FI87230B - Serumfritt vaextmedium och dess anvaendning. - Google Patents

Description

1 87230

Seerumivapaa kasvuväliaine ja sen käyttö - Serumfritt växt-medium och dess användning

Esillä oleva keksintö kohdistuu seerumivapaaseen kasvuväliai-neen lisään, jota on tarkoitus käyttää rautaa kasvuväliainees-sa suosivien solujen kasvatuksessa. Solujen kasvatuksen mahdollistamiseksi väliaineesssa, joka on seerumiton, lisäainetta voidaan myöskin käyttää muiden väliaineiden laadun tarkistamiseksi .

Erityisesti teollisuudella ja tutkimuksella on kauan ollut suuri tarve seerumittomista väliaineista ja kasvuvi1jelyistä, koska seerumin lisääminen tällaisiin väliaineisiin solun kasvun välttämättömien aineiden lisäyksen lisäksi, lisää myöskin aineita, jotka vaikuttavat epäedullisesti useimpiin kokeisiin, joissa tulosten tarkkuudella on suuri merkitys.

Tämä koskee erityisesti sellaisia tieteen alueita, kuin so-luimmunologia, bioteknologia, hedelmöitys in vitro elinsiirrot, syövän tutkimus ja veren varastointi ja siirto.

Ne väliaineet ja fysiologiset liuokset, joita nykyään käytetään tutkimuksissa ja teollisuudessa sekä kliinisissä töissä, perustuvat lähes 100 vuotta vanhoihin tietoihin ja edustavat näin ollen seisahdusta tällä biologisen tutkimuksen alueella. Tähän asti käytetyt soluviljelmien väliaineet muodostuvat nk. kaupallisesta perusväliaineesta, johon on lisätty noin 10 % 1ämpöinaktivoitua seerumia. Tähän hyvin vanhaan menetelmään liittyvät mm. seuraavat epäkohdat: 1) Lämpökäsittely, joka tarvitaan estämään seerumin lyyttinen vaikutus soluihin, vaikuttaa denaturoivasti tärkeisiin seeru-mikomponentteihin.

2) Eri seerumitoimituksi1 la on myöskin erilaiset ominaisuudet 87230 2 niiden alkuperän mukaan, mikä seikka johtaa ei-toivottuihin vaihteluihin soluviljelmän käyttäytymiseen in vitro.

3) Seerumi sisältää monia ei-toivottuja aineita, joilla on tuntemattomia ja kontrolloimattomia vaikutuksia soluihin.

4) Seerumi on epäfysiologinen neste lähes kaikille soluille, koska solut ovat sopeutuneet kehon kudosnesteisiin, niillä on erilaisten aineiden toisenlainen sisältö kuin seerumilla.

5) Seerumin vasta-aineet voivat sitoutua soluihin ja vaikuttaa kokeisiin.

6) Seerumi estää solujen seerumitekijän in vitro synteesin tutkimuksen, koska seerumin taustataso tällaisia tekijöitä varten on suhteellisen korkea.

Käyttämällä keksinnön mukaista seerumitonta lisäainetta väitetään edellä esitetyt haitat, ja tämän lisäksi on sitä sisältävä väliaine erittäin käyttökelpoinen solujen ja kudosten in vitro kasvattamiseksi ja säilyttämiseksi.

Tämän lisäksi on sitä sisältävä väliaine erittäin tarkkaan määritelty, se on seerumiton ja proteiiniton (lukuunottamatta mahdollisesti pieniä määriä insuliinia, joka tarvitaan yksittäisiä soluja varten ja jota käytetään sellaisessa tapauksessa, jossa se on välttämätöntä) sisältää rasvaa ja hivenaineita stabiloituja kelatoituina yhdisteinä ilman transferriiniä, ja ilman albumiinia tai että lipidiä on läsnä. Keksinnön mukainen lisäaine on lisäksi erittäin halpa valmistaa.

Aikaisempien seerumittomien, määriteltyjen väliaineiden (kts. N.N. Isocove ja F. Melchers "Complete Replacement of Serum by Albumin, Transferrin, and Soybean Lipidin in cultures of Lipopolysaccharide-reactive B Lymphocytes".

