FI77251C

FI77251C - Mellanprodukt foer anvaendning vid framstaellning av penta- och hexapeptiden vilka frigoer tillvaexthormon.

Info

Publication number: FI77251C
Application number: FI833057A
Authority: FI
Inventors: Frank A Momany; Cyril Y Bowers
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Priority date: 1981-12-28
Filing date: 1983-08-26
Publication date: 1989-02-10
Also published as: FI833057A; WO1983002272A1; EP0083864A2; CA1317069C; IL82215A; FI833057A0; KR890002760B1; KR900002681B1; EP0083864A3; DE3276319D1; IE823072L; KR840002772A; EP0083864B1; AU549053B2; JPS58501861A; CA1242435A; PT76041B; IL67577A; IE54515B1; BR8208035A

Description

1 77251

Kasvuhormonia vapauttavien penta- ja heksapeptidien valmistuksessa käytettäviä välituotteita

Keksintö koskee penta- ja heksapeptidejä, joiden kaa- 5 va on (g)

(Pr)r-B^-D-Trp-B3-Trp-B5-Bg-^y I

jossa r on 0 tai 1;

Pr on t-butoksikarbonyyliryhmä (tai butoksikarbonyyli); 10 Βη on His(Tos), Tyr(Brz), p-kloori-(tai p-halogeeni)-Phe, 0-metyyli-(tai 0- (C^-C^-alkyylj -Tyr(BrZ), tai 3-N-metyyli-(tai C^-C^)alkyyli)His, kun r on 1, tai desamino-Tyr, kun r on 0; B^ on Ala, Gly, Vai, tai Ser(Bzl); ja Br-B, on D-Phe, D-His(Tos), D-Tyr(BrZ), D-p-kloori(tai ha- 56 v/~ 15 logeeni)Phe, D-Phe-Met, D-Phe-Thr(Bzl), D-Phe-Glu-Y -Bzl, D-Phe-Gln, D-Phe-Asn, D-Phe-Lys(C1Z), D-Phe-Phe, D-Phe-Gln-ONP, D-Phe-Arg(Tos), D-Phe-HomoArg(Tos), tai D-Phe-Orn(Z); sillä edellytyksellä, että B^ ei ole Tyr(BrZ), kun B^ Ala, Gly, Vai tai Ser(Bzl) ja B^-Bg on D-Phe, 20 D-Tyr(BrZ), D-Phe-Gln, D-Phe-Thr(Bzl) tai D-Phe-Lys(Clz); jolloin

BrZ on o-bromibentsyylioksikarbonyyli;

Bzl on bentsyyli; Y-Bzl on Y-bentsyyliesteri; 25 C1Z on o-klooribentsyylioksikarbonyyli; ONP on nitrofenyyliesteri;

Tos on p-tolueenisulfonyyli; ja Z on bentsyylioksikarbonyyli; ja ®on p-metyylibentshydryyliamiini- tai hydroksimetyylihartsi. 30 Nämä yhdisteet ovat käyttökelpoisia välituotteina valmistettaessa penta- ja heksapeptidejä, joilla on aivolisäkkeen kasvuhormonia vapauttava vaikutus.

Kasvuhormoni, jota erittyy aivolisäkkeestä, saa aikaan kehon kaikkien kasvukykyisten kudosten kasvua. Lisäk-35 si kasvuhormonilla tiedetään olevan seuraavat perusvaiku-tukset kehon aineenvaihduntatoimintaan: 2 77251 1. Nopeutunut proteiinisynteesi kehon kaikissa soluissa ; 2. Hidastunut hiilihydraattien hyväksikäyttö kehon soluissa; 5 3. Lisääntynyt vapaiden rasvahappojen liikkuvuus ja rasvahappojen käyttö energian tuotantoon.

Kasvuhormonin erityksen vajavaisuuden tuloksena voi olla erilaisia lääketieteellisiä häiriötiloja, kuten eräät kääpiökasvutapaukset.

10 Monenlaisia kasvuhormonin vapautumistapoja tunnetaan.

Esimerkiksi kemikaalit, kuten arginiini, L-3,4-dihydroksi-fenyylianiliini (L-DOPA), glukagoni ja vasopressiini sekä insuliinin aiheuttama hypoglysemia samoin kuin sellaiset toiminnat, kuten uni ja liikunta saavat epäsuorasti aikaan 15 kasvuhormonin vapautumisen aivolisäkkeestä vaikuttamalla jollakin tavoin hypothalamukseen, kenties joko vähentäen somatostatiinin eritystä tai lisäten tuntemattoman endogee-nisen kasvuhormonia vapauttavan hormonin määrää tai molemmin tavoin.

20 Yhdisteisiin, jotka vaikuttavat suoraan aivolisäk keeseen saaden aikaan kasvuhormonin vapautumisen, kuuluvat prostaglandiini ja prostaglandiini E2, teofylliini ja sykliset nukleotidit. Nämä yhdisteet eivät kuitenkaan spesifisesti vapauta kasvuhormonia eikä niiden uskota vaikut-25 tavan aivolisäkesolun ulomman membraanin oletetuissa kasvuhormonia vapauttavan hormonin reseptoreissa kasvuhormonin vapautumisen alkuunpanemiseksi.

Lisäksi määrätyissä olosuhteissa eräät kemiallisesti tarkkaan määritellyt peptidit, esimerkiksi vasopressiini, 30 tyrotropiinia vapauttava hormoni (TRH), luteinisoivaa hormonia vapauttava hormoni (LH-RH), ft-melanosyyttiä stimuloiva hormoni (rt-MSH), glukagoni, aine P, neurotensiini, Met-enkafaliini, /i-endorfiini, koleraenterotoksiini ja emäksinen myeliiniproteiini, saavat aikaan kasvuhormonin 35 vapautumisen aivolisäkkeestä. Kuitenkin ainoastaan TRH vaikuttaa suoraan aivolisäkkeeseen saaden aikaan tämän vas- 3 77251 teen. Sitä paitsi edellä luetellut hormonit vapauttavat muita aivolisäkehormoneja eivätkä useimmissa koeolosuhteissa vapauta kasvuhormonia. Esimerkiksi TRH ei vapauta kasvuhormonia tavallisilla rotilla tai ihmisillä tai tavallisten 5 rottien tai apinoiden aivolisäkkeestä. In vitro TRH vapauttaa joillakin lajeilla kasvuhormonia, prolaktiinia ja kilpirauhasta stimuloivaa hormonia (TSH), ja in vivo TRH vapauttaa näitä hormoneja naudan aivolisäkkeestä.

Vasopressiinin aikaansaaman kasvuhormonin vapautumi-10 sen katsotaan aiheutuvan epäspesifisestä vasteesta, jonka tuottaa stressi, jonka aiheuttaa suurten vasopressiini-annosten anto.

Niinpä olisi erittäin toivottavaa, että olisi käytettävissä yhdiste tai yhdisteiden yhdistelmä, joka vaikuttaa 15 suoraan aivolisäkkeeseen normaaleissa koeolosuhteissa saaden aikaan kasvuhormonin vapautumisen siitä. Sellainen yhdiste tai yhdisteiden yhdistelmä olisi käyttökelpoinen in vitro, esimerkiksi ainutlaatuisena tutkimusvälineenä sen ymmärtämiseksi, miten kasvuhormonin eritystä säädellään 20 aivolisäkkeen tasolla ja se olisi käyttökelpoinen myös in vivo, esimerkiksi kasvuhormonin puutteisiin liittyvien oireiden hoidossa, hyötyeläinten kasvun nopeuden ja määrän lisäämisessä, hyötyeläinten maidontuoton lisäämisessä ja veren hapenpuutteen aiheuttamien limakalvojen kulumisten 25 määrän vähentämisessä.

Keksinnön mukaisista välituotteista saadaan peptidejä, jotka vaikuttavat suoraan aivolisäkkeeseen normaaleissa koeolosuhteissa in vitro vapauttaen siitä kasvuhormonia. Lisäksi välituotteista saadaan yhdisteiden yhdistelmä, joka 30 vaikuttaa suoraan aivolisäkkeeseen normaaleissa koeolosuhteissa in vitro vapauttaen synergistisesti siitä kasvuhormonia .

Näitä kasvuhormonia vapauttavia yhdisteitä ja yhdistelmiä voidaan käyttää in vitro ainutlaatuisina tutkimus-35 välineinä mm. sen ymmärtämiseksi, kuinka kasvuhormonin vapautuminen on säädetty aivolisäkkeen tasolla.

4 77251

Keksinnön mukaisista välituotteista saatavia kasvuhormonia vapauttavia peptidejä voidaan myös antaa in vivo kasvuhormonin vapautumisen lisäämiseksi.

Keksinnön mukaisissa välituotteissa olevilla amino-5 happotähteillä on luonnonmukainen tai L-konfiguraatio, ellei toisin ole erityisesti mainittu.

Aminohappotähteistä käytetään seuraavan, tavanomaisen peptidinimistön mukaisia lyhenteitä:

Tyr L-tyrosyyli Ile L-isoleusyyli 10 D-Tyr D-tyrosyyli D-Ile D-isoleusyyli

Gly glysyyli Leu L-leusyyli

Phe L-fenyylialanyyli D-Leu D-leusyyli D-Phe D-fenyylialanyyli Thr L-treonyyli

Met L-metionyyli D-Thr D-treonyyli 15 D-Met D-metionyyli Vai L-valyyli

Ala L-alanyyli D-Val D-valyyli D-Ala D-analyyli Pro L-prolyyli

Ser L-seryyli D-Pro D-prolyyli D-Ser D-seryyli Gin L-glutaminyyli 20 Lys L-lysyyli D-Gln D-glutaminyyli D-Lys D-lysyyli Glu L-glutamyyli

Asn L-asparaginyyli D-Glu D-glutamyyli D-Asn D-asparaginyyli Trp L-tryptofyyli

His L-histidyyli D-Trp D-tryptofyyli 25 L-Asp L-aspartyyli D-His D-histidyyli D-Asp D-aspartyyli

Cys L-kysteinyyli Arg L-arginyyli D-Cys D-kysteinyyli D-Arg D-arginyyli

Hypro L-hydroksipropyyli 30 D-Hypro D-hydroksipropyyli

Dopa L-3,4-dihydroksi- fenyylialanyyli L-<Glu L-pyroglutamyyli D-Dopa D-3,4-dihydroksi- fenyylialanyyli D-<Glu D-pyroglutamyyli 5 77251

Hylys L-J-hydroksilysyyli Sar N-metyyliglysyyli (sarkosyyli) D-Hylys D-^-hydroksilysyyli

Aib L-d-metyylialanyyli <*-Naphth L-*-naftyyliala- 5 (L-aminoisobutyryyli) nyyli D-d--Naphth D-*-naftyyliala-nyyli f-Naphth L-P-naftyyliala-nyyli 10 Igl L-isokinolyyli D-P-Naphth D-P-naftyyliala- nyyli D-Igl D-isokinolyyli

Keksinnön mukaisia penta- ja heksapeptidivälituottei-ta voidaan valmistaa käyttäen tavanomaista kiinteätaasi-15 tekniikkaa. Kiinteäfaasisynteesi voidaan esimerkiksi aloittaa peptidin C-terminaalisesta päästä käyttäen aminohappoa, jonka ä-aminoryhmä on suojattu. Lähtöaine saadaan sopivasti esimerkiksi kiinnittämällä tarvittava ^-aminohappo hydroksi-metyylihartsiin tai p-metyylibentshydryyliamiinihartsiin 20 (p-Me-BHA-hartsiin). Hydroksimetyylihartsin valmistusta ovat kuvanneet Bodansky et ai., Chem. Ind. (London) 38 (1966) 1597. BHA-hartsia ovat kuvanneet Piettä ja Marshall, Chem. Commun. 1970, 650 ja sitä myy hydrokloridimuodossa (BHA-HCl) Beckman Instruments, Inc., Palo Aito, Kalifornia. 25 Tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden kiinteäfaasi- valmistuksessa suojattu aminohappo voidaan kiinnittää hartsiin kytkentäaineen avulla. Ensimmäisen kiinnittämisen jälkeen d-aminoryhmää suojaava ryhmä voidaan poistaa erilaisilla reagensseilla, mm. etikkahapon (TFA) tai suolaha-30 pon (HCl) orgaanisella liuoksella huoneen lämpötilassa. <*-aminoryhmää suojaavan ryhmän poistamisen jälkeen loput suojatut aminohapot voidaan liittää asteittain halutussa järjestyksessä.. Kunkin suojatun aminohapon voidaan yleensä antaa reagoida noin kolminkertaisena ylimääränä käyttäen 35 sopivaa karboksyyliryhmää aktivoivaa ainetta, kuten disyk-loheksyylikarbodi-imidiä (DCC) liuotettuna esimerkiksi metyleenikloridin (CI^Clj) ja dimetyyliformamidin (DMF) seoksiin.

6 77251

Saadusta keksinnön mukaisesta peptidivälituotteesta saadaan haluttu peptidilopputuote lohkaisemalla peptidi-hartsikantajasta käsittelemällä välituotetta reagenssilla, kuten fluorivedyllä (HF), joka ei pelkästään lohkaise pep-5 tidiä hartsista, vaan lohkaisee myös kaikki jäljellä olevat sivuketjujen suojausryhmät. Käytettäessä hydroksimetyy-lihartsia HF-käsittelyn tuloksena muodostuu vapaita pepti-dihappoja, p-Me-BHA-hartsia HF-käsittelyn tuloksena syntyy suoraan vapaita peptidiamideja. Vaihtoehtoisesti, kun käy-10 tetään hydroksimetyylihartsia, peptidi, jonka sivuketjut on suojattu, voidaan lohkaista hartsista käsittelemällä peptidi-hartsi-yhdistelmää ammoniakilla, jolloin saadaan haluttu amidi, jonka sivuketjut on suojattu tai alkyyli-amiinilla, jolloin saadaan alkyyli- tai dialkyyliamidi, 15 jonka sivuketjut on suojattu. Sivuketjujen suojaus voidaan sitten poistaa tavallisella tavalla käsittelemällä HFrllä, jolloin saadaan vapaita peptidiamideja, -alkyyliamideja tai -dialkyyliamideja.

Valmistettaessa keksinnön mukaisista välituotteista 20 esterilopputuotteita voidaan käyttää hartseja, joita käytetään valmistettaessa happoja, ja peptidi, jonka sivuketjut on suojattu, voidaan lohkaista emäksellä ja sopivalla alkoholilla, so. metanolilla. Sivuketjuja suojaavat ryhmät voidaan sitten poistaa tavallisella tavalla käsittelemällä 25 HF:llä halutun esterin aikaansaamiseksi.

Edellä kuvattu kiinteäfaasimenetelmä on alalla tunnettu ja sen pääkohtia ovat selostaneet Stewart ja Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman & Co., San Francisco (1969) .

30 Keksinnön mukaisista välituotteista saatavat kasvu hormonia vapauttavat peptidit sekä niiden yhdistelmät vähintään yhden kasvua edistävän aineen kanssa ovat käyttökelpoisia in vitro tutkittaessa kasvuhormonin erityksen säätelyä aivolisäkkeen tasolla. Tähän sisältyy käyttö mo-35 nien sellaisten tekijöiden arvioinnissa, joiden arvellaan tai tiedetään vaikuttavan kasvuhormonin eritykseen, kuten 77251 ikä, sukupuoli, ravintotekijät, glukoosi, aminohapot, rasvahapot sekä paastoamis- ja paastomattomuustila. Lisäksi keksinnön mukaisista välituotteista saatavia peptidejä voidaan käyttää arvioitaessa kuinka muut hormonit muuttavat 5 kasvuhormonin vapautusvaikutusta. On jo esimerkiksi näytetty toteen, että somatostatiini estää kasvuhormonin vapautumista. Muita hormoneja, jotka ovat tärkeitä ja tarpeen tutkia sen selvittämiseksi, miten ne vaikuttavat kasvuhormonin vapautumiseen, ovat sukurauhashormonit, esimerkiksi 10 testosteroni, estradioli ja progesteroni; lisämunuaishor- monit, esimerkiksi kortisoli ja muut kortikoidit, epinefrii-ni ja norepinefriini, haiman sekä mahan ja suoliston hormonit, esimerkiksi insuliini, glukagoni, gastriini ja sek-retiini; verisuonistoon vaikuttavat suolistopeptidit, 15 esimerkiksi bombesiini; ja kilpirauhashormonit, esimerkiksi tyroksiini ja trijodityroniini. Keksinnön mukaisista välituotteista saatavia peptidejä ja yhdistelmiä voidaan myös käyttää tutkittaessa joidenkin aivolisäkehormonien, esimerkiksi kasvuhormoni- ja endorfiinipeptidien, mahdol-20 listen positiivisten tai negatiivisten palautevaikutusta, joka kohdistuu aivolisäkkeeseen muuttaen kasvuhormonin vapautumista. Tieteellisesti erityisen tärkeää on näiden peptidien käytön kasvuhormonin vapautumisen solutason alapuolisten välitysmekanismien valaisemiseksi.

25 Keksinnön mukaisista välituotteista saatavien pepti dien kasvuhormonia vapauttava vaikutus in vitro tutkittiin seuraavasti: CD-1-kannan naarasrottia sijoitettiin vakiolämpöi-seen huoneeseen, jonka lämpötila oli 24°C ja jossa oli 14 30 tuntia valoa ja 10 tuntia pimeää. Rotille annettiin ravinnoksi Purina-rotanruokaa mielin määrin. Kaikki tutkimukset aloitettiin tuntien 0800 ja 1000 välillä.

20 vrk:n ikäisiltä naarasrotilta poistettiin aivolisäke. Kussakin polytetrafluorietyleenimaljassa (10 ml) 35 inkuboitiin kahta aivolisäkettä 36°C:ssa 1 ml:ssa laktaat-tipitoista Ringerin liuosta käyttäen Dubnoff-ravistinta 8 77251 (90 kierrosta/minuutti). Kutakin taulukossa VI esitettyä annostusta kohden käytettiin kolmea maljaa. Kaikki väliaine poistettiin kustakin maljasta tunnin välein (esim. P^ , II4, ϊς) ja tuoretta väliainetta lisättiin sitten takai-5 sin joka maljaan. Kustakin poistetusta väliaineesta määritettiin GF, rinnakkaismäärityksenä tavanomaisella radioimmunologisella mittauksella (P.IA) .

