuna plasmidiin pTG1828. Toisaalta TGY14-l-kan-nan tapauksessa (sukupuolityyppiä Mat a) PTG1833 ei lain-20 kaan indusoinut hirudiinin erittymistä, kuten saattoi odottaa, kun taas TGY14-2-kanta tuotti hirudiinia.
Taulukko 1 25 Hiivaviljelmien supernatantin (10 ml) antitrom- binen aktiivisuus (48 tunnin viljely, YNGB-alusta + 0,5 % kasaminohappoja) _Kanta__Plasmidi__Kokonaisaktii visuus TGYlsp4 pTG881 ei todettavissa 30 PTG1818 158 ψ pTG1828 73 pTG1833 149 15 96^6 o
Taulukko 2
Hiivaviljelmien supernatantin (10 ml) antitrom-binen aktiivisuus (72 tunnin viljely, YNGB-alusta 5 + 0,5 % kasamiinohappoja) _Kanta__Plasmidi__Kokonaisaktiivisuus TGY14-1 pTG881 ei todettavissa pTG1828 54 __pTG1833__ei todettavissa TGY14-2 pTG881 ei todettavissa pTG1828 103 pTG1833 210 10 Esimerkki 5 Täydellisellä alustalla viljeltäessä plasmidien an taman fenotyypin säilyttävien kantojen eristäminen WO-patenttijulkaisussa 01224 osoitettiin, että määrätyt mutaatiot, jotka antavat ura+ -kannaksi transformoi-15 dulle ura3-kannalle 5-FU-resistenssin plasmidin välityksellä, mahdollistavat suuremman valinnanvapauden viljely-alustan suhteen viljeltäessä näitä kantoja; erityisesti voidaan käyttää teollisesti käytettäviä kompleksisia alustoja. TGYsp4 pTG1833 -kannasta lähtien on eristetty spon-20 taaneja mutantteja, jotka pystyvät muodostamaan pesäkkeitä täydellisellä alustalla (YPH), johon on lisätty 5-fluori-.· urasiilia 1 mg/ml, kun seurataan WO-patenttijulkaisussa 86/01224 esitettyä menetelmää. Viljeltiin kuusi mutanttia täydellisellä alustalla ja valittiin näistä yksi, jossa ei 25 esiintynyt plasmidin häviämistä yli 20 viljelysukupolven-kaan jälkeen kasvatettaessa ei-selektiivisissä olosuhteissa.
Mutantti, joka kutsuttiin TGYlsp4-3, voidaan käyttää hirudiinin tuottamiseksi täydellisellä alustalla.
96v6q 16
Esimerkki 6 HVl:tä koodattavan DNA-sekvenssin synteesin strategia Tämän sekvenssin täytyy sisältää elementtejä, jotka 5 mahdollistavat HVl-sekvenssin ja MF-alfal:n pre-prosek-venssin ja erittyvän hirudiinin maturaation mahdollistavien signaalien liittymisen oikeassa lukuvaiheistuksessa, erityisesti liittymiskohdan on sisällettävä Lys-Arg-duble-tin juuri HVl-sekvenssin NH2-pään ensimmäisen jäännöksen 10 yläpuolella.
Käytetty strategia on samankaltainen kuin FR-pa-tenttijulkaisussa 8413250 esitettiin. Synteesi suoritettiin kahdessa erillisessä vaiheessa ja fragmenttien yhdistäminen tapahtuu tämän jälkeen kohesiivisten BamHI-päiden 15 välityksellä. Ensimmäinen fragmentti koostuu yhdeksästä oligonukleotidista (1 - 9) ja toinen fragmentti 10 oligo-nukleotidista (10 - 19). Näiden sekvenssit ja oligonukleo-tidien sijainti on esitetty kuviossa 8.
Restriktiokartta ja sekvenssin kääntäminen amino-20 happosekvenssiksi esitetään kuvioissa 9 ja 10.
