FI95602B

FI95602B - Menetelmä deoksimulundokandiinin valmistamiseksi

Info

Publication number: FI95602B
Application number: FI910366A
Authority: FI
Inventors: Triptikumar Mukhopadhyay; Bimal Naresh Ganguli; Hans-Wolfram Fehlhaber; Herbert Kogler; Kirity Roy
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1990-01-26
Filing date: 1991-01-24
Publication date: 1995-11-15
Also published as: EP0438813B1; AU6998691A; ES2110405T3; DE69031730T2; NZ236888A; CA2034979C; JP3156232B2; IE910270A1; FI95602C; ZA91570B; GR3025607T3; AU644838B2; US5387670A; KR910014398A; CA2034979A1; PT96564A; KR0172949B1; FI910366L; IL97040A; NO179755B

Description

1 95602

Menetelmä deoksimulundokandilnin valmistamiseksi

Keksintö kohdistuu menetelmään deoksimulundokan-diinin valmistamiseksi, jolla on kaava I 5

^-Νγ° OHoAm° m*X

10 hn-^0H

°Vvö0H

Λοη° 'Λη ό

OH

uusi deoksimulundokandiini on ekinokandiini-tyyppinen an-20 tibiootti, mutta se kuitenkin eroaa tunnetuista ekinokan-diini-tyyppisistä antibiooteista jäljempänä esitetyistä syistä. Ekinokandiini-tyyppisiä antibiootteja on kuvattu teoksessa CRC Handbook of Antibiotic compounds. voi. IV, osa I, Amino Acid and Peptide Antibiotics. sivut 355-368, 25 Janos Berdy (kirjoittaja), CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, USA 1980. Lähiaikoina samankaltaisia antibiootteja on kuvattu julkaisuissa J. Antibiotics 42 (1989) 163-167 ja J. Antibiotics 42 (1989) 168-173,.

Ekinokandiini-tyyppisiä antibiootteja tuotetaan 30 useilla Moniliales-lahkoon ja Monlliaceae-heimoon kuuluvilla mikro-organismeilla, esimerkiksi mikro-organismeilla Aspergillus nidulans, Aspergillus rugulosus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans-ec-hinulatus, Aspergillus sydowii (Bainier ja Sartory) Thom 35 and Church var. nov. mulundensis Roy (kuvattu intialai- 2 95602 sessa patenttihakemuksessa 162032, 3.2.1986) tai Rcrophi-lophora luminispora. Ekinokandiini-tyyppiset antibiootit sisältävät usein luonnon peptidin, Jossa on rasvahapposi-vuketju. Peptidiosa voi olla treoniini, seriini, hydroksi-5 proliini Ja moni epätavallinen aminohappo. Rasvahappo-osa voi olla linoleenihappo, myristiinihappo tai palmitiini-happo. Ekinokandiini-tyyppisen antibiootin luonteenomainen UV-absorptio on alueilla 225 - 226 nm Ja 276 - 278 nm, sillä on hiivojen Ja sienten vastaista tehoa ja usein vä-10 häinen toksisuus.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle uuden deoksimu-lundokandiinin valmistamiseksi on tunnusomaista, että viljellään mikro-organismia Aspergillus sydowii Y-30462 (DSM 5745) aerobisissa olosuhteissa ravintoalustassa, joka si-15 sältää hiililähteitä, typpilähteitä ja epäorgaanisia suo loja.

Keksinnön mukaisesti käytetty mikro-organismi Aspergillus sydowii (Bainier ja Sartory) Thom and Church var. nov. mulundensis Roy viljelmä Y-30462 on kuvattu in-20 tialaisessa patenttihakemuksessa 162032, 3.2.1986. Kysees sä oleva mikro-organismi on talletettu Budapestin sopimuksen mukaisesti talletuslaitokseen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Braunschweig 15.1.1990 talletusnumerolla DSM 5745.

