FI82444C - Amin, som aer anvaendbar som mellanprodukt vid framstaellning av l-aspartyl-d -aminosyradipeptidamider. - Google Patents

Description

1 82444

Amiini, joka on käyttökelpoinen välituotteena valmistettaessa L-aspartyyli-D-aminohappodipeptidiamideja

Jakamalla erotettu patenttihakemuksesta 810148 (pa-5 tentti 77044).

Keksinnön kohteena on amiini, joka on käyttökelpoinen välituotteena valmistettaessa L-aspartyyli-D-ami-nohappodipeptidiamideja, sekä tämän amiinin käyttö väli-10 tuotteena.

Kantahakemukselle myönnetty FI-patentti 77044 koskee uusia L-aspartyyli-D-aminohappodipeptidiamideja, jotka ovat L-aspartyyli-D-alaniini, L-aspartyyli-D-2-aminovoiha-pon tai L-aspartyyli-D-valiinin amideja ja, jotka ovat 15 erityisen käyttökelpoisia voimakkaiden makeutusominaisuuk- siensa takia, sekä niitä sisältäviä syötäväksi kelpaavia koostumuksisa.

US-patentissa 3 492 131 on todettu L-aspartyyli-L-fenyylialaniinin tiettyjen alempialkyyliesterien olevan 20 jopa 200 kertaa sakkaroosia makeampia ja olevan oleel lisesti vailla katkeria makuvivahteita, jotka ovat olleet aikaisempien keinotekoisten makeutusaineiden, kuten sak-kariinin, haittapuolia. Näiden yhdisteiden stabilisuuden todettiin myöhemmin olevan vain rajoitettua vesipitoisis-25 sa seoksissa, johtuen diketopiperatsiinin muodostumisesta erityisesti neutraaleissa-happamissa pH-olosuhteissa, jotka ovat vallitsevia useimmissa elintarvikeseoksissa.

Mazur ym. ovat julkaisussa J. Med Chem. 16 (1973) 1284 esittäneet, että L-aspartyyli-D-alaniinin alempial-30 kyyliesterien ja niiden eräiden homologien, erityisesti L-aspartyyli-D-alaniini-isopropyyliesterin makeutustehot ovat jopa 125-kertaisia sakkaroosiin verrattuna.

Sukehiro ym. ovat julkaisussa Seikatsu Kagaku 11 (1977) 9-16; Chem. Abstr. 87 (1977) 168407h esittäneet 35 eräitä L-aspartyyli-D-alaniinin amideja, joiden kaava on 2 82444

NH2 O

COOH O CH3 5 jossa R1 on metyyli, etyyli, n-propyyli, isopropyyli, n-butyyli, isobutyyli, sekundäärinen butyyli, sykloheksyyli tai glysiinin, D-alaniinin tai L-alaniinin metyyliesteri-10 en hiilitähde. Tehokkaimpia olivat yhdisteet, joissa R1 on jokin edellä mainituista butyyliryhmistä tai sykloheksyyli, jotka ovat vastaavasti 100-125 ja 100 kertaa sakkaroosia makeampia. Koska n-butyyliamidin todettiin olevan 125 kertaa sakkaroosia makeampia ja isobutyyli- ja sekun-15 dääriset butyyliamidit ovat 100 kertaa sakkaroosia makeampia, pääteltiin, että näiden amidien tehoon vaikuttaa pääasiallisesti alkyyliryhmän R1 hiiliatomien lukumäärä, ja että alkyyliryhmän rakenteellisella isomerismilla on vähän vaikutusta makeutustehoon.

20 Nyt on yllättäen todettu, että ei ainoastaan amidi- substituentin koolla ole ratkaisevaa vaikutusta L-aspar-tyyli-D-alaniiniamidien korkeaan makeusasteeseen, vaan päinvastoin, ratkaiseva merkitys on amidi-substituentin R täsmällisellä avaruudellisella sijoittumisella. On todet-25 tu, että tietyillä L-aspartyyli-D-alaniini-amideilla, joiden a-hiiliatomissa (hiiliatomi, jossa on amidi-typpiato-mi) on sivuketju ja sivuketju myös toisessa tai molemmissa ö- ja fl'-hiiliatomeissa, on merkittäviä etuja.

FI-patenttijulkaisun 77044 kohteena ovat uudet si-30 vuketjuiset L-aspartyyli-D-alaniinin ja tiettyjen muiden L-aspartyyli-D-a-alkyyli-a-aminohappo-dipeptidien amidit, joilla on yllättävän suuri makeutusteho ja joille ei ole ei-toivottuja makuvivahteita tavanomaisina käyttömäärinä, sekä mainittuja amideja sisältävät koostumukset, joita 35 voidaan käyttää syötäväksi kelpaavien aineiden makeut- ti 3 82444 tamiseen. Myös niiden stabiilisuuden on todettu olevan yllättävän hyvä sekä kiinteässä muodossa että vesiseoksis-sa useimpien elintarvikeseosten ominaisella pH-alueella korkeammissakin lämpötiloissa, joita käytetään leivottaes-5 sa ja tavanomaisessa elintarvikkeiden valmistuskäsitte-lyssä.

FI-patentin 77044 kohteena olevat uudet yhdisteet ovat L-aspartyyli-D-aminohappo-dipeptidiamideja, joilla on kaava I

10 fH2 ° (^ΥΎ^-ηη COOH 0 Ra 15 ja niiden fysiologisesti hyväksyttäviä kationi- ja hap-poadditiosuoloja, jossa kaavassa Ra on metyyli, etyyli tai isopropyyli; ja R on fenkyyli; di-isopropyylikarbinyyli; d-metyyli-t-butyylikarbinyyli; d-etyyli-t-butyylikarbi-20 nyyli; di-t-butyylikarbinyyli; disyklopropyylikarbinyyli; dimetyyliakrbinyyli; metyyli-isobutyylikarbinyyli; isopro-pyyli-t-butyylikarbinyyli; 2-metyylitio-2,4-dimetyylipen-tan-3-yyli; ryhmä, jolla on kaava (a) tai (b) 25 4 4

R3 R 3 R

V R3—-jL

30 R R5 (a) (b) joissa ainakin yksi ryhmistä R3, R4, R5 ja R6 on alkyyli, jossa on 1 - 4 hiiliatomia ja muut ovat vetyjä tai alkyy-35 lejä, joissa on 1 - 4 hiiliatomia; X on O, S tai S02, m on 4 82444 O, 1, 2 tai 3; n ja p on kumpikin 0 tai 1; ja ryhmien R3, R4, R5 ja R6 hiiliatomien summa ei ole suurempi kuin 6, ja kun sekä R3 että R4 tai R5 ja R6 ovat alkyylejä, ne ovat metyylejä; 5 ryhmä, jolla on kaava (c) 7 f AA-r9 \ \-i (c) 10 r1° _J .

—<CHAm λ m jossa R7, R8 ja R9 merkitsevät kukin vetyä tai alkyyliä, jossa on 1 - 4 hiiliatomia, ja ryhmien R7, R8 ja R9 hiili-15 atomien summa ei ole suurempi kuin 6, R10 on vety tai al-kyyli, jossa on 1 - 4 hiiliatomia, ja m on 0 - 2; ryhmä, jonka kaava on (d) CH,

H3C

20 \ (d) 0 tai ryhmä, jonka kaava on (e)

25 CH

H-C /

7----OH

(e) 30

Kaavan I mukaisten yhdisteiden fysiologisesti hyväksyttävillä kationionisuoloilla tarkoitetaan suoloja, jotka on muodostettu neutraloimalla kaavan (I) mukaisten yhdisteiden vapaa karboksyylihapporyhmä fysiologisesti 35 hyväksyttävien metallien emäksillä, ammoniakilla ja amii- 5 82444 neilla. Esimerkkejä sellaisista metalleista ovat natrium, kalium, kalsium ja magnesium. Esimerkkejä sellaisista amiineista ovat N-metyyliglukamiini ja etanoliamiini.

Termillä fysiologisesti hyväksyttävät happoadditio-5 suolat, tarkoitetaan niitä suoloja, jotka on muodostettu kaavan (I) mukaisen yhdisteen vapaan aminoryhmän ja fysiologisesti hyväksyttävän hapon kesken. Esimerkkejä sellaisista hapoista ovat etikkahappo, bentsoehappo, bromivety-happo, kloorivetyhappo, sitruunahappo, fumaarihappo, glu- 10 konihappo, maitohappo, maleiinihappo, maliinihappo, typpihappo, fosforihappo, sokerihappo, meripihkahappo ja viini-happo .

Keksinnön kohteena olevalle uudelle amiinille, joka on käyttökelpoinen välituotteena valmistettaessa L-aspar- 15 tyyli-D-aminohappodipeptidiamideja on tunnusomaista, että amiinilla on kaava

RbNH2 20 jossa Rb on a) syklopropyyli-t-butyylikarbinyyli tai syklopen-tyyli-t-butyy1ikarbinyyli; R„ : M ^ --( (CH2)mi r6 R5 30 jossa mx on 1 tai 2, ja kun % on 1, R3, R4, R5 ja R6 merkitsevät kukin metyyliä, kun mx on 2, R3 on etyyli ja R4, R5 ja R6 merkitsevät kukin vetyä, tai 35 6 82444 CHo

Ch3^ / 3 C) / “(CH2)ni^^ Λ^η^Χι 5 3 CH3 jossa, kun n2 on 0 ja Pj on 1, X2 on O, S tai S02; ja kun nx ja pj ovat kumpikin O, Xx on S tai S02.

Rinnakkaisessa FI-patenttijulkaisussa 79834 puolestaan kuvataan toisia arvokkaita uusia väliyhdisteitä, jot-10 ka ovat käyttökelpoisia välituotteina valmistettaessa L-aspartyyli-D-aminohappodipeptidiamideja. Nämä väliyhdis-teet ovat D-aminohappoamidiyhdisteitä, joilla on kaava R“-CHC0NHRc 15 | nh2 jossa R“ on metyyli, etyyli tai isopropyyli ja Rc on di-isopropyylikarbinyyli, di-t-b-tuyylikarbinyyli, disyk-20 lopropyylikarbinyyli tai ryhmä, jolla on kaava R41 (CH2)n2 / ">X2 25 \_^CcH2)P2 CH{\ r61 jossa, kun n2 ja p2 ovat kumpikin 0, R41 ja R61 ovat kumpikin 30 metyyli ja X2 on S tai S02, kun n2 on 0 Ja p2 on 1, R41 ja R61 ovat kumpikin metyyli ja X2 on S tai S02, ja kun n2 on 1 ja p2 on 1, R41 ja R61 ovat kumpikin vety ja X2 on S.

35 Tässä käytettynä loppuliite "karbinyyli" tarkoittaa ryhmää -CH-. Täten, esimerkiksi di-isopropyylikarbinyyli

II

7 82444 on ryhmä ( i-C3H7 )2-CH- ja disyklopropyylikarbinyyliamiini on (a)2chnh2.

Lisäksi esillä olevan keksinnön kohteena on keksinnön mukaisen amiinin, ts. kaavan RbNH2 mukaisen amiinin 5 käyttö välituotteena valmistettaessa L-aspartyyli-D-amino-happodipeptidiamideja, joilla on kaava I

fH2 ? ίο ιΥΎ^νηκ a) COOH 0 Ra jossa R* on metyyli, etyyli tai isopropyyli; ja R merkit-15 see samaa kuin Rb patenttivaatimuksessa 1.

Kaavan (I) mukaisia dipeptidi-amideja valmistetaan mukavasti menetelmin, jotka soveltuvat aminohappojen kytkentään. Ensisijainen menetelmä kaavan (I) mukaisten di-peptidiamidien valmistamiseksi on esitetty seuraavassa: 20 L- ,-χNBQ Ra _OobOOH + B-NH^HCOOR11 (1) kondensointi^ (2) h2o 25 tai karboksyyli-aktivoitu johdannainen

Ra

NHQr3 _^NHQ I

30 / \ RbNH2 / lOCONH^^CONHR13

COOR10 COHN COOH -^ C00R

suojauksen poisto 35 (I) 8 82444

Edellä esitetyissä L-aspartiinihappo-johdannaisissa Q on jokin hyvin tunnetuista aminosuojaryhmistä, jotka voidaan poistaa selektiivisesti, kuten ryhmät, joita on selostanut Boissonnas, Advances in Organic Chem. 3 (1963) 159-190.