3 87230 J. Exp. Med., nide 147, sivu 923-933 (1978); R.G. Ham "Importance of the Basal Nutrient Meidum in the Design of Hormonally Defined Media" i Growth of cells in Hormonally Defined Media, Cold Spring Harbor Conference on Cell Proliferation, nide 9, sivu 39-60 (1982); D. Barnes ja G. Sato "Methods for Growth of Cultured Cells in Serum-Free Medium", Anal. Biochem. 102 sivu 255-270 (1980)) pääongelmana on se, että ne eivät sovellu käytettäväksi satunnaisesti valittuihin soluviljelmiin kahdesta syystä: 2+ 2+ 1) Bikarbonaatin ja Ca /Mg -ionien fysiologisen määrän läsnäolo saostaa raudan ja trivalenttiset hivenmetallit lähes jokaisesta kelatointijärjestelmästä lämpötilassa 37°C ja pH:ssa 7-8 (lukuunottamatta transferriiniä).

Tämä päätelmä perustuu keksijän henkilökohtaisiin tutkimuksiin (ei julkaistu).

2) Hivenmetal1 ien, mukaanlukien toksisten aineiden, pitoisuus väliaineessa ei ole kontrolloitu ja vaihtelee suuresti riippuen yksittäisten ominaisuuksien yhdistelmästä veden ja epäpuhtauksien suhteen. Ainoa ratkaisu tähän ongelmaan on käyttää täysin stabiilia metalli-ionipuskuria, joka käsittää kaikkien tarpeellisten hivenmetallien tasapainoitetun liuoksen, ja näin toksiset metallit absorboituvat puskuriin (toksinen vaikutus poistetaan).

Koska transferriini on kallista ja jokaiselle eläinlajille ominainen, valmistettiin keksinnön mukaisesti väliaine synteettisen ei-proteiinisen kelatointiaineen Fe/hivenaine-elementti-puskurin perusteella ja niin, että pääongelma, metallien saostu 37°C:ssa (kts. yllä) ratkaistiin lisäämällä tietty kelatointiaine, jolla seoksessa on hyvin erilaisia ja ainutlaatuisia ominaisuuksia verrattuna kuhunkin kelatoininaineeseen yksinään. Toinen ongelma, nimittäin .···. raudan siirtäminen solumembraaniin ja soluun, ratkaistiin 4 87230 lisäämällä auriinitrikarboksyylihappoa väliaineeseen.

Vaikkakin EDTA/sitraatti tekee metallilieteen täysin stabiiliksi, erilaiset eläinsolut ja ihmissolut eivät kasva raudanpuutteen johdosta. On osoittautunut, että yhdistelmä EDTA/sitraatti/auriinitrikarboksyylihappo antaa ainutlaatuisia gelatoivia ja rautaa luovuttavia ominaisuuksia, joita ei aikaisemmin ole kuvattu. Erityisesti tässä yhteydessä ei sillä ole merkitystä, että EDTA:ta (etyleenidiamiinitetraetikkahappoa) yksinään on aikaisemmin käytetty rauta-gelatointiaineena kasvissolujen viljelyssä pH-arvossa 5,0 olosuhteissa, joissa metallin saostus ei muodosta mitään ongelmaa, kts. P. Kruse og M.K. Petterson "Tissue Culture Methods and Applications", Acad. Press 1973; J.R. Stein "Handbook of Physiological Methods",

Cambridge University Press (1973).

Solukasvun suhteen on osoittautunut, että EDTA:n ja sitruunahapon (sitraatin) seossuhde esimerkiksi 1:3 on erittäin edullinen. On myöskin lyhyesti mainittava, että solukasvu väliaineessa yleensä tapahtuu pH-arvossa 7,4 mutta että pH-arvot lopullisessa väliaineessa läsnäolevien lisäaineiden johdosta myöskin voivat poiketa tästä arvosta riippuen yksittäisten solujen kasvuvaatimuksista.