Tutkittavaa kasvuhormonin agonistia ei lisätty inku-bointijakson ensimmäisen tunnin (P^) tai toisen tunnin (P2) 10 aikana käytettyihin inkubointiväliaineisiin. Tutkittava kasvuhormonin agonisti liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO; 10:1, agonisti:DMSO) ja lisättiin jokaiseen inku-bointijakson kolmannen tunnin (I^) aikana käytettyyn inku-bointiväliaineeseen, jokaiseen inkubointijakson neljännen 15 tunnin (1^) aikana käytettyyn väliaineeseen ja silloin kun suoritettiin, jokaiseen inkubointijakson viidennen tunnin (I,.) aikana käytettyyn väliaineeseen. Kasvuhormonin vapautuminen rekisteröitiin 4GH-arvoina, jotka saatiin kolmesta kutakin annostustasoa kohden käytetystä maljasta ja jotka 20 mitattiin ajanhetkillä 1^, I4 ja, silloin kun suoritettiin I,-. Tulokset on esitetty taulukoissa I-XXX.

9 77251

U1 I

0 0 l

,* Ή K

o e> +i - g (0 0 0 X» -H 0

U ?J> G

0 0-0 G f-t (0

•H (3 -H

0 C Ή •H 0 :0 ,H >

:0 C

> -H c -H 4-3 :0 O 4J 0 £ > <— *- C -H :0 Ο 34 I m — o o -P C 4-> S id ! 9 °- ° ° o o +> ' ' 2 o cT σ Λ % '% > v v v jjj 03 £

G G 4J

£ ·Η Ή r—i

Ή C

G *3· co σ\ γ·*ι m £0£-H

0 *— vo r- o <ri ^4-( 3-10 C T- cm σ> x> Ο •H K , I _j_ I , I , I , e G 0 .G 0 S a +1+1+1+1+1 c 3-0 G <3 r-~ 40 co tn vo '7j mti 4-> VO O CO O *3· G 0 0 0

l_l 3 T- ΓΜ CM O O :0 -H 0 -H

0 I A1 M rH :0 λ: C

O a, CM m . :0 4J o v>0 cm -0 2 £* C :0 t3 > cc 0 U -r| :0 :0 ft)

3 z Λί W -P -Ρ +J

HG I ’ >, — C 0 Ή 3

«* *H m Ή W !^3 H

0 C £ -00^0-0 f;o £ o x: λ >i -h « g I > 34 3 4-> 0 4-> 3-1 Q 34 -Η Μ Ή 34 O I 0>CAiG0 X cl, -Η -H -i-t S-ι > 3 CM tr Αί Ό 0 0 >0H 0 34 ε -o c 0 3 , 0 0 £ 0 0-Prtl Ai "0 ^ 0 ' -π

M 0 ,Α CCT100O

Orf· 2 S G0G-P00 C| 0 +J 4-10 0 c Qi 0 0 :0 -H 0 4-> <c u λ; c o 0 I c £ >1 G 30 A< C K -0 T 4-> o ai m -0 u x

λ -0 > X 0 0 -H

, 34 34 ·0 X> -0 G Ο m :0 0 0 t—I 0 0 . . :0 -H M CO :0 -H 0 £ 2 Ai 3h 2 > >4-> 'cm ....

*£ T— CM ro TJ* 10 77251

03 I

03 di I

ih a o o +i ' c 3 3 a -P -HQ) -u tn q 0) ο ή C I—I rd

H 3 -H

(3 C Ή -Η 3 :3

rH

:(3 C

> -H C

·Η 4-) :3

0 -P co E

Ο ρ I o ,S e S

ph l en u) c/3 o X

p<3 I Z Ζ Z - O o P

-PI σ X! cr> :n3 7 cl v a 3 ε > X :3

C C -P

£ _ -H Ή »—I

•3 C :3

r-l 0 W

C rrroooim Sf3S-H

S - =P!S:g£ - ϋ s » E g +1 +1 +1 +1 +1 c g § .2

3 <3 r- σ> <n <N .— :3 -H >P

H-P νΟΓ'ίΤιΟ'- C 3 U) U)

H 3 7 7 7 °P ^ :0 -Η 3 -H

n 3 till Λί rH :i3 Λί C

2 S' cm -* cr 7 43 ° 7$ 3 -H 2 > c :3 t3 " > " 01 W -H :0 -.3 3

7 «f* C/3 P -P -P

d G I ^'-'CQJrHa

3 -3 ” -Η ω :3 I—I

£ C 7 * Q) 0 2/ 01 -H

^ o * o J3 Λ >1 -H 3 S Λ > ρ 3 -P οι -p

^ 7 P -Η Λί ·Η P

o I 3 > C 24 3 0) -3 g< -H -H -H P 24 > 3 <N m il 3 3 0

>037 03 P Ή E -n G

« 3 I 0) 3 E <13 3 4J 3 ΛΙ 3 \ ' -n ® > I r— noo £ CP 3 3 Ο 0 7 1 ~ cr, C3C-P0303 £ * Q) -P -P 03 3

£ P* 0) 0) :3 -H 0) -P

< r. x c ο ω I c

7 >, £ :0 λ; £ k -H

• .p o 24 p -h to x:

7 -H > x 3 3 -P

P P -Η -P -H C 0 ” :3 3 03 >H Q) 3 :3 -p X <Λ :3 -H 3 7 s 24 >< z > > -p <M ....

® r— <N n H1 11 77251 g i

οι G) I

Ai i—I HE

O O

+ 1

- G

oi m cd -G -G G)

-G tT> G

0) o -g G -M 03 Ή (XJ Ή G G <-t •G (Xj :<xl i—( >

:G G

> -H G

*3* - -rl 4-) :G

O hj g g > — G -n =0

O u 1 ro O -rl G -G

cg ιωωοΊο o

G I O J3 CP =G

•H n. v P G g

> Ai :G

G G -G

G 'G -G rH

-rl G :G

rH O tn

G Lfirooro-o- g G g -G

G) CM ui ro ro CO \ 4-> MW

£ r- r- CM CM r~ CM CP -G O

g O +1 +1 +1 +1 +1 c c G -H

H G <3 ιο lO <Ti CO CO ;G -h >-G

H. 4-> ro cn σι ro σι G G tn tn H g es r- i cm in :0 -H g -h

G 11 1 Ai r-l :G Ai G

0&< Ai — :G -G O

AiG m -g 2 > c :G CP

X > M G W -G :0 :G G

G 2 Ai tn -G -G -G

rH G I >, 'r' G O rH G

G -H M -rl tn :G «H

GC >i ' 0) O Ai G -G

Eh O Eh O JS -Q >i -G G

g I > G G 4-> G -G

G Q G -H Ai -H G

O I G > G Ai G 01 X Pj -H -rl -H G Ai >

G <N G Αί T3 0) O

>tnE-i tn G rH H -n G

G G I G G g Q> G-GG, Αί Ό G ·“ -m

SiS G rH 1.-,-.-, G tT> G G O

O < 2 O O G G G -G G G

cl r-o g 4-> 4-i tn G

G Pj G G :G -H 01 -G

CG — Ai G 0 01 I G

Eh >i G ‘-O Ai G K -H

I -G O Ai G -G O JS

O -G > Ai G G Ή I G G -G +1 -G G 0

G :G G G rH G G

•G :G -G X tn :g -G G

π s a; >< 2 > > -c i (N ....

K T- (N ro n· 12 77251

G I

CU G I

42 H S

O o + 1 “ c

G fTJ OJ

44 -H G

4-1 Cn G

0) 0 -H

C -H G

-G G "'“C

G G i—I

-H G :G

-G >

:G G

> -H G

^ -H -U :G

O -P ui 6

Im o 0 -H :θ

Oi-ι icncnc/io c-u 1-1 (0 122:2- O O 44

-u) · O jä tji :G

•H α V 3 fl S

> 42 .'G

G G 4-1

G *G Ή r—I

•H G :G

„ -H O UI

G mr-cNincN g ,* p -h

S 2 K £ s ™ v 5 S S

e — , ™ en 4J o •H K +1 +1 +1 +1 +1 e o -e g 3 < vo vd σι m — :g -H >4-1 >3 ™ ^ ^ £ .g 2 £h

M 3 II -O -H G H

3 _ 42 G :G 42 G

o Oi 42 —- :G 4-) O

X 5 (N -G 2 > e :G en

42 g K UI W -H :0 :G G

3 2 42 W 4-> 4-1 4J

r-i C I - G 01 --H 3

G -H to -G G :G r—I

G £ -H - G O 42 G -G

E-iO 2 O -G 42 >. -g G

E I > 14 3 4-1 UI 44 G Q M -H 42 -H >4 O I G > e 42 G 01 42 n. -H -H -H l-i 42 >

3 <N j_| 42 -3 CU O

> ™ B G i-ι -H g -n G

W 3 | <D G ε 01 34-1,-51 M G \ G - -n

2 wrH I *- o o o GenGGO

0<c I t-σο G G £ 44 G G

G I — O G 4-1 44 G G

Cq. G G :G -G G 44

*“ 42 G O 01 I G

>1 e :0 42 G K -G

, 44 O 42 G -G O 42

Q -G > 42 G G -G

, 14 14 -G 44 -g G O

tn :G G G -H G G

•H :G -G 42 UI :G -G G

K S 42 >* 2 > >44 i ....

32 t— (N m -g- 13 77251

U) I

Q) a) i

X rP B

o u +1

- C

ra m q> P -HO) p o> c

(D O -H

C r—i ft!

•P (¾ -P

ro G I—I

-P m :rd rH >

:aJ C

> -H G

-P -P :(0

O P tn G

> r— C ·Η :θ

OP In O·—-'-· C-P

p nj icncncnoo o O-P

4J I I 2 2 2 - tn :id •p o. S 9 3 « ε > v v A! :r0

C C-P

G -Η -Η Ή -P C :aj r—I 0 w ^ "S· n ΓΡ 00 f1? S rn

LncocMr'M'rn^P Pt/i

C t— T- tn P O

Ή K I , I ι,ιι.ι G d) ^ S Orsj +1+1 +1+1 +1+1 a s -h > G f ™ ? 2 9 £ 5 :§ -P " "

λ fd λ» Λί *H :id x G

S a, S Λί — :«J P o 2(0 £ -P S > G Cr> 2 > I cn W -P :0 :G ttj jj ' x ω p p p d c 7] >, ~ c a) ^ c ~ -Η V -H cn :n} r-i

Sc L

^0 9 O Ä Λ >i -H <0 ε Λ > p g -p w p PV Ρ ·Η X -H Ρ

O O (3 > G A! ti <D

x; V ·ρ ·ρ ·ρ p Ai >

G (N Γ. X Ό 0) O

> «1 V U3 Ρ I—I £ -r—> c tn g L (U to £ Φ nj-pjj α: Ό \ <ö ~ ·η

ϊ< ui ·~1 looooo GCntöGO

O V — mooo CGCPtntn

ci,1 MOO (UP -PCOITJ

crr no tn tn :G -h O-P

< £ n Ai COQJIC

V >i G =0 Ai C K -H

Λ p o Ai p ·η u χ: V -p > x td to -p ' )H P -p P -p c o V :ttj nj tn rP o tn

>* :rtj ·Ρ Ai W :ttS -P G

^ S Ai >< 2 P> > P

<N ....

® r- f\l n «3* 14 77251 c + l 0 0

•H *H

0 > x;

P 0 -P

-P Ή 0 0 O tn 0 0 -p - p ta ta i •p Ή ΓΠ

i—i ΪΤ1 O

:ta o > r-t c -h ta 0 -0 0 0 0 ta c •H Ή o c ta

rO Xl -H -H

0 — 0 -u i—i > n o m tn :ta 0 , ° ° ° 0 -p > n?5 I O o O £

0 1 I v v v 0 G

M q, Ή tT' ·<Τ3 u e 0 e •H \ :0 > tn 0 -0 0 -H xl 0 0 :ta •H :0 O £ O' o ro o c 0 £ :0

0 :0 -P 0 -P

0 <- ^ ^ -PO*—I

C K +| +| 4-1 +1 ^ D X

•p g iiii -h c 3 tn £ <] o- co ui vo tn -p > -p H X* 7 ^ >ι Ξ -P 0 > X) 1 W <-t X 0 0 o tn :ta -h

o o > ^ > :0 -P

χ; 0 OI 0 -H :ra tn

χ; > K 0 0 -P -P -P

0 2 -p .0 G *P c rP 0 I X 0 -H :ta o 3 -h o ui -h o tn en ta e x 0 > λ -h ta EH o Λ X -h X 0

El 'Ό X G

m q e m e ta *-)

O 04 | 0 0 -P Χί -P

Λ tn o, 0 x) O 0

0 0 P Xi 0 *P M—1 -P

> 4J Eh >1 0 E 0 tn tn i i o o o +> -U ό - 0 0 O 0 i 5 o o -p tn en 0 > X Cp I m o o 0 00

G e :0 G 0 C

Ci no :0 O :0 0 0 Q 00 E > C 0 -n

I 0 :0 0 O

Qj 0 0 X -P 0 p 0 -P X 0 0

[h Ό X -P -P -P

I 0 0 0*—Il q 0 0 X :0 0 1 « λ >< > a p jp1 r- 04 Γ0 04

K

15 7725 1 +ι ft

4-> I

4-) ft I

ft 1—1 K

c o o

•H

ft - β •H ft ft r—1 *H ft .•ft en c

> O -H

H f—1 ft

4-1 ft -H

α β ή •H ft :ft 0 > jQ β β -H c X 4-> :ft O in r- C ft Ξ > o o ·— -H -H :0 M I n - - ο β 4-)

oft ! £ S S °- ^ Q4J

U I I 2 v v - g 01 :ft

4-) (1, v \ ft E

•H 0i 1ft > β β +*

_ *H rH

β :ft β :ft Η β 0 ft r- »— σι o m :0 ft E Ή β o n- m »r X 4-) H ft

ft r- .-04.-.--- X 4-) O

-S ’3 +1 +1 +1 +1 +1 ft π "β -H

H 3 ^ Ξ 3 5 ^ oi >i — ft ftft

Γ"! 4-) O) 04 n Γ~ n S -H ft -H

t? p II *> W r-4 :ft X β

Ή ft 04 O (Λ :ft 4J O

o D< K >—' > β :ft tJ> X ft 2 H -H :0 :ft ft X > I ft ft 4-) -H 4-> p ft -H .β β ft r-4 3

,-Ι β .β X )-4 -r4 1/) :ft rH

p -H pL, ft -H o X ft -H

ft β I ft > XI >1 -H ft

EhOP X Ή β 4J ft -P

El Ό X -H )-1 )4 0. β β β X ft ft 0)4 ft ft Ή )4 X r>

SP E-4 ft X) ft O

β O) I X β 1-4 E ‘•""I β > tn ft >i ft E ft ft β ,-4 4l 4J s Λ ' ·η ft 4-) <d I g o o o -h ft tn ft ft 0 ^ ft I I^oo M β 4-) ft ft O a. 1 noo :ftc 4-) ft ft β S_i t— o :ft 0 ift Ή ft 4-1 β E-· — E > β 0 ft I β

I β iO X β 23 -H

a ββΧΜ-ποχ:

I ft -H X ft ft -H

ft Ό X -H 4-) -Η β o r| β ft ft r4 ft ft ο β ft X W :ft -H ft

I X X >4 2 > > 4J

f—i 0 .....

1 t— 04 n a oi

J-H

16 77251

P

α) I

C <U I

•H r-H

rd o a

*rH

<-4 ** C

rd <τϊ CD

> -HO

•P t3 G

4-> O -P

C I—I ftJ

Ή d Ή O C r-1 X) d -.id 3 P> λ: c

O 3 -P C

O I .- P 4-) rd > I CM «- r- o U) g P I <3 O O O r-4 -P :0 7 cT o*^ ο“ cT 4 § ϋ 00, SVVV ^ o -p P 3 ra 6 -P :d

•H rd C -P

^ in <rr .- n .¾ '"j U") *£> O O .— -0 3-d 3 .— CM Xi 0 [/) P I * 1 I I M d £ -p *- +1 +1 +1 +1 +1 ή ~ 4i u ui £ E CO _ U1S-P0 OO U CD XI rtf

3 <3 cm rr o co >, c/j c 3 -P

P ffi ' - -p > x> H £ g *· ftJ (Λ (/)

IP 3 o <D -P d -H

M -P I > Λ in x c

> 3 “J P P rd O

n G g· d -P > :d cn ° a -P > -P :G d

g d I x: -P -p -P

g > V 3 *3 3 1—I 3 _g I a) p -p :d ή

Γ3 G xi d 0 u) -P

2 -p £ 3 X2 -P G

2 C « V 3 3 3(/)4-) o w Ο ω < >1 0 x: O I 4-> 3 >-l -o 3 3 3 P* -p O £ 0) > G P , p>^--n

w<v oooo rdPtxidO

d · loooo :d d 3 ui 3 ti! p* noo « -P o) d

* Xi :d Q) -P

P ^ s G m 3 0) I 3

>t ^ rd 0) :0 3 21 -P

0 w xi x: -p a x: 2 x: x: d -p c oj +1 -p -p 3 o -p 3 u) .-p 3 ui 5 x d x: rd -p d

d >4 p X > > 4J

<Λ a) ...

3 r- CM n

<N

a 17 77251

0) I

0) <S) I

x rH a: o o +i - c

id «3 CU

4J -HQ) -p σ' c o o -h C Ή <d

•p (G *H

(0 G Ή -P (0 :rd r-i >

:rd G

> -PC

I ro .— r— "P -P :2

0 I C/3 CO IN O O 4.) MS

> I Z Z ο σ o G -P :0 OP ~ ~ 'H G 4->

PrO 0 4-» •P I s v J3 Cn :id

-P o G id E

> ^ 44 :id C G 4-) C _ -P -P <-· •P g C :nj Ή 0 ^

G co o r~ in . S G S'P

Φ m r- tn cm co +1 \ 4-) pin

C T- co tr -P O

•P 53 , I . I , I , I , I g C <D -G id

£ U + I + I + I + I + I g C G -P

v 3 < in r> co in g % H

rs+j η- ο σι·- G <0 m in

H 3 t— cm in :0 ·Ρ ιΰ -P

trj III 44 -π :rd 44 C

O Qj <N X ^ :ifl -P O

nj 53 -P 2 > G :rd tn 44 > Z in W -P Ό :nJ (0 G I 44 Ui 4-) -P 4-)

rH G 0) >i —' C 0) f-4 G

G -p G3 -p in :.G Ή

tG G CU ~ G O 44 W -P

Eh O I O -C -Q >t -P id

S Q > p g 4-) in -P

pi p -p x -P p O a id > G 44 rd 0) jG p -η -p ·ρ p > G (N Eh 44 Ό <1)0 >ini in p «η £ ·η c tn G (0 Φ id £ Φ rO 4J «Η 44 Ό (G “ -rn

« in < GCniUnJO

01 g R R § o c ιΰ G 4-) in in c (¾ Roc a> 4-) -P w id G P in in :G -p <U 4-)

rilEn ro o 44 COQJIC

I m >, G :0 44 G 53 -P

q .p O 44 Μ -P O -G

I -p > X id id -P

p p P -P -P -P G O

>, :G id m ip n) in 33 - Eh :id -P X W :rd -P id

I 2 44 » Z > > -P

O

U ....