5 Erityisen ensijäisiä aminosuojaryhmiä ovat bentsyyliok-sikarbonyyli ja tert-butyylioksikarbonyyli. R10 on lähinnä aikyyliryhmä, jossa on yksi-neljä hiiliatomia tai bentsyy- li. Käytettävä D-alaniini, D-2-aminovoihappo tai D-valiini voi olla vapaana aminohappona, jossa R11 on vety, mutta lä-10 hinnä se on karboksyyli-suojattu johdannainen, jossa R11 voi olla esteriryhmän tähde, kuten metyyli tai etyyli, mutta lähinnä se on silyyliryhmä, kuten trialkyylisilyy-li, jossa on 3-12 hiiliatomia. Taloudellisista ja tehokkuussyistä erityisen ensisijainen sellainen ryhmä on tri-15 metyylisilyyli.

Edellä esitetyn reaktiosarjän ensimmäisessä vaiheessa di-suojattu L-aspartiinihappo kondensoidaan sopivan D-aminohapon tai karboksi-suojatun johdannaisen kanssa, jolloin saadaan kaavan (II) mukaista di-suojattua dipep-20 tidiä. Vaikkakin tämä vaihe voidaan suorittaa di-suojattua aspartiinihappoa käyttäen kondensointiaineiden, kuten esimerkiksi disykloheksyylikarbodi-imidin läsnäollessa, on suositeltavampaa käyttää di-suojatun aspartiinihapon a-karboksyyli-aktivoitua johdannaista. Ensisijaisia sel-25 laisia karboksyyli-aktivoituja johdannaisia ovat kloridi, bromidi, anhydridi tai seka-anhydridi. Tehokkuussyistä erityisen ensisijaisia ovat edellä mainittujen di-suojattu j en L-aspartiinihappojen seka-anhydridit kloorikar-bonihapon esterien kanssa, erityisesti alkyyliesterien 30 kanssa, joiden mainitussa alkyylissä on yksi-neljä hiili- atomia. Ensisijaisimpia seka-anhydridejä ovat anhydridit, jotka on valmistettu kloorikarboksyylihapon metyyli- ja etyyliestereistä, taloudellisista syistä johtuen.

Erityisen ensisijaisessa kaavan (I) mukaisten yh-35 disteiden valmistusmenetelmässä β-bentsyyli-N-bentsyyliok- 9 82444 sikarbonyyli-L-aspartiinihapon annetaan reagoida alan tunnetuin menetelmin etyylikloorikarbonaatin kanssa, jolloin muodostuu vastaavaa seka-anhydridiä. D-aminohappo,

RaCH(NH2)COOH, jota on saatu kaupan olevista lähteistä tai 5 hajottamalla raseemista aminohappoa tunnetuin menetelmin [ks. esim. Yamada ym., J. Org. Chem. 38 (1973) 4408], muutetaan erillisessä astiassa trimetyylisilyyliesteriksi saattamalla aminohappo kosketuksiin ekvimoolimäärän kanssa trimetyylisilyylikloridia reaktion suhteen neutraalin or-10 gaanisen liuottimen läsnäollessa. Tähän tarkoitukseen sopivia liuottimia ovat esimerkiksi pyridiini, dimetyyli-formamidi tai dimetyyliasetamidi; erityisen ensisijainen on dimetyyliformamidi.

Tyypillisessä tämän menetelmän mukaisessa reaktios-15 sa D-aminohapon, esim. D-alaniinin, joka on liuotettuna dimetyyliformamidiin ja ekvimolaarisen trimetyylikloori-silaani-määrän lisäys tapahtuu huoneen lämpötilassa. B-bentsyyli-N-bentsyylioksikarbonyyli-L-aspartiinihappo j a mooleina ylimäärin käytettävä happoa sitova aine, lähinnä 20 trietyyliamiini, liuotetaan erillisessä pullossa dimetyy-liformamidin ja tetrahydrofuraanin seokseen ja huoneen lämpötilassa tai sitä alemmassa lämpötilassa, lähinnä noin -25 - +25 °C:ssa ja erityisesti noin -10 - 0 °C:ssa lisätään ekvimoolimäärä etyylikloorikarbonaattia, jolloin 25 muodostuu seka-anhydridiä. Tähän lisätään esim. D-alanii-nitrimetyylisilyyliesterin liuos, lämpötilan ollessa lähinnä samoissa rajoissa. Reaktio on tavallisesti päättynyt 1-2 tunnin kuluessa, minkä jälkeen reaktioseos kaadetaan veteen tai vesipitoiseen happoon, esimerkiksi suolahappoon 30 ja kaavan (II) mukainen tuote uutetaan veden kanssa se-koittumattomalla liuottimena, tyypillisinä esimerkkeinä kloroformi, metyleenikloridi tai etyylieetteri, ja eristetään yleisin menetelmin. Di-suojattu dipeptidi (II) on tavallisesti riittävän puhdasta käytettäväksi seuraavassa 35 vaiheessa, mutta voidaan puhdistaa haluttaessa edelleen, 10 82444 esimerkiksi kromatografoimalla kolonnissa.

Tämän menetelmän toisessa vaiheessa di-suojatun di-peptidin (II) annetaan reagoida ekvimoolimäärän kanssa kaavan RbNH2 mukaista primääristä amiinia, jolloin saadaan 5 vastaavaa kaavan (III) mukaista di-suojattua dipeptidi-amidiväliyhdistettä, jossa Ra, Rb, R10 ja Q ovat aikaisemmin määriteltyjä.

Kuten ensimmäisessä vaiheessakin, tällöin voidaan käyttää menestyksellisesti reagenssin (II) karboksyylihap-10 pomuotoa, kun käytetään kondensointlaineita, esimerkiksi disykloheksyylikarbodi-imidiä, jolloin saadaan kaavan (II) mukaisia väliyhdisteitä. Suositeltavaa on kuitenkin, että kaavan (II) mukainen yhdiste muutetaan karboksyyli-akti-voiduksi johdannaiseksi, esimerkiksi kloridiksi, bromi-15 diksi tai seka-anhydridiksi viimeksi mainitun ollessa ensisijainen. Täten seka-anhydridiä valmistetaan käyttämällä erityisen ensisijaisesti kaavan (II) mukaista yhdistettä, jossa R10 on bentsyyli ja Q on bentsyylioksikarbonyyli. Kuten edelläkin, ensisijaisia anhydridejä ovat anhydri-20 dit, joita on saatu kloorikarboksyylihapon estereistä ja erityisen ensisijaisia ovat niiden metyyli- tai etyyli-esterit. Yhdisteen (II) seka-anhydridejä valmistetaan käyttämällä reagensseja ja olosuhteita, joita on selostettu edellä tämän reaktiosarjan ensimmäisen vaiheen osalta. 25 Tyypillisessä reaktiossa kaavan (II) mukaista yhdistettä ja trietyyliamiinia yhdistetään suunnilleen ekvimoolimää-rin reaktion suhteen neutraalissa orgaanisessa liuottimes-sa, esimerkiksi tetrahydrofuraanissa, seos jäähdytetään noin -10 °C:seen ja lisätään etyylikloorikarbonaattia, 30 jolloin saadaan seka-anhydridiä. Tähän lisätään sitten ekvimoolimäärä kaavan RNH2 mukaista amiinia tai sen liuosta, esimerkiksi samassa reaktion suhteen inertissä liuot-timessa ja lämpötilan ollessa noin -50 ... +25 eC ja lähinnä välillä -35 ... -5 °C. Amiinin lisäyksen päätyttyä 35 reaktioseoksen annetaan lämmetä suunnilleen huoneen lämpö- u 82444 tilaan ja pidetään tässä lämpötilassa, kunnes reaktio on pääasiallisesti päättynyt, tavallisesti noin 1-20 tuntia. Sen jälkeen haluttu kaavan (III) mukainen väliyhdiste eristetään ja puhdistetaan, mikäli halutaan, samoin mene-5 telmin kuin edellä on selostettu yhdisteen (II) osalta.

Tämän menetelmän viimeisessä vaiheessa poistetaan karboksyyli-suojaryhmä R10 ja amino-suojaryhmä Q, jolloin saadaan haluttuja kaavan (I) mukaisia makeutusaineita.

Suojaavien ryhmien poistamiseksi kaavan (III) mu-10 kaisesta dipeptidi-amidista valittava menetelmä riippuu useista alan asiantuntijoille ilmeisen selvistä tekijöistä. Kaksi merkittävää tekijää tällaisen valinnan suorittamisen yhteydessä on suojaavien ryhmien R10 ja Q luonne ja amidisubstituentin R luonne. Esimerkiksi, kun R10 ja Q 15 ovat, vastaavasti, erityisen ensisijaisia ryhmiä, bentsyy-li ja bentsyylioksikarbonyyli eikä R:ssä ole rikkiä, ensisijaisena menetelmänä mainittujen suojaryhmien poistamiseksi on yleensä hydrogenolyysi. Kuitenkin, kun R10 on bentsyyli tai edellä määritelty alkyyli ja Q on tert-bu-20 tyylioksikarbonyyli ja R:llä on mikä tahansa edellä mainituista merkityksistä, yleensä on suositeltavaa poistaa suojaryhmät hydrolysoimalla. Hydrolyysin ja hydrogenolyy-sin yhdistelmä on suotava sellaisissa tapauksissa, jolloin R10 on alkyyli, Q on bentsyylioksikarbonyyli eikä R:ssä ole 25 rikkiä.

Kun suojaavien ryhmien poistamiseksi kaavan (III) mukaisesta väliyhdisteestä valitaan hydrogenolyysi, on suositeltavaa, että reaktio suoritetaan katalyyttisen ja-lometalli-katalyyttimäärän läsnäollessa, palladiumin ol-30 lessa erityisen ensisijainen ja reaktion suhteen inertin liuottimen läsnäollessa. Esimerkkejä sellaisista liuottimista ovat pienimolekyyliset alkanolit, kuten metanoli, etanoli, isopropanoli ja n-butanoli; eetterit, kuten tet-rahydrofuraani, etyylieetteri, 1,2-dimetoksietaani ja di-35 etyleeniglykoli-dimetyylieetteri; esterit, kuten etyyli- i2 8 2444 asetaatti, metyylipropionaatti ja dimetyylisukkinaatti; ja dimetyyliformamidi. Erityisen ensisijaisia sellaisia liuottimia ovat metanoli ja etanoli taloudellisuutensa ja tehokkuutensa vuoksi. Vaikkakin hydrogenolyysi voidaan 5 suorittaa menestyksellisesti korkeammissa paineissa ja lämpötiloissa, taloudellisuuden ja mukavuuden kannalta noin 1-10 ilmakehän paineita ja huoneen lämpötilaa pidetään ensisijaisina. Lämpötilan ja paineen ollessa ensisijaiset, reaktio on yleensä tapahtunut loppuun noin 30 10 minuutin - noin kuuden tunnin kuluessa, minkä jälkeen katalyytti poistetaan, tyypillisesti suodattamalla, liuotin haihdutetaan pois ja saatu tuote puhdistetaan, haluttaessa, normaalein menetelmin, esimerkiksi kiteyttämällä uudelleen tai kromatografoimalla kolonnissa.

15 Kun toisen tai molempien suojaryhmien R10 ja Q pois tamiseksi valitaan hydrolysointi, jonkinlaisella menestyksellä voidaan käyttää mitä tahansa hyvin tunnetuista menetelmistä, Joita käyttäen suoritetaan esterien alkalinen hydrolyysi tai hapan hydrolyysi tai näiden kaltaista mene-20 telmää. Kuitenkin, kun on poistettava hydrolysoimalla suo-jaryhmät R10, alkalinen hydrolyysi on ensisijainen ja erityisen ensisijaisina olosuhteina on pidettävä ainakin ek-vivalenttisen vahvan emäsmäärän käyttöä, esimerkiksi nat-riumhydroksidin tai kaliumhydroksidin käyttöä veden ja 25 pienimolekyylisen alkanolin, erityisesti metanolin tai etanolin läsnäollessa, huoneen lämpötilassa tai suunnilleen huoneen lämpötilassa. Näissä ensisijaisissa olosuhteissa R10-ryhmän hydrolyyttinen poisto on tavallisesti päättynyt muutamassa tunnissa tai lyhyemmässä ajassa.