Keksinnön mukainen lisäaine voidaan valmistaa esimerkiksi lisäämällä yksinkertaisen komponentin väkevä liete puhtaaseen veteen (on erittäin tärkeää, että käytetään vettä, jonka (R) puhtaus on suurin mahdollinen, esimerkiksi "Travenol" steriloitua vettä valmistettaessa keksinnön mukaista lisäainetta. Esimerkki tällaisesta väkevästä liuoksesta on annettu alla, nimittäin seos, jota voidaan käyttää 1000 x pitoisuutena: 5 87230

Paino 100 ml vettä kohti 3 mM Fe-EDTA1’ 120,1 mg 2 ) 3 mM Auriinitrikarboksyylihappo 126,7 mg 1 mM Na2-EDTA 37,2 mg 15 mM Sitruunahappo 315,0 mg 25 mM Na^-sitraatti 735,0 mg J 3) (mahd. 1 % hivenaineita ) 1) Etyleenidiamiinitetraetikkahappo-Fe(lii)-Na kelaatti-dihydraatti (Koch-light nr. 2529-00) 2) Sigma A 1895 3) Voi olla alla kuvattu hivenaineseos.

Seoksen pH säädettiin edullisesti arvoon 4,5-5,0.

Mahdollinen hivenmetallien lisääminen voidaan suorittaa esimerkiksi peruslietteen muodossa, joka voidaan valmistaa seuraavalla tavalla. Mainitun lietteen pitoisuus on 1000 000 kertainen lisäaineena käytettyyn verrattuna. Valmistettaessa alla kuvattua lietettä on lisättävä Zn, Cu ja kelatointiainetta (EDTA ja sitraattia) pH:n säätämiseksi arvoon 5,0 5-10N:lla natriumhydroksidia, : .’ minkä jälkeen lisätään vielä lisäkomponenttia. Lopullisen pH-arvon on oltava välillä 4,0 ja 4,5.

6 87230

Hivenmetalli Lähtösuola Paino veden (Kons.)______.____100 ml kohti 10 mM Zn ZnS04.7H20 187,5 mg 2 mM Cu CuS04.5H20 49,9 mg 0,1 mM Mn MnS04.H20 1,7 mg 0,02 mM Ni Ni(N03)2.6H20 0,58 mg 0,2 mM AI NH4A1(S04)2.12H20 9,2 mg 0,1 mM Cr KCr(S04)2.12H20 5,0 mg 0,02 mM Co CoC12>6H20 0,48 mg 1 mM Se Se02 11,1 mg 14 mM Na2-EDTA 521,1 mg 1 mM Na^-sitraatti 29,4 mg

On itsestään selvää, että tällainen hivenaineiden seos voi sisältää muitakin aineita kuin mitä yllä olevassa taulukossa on mainittu riippuen käytettyjen kudos- ja solulajien vaatimuksista.

Keksinnön mukainen lisäaine voi jo mainittujen ainesosien myöskin sisältää kasvua edistäviä ja solukasvun välttämättömiä yhdisteitä. Tällaisia yhdisteitä voi olla esimerkiksi pinta-aktiivinen aine "Pluronic"F 68 (20 mg/1), D-glukoosi (2,5 g/1), L-glutamiini (2 mM), natriumpyruvaatti (1 mM), insuliini (0,5 mg/1) ja/tai etanoliamiini (20 μΜ). Kaikki suluissa annetut pitoisuudet tarkoittavat loppupitoisuutta. Mainittujen yhdisteiden seos (lukuunottamatta etanoliamiinia, joka.huoneen lämpötilassa on juokseva) voidaan valmistaa kuivana tuotteena ja sellaisenaan varastoida pitkiä aikoja, jopa useita vuosia. Etanoliamiinia voidaan tarvittaessa lisätä väliaineeseen toivottuna pitoisuutena seoksia käytettäessä. Etanoliamiinia käytetään useimmiten hybridomasolujen kokeissa valmistettaessa monoklonaalisia vasta-aineita.

Edullinen basa1ttiväliaine, johon voidaan lisätä keksinnön mukainen väliainelisäaine on RPMI 1640, 2/2,5 g/1 NaHCO^ 87230 ja 20 mM HEPES (N-2-hydroksietyylipiperatsiini-N,N 1 -etaanisulfonihappo).