Esimerkki 7
Synteettisen geenin kokoaminen
Ensimmäinen synteettinen fragmentti
Oligonukleotidit 2-8 (kuviossa 8) fosforyloitiin 25 5'-päissään, jotta vältettäisiin dimeerien tai polymeerien muodostus: 500 pikomoolia jokaista oligonukleotidia käsiteltiin polynukleotidikinaasilla (2 yksikköä) 60 mM Tris-HC1, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 8 mM ditiotreitolia sisältävässä reaktiopuskurissa, jonka lopullinen tilavuus oli 25 μΐ ja 30 joka sisälsi 3,3 pmoolia 32P-gamma-ATP:tä (5000 Ci/nmol) , inkuboitiin 15 minuuttia 37 °C:ssa, jonka jälkeen lisättiin 5 nmoolia leimaamatonta ATP:tä.
Inkuboitiin 30 minuuttia 37 °C:ssa, jonka jälkeen vastinfragmentit hybridisoitiin pareittain, paitsi frag-35 mentit 1, 2 ja 3, joiden annettiin reagoida yhdessä. Käy- 17 9 b 6 ö tettiin 300 pmoolia jokaista oligonukleotidia 10 μΐ tilavuudessa seuraavaa puskuria: 6 mM Tris-HCl, pH 7,5, 6 nH MgCl2, 100 mM NaCl, 0,5 mM spermidiiniä, 8 mM DTT.
Seoksia kuumennettiin 100 °C:ssa kolme minuuttia ja 5 jäähdytettiin hitaasti 37 °C:seen kahden tunnin aikana. Hybridisoidut oligonukleotidit 1-2-3 sekoitettiin oligo-nukleotidien 4-5 kanssa ja inkuboitiin 37 °C:ssa kaksi tuntia. Samalla tavalla hybridisoitiin oligonukleotidipa-rit 6 - 7 ja 8 - 9. Viimeisessä vaiheessa koottiin täten 10 esikäsitellyt oligonukleotidit inkuboiden kaksi tuntia 37 °C:ssa 100 μΐ lopullisessa tilavuudessa.
Hybridisoidut oligonukleotidit (14 pmol) alistet tiin. T4-ligaasikäsittelyyn 15 tunnin ajaksi 15 °C:ssa. Tämän jälkeen lisättiin reaktioseokseen 50 ng geelissä 15 puhdistettua isompaa Hindlll-BamHI -fragmenttia faagista M13TG131. Ligaatioseos käytettiin tämän jälkeen E. coli JM103 kompetenttien solujen transformointiin. 12 täten saadun faagikloonin joukosta yksi ainoa sisälsi halutun sekvenssin: M13TG1888.
20 Toinen synteettinen fragmentti Käytettiin samaa strategiaa toisen fragmentin syn-tetisoimiseksi (kuviossa 8), joka kloonattiin BamHI- ja Sali-kohtien väliin faagiin M13TG131. Kaksi kloonia kahdestatoista sisälsivät haluttua sekvenssiä vastaavan in-25 sertin. Toinen näistä klooneista nimettiin M13TG1889.
Synteettisen geenin kokoaminen
Molemmat kaksisäikeiset DNA-fragmentit, M13TG1888 ja M13TG1889, digeroitiin, toinen Hindlll- ja BamHI-ent-syymeillä ja toinen BamHI- ja Sali-entsyymeillä ja sekoi-30 tettiin geelissä puhdistetun pBR322 ison Hindlll-Sall -- fragmentin kanssa. Ligatoitiin ja käytettiin seos E. coli 1106:n transformoimiseksi. Selektio suoritettiin ampisil-liiniresistenssin suhteen ja saatiin plasmidi pTG1890, joka sisältää oikein kootun synteettisen sekvenssin.