CM r- CM CO TJ.

53 u 18 77251 t tn i

<D Q) I

P P X

O O + l - c (0 ra 0) P -P 0)

P tn C

CJ O -H

C *—i rd Ή to ·Ρ to C r—(

-P to :rO

Ή

:tO C

> -PC

•'T o in 'h -U :i0 O o o P tn β > l n - -. C -p :θ 0 M I CO O O -P C 4-1

P tO I 2 v v o OP

P 1 J3 tn :t0

CU 3 (0 S

> λ; :t0

C CP

C Ή -H rH

P C :t0 c CO CO l£> CO - 2

3 co co CO co S tO c; "P

QJ — γμπ ">. P P tn C ’ * · I I tTt P o

s +1+1+1+1 C 0» .CrO

1 3 N t r s a » 5 ! 1 P X . £0 c tO in in

X P z :0 -H rd -H

to I -- P r-l :<0 X £

oQjQj P :tfl P O

>> [0 r« -P 3 > C :t0 (Τ' v !> a, cn W ·Ρ :0 :t0 to

3 I At to p p P

r-t G Q >1 C <U -H 3 3 *P I *P tn :r0 1—1 mC α ^ 0 0 p in -p

Eh O u O P P >1 -P tO

£ c., > p 3 .u in P

P I P -P X -P P

0 to > c x <0 o P 1 -P -P -P P Pi > p fN M O Cl) Ο >017* cn P .P S -r-i £ to P 0, a> to ε a> tO P 1. I O 0 0 Ji Ο β ' ·η x “μ 2 2° c σ to to o Ο I I cn o cd CtOCPtntn

Cq _ 0) p p tn to

c I 2 tn «1 :10 ·ρ 0) P

< u P C Ο <U I C

>, >1 C :0 P c 2 -P

H POPP -PUP

I -P > X fO tO ·ρ

m P p -P P -P C O

:t0 to ω rP ο tn I :rö -P P 10 :t0 P (0

0 SPX2>>P

CN ....

►3 -— CN tO

77251 19 + 1

Id

+J I

44 <D I

(1) rH 3 c o o Ή

03 ' C

-H id <L) rH -H 0

:rd σ' C

> O H

•h rH σ

U id -H

C G Ή •H rd :id O > '

X! G

G -H c h< 44 -P :(0 o c m £ > ·Η -H :0 H , po _ _ G 4->

Oid I r/3 o o “} 0 tj HI i 2 — *- £ tT» -G o, o o -- rd £ •H v v tT> :(d

> C G 4J

rH

C :id G :.¾

-H COW

:0 id £ H

c /--- in r- y ±) u m

Or- 44 44 O

c ‘X -h <d xx (d -h e> 1 +1 +1 +1 w c g-h

£ <J I I I I λ; -H > 4J

G COVDOC4 >-, .—. ro mm I rruivom y .h m ή

G G y rg· 04 co . a m :,d 2 C

^ <d — ^ o w Λ 4J o O a > —· > c :id tn x: (d _r* Η -H :o :rd (d * > E (fl φ 44 44 44

G S -H3G0)rHG

Ή C I 44 Η -H U) :rd rH

G -H -G W -Η 0 44 W Ή (dcjO ai>X3>,-H(d

Aj-HG4-i(n-P

g I -a -h n

hO C H C 44 id O

0 £ <D(d-HH^;> XX 1¾ m Ό <d0

G 04 · ^CrHg-nC

> (Λ Q >1 (d £ 0 U) G * 4J4J--rd--n

0344¾ . -H U3 CP id (d O

fcdrnH ooo H C4Jyiui 0Eh inoo :<dG 44t/ird

Cl ro o :td O :ifl -h O 4J

G G g > G O O I C

<-1 Π :θ 4* G E -H

< C(d44H-HCJ3

I <U -H 44 id (d -H

Οι Ό 44 -H 44 -H G 0 H G t/3 (/) .H CJ U)

Eh G Q) 44 to :td -H id

I X X X 2 > > 4J

Q

f ....

H t— (M m rr

>1 Eh I

(N

E

20 77251 + l 3

4-1 I

4-1 (1) I

<U i—( o c ο a 3 - c •h ra a) I—I -HO) :3 tn c

> O -H

Ή —13

4J (15 -H

C C Ή Η (53 :3 0 >

X! C

3 -H c

Pi 4-) :3 p c to ε ^ -Η -H :0

M 1 m — — C 4J

Ora iwcnoo —I O 4-1

Ml I 2 *· ·* g (Τ' :3

•S § S - » I

> C C n-> •H *—l c :rd C :n3

M COO

n in <n o — :9 u m

C n o m <n m ^ -M MO

O'— m in co Pi 4-1 O

C E l i I . * I -H O PC 3

•H 'O +)+1+1+1+1 n C 3 -H

HI 5 5 o in o !n ^ lJ 1 ·3 I Ο — ΟΊ 2 Ή 3 Ή

d 3 ‘ W H JD ^ C

-^3 rsitN O c/a :a3 4-t O

O O' > — > C :3 tn pi <TJ cm Μ -H :0 :3 3

Pi > S3 3 03 4-> 4-> 4-1 3 2 -H .C C 0) —I 3

rH C I Pi M -H 0 :3 rH

3 Ή )_| O-H O Pi O-H

3 C PC ¢) > Λ >1 H (A

Eh O £h Pi -H 3 -p O +)

£ I Ό Pi -H M

Mq) C M C Pi 3 0)

On 03 3 -H M Pi >

J3 pj O T3 03 O

3<N, Pi C ·—I £ ’(—1 C

> w Q >, (5) ε 03 O 3 1 4-14-1^(53' ΤΗ

Λ 41 a I OOOO -H O CP 3 3 O

« M ^ l—OOO 44 C4JOO

Oc-( I — 00 :(53 C 4-10(53

C 1 :n3 0 :3 -H <D 4J

C (53 ix E > C 0 03 I C

< r-i M :0 Pi C 33 -H

,3 C3PiM-HO-C

I CL) -H pi π3 π3 -H

α Ό Pi -H 4-1 -H c 0

i4 3 o O iH a) O

PH 3 03 Pi 03 :3 Ή 3

I 2 Pi Lx 2 > > 4J

Q

I · * * * ^ — (N Γ0 rp >5

Eh

CN

« + 1 21 77251 ftj

-P I

-p a) I

Q) r-l 5C

c o u

•H

<0 - d

rH ns CJ

*P Q1

:r0 CT» C

> 0 -H

P I—I (fl

-P f0 *H

C C -H

•P (¾ :ra 0 >

X! G

3 -PC

Pi -p :iTJ

O C οι E

> CT ·Ρ ·Ρ :0 Γ. \ rn Ο τ- ,-.,j Ρ I CO o es 5 ,

O tO I 2· c- Ή Ο -P

PI Ο Ο 2 CP :3

-P q. v v \ to E

•p · CP :t0 > c d -p

Ή »H

C ^ :3 C :¾ •p r- a ο ui £ en r\i :0 3 E -p C ίη,Τ;'· X! -P P 01 Ο r- χ; -p o ex +1 +1 +1 +1 ·* ® -S2

•PC? till 01 C 3 -P

E<J ο γί σι λ; ·ρ > -P

m3 γιηιηα> — to οιυι ΰ iJ ir-r-σι S ·ρ 3 ·ρ

H G CNrp *Wi l:rO^C

Li (0 rsn 0 CO :t0 -P 0 'χα, > '—' > C :3 tT> H (0 -I p -P :0 :3 3 'o > 5 πίαι^-Ρ-Ρ •S V -p ä e a) h 3 _3c ‘ Xi Ρ ·Ρ 01 :t0 Ή d -p ^ 01 -P Ο Xi W -p ai > XI >1 -P m

<5o9 Xi "P 3 -P 01 -P

Ei g I X) Χί -P P

p 3 C P G Xi 3 <1> 0 £ 01 3 -Ρ Ρ X! > si 9 01 xi Q) o

3 cN JL Xi G Ή E ‘ft C

> oi 9 >1 to S a> 01 3 I I ,—I _ -p-P^fd'-n

3 -P 9 I O O o -P 0) tP 3 3 O

x m £ I r- o a P G -p 01 01 0 v :t0 G -P oi to

C * *— o :t0 Ο :-3 -P <D -P

C — E>G0Q)IG

< Zi p :o x: C X -P

e g xi p -p u .g * οι -p ^ to to -p R* xl λ; -p -p -p g o P 3 01 Ul H 0) 01

H 3 a) x; CO :<0 -P tO

^ « x: s > > .p

I * III

P T— <N ΓΟ >0· >1 £-<

CM

K

22 77251 + ι 0}

-P I

-P d) I

0) I—I H

c o u

•H

<d - c •P rd d) (—( -H d)

'.(d O' G

> O -H

-P I—( (Tj -p rd 'p C C Ή Η Π3 :3 0 > ja c

3 -PC

"3· λ; -p O g m 2 > »- ,- -P -P :0

P I fp >— DO C -P

0 3 ItQODO r—I 0-P

M ' o" cT e O' :¾ -^o, °v° ^ «e •p O' :r0

> G C -P

•H rH

G :3 G :3 •P CO«

LnOpoinuj :0 3 2-p C fncricNcor^ -P p to d) *- trir-in p: 4-> 0 G 31 j I 1 I , I , I . -P d) ,c 3

•P U +I+I+I+I+I U) c 3 -P

OOOlOr- Pi >-P

rr 3 ^•Tonrj· 3 «ιοί Π -p ItNOfNr- S -P (0 -p

^3 * _ - W >—I :3 Pi C

-(d Ο ω P O

ycii i> ' > C :3 O' 3 τΓ1 P -P :0 :3 3 35 > χ go-p-p-p _p -f -P x; c o I—( o

'jG ’ piP-PU):iflrP

3 -H c tn -P o P! w -P

5G7^ d) > XI >i -P 3

Boy λ: -p 3 -P w +J

2 ‘ ό p: -p p p CPCPiGd) 0 £ d) 3 -P P Pi > J3 o

3 CN I Pi C rP g -1-1 C

> in 9 >*3 2 dJ

(/13' 1 3 -P P< oooo -p tn o' 3 3 0 ^Ujp »-Ooo p c -p M w 0^1 >-oo :3 G U oi d

G i «- Ο :3 O :3 -P d) -P

31¾ — 2 > G O d) I C

< P P :0 Pi G B -P

'p G 3 Pi P -P O .G

j. Φ ·Η ^ (lj flj Ή

P* T3 Pi ·Ρ 4-1 -P G O

ρ 3 en ui rp o tn H o d) X ίΛ :3 -P 3 • X ρί > Z > > 4-i

Q

i ....

P »— (N n

>1 En I

(N

X

77251 23 g + l Φ c

•rl H

(ö > x: 4J Ο) Ή -P rH 0 o o tn c 3

•H ' 4J

nj rt i •r| ·Η Π* ih σ> u

:rd O

> rH C

•rl «5 dJ

4J fid) c me •H -rl O G Π3

ro XI -Η -H

O 3 -P Ή > ,- X 01 :π3 P I r- r- O G -H >

(0 I O O O -H G

oi 1 ~ _r* _·* o g ΰ o· 555 h g»« H ^ !0 > CP G -t-1

C -HP

C G :rg H *- co -<r vo :2 - § .3 up in co cm G fOK-fo

C — ·- :0 -P M 4J

O'- ,.,1,.,. Pi -μ Ο Ή G CC +1 +1 +1 +1 pi CD .G :3

p ^ <Ti rr oo o S > -H

£<J oo^rrMr-' 01 -hp>-h 3 i cm m co Pi — nj οι oi J> -P >.£-3 3

£¢3 cm *- WrH^ItC

3 33 0 W :t0 ·Ή

O O £ > — > :rfl -P

M G I μ ·Η :it) l/l

Pi > e m ¢) -μ +j h 3 οι -3 x; e rH c rH g <; λ; μ -h :g o

3 -H I oi -H o 01 CP

AGO) cd > X} -h g EH o jC P! -H 3 01 go. Ό Pi 3 μι e μ G G -η O CM Q Q) G -H pi -rl

JG 01 I 01 Ό o G

330. Pi G Ή -o 4-1 > 4J μ >i ra Ξ o in n E I o o o ρ p ^ oi 3 0 1 rnoS -3 oi Cp G > «CG 1 — o μ G 01

G Ή :G G 01 G

< :G O :G CD <U

I g > G <D ·γί

o. μ :0 G O

μ e G Pi -3 oi

Eh <D -P Pi 3 G

I Ό p; -H ·3 -μ

Q 3 oi 01 r-H I

I 3 0) Pi :G £

μ « pi > > CD

>1

Eh ...

I r M ro

CM

K

24 77251

-M

CD I

C CD I

-H f—Η m ο a

-H

i—I - C

:rd fTJ CJ

> -H CD

-H U> C

4-) O x C r-t 03 -H 03 Ή

0 C '—I

XI Γ3 :o3 3 >

Xi c m c -H c 0 ,— __ , -H 4-1:03 > I «- o o o u) ε 54 ο Ο Ο ο Ή H :0 o3 1 * *· - *> ε c4-i 1 Ο ο σ ο \ η _μ 0¾ vvv tj, cr> :rt$

>-i C 03 E

•X* :03 H :03 C x>

C *H f-H

.-, cn in n co '2 £ ^ x ·— r- o r~ LD 0 t/i •H <— m ro »— ro χί rg E -x c n: + 1 +1 +| +| +| oi £ -u 0 <l> Q ^ ϋ l) £ 5)

'X »— ΟΙ ίΟ (M r. ^-' r-)>4J

,, E CN 1 - 03 01 0) f d ffi I *- CN 01 O CD -h o3 h g x> z > x: ^ x: g x 3 I G Ci :05 0 <T3 01 03 -X > :o3 σ> O CU >1 -H > ·χ :oJ 03 m m X) λ; -h -o -o

X > I UI 13 G i-H G

G CD CD Ci -X :o3 ^-l

1—I G -G X 03 O 0) -X

3 -X iU U Xl -X G

o3 G cn l G G 3 oi 4J

E-iOOIQ CD 03 X Cl

E G I 01 4-) G G CD

Ci 4-) CU x ui ·χ χ >

0 oi ci >1 O

x:oh x* g —1 ί—i g

G G I I -H O E O

>Co3 — ro O O Ci > \ - -r-i

01 < H 1 "-ro :0J Cl tn 03 O

05 < :03 G G 01 ui

Z I E -H 01 G

CU X :03 <D 4)

5-1 G 01 G CD I G

E-< :«3 CU :0 G CG -¾ I 01 X X -H U x: Q X Xi G ·Η I 0 4 I -H -H G 0 01 13 01 r-l CD 01

H X3 03 Xi :o3 -X G

K >H 4J >1 > > 4-) fM ...

33 i— <0 ro 77251 25 4-)

rt I

c -η rt •H tj> c

4-) Ο -H

C r-l ίΰ

•Η Π5 -H

O 3 --4 £t πί :rT3 3 >

Ai d

ro d -A C

0 -A -4-) :ra > I σ ο ο σ tn £ M I ο ο σ σ -H -H :0

rt ' ~ ~ ~ ,-T S C 4J

1 O O O O o jJ

oa vvvv ^ CP :<TJ

u d rt E

-M ert

-A :ro C -P

> C -H Ή o co ex uo r- :9 S :!5 C m rs) o ro *3· Ai Q tn •A o-)r-T— pj Ai rt £ Ά d td +1+1+1+1+1 en s 4-> o rt O Ai H rt -d rt c<3 oM-^rvon.— ^ „ 5 :c Π

•H | ro ·- vx) ro -h ?> -P

h £ -Τ'1 - rt m en L_id -d * 04'— — O rt Ά rt Ά >4j3 > x: ά a: d

X 3 1 5-1 S-4 :rt O

rt rt rt -A > :rt tn O cu >i -r-i > -r-t :rö n3

Ai «j dl At -h 4J 4-1

Ai > i en τ! d ή rt

3 rt (B 54 -rl :fl H

·—i e ·£ Ai rt O en -A

3-i-t O. t3 A3 -i-t nj

rt d oi l e d 3 en -M

E-«oenQ rt rt Ai A

E 3 I en -M d rt Q) P4-)CU Ai en -A Ai P"

O en 54 >i O

XI O £< 4J d ή m-i d 3d1 I e o o -a OS rt >drt i ro o o o p > - -m

tn<H · ^ ° g :rt A tn rt O

rt rr, ° :rt rt d en w X l o £ ά en rt di ro Ai :d rt 4-) M d en d rt i d

Eh :rt QJ :0 d td -H

l en Ai Ai -a O 4d

Q Ai Ai rt -A

I a) + I -H -H d o M ^ en r-4 o en >1 Xt (0 Ai :rt -H (0 H >4 4J >4 > > 4-) 04 ...

td T- OI CO

26 77251

+J

<D I

C ID I

•H I—i tO 0 o •ft <—t - c :<0 to a)

> -HQ

-H t? β

4J o H

C <-H to H fO Ή O C f—t

XI to ;tO

d > λ; c m c -H c O ,— -H -U t(0

> I in m o o in B

U I C O O O rH -h :o

P ' o o o o \ O+J

ο Λ S S V V ^ 0 £ ^ Ά c to ε Π-* :r0

•r· :t0 C -P

^ C Ή ,—I

_ o cd ο o C:t3 C in σ-ι o r~ r- -V Ο 'Λ

•H *- «- fN X to 6 -H

c k +1 +l +1 +1 +1 m s ί o M

rrf cr> -r cn «τ o ^ ^ 5

,, <N CM Γ- O O >1 to c D

Γ . I tM -3· <r cn -H > -u μ § ^ - fO w m

tx d g OO-HtO-H

0;-ι-> 9 >x:^-ixic

^ d ' P H :to O

Λ (0 3 to -H > :t0 Cn o a· -H > -r-t :t0 10

·* to 9 x; -η -P -P

·* > inTOC'-td

3 β> dj U -H :t0 r—I

TjC Λ xttootn-H

3 -rH (X Ό X> -H (0 tOcrnl CCdm-u E-iotnQ (Dro^vj

Ed' tn+JdfOOJ

P -P fx x in -rH x >

O in SH >1 O

ΧίΟξ-* H-iCrH-mC

d c 1 ιοοσσ -h o E o >c<0 nooo H ^ * -n

insCr-j I moo :t0 Η σ' to O

to < mo ttOtOdinin rA J_ rn S Ή tfl <3

^ :rtf 0) 4J

,Η c in c m I c

Η :ιθ ID :0 c S -H

I in λι x -h tj x: 9 xi to I CL) + I -rH -Η β 0 P Ό in rH <y in >ι X (0 -V :t0 -Η r0

Ep· X -U x > > .u CN ...