25 Fermentointi voi siis tapahtua aerobisissa olosuh teissa kasvatusalustassa, joka sisältää hiililähteitä, kuten glukoosia tai tärkkelystä, typpilähteitä, kuten li-hauutetta, tryptonia tai hiivauutetta, ja epäorgaanisia suoloja, kuten natriumin, kaliumin, magnesiumin, kalsiu-30 min, raudan, sinkin, koboltin, mangaanin, kuparin, fosforin tai rikin suoloja, lämpötilavälillä 25 - 30 °C sekä pH:ssa 6-7. Antibiootti eristetään ja puhdistetaan kas-vatusliemestä sinänsä tunnetulla tavalla.

Haluttaessa viljelmän Y-30462 kasvatus suoritetaan 35 vaahdonmuodostusta estävän aineen kanssa, kuten rekiste- • · 3 95602 röidyn valmisteen DesmophenR avulla (lineaarinen polyeette-ri, joka pohjautuu propyleenioksidiin, Bayer AG, Leverkusen, Saksa). Edullisesti viljelmän Y-30462 kasvatus suoritetaan submerssiolosuhteissa ja se lopetetaan 66 - 80 tun-5 nin kuluttua. Uusi antibiootti kasvatusliuoksessa ja huo-vasto pystytään havaitsemaan määrittämällä aktiivisuus mikro-organismeja Candida albicans ja Saccharomyces cere-visiae vastaan tavanomaisella agarlevy-diffuusiomääritys-menetelmällä (Assay method of antibiotics, a laboratory 10 manual, 1955, D.C. Grove ja W.A. Randall, Medical Encyclopaedia Inc., New York).

Uuden deoksimulundokandiinin ylivoimainen aktiivisuus tekniikan tasoon kuuluviin yhdisteisiin mulundokan-diini ja flukonatsoli nähden on osoitettu vertailukokein 15 käyttäen kahta erilaista mallia, Candida albicansin aiheuttamaa akuuttia verenmyrkytystä ja ei-tappavaa systeemistä infektiota hiirissä. Flukonatsolia on käytetty standardina, koska sitä on kauan käytetty lukuisten eri Candida albicans -infektioiden hoidossa. Kontrollina on infektoi-20 tujen, käsittelemättömien hiirien ryhmä.

Ensimmäinen koe suoritettiin 8 hiiren ryhmille, jotka infektoitiin käyttäen ymppinä 2,0 x 108 Candida albicans-solua i.v. hiirtä kohti. Annostusohjeina oli seuraa-va: -2, +2 ja +24 h. Tulokset on esitetty taulukossa I.

, 95602 4

C

Ή ρ *0 so H (N oo (N in oo vo H ». * * * s s

X t> Q\ o rH H VO

CO t—{ iH rH

0)

.««-V

x [2 N V» Vi ^ ^ d\

?—( i—( «H i—I tH

ad j§ £ -H O' vf <*·<* 00 oo

(0 H H H H

3 " •h J= „ ooh n ^ n oo •C IS o ^ ^ rH ^ R ·? J! P n -ie oooo h n n oo

t H ” rH H H

U “

sL C

e °

5 iH VO CO O' (S H vO

§ £ H ^

Cj Λ o »

S P VO CO O' O rH VO

C rH rH

<0 H

E

(0 P vo oo oo o in

P rH

3 a) £ 0 CO 00 Ό O 00

H

R

•H

<0 q co o m ox -mo m o o o c \ m ϋ > * * •H CD) · cs m csino ,Q < E CO rH CH rH cn in