96>Co 18
Esimerkki 8
Syntetisoidun hirudiinin erittymisen mahdollistavan vektorin pTG1891 konstruktio
Plasmidin pTG1890 DNA-fragmentti, jossa on HVl:tä 5 koodittava sekvenssi, otettiin ulos Hindll-Bglll -fragmenttina (Bglll-kohdan ollessa juuri edellisessä kloonauksessa käytetyn Sali-kohdan alapuolella) ja insertoitiin FI-patenttijulkaisussa 865303 esitetyn plasmidin pTG881 Hindlll- ja Bglll-kohtien väliin. Saadussa plasmidissa 10 pTG1891 HVl-geeni sijaitsee täten insertoituna MF-alfal- pre-pro-sekvenssin ja transkription lopetuskohdan välissä, tämä konstruktio mahdollistaa siten hirudiinin HV1 matu-raation ja erittymisen, koska se on identtinen plasmidin pTG1818 (FI-patenttijulkaisu 865303) kanssa, paitsi että 15 HV2:ta koodittava sekvenssi on vaihdettu HVl-sekvenssiin.
Esimerkki 9 TGYsp4-kannan transformaatio plasmidin pTG1891 DNA- : 11a
Kanta TGYlsp4 (alfa-1 ura-3-251-373-328, His3-ll-20 15) transformoitiin plasmidilla pTG1891, selektoitiin ura+ -ominaisuuden suhteen ja saadut kaksi kloonia viljeltiin ja niiden viljelyalustaan erittyneen hirudiinin tuotanto määritettiin. Kontrollina määritettiin samoissa olosuhteissa TGYlsp4 pTG1818-kannan erittyneen hirudiinin määrä. 25 Mitattiin kaksinkertainen antitrombinen aktiivisuus 1 kannan TGYlsp pTG1891 viljelysupernatantista (0,9 mg/1 viljelysupernatanttia) verrattuna kantaan TGYlsp4 pTG1833.
Keksintöä edustavien kantojen talletukset
Seuraavat kannat on talletettu Institut Pasteur'iin 30 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 28 rue de Docteur Roux, 75724 Pariisi Cedex 15: 6. kesäkuuta 1986:
Saccharomyces cerevisiae TGYlsp4 pTG1828 numerolla 1-569 Saccharomyces cerevisiae TGYlsp4.3pTG1833 numerolla 1-570 35 6. marraskuuta 1986:
Saccharomyces cerevisiae TGYlsp4 pTG1891 numerolla 1-623.
Claims (5)
1. Ilmentämiskasetti hirudiinivariantin tuottamiseksi hiivassa, tunnettu siitä, että se sisältää: 5 a) ensimmäisen DNA-fragmentin, joka koodaa hirudii nivariantin HVl prekursoria, jolloin prekursori sisältää hirudiinivariantin, kuten kuviossa 10 esitetyn hirudiinva-riantin, ja enemmän kuin kaksi aminohappoa käsittävän lisäalueen, joka on peptidisidoksella liittynyt hirudiini-10 variantin N-päähän ja joka sisältää yhden ainoan yscF-pro-teinaasin tunnistaman pilkkomiskohdan, joka on dipeptidi Lys-Arg, kuten kuviossa 7 on esitetty, ja joka muodostaa em. lisäalueen C-pään, b) toisen DNA-fragmentin, joka koodaa leader-pepti-15 dia, joka on α-tekijän pre-pro-prekursorin pre-pro- tai pro-fragmentti, jolloin toinen DNA-fragmentti on liittynyt oikeassa lukuvaiheessa ensimmäisen DNA-fragmentin 5-pää-hän, ja c) asianmukaiset säätelyalueet em. DNA-fragmenttien 20 ilmentämiseksi, kuten PGK-geenipromoottori.
2. Hiivasolu, tunnettu siitä, että se on transformoitu patenttivaatimuksen 1 mukaisella ilmentämis-kasetilla.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen hiivasolu, .· 25 tunnettu siitä, että ilmentämiskasetti lisätään plasmidiin, joka sisältää hiivassa toimivan replikaation aio ituskohdan.
4. Plasmidi, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaisen ilmentämiskasetin ja 30 hiivassa toimivan replikaation aloituskohdan.