LE <— oj m 27 77251

03 I

Q) <U I

M I—I SC

O U + l *· £ <0 m Φ -O -HO)

-O 01 C

<U O -H

C -Η Γ3

•H rO -H

(0 C Ή

-H rO :rO

ι—l > :(0 c > Ή £ τγ -H -Ο ::0 O -o tn £ > I m — o 5 '2 :9 OM 1030300 -H £ -o

M (0 12 2···* 0 0 4J

jj I O o n 0i :rd

-H _ s V -¾ m E

>a x :ra

£ £ -O

r" -Η Ή f—I

•H £ :(0 I—I o 03

«a· r* m r> m prtiS-H

S ^in^rvorn < .2 S 03 C <— 0i -O 0 -h k +1 +1 +1 +1 +1 c <u .£ ns E u £ £ -h

:>< 3 < g} ° 8 Ξ S :as >+J

h 4-1 <n ™ tn w X 3 5G :0 Ή £ Ή 3 2 r- ,χ γ-η :r0 Λί £ o 04 I o: 2.

d) Ή «>, > £ 00 0> x > r* [)1 W -Η :0 Λ

3 Cu χ 03 -O -O -O

,Η £ I >, ~ £ Ο) -H 3 3 -Η 0) Ή W :·Ό Ή ιΟ £ XS * d) O Ji 0) ·Η ΰ O & O .£ Λ >ι -H <0 ^ E I >03-00343

O Q M -H X -H O

O I to > £ -X Ό Qj £, Οι -Η -Η -Η Ο χ >

3 IN o M Ό 0) O

> Μ μ 03 O iH E "m £ 03 3 I Cl) ιβ E o rö -O I o o o o 3i fl \ m » ·η

X en ,_i Imooo £ 0i to to O

OkC 1 rnco £ ro £ -O 01 03 £ 1 π 0-0-003(0

£04 ^ S 03 03 -.ro -O CU -O

<£7 Λί £ O Ο I £

£ >4 £ :0 £ X -H

, -O O 3* M -H U ,£ ö -h > jc (0 a -h

I U O -H -O -H £ O

i_i :r0 (0 03 r-l O) 03 ·>, :c0 -3 jsi 03 :r0 -H 10 9? s x 2 > > -o CN ....

►g t— (N m rr + 1 28 77251 fd

-M I

4-1 QJ I

QJ .H 23

C O U

•H

td » c ή go r—4 Ή φ

:id tp C

> ο -H

-H I—I rd

4-4 rd -H

C G Ή H rd :<d 0 > XI c

G -H C

X 4-) :0 0 G W g > Η -H :0 g? I ^ g 1 ^ 0 ϋ 1 12*.» 6 tP :0 X* rv O o ^ rd g

•H v ν' tP :G

> G G 4-)

Ή r—I

G :<d C :¾

-H C 0 W

:0 rd g -H

G ° ™ X 4J )4 O

q)t- ^4-)0 G K -H 0 2 (d

HO +1+1+1+1 « c G-H

g < III X -H > 4-1 G J; 5 p IN >( ·— O tfl U)

x 4-1 S-H Id -H

x G 1 «-O - W r-i :0 C

Id _ O Cfi :rd + 0 0^4 <N >'— >C:GCp

X rd jc U -H :0 :id O

»>>12 o O 4-) 4J 4->

3 I Ή .G G O »H G

,_|C C Λί Sh -H tn :0 -H

3 -H G cn -H 0 Μ !Λ -H

mG n d) > XI >i -H rd

cj O I X Ή G 4-> U1 -P

g <U Ό X -H )-1

Mr* C *4 C ,X 0 0) 0 rv OG-Hi-iX>

.G I Ο Ό <1) O

G CN q M G Ή g -n G

> W I X rd g 0)

u5drv -p-u^id-TP

0 4-> |7 I O <-> r-, -HUldPIdrdO

* ω £ l°o§ u G +) w w 0 V I «-o :o c 4-) tn rd G iU :G 0 :id -H O +

G 4- g > C 0 0 I C

< 3 P :Q Λί C 2 -H

, cgxh-hOx: α CD ·Η pi 0 0 ·Η U Ό Λ ·4 4) 4 c 0

pj G m (Λ <—I <1) CO

I G J) Jl W :d -H G

Q X+iX2>>4J

^ f- rN n ^

H

(N

K

77251 29 i

M

3 I

C 3 I

•H -—I a 3 o o Ή

r-t - C

:3 3 3 > ·Η 3 -h cn d 4.) Ο -3 C Ή 3

-H 3 -H

O dr-4 Λ (0:(3 3 >

Ai d n d -3 d O r— ·Η -iJ :3 > I — 04 o c/1 6 >-l I O O O r-4 -H :0

(0 1 ~ e d -P

' v V v ^ o 4J

0 CU tr> CT> :3 ρ d ίο ε 4-) :3 •H :3 d 4-) > d -A --4 r- co r'· ro :0 d :3 d va r- --£> in Ai 03

-3 *- — ro Ai 3 S -A

-- ,1,1 i,i ·γ4^4-)Ρ3 dS + I + I + I + I 3S4J0 3 q vor^o— Ai W 3 Xl 3 C < T7* «X; rn tt Ξ>ι CO C 3

•H *— <*τ r") *3* —' M>-P

., g 5 I - rd ' oi ca

9 CN 0<U*Hrn*H

^ 4) . > a ^4 a* d λ 3 3 P P :3 0

„ 3 O 3 -H > :3 CD

0 Q, l·-! -H > -A :3 3 x 3 · a; -h 4-) 4.) A4>3 MOCrH3 3 -d 3 3 *3 :3 --4 --4 G ^ Ai 3 O 3 -3 3 -H Ό Λ -H 3 3 d r-j 9 dd334-» E-· 0 3 3 3 A! 3 E 3 P4 3 -P G 3 3 3 4-> P Ai 3 -H Ai >

O 3 V >1 O

Λ 0 I -P G -H to d 3 d 3 I -Η ο ε 3 >£4-—· I T— o O p > \ - ·Γ~ί m § < » -o :3 3 CP 3 0 3* :3 3 C 3 3 « P4 E -H 3 3

P Ai :3 3 4J

t4 d 3 d 3 I d * :3 3 :0 C S -3

Q 3 Ai M -3 O XL

I Ai Ai 3 -3

3 3 4- I -H -H d O

•3 -O 3 r-l Q) 3 K XL 3 Ai -.3 -3 3 I >4 4-) >4 > > 4->

<N

a ....

t— (N ro 30 77251 -μ

<U I

G CU I

•iHI r—H

cd O O

rH

«--< ** c :rd Λ dl

> -H QJ

•H tn G

-G O -H

G M cd

Ή fd 'H

O G M

Λ cd :cd G >

22 G

C Ή C

0 r- Ή -PM}

> l o o o tn S

P I O O o rH -H :0

(fl 1*1·^*- g G -P

1 v S S <· o ^

Op, vv j-p tn :cd n G Cd 6 -P :d

•H :rd G -P

k* G Ή 1—1 cd (N oi u :0 C :d G tn ld "τ· rr O Λ

•H «— rsj ro Ai cd £ M

* , I i,i -h -p p tn

G 2 +1+1+1+1 tn S -P O

G U en tn r» «. Ai 2 G .G cd g <1 coocnS ^ cfl S 5 'Ί

H I OO o o · -H > -P

Mg - td UI CO

Md CN <N O O M ra -H

X! -P 2 > »G rH Ai G

XI G 2 P M :rd O

cd I td m > :td tn O a σ> -H > -H :td Id

Ai cd p 22 -h -p -P

2<l > < UI Td G M G

G I <U P M :rd M

H G (U 22 ta 0 tn -P

G Ή XJ T3 Xl M td

td G cn P p G G tn -P

H o ui i ai cd xi μ

S G Q tn -P G ta G

P -P i x κι ή ^ > O tn Pj >1 o

.G O p -P G rH -n G

G G H I -H O £ G

> G I — no μ>\*·η

tn nj 1 *“ idPtnrdO

cd rH :cd cd c <n tn xi <c ε -h ω cd

I 22 :cd G -P

Cu g tn g g i g

p · :cd G :0 G 2 -H

En tn 22 22 -h u .c i 22 22 cd m

Q G + I -H -H G O

1 Td tn rH <u tn tn JG cd 22 :td -h g

-H S* -P >i > > -P

35 1 ...

(M «— cn n 2 + 1 31 77251

<TJ

0 I

0 0) I

a) rH 2 c o o Ή ft ' c •0 (tJ 01

0 -H (U

:it <7> C

> 0--1 *H «—i (¾ 0 (0-0 C C 0 •H it :rrj O > Λ c

3 0 C

44 0 :3 O C we > -Η -H :0 0 C 0 O O I m cm 0 O 0 0 1 ! en CO o E tr> :nj

0 '22- \ ιί E

•H Oj O (ji :rd > s C C 0

*H r—I

C :it C :rt

•H COW

:θ (0 E -0 C cm vo oo vo -¾ ϋ il “

Ο T- co m vo to 44 0 O

C a — id w -H o a ο

•HO I * . W C 3 H

H S <j +1+1+1+1 44 -H >0 I—1 3 ~ Ln _ >i — it MU)

m 0 m ^ 2 iC S -η <β -H

«*< 3 cm ,_£j > W H :d Ji C

C <t I o 01 :tt 0 O

Cu o. > — > C :<t tn O it πϋ 0 ·Η :0 :<t it y > 5 (,3044+)0 3 *7 -h a c ω 0 c mCc· 44 0 -H U) :it 0 JZ -0 Jt M 0 O 44 W Ή 3 C rn (U > Λ >i -H <t m0| 44 0 3 0 W 0

Eh M m Ό 44 0 0

^0¾ £ 0 C 44 ft <D

O £ O it 0 0 44 > a ι μ t <U 0

C <m Λ 44 C 0 E -n C

> co , >ι Ο E 0 ϋ)3ό 00\π3-·η

(Ο0Γ7 -HWCriititO

t4 U) £J I 0G0WU3 O, ! ' co o :itd 0Ul(t C i ' *- :ra O :<t -H O 0

C "J g>COOIC

«< 3 0 :0 44 C S -H

7* C (t 44 0 0 CD a 0 <D -0 44 it it -0 £7 Ό 44 -0 0 -0 C 0

£7 c w w 1-0 O W

v 3 (D 44 Cfl !it -0 it ^ X Ji >< 2 > > 0 1 ....

T- CM CO Ttf a

CM

a 32 77251

W I

o cd I

ϋ h x

o CJJ

+i

- G

g id o 4J -HO) -P tr> c 0) Ο Ή C H 3 •h <a -h <a c --1 •H re :ra rH i> :ta c

> H G

Ί· -H 4-1 :ra

0 -P tn E

Λ > I m e H :0 2 ra \ % ο oh s iu s' 3 Ϊ1

> Ai :G

c c -p

G Ή Η I—I

’H C :fa un how

G o <n lh _ g ra E H

0) r- (" -ΓΓ \ _p P in

G T- +1 S' H O

> e o J +l +l +1 +1 c g § .3

H3 < in CO -r n [" :¾ H > -P

X H fNr^cntrr- c fa win X 3 I I OJ oj r- :0 H fa h

G 11 Ai H :ca Ai C

OO) IN Ai :G -P O

·* G K H 2 > C :m

X > Z W W -H :0 :G nJ

G I Ai cn -P -P -P

HC G ^-"GCUHS

G -H H H in :G H

GC Ο * 0) 0 Ai tn h E-*0 I Ο £ Λ >ι Ή fl £ i) > ρ g -p tn -p >H ,C P Η Ai H Ρ o a ta > e Ai g o G I Ή -H -H p Ai i>

G IN Q Ai Ό 0) O

>tni ini-iHg-nC

tn g a ai m ε ai G -P p . Ai T3 G * "f—i

X «H I *— m o C O1 G G O

01 i 2 ° e g e -P tn tn

Cg ai -P +j tn ra

G h tn tn :G h 0) -P

< < Ai e O G I G

I >, G :0 Ai G K H

(¾ -Ρ O .X P H U G

P H > Ai ta G H

En p P H -P H G O

i :ta g tn h g tn Ω :rn -H Ai en :G H g

I S Ai in S > > -P

tn •H · · · · K *— (N m ^ ΓΜ

K

77251 33

G

+ 1 Φ C

•H ·Η rt > x:

4J <D -H

-P rH O

(1) O tn G rt

•H - -P

rt rt i

H Ή Z

rH tT> O

:rt O

r> <—I C

-h rt rt -P G rt

G rt G

•H -H

O G rt

m „Q -H -H

O , 3 -P Ή H I O O C -H >

rt “> »k -H G

OI o o O G

P o Sv rH Cr> :rt P a g rt e -H ^ :0

> CT> G -P

G -H -P

C in rr r- g :rt -H ° £> J» :rt O g ^ G rt S :rt

G +1 H-l +1 :0 4JP-P

(U r- I I -r 1 ^ o rH

G a novo Ai rtx;:rt •HO inincr, -H G 3 tn HO 7 T ° tn -h > -h >3 m 1 ' _ Ai -« rt tn tn X -P 35 >i S -H rt X 3 Z W rH Ai rt

rt I o Cfl :rt -H

O Q tn >—>:rt-P

Ai rt p p -h :rt tn

Ai > < rt c) -P -P *H

3 O -H x; G rH G

rH G E -¾ P -H :rt O

3 -h O tn -h o tn Cn rtC Z rt>XJ-Hrt

EH O I A! -H 3 W

g 0) Ό X 3

P ,G G P G rt «H

O (N Oh <D rt ·Η Ai ·Η XJ tn I tn zs O rt

3 3 Q Ai G rH -r-i -P

> -P i >i rt S P

tn tn £, -P -p ^ - ti) rtOpI -h tn tri rt > X G gi — o P G tn G i ' *“ :rt G tn e

< ta :rt O :rt <U <U

rH g > e ω -Γ-Ι

0 P :0 G O

1 G rt X -H w a <D -h a: rt rt

>H ZJ Ai Ή -H -P

En 3 tn tn -h i

I 3 tl) Ai :rt Z

Q X Ai >1 > O

tn ...

-rl «- OJ n a

(N

a 34 77251 tn i

(U Q) I

Ai f—I H

O o + l - g tO ro 0) -P -P Φ

-P D> C

CU O -P

£0 Ή rO

*P Π3 *P

(0 G ι-Ί •P rO :r0 Ή

:<0 G

> -H C

'T -H -ui :rö O -P UI g > ! m — G H :0

OP I V) o -M C +J

M i0 I 2 - O O -P

4J I O X, CT> :rö •Γ* ft V 3 ro g > AI :t0 g g -p

G "M -H f—H

•P G :o5 c VO VO rr 7^2^

S r-nuo S ^ c -P

CU ^ Jp p U) G <- , , CP -P o

P K +I+ + G 0) £ O

t- g O G G -P

£ 3 ^ esi ro \2 uo ··« -P > +> e 7 ac TT r= O) G G tn en

5< G S :θ -H G -P

nfl f — AI -P :i0 AI G

U Q e « p q > G1 ui M -P :0 :r0 rö

2 V AI e/] -P -P -P

'qc ' - g m p o

2 ·Ρ 2 -P tn :.0 i—I

f” ^ cu O x tn -P

** o 7 OXJ3>.-Prö ε Λ >mg4->ui-p p V P -P Ai -P p

o ' <0 > G AI (0 CU

ä “* -p p -p p ai >

3 CN P Ai Ό <U O

> en 7 ui P >—i E -n β tn G ' cu co g cu tO +J to | AI Ό N n) - -n « en 'p <- o GCnctjtoo 07 *- e ro G -P en en

Ci. <u -P -P en 10

G P U) en :rd -P CU -P

< £ AI G O CU I e V >1 C :0 AI G a: -p Λ -poaip-pux: 7 -p > x ro to -p

' P P -P -P -P G O

x o o «1 h ui tn

7 :nj -P Ai en :c0 -P G

^ s AI >4 S > > -P

t ....

7 i— CM m -TT

CM

K

35 77251

οι I

CD a) I

Μ Ή 33 ο o +1 - a

3 3 CD

-P -P a) -P I? fi

0) O P

G h rd

*P Γθ -P

3 C rp -P (¾ :3 i—i >

:3 G

> -PC

•«r -P -*-1 :(0 o o 4J ω £ > I ro ·» G -H :0

OP I ^ o -P C -P

3-1 (0 I Z v 0 0 -P

-PI XI Cn :3

-H n 3 3 E

> Ά Μ :Λ

G C -P

C *M Ή iH

-H C :rtJ

vo m o

C r~>— o £ 3 e -P

(D r- ·— CO \ 4J p 01

C , I i I , I CT>-P O

Η -P K +I+I+I C CD £ n) h 6 U ro m u> cd 5 ? 7i

>3 < a ro cn co ·3 -P > -P

s<-P O m G 3 οι oi X 3 (N :0 ·Ρ (0 ·Ρ (0 E *“ Ji! H :fl ^ d oo. u x: ^ 0 «J a -P 2 > G :3 C> 2 > 2 0) ω -P :θ -.3 3

a I in 4J 4J 4J

I—I C in >i —' G <D ·-* 3 3 ·ρ s* -P 03 :.3 Ή

3 G ,3 - 0) O X 01 -P

HO I O .G Λ >i -P 3

£ 3-i 3 -P 01 -P

Pa P -P X -P P

0 a 3 > c x 3 <d si I -p -p -P p x >

3 (N Q X Ό (DO

>03| 0) P rH 6 -n C

01 3 n, CD 3 £ <D

3 -P p X Ό ^ 3 ' ·π

X 01 £ G tT> 3 3 O

O I , G3C-P0101 G 3 I ·— o <D +> -PW3

C,P I ¥ 03 01 :3 -P I) -P

<3 a G O 0) I G

, >, C :0 X G X -P

λ 4->o-*m-hux: i7 -P > X 3 3 -p £ p P -P -P -H c o I 1(¾ n) (/) »H Q) (ft r\ :nj *Η ^ C/} Ή rd

I 2 X >< 2 > > -P

01 •p ....