30 Kun amino-suojaryhmä Q on tert-butyylioksikarbonyy- li, sen poistamiseen on suositeltavaa käyttää hapanta hyd-rolyysiä. Erityisen suotavaa on laimean suolahapon vesi-liuoksen käyttö metanolin tai etanolin läsnäollessa ja seoksen lämmittäminen kiehumislämpötilassa. Näissä olosuh-35 teissä hydrolyysi on tavallisesti tapahtunut loppuun muu- i3 82444 tamassa tunnissa tai lyhyemmässä ajassa.

Kaavan (I) mukaisten tuotteiden eristämiseksi, millä tahansa edellä esitetyillä hydrolyysimenetelmillä tapahtuneen suojaryhmien poistamisen jälkeen, käytetään alan 5 tunnettuja yleisiä menetelmiä. Esimerkiksi happamen hydro-lyysin jälkeen reaktioseos haihdutetaan liuottimen poistamiseksi kuiviin, vesipitoinen jäännös pestään veden kanssa sekoittamattomalla polaarittomalla liuottimena, esimerkiksi etyylieetterillä tai kloroformilla, minkä jäl-10 keen vesikerros tehdään alkaliseksi ja tuote uutetaan veden kanssa sekoittamattomalla liuottimena, kuten esimerkiksi etyyliasetaatilla ja tuote saadaan talteen haihduttamalla liuotin pois. Haluttaessa tuotetta voidaan puhdistaa edelleen, esimerkiksi kiteyttämällä uudelleen tai kro-15 matografoimalla kolonnissa. Kun alkalista hydrolyysiä suo-jaryhmän R10 poistamiseksi seuraa hydrogenolyysi aminosuo-jaryhmän Q poistamiseksi, on suotavaa, että alkalisessa hydrolyysissä saatu reaktioseos neutraloidaan lisäämällä happoa, esimerkiksi suolahappoa ja neutraloitu reaktioseos 20 hydrogenolysoidaan edellä selostetulla tavalla.

Toinen ensisijainen menetelmä kaavan (I) mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi on esitetty seuraavassa.

Ra Ra 25 D-QNHCHCOOH + RbNH2 QNHCHCONHRb —-- tai karboksyyli-aktivoi- (IV) tu johdannainen

_ .NHQ

30 a L" / \

suojauksen poisto R COOR10 COOH

-----^ NH2CHCONHRb -^ (m)_^(i) (V) 35 i4 82444 R", Rb, R10 ja Q ovat edellä määriteltyjä.

Amino-suojatun D-aminohapon tai sen karboksyyli-aktivoidun johdannaisen annetaan reagoida ekvimoolimäärän kanssa amiinia RNH2 käyttämällä menetelmiä ja olosuhteita, 5 joita on edellä selostettu väliyhdisteiden (II) ja (III) valmistamiseksi, jolloin saadaan kaavan (IV) mukaista ami-nosuojattua D-aminohappoamidia. Suojaryhmä Q poistetaan hydrogenolysoimalla tai hydrolysoimalla edellä selostetulla tavalla ja saatu vapaa aminoamidi (V) kondensoidaan di-10 suojatun L-aspartiinihappo-johdannaisen tai sen karbok-syyliaktivoidun johdannaisen kanssa, kuten edellä on selostettu valmistettaesssa kaavan (II) mukaisia väliyhdis-teitä, jolloin saadaan di-suojattua kaavan (III) mukaista dipeptidiamidia, josta saadaan edellä selostetulla tavalla 15 haluttua kaavan (I) mukaista makeutusainetta.

Tämän menetelmän eräässä muunnelmassa kaavan (IV) mukainen väliyhdiste, jonka R:ssä on syklinen tai asyk-linen sulfidi-ryhmä (-S-), voidaan hapettaa vastaavaksi sulfoksidiksi tai sulfoniksi ennen sen muuttamista väliyh-20 disteeksi (V) ja sen jälkeen tapahtuvin edellä selostetuin reaktioin, jolloin saadaan kaavan (I) mukaisia yhdisteitä, joissa R on sulfoksidi tai sulfoni.

Kolmannessa ensisijaisessa menetelmässä kaavan (I) mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi edellä selostettu 25 kaavan (V) mukainen D-aminohappo-amidi saatetaan reagoimaan L-aspartiinihappo-N-tiokarboksianhydridin kanssa, jolloin saadaan suoraan kaavan (I) mukaisia yhdisteitä. Tätä menetelmää suoritettaessa väliyhdiste (V) saatetaan sopivassa liuottimessa kosketuksiin ekvimoolimäärän kanssa 30 L-aspartiinihappo-N-tiokarboksianhydridiä lievästi aikali sissä pH-olosuhteissa lämpötilan ollessa välillä noin -25 - +10 °C, jolloin saadaan kaavan (I) mukaista yhdistettä. Tässä reaktiossa tarvittava alkalinen pH saadaan aikaan vahvan emäksen, esimerkiksi natriumhydroksidin tai 35 kaliumkarbonaatin avulla. Tässä reaktiossa käytettäviä is 82444 sopivia liuottimia ovat liuottimet, jotka liuottavat ainakin osan reagensseissa käytettävissä reaktio-olosuhteissa reagoimatta huomattavassa määrässä kummankaan reagenssin kanssa ja mahdollistavat reaktiossa muodostuneiden tuot-5 teiden eristämisen suhteellisen helposti. Esimerkkeinä sellaisista tässä reaktiossa käytettävistä liuottimista ovat vesi, tetrahydrofuraani, 1,2-dimetoksietaani, diety-leeniglykoli-dimetyylieetteri, dimetyylisulfoksidi, dime-tyyliformamidi ja niiden yhdistelmät; ensisijaisia liuot-10 timia ovat vesi ja sen seokset tetrahydrofuraanin kanssa. Suositeltava tässä reaktiossa käytettävä alkalinen pH-alue on välillä noin 8-10 ja erityisen ensisijainen pH on noin 9. Erityisen ensisijainen lämpötila on välillä noin -10 - 0 °C.

15 Edellä mainituissa ensisijaisissa olosuhteissa reaktio on tavallisesti päättynyt 1-2 tunnin kuluessa. Sen jälkeen kaavan (I) mukainen tuote eristetään yleisin menetelmin, esimerkiksi reaktioseoksen pH säädetään tuotteen isoelektristä pH;ta vastaavaksi, tavallisesti välille noin 20 pH 5,0 - 5,6, jolloin kaavan (I) mukainen tuote saostuu, liuottimen pääosa poistetaan haihduttamalla tai suodattamalla ja raakatuote lietetään orgaaniseen liuottimeen, esimerkiksi metanoliin, etanoliin, etyylieetteriin, etyyliasetaattiin tai niiden seokseen. Sen jälkeen kaavan (I) 25 mukainen tuote eristetään, esimerkiksi suodattamalla. Sitä voidaan puhdistaa edelleen haluttaessa, esim. kiteyttämällä uudelleen tai kromatografoimalla kolonnissa.

Tarvittavat kaavan RbNH2 mukaiset amiinit, joissa Rb on aikaisemmin määritelty, voidaan saada helposti saata-30 vista lähtöyhdisteistä. Monia amiineja saadaan pelkis-tysaminointia käyttäen vastaavista ketoneista käyttämällä erilaisia alalla tunnettuja olosuhteita. Käyttökelpoinen voi esimerkiksi olla pelkistysaminointi hyvin tunnetun Leuckhart-reaktion avulla, käyttämällä pelkistysaineina 35 muurahaishappoa ja formamidia; ks. esimerkiksi artikkelia ie 82444

Organic Reactions, Wiley and Sons, New York, Vol. 5, s. 301, 1949. Vaihtoehtoisesti sopivaa ketonia voidaan ami-noida pelkistämällä käyttämällä natriumsyaaniboorihydridiä ja ammoniumasetaattia, ks. esimerkiksi J. Amer. Chem. Soc.

5 93 (1971) 2897 tai etanolissa olevan ammoniakin avulla hydrauskatalyytin, kuten Raney-nikkelin, platinan tai palladiumin läsnäollessa; ks. esimerkiksi Organic Reactions 4 (1948) 174. Monia kaavan RbNH2 mukaisia amiineja saadaan vastaavista ketoneista muodostamalla oksiimi-väliyhdiste, 10 jota muodostetaan saattamalla ketoni reagoimaan hydrok-syyliamiinin tai sen suolojen kanssa alalla hyvin tiedossa olevissa olosuhteissa. Oksiimi-väliyhdiste pelkistetään sitten hydraamalla katalyyttisesti tai natriumin avulla pienimolekyylisen alkanolin läsnäollessa normaalia 15 korkeammassa lämpötilassa. Erityisen ensisijaisessa menetelmässä, joka on erityisen käyttökelpoinen pelkistettäessä rikkipitoisten ketonien oksiimeja, oksiimi pelkistetään etanolissa ja käyttämällä mooleina ylimäärin natriumia, seoksen kiehumislämpötilassa.

20 Tarvittavat, kaavan RbNH2 mukaisten amiinien ketoni- lähtöaineet ovat joko kaupan olevia, jotka ovat alalla tunnettuja tai niitä valmistetaan tunnetuin menetelmin. Esimerkiksi ketoneja, joilla on kaava (VI) tai (VII)

25 4 CH

h3 r cH3\y /^«CH2>n.

°=\ <ca2)m 1 0=/ b6><5 .V'CH2»Pi

Ix I\ prt \ ''j CH, 30 3 (VI) (VII) joissa R3, R4, R5, R6, X:, m!, ja px ovat edellä määritel tyjä, voidaan saada alkyloimella vastaavia yhdisteitä, 35 joissa ryhmien R3, R4, R5 ja R6 tai vastaavasti kaikkien i7 82444 CH3-ryhmien tilalla on vety. Alkylointi suoritetaan esimerkiksi käyttämällä alkylointiaineita, kuten sopivaa alkyy-lihalogenidia tai alkyylisulfaattia, neutraaleissa tai aikalisissä olosuhteissa, jotka on saatu aikaan vahvoilla 5 emäksillä, esimerkiksi natriumhydridillä tai natriumami-dilla.

Tarvittavia syklobutanoneja saadaan menetelmin, joita ovat selostaneet Conia ym., Bull. Soc. chim. France (1963) 726 ja Conia, Ind. chim. Beige 31 (1966) 981.

10 Vaihtoehtoiseen menetelmään kaavojen (VI) ja (VII) mukaisten ketonien valmistamiseksi sisältyy asyklisen läh-töyhdisteen syklisointi; esimerkiksi käyttämällä hyvin tunnettua dikarobksylaatti-esterien Dieckmann'in syk-lisointia ja hydrolysoimalla dekarboksyloimalla sen jäl-15 keen; ks. esim. Modern Synthetic Reacktions, W.A. Benjamin, Menlo Park, Cal., 1972, s. 740. Valmistetut a-keto-esterit, erityisesti sellaiset, joissa ei ole muuta a-substituenttia, voidaan myöskin alkyloida ennen hydrolyy-siä ja dekarboksylointia, mikäli niin halutaan.

20 Tiettyjä kaavan (VII) mukaisia ketoneja saadaan myös asyklisistä lähtöyhdisteistä, jotka ovat kaavan (VIII) mukaisten ketonien johdannaisia, 0 25 y — CH-, (VIII) ch3 ch3 30

Esimerkiksi nelijäsenisen renkaan omavia kaavan (VII) mukaisia ketoneja, joissa X on S, saadaan bromaamalla yhdistettä (VIII) kahden moolin kanssa bromia ja saatu α,α'-dibromi-yhdiste syklisoidaan esim. rikkivedyllä, jolloin 35 saadaan tietanonia. Vastaavasti viisijäsenisen renkaan is 82444 omaavia ketoneja (VII), jossa X on 0 tai S, saadaan, kun yhdiste (VIII) saatetaan ensin reagoimaan formaldehydin kanssa, jolloin saadaan a-hydroksimetyyli-väliyhdistettä, jonka a'-asema bromataan tämän jälkeen ja sitten syk-5 lisoidaan natriumhydroksidilla tai rikkivedyllä, jolloin saadaan vastaavia kaavan (VII) mukaisia yhdisteitä, joissa X on O tai vastaavasti S.

Tiettyjä kaavan (VII) mukaisia tetrahydropyran-4-oneja ja tetrahydrotiapyran-4-oneja saadaan lisäämällä 10 vettä tai rikkivetyä sopivasti substituoidun divinyliketo-nin joukkoon.