Edullisia soluviljelmiä, joissa keksinnön mukainen seerumiton lisäaine on osoittautunut erityisen käyttökelpoiseksi, ovat L 929 hiiri-fibroblastisolulinjan, HeLa ihmiskasvain-soluiinjan, erilaisien hiiri- ja ihmis B-hybridomasolujen viljelmät, jotka kaikki muodostavat monoklonaalisia vasta-aineita määrinä, jotka vastaavat seerumipitoisten viljelmien kasvua, ja ihmismonosyyttejä, jotka erottuvat kehittyneiksi makrofaageiksi 7 päivän kuluessa ylläpitäen komplementti reseptoreita.

Erityisen edullinen keksinnön mukaisen lisäaineen käyttö on yhdessä nopeasti kasvavien solutyyppien kanssa erilaisten väliaineiden laadun koestuksessa. Sekoittamalla keksinnön mukaista seerumitonta väliaine-lisäainetta RPMI 1640:n kanssa ja lisäämällä tämä tutkittavaan väliaineeseen suhteessa seeιumitonväliaine-lisäaine + RPMI 1640/tuntematon väliaine suhteessa 1:1 ja tämän jälkeen lisäämällä nopeasti ' : kasvavia soluja lukumäärältään noin 30 000 solua/ml, :T; voidaan, ilman toksisten yhdisteiden läsnäoloa tutkittavassa väliaineessa, havaita solujen lukumäärässä 4 päivän kuluttua lisäys, joka on 10 kertaa enemmän soluja kuin alkuperäinen lukumäärä. Jos sitä vastoin myrkyllisiä yhdisteitä on läsnä tuntemattomassa väliaineessa, ei solun kasvua voida havaita. Näin ollen on siis aikaansaatu erittäin yksinkertainen laatukoe, joka on erittäin herkkä, koska se suoritetaan ilman seerumin läsnäoloa, ja vältetään väärät tulokset, koska vältytään siitä, että seerumi sitoutuu myrkyllisiin epäpuhtauksiin ja peittää ne.

Kun muiden vi 1jeLyväliaineiden kokeilua yllä mainitulla tavalla käy tietään nopeasti kasvavia soluja, voidaan tähän tarkoitukseen erityisen edullisesti käyttää tähän asti tuntematonta solulinjaa. Tämä solulinja on deponoitu 87230

European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC),

Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, 20. marraskuuta 1986 deponoin!inumerolla 86112001. Tämä solulinja on erityislaji hybridomatyyppisiä nopeasti kasvavia soluja ja muodostettu fuusioimalla p^U^-kasvainsoluja ja B-lymfosyyttejä. Tämä solulinja on osoittautunut erityisen hyödylliseksi muiden kasvuväliaineiden laadun koetuksessa, kuten edellä on selitetty ja on osa esillä olevaa keksintöä.

Keksinnön mukainen kasvuväliaine yhdessä mainitun nopeasti kasvavan hybridomasolutyypin kanssa voidaan siis liittää yhteen koelaitteeseen, joka sisältää esimerkiksi keksinnön mukaisen seerumin korvikkeen, jäädytetyt solut (esimerkiksi kuivajäällä) sekä mahdollisesti väliaineen (RPMI 1640) ja kasvatustaitteen muovista tai muusta aineesta.

Solulinjan 1 Kb valmistus ja käyttö kasvuväliaineon laadun tutkimiseksi ________________________________________

Edellä mainittu deponoitu solulinja valmistettiin sillä myeioomahybiiditekniikalla, jonka ovat kuvanneet G.

Köhler ja C. Milstein; Nature (London), 256, 495, 1975.

Emosoluina olivat p^U^-myeloomat ja Balb/c B-lymfosyytit, kaikki lajit peräisin hiiristä.

On tunnettua, että hybridomasolut vaativat väliaineelta laatua. Solulinja 1E6 valittiin nopeimmin kasvavana hybridomana 20 kokeillusta solulinjasta. Solulinjaa käytettiin tunnettujen valmistajien erilaisten kaupallisten väliaineiden koearvostelussa. Ainoastaan kahdella yhdeksästä kokeillusta vä1 laineesta osoittautui olevan hyväksyttävä laatu. Kuuden muun väliaineen sytotoksisuus oli 61-100 %. Seerumi ton hybridomatesti on herkempi kuin muut biokokeet, joihin kuuluu seerumin (myrkynpoistovaikutus) lisääminen viljelyn aikana.