►y <N CO *3*

CN

a 36 77251 + ι rd

44 I

4-) Q) I

<D i—I S

c O o

-H

ra ' c

-P ia (U

r-H -H QJ

:ra Q1 C

> O -P

ή <—ta -p a -a

c c iH

•h a :a o >

Xi c a -pc '•a* 44 44 :3 O — c a g > I ro o -h -a :0 P I en o G 4-) o a i 2 ·* rH 0 4-i H i 5 ε σ> ;a ^ o. ^ g e •h tn :a

> G G -P

*H r—f G :a G :a LA Γ0 CM G O a

o en σ> :θ a S -H

G 44 4J G a

O r- .i.i.i 44 44 O

H G K +1+1+1 -H CU .g a

H‘ä^ ro lT) LO aCG-H

H § ^ LAOLLA 44 -H >4-1 >3 LAAjro >l a aa χ -g il s -a a -a x 3 - ω r-ι -.a 44 c a o en :a 4J o O Q* > ^ > G :G tn 44 G a) G -a :0 :3 a 44 > K a O 4-) 4-) 4-t

G Z -H-GCOr-IG

rP G I 44 Vt a IB ·Λ h 3 -a 3 a -h o 44 a -h a g p «n > jq >1 -h a E-tO o 44 -p 3 44 a 44

S I 13 44 -H G

P φ G P G 44 a <1) O 43 Φ a -P P 44 >

-G Oi a 13 d) O

3 fN I 44 G Ή £ το β > a q >, a 6 e o <u i e

< I-I P :0 44 e 2 -H

< e a 44 p -p o .e i a) -h 44 a a -a

Q. U 44 -p 44 -P G O

p 3 a a fp φ a EP 3 dl 4ί (Λ :a -P a | X 44 >4 Z > > 44

Q

I ....

a f (N O ^1 Ή

K

A)

K

77251 37

G

+ 1 CU G

Ή *H

G > Λ

+) 0) -H

P Ή O

<u o tn G (tl

H * P

m g t

-P -P K

i—I en O

:G O

> rH G

•P (0 <U

P CO)

G (d G

•r4 ·Η 0 G id m p -h -h

O G -P rP

> I r- ^ tn :td O I o e -P >

id 1 * -H G

OI O o e M λ v rP en :td P a e G £ •H '-s :0

> en e -P

G -h -P

•h ss * § ;|

G G £ :G

G , ;0 -P O -P

(Ur- +1+ X -PO1—I

CSC „ X G .G :G

-PO S Ξ -P G G tn y £ <3 [n— tn -p > -p t_i g il ^ — g en tn

X -P >1 S -p G

O G (N W rp X G

G K O CO :G -P

002 >— >:G-P

M G I P -P :G tn

X > U) GO-P-P-P

G >, -P X G —I G

r-Η G GI PC P -P :G O

3 -p I en -P O tn tn

G G G O > ,0 -P G

EP o p X -P G tn £ cu ό p: g P I G o G G fp

O <N Q G G -P P! -P

p m i en Ό o G

GGOj pi G H ·η P

> P p I >i G £ M

en tn eh lo P P ~ G

G O i lm -P en o1 G > « G r-ι p G tn

G G :G G M G

,< > :G O :G G G

I £ > G G τι

CU P :0 G O

p G G Ρί -P tn

Ph G -P Pi G G

I Ό p; -P -P P

q G Ui Ui «-I l I G G Pi :G 2

en « p; ^ > O

•H

k ...

I T- <n m

(N

X

+ 1 38 77251 Π3

4-) I

+J Q) I

0) -H 33 c o u

•H

fO - C

•H <0 0 -H -HO)

»o d» G

> O -H

•H i—I r0

4-) ro -H

G G *—r •H r0 :3 O >

XI G

3 -H c ^ ^ 4-) :t0 O G tn g p* | ro <— -H H :0 H | t/3 O G 4->

O ro I Z *- rH O 4J

H ' 0 S Dl :r0

-U CU v \ ro E

H Di :r0

> G G X

•H r—t C :rO G :3 'H 04 r- en ί O ” m m *r .0 rO 5 -h

G Λ! 4-> G tO

o i- .il x: x o G 33 + | +| + i -H O .Gro

HU (Λ G 3 -H

g « SSo x ^ > u X ^ i— i— I— 3g -—· ro tn tn >< -*-> I S -H ro -h

χ 3 *· W i—i :rO G

rO O UI :<0 X O

O ^ oi > ^" > C m3 Di rO w G -H :0 :rO <0 2>S t00)+J4J4-) o I Ή X G 0) Ή 3

_|C rn X Li -rl U) '.ITS '—I

o -H J tn H o X tn -h rt G j m > Λ >1 H ro fh o i x -h 3 x tn 4-)

Em Ο M Ή G

H 3 G G G X rO 0) 02 d) ro -H G X > 33 , to το <u o

3CHq -M G Ή S "r—1 G

> w V >. ro E d) tn 3 n I -U 4-1 \ tO K ti

t04-)h7 | O O -HtODirOtOO

K tn r i^n g c 4-) tn tn O , :rO G X tn to G Λ :rO O :rO -H Φ 4->

G 3 E > G O <D I G

C γλ M :Q 4i G 33 -H

1 G rO X H -H U X

0 dl -rl nj ro -H

rr ό -h 4-> -h c o 2 3 tn tn rH cj tn

7 3 Q) X <Λ :rO -H G

Q X X X Z > > 4J

1 ....

i- oi m ^ 33 04 33 39 7 7 2 51

Taulukoissa I-XXX esitetyt tulokset osoittavat, että keksinnön mukaisista välituotteista saatavat peptidit voivat saada aikaan kasvuhormonin merkittävän vapautumisen aivolisäkkeestä in vitro.

5 Lisäämällä erilaisia muita hormoneja, esimerkiksi somatostatiinia, testoteronia, kortisolia, insuliinia jne., edellä käytettyyn inkubointivällaineeseen voidaan tutkia, mikä vaikutus näillä viimeksi mainituilla hormoneilla on kasvuhormonin erityksen säätelyyn.

10 Keksinnön mukaisista välituotteista saatavien pepti dien kasvuhormonia vapautava vaikutus in vivo tutkittiin seuraavasti, CD-1-kannan naarasrottia sijoitettiin vakiolämpöi-seen huoneeseen, jonka lämpötila oli 24°C ja jossa oli 15 14 tuntia valoa ja 10 tuntia pimeää. Rotille annettiin ra vinnoksi Purina-rotanruokaa mielin määrin. Kaikki tutkimukset aloitettiin tuntien 0800 ja 1000 välillä.

Kullekin naarasrotalle (21 vrk:n ikäisiä; kahdeksan rottaa kutakin taulukossa XVI esitettyä annostustasoa koh-20 den) annettiin vatsakalvonsisäisenä ruiskeena haluttu annos esimerkin 1 peptidiä. Noin 15 minuuttia ruiskeen antamisen jälkeen rotalta katkaistiin kaula. Rotasta, jonka kaula oli katkaistu, otettiin verinäyte. Verinäyte sentri-fugoitiin ja siitä kerättiin seeruminäyte. Kustakin seeru-25 minäytteestä määritettiin GH, rinnakkaismäärityksenä, tavanomaisella radioimmunologisella mittauksella (RIA). Kutakin annostustasoa kohden saatujen GH-arvojen keskiarvo on esitetty taulukossa XXXI-XXXIX.

40 7 725 1 w c •H 0)

:3 -H

oi 4-1 •H 4-4

05 O

c p o

> CC

i—I 3 Ή c a £ -h -h 3 3 o 05 C 05 •4-5 c ra ra ta -u

O > 05 I

> na

•HO iH :r3 O

> U Jtnn 5 £ c

C 3 °. § g ° ^ S ^ -H

•Hl O c C X 4-) E

0 v V 05 Oi 3

C ^ :ra '—· QJ V-I

0) C Qj CL) C :0 0) 0) •H >1 £ fl 01

H E -¾ H C

X 3 — — CN <- 00 -H H <UC

X -P 05 > QJ O)

X e «- X Ή Λ! -H

ra k -t-| +i +i +| +| >1 a oi -u

O Dj O 1 1 1 1 1 C -H -P

3 < Ί* - N tN (N »ra 30

X > 00 O Ό PC

3 > C 3 Ή C H ra :ra :3 i—l 3 Ή 3D -P C Ή 3Com -h o) £ 3 3

H O K Di :0 oi -P

S S 01 C 3 -P -H p PI Q5 O -H O :3 Q5 005 X > £ Ui Ui >

Ä X P 3 -H

3 Pj C 3 P >-i 0) 3

>1 3 -H 3 -P C C

05 Q 05 ,ϋ 3 -H O 3 3 1 X Ui Ui X > 4-4 X Qj >1 05 p 1-t 4-5 _, P -P X --4 3 3 3

^ EH -h e E X P

05 I P + I \ 3 p 3 3 :3 Dl 3 05 05 -Pr—13 :3 3 3 3 -P > 05 <C Ήτ-οοο 6 -P "-v-P 3 01 ·Η ·»»* ·» -P -P > 3 CDj 3 α 'H- ° g C 05 :3 -H 3 CP 4-1 2 3 X C O -P 01

<CEhP 0) 05 :0 X O -H

13 X -H X p 0) E

Q > 3 3 X 3 3 3 I p -h +j -P p

Ui x: Ui 13 •H . 3 :3 X U5 K 3 K X -P >h Z C5 3 CM ....

JC T- γμ n 77251 41 tn I ·Η

tn S

•H 3

3 H

M d) 0) oj tn

4J

tn c

•H (U

03 Ή rH 4-> o3 4-i

C O

O H

JZ

O ·Η cc

>00 d) -H

-HO -H T3 .C

> > , tr S -H -H

S 5 § § ^ <U O

G 03 i - - Cn CO) •Hl O O O C <d o3 n V V V 05 4-1 e ^ :n3 ui i 0) C te

C :0 rt O

h -h X —- -h

HE a: 2 o3 C

m i «- *=r m ro -h W -H -H

x 4-1 04 04 ^3· tn 0) 4-1 E

x e T- x ~ a e

03 E +1 +1 -4-1 + I tn (DH

o o. o 1,11 a) a <D

Ai oJ VO <Tv VD ' jC 0) a; > ^ i^· '— oh o3U)

3 DC *“ r-C4 >-HC

iH C O H > dl C

3 -H I 0) -h ai a)

03 C W -H T3 X -H

Ph O >i Λ! H U) 4-1 E O 0) 03 03 Ή 4->

Hl QJ Ό -H 3 O

O ω X C £ H H

4C JC 03 3 3 3 C4 e 4J U 3 Ή

>1 d) UJ 0) C -H

tn Q 0) 0) d) 03

o3 I X C tn o) -P

W a >i 0 -H H

04 h 4-1 > >H 03 0) tn eh -h h E <h > 3 1 H 03 ^ 03 -ι-l oj ιΗ :o3 -H &i C 03

tn .-H ,3 :o3 Ai 3 O C

OC □ o o o Etn X 3

Cl 1J ·* ·- *» d) -H 4-> < H I. ^ 0)C4->03

Eh Dj tn 4-1 :θ O H

l ·> X X in u

Q ^ 0) Λ X 03 <D

I 03 4-1 -H 4J > tn jC 4-i tn i •h td d> X te 3 DC X Ai >h O en (N ...

a *- 04 ro 42 77251 m

I -H

UI g •H 3

3 M

P CU '

CU

CÖ UI

-M

m c

•M CU

rö -n

i I +J

n3 -P

C O

O M

S

O -h C c

> rr Q> -H

P O _ i—I T3 x;

^ ^ I o"> O (N O ε -H -H

P I Cd O O O \ <u o C oi 12*·*«. oi CU) H 1 w ° S c 3 ra

Di VV rt -M

C :rd U) I

CU CS

H C :0 :ii O

H -H X -H

H g ^ ^ ^ X S C

^ p{ <N m in 1— m -H td -h -h

X S m ui ui -P G

3 K + I + I + I + I + I >, cu P

o Dj O _ Q) p_, CU

s 3 <3 ^ ^ ^ " - s o ^ LT) O'* fN Γ-- r— O &-< U)

3 S m ro η > -p C

Ή C Z P > :ta CU C

3 -H l 0) -H 4-> a) 0)

Λ C Ö1 -H Ό e X -P

E-* O P S P :0 U) -P

S < in nj nj 3 -h d

M I Q) V -H CU 3 O

o cu x e ε en p p ss ta o s 3 3 S C .p p >, ta ,-t

> I CU U) CU S C H

tn q en cu -h cu ta ta i x e u) s to -p

X ™ S >, O P -P P

U) P -P > ,H <U 3 <U

3E-· -P P ε ε S > S I o p 3 3 en ca S :3 -P Oi 3 3 3

O rH -P _ „ :3 >d 3 3 O G

CC 3 °_ Hu) \ S S 3

Ci s ,— ro o o n) -p-H-p

CS p ro e S :t0 'H S

P CU 3 C O S ta

tn > U) +1 :0 X O P

i λ; x p en p Q en s s en i •h ta cu x m x 3 K X S >1 SOU) CN ....

S t— o) ro ^ 43 7 7 2 51 to

•H

I 6 to 3

•H M

3 0) )-i 0) to (0

-P C

to 0)

•Η -H

3 -P

H -P

rtJ O

G P

O

o x: ö c > ts· -h <d ·η

•HO Ό X

^ rH Ή -H

Vi I n m g O 0 c 3 ! g g ° < c « -HI 1 ^ ^ o Co ft! 3

CV v G 3 -P

C to I

S :rd 53

G G :3 CJ

> -H :0 — -H

MS (j> tJ-\ <— H- 2 Ό C

X 3 - - Pi W Μ -H

x 4J OOtN·— -H CO -PS

X 3 *“ to — & 3 o a ic +i +i +ι +i >, (u a 0

Pi 3 O CTi'S'OO*— ·£ _ίϋ

Pi > ^ CN - * P 3 3

K ^r-mtN Ο Ή C

MG Z 00 > > :3 <D G

3 -H I p -Η -P 0) 0)

tt5 C G 3 Ό G Pi M

Eh O M -HP :0 to -P

g CJ p< ttj <0 -P -H -P

p I to Ό -H d) 3 O

O <U OGStOPP

XJ XJ Pi 3 3 Pi 3

3 (¾ -P P >1 3 <H

> I c w O -P C -h 10 Q <U Q) -H <u 3

3 1 to c 10 Pi to -P

X a Pi 0 P -H P

(MP >ι>γΗΦ3Φ tfl Eh -p P E £ rH > 3 I 3 -H 3 ^ 3 4J3 P -H tji 3 G 3

tOM :3 Pi 3 3 O G

O <J 300O :3 3 ^ -P .G 3

C I jj - - EO 4J-H4J

GO. t: t— ro 0 Pi :3 -P -P

3 P m - G G O -P 3

Eh ·> :3 +1 :θ Pi O P

I 3 Pi P 3 P

Q Pi 3 X 3 3 <U

I CU -P -H -P -P >

to Ό -P 3 I

-H jC tU Pi CO 33 3 X ' >H Pi >H 2 U to CN ....

a T— CN ΓΟ --31 44 77251 tn

•H

ε g g o p > O) ρ φ ro tn

•H

M C

tn φ

φ -H

λ; -p 4-4 +1 o

0 M

> to c

•H 4-1 G -H

> O Q 4-1 ® £

> in <D TJ -P

G P i en lo en o a; -HO

•H(0 I 2 2 2 S W φ tn I -H C ro CO. 3 (0 44

Φ 14 ro I

G tn X

. -H φ O

> P eri vOtacojj -m X G ^ in i- vo {n a c

St! o o σ o rT 'd

+1+1+1+1+-1 -h -PG

O Oh ffi fd CX

r* rt (J ΞΙ Ξ £ X e Q) Φ a; > 3 " . “1 t ° o α φ 3 «Noo.-»- co -G tn Ή G G* Ή r0

G -H z :t0 C G

t0 G I i—l 4-J φ Φ

E4 O G ε G Φ -H

ε Ή :0 Αί 4-) MO Cn to 4-1 tn 4->

01 G -H φ -H O

.G Φ ε tn G M

G Ä :t0 G Ai M G

> (A G M >1 rH

tn I :0 — Φ -P S -H

to a ji s oi m jj to x i λ; w tn Λί tn 4-i tN CU -H C/ί p -H p inM ιη'-^.-ΐφίΟΦ G E-· Ai ε ε rp > 4-)| 3 >1 Φ to «m .h .g en m e to

O Ή -Ρ _ _ _ ^ G M G to O G

G < o ° ° °,. ° Φ 4 \+J £ 5 G I 4-) *— n C3 Ο Ά -P -H 4-)

Dj p .— ro U5 -H :t0 *P 4-)

M Φ Ai Τ3 G O -P rO

E4 > >i P :0 A! O M

i 4-J to Ai P tn p Q -M Ό Ai to (0 Φ I P C -H 44 4-> >

tn :r0 (0 en I

•M :r0 44 X tn EG rO

53 2 tn >h 2 O tn CN ....