Alkyylisykloalkyyliketoneja (XIX) valmistetaan saattamalla sopiva happohalogenidi ja Grignard-reagenssin reagoimaan keskenään käyttämällä alalla hyvin tunnettuja 15 olosuhteita ja reagensseja, esim. seuraavasti: C0C1 CH3^_CH3 CH3 fY - c<~ M^cl >rCH3 20 ^ ^ o=\ CH3 (m on 0 tax 2) \_^ (XIX) <CH2'm

Kaavan RbNH2 mukaisia amiineja, joissa Rb on aikai-25 semmin määritelty, saadaan myöskin hyvin tunnettua

Hofmann’in reaktiota käyttäen suorittamalla sopivan kar-boksiamidin konversio alkalimetallihypohaliitilla.

Keksinnön mukaisia amidi-väliyhdisteitä, joissa Rb on 30 CHo CH1 \ j;xi 35 „ V'(CH2»Pl'^ CH3 CH3

II

i9 82444 jossa Xj on S02, saadaan vastaavista yhdisteistä, joissa Xx on S, hapettamalla käyttämällä reagensseja ja olosuhteita, jotka on tuttuja muodostettaessa sulfoneja sul-fideista. Vaihtoehtoisesti sopiva kaavan (VII) mukainen 5 ketoni, jossa Xx on S tai mainitusta ketonista edellä selostetulla tavalla saatu amiini, voidaan hapettaa sul-foniksi ennen kuin suoritetaan kytkentäreaktio, jolloin saadaan kaavan (I) mukaista amidia. Sellaiseen sulfidien hapettamiseen käytettäviin ensisijaisiin reagensseihin ja 10 olosuhteisiin sisältyy vetyperoksidin käyttö liuottimes-sa, esimerkiksi etikkahapossa tai asetonissa. Kun reagensseja käytetään ekvimoolimäärin, tuote on sulfoksidi, joka on helposti muutettavissa vastaavaksi sulfoniksi lisäämällä toinen mooli peroksidia. Muita ensisijaisia hapet-15 timia ovat kaliumpermanganaatti tai kromihappo, valmistettaessa sulfoneja, ja m-klooriperbentsehohappo. Jälkimmäinen reagenssi on erityisen käyttökelpoinen muutettaessa edellä mainittuja tioketoneja (VII) vastaaviksi sulfoniksi käyttämällä kaksi moolia perhappoa.

20 Kaavan (I) mukaiset yhdisteet ja niiden fysiologi sesti hyväksyttävät suolat ovat suuren tehokkuutensa, fysikaalisen muotonsa ja stabiilisuutensa ansiosta edullisia maketusaineina.

Keksintöä valaistaan lisäksi seuraavin esimerkein. 25 Viite-esimerkki 1 L-aspartyyli-D-alanilni-N-(2-metyylisykloheksyyll-amidi (cis,trans-isomeerien seos) A. Seokseen, jossa oli 1,28 g (3 mmol) S-bentsyyli-N-bentsyylioksikarbonyyli-L-aspartyyli-D-alaniinia, 40 ml 30 tetrahdyrofuraania ja 0,29 ml (3,6 mmol) pyridiiniä jäähdytettynä -20 °C:seen, lisättiin kuivien olosuhteiden vallitessa tiputtamalla 0,29 ml (3 mmol) etyylikloorifor-miaattia. Saatua lietettä sekoitettiin -15 °C:ssa 10 minuuttia ja sitten lisättiin tiputtamalla muutaman minuutin 35 kuluessa 0,79 ml (6 mmol) 2-metyylisykloheksyyliamiinin 20 8 2 4 44 cis- ja trans-isomeerien seosta. Reaktioseksen annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan, laimennettiin vedellä ja uutettiin kloroformilla. Orgaaninen kerros pestiin laimealla suolahapolla, vedellä, natriumvetykarbonaattiliuoksella, 5 uudelleen vedellä ja lopuksi kyllästetyllä natriumkloridin vesiliuoksella. Pesty uute kuivattiin natriumsulfaatilla ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin väritöntä kiinteää ainetta. Kiinteää ainetta trituroitiin etyylieetterin kanssa, sekoitettiin, suodatettiin ja kuivattiin, jolloin 10 saatiin 1,3 g (83 %) β-bentsyyli-N-bentsyylioksikarbonyy- li-L-aspartyyli-D-alaniini-N-( 2-metyylisykloheksyyli )amii-nia, joka antoi ohutkerroskromatografioitaessa ainoastaan yhden täplän (Rf 0,65) (etyyliasetaatti/heksaani/etikkahap-po, tilavuussuhde 10:9:1).

15 B. Edellä osassa A saadun tuotteen liuokseen, 1,05 g (2 mmol) 100 ml:ssa metanolia, lisättiin 0,5 g 5-%:ista palalidum-hiilikatalyyttiä ja seosta hydrattiin Parr'in ravistimessa huoneen lämpötilassa 3,5 kg/cm2:n (50 psi) paineessa 30 minuuttia, minkä jälkeen vedyn sitoutuminen 20 lakkasi. Reaktioseos suodatettiin, suodos haihdutettiin kuiviin vakuumissa, jolloin saatiin 610 mg haluttua tuotetta maalarinvalkeana kiinteänä aineena, joka on cis- ja trans-isomeerien seosta; sp. 206-209 °C.

Viite-esimerkki 2 25 L-aspartyyli-D-alaniini-N-(disyklopropyyllkarbinyy- li)amidi: I, R = CH^ , Re = CH3 30 A. Disyklopropyylikarbinyyliamiini 500 ml:n pyöreäpohjäiseen pulloon pantiin 41,7 g (0,60 mol) hydroksyyliamiinihydrokloridia ja 80 ml vettä. Sekoittaen lisättiin 44 ml 10-molaarista natriumhydrok-35 sidiliuosta ja 44,4 g (0,40 mol) disyklopropyyliketonia.

2i 82444

Seosta sekoitettiin kiehuttaen kolme tuntia. Jäähdyttämisen jälkeen lisättiin 60 ml metyleenikloridia ja seosta sekoitettiin, kunnes kaikki oksiimi oli liuennut. Metylee-nikloridikerros erotettiin ja kuivattiin vedettömällä mag-5 nesiumsulfaatilla. Liuotin poistettiin haihduttamalla va-kuumissa ja jäännös kiteyttiin uudelleen 55 ml:sta hek-saania, jolloin saatiin 40,0 g disyklopropyyliketoksiimia, sp. 69-72 °C.

500 ml:n kolmikaulaiseen pyöreäpohjaiseen pulloon 10 pantiin 18,8 g (0,15 mol) disyklopropyyliketoksiimia ja 150 ml kuivaa etanolia. Tehokkaasti sekoittaen lisättiin mahdollisimman nopeasti annoksittain 19,2 g (0,83 mol) natriumpallosia, kiehuttamalla koko lisäyksen ajan. Natriumin liukenemisen jälkeen reaktioseos jäähdytettiin 60 15 °C:seen ja lisättiin 60 ml vettä. Jäähdyttämisen jälkeen lisättiin tiputtamalla ja sekoittaen 78 ml väkevää suolahappoa. Etanoli tislattiin pois vakuumissa ja suolojen liuottamiseksi lisättiin 50 ml vettä. Seoksen pH säädettiin 10-molaarisella natriumhydroksidiliuoksella arvoon 13 20 ja uutettiin kolmella 40 ml:n erällä metyleenikloridia. Uutteet yhdistettiin, kuivattiin vedettömällä magnesium-sulfaatilla, suodatettiin ja konsentroitiin vakuumissa. Jäljelle jäänyt amiini tislattiin 88-90 eC:ssa/95 mmHg, jolloin saatiin 11,0 g haluttua tuotetta.

25

B. CrHcCHo0C0CH-CHC0NHCHC0NHCH CT

O D Z Z | I X

NHCbz CH3 30 250 ml:n kolmikaulaiseen pulloon, johon oli kiin nitetty tulppa, lämpömittari, kuivausputki ja sauvamag-neettisekoitin, lisättiin 4,28 g (0,010 mol) B-bentsyyli-N-bentsyylioksikarbonyyli-L-aspartyyli-D-alaniinia, 75 ml tetrahydrofuraania ja 1,53 ml (0,011 mol) tiretyyliamii-35 nia. Seos jäähdytettiin -10 eC:seen, lisättiin 1,05 ml 22 8 2 4 4 4 (0,011 mol) etyyliklooriformiaattia, sekoitettiin 20 minuuttia, jäähdytettiin -35 eC:seen ja lisättiin 1,11 g (0,010 mol) disyklopropyylikarbinyyliamiinia. Reaktioseok-sen annettiin lämmetä hitaasti huoneen lämpötilaan ja se-5 koitettiin yön ajan. Seos kaadettiin 150 ml:aan vettä, uutettiin 250 ml:11a etyyliasetaattia ja orgaaninen faasi pestiin 5-%:isella natriumvetykarbonaatin vesiliuoksella (2 x 75 ml), 3-molaarisella suolahapolla (2 x 75 ml), suolaliuoksella (1 x 100 ml) ja kuivattiin vedettömällä mag-10 nesiumsulfaatilla. Kuivattu uute haihdutettiin kuiviin va- kuumissa, jolloin saatiin väritöntä kiinteää ainetta, joka kiteytettiin uudelleen 75 ml:sta kiehuvaa etyyliasetaattia, jolloin saatiin 3,78 g (72 %) di-suojattua amidia, sp. 164-165 °C. Ohutkerroskromatografiointi (TLC) silika-15 geelillä, eluoitaessa etyyliasetaatti/heksaaniseoksella 1:1, antoi yhden ainoan täplän, Rf 0,40 vanilliinin ollessa suihkereagenssina. Emäliuoksista saatiin talteen vielä 0,65 g ainetta.

C. Lietteeseen, jossa oli 2,58 g (4,9 mmol) osassa 20 B saatua tuotetta 250 ml:ssa metanolia, lisättiin 0,60 g 5-%:ista palladium-hiilikatalyyttiä (kosteus 50 %) ja seosta hydrattiin tunnin ajan alkupaineen ollessa 71 psi (5,0 kg/cm2). Katalyytti poistettiin suodattamalla ja meta-noli haihdutettiin vakuumissa, jolloin saatiin 1,47 g (100 25 %) väritöntä tuotetta, sp. 190-191 °C. TLC antoi, käytet täessä seosta butanoli/vesi/etikkahappo, tilavuussuhteen ollessa 4:1:1, ja suihkuttamalla ninhydriiiniä, yhden ainoan täplän, Rf 0,36.

Viite-esimerkki 3 30 L-aspartyyli-D-2-aminovoihappo-N-(disyklopropyyli- karbinyyli)amidi x<!

I, Ra = C2H5, R = CH

'O

35 A. D-CH3CH2CHCONHCH(Δ)2 NHCbz li 23 8 2 444 N-bentsyylioksikarbonyyli-D-2-aminovoihappo, 4,75 g (0,020 mol) liuotettiin 200 ml:aan tetrahydrofuraania ja jäähdytettiin typpiatmosfäärin suojaamana -15 °C:seen. Lisättiin N-metyylimorfoliinia, 2,02 g (0,020 mol) ja etyy-5 liklooriformiaattia, 2,17 g (0,020 ml) ja saatua seosta sekoitettiin -15 - -10 eC:ssa 30 minuuttia. Saatu seka-anhydridin liuos jäähdytettiin -20 °C:seen ja lisättiin 2,22 g (0,020 ml) disyklopropyylikarbinyyliamiinia liuotettuna 10 ml:aan tetrahydrofuraania. Sekoittamista jat-10 kettiin 15 minuuttia -20 ... -15 °C:ssa, minkä jälkeen seoksen annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan, lisättiin 150 ml etyyliasetaattia ja seos uutettiin 2 x 100 ml:11a 1-norm. suolahappoa, 2 x 100 ml:11a 5-%:ista natrium-vetykarbonaatin vesiliuosta ja 100 ml:11a kyllästettyä 15 suolaliuosta. Orgaaninen kerros kuviattiin (MgS04) ja liuotin haihdutettiin pois vakuumissa, jolloin saatiin 6,62 g (100 %) väritöntä kiinteää ainetta, Rf 0,68 silikageeli-TLC:tä käytettäessä (liuotin:etyyliasetaatti/heksaani, til.suhde 1:1; levy suihkutettiin 3-%:isella vanilliinil-20 la).