: 5. Menetelmä hirudiinivariantin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen hiiva viljellään ja hirudiinivariantti otetaan talteen viljelmän supernatantista. 96>υϋ 20
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8610090 | 1986-07-10 | ||
| FR868610090A FR2601383B2 (fr) | 1985-05-02 | 1986-07-10 | Vecteurs perfectionnes d'expression de l'hirudine dans les levures, procede et produit obtenu |
| FR8616722 | 1986-10-01 | ||
| FR868616722A FR2607516B2 (fr) | 1986-12-01 | 1986-12-01 | Vecteurs perfectionnes d'expression d'un variant de l'hirudine dans les levures, procede et produit obtenu |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI873068A0 FI873068A0 (fi) | 1987-07-10 |
| FI873068A FI873068A (fi) | 1988-01-11 |
| FI96966B true FI96966B (fi) | 1996-06-14 |
| FI96966C FI96966C (fi) | 1996-09-25 |
Family
ID=26225387
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI873068A FI96966C (fi) | 1986-07-10 | 1987-07-10 | Ilmentämiskasetti hirudiinivariantin tuottamiseksi hiivassa, sitä sisältävä plasmidi, sillä transformoitu hiivasolu ja menetelmä hirudiinivariantin valmistamiseksi hiivasolun avulla |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5591640A (fi) |
| EP (1) | EP0252854B1 (fi) |
| JP (1) | JP2733602B2 (fi) |
| KR (1) | KR960013464B1 (fi) |
| AT (1) | ATE153066T1 (fi) |
| AU (1) | AU614933B2 (fi) |
| BG (1) | BG80504A (fi) |
| CA (1) | CA1341490C (fi) |
| CZ (1) | CZ278268B6 (fi) |
| DE (1) | DE3752063T2 (fi) |
| DK (1) | DK175195B1 (fi) |
| ES (1) | ES2103700T3 (fi) |
| FI (1) | FI96966C (fi) |
| GR (1) | GR3024368T3 (fi) |
| HU (1) | HU214236B (fi) |
| MC (1) | MC1834A1 (fi) |
| NO (1) | NO179489C (fi) |
| PL (1) | PL154118B1 (fi) |
| PT (1) | PT85296B (fi) |
| RU (1) | RU1776276C (fi) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8530631D0 (en) | 1985-12-12 | 1986-01-22 | Ciba Geigy Ag | Thrombin inhibitors |
| MY101203A (en) * | 1985-12-12 | 1991-08-17 | Ucp Gen Pharma Ag | Production of thrombin iinhibitors. |
| MC1834A1 (fr) * | 1986-07-10 | 1988-06-03 | Transgene Sa | Bloc fonctionnel d'adn et plasmide codant pour l'hirudine,levure transformee,procede de preparation de l'hirudine,hirudine obtenue et son utilisation |
| US5256559A (en) * | 1988-03-04 | 1993-10-26 | Biogen, Inc. | Methods and compositions for inhibiting platelet aggregation |
| GB8809860D0 (en) * | 1988-04-26 | 1988-06-02 | Ciba Geigy Ag | Process for production of polypeptides |
| US5112615A (en) * | 1988-08-03 | 1992-05-12 | New England Deaconess Hospital Corporation | Soluble hirudin conjugates |
| US5167960A (en) * | 1988-08-03 | 1992-12-01 | New England Deaconess Hospital Corporation | Hirudin-coated biocompatible substance |
| DK105489D0 (da) * | 1989-03-03 | 1989-03-03 | Novo Nordisk As | Polypeptid |
| FR2645175B1 (fr) * | 1989-03-31 | 1994-02-18 | Transgene Sa | Souche de saccharomyces cerevisiaeproductrice d'une proteine heterologue et procede de preparation de ladite proteine heterologue par fermentation de ladite souche |
| FR2645174B1 (fr) * | 1989-03-31 | 1994-01-07 | Transgene Sa | Souches de levure ameliorees pour la production de proteines heterologues matures en particulier d'hirudine et procede de preparation d'hirudine correspondant |
| US5879926A (en) * | 1989-03-31 | 1999-03-09 | Transgene S.A. | Yeast strains for the production of mature heterologous proteins, especially hirudin |