2 *— cN ro ^ 77251 45

UI

•H

e 3

I M

tn <u •H 0) G tn

M

c (tl 0)

-P -H

tn -p

•H -P

«3 O

rH P

O 3 > H· c cc •HO O (1) -p

> > , _ TT -G Ό -G

p I 2 -p -h -h £5 3 I § « 9

•Hl o Ή C W

& v ε 3 3

C \ 3 -U

o cp tn i G G x

M -H :3 O

S ε :3 — -H

C3 ocnoo G S OC

Ö -P :0 W -H -h O g Ai ω -p ε 3 r- + t π- | + I Ai —· 0.3

o ft E +I I+I -H <U P

rJ 3 O o ro γη tn cu ft <u

3 > < CN to Ai .G <D

t G | *3 G “

'G -H | - > :3 G G

2d tn o -p -P <U <U

5 O u > 3) G Ai -P

ε5 p p :0 3 -P

p O 3 3 3 -P Ή -P

o g -H Ό *H QJ 3 0 χ o a; G ε tn p p

G m U1 3 3 Ai G

> 7 0) -p P >t 3 Ή

tn /n Aiintu-PC-H

3 Ϊ 0) -H 3 3

«(NS CCtOAitn-P

tn I o) o P -p P

Go tn > rH 0) 3 0) ΐ> V ^ρεε-π> tn n. 3 >1 3 \ 3 o J. rH 4-> ·Ρ O' 3 G 3

G Ph ’P ro o "P A· 3 3 0 G

d, 3- ·. h tn \-P .G 3

<5 -poo :3 <U hJ-P-P

% P ·“ :3 Ai :3 -P -P

7! 0) g G O -P 3

7 > + I :0 Ai O P

n. G Ai P tn P

r 0) 3 Ai 3 3 CU

P T3 4-» -P -P -P >

V G -P tn I

A. g ti ji w s 3 7 « Ai x 2 o tn H ....

£ r (N O -i 1

(N

EC

46 77251 03 I Ή ί-» ε QJ 3

Λί U

tn q>

H QJ

3 03

M

G

ra <d

-U -H

tn 4j

•H -M

(0 O

n rH Sh

ttJ

O C c C

> j *— r— O 03 -H

G I o o χ Ό 3

1Ö I O O -H -H -H

' cT o' VD \ (¾ +j •h · Cn tn i

> o o us c K

»- :ttJ O

C K + I 4- I 4. I :(tJ -H

•HO * ’ ‘ C Ό C

f\j 1— o :0 *H Ή G τ< · *- X +J ε HIO) 2 TiQ® A! S a 3

H ! C | ^ CN -H w Q) M

> H UJ 03 Ui a QJ

X g >, X ~ <\) X 3 o >i ra tn

X -*-> I «DC

3 φ ' Λ 0) C

O ^ rl O J-( d) CU

vj G* n, > Ή X ·<*

vf rtJ I G > 03 -P

q Q rtJ Ή (¾ Ή 4-3

^ I ·Η Ό *H 3 O

qGA a: m ε g m

Jrt "H JT tn (rt 3 3

Sei dj -3 G nj Ή H o ™ 7 a: e ai e -h ε cn ^ ttj ο) ω to G G Ji c-ptntn-a O H-> Ai 03 03 Ή >4 £ tl) f 03 rH (TJ 03 3 O ,7 At G ε Ή > > C u >1 O 'N fl ω G £ 3 +i > tf e m

(tJ<V rH Ή G 3 O G

o -H ro o G «3 \ -G 3

(H * ·> :t0 -H H JJ

,n 4j o o :<ö A! :<U -U

h Sh *" β tn e -U nj

5 03 QJ :0 O G

7 > G X x UI u

}n Φ Ai <0 (U

.Si rd 41 -H -U >

7 3 03 I

Λ 3 td Ai 3d rtJ

•γ x 4J >h O tn o ...

'(M t— cn n

K

77251 47 tn

I H

μ 6 <u 3 •X μ 0) Φ •Η φ G 10

M

G

id ω

μ -H

0) μ H +)

Id O

n ή μ m 0 r- c d c

> I in o O (U -H

μ o o x: τι Λ

rd o' o' 'H -H -H

1 v v <U O

CU -H C w O E (d id > VO \ Id μ

•μ tn in I

> ° ^ £! c K

t- :id O

G B + | +l ·Φ -H

•HU , G Td G

<1 -- O + :0 -H -H

H S - £ £ is a g hc ~ -- -h w <υ μ m -h tn ω α. ω > 6 Λί — ω χ d υ >ι id tn

X -U d) G

X G ?? - Λ (DG

n Id y O μ -H Λ! -h

-¾ id ·? μ > tn -P

-¾ > * id -h (d -h -U

G ω -H T3 -H G o dc Λ-μεπμ

2 -H 9 tn Id G G

S g ο-ομ^Ή Λί G <U G ·Η

H tn £ id ω ω G

μ G , c μ tn tn μ O -μ X qj tn ·η μ x: tn 9 tn -h rd a> G O ' X C & r-i > > G P1 >i o ^ (d tn c P .3^1.° u c n id < ^ □ o o ·η μ g o c x · m — m G g id 2 ;id -h -H μ •~j tj :id X :<d μ f ft e tn G -H Id

• ^ (U ro O H

o· > c ,* λ: tn μ M i g tn i 9 3 td K id I X μ >H U tn

CO

•H · · « ® <— m m m

E

77251 48 _ _ i

UI

•H

ε 3 I ρ UI Q) •P 0) 3 m u c

(O (U

4-> -H

(Λ -P

-P 4-) (0 0

Ω HP

h n C C C

Γ 2 Ο G H

P | 7 O O c ^ HH

g * i § °^ S. ° ° 0) 0

^ Λ oooo H CW

^)¾ vsvv E 3 3 £ \ 4-)

2 O' W I

x 5 c s η ‘2 s o X g :3 -- -p

X 3 ο lt> in σν -<r C S Ό C

X t! :0 W -H H

2 . X CO -P £ o a ’"a +1+1 +1+1 +1+1 3 3 p X G S! O CO VO VO Ο Ω4 111 II ft 3

^►>«3 rovoocN X-C G

3 „ ^ ·“ >iPmui H 5 (N H c

3 '2 S3 - > :3 G C

3 5 S O-HXOG

Eh 2 I > Ό 3 X H

p ui P P :0 ui x ">, 3 3 3 -P -P 4-> 2 P) Η Ό H G 3 0

Si x c ε U) P P

? Q) UI 3 3 X 3 £ χ G 4-> P >i 3 h

2(¾ X UJ O 4J C -P

^ , G H G 3

XtNQ C C U) X U) -P

® I GO P -P P

3 a U) > H G 3 G

+* p _ χρεεπ> 2 h 2 >ι g -- <o 0|H 4J -P cn 3 C 3 0 3 ’p oi o O O O ’p X 3 3 o c

rt.-!· -P o — ro o o :3 G +J HX

I p <- n :3 x :3 H +) q, G ε C O X 3

p > + I :0 X O P

£ C X P U) P

I G 3 X 3 3 G

Q Ό 4-1 -P X X >

T 3 4-)3 I

M 3 G X CO 33 3 ,ρ X X >h 2 O 3 33 '(Μ T- cn ro ^ 33 49 7 7 2 51

Taulukoissa XXXI-XXXIX esitetyt tulokset osoittavat, että keksinnön mukaisista välituotteista saatavat peptidit saavat aikaan kasvuhormonin merkittävän vapautumisen in vivo.

5 Tutkittiin kasvua edistävän aineen zeranolin, C-)3^26^57 vaikutusta kasvuhormonin vapautumiseen in vitro. Tulokset on esitetty taulukossa XXXX. Tutkittiin myös jäljempänä esitetyn esimerkin 21 mukaisen peptidin ja kasvua edistävän aineen zeranolin, C^gi^gO,., yhteisvaikutus kasvuhormonin 10 vapautumiseen in vitro. Tulokset on esitetty taulukossa XXXXI ja ne osoittavat, että yhdistelmä voi saada aikaan synergistisen kasvuhormonin vapautumisen aivolisäkkeestä in vitro.

so 7 7 2 51

Μ I

cu o) I

Λ! r-l k o o +t - c 3 3 <u 44 -HQ) 4-) tn c

<U Ο -H

C rH (TJ

•Η 3 -H

3 c ή -H 3 :3 Ή >

:3 C

> -H c "V -H 4-) :3

O -M m E

r* CN CN G -H :0 0>4 I O O o O 'H C 4-) )4 Π3 0 04-)

4-)1 10002 XI CT* :(TJ

h o, V V 3 3 E

> X :3 C G 4-) G -Η -H »—\ ·-< C :3 h ο w § £ £ g ^ co \ 5 G m C «- ο, ΰ o •7* ® - - c cu x: 3

X G U +1 +1 + + +1 G G -H

X G < ^ :3 -H > 4J

X 4-) - 3 £ £ £ C 3 MM

X 3 - ® 00 S £ :0 ·>-4 rg -H

(¾ I I X rH :3 X G

O Q-i x — :rg -u O

X 3 -H 2 > c :3 CD

X > Μ ω -H :0 :3 3 3 X U) 4-> 4-> X)

rH C >,'-'CQ)'HG

3 -H -H M :3 iH

3^ -QJOXM-H

bQ ox:x)>i-H(g

E > H 3 4-) M X

)4 M -H X -H )4 0 3 > G X 3 Q) -G in -Η -Η -H >4 X > G cn o X Ό 0)0

>Mvd MUrHg-r-iC

M G fs, Q> 3 E 0) 344¾ X Ό \ 3 * τη

X «00 loooo G tn 3 3 O

O OOOO G3C-UMM

G u loooo 0) 44 44 M 3 C _ _ M M :3 -H 0) 44

< * 00 g g X GOCUIG

-Η Ο Ο >, C :0 X C a -H

440XV4-HOX! o -H > x 3 3 -H

c )4 )4 -H 44 -H G O

(g :3 3 M rH 0) M

U :3 -H X W :3 -3 3 h2>>44 IS) t— CN ro rr 77251 51

4J

<u i

G Q) I

•H I—I E

ftJ 0 o

•r-I

-h - G

:rtJ (O QJ

> -HO)

•H Cn G

+> O -H

c r-t m

•H (0 *H

O G rH

X» Π3 :tts O 3 ^ >

S-l X G

£ G Ή G

•r) n +· >0 I o o o o “J.5

> i O C O O 1—1 -H .O

Π0 I ·--·*·- £ G X>

•H(Tj oooo \ 0-P

I vvvv CP CP :(0 c a c « s a> :π*

C -H H

*-j β :θ £ C5 a>cnvDr^vo ^ oai X 3 ro cr, m oj m ^ „< 2 li X -P mromro «X p ^ si -¾ Ή —. +J S-ι U3 * g - +1 +1 +1 +1 +1 «0 s 4J o η, μ λ; w a) x: g

. ΐ ri σ> ro -o· vo — r^cncG -H

0 £ U o co vo vo ^ i-i .5 i> x>

Ai > <3 r>1 - - N P _ ^rnTn ^ <N I ^ (U (I) 1/1 7h ^ njh <N <N <N Cs| 3-5 z > ^ £

rj r· I S-ι S-t :(¾ O

(0 0 cn (0 -H > :rd Cn ΰ g >, -ι-t > -H :ro (¾

"5 S Λί -A +> -P

O I ω Ό G ή 3

γ* Λ Ö) 0) W H :n} r-H

3 <; x: ,¾ to 0 03 ·η > ^ Cu fl Λ ή ιί in m i G G 3 tn x> (0 o Q <D nj λ; !-i x voi caacacQ to 4J c m <d (N (N p-ι t- ro ro jx* tn -rH ^ >

03 K M + + 4.J. >i O

O CO E-1 -O G -n G

X> r- + I !«£<£<< -·Ηθ6 ω 03 U (¾ O > ^ - ·η

o -H I o o o o KdOCnmO

e - c g g g § « 2 β » “ C-HI g -H to Id

rijrHOi ro n o o :t0 dl -P

OO roro G W G 0) I G

C E-< :(0 Q) :θ G K Ή 5 I tn,*Ai-HOx3 u Q .li .*4 nJ Ή Q) I Q) +1 -H -H G 0 N 03 Ό UI Γ-l H -p ΪΗ > > +> es ...

35 r N ^ 52 7 7 2 51

Keksinnön mukaisista välituotteista saatavia peptidejä ja yhdistelmiä voidaan myös antaa eläimille, ihminen mukaan luettuna, kasvuhormonin vapauttamiseksi in vivo. Peptidejä voidaan esimerkiksi antaa kaupallisesti tärkeille 5 eläimille, kuten sioille, naudoille, lampaille ja vastaaville, niiden kasvunopeuden kiihdyttämiseksi ja kasvun määrän lisäämiseksi sekä niiden maidontuoton lisäämiseksi. Lisäksi näitä peptidejä voidaan antaa ihmisille in vivo diagnostisena välineenä sen seikan määrittämiseksi suoraan, 10 kykeneekö aivolisäke vapauttamaan kasvuhormonia. Näitä peptidejä ja yhdistelmiä voidaan esimerkiksi antaa in vivo lapsille. Ennen sellaista antoa ja sen jälkeen otetuista seeruminäytteistä voidaan tehdä kasvuhormonimääritys. Kussakin näistä näytteistä olevien kasvuhormonimäärien vertailu 15 olisi keino määrittää suoraan potilaan aivolisäkkeen kyky vapauttaa kasvuhormonia.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.

Esimerkki 1 H2-His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-NH2:n synteesi 20 Asetettiin p-metyylibentshydryyliamiinihydrokloridi- hartsi (p-Me-BHA-HCl-hartsi) reaktioastiaan. Sen jälkeen käytettiin seuraavaa menettelytapaa aloittaen vaiheesta 6 sekä Beckman Peptide Synthesizer Model nro 990 -laitetta valmistettaessa peptidi I^-His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-N^· 25 Synteesi aloitettiin vaiheesta 6, koska hartsissa ei ollut mukana aminohappoa ja hartsi, joka oli alunperin HCl-muo-dossa, piti ainoastaan neutraloida.

1. Pestään metyleenikloridilla (Ci^C^) 1 »5 minuuttia kolmesti.

30 2. Käsitellään trifluorietikkahappo-metyleeniklori- di-seoksella (40 tilavuus-% TFA/Cf^C^) r joka sisältää 0,1 % indolia, 1,5 minuuttia.

3. Toistetaan vaihetta 2 20 minuutin ajan.

4. Pestään kloroformilla (CHC13) 1,5 minuuttia kol- 35 mesti.

53 7 7 2 51 5. Pestään etanoli-metyleenikloridi-seoksella (30 tilavuus-% EtOH/CH2Cl2) 1,5 minuuttia kahdesti.

6. Pestään CH2Cl2:lla 1,5 minuuttia kolmesti.

7. Käsitellään CH2Cl2:een liuotetulla trietyyliamii-5 nilla (10 tilavuus-% TEA/CH2C12) 1,5 minuuttia.

8. Toistetaan vaihetta 7 10 minuutin ajan.

9. Pestään CH2Cl2:lla 1,5 minuuttia kolmesti.

10. Lisätään pestyyn hartsiin 2,5 ekvivalenttia sopivalla tavalla suojattua aminohappoa dimetyyliformamidi- 10 metyleenikloridi-seoksessa (DMF-CH2C12).

11. Lisätään disykloheksyylikarbodi-imidin 0,5N CH2Cl2-liuosta (DCC/CH2C12); yli 2,5 ekvivalenttia.

12. Huuhdotaan tiputussuppiloa CH2Cl2 »Ha ja lisätään huuhteluliuos reaktioastiaan.

15 13. Sekoitetaan vaiheissa 10-12 lisättyjä reagens- seja vähintään kaksi tuntia.

14. Pestään CH2Cl2:lla 1,5 minuuttia kolmesti.

15. Pestään DMF:11a 1,5 minuuttia.

16. Pestään CH2Cl2:lla 1,5 minuuttia kahdesti.

20 17. Testataan ninhydriinireaktiolla käyttäen menet telytapaa, jonka ovat esittäneet Kaiser et ai., Annal. Biochem. 34 (1970) 595.

18. Jos vaihe 17 osoittaa reaktion menneen loppuun, toistetaan edellä esitetyt menettelyt aloittaen vaiheesta 1 25 käyttäen seuraavaa suojattua aminohappoa. Jos vaihe 17 osoittaa epätäydellistä reaktiota, toistetaan vaiheet 7-17.

Noudatettiin edellä esitettyä menettelytapaa käyttäen seuraavaa aminohappojärjestystä:

Boc-D-Phe 30 Boc-Trp

Boc-Ala Boc-D-Trp Boc-His(Tos*) *Tos tarkoittaa p-tolueenisulfonyyliä.

35 Halutun peptidihartsin synteesin mentyä loppuun peptidihartsin sisältävä reaktioastia laitettiin eksikkaat- 54 77251 toriin, ja sitä kuivattiin yön yli alipaineessa. Kuivattu peptidihartsi poistettiin reaktioastiasta ja pantiin toiseen astiaan, joka soveltui lohkaisuun HF:llä. Tämä jälkimmäinen astia sisälsi myös magneettisekoitussauvan. Tähän 5 astiaan lisättiin sellainen määrä anisolia, joka riitti kostuttamaan peptidihartsin. Astia yhdistettiin seuraavak-si HF-putkeen ja asetettiin alipaineeseen siinä mahdollisesti olevan ilman poistamiseksi. Sen jälkeen astia jäähdytettiin noin -78°C:seen hiilihappojää-asetoni-hauteella.

10 Astiaan lisättiin kahdesti tislattua HF:ä (noin 10 ml/g kohden peptidihartsia). Hiilihappojää-asetoni-haude poistettiin sitten astian ympäriltä ja korvattiin jäävesihau-teella. Astian sisältöä sekoitettiin voimakkaasti noin 45 minuuttia, samalla kun astia pidettiin edelleen upotettuna 15 jäävesihauteeseen. Suurin osa astiassa olevasta HF:stä poistettiin sen jälkeen vesisuihkupumpulla. Sen jälkeen kun pääosa HF:stä oli poistettu vesisuihkupumpulla, loppuosa HF:stä sekä anisoli poistettiin vakuumipumpulla.

Astian sisältö pestiin noin 100 ml :11a eetteriä 20 mahdollisesti jäljellä olevan anisolin poistamiseksi tarkemmin .

Peptidi irrotettiin hartsista uuttamalla etikkaha-pon vesiliuoksella (aq*HOAc). Etikkahapon vesiliuos poistettiin kylmäkuivaarna1la, jolloin saatiin kevyttä peptidi-25 jauhetta.

Peptidi puhdistettiin sitten käyttäen hyväksi parti-tiokromatografiaa tai vastavirtajakaantumista (CCD) ja käyttäen butanoli-HOAc-vesi-systeemiä (4:1:5). Silloin kun perusteellisempi puhdistaminen oli välttämätöntä, käytet-30 tiin myös Pharmacia LH-20 -kromatografiapylvästä.