M

CO

10 iH I

Ό *H CP

Ή Ό -H H

Ό C H

q ή ίο '0

<o c .* CP

o -ho op

P Ο Ή PC

Ό C rH ® 0 «· c 3 o E x H (0 rH CO Q) X 3 P H 3 o a) o e co a) p

X P OP C P -H

2 co c co o p o

3 -H 3 JÄ Ä P P

Η O rH o 3 CO X

3 £ 3 0) P H *0 0)·

rd >c Σ QC U< P

Eh ___L_L__J

5 95602

Verenmyrkytysmallissa käsittelemättömät kontrolli-hiiret säilyivät hengissä ainoastaan 6,6 vrk, kun taas deoksimulundokandiinilla tai mulundokandiinilla käsitellyt hiiret säilyivät hengissä huomattavasti pidempään. Deoksi-5 mulundokandiinilla saatiin kuitenkin kummallakin annostuksella ylivoimainen eloonjäämisaika. Alhaisemmalla annostuksella 12,5 mg/kg x 3 (s.c.) deoksimulundokandiinilla käsitellyt hiiret säilyivät hengissä 3,6 vrk kauemmin kuin kontrollihiiret ja 3 vrk kauemmin kuin mulundokandiinilla 10 käsitellyt hiiret. Korkeammalla annostuksella 25 mg/kg x 3 (s.c.) deoksimulundokandiinilla käsitellyt hiiret säilyivät hengissä noin 5 vrk kauemmin kuin kontrollihiiret ja noin 2 vrk kauemmin kuin mulundokandiinilla käsitellyt hiiret. Deoksimulundokandiinin annostuksella 25 mg/kg x 3 15 saatu hyödyllinen vaikutus vastasi flukonatsolin kaksi kertaa suuremmalla annostuksella 50 mg/kg x 3 (s.c.) saatua vaikutusta.

Toisessa kokeessa käytettiin ymppinä 4,0 x 105 Candida albleans-solua i.v. hiirtä kohti ja kokeen lopussa 20 mitattiin ko. mikro-organismin määrää hiirten munuaishomo-genaatissa. Annostusohjelma oli seuraava: 5 kertaa (D+0, D+l, D+2, D+3, D+4), s.c. Infektio suoritettiin päivänä D+0, autopsia päivänä D+6. Tulokset on esitetty taulukossa II.

6 95602

Taulukko II. Candida albicansin aiheuttama el-tappava infektio hiirissä

Yhdiste Annos Candida albicansin määrä 5 mg/kg päivänä D+6 (CFU/g x 5, munuaista) _s.c._

Deoksimuludokandiini 25,0 2,30 x 103 _50,0_6,40 x 101_ 1Q Mulundokandiini 25,0 3,32 x 104 _50,0_2,03 x 102_

Flukonatsoli 25,0 . 4,80 x 103 _50,0_8,91 x 102___ Käsittelemätön, in- 15 fektoitu kontrolli 3,90 x 106

Ei-tappavan infektion mallissa käsittelemättömissä infektoiduissa kontrollihiirissä oli keskimäärin 3,9 x 106 cfu Candida albicansia grammaa kohti munuaista. Deoksimu-20 lundokandiinilla tai mulundokandiinilla käsitellyissä hiirissä cfu-arvot olivat paljon pienempiä, ja pienimmät arvot määritettiin deoksimulundokandiinilla käsitellyissä hiirissä. Annostuksella 25 mg/kg x 5, s.c., arvo oli mulundokandiinilla 3,32 x 104 cfu ja deoksimulundokandiinilla 25 2,30 x 103 cfu, mikä merkitsee 14,43 kertaa suurempaa las kua Candida albicansin määrässä jälkimmäisen osalta. Annostuksella 50 mg/kg x 5 (s.c.) deoksimulundokandiinilla lasku oli 6,40 x 101 verrattuna arvoon 2,03 x 102 mulundo-kandiinin osalta, mikä vastaa yli 3,17 kertaa suurempaa 30 laskua. Deoksimulundokandiini oli ylivoimainen myös flu-konatsoliin nähden samoilla annostuksilla.

Deoksimulundokandiinilla on siten ylivoimainen terapeuttinen teho mulundokandiiniin nähden.

Seuraavat esimerkit kuvaavat käsillä olevaa kek- 35 sintöä.