B. D-(CH3CH2CHC0NHCHC(A)2 nh2 25

Edellä osassa A saatu Cbz-amino-suojattu amidi, 6,62 g (0,020 mol) liuotettiin 250 ml:aan reagenssilaa-tuista metanolia. Lisättiin 5-%:ista palladium-hiili-kata-lyyttiä 1,5 g ja seosta hydrattiin 50 psi:n paineessa 30 (3,52 kg/cm2) 45 minuuttia. Katalyytti poistettiin suodat tamalla ja suodos haihdutettiin kuiviin vakuumissa, jolloin saatiin nestemäistä jäännöstä. Lisättiin 1-norm. suolahappoa 25 ml, minkä Jälkeen seosta sekoitettiin 25 ml:n kanssa etyylieetteriä. Vesifaasi tehtiin vahvasti alkali-35 seksi (pH 14) 10-mol. natriumhydroksidilla ja seos uutettiin 3 x 25 ml:lla eetteriä. Uutteet yhdistettiin, kui- 24 82444 vattiin (MgS04) ja eetteri haihdutettiin pois, jolloin saatiin 3,29 g (83,9 %) väritöntä kiinteää ainetta, sp. 63-64 °C. Rf 0,60 (butanoli/etikkahappo/vesi, til.suhde; nin-hydriini-suihke); [a]D -46,7 ° (c = 2, 1-norra. HC1). ^-5 NMR-spektri oli D-2-aminovoihappo-N-(disyklopropyyli- karbinyyli)amidin struktuuria vastaava.

C. Di-suojattu dipeptidiamidi

Liuokseen, jossa oli B-bentsyyli-N-bentsyylioksi-karbonyyli-L-aspartaattia 5,61 g (0,0157 mol) liuotettuna 10 50 ml:aan tetrahydrofuraania jäähdytettynä -15 °C:seen, lisättiin 1,59 g (0,0157 mol) N-metyylimorfoliinia. Tähän lisättiin tiputtamalla 1,70 g (0,0157 mol) etyylikloori-formiaattia, saatua seosta sekoitettiin 30 minuuttia -15 °C:ssa ja tiputtamalla lisättiin liuos, jossa oli D-2 ami-15 novoihappo-N-(di-syklopropyylikarbinyyli)amidia 15 ml:ssa tetrahydrofuraania. Sekoittamista jatkettiin 15 minuuttia -15 eC:ssa, minkä jälkeen reaktioseoksen annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan. Liuotin haihdutettiin pois vakuumis-sa, jolloin saatiin kiinteää jäännöstä. Tämä sekoitettiin 20 150 ml:n kanssa etyyliasetaattia ja saatu suspensio pes tiin 2 x 75 ml:11a 1-norm. suolahappoa. Kirkas orgaaninen kerros pestiin 2 x 75 ml:11a 5-%:ista natriumvetykar-bonaatin vesiliuosta, 75 ml:11a suolaliuosta, kuivattiin (MgS04) ja liuotin haihdutettiin pois vakuumissa, jolloin 25 saatiin 8,36 g (99,5 %) väritöntä kiinteää ainetta, Rf 0,36 TLC:tä käytettäessä (etyyliasetaatti/heksaani 1:1, vanil-liinisuihke). Kiteyttämällä uudelleen etyyliasetaatista, saatiin 6,12 g (73 %) kiteitä, sp. 167-168 °C.

D. Liuokseen, jossa oli di-suojattua dipeptidiami-30 dia, jota oli saatu osassa C, 250 ml:ssa metanolia, li- sät-tiin 1,5 g 5-%:ista Pd/C-katalyyttiä (kosteus 50 %) ja seosta hydrattiin 50 psi:n paineessa (3,52 kg/cm2) 45 minuuttia, jona aikana vetyä kului teoreettinen määrä. Katalyytti poistettiin suodattamalla, suodos haihdutettiin 35 vakuumissa noin 75 ml:n tilavuiseksi. Konsentraatti suoda-

II

25 82444 tettiin saostuneen tuotteen poistamiseksi, joka pestiin metanolilla ja kuivattiin vakuumissa, jolloin saatiin 2,85 g väritöntä jauhetta, sp. 225-227 °C (hajoten). Emäliuok-sesta saatiin vielä 0,75 g tuotetta. Kokonaissaanto: 100 5 %. Rf 0,56 (butanoli/etikkahappo/vesi, 4:1:1, ninhydrii- nisuihke).

Viite-esimerkki 4 2,2,5,5-tetrametyyllsyklopentyyliamilni ja sen käyttö L-aspartyyll-D-alaniini-N-(2,2,5,5-tetrametyyli-10 syklopent-l-yyli)amidin valmistukseen

RbNH2 ja I; CH3^3 « Rl> ’ -<] , Ra = CH, A. 2,2,5,5-tetrametyyllsyklopentyyliamiini

Seosta, jossa oli 21,0 g (0,15 mol) 2,2,5,5-tetra-20 metyylisyklopentanonia (kp. 63-68 °C/40 mm), 40,5 g (0,8 mol) formamidia ja 4 ml muurahaishappoa, lämmitettiin 160-190 °C:ssa 20 tuntia lisäämällä 10 ml:n lisäyksin muurahaishappoa aina silloin, kun jäähdyttäjään muodostui kiinteää ammoniumkarbonaattisakkaa. Tänä aikana reaktioseok-25 sesta poistettiin vettä käyttämällä tislauspäätä, jonka avulla voitiin säätää fraktioiden poistoa. Seos jäähdytettiin, uutettiin etyyliasetaatilla ja uutteet haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin tummaa jäännösöljyä. Tämä sekoitettiin 60 ml:aan 6-norm. suolahappoa ja seosta lämmitet-30 tiin kiehuttaen kolme tuntia. Saadun liuoksen pH säädettiin natriumhydroksidilla arvoon 13, uutettiin etyylieet-terillä, uutteet pestiin vedellä, suolaliuoksella, kuivattiin (magnesiumsulfatilla) ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 4,9 g raakaa amiinia, joka tislattiin, jol-35 loin saatiin 1 g haluttua tetrametyyliamiinia, kp. 66-69 ° (30 mm).

26 82444 «3b>2

B. C6H5CH2OCOCH2CHCONHCHCONH-^ I

NHCbz CHg )- 5 <CH3)2 Käyttämällä 856 mg (6,1 mmol) 2,2,5,5-tetrametyyli-syklopentyyliamiinia ja vastaaviin suhteellisin määrin muita viite-esimerkin 2 osassa B käytettyjä reagensseja, 10 tuon viite-esimerkin menetelmällä saatiin edellä esitetyn kaavan mukaista di-suojattua dipeptidiamidia. Rf 0,36 si-likageeli/TLC-analyysissä (etyyliasetaatti/heksaani 2:3). Se puhdistettiin kromatografoimalla silikageelillä, eluoi-malla etyyliasetaatti/heksaani-seoksella (2:3), jolloin 15 tuotetta sisältävien fraktioiden kuiviin haihduttamisen jälkeen saatiin 495 mg tuotetta.

C. Osassa B saatu puhdistettu di-suojattu dipep-tidiamidi, 495 mg, liuotettiin 75 ml:aan metanolia ja hyd-rattiin 300 mg:lla 5-%:ista palladium-hiili-katalyyttiä 20 viite-esimerkin 2 osassa C selostetulla tavalla. Liuottimen haihduttamisen jälkeen saatiin 185 mg haluttua dipeptidiamidia maalarinvalkeana kiinteänä aineena, sp. 136-140 °C.

Esimerkki 1 25 t-butyylisyklopropyylikarbinyyliamiini ja sen käyt tö L-aspartyyli-D-alaniini-N-(dl-t-butyylisyklopropyyli-karbinyyli)amidin valmistukseen

RbNH2 ja I; 30

Rb = CHC(CH0)q, Ra = CHq k A. t-butylisyklopropyylikarbinyyljämiini 35 Seokseen, jossa oli syklopropaanikarbonyylikloridia ja kuprokloridia, kumpaakin 0,5 moolia, 500 ml:ssa kuivaa il 27 82444 eetteriä lisättiin tiputtamalla typpiatomosfäärin suojaamana 238 ml (0,5 mol) 2,1-molaarista t-butyylimagnesium-kloridia samaan liuottimeen liuotettuna lämpötilan ollessa -10 °C. Reaktioseos kaadettiin seokseen, jossa oli 250 ml 5 3-mol. suolahappoa ja 700 g jäitä, orgaaninen kerros erotettiin, pestiin vedellä, natriumvetykarbonaattiliuoksel-la, suolaliuoksella ja kuivattiin vedettömällä magnesium-sulfaatilla. Eetteri haihdutettiin pois vakuumissa ja jäännös tislattiin ilmakehän paineessa, jolloin saatiin 45 10 g (72 %) t-butyylipropyyliketonia, kp. 145-153 °C.

45 g (0,36 mol) ketonia saatettiin reagoimaan hyd-roksyyliamiinihydrokloridin ja natriumasetaatin kanssa etanoli/vesi-seoksessa (1:1) noudattamalla viite-esimerkin 2 osan A menetelmää. Yön ajan kiehuttamisen jälkeen reak-15 tioseos jäähdytettiin ja saostunut oksiimi koottiin talteen ja pestiin kylmällä etanolilla, jolloin saatiin 23,5 g t-butyylisyklopropyyliketoksiimia. Emäliuoksista sitä saatiin lisää vielä 7,7 g. Yhdistetyt erät kiteytettiin uudelleen etanoli/vesi-seoksesta (1:1), jolloin saa-20 tiin 25,2 g (50 %) oksiimia, sp. 113,5-114 °C.

Liuokseen, jossa oli 5,0 g (0,035 mol) oksiimia 80 ml:ssa etanolia, lisättiin 8,04 g (0,35 mol) natriumia ja reaktio suoritettiin loppuun ja tuote eristettiin viite-esimerkin 2 osassa A selostetulla tavalla, jolloin saatiin 25 3,31 g raakaa dl-t-butyylisyklopropyylikarbinyyliamiinia.

Tämä tislattiin ilmakehän paineessa, jolloin saatiin 2,01 g (45 %) tuotetta, joka kiehui 153-155 °C:ssa.

C(CH3)3 30 B. C £ H c CH _ OCOCH,, CHCONHCHCONHCH ^

O 5 2 2 j I

NHCbz CH3

Toistettiin viite-esimerkin 2 osan B menetelmä käyttämällä 0,76 g (6,6 mmol) dl-t-butyylisyklopropyyli-35 karbinyyliamiinia disyklopropyylikarbinyliamiinin asemesta ja vastaavin määrin muita reagensseja. Haihduttamalla 28 82444 etyyliasetaattiuutteet vakuumissa kuiviin, saatiin 3,12 g (97 %) kiinteää di-suojattua dipeptidiamidia. Tämä puhdistettiin kromatografisesti kolonnissa (2,5 x 30 cm) eluoi-malla etyyliasetaatti/heksaaniseoksella 1:1. Haluttua tuo-5 tetta sisältävien fraktioiden (määritetty TLC:n perusteella) kuiviin haihduttamisen jälkeen saatiin 2,33 g (72 %) väritöntä kiinteää ainetta, sp. 118-120 °C.

C. Osan B puhdistettua tuotetta, 2,33 g, hydrattiin palladium-hiili-katalyytillä viite-esimerkin 2 osassa C 10 selostetulla tavalla, jolloin saatiin 1,28 g (95 %) haluttua dipeptidimaidia, sp. 180-182 °C (hajoten); silikagee- li-TLC (butanoli/vesi/etikkahappo 4:1:1): yksi täplä, Rf 0,43.

Esimerkki 2 15 3-amino-2,2,4,4-tetrametyylitetrahydrofuraani A. 2,2,4,4-tetrametyylitetrahydrofuran-3-oni 4-bromi-l-hydroksi-2,2,4-trimetyylipentan-3-onia (valmistettu esimerkin 4 osissa A ja B selostetulla tavalla), 25 g (0,1 mol), liuotettiin 160 ml:aan etanolia ja 20 lisättiin liuos, jossa oli 8 g (0,2 mol) natriumhydroksi-dia 80 ml:ssa vettä. Saatua seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 30 minuuttia, laimennettiin vedellä, uutettiin etyylieetterillä, uutteet pestiin vedellä, suolaliuoksella ja kuivattiin vedettömällä magnesiumsulfaatil-25 la. Liuotin haihdutettiin pois, jolloin saatiin 17,7 g 2,2,4-trimetyylipentaani-l,4-diolia värittömänä nesteenä, joka identifioitiin xH-NRM:n avulla. Dioli liuotettiin 50 ml:aan kloroformia, lisättiin tiputtamalla 1,5 ml väkevää rikkihappoa. Seosta lämmitettiin kiehuttaen kolme tuntia, 30 tislaamalla samalla seoksesta aseotrooppina vesi/klorofor-miseosta. Reaktioseoksen oltua paikoillaan yön ajan huoneen lämpötilassa, se pestiin vedellä, orgaaninen kerros kuivattiin (MgS04) ja liuotin haihdutettiin pois vakuumissa, jolloin saatiin 13,9 g väritöntä nestettä. Tislaamalla 35 saatiin 8,3 g haluttua tuotetta, kp. 70-72 ° (50 mm), kokonaissaanto 58 %.