| FR2646437B1 (fr) * | 1989-04-28 | 1991-08-30 | Transgene Sa | Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant |
| US5179196A (en) * | 1989-05-04 | 1993-01-12 | Sri International | Purification of proteins employing ctap-iii fusions |
| DE4009268A1 (de) * | 1990-03-22 | 1991-09-26 | Consortium Elektrochem Ind | Sekretion von hirudinderivaten |
| GB9015825D0 (en) * | 1990-07-18 | 1990-09-05 | Ciba Geigy Ag | In vitro processing of fusion proteins |
| US6514730B1 (en) | 1991-03-21 | 2003-02-04 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Secretion of hirudin derivatives |
| US5837808A (en) * | 1991-08-20 | 1998-11-17 | Baxter International Inc. | Analogs of hirudin |
| SG49859A1 (en) * | 1992-09-04 | 2002-03-19 | Ucp Gen Pharma Ag | Process for the production of protease inhibitors |
| TW282490B (fi) * | 1992-12-15 | 1996-08-01 | Ciba Geigy Ag | |
| US5712114A (en) * | 1995-06-06 | 1998-01-27 | Basf Aktiengesellschaft | Compositions for expression of proteins in host cells using a preprocollagen signal sequence |
| AU2149899A (en) | 1998-01-23 | 1999-08-09 | Novo Nordisk A/S | Process for making desired polypeptides in yeast |
| KR100949722B1 (ko) | 2002-08-12 | 2010-03-25 | 에이펙셀 (주) | 마이크로 초미립 분쇄기 |
| US7795205B2 (en) | 2004-04-12 | 2010-09-14 | Canyon Pharmaceuticals, Inc. | Methods for effecting regression of tumor mass and size in a metastasized pancreatic tumor |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4356270A (en) * | 1977-11-08 | 1982-10-26 | Genentech, Inc. | Recombinant DNA cloning vehicle |
| US4769326A (en) * | 1980-02-29 | 1988-09-06 | The Regents Of The University Of California | Expression linkers |
| US4546082A (en) * | 1982-06-17 | 1985-10-08 | Regents Of The Univ. Of California | E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins |
| NO840200L (no) * | 1983-01-28 | 1984-07-30 | Cefus Corp | Glukoamylase cdna. |
| JPS6041487A (ja) * | 1983-04-25 | 1985-03-05 | ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド | 酵母発現系でのアルフア因子配列の使用 |
| EP0158564B1 (fr) * | 1984-03-27 | 1992-07-15 | Transgene S.A. | Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformées et procédé de préparation de l'hirudine |
| DE3583361D1 (de) * | 1984-06-14 | 1991-08-08 | Ucp Gen Pharma Ag | Verfahren zur herstellung von thrombin-inhibitoren. |
| DE3429430A1 (de) * | 1984-08-10 | 1986-02-20 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| DE3445517C2 (de) * | 1984-12-13 | 1993-11-18 | Ciba Geigy | Für ein Hirudin-ähnliches Protein codierende DNA-Sequenz und Verfahren zur Herstellung eines Hirudin-ähnlichen Proteins |
| FR2593518B1 (fr) * | 1985-05-02 | 1989-09-08 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees |
| MY101203A (en) * | 1985-12-12 | 1991-08-17 | Ucp Gen Pharma Ag | Production of thrombin iinhibitors. |
| MC1834A1 (fr) * | 1986-07-10 | 1988-06-03 | Transgene Sa | Bloc fonctionnel d'adn et plasmide codant pour l'hirudine,levure transformee,procede de preparation de l'hirudine,hirudine obtenue et son utilisation |
-
1987
- 1987-07-02 MC MC871896A patent/MC1834A1/xx unknown
- 1987-07-08 AU AU75366/87A patent/AU614933B2/en not_active Expired
- 1987-07-09 BG BG080504A patent/BG80504A/bg unknown
- 1987-07-09 RU SU874202962A patent/RU1776276C/ru active
- 1987-07-09 CA CA000541712A patent/CA1341490C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1987-07-09 PT PT85296A patent/PT85296B/pt not_active IP Right Cessation