Esimerkki 2 H2-Tyr-D-Trp-Ala-Trp-D-His-NH2:n synteesi

Esimerkissä 1 esitettyä menettelytapaa voidaan käyttää peptidin H2~Tyr-D-Trp-Ala-Trp-D-His-NH2 syntetisoimi-35 seksi käyttäen seuraavaa aminohappojärjestystä: 77251 55

Boc-D-His(Tos)

Boc-Trp

Boc-Ala

Boc-D-Trp 5 Boc-Tyr(BrZ*) *BrZ tarkoittaa o-bromibentsyloksikarbonyyliä.

Esimerkki 3 H2-His-D-Trp-Ala-Trp-D-Tyr-NH2:n synteesi

Esimerkissä 1 esitettyä menettelytapaa voidaan käyt-10 tää peptidin H2-His-D- Trp-Ala-Trp-D-Tyr-NH2 syntetisoimi-seksi käyttäen seuraavaa aminohappojärjestystä:

Boc-D-Tyr(BrZ)

Boc-Trp

Boc-Ala 15 Boc-D-Trp

Boc-His(Tos)

Esimerkki 4 H2-His-D-Trp-Ala-Trp-D-His-NH2 :n synteesi

Esimerkissä 1 esitettyä menettelytapaa voidaan käyt-20 tää peptidin H2-His-D-Trp-Ala-Trp-D-His-NH2 syntetisoimi-seksi käyttäen seuraavaa aminohappojärjestystä:

Boc-D-His(Tos)

Boc-Trp Boc-Ala 25 Boc-D-Trp

Boc-His(Tos)

Esimerkki 5 H2-Tyr-D-Trp-Ala-Trp-D-p-Cl-Phe-NH2:n synteesi

Esimerkissä 1 esitettyä menttelytapaa voidaan käyt-30 tää peptidin H2-Tyr-D-Trp-Ala-Trp-D-p-Cl-Phe-NH2 synteti-soimiseksi käyttäen seuraavaa aminohappojärjestystä:

Boc-D-p-Cl-Phe

Boc-Trp

Boc-Ala 35 Boc-D-Trp

Boc-Tyr(BrZ) 56 77251

Esimerkki 6 H2-Tyr-D-Trp-D-Ala-Trp-D-Phe-NH2:n synteesi Esimerkissä 1 esitettyä menettelytapaa voidaan käyttää peptidin H2~Tyr-D-Trp-D-Ala-Trp-D-Phe-NH2 syntetisoimi-5 seksi käyttäen seuraavaa aminohappojärjestystä:

Boc-D-Phe

Boc-Trp

Boc-D-Ala

Boc-D-Trp 10 Boc-Tyr(BrZ)

Esimerkki 7 H2-p-Cl-Phe-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-NH2:n synteesi Esimerkissä 1 esitettyä menettelytapaa voidaan käyttää peptidin H2-p-Cl-Phe-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-NH2 synteti-15 soimiseksi käyttäen seuraavaa aminohappojärjestystä:

Boc-D-Phe Boc-Trp Boc-Ala Boc-D-Trp 20 Boc-p-Cl-Phe

Esimerkki 8 H-deaminoTyr-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-NH2:n synteesi Esimerkissä 1 esitettyä menettelytapaa voidaan käyttää peptidin H-deaminoTyr-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-NH2 synteti-25 soimiseksi käyttäen seuraavaa aminohappojärjestystä:

Boc-D-Phe Boc-Trp Boc-Ala Boc-D-Trp 30 3-(p-OH-fenyyli)propaanihappo

Esimerkki 9 H

CH3CO-Tyr-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-NH2:n synteesi Esimerkissä 1 esitettyä menettelytapaa voidaan käyt-35 H

tää useita muutoksia sisältävänä peptidin CH^CO-Tyr-D-Trp- 57 7 7 2 51

Ala-Trp-D-Phe-NI^ syntetisoimiseksi käyttäen seuraavaa aminohappo j ärj estystä:

Boc-D-Phe

Boc-Trp 5 Boc-Ala

Boc-D-Trp Boc-Tyr(BrZ)

Muutokset koostuivat seuraavista lisävaiheista viimeisen suojatun aminohapon, Boc-Tyr(BrZ):n, peptidihartsiin 10 lisäämisen jälkeen: 19. Poc-ryhmä poistetaan peptidihartsista TFA:lla.

20. Tuloksena olevaa peptidihartsia pestään CH2Cl2:lla 1,5 minuuttia kahdesti.

21. Lisätään etikkahappoanhydridiä (2,5 kertainen moo-15 linen ylimäärä) ja pyridiiniä (2,5 kertainen moolinen ylimäärä) ja sekoitetaan noin 10 minuuttia.

22. Toistetaan vaihe 20.

Sitten käytettiin samanlaista kuivausvaihetta ja puh-distusvaihetta kuin esimerkissä 1 halutun peptidin aikaan-20 saamiseksi.

Esimerkki 10 H2-0-Me-Tyr-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-NH2:n synteesi

Esimerkissä 1 esitettyä menettelytapaa voidaan käyttää peptidin H2~0-Me-Tyr-D-Trp-D-Phe-NH2 syntetisoimiseksi 25 käyttäen seuraavaa aminohappojärjestystä:

Boc-D-Phe

Boc-Trp

Boc-Ala

Boc-D-Trp 30 Boc-O-Me-Tyr(BrZ)

Esimerkki 11 H2~Tyr-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Met-NH2:n synteesi

Laitettiin BHA*HC1-hartsi reaktioastiaan. Sen jälkeen käytettiin seuraavaa menettelytapaa ja Beckman Peptide 35 Synthesizer Model nro 990 -laitetta heksapeptidin H2~Tyr-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Met-NH2 valmistuksessa: 77251 58 1. Reaktioastiaan lisättiin metyleenikloridia (CH2Cl2; noin 10 ml grammaa kohden BHA-HCl-hartsia).

BHA-HCl-hartsia pestiin samalla voimakkaasti sekoittaen noin 1,5 minuuttia. Sen jälkeen C^Cl -liuos valutettiin 5 pois reaktioastiasta. Tämä pesuvaihe toistettiin kerran.

2. Trietyyliamiiniliuosta /Et^N/Ci^Cl (10:90); noin 10 ml grammaa kohden BHA-HCl-hartsiaJ7 lisättiin reaktio-astiassa olevaan pestyyn BHA-HCl-hartsiin. Syntynyttä seosta sekoitettiin voimakkaasti noin 1,5 minuuttia. Sen jäl- 10 keen liuos valutettiin pois reaktioastiasta.

3. Toinen erä Et^Nin metyleenikloridiliuosta (10:90; noin 10 ml grammaa kohden BHA-HCl-hartsia) lisättiin reaktioastiaan. BHA-HCl-hartsi neutraloitiin sekoittamalla voimakkaasti noin 20 minuuttia. Sen jälkeen liuos valutettiin 15 pois reaktioastiasta.

4. Reaktioastiaan lisättiin CH2Cl2:a (noin 10 ml grammaa kohden BHA·HCl-hartsia). Syntynyttä seosta sekoitettiin voimakkaasti noin 1,5 minuuttia. Sen jälkeen liuos valutettiin pois reaktioastiasta. Tämä menettely toistet- 20 tiin vielä kahdesti.

5. Reaktioastiaan lisättiin t-butyloksikarbonyyli-metioniinia (Boc-Met; noin 2,5 kertaisesti se teoreettinen määrä, joka vastaa reaktioastiaan alunperin laitetun BHA* HCl-hartsin koko sitomiskapasiteettia) noin 50 ml:ssa di- 25 metyyliformamidi-metyleenikloridi-liuosta /DMF-CHjC^ (1:).7. Syntynyttä seosta sekoitettiin voimakkaasti noin 1,5 minuuttia.

6. Reaktioastiaan lisättiin disykloheksyylikarbodi-imidin (DCC) 0,5 M Cl^C^-liuosta (noin 2,5 kertaisesti se 30 teoreettinen määrä, joka vastaa reaktioastiaan alunperin laitetetun BHA*HCl-hartsin koko sitomiskapasiteettia). Syntynyttä seosta sekoitettiin voimakkaasti, kunnes ninhyd-riinikoe oli negatiivinen (noin 120 minuuttia). Sen jälkeen liuos valutettiin pois reaktioastiasta.

35 7. Reaktioastiaan lisättiin C^C^ja (noin 10 ml grammaa kohden BHA·HCl-hartsia). Syntynyttä liuosta 59 7 7 2 51 sekoitettiin voimakkaasti noin 1,5 minuuttia. Sen jälkeen liuos valutettiin pois reaktioastiasta. Tämä pesutoimenpi-de toistettiin kerran.

8. Reaktioastiaan lisättiin DMF:a (noin 10 ml grammaa 5 kohden BHA'HCl-hartsia). Syntynyttä seosta sekoitettiin noin 1,5 minuuttia. Sen jälkeen liuos valutettiin pois reaktio-astiasta .

9. Reaktioastiaan lisättiin CH2Cl2:a (noin 10 ml grammaa kohden BHA-HCl-hartsia). Syntynyttä seosta sekoitettiin 10 voimakkaasti noin 1,5 minuuttia. Sen jälkeen liuos valutettiin pois reaktioastiasta. Tämä pesutoimenpide toistettiin vielä kahdesti.

10. Reaktioastiaan lisättiin trifluorietikkahappo-metyleenikloridi-liuosta /TFA/CH2C12 (40:60); noin 10 ml 15 grammaa kohden BHA*GCl-hartsia.7. Syntynyttä seosta sekoitettiin voimakkaasti noin 1,5 minuuttia. Sen jälkeen liuos valutettiin pois reaktioastiasta.

11. Lisättiin toinen erä TFA-CH2Cl2-liuosta (40:60; noin 10 ml grammaa kohden BHA*HCl-hartsia) reaktioastiaan.

20 Syntynyttä seosta sekoitettiin voimakkaasti noin 20 minuuttia. Sen jälkeen liuos valutettiin pois reaktioastiasta.

12. Reaktioastiaan lisättiin CH2Cl2:a (noin 10 ml grammaa kohden BHA*HCl-hartsia). Syntynyttä seosta sekoitettiin voimakkaasti noin 1,5 minuuttia. Sen jälkeen liuos 25 valutettiin pois reaktioastiasta. Tämä pesutoimenpide toistettiin kerran.

13. Reaktioastiassa olevaan pestyyn BHA*HCl-hart-siin lisättiin trietyyliamiiniliuosta /Et^N/Cl^C^ (10:90); noin 10 ml grammaa kohden BHA-HCl-hartsia7· Syntynyttä 30 seosta sekoitettiin voimakkaasti noin 1,5 minuuttia. Sen jälkeen liuos valutettiin pois reaktioastiasta.

14. Toinen erä Et^N-CH^C^-liuosta (10:90; noin 10 ml grammaa kohden BHA*HCl-hartsia) lisättiin reaktioastiaan, BHA*HCl-hartsi neutraloitiin sekoittamalla voimakkaasti 35 noin 20 minuuttia. Sen jälkeen liuos valutettiin pois reaktioastiasta.

60 7 7 2 51 15. Reaktioastiaan lisättiin kloroformia (CHCl^; noin 10 ml grammaa kohden BHA*HCl-hartsia). Syntynyttä seosta sekoitettiin voimakkaasti noin 1,5 minuuttia. Sen jälkeen liuos valutettiin pois reaktioastiasta.

5 16. Reaktioastiaan lisättiin etanoli-metyleeniklo- ridi-liuosta /EtOH/CI^C^ (30:70); noin 10 ml grammaa kohden BHA*HCl-hartsia./. Syntynyttä seosta sekoitettiin voimakkaasti noin 1,5 minuuttia. Sen jälkeen liuos valutettiin pois reaktioastiasta. Tämä pesutoimenpide toistettiin ker-10 ran.

Vaiheet 4-16 toistettiin sitten käyttäen seuraavaa aminohappojärjestystä:

Boc-D-Phe

Boc-Trp 15 Boc-Ala

Boc-D-Trp Boc-Tyr(BrZ*) *BrZ tarkoittaa o-bromibentsyloksikarbonyyliä

Halutun peptidihartsin synteesin mentyä loppuun pep-20 tidihartsin sisältävä reaktioastia laitettiin eksikkaatto-riin ja sitä kuivattiin yön yli alipaineessa. Kuivattu pep-tidihartsi poistettiin reaktioastiasta ja pantiin toiseen astiaan, joka soveltui lohkaisuun HF:llä. Tämä jälkimmäinen astia sisälsi myös magneettisekoitussauvan. Tähän astiaan 25 lisättiin sellainen määrä anisolia, joka riitti kostuttamaan peptidihartsin. Astia yhdistettiin seuraavaksi HF-linjaan ja asetettiin alipaineeseen siinä mahdollisesti olevan ilman poistamiseksi. Sen jälkeen astia jäähdytettiin noin -78°C:seen hiilihappojää-asetoni-hauteella. As-30 tiaan lisättiin kahdesti tislattua HF:ä (noin 10 ml grammaa kohden peptidihartsia). Hiilihappojää-asetoni-haude poistettiin sitten astian ympäriltä ja korvattiin jäävesi-hauteella. Astian sisältöä sekoitettiin voimakkaasti noin 45 minuuttia, samalla kun astia pidettiin edelleen upotet-35 tuna jäävesihauteeseen. Suurin osa astiassa olevasta HF:stä poistettiin sen jälkeen vesisuihkupumpulla; loppuosa HF:stä sekä anisoli poistettiin vakuumipumpun avulla.

61 77251

Astian sisältö pestiin noin 100 ml :11a eetteriä mahdollisesti jäljellä olevan anisolin poistamiseksi tarkemmin .

Peptidi irrotettiin hartsista uuttamalla etikkaha-5 pon 30 % vesiliuoksella (aq*HOAc). Etikkahapon vesiliuos poistettiin kylmäkuivaarna1la, jolloin saatiin kevyttä peptidi jauhetta .

Peptidi puhdistettiin sitten käyttäen hyväksi parti-tiokromatografiaa tai vastavirtajakaantumista (CCD) ja 10 käyttäen butanoli-HOAc-vesi-systeemiä (4:1:5). Silloin kun perusteellisempi puhdistus oli välttämätöntä, käytettiin myös Pharmacia LH-20 -kromatografiapylvästä.

Esimerkki 12 H2-Tyr-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Thr-NH2:n synteesi 15 Esimerkissä 11 esitettyä menettelytapaa käytettiin heksapeptidin H2-Tyr-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Thr-NH2 synteti-soimiseksi käyttäen seuraavaa aminohappojärjestystä:

Boc-Thr(Bzl*)

Boc-D-Phe 20 Boc-Trp

Boc-Ala Boc-D-Trp Boc-Tyr(BrZ) *Bzl tarkoittaa bentsyyliä 25 Esimerkki 13 H2-Tyr-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Gln-OH:n synteesi

Esimerkissä 11 esitettyä menettelytapaa käytettiin heksapeptidin H2-Tyr-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Gln-OH synteti-soimiseksi käyttäen seuraavaa aminohappojärjestystä: 30 Boc-Glu-bentsyyliesteri

Boc-D-Phe Boc-Trp Boc-Ala Boc-D-Trp 35 Boc-Tyr(BrZ) 77251 62

Esimerkki 14 H2-Tyr-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Gln-NH2:n synteesi

Esimerkissä 11 esitettyä menettelytapaa käytettiin useita muutoksia sisältävänä heksapeptidin H2~Tyr-D-Trp-5 Ala-Trp-D-Phe-Gln-NH2 syntetisoimiseksi. Muutokset olivat seuraavia: (1) Esimerkin 11 vaiheet 2-4 jätettiin pois ja korvattiin yhdellä ainoalla vaiheella, joka teki välttämättömäksi liuottaa Boc-Gln (noin 5-kertaisesti se teoreettinen 10 määrä, joka vastaa reaktioastiaan alunperin laitetun BHA* HCl-hartsin koko sitomiskapasiteettia) pyöreäpohjäisessä pullossa 10 ml:aan CH2Cl2“DMF-liuosta (3:2). Pullo ja sen sisältö jäähdytettiin jäähauteella ja sitten pulloon lisättiin DCC:ä (noin 1,25 kertaisesti se teoreettinen määrä, 15 joka vastaa reaktioastiaan alunperin laitetun BHA*HCl-hart-sin koko sitomiskapasiteettia). Syntynyttä seosta sekoitettiin jäähauteessa noin 25-30 minuuttia. Boc-GlN:n ja DCC:n välisessä reaktiossa muodostunut DCC-urea-saostuma erotettiin supernatantista suodattamalla. Supernatantti, 20 joka käsitti CH2Cl2-DMF-liuoksen, johon oli liuenneena symmetristä anhydridiä (jota myös muodostui Boc-Gln:n ja DCC:n välisessä reaktiossa), lisättiin reaktioastiaan. Tuloksena ollutta seosta sekoitettiin, kunnes ninhydriinikoe oli negatiivinen. Sen jälkeen liuos valutettiin pois reaktioas-25 tiasta.

(2) Sen jälkeen kun esimerkin 1 vaiheet 7-16 saatiin päätökseen, toistettiin esimerkin 11 vaiheet 4-16 ilman muutoksia käyttäen seuraavaa aminohappojärjestystä:

Boc-D-Phe 30 Boc-Trp

Boc-Ala Boc-D-Trp Boc-Tyr(BrZ)

Esimerkki 15 35 H2~Tyr-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Asn-NH2:n synteesi

Esimerkissä 11 esitettyä menettelytapaa käytettiin useita muutoksia sisältävänä heksapeptidin H2~Tyr-D-Trp- 63 77251

Ala-Trp-A-Phe-Asn-NH2 syntetisoimiseksi. Muutokset olivat seuraavia: (1) Esimerkin 11 vaiheet 2-4 jätettiin pois ja korvattiin yhdellä ainoalla vaiheella, joka teki välttämättö- 5 maksi liuottaa Boc-Asn (noin 5-kertaisesti se teoreettinen määrä, joka vastaa reaktioastiaan alunperin laitetun BHA· HCl-hartsin koko sitoraiskapasiteettia) soveltuvassa pullossa noin 50 ml:aan DMF:a. Syntynyt liuos lisättiin reaktio-astiaan, jolloin muodostui seos. Seosta sekoitettiin voi-10 makkaasti, kunnes ninhydriinikoe oli negatiivinen. Sen jälkeen liuos valutettiin pois reaktioastiasta.