29 82444 B. Osassa A saatu ketoni, 8,0 g (0,056 mol), hydr-oksyyliamiinihydrokloridi, 8,0 g (0,113 mol) ja natrium-asetaatti (2,3 g, 0,113 mol) yhdistettiin 85 ml:ssa etanolia ja seosta lämmitettiin kiehuttaen 48 tuntia. Saatu 5 seos laimennettiin vedellä, uutettiin etyylieetterillä, uutteet pestiin vedellä, kuivattiin ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 9,0 g syn- ja anti-oksiimien seosta, joka identidioitiin ^-NMR-spektrinsä perusteella.

Edellä saatu oksiimi, 1,3 g (8,28 mmol) liuotettiin 10 70 mitään kuivaa etanolia, lisättiin 1,9 g natriummetallia ja seos lämmitettiin kiehuvaksi ja pidettiin tässä lämpötilassa 15 minuuttia. Lämmittämistä jatkettiin kaksi tuntia lisäämällä vielä kaksi erää (kumpikin 1,9 g) natriumia. Reaktioseos laimennettiin sitten varovaisesti vedel-15 lä, uutettiin etyylieetterillä. Eetterikerros uutettiin laimealla suolahapolla, vesifaasi tehtiin alkaliseksi nat-riumhydroksidilla ja uutettiin uudelleen eetterillä. Uutteet kuivattiin (MgS04) ja haihdutettiin kuiviin ja jäännös tislattiin, jolloin saatiin haluttua amiinia, kp. 68-69 eC 20 (15 mm). Kun puhdistusta oli jatkettu edelleen saostamalla hydrokloridisuola etyylieetteri-metanoli-seoksesta, tekemällä suola emäksiseksi ja uuttamalla uudelleen eetterillä, saatiin 0,87 g amiinia, jonka puhtaus oli kaasukromatografisen määrityksen perusteella (OV-l-kolonni) 93 %.

25 Esimerkki 3 Käyttämällä viite-esimerkin 1 menetelmässä sopivaa kaavan RNH2 mukaista amiinia samalla tavalla, saatiin seu-raavia L-aspartyyli-D-alaniinin amideja.

30 82 444 NH~

X

CH2-CH

COOH CONHCHCONHR

ch3

Di-suojattu Dipeptidiamidi (I) dipeptidiamidi R* R^ 5aanto-% Sp. °C Saanto-% trans '-1 0,7 5a 96 89-93° haj 82 3 >—-i CH3 0,2° 94 95-99° 100 dl <^3(ch3)3 o,4° 95 186-188° haj. 73 dl CH3 CH3 -<^> - - 144-148° haj.

CH^H3 3i 82444 *Amiinin konfiguraatio, RNH2 ilmoitettu sen ollessa tunnettu: c = cis; t = trans, 1 = vasemmalle kiertyvä, dl = ra-seeminen.

*7:3 etyyliasetaatti/heksaani.

5 cl:l etyyliasetaatti/heksaani,

Liuotinseosten suhteet ovat tilavuussuhteita.

Esimerkki 4 3-amino-2,2,4,4-tetrametyylitetrahydrotiofeeni A. l-hydroksi-2,2,4-trimetyylipentan-3-oni 10 Natriummetylaattiin, joka oli valmistettu 7,5 g:sta natrium-metallia ja 250 ml:sta metanolia, lisättiin 72,5 g (2,4 mol) paraformaldehydiä ja sen jälkeen 250 g (2,2 mol) di-isopropyyliketonia ja saatua seosta lämmitettiin kiehuttaen kolme tuntia. Reaktio sammutettiin vedellä, neut-15 raloitiin suolahapolla, uutettiin etyylieetterillä, pes tiin vedellä, suolaliuoksella ja liuotin haihdutettiin pois. Jäljelle jäänyt öljy (90 g) tislattiin vakuumissa, jolloin saatiin 28 g haluttua tuotetta, joka kiehui 92-98 °C:ssa 16-20 mm:n vakuumissa. GLC-määritys OV-l-kolonnissa 20 107 °C:ssa, retentioaika 314 sekuntia, puhtaus 96 %.

Kun edellä esitetty menettely uusittiin samassa mittakaavassa, mutta reaktioseosta kiehutettiin 16 tuntia, saatiin 31 g tuotetta, jonka puhtaus oli GLC:n perusteella 96 %.

25 B. 4-bromi-l-hydroksi-2,2,4-trimetyylipentan-3-oni

Sekoitettuun, kiehuvaan liuokseen, jossa oli 69 g (0,48 mol) l-hydroksi-2,2,4-trimetyylipentan-3-onia 500 ml:ssa kloroformia, lisättiin tiputtamalla liuos, jossa oli 77 g (0,48 mol) bromia 100 ml:ssa kloroformia. Lisäyk-30 sen päätyttyä seosta sekoitettiin kiehuttaen tunnin ajan, annettiin jäähtyä ja olla paikoillaan huoneen lämpötilassa yön ajan. Haihduttamalla liuotin pois vakuumissa, saatiin 127 g tuotetta, jota käytettiin seuraavassa vaiheessa puhdistamatta.

32 82 444 C. 2,2,4,4-tetrametyylitetrahydrotlofen-3-oni

Osassa B saatu tuote, 79 g (0,3 mol) liuotettiin 300 ml:aan kuivaa pyridiiniä, jäähdytettiin 0 °C:seen ja O eC:ssa lisättiin annoksittain 114 g (0,6 mol) p-toluee-5 nisulfonyylikloridia. Saatua seosta sekoitettiin tässä lämpötilassa kolme tuntia 15 minuuttia, kaadettiin jää/ve-siseokseen ja uutettiin etyylieetterillä. Uutteet pestiin laimealla suolahapolla, vedellä ja suolaliuoksella, minkä jälkeen kuivattiin vedettömällä magnesiumsulfaatilla.

10 Liuotin haihdutettiin pois, jolloin saatiin 111 g (98 %) kiteistä tosylaattia.

Tosylaatti, 94 g (0,25 mol), liuotettiin litraan pyridiiniä, lisättiin 180 g (0,75 mol) natriumsulfidi-monohydraattia ja seos lämmitettiin 75 °C:seen ja sitä 15 pidettiin tässä lämpötilassa tunnin ajan ja annettiin olla huoneen lämpötilassa yön ajan. Lisättiin vettä ja seos uutettiin eetterillä. Uutteet pestiin suolahapolla, suolaliuoksella, kuivattiin (MgS04) ja liuotin haihdutettiin pois, jolloin saatiin 35 g otsikon yhdistettä, 89 %:n 20 saannoin. Tuote antoi silikageeli-TLC-analyysissä ainoastaan yhden täplän eluoitaessa etyyliasetaatti/heksaani-seoksella (til.suhde l:d, Rf 0,5). ^-NMR-spektri oli sopusoinnussa otsikon yhdisteen rakenteen kanssa.

D. Ketonin Leuckart-pelkistys 25 100 ml:n pyöreäpohjäiseen kolmikaulaiseen pulloon, johon oli kiinnitetty sekoittaja, lämpömittari ja jääh-dyttäjä fraktiointipäineen, lisättiin 10,0 g (0,063 mol) 2,2,4,4-tetrametyylitetrahydrotiofen-3-onia, 15,2 ml (0,38 mol) formamidia ja 3,5 ml (0,092 mol) muurahaishap-30 poa ja seosta lämmitettiin kiehuttaen (163 °C) poistamalla vettä. Reaktioseosta pidettiin 160-180 eC:ssa 20 tuntia lisäämällä silloin tällöin muurahaishappoa (10 ml). Tänä aikana seoksen lämpötila kohosi 200 °C:seen. Reaktioseos jäähdytettiin, lisättiin vettä ja seos uutettiin etyyli-35 asetaatilla. Uutteet haihdutettiin kuiviin vakuumissa.

Il 33 8 2 444 Jäännöstä kiehutettiin 20 ml:n kanssa 6-norm, suolahappoa kaksi tuntia, jäähdytettiin, saatu seos pestiin etyylieet-terillä, vesifaasin pH säädettiin natriumhydroksidiliuok-sella arvoon 11 ja uutettiin etyylieetterillä. Uutteet 5 kuivattiin ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 2 g 3-amino-2,2,4,4-tetrametyylitetrahydrotiofeenia, joka identifioitiin 1H-NMR:n avulla ja se näytti homogeeniselta silikageeli-TLC-analyysin perusteella kahdessa systeemissä: Rf 0,63, etyyliasetaatti/heksaani 7:4 ja Rf 10 0,53, butanoli/etikkahappo/vesi 4:1:1; ninhydriini posi tiivinen. Tuote oli keltainen öljy.

Esimerkki 5 L-aspartyyli-D-alaniini-N-( 2,2,4,4-tet räme tyyli tet-rahydrotiofen-3-yyli)amidi: 15 CH3\^H3 I' Rh = ' r3 = CH3 CHi\H3 20 3 CH3\/ch3 A> t-Boc-NHCH-CONB—/(

25 CH-. VS

J ch3 \Ch3

Liuokseen, jossa oli 2,09 g (11 mol) N-t-butok-30 sikarbonyyli-D-alaniinia 75 ml:ssa tetrahydrofuraania, lisättiin 1,47 ml (10 mmol) tirietyyliaminia ja seos jäähdytettiin -10 °C:seen. Tässä lämpötilassa lisättiin 0,96 ml (10 mmol) etyyliklooriformiaattia ja sekoittamista jatkettiin 15 minuuttia. -20 °C:seen jäähdyttämisen jälkeen 35 lisättiin 1,6 g (10 mmol) dl-3-amino-2,2,4,4-tetrametyyli- 34 8 2 444 tetrahydrotiofeenia ja saadun seoksen annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan. Lisättiin etyyliasetaattia ja seos pestiin kahdesti 50 ml:n erillä 5-%:ista (paino-%) sitruunahapon vesiliuosta, natriumvetykarbonaatin vesiliuoksella 5 (1 x 50 ml) ja kyllästetyllä suolaliuoksella (1 x 50 ml).

Orgaaninen kerros kuivattiin (Na2S04) ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa, jolloin saatiin 3 g N-(2,2,4,4-tetrame-tyylitetrahydrotiofen-3-yyli )-t-butoksikarbonyyli-D-ala-niiniamidia öljynä. Tuotteen struktuuri varmennettiin sen 10 1H-NMR-spektrin avulla. Se oli oleellisen homogeenista si- likageeli-TLC-analyysin perusteella. Tätä tuotetta käytettiin enempää puhdistamatta seuraavassa vaiheessa.

CH, CH-3\/ 3 15 B. ch3ch(nh2)conh—

Osan A tuotteeseen lisättiin 5 ml metanolia ja 40 20 ml 1-mol. suolahappoa ja seosta lämmitettiin vesihauteella 30 minuuttia. Metanoli poistettiin haihduttamalla ja jäännös uutettiin eetterillä. Eetteri hävitettiin ja vesifaasin pH säädettiin antriumhydroksidiliuoksella arvoon 11,0, uutettiin etyyliasetaatilla, uutteet kuivattiin (Na2S04) ja 25 haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 1,0 g N-(2,2,4,4,-tetrametyyli-tetrahydrotiofen-3-yyli)-D-alaniiniamidia, joka identifioitiin ydinmagneettisen resonanssispektrinsä perusteella. Se oli silikageeli-TLC:n perusteella homogeenista.