9 87230

Esillä olevaa keksintöä voidaan myös käyttää mahdollisten myrkyllisten aineiden myrkyllisyyden identifioimiseksi tutkimalla niiden vaikutusta keksinnön mukaisten 1E6-solujen kasvatuksessa yhdessä seerumittoman väliaine-lisäaineen kanssa.

Kasvuväliaineen laatu tutkittiin kokeessa ja vertaamalla hiirien sikiökokeeseen. Hiirisikiökoe perustuu siihen, että hiirisikiö, joka on hedelmöittynyt in vivo, viljellään 4-5 päivää koeväliaineessa. Mikäli yli 80 % sikiöistä kehittyybastosyyteiksi, hyväksytään väliaine.

Solun viljelykokeeseen kuului hybridomasolulinja 1E6 ja RPMI-1640/SSR-väliaine (RPMI/SSR). Kokeet suoritettiin seuraavalla tavalla:

Vaihe 1: RPMI/SSR ja koeväliaineen näyte sekoitettiin suhteessa 1:1 (ilman seerumia).

4

Vaihe 2: Lisättiin hybridomasoluja 1,5 x 10 solua/ml ja inkuboitiin 4 päivää.

Vaihe 3: Solut lasketaan. Mikäli ei läsnä ole mitään · _' myrkyllisiä aineita, on tuloksen oltava noin ’ 3x10^ solua/ml.

Lidokaiinin myrkyllisyyden tutkimuksissa suoritetussa kokeessa tutkittiin solulinjan 1E6 solukasvun inhibointi. :Y: Tulokset on annettu alla.

(Yllä esitetyt tulokset on julkaistu ESHRE-kongressissa, Cambridgessä, Englanti, 26. kesäkuuta - 1. heinäkuuta 1987 . . ja ESCO-ESHRE-kongressissa, Budapestissa, Unkari, 27.- 30. syyskuuta 1987).

: ; ; Näiden kokeiden johtopäätös on, että lidokaiinipitoisuus ' . 0,01 mg/ml tai sen yli on osoittautunut olevan myrkyllinen.

Hiirisikiökokeessa ei todettu minkäänlaista myrkyllisyyttä.

10 87230 Tästä seuraa, että koe, jossa käytetään keksinnön mukaista hybridoma- ja kasvuväliainelisäainetta, on parempi kuin mitä nykyään tunnettu yleisesti käytetty koe. Voidaan myöskin päätellä, että hiirisikiökoe on erittäin epäherkkä verrattuna so Luhybridomakokeeseen.

Väliaineen laatukoe

Juokseva väliaine (lx) Väliaine, Väliaine Alkuperä Solukasvun annos n:o_____inhibointi_ 1 EBSS Sigma 0% 2 EBSS Gibco 32% 3-5 EBSS Flow, Gibco, 85-92%

Sigma 6-8 Hain F 10 Flow, Gibco, 61-100%

Sigma 9 RPMI 1640 Sigma 0%

Jauhemainen väliaine + vesi väliaine, väliaine Alkuperä Solukasvun annos n;o_____inhibointi 10-11 MEM Göteborg 30-33% 12-17 EBSS Göteborg 12-45% 18-23 EBSS Tromsö (Flow, 0%

Gibco, Sigma) 24-27 Ham F 10 Tromsö (Flow, 0%

Gibco, Sigma) 11 87230

Vesilaatukoe

Vesityyppi Solukasvun ___________;___inhibointi

Tromsö, 2 x tislattu 35%

Tromsö, 2 x tislattu, varastoitu steriiiittömästi 92%

Millipore RO, Göteborg 11%

Pharmacia S.W. (Ruotsi) 88%

Steridos S.W. (Ruotsi) 0% NAF S.W. (Not ja) 0%

Travenol S.W. (UK) 0%

Travenol s.w. (USA) 0%

Medipolai S.W. (Suomi) 0%

Analar S.W. (UK) 0%

Lidokaiini-myrkyllisyyskoe

Lidokaiiniu pitoisuus Solukasvun ("Xylocain"*R', Astra, Ruotsi) inhibointi 0, . 0001 mg/m J 0% 0,001 mg /m I 0% : 0,01 mg/rn J 20% 0,1 mg/ml 8 5%