7 95602

Esimerkki 1

Kannan Y-30462 viljely ravistelupulloissa deoksimulundo-kandiini-antibiootin fermentatiiviseksi tuottamiseksi

Ymppiviljelyalustan koostumus: 5 Soijajauho 20,0 g

Glukoosi 30,0 g

Kalsiumkarbonaatti 6,0 g

Natriumkloridi 3,0 g

Ammoniumkloridi 2,5 g 10 Kaliumdivetyfosfaatti 2,0 g

Demineralisoitu vesi 1,0 1

Yllä esitetty ymppiviljelyalusta jaettiin 100 ml:n leveäsuisiin Erlenmeyer pulloihin ja niitä steriloitiin 15 121°C:ssa 20 minuuttia. Ennen autoklavointia liuoksen pH

oli 6,5. Pullot jäähdytettiin ja niihin siirrostettiin muutama silmukallinen hyvin itiöitä muodostunutta Y-30462-viljelmää ja pulloja ravisteltiin nopeudella 240 rpm 60 tuntia 26 eC:ssa (±1 eC). Tätä käytettiin ymppiviljelmä-20 nä tuotantoalustan siirrostamisessa.

Tuotantoalustan koostumus:

Lihauute 3,0 g

Tryptoni 5,0 g

Glukoosi 10,0 g 25 Liukoinen tärkkelys 24,0 g

Hiivauute 5,0 g

Kalsiumkarbonaatti 4,0 g

Mangaanikloriditetrahydraatti 0,5 mg Sinkkisulfaattiheptahydraatti 0,22 mg 30 Kalsiumkloridi 0,55 mg

Ferrosulfaattiheptahydraatti 0,5 mg Kuparisulfaattipentahydraatti 0,16 mg Kobolttikloridiheksahydraatti 0,16 mg Demineralisoitu vesi 1,0 1 • 8 95602

Yllä kuvattua tuotantoalustaa laitettiin 200 ml litran Erlenmeyer pulloihin ja niitä steriloitiin 121 °C:-ssa 20 minuuttia. Ennen autoklavointia liuoksen pH oli 6,5. Pullot jäähdytettiin ja sitten niihin siirrostettiin 5 ymppiviljelmää (1% v/v). Fermentointia jatkettiin pyörivässä ravistimessa 26 ''Ctssa (± 1 °C) 76 tuntia. Talteen-ottamisen jälkeen kasvatusliuos sentrifugoitiin ja uusi antibiootti eristettiin sekä huovastosta että suodoksesta, kuten esimerkissä 2 on kuvattu.

10 Esimerkki 2

Kannan Y-30462 viljely fermenttoreissa uuden deoksimulun-dokandiini-antibiootin tuottamiseksi

Vaihe I: Ymppiviljelmän valmistus (a) Ravistelupulloissa 15 100 ml ymppiviljelmäalustaa (kuten esimerkissä 1 on kuvattu) laitettiin 500 ml:n leveäsuiseen Erlenmeyer-pul-loon ja pH säädettiin arvoon 6,5 ennen sterilointia. Alusta steriloitiin autoklaavissa 121 eC:ssa 20 minuuttia, jäähdytettiin ja siihen siirrostettiin viljelmän Y-30462 20 itiöitä. Pulloja inkuboitiin 26 °C:ssa (± 1 eC) 48 tuntia pyöröravistimessa nopeudella 240 rpm.

(b) Imupulloissa 1 litra ymppiviljelyalustaa (kuten esimerkissä 1 on kuvattu) ja 0,4 ml vaahdonestoainetta (Desmophen) laitet-25 tiin 5 litran imupulloon. Tämä steriloitiin autoklaavissa 121 °C:ssa 30 minuuttia, jäähdytettiin ja siihen siirrostettiin viljelmän Y-30462 itiöitä. Pullot asetettiin pyörivään ravistimeen ja niitä inkuboitiin 48 tuntia 26 °C:-ssa (± 1 °C) nopeudella 240 rpm.