30 C. Kytkentä dipeptidiamidln muodostamiseksi

Osassa B saatu D-alaniiniamidi, 0,97 g (4,25 mmol), sekoitettiin 10 ml:n kanssa vettä, jäähdytettiin jäissä ja seoksen pH säädettiin 0,5-norm. natriumhydroksidiliuoksel-la arvoon 9,2. Tähän lisättiin annoksittain ja sekoittaen 35 0,8 g (4,25 mmol) L-aspartiinihappo-N-tiokarboksianhydri- 35 8 2 444 diä pitämällä seoksen pH-arvossa 9 natriumhydroksidiliuok-sen avulla (0,5-norm.). Lisäyksen päätyttyä saatua seosta sekoitettiin 0 °C:ssa 45 minuuttia, pH säädettiin suolahapolla arvoon 5,2 ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa. J-5 äännöstä lietettiin metanolin kanssa, suodatettiin saostuneiden kiinteiden ainesten poistamiseksi ja metanoli poistettiin suodoksesta haihduttamalla vakuumissa. Jäännökseen lisättiin etyylieetteriä, jolloin muodostui kiinteää ainetta. Tämä koottiin talteen suodattamalla, lietettiin 10 uudelleen etyylieetteriin, suodatettiin jälleen ja kiinteä aine kiteytettiin uudelleen 8 ml:sta vettä. Vakuumiuunissa kuivaamisen jälkeen saatiin noin 1 g tuotetta, sp. 124-126 eC. Toinen erä saatiin käsittelemällä uudelleen emä-liuoksia.

15 Esimerkki 6 3-amino-2,2,4,4-tetrametyylitioetaani A. 2,4-dibromi-2,4-dlmetyylipentan-3-oni 136 g:aan (1,2 mol) di-isopropyyliketonia lisättiin 2 ml fosforitribromidia ja seos jäähdytettiin 10 °C:seen. 20 Tähän lisättiin tiputtamalla 384 g (2,4 mol) bromia, seoksen annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan. Seoksen oltua kaksi tuntia tässä lämpötilassa, sitä lämmitettiin tunnin ajan 55-60 °C:ssa, minkä jälkeen seos jäähdytettiin ja jaettiin kloroformiin ja veteen liukeneviin osiin. Vesi 25 hävitettiin ja orgaaninen kerros pestiin natriumkarbonaat-tiliuoksella neutraaliksi. Orgaaninen kerros kuivattiin (MgS04) ja liuotin haihdutettiin pois, jolloin saatiin 316 g (97 %) haluttua tuotetta.

B. 2,2,4,4-tetrametyyll-3-oksotioetaani 30 Natriummetallia, 23 g (1,0 mol) liuotettiin 500 ml:aan kuivaa metanolia ja saatu seos jäähdytettiin 10 °C:seen. Seoksen läpi johdettiin rikkivetyä, kunnes seos oli kyllästetty. Sitten lisättiin tiputtamalla, 136 g (0,5 mol) osassa A saatua dibromiketonia jatkamalla rik-35 kivedyn johtamista reaktioseoksen läpi. Lisäyksen päätyt- 36 8 2 444 tyä seosta sekoitettiin kaksi tuntia 10 eC:ssa, annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan ja sekoitettiin yön ajan. Kun reaktioseos oli kaadettu veteen, se uutettiin etyylieet-terillä ja uutteet pestiin laimealla suolahapolla ja suo-5 laliuoksella. Magnesiumsulfaatilla kuivaamisen jälkeen eetteri haihdutettiin pois, jäännös lietettiin metanoliin, jäähdytettiin ja suodatettiin, jolloin saatiin 46 g (64 %) kiinteää tuotetta, jota käytettiin puhdistamatta seuraa-vassa vaiheessa.

10 C. Ketonin pelklstysaminointi 75 mlraan kuivaa metanolia lisättiin 4,5 g (0,031 mol) 2,2,4,4-tetrametyyli-3-oksotioetaania, 23,9 g (0,31 mol) ammoniumasetaattia ja 1,36 g (0,0217 mol) natrium-syaaniboorihydridiä ja saatua seosta lämmitettiin kiehut-15 taen neljä tuntia. Lisättiin vielä natriumsyaaniboorihyd-ridiä (1,36 g) ja kiehuttamista jatkettiin kolme päivää lisäämällä kolmannen päivän alussa kolmas erä samaa rea-genssia. Saatu seos tehtiin happameksi pH-arvoon 2 suolahapolla ja haihdutettiin kuiviin pyörivässä haihduttimessa 20 vakuumissa. Jäännös liuotettiin veteen, pestiin etyylieet-terillä, vesifaasin pH säädettiin arvoon 11 natriumhydrok-sidiliuoksella ja uutettiin etyylieetterillä. Uutteet pestiin suolaliuoksella, kuivattiin (MgS04) ja haihdutettiin * . kuiviin, jolloin saatiin 1,9 g (42 %) haluttua amiinia 25 kiteisenä kiinteänä aineena. Tuotteen struktuuri varmennettiin 1H-NMR-spektrinsä avulla, sp. noin 45 °C, kp. 90 °C (20 mm).

D. 3-amlno-2,2,4,4-tetrametyylitioetaani-l,1-diok- sldl 30 Edellä osassa C saatu amiini, 29 g (0,2 mol) liuo tettiin 50 ml:aan asetonitriiliä ja lisättiin 250 ml vettä. Pitämällä seoksen pH natriumhydroksidilla arvossa 10-30 minuutin kuluessa lisättiin 35,8 g (0,21 mol) karbo-bentsoksikloridia, seosta sekoitettiin tunnin ajan, suoda-35 tettiin, sakka pestiin vedellä ja kuivattiin vakuumissa

II

37 82444 50 °C:ssa, jolloin saatiin NCbz-amiinia, Rf 0,7 (heksaa-ni/etyyliasetaatti, til. suhde 4:1, fosfomolybdeenihappo-suihke), 52,1 g (93,4 %). Tämä liuotettiin 700 ml:aan me-tyleenikloridia, lisättiin hitaasti, pitämällä lämpötila 5 45 °C:n alapuolella (20-42 °C), 77 g (0,372 mol) m-kloori- perbentsoehappoa. Saostunut kiinteä aine koottiin talteen suodattamalla, suodos pestiin 1-norm. suolahapolla, nat-riumvetykarbonaatin vesiliuoksella, kuivattiin (MgS04) ja liuotin haihdutettiin pois. Jäännös kiteytettiin asetoni-10 vesi-seoksesta, jolloin saatiin 42 g (73 %) Cbz-suojattua amiini-1,1-dioksidia, Rf 0,7 (heksaani/etyyliasetaatti til.suhde 1:1, fosfomolybdeenihappo-suihke).

Suojausryhmä poistettiin hydraamalla 5 g Cbz-amii-nia 250 ml:ssa metanolia, käyttämällä 5 ml väkevää suola-15 happoa ja 2 g 5-%:ista Pd/C-katalyyttiä (kosteus 50 %).

Tuote eristettiin tavalliseen tapaan. Saanto: 2,4 g (85 %), Rf 0,6. Retentioaika kaasu-nestekromatografioitaessa 1 metrin 0V-l-kolonnissa 180 °C:ssa oli 1,3 minuuttia. Kolmen vaiheen osalta kokonaissaanto oli 3-amino-2,2,4,4- 20 tetrametyylitioetaani-lähtöaineesta laskien 65 %.

Esimerkki 7 L-aspartyyli-D-alaniini-N-( 2,2,4,4-tetrametyylitio-etan-3-yyli)amidi: 25

CH3 CH

h 3\^CH3 I, R = -\^S ’ r3 = CH3 CHf<CH3 30 CH3 ch3 A. t-Boc-NHCH(CH3)CONH-<^^ 35 ch3X:h3 38 82444

Liuokseen, jossa oli 2,09 g (11 mmol) N-t-butoksi-karbinyyli-D-alaninia 75 ml:ssa tetrahydrofuraania, lisättiin 1,47 ml (10 mmol) trietyyliamiinia ja seos jäähdytettiin -10 °C:seen. Lisättiin 0,96 ml (10 mmol) etyyli-5 klooriformiaattia, seosta sekoitettiin 10 minuuttia, sitten jäähdytettiin -20 °C:seen ja lisättiin 1,70 g (11 mmol) 3-amino-2,2,4,4-tetrametyylitioetaania liuotettuna 5 ml:aan tetrahydrofuraania. Reaktioseoksen annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan, lisättiin etyyliasetaattia ja 10 seos pestiin 5 paino-%:isella sitruunahappoliuoksella (2 x 50 ml), natriumvetykarbonaattiliuoksella neutraaliksi, sitten suolaliuoksella. Orgaaninen kerros kuivattiin (Na2S04) ja liuotin poistettiin haihduttamalla, jolloin saatiin 2,7 g (78 %) haluttua kiinteää tuotetta. Tuotteen 15 XH-NMR-spektri oli odotetun mukainen. Silikageeli-TLC:n perusteella, eluoitaessa etyyliasetaatti/heksaani-seoksel-la 1:1, tuote näytti homogeeniselta, R, 0,77.

20 CH3 ^CH3 B. D-CH3CH(NH2)CONH_s CH3 CH3 25 Tämän esimerkin osassa A saatu t-Boc-D-alaniini- amidi hydrolysoitiin liuottamalla se 15 ml:aan etanolia ja lisäämällä seos, jossa oli 5 ml väkevää suolahappoa ja 10 ml vettä. Saatua seosta lämmitettiin kiehuttaen 30 minuuttia, jäähdytettiin ja etanoli poistettiin haihduttamalla 30 vakuumissa. Vesipitoinen jäännös pestiin etyylieetterillä, tehtiin alkaliseksi natriumhydroksidiliuoksella, uutettiin eetterillä ja uutteet kuivattiin (Na2S04). Haihduttamalla liuotin pois saatiin vapaata a-aminoamidia 43 %:n saannoin. Tuote oli homogeenista silikageeli-TLC:n perusteella 35 ja antoi XH-NMR-spektrin, joka oli sopusoinnussa sen rakenteen kanssa.

39 82444 C. Kytkentä dipeptidiamidin muodostamiseksi

Liuos, jossa oli 0,7 g (3,2 mmol) edellä osassa B valmistettua α-aminoamidia, sekoitettiin 10 ml:n kanssa vettä, pH säädettiin arvoon 10,1, jäähdytettiin jäähau-5 teessä ja lisättiin annoksittain 0,567 g (3,2 mmol) L-as-partiinihappo-N-tiokaboksianhydridiä, pitämällä seoksen pH arvossa 9 lisäämällä 0,5-norm. natriumhydroksidiliuosta. Seosta sekoitettiin sitten 0 °C:ssa 45 minuuttia, pH säädettiin arvoon 5,2 ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa.

10 Jäännös lietettiin metanoliin, kiinteät aineet poistettiin suodattamalla ja suodos haihdutettiin kuiviin. Jäännökseen lisättiin 150 ml etyylieetteriä, saostunut tuote koottiin talteen suodattamalla ja kuivattiin vakuumiuunis-sa yön ajan, jolloin saatiin 1,5 g raakaa ainetta. Vielä 15 kahdesti etyylieetteriin uudelleen liettämisen jälkeen saatiin 0,9 g tuotetta (85 %). sp. 135 eC (haj.).

Esimerkki 8 L-aspartyyli-D-alaniinl-N-(2,2,4,4-tetrametyyli- 1,l-dioksotioetan-3-yyll)amidi 20 CH3 x.CH3 I , R3 = CHj, Rb = »<^S02 CH'''"cH, 25 3 3 CH, 3 X^3 A. t-Boc-NHCH (CH3 ) CONH <^S02

Liuos, jossa oli 31,6 g (0,10 ml) N-t-butoksikarbo-nyyli-D-alaniini-N-( 2,2,4,4-tetrametyylitloetan-3-yyli )- 35 amidia, jota oli saatu esimerkin 7 osassa A, 500 mlrssa 40 82444 kloroformia, jäähdytettiin 10-20 °C:seen ja lisättiin hitaasti, pitämällä reaktioseoksen lämpötila 45 °C:n alapuolella, 41,3 g (0,24 mol) m-klooriperbentsoehappoa. Saatua seosta sekoitettiin tunnin ajan, laimennettiin klorofor-5 millä ja pestiin peräkkäin 5-%:isella natriumvetykarbo-naatin vesiliuoksella, 0,1-norm. suolahapolla, 5-%:isella natriumtiosulfaatilla ja kyllästetyllä suolaliuoksella. Pesty orgaaninen kerros kuivattiin (MgS04) ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 33,7 g jäljelle jäänyttä öljyä 10 (97 %), joka oli sopivan puhdasta käytettäväksi seuraavas- sa vaiheessa:

CH- CH

3 V 3 B. D-CH3CH(NH2)CONH -<T^so2 15 CH3><CH3

Edellä osassa A saatua t-Boc-amidia, 34,8 g (0,10 mol), liuotettuna seokseen, jossa oli 50 ml väkevää suola-20 happoa ja 100 ml vettä ja 100 ml etanolia, lämmitettiin kiehuttaen tunnin ajan. Seos jäähdytettiin, pestiin etyy-lieetterillä, vesifaasin pH säädettiin arvoon 12 50-%:isella natriumhydroksidian vesiliuoksella ja uutettiin etyyliasetaatilla. Uutteet kuivattiin (MgS04) ja haih-25 dutettiin kuiviin vakuumissa, jolloin saatiin 18,7 g (75 %) kiteistä kiinteää ainetta. Tämä kiteytettiin uudelleen hiilitetrakloridista, jolloin tuotetta saatiin talteen 80 %.