Claims (11)

87230

1. Seerumiton kasvuväliaine, joka muodostuu soluviljelmän basaalivällaineesta, kuten RPMI 1640/HEPES/NaHCO3 sekä mahdollisista hivenaineista, jotka ovat välttämättömiä solun kasvulle, kuten Zn, Cu, Mn, Ni, Ai, Cr, Co ja/tai Se, joka kasvuvä-liaine on puskuroitu pH-alueelle 7,0 - 7,8, tunnettu siitä, että kasvuväliaine lisäksi sisältää ei-toksista rauta-kelaattia, jossa raudan pitoisuus on 1 - 10 μΜ, sekä ylimäärä yhtä tai useampaa sinänsä tunnettua ei-toksista kelatoivaa ainetta ja sitruunahappoa/sitraattia pitoisuutena, joka on vähintään kolme kertaa niin suuri kuin kelaattien kokonaispitoisuus, sekä auriinitrikarboksyylihappoa 0,5 - 6 μΜ.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen seerumiton kasvuväliaine, tunnettu siitä, että auriinitrikarboksyylihapon pitoisuus on 2,4 - 3,6 μΜ.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen seerumiton kasvuväli-aine, tunnettu siitä, että mahdollisia hivenaineita on läsnä sellaisena pitoisuutena, että kelatoivan aineen/ke-latoivien aineiden seoksen pitoisuus on 300 - 300 000 kertaa suurempi kuin yksittäisen hivenaineen pitoisuus.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen seerumiton kasvu-väliaine, tunnettu siitä, että se sisältää yhtä tai useampaa pinta-aktiivista ainetta.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen seerumiton kasvu-väliaine, t u n n e t t u siitä, että se sisältää vielä kasvutekijää, kuten D-glukoosia, L-glutamiinia, Na-pyruvaat- * tia, insuliinia ja etanol iamiinia.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen seerumiton kasvuväliaine, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää kasvutekijää kuten vitamiinia ja ei-proteiinisia hormooneja. 87230

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen seerumiton kasvu-väliaine, tunnettu siitä, että se sisältää basaalivä-liaineen, jonka pitoisuus on 2,5 g/1 NaHC03 ja 20 mM HEPES.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen seerumiton kasvu-väliaine, tunnettu siitä, että käytetty kelatoiva aine on EDTA.

9. Seerumittoman kasvuväliaineen tiiviste käytettäväksi valmistettaessa jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukaista vesipitoista seerumitonta kasvuvällainetta, tunnettu siitä, että se muodostuu yksittäisten komponenttien tiivistelmästä, edullisesti 1000 kertaisesta tiivistelmästä, jonka muodostaa 2,4 - 3,6 mM Fe-EDTA ja 0,2 - 1,2 mM, Na2_EDTA sekä 32 - 48 mM sitruunahappoa/sitraattia, 0,5 - 6 mM, edullisesti 2.4 - 3,6 mM auriinitrikarboksyylihappoa, sekä mahdollisesti metalli-ioneja pitoisuusalueella 0,08 - 0,12 mM Zn2+, 0,016 - 0,024 mM Cu2+, 0,0008 - 0,0012 mM Mn2+, 0,00016 - 0,00024 mM Ni2+, 0,0016 - 0,0024 mM Äl3+, 0,0008 - 0,0012 mM Cr3+, 0,00016 - 0,00024 mM Co2+ ja 0,008 - 0,012 mM Se^+, joka seos on puskuroitu pH-alueella 4.5 - 5,0.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen seerumittoman kasvuväliai-neen tiiviste, tunnettu siitä, että se on kuiva-aineseoksen muodossa.

11. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukaisen seerumittoman kasvuväliaineen käyttö kasvuväliainelaadun tutkimiseksi edullisesti käyttäen solulinjaa ECACC 86112001, joka on talletettu The European Collection for Animal Cell Culture -laitokseen 20. marraskuuta 1986. 14 87230