30 Vaihe II: Fermentointi (a) Pienessä mittakaavassa 10 litraa tuotantoalustaa (kuten esimerkissä 1 on kuvattu), jonka pH oli säädetty arvoon 6,5 ennen sterilointia, ja 4 ml vaahdonestoainetta (Desmophen), jotka 35 laitettiin 15 litran ruostumattomasta teräksestä valmis- 9 95602 tettuun fermenttoriin, steriloitiin autoklaavissa 121 °C:ssa 36 minuuttia, jäähdytettiin steriilin positiivisen ilmanpaineen alla vesihauteessa ja tähän ympättiin 1 % ymppiä aseptisissa olosuhteissa.

5 Seuraavia parametrejä käytettiin:

Lämpötila 26 - 27 °C

Ilmastus 1:0,6 - 0,8 voi/voi kasvatusliemestä 6-8 litraa minuutissa Sekoitusnopeus 160 rpm 10 Kasvatusaika 66 tuntia (b) Laajassa mittakaavassa 95 litraa tuotantoalustaa (kuten esimerkissä 1 on kuvattu), jonka pH oli säädetty arvoon 6,5 ennen sterilointia, ja 40 ml vaahdonestoainetta (Desmophen) 150 lit-15 ran fermenttorissa tai 270 litraa alustaa ja 75 ml Desmo-pheniä 390 litran fermenttorissa steriloitiin in situ 121-°C:ssa 32 minuuttia ja tähän ympättiin 1% ymppiä aseptisissa olosuhteissa.

Ymppitilavuus 110 litraa 150 litran fermenttorissa 20 280 litraa 390 litran fermenttorissa

Seuraavia parametrejä käytettiin:

Lämpötila 26 - 27 °C

Ilmastus 1:0,6 - 0,8 vol/vol kasvatusliemestä 110 litralle 60 - 80 litraa minuutissa 25 280 litralle 160 - 224 litraa minuutissa (9-13 nm3/tunti)

Sekoitusnopeus 100 - 110 rpm

Kasvatusaika 66 tuntia

Talteen otettu kasvatusliemi sentrifugoitiin huo-30 vaston erottamiseksi kasvatussuodoksesta ja sitten sitä käsiteltiin edelleen.

Vaihe III: Deoksimulundokandiinin eristäminen Kaksi kasvatuslientä - toinen 150 litran ferment-torista ja toinen 390 litran fermenttorista - yhdistettiin 35 ja sentrifugoitiin kasvatussuodoksen erottamiseksi huovas-tosta (33,5 kg).

10 95602

Kasvatussuodosta (337 litraa) uutettiin kerran etyyliasetaatilla (245 litraa). Huovastoa (33,5 kg) uutettiin asetonilla (2 x 100 litraa) ja uute konsentroitiin 60 litraan 38 °C:ssa alipaineessa (< 100 torria). Konsent-5 raattia laimennettiin 60 litralla vettä ja sitä uutettiin etyyliasetaatilla (4 x 60 litraa). Uute yhdistettiin kas-vatussuodosuutteen kanssa. Yhdistettyjä etyyliasetaatti-uutteita konsentroitiin 38 °C:ssa alipaineessa (< 100 torria), jolloin saatiin raaka antibioottivalmiste öljynä 10 (253 g). Tätä trituroitiin asetonitriilillä (3x5 litraa) ja sentrifugoitiin. Kirkas liuos heitettiin pois ja jäljelle jäänyttä kiinteää ainetta käsiteltiin metanolilla (2 x 1 litra). Sentrifugoinnin jälkeen metanoliliuos konsentroitiin, jolloin saatiin puolipuhdasta yhdistettä (6 g). 15 Tätä yhdistettä adsorboitiin ohutlevykromatografi- sesti (TLC) silikageelillä ja sitten se laitettiin kolonniin (3 cm x 85 cm), joka oli pakattu TLC-asteen silikageelillä (350 g). Kolonni, joka oli pakattu etyyliasetaatissa, eluoitiin paineen alla virtausnopeudella 20 ml/min 20 seoksella etyyliasetaatti:n-propanoli (5:3). Deoksimulun-dokandiini eluoitui ulos ensimmäisenä ja seuraavana mul-undokandiini ja muut bioaktiiviset yhdisteet. Fraktioiden puhtautta tarkasteltiin TLC:11a (silikageeli; kehitysliuo-tin: Et0Ac:n-propanoli:H20 (5:3:1); detektio- I2-kaasu) ja 25 ainoastaan deoksimulundokandiinia sisältävät fraktiot yhdistettiin. Sen jälkeen kun liuotin oli poistettu alipaineessa, saatiin puhdas yhdiste (85 mg).