C. Di-suojattu dipeptidlamidi 30 Liuokseen, jossa oli 14,28 g (0,04 mol) 8-bentsyy- li-N-bentsyylioksikarbonyyli-L-aspartaattia 700 ml:ssa tetrahydrofuraania, lisättiin 4,4 ml (0,04 mol) N-metyyli-morfoliinia ja seos jäähdytettiin -10 °C:seen. Lisättiin etyylikloorimorfiaattia, 3,9 ml (0,04 mol), seosta sekoi-35 tettiin -10 eC:ssa 15 minuuttia ja jäähdytettiin

II

4i 82444 -20 °C:seen. Lisättiin liuos, jossa oli 9,92 g (0,04 mol) edellä osassa B saatua D-alaniini-N-(2,2,4,4,-tetrametyy- li-1,l-dioksotiotetan-3-yyli)amidia 50 ml:ssa tetrahydro-furaania ja saatua seosta sekoitettiin ympäristön lämpöti-5 lassa tunnin ajan. Reaktioseos kaadettiin 700 ml:aan etyyliasetaattia, pestiin peräkkäin 1-norm. suolahapolla, nat-riumvetykarbonaattiliuoksella, 0,1-norm. natriumhydrok-sidilla ja suolaliuoksella. Pestyt uutteet kuivattiin (MgS04) ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa. Jäännös lie-10 tettiin etyylieetteriin ja kiinteä aine koottiin talteen suodattamalla, jolloin saatiin 19,8 g (84 %) di-suojattua dipeptidiamidia, joka kiteytettiin uudelleen etyleenigly-kolidimetyylieetteri/isopropyylieetteriseoksesta, jolloin saanto oli 77 %.

15 D. Liuokseen, jossa oli 10 g edellä osassa C saatua tuotetta 250 mlrssa metanolia, lisättiin 3 g 5-%:ista Pd/C-katalyyttiä (kosteus 50 %) ja 1 ml väkevää suolahappoa ja seosta hydrattiin tunnin ajan 50 psi:n paineessa (3,52 kg/cm2). Katalyytti poistettiin suodattamalla, suo-20 doksen pH säädettiin natriumhydroksidiliuoksella arvoon 5,2 ja haihdutettiin vakuumissa lähes kuiviin. Jäännös sekoitettiin etyylieetterin kanssa ja kiinteä aine koottiin talteen suodattamalla ja kuivattiin vakuumiuunissa 45 °C:ssa, jolloin saatiin 5,5 g, 89 %, haluttua dipep- 25 tidiamidia, sp. 135 °C (haj.).

Esimerkki 9 N-bentsyylioksikarbonyyli-D-2-aminovoihappo 500 ml: n reaktioastiaan, johon oli kiinnitetty mekaaninen sekoittaja, lämpömittari ja kaksi lisäsuppiloa, 30 lisättiin 20,0 g (0,194 mol) kaupan olevaa D-(-)-2-amino-voihappoa ja liuos, jossa oli 7,76 g (0,194 mol) natrium-hydroksidia 97 ml:ssa vettä. Seosta sekoitettiin, kunnes liukeneminen oli tapahtunut täydellisesti ja jäähdytettiin 5 °C:seen. Lisäyssuppiloista lisättiin samanaikaisesti 35 40,66 g (0,205 mol) 86-%:ista bentsyyliklooriformiaattia 42 82444 ja liuosta, jossa oli 7,76 g natriumhydroksidia 58 ml:ssa vettä. Lämpötila pidettiin lisäyksen ajan 4-6 °C:ssa. Reaktiolämpötila kohotettiin sitten hitaasti 14 °C:seen. Sekoittamista jatkettiin 15 minuuttia lämpötilan asetuttua 5 paikoilleen, minkä jälkeen sen annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan. Reaktioseos pestiin 3 x 75 ml:11a etyylieet-teriä, vesifaasin pH säädettiin arvoon 2 väkevällä suolahapolla (16 ml), mikä aiheutti tuotteen erottumisen öljynä. öljy uutettiin 3 x 100 ml:11a eetteriä, kuivattiin 10 (MgS04) ja liuotin haihdutettiin pois, jolloin saatiin kir kasta, väritöntä nestemäistä jäännöstä, joka kuivattiin yön aikana 0,3 mmHg:n vakuumissa, jona aikana tuote kiteytyi ja saatiin 41,24 g (89,6 %) otsikon yhdistettä. 1,0 g:n erä kiteytettiin uudelleen 5 ml:sta ksyleeniä ja sak-15 ka pestiin ksyleenillä ja pentaanilla. Yön kuivaamisen jälkeen saatiin 0,77 g värittömiä kiteitä; R( 0,57 TLC-silikageeli-analyysissä (liuotin: etyyliasetaatti/heksaa-ni/etikkahappo, til. suhde 4:14:2; levyihin suihkutettiin 3-%:ista vanilliinia), sp. 76-78 °C, [a]D +10 (c = 2,8, 20 etanoli).

Analyysi yhdisteelle Cl2HisN®4: laskettu: C 60,75 H 6,37 N 5,90 saatu: C 60,61 H 6,41 N 5,97.

Jäljellä olevat raakakiteet (40 g) kiteytettiin uu- 25 delleen ksyleenistä (150 ml), pestiin ksyleenillä (3 x 25 ml) ja pentaanilla (2 x 25 ml) Ja kuivattiin vakuumissa 45 or. 4 n 4 . oq cq /71,7 %) värittömiä kiteitä, °C:ssa, jolloin saatiin 28,59 sp. 78-79 °C.

Esimerkki 10 „ ^.nihappo-N-(2,2,4,4-tetrame- 30 L-aspartyyli-D-2-aming!g£-—“- tyyli-1, l-dioksitioetan-3-yyli-^^1^1*

Ra = C2H5 , B Ä 35 A* d-CH3CH2CHCONH—<^5S02 ‘ NHCbz

II

43 8 2 4 4 4 Käyttämällä viite-esimerkin 3 osan A menetelmässä disyklopropyylikarbinyyliamiinin asemesta 3-amino-2,2,4,4-tetrametyylitioetaani-1,1-dioksidia, saatiin N-bentsyyli-oksikarbonyyli-D-2-aminovoihappo-N-(2,2,4,4-teträmetyyli-5 1,l-dioksietan-3-yyli)amidia 99 %:n saannoin, Rf 0,50.

B. Hydrogenolysoimalla edellä saatu tuote viite-esimerkin 3 osan B mukaisella menetelmällä, saatiin D-2-aminovoihappo-N-( 2,2,4,4-tetrametyyli-l, 1-dioksitioetan- 3-yyli)amidia 18 %:n vaihesaannoin, Rf 0,41.

10 C. Viite-esimerkin 3 osan C mukaisella menetelmällä saatiin 99 %:n vaihesaannoin vastaavaa di-suojattua dipep-tidiamidia, c6h5c„2ococ„2c„cok„ch(c„2„5,coNh-^<so2. Rf 0,68 15 NHC00CHoC-.Hc

Zoo D. Hydrogenolysoimalla edellä osassa C saatua tuotetta (1,16 g), viite-esimerkin 3 osan D menetelmällä, käyttämällä 0,4 g 5-%:ista PD/C-katalyyttiä (kosteus 50 20 %), saatiin otsikon yhdistettä 92 %:n vaihesaannoin; sp.

165-167 °C (hajoten), Rf 0,4.

Esimerkki 11

Alkyylisykloalkyyllkarbinyyliamllneja i. Seokseen, jossa on 1,0 mol syklopentyylikar-25 bonyylikloridia ja 99 g (1,0 mol) kuprokloridia 1 000 ml:ssa kuivaa eetteriä, lisätään typpi-atmosfäärin suojaamana tiputtamalla 478 ml (1,0 mol) 2-mol. t-butyyli-magnesiumkloridia, jossa on samaa liuotinta. Lisääminen suoritetaan -5 ... -15 °C;ssa. Saatu seos kaadetaan 500 30 ml:aan 3-mol. suolahappoa ja 700 g:aan jäitä, orgaaninen kerros erotetaan ja pestään peräkkäin vedellä, natrium-vetykarbonaattiliuoksella, suolaliuoksella ja kuivataan (MgS04). Kuivattu eetteriuute haihdutetaan kuiviin vakuu-missa ja jäännös tislataan, jolloin saadaan t-butyylisy-35 lopentyyliketonia.

44 8 2 444 ii. Ketoni (0,75 mol) sekoitetaan hydroksyyliamii-ni-hydrokloridin, 38,3 g (1,16 mol) ja natriumasetaatin, 123 g (1,50 mol), kanssa niin riittävässä määrässä vettä, että liukeneminen tapahtuu, lämmitetään vesihauteella tun-5 nin ajan, jäähdytetään ja seoksen pH säädetään natrium-hydroksidiliuoksella arvoon 7,5. Kun seos on uutettu eetterillä, uutteet kuivataan (MgS04) ja haihdutetaan kuiviin, jolloin saadaan oksiimia. Oksiimi liuotetaan vedettömään etanoliin (noin 2 1 moolia kohden oksiimia) ja liuosta 10 lämmitetään kiehuttaen. Lisätään annoksittain natriumme-tallia (noin 10 moolia yhtä oksiimi-moolia kohden) sellaisella nopeudella, että se riittää pitämään seoksen kiehuvana. Kun kaikki natrium on lisätty, saatu seos jäähdytetään ja lisätään 200 ml etanolia ja sen jälkeen 300 ml 15 vettä. Seos tehdään happameksi suolahapolla, haihdutetaan

etanolin poistamiseksi ja jäännös tehdään alkaliseksi (pH

12-13) 10-mol. natriumhydroksidilla. Alkalinen seos uutetaan useaan kertaan eetterillä ja yhdistetyt uutteet kuivataan (MgS04). Kuivattujen uutteiden läpi johdetaan kui-20 vaa kloorivetyä, kunnes saostuminen on päättynyt. Saostunut hydrokloridisuola kootaan talteen suodattamalla, pestään eetterillä ja kuivataan ilmassa. Suola muutetaan vapaaksi emäkseksi natriumhydroksidin vesiliuoksella, uutetaan etyylieetterillä ja uutteet haihdutetaan kuiviin. 25 Tuote, t-butyylisyklopentyylikarbinyyliamiini, puhdistet tiin tislaamalla, kp. 80-90 °C (21 mm).

Claims (2)

45 82444

1. Amiini, joka on käyttökelpoinen välituotteena valmistettaessa L-aspartyyli-D-aminohappodipeptidiamide- 5 ja, tunnettu siitä, että amiinilla on kaava RbNH2 jossa Rb on 10 a) syklopropyyli-t-butyylikarbinyyli tai syklopen- tyyli-t-butyylikarbinyyli; Ry. 15 - jossa m1 on 1 tai 2, ja 20 kun mx on 1, R3, R4, R5 ja Rs merkitsevät kukin metyyliä, kun mj on 2, R3 on etyyli ja R4, R5 ja R6 merkitsevät kukin vetyä, tai 25 c) ch3 30 jossa, kun nx on 0 ja px on 1, X3 on 0, S tai S02; ja kun nx ja Pj ovat kumpikin 0, X3 on S tai S02.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen amiinin käyttö välituotteena valmistettaessa L-aspartyyli-D-aminohappo-dipeptidiamideja, joilla on kaava I 35 46 82444 NH0 O 11 _ "cr γ ^nhr (i) 5. ii I a COOH O R 10 jossa Ra on metyyli, etyyli tai isopropyyli; ja R merkitsee samaa kuin Rb patenttivaatimuksessa 1. !l 47 8 2 4 4 4