- 1987-07-09 DK DK198703558A patent/DK175195B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-07-10 HU HU873161A patent/HU214236B/hu unknown
- 1987-07-10 JP JP62173724A patent/JP2733602B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-10 AT AT87401649T patent/ATE153066T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-07-10 PL PL1987266756A patent/PL154118B1/pl unknown
- 1987-07-10 FI FI873068A patent/FI96966C/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-07-10 CZ CS875277A patent/CZ278268B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1987-07-10 DE DE3752063T patent/DE3752063T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-10 EP EP87401649A patent/EP0252854B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-10 ES ES87401649T patent/ES2103700T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-10 KR KR1019870007450A patent/KR960013464B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1987-07-10 NO NO872878A patent/NO179489C/no not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-03-16 US US08/405,765 patent/US5591640A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-09-05 US US08/708,543 patent/US5902735A/en not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-08-06 GR GR970402015T patent/GR3024368T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI96966B (fi) | Ilmentämiskasetti hirudiinivariantin tuottamiseksi hiivassa, sitä sisältävä plasmidi, sillä transformoitu hiivasolu ja menetelmä hirudiinivariantin valmistamiseksi hiivasolun avulla | |
| FI84080B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av rennin och daeri anvaendbara hybridplasmider. | |
| US4897348A (en) | Recombinant materials and methods for producing human connective tissue-activating peptide-III and analogs thereof | |
| JP2781459B2 (ja) | ヒト血清アルブミンのｎ―末端フラグメント含有融合蛋白質 | |
| Roberts et al. | Molecular analysis of a Neurospora crassa gene expressed during conidiation | |
| GB2137208A (en) | The use of the gal1 promoter | |
| IE53897B1 (en) | Methods and products for facile microbial expression of dna sequences | |
| JPH07308191A (ja) | ハイブリド型ヒト白血球インタフェロンをコードするｄｎａ | |
| US5010010A (en) | Production of human parathyroid hormone from microorganisms | |
| US5516656A (en) | Production of a new hirudin analog and anticoagulant pharmaceutical composition containing the same | |
| JPH06315384A (ja) | セリンプロテアーゼインヒビターの産生のための遺伝子組み換え法と、同じ目的に有用なｄｎａ塩基配列 | |
| EP1114865B1 (en) | Production of human parathyroid hormone | |
| EP1364030B1 (en) | Supersecretable peptides, processes for their production, and parallel improvement of the secreted form of one or more other polypeptides | |
| Webster et al. | Bacteriophage T4 regA protein binds to the Shine-Dalgarno region of gene 44 mRNA | |
| US5736379A (en) | DNA sequences expressing mammalian α1 antitrypsin | |
| NZ228064A (en) | A 65 residue hirudin derivative and anti-coagulant composition | |
| CA1275953C (en) | Recombinant materials and methods for producing human connective tissue-activating peptide-iii and analogs thereof | |
| DE69121489T2 (de) | In vitro-Behandlung von Fusionsproteinen | |
| US5464770A (en) | DNA encoding (ASP 113) and (LYS 46, ASP 113) thaumatin I | |
| JPS62158487A (ja) | 突然変異体コ−デイング配列 | |
| JP3226289B2 (ja) | 分泌ベクター、該ベクターで形質転換した微生物及び該微生物から産生される産物の製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT |
|
| FG | Patent granted |
Owner name: SCHERING AKTIENGESELLSCHAFT |
|
| MA | Patent expired |