Myöhemmät fraktiot, jotka olivat deoksimulundokan-diinin ja mulundokandiinin seoksia, yhdistettiin. Sen jäl-30 keen kun liuotin oli poistettu alipaineessa saatiin epäpuhdasta deoksimulundokandiinia (440 mg).

Uuden deoksimulundokandiini-antibiootin fysikoke-mialliset ominaisuudet: 11 95602 1. Ulkomuoto: Valkoinen amorfinen jauhe

2. Sulamispiste: 167 - 168 °C

3. Liukoisuus: Liukenee metanoliin, dimetyyliformami- diin, dimetyylisulfoksidiin, liukenee 5 heikosti veteen, asetoniin, asetonitrii- liin, etyyliasetaattiin, hiilitetraklo-ridiin, kloroformiin, bentseeniin, pet-rolieetteriin 4. Värireaktiot (yhdiste laitettu silikageelilevylle ja 10 ruiskutettu):

Ruiskutusreagenssi Väri KMn04 Valkoinen vaaleanpunai sella taustalla

FeCl3/K3Fe(CN)6 Sininen vaalean vih- 15 reällä taustalla

Ninhydriini Ei luonteenomaista väriä

Pauley's Ei luonteenomaista väriä

Ehrlich Ei luonteenomaista väriä

Bentsidiini- Ei luonteenomaista väriä 20 perjodihappo 5. [a]25D: -28,23° (c, 0,25, metanoli) 6. Ohutkerroskromatografia (silikageelilevyllä, E. Merck, tuote 5554):

Kehityssysteemi Rf 25 EtOAc:n-PrOH:H20 (5:3:1) 0,76

BuOH:AcOH:H20 (4:1:1) 0,71 CHCl3:MeOH:17% ammoniakkiliuos 0,58

Alempi kerros 7. Korkeapainenestekromatografia Retentioaika 30 Suojapylväs 10μ ODS Hypersil* 9,2 min (3 cm x 0,4 cm)

Pylväs 10μ ODS Hypersil* (25 cm x 0,4 cm)

Eluentti MeOH: 0,2% NaH2P04, 2 H20 vedessä: H3P04 35 (75:25:0,1)

Virtausnopeus 2 ml/min 12 95602 8. Molekyylikaava: C48H77N7015 (992,2) 9. Molekyylipaino: varmistettu FAB-MS (matriisi 3-nit- robentsyylialkoholi + litiumjodidi); M+Li* havaittu m/z 998,55, laskettu 5 m/z 998,562 (“C^H^N^O^Li) 10. UV-spektri: λ max (E11%cn) a) MeOH: 225 (74), 276 (16,5), 282 sh (13,5 nm) 10 b) MeOH/NaOH (50 μΐ 0,1N NaOH + 3 ml MeOH-liuos ta): 224 (72,5), 241 sh (37,5), 277 (15), 282 (14,5), 294 (8) nm 11. IR-spektri (KBr): Katso kuvio 1 selitysosan jälkeen 12. 400 MHz *H NMR- Katso kuvio 2 selitysosan jälkeen 15 spektri: 13. Aminohappokoostumus: 4-hydroksiproliini, seriini, treoniini, 3-hydroksi-4-metyyli proliini,4,5-dihydroksiornitiini ja 3-hydroksihomotyrosiini 20 14. Rasvahappokoostumus: 12-metyylitetradekaanihappo Näin uusi deoksimulundokandiini-antibiootti sisältää rasvahappo-osan, joka on 12-metyylitetradekaanihappo. Tämä rasvahappo on ainoastaan mulundokandiinissa eikä muissa ekinokandiini-tyyppisissä antibiooteissa. Kuitenkin 25 deoksimulundokandiinin aminohappokoostumus on erilainen kuin mulundokandiinin aminohappokoostumus. Deoksimulundokandiini sisältää 3-hydroksihomotyrosiinin, mutta se ei sisällä 3,4-dihydroksihomotyrosiinia, joka taas on mulundokandiinissa. Kuten uuden deoksimulundokandiini-antibioo-30 tin fysikokemiallisten ominaisuuksien sekä sen rakenteen perusteella on selvää, on uusi deoksimulundokandiini-anti-biootti täysin erilainen kuin mikään aiemmin tunnettu eki-nokandiini-tyyppinen antibiootti.

Uudella deoksimulundokandiini-antibiootilla on ha- 35 vaittu olevan hiivojen vastaisia, sienten vastaisia ja im- 95602 munomodulatorisia ominaisuuksia. Uuden deoksimulundokan-diini-antibiootin pienimmät mahdolliset pitoisuudet, jotka vaaditaan erilaisten hiivojen ja sienten kantojen inhiboi-miseksi, on esitetty taulukossa 111.

5

Taulukko III

Koeorganismi Uuden deoksimulundokandiini-anti- biotin pienin mahdollinen inhiboiva 10 pitoisuus mikro-grammeissa per mil- lilitra

Candida albicans 1,5

Saccharomyces cerevisiae 3,1 15 Aspergillus niger 3,1

Penicillium italicum 25

Cladosporium species 0,75

Cercospora beticola 71 6,25

Botrytis cinerea 47 6,25 20 Botrytis cinerea 57 50

Botrytis cinerea 211 25

Botrytis cinerea 212 25

Trichophyton mentagrophytes <0,18

Microsporum gypseum 0,18 : 25 Microsporum canis <0,18

Kaavan I mukaisesta yhdisteestä tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävistä johdannaisista voidaan muodostaa farmaseuttisia valmisteita yhteensopivien tavanomaisten 30 apuaineiden ja/tai vehikkeleiden kanssa. Voidaan myös käyttää kaavan I mukaisen yhdisteen farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa lääkkeiden valmistamisessa. Valmistukseen liittyvät yksityiskohdat tunnetaan ekinokandiini-tyyppisiin antibiootteihin liittyvästä kirjallisuudesta.

• ·

Claims

14 95602

1. Menetelmä deoksimulundokandiinin valmistamiseksi, jolla on kaava 1

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kasvatus suoritetaan lämpöti- 25 lassa 25 - 30 °C.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kasvatus suoritetaan pH-alu-eella 6-7.

4. Jonkin patenttivaatimusten 1-3 mukainen mene-30 telmä, tunnettu siitä, että kasvatus suoritetaan lämpötilassa noin 26 eC ja pH:ssa noin 6,5.

5. Jonkin patenttivaatimusten 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kasvatusta jatketaan pitempään kuin 66 tuntia. il - an mtu ι μίμ is 95602

5. OH /M· 10 hA-0H WMi »VVA1- ° ^(0H 15 i'll OH tunnettu siitä, että viljellään mikro-organismia 20 Aspergillus sydowii Y-30462 (DSM 5745) aerobisissa olosuhteissa ravintoalustassa, joka sisältää hiililähteitä, typpilähteitä ja epäorgaanisia suoloja.

6. Jonkin patenttivaatimusten 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kasvatus suoritetaan submerssikasvatuksena. 16 95602