(2) Sen jälkeen kun esimerkin 11 vaiheet 7-16 saatiin päätökseen, toistettiin esimerkin 11 vaiheet 4-16 ilman muutoksia käyttäen seuraavaa aminohappojärjestystä: 15 Boc-D-Phe

Boc-Trp Boc-Ala Boc-Tyr(BrZ)

Esimerkki 16 20 H2-His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2:n synteesi

Laitettiin reaktioastiaan p-metyylibentshydryyliamii-nihydrokloridihartsia (BHA’HCl-hartsia). Sen jälkeen käytettiin seuraavaa menettelytapaa aloittaen vaiheesta 6 sekä Beckman Peptide Synthesizer Model 990 -laitetta valmis-25 tettaessa peptidi I^-His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NI^ · Synteesi aloitettiin vaiheesta 6, koska hartsissa ei ollut mukana aminohappoa ja hartsi, joka oli alunperin HCl-muodos-sa, piti ainoastaan neutraloida.

1. Pestään metyleenikloridilla (CHjC^) 1,5 minuut-30 tia kolmesti.

2. Käsitellään trifluorietikkahappo-metyleenikloridi-seoksella (40 tilavuus-% TFA/Ct^C^) , joka sisältää 0,1 % indolia, 1,5 minuuttia.

3. Toistetaan vaihetta 2 20 minuutin ajan.

35 4. Pestään kloroformilla (CHCl^) 1/5 minuuttia kol mesti .

64 77251 5. Pestään etanoli-metyleenikloridi-seoksella (30 ti-lavuus-% EtOH/CHjC^) 1/5 minuuttia kahdesti.

6. Pestään Cl^C^tlla 1,5 minuuttia kolmesti.

7. Käsitellään Cl^C^reen liuotetulla trietyyliamii-5 nilla (10 tilavuus-% TEAfCI^C^)) 1,5 minuuttia.

8. Toistetaan vaihetta 7 10 minuutin ajan.

9. Pestään C^C^slla 1,5 minuuttia kolmesti.

10. Lisätään pestyyn hartsiin 2,5 ekvivalenttia sopivalla tavalla suojattua aminohappoa dimetyyliformamidi- 10 metyleenikloridi-seoksessa (DMF-C^C^) · 11. Lisätään disykloheksyylikarbodi-imidin 0,5N C^C^-liuosta (DCC/C^C^) ; yli 2,5 ekvivalenttia.

12. Huuhdotaan tiputussuppilo C^C^slla ja lisätään huuhteluliuos reaktioastiaan.

14. Pestään CH2Cl2:lla 1,5 minuuttia kolmesti.

15. Pestään DMF:lla 1,5 minuuttia.

16. Pestään C^C^slla 1,5 minuuttia kahdesti.

20 17. Testataan ninhydriinireaktiolla käyttäen menet telytapaa, jonka ovat esittäneet Kaiser et ai., Annal, Biochem. 34 (1970) 595.

18. Jos vaihe 17 osoittaa reaktion menneen loppuun, toistetaan edellä esitetyt toimenpiteet aloittaen vaihees- 25 ta 1 käyttäen seuraavaa suojattua aminohappoa. Jos vaihe 17 osoittaa epätäydellistä reaktiota, toistetaan vaiheet 7-17.

Boc-Lys(C1Z+) 30 Boc-D-Phe

Boc-Trp Boc-Ala Boc-D-Trp Boc-His(Tos*) 35 +C1Z tarkoittaa o-klooribentsyloksikarbonyyliä *Tos tarkoittaa p-tolueenisulfonyyliä 65 77251

Halutun peptidihartsin synteesin mentyä loppuun pep-tidihartsin sisältävä reaktioastia laitettiin eksikkaatto-riin ja sitä kuivattiin yön yli alipaineessa. Kuivattu pep-tidihartsi poistettiin reaktioastiasta ja pantiin toiseen 5 astiaan, joka soveltui lohkaisuun HF:llä. Tämä jälkimmäinen astia sisälsi myös magneettisekoitussauvan. Tähän astiaan lisättiin sellainen määrä anisolia, joka riitti kostuttamaan peptidihartsin. Seuraavaksi astia yhdistettiin HF-putkeen ja laitettiin alipaineeseen siinä mahdollisesti 10 olevan ilman poistamiseksi. Sen jälkeen astia jäähdytettiin noin -78°C:seen hiilihappojää-asetoni-hauteella. Astiaan lisättiin kahdesti tislattua HF:ä (noin 10 ml grammaa kohden peptidihartsia). Sen jälkeen hiilihappojää-asetoni-hau-de poistettiin astian ympäriltä ja korvattiin jäävesihau-15 teella. Astian sisältöä sekoitettiin voimakkaasti noin 45 minuuttia, samalla kun astia pidettiin edelleen upotettuna jäävesihauteeseen. Suurin osa HF:stä poistettiin sitten vesisuihkupumpulla. Sen jälkeen kun pääosa HF:stä oli poistettu vesisuihkupumpulla, jäljelle jäänyt HF sekä anisoli 20 poistettiin vakuumipumpun avulla.

Astian sisältö pestiin noin 100 ml:11a eetteriä mahdollisesti jäljellä olevan anisolin poistamiseksi tarkemmin.

Peptidi irrotettiin hartsista uuttamalla etikkaha-pon vesiliuoksella (aq*HOAc). Etikkahapon vesiliuos pois-25 tettiin kylmäkuivaamalla, jolloin saatiin kevyttä peptidi-jauhetta .

Peptidi puhdistettiin sitten käyttäen hyväksi par-titiokromatografiaa tai vastavirtajakaantumista (CCD) ja käyttäen butanoli-HOAc-vesi-systeemiä (4:1:5). Silloin 30 kun perusteellisempi puhdistus oli välttämätöntä, käytettiin myös Pharmacia LH-20 -kromatografiapylvästä.

Esimerkki 17 ^-Tyr-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-N^:n synteesi

Esimerkissä 16 esitettyä menettelytapaa voidaan käyt-35 tää peptidin ^-Tyr-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-N^ synteti-soimiseksi käyttäen seuraavaa aminohappojärjestystä: 77251 66

Boc-Lys(ClZ)

Boc-D-Phe

Boc-Trp

Boc-Ala 5 Boc-D-Trp

Boc-Tyr(BrZ*) *BrZ tarkoittaa o-bromibentsyloksikarbonyyliä Esimerkki 18 H^-Tyr-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Glu-NI^:n synteesi 10 Esimerkissä 16 esitettyä menettelytapaa voidaan käyttää peptidin H2-Tyr-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Glu-NH2 syn-tetisoimiseksi käyttäen seuraavaa aminohappojärjestystä:

Boc-Glu-y-Bzl*

Boc-D-Phe 15 Boc-Trp

Boc-Ala Boc-D-Trp Boc-Tyr(BrZ) *Y-Bzl tarkoittaa Y-bentsyyliesteriä 20 Esimerkki 19 H2-Tyr-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Phe-NH2:n synteesi Esimerkissä 16 esitettyä menettelytapaa voidaan käyttää peptidin H2-Tyr-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Phe-NH2 synteti-soimiseksi käyttäen seuraavaa aminohappojärjestystä: 25 Boc-Phe

Boc-D-Phe

Boc-Trp

Boc-Ala

Boc-D-Trp 30 Boc-Tyr(BrZ)

Esimerkki 20 H2~Tyr-D-Trp-Gly-Trp-D-Phe-Gln-NH2:n synteesi Esimerkissä 16 esitettyä menettelytapaa voidaan käyttää peptidin H2-Tyr-D-Trp-Gly-Trp-D-Phe-Gln-NH2 synteti-35 soimiseksi käyttäen seuraavaa aminohappojärjestystä: 77251 67

Boc-Gln-ONP*

Boc-D-Phe

Boc-Trp

Boc-Gly 5 Boc-D-Trp

Boc-Tyr(BrZ) *ONP tarkoittaa p-nitrofenyyliesteriä

Ainoa muutos tehtiin nimenomaan menettelytapaan Boc-Gln-ONP:n kiinnittämiseksi hartsiin. Tämä muutos oli 10 esimerkin 16 vaiheen 11 jättäminen pois tästä nimenomaisesta kiinnitystoimenpiteestä.

Esimerkki 21 H2-His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-OH:n synteesi

Esimerkissä 16 esitettyä menettelytapaa voidaan käyt- 15 tää useita muutoksia sisältävänä peptidin I^-His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-OH syntetisoimiseksi käyttäen seuraavaa aminohappoj ärj estystä:

Boc-Lys(C1Z)

Boc-D-Phe 20 Boc-Trp

Boc-Ala Boc-D-Trp Boc-HiS(Tos)

Muutokset olivat seuraavia: 25 1. p-Me-BHA-HCl-hartsin asemesta käytettiin hydrok- simetyylihartsia.

2. Menettelytavan vaiheet 6-18 muutettiin seuraavasti nimenomaan Boc-Lys(ClZ):n kiinnittämiseksi hydroksi-metyylihartsiin: 30 a. Vaihe 6 pysyi ennallaan; b. Vaiheet 7-9 jätettiin pois; c. Vaiheet 10 ja 11 pysyivät ennallaan; d. Vaihe 12 jätettiin pois ja kovattiin seuraavalla toimenpiteellä: 35 Lisättiin 2,5 ekvivalenttia N,N-dimetyyliaminopy- ridiiniä (DMAP).

6c 77251 e. Vaiheet 13-16 pysyivät ennallaan; f. Vaiheet 17 ja 18 jätettiin pois ja korvattiin seu-raavalla menettelyllä:

Aminohappo-hartsi-yhdistelmää kuivataan alipainees-5 sa, kunnes sen paino ei enää muutu. Jos lopullinen vakio-paino on yhtä suuri kuin reaktioastiaan lisätyn hartsin ja Boc-aminohapon painon summa, lisätään 10 ekvivalenttia bentsoyylikloridia ja 10 ekvivalenttia pyridiiniä mahdollisen käyttämättömän hydroksimetyylihartsin deaktivoimiseksi.

10 Pestään vaiheissa 15 ja 16 esitetyllä tavalla. Sen jälkeen sovelletaan esimerkin 16 vaiheita 1-18 jäljellä oleviin suojattuihin aminohappoihin.

Jos lopullinen vakiopaino ei ole yhtä suuri kuin reaktioastiaan lisätyn hartsin ja Boc-aminohapon summa, tois-15 tetaan vaiheet 10:stä eteenpäin aikaisemmin tässä esimerkissä muunnetulla tavalla.

Esimerkki 22 i^-His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Arg-NH^:n synteesi

Esimerkissä 16 esitettyä menettelytapaa voidaan 20 käyttää peptidin H2-His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Arg-NH2 syn-tetisoimiseksi käyttäen seuraavaa aminohappojärjestystä:

Aoc*-Arg(Tos)

Boc-D-Phe

Boc-Trp 25 Boc-Ala

Boc-D-Trp Boc-His(Tos) *Aoc tarkoittaa isoamyloksikarbonyyliä

Esimerkki 23 30 H2-His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Gln-NH2:n synteesi

Esimerkissä 16 esitettyä menettelytapaa voidaan käyttää yhden muutoksen sisältävänä peptidin H2~His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Gln-NH2 syntetisoimiseksi käyttäen seuraavaa aminohappojärjestystä:

35 Boc-Gln-ONP

Boc-D-Phe 69 7 7 2 51

Boc-Trp Boc-Ala Boc-D-Trp Boc-His(Tos) 5 Ainoa muutos tehtiin juuri menettelytapaan Boc-Gln- ONP:n kiinnittämiseksi hartsiin. Tämä muutos käsitti esimerkin 16 vaiheen 11 jättämisen pois tästä nimenomaisesta kiinnitysmenettelystä.

Esimerkki 24 10 H2-His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Glu-NH2:n synteesi

Esimerkissä 16 esitettyä menettelytapaa voidaan käyttää peptidin H2-His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Glu-NH2 syn-tetisoimiseksi käyttäen seuraavaa aminohappojärjestystä:

Boc-Glu-V-Bzl 15 Boc-D-Phe

Boc-Trp Boc-Ala Boc-D-Trp Boc-His(Tos) 20 Esimerkki 25 H2-His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-HomoArg-NH2:n synteesi Esimerkissä 16 esitettyä menettelytapaa voidaan käyttää peptidin H2-His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-HomoArg-NH2 synte-tisoimiseksi käyttäen seuraavaa aminohappojärjestystä: 2 5 Boc-HomoArg(Tos)

Boc-D-Phe

Boc-Trp

Boc-Ala

Boc-D-Trp 30 Boc-His(Tos)

Esimerkki 26 H2-3-N-Me-His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2:n synteesi Esimerkissä 16 esitettyä menettelytapaa voidaan käyttää peptidin H2-3-N-Me-His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2 35 syntetisoimiseksi käyttäen seuraavaa aminohappojärjestystä: 77251 70

Boc-Lys(ClZ)

Boc-D-Phe

Boc-Trp

Boc-Ala 5 Boc-D-Trp

Boc-3-N-Me-His

Esimerkki 27 H2-His-D-Trp-D-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NHCH2CH3:n synteesi

Esimerkissä 16 esitettyä menettelytapaa voidaan käyt-10 tää useita muutoksia sisältävänä peptidin H2-His-D-Trp-D-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NHCH2CH3 syntetisoiraiseksi käyttäen seu-raavaa aminohappojärjestystä:

Boc-Lys(ClZ)

Boc-D-Phe 15 Boc-Trp

Boc-D-Ala Boc-D-Trp Bod-His(Tos) HF-lohkaisumenettelyn, joka on esitetty esimerkissä 20 16, asemesta käytettiin seuraavaa lohkaisumenettelyä etyy- liamiinilla (CH3CH2NH2):

Halutun peptidihartsin synteesin mentyä loppuun pep-tidihartsin sisältävä reaktioastia laitettiin eksikkaatto-riin ja sitä kuivattiin yön yli alipaineessa. Kuivattu pep-25 tidihartsi poistettiin reaktioastiasta ja laitettiin toiseen astiaan, joka soveltui lohkaisuun etyyliamiinilla. Tämä jälkimmäinen astia sisälsi myös magneettisekoitussauvan. Astia asetettiin jäähauteeseen ja etyyliamiinikaasu kondensoitui astiaan. Astian sisältöä sekoitettiin yön yli.

30 Tätä lohkaisutoimenpidettä seurasivat esimerkissä 16 esitetyt uuttamis- ja puhdistustoimenpiteet.

Esimerkki 28 H2~His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Orn-NH2:n synteesi

Esimerkissä 16 esitettyä menettelytapaa voidaan käyt-35 tää peptidin H2-His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Orn-NH2 synteti-soimiseksi käyttäen seuraavaa aminohappojärjestystä: 71 77251

Boc-Orn(Z*)

Boc-D-Phe

Boc-Trp

Boc-Ala 5 Boc-D-Trp

Boc-His(Tos) *Z tarkoittaa bentsyloksikarbonyyliä Esimerkki 29 H2-His-D-Trp-Val-Trp-D-Phe-Lys-NH2:n synteesi 10 Esimerkissä 16 esitettyä menettelytapaa voidaan käyttää peptidin H2-His-D-Trp-Val-Trp-D-Phe-Lys-NH2 synte-tisoimiseksi käyttäen seuraavaa aminohappojärjestystä:

Boc-Lys(ClZ)

Boc-D-Phe 15 Boc-Trp

Boc-Val Boc-D-Trp Boc-His(Tos)

Esimerkki 30 20 H2-His-D-Trp-Ser-Trp-D-Phe-Lys-NH2:n synteesi

Esimerkissä 16 esitettyä menettelytapaa voidaan käyttää peptidin H2-His-D-Trp-Ser-Trp-D-Phe-Lys-NH2 synteti-soimiseksi käyttäen seuraavaa aminohappojärjestystä:

Boc-Lys(ClZ) 25 Boc-D-Phe

Boc-Trp Boc-Ser(Bzl)

Boc-D-Trp Boc-His(Tos) 72 772 5 1

Esimerkeissä 1-30 valmistettujen tuotteiden TLC- ja aminohappoanalyysiarvot

Taulukko A 5 RF-arvot butanoli:etikkahappo: butanoli:etikkahappo:

Esimerkki vesi (4:1:5) vesi:pyridiini _(15:3:12:10) 10 1 0,33 0,66 2 0,62 0,39 3 0,33 0,66 4 0,23 0,57 15 7 0,69 0,65 8 0,85 0,81 9 0,76 0,74 11 - 0,65 12 0,69 20 13 0,77 0,75 14 0,69 0,69 15 0,64 0,67 16 0,2 0,6 17 0,32 0,70 25 18 0,70 0,70 19 0,86 0,76 20 0,67 0,56 21 0,32 0,65 22 0,25 0,62 30 23 0,30 0,69 24 0,42 0,66 25 0,15 0,36 26 0,24 0,5 27 0,36 0,74 35 28 0,26 0,54 29 0,24 0,56 30 0,21 0,60 73 7725 1

Taulukko B Aminohappoanalyysi 5 Esimerkki 1 His: Trp: Ala:Phe 1.03:2.27:1.03:0.95 2 Tyr: Trp: Ala:His 0.99:2.30:1.05:0.95 10 3 Ala : Trp : His : Trp 0.973:0.973:0.984:2.072 5 Tyr: Trp: Ala 1.05:1.87:1.09 6 Tyr: Trp: Ala: Phe 15 1.00:2.03:0.93:1.04 7 Trp: Ala: Phe 1.96:1.03:1.01 8 Tyr: Ala: Phe 1.93:1.03:1.04 2° 9 Tyr: Trp: Ala: Phe 1.07:1.86:0.97:1.?? 10 Tyr: Ala: Phe 0.95:1.06:1.05 11 Tyr: Trp: Ala: Phe: Met 25 0.96:1.39:0.97:1.03:1.05 12 Tyr: Trp: Ala: Phe: Thr 1.01:1.93:0.9 :1.12:1.04 13 Tyr: Trp: Phe: Ala: Glu 1.05:1.78:1.07:1.04:1.07 30 14 Tyr: Trp: Phe: Ala: Glu 1.04:0.95:1.04: 1 :1.04 15 Tyr: Trp: Ala: Phe: Asp 0.97:1.80:0.97:1.12:1.16 16 His: Trp: Ala: Phe: Lys oc 1.01:2.04:0.96:0.97:1.02 35 77251 74

Taulukko B (jatkuu) 17 Tyr: Trp: Ala: Phe: Lys 5 0.99:1.93:0.97:1.01: 1.1 18 Tyr: Trp: Ala: Phe: Glu 1.05:2.05:1.01: 1.1: 0.8 20 Tyr: Trp: Gly: Phe: Glu 0.98:0.77:0.98:1.01:1.02 10 21 Ala : Phe : Lys : His : Trp 0.977:1.012:1.044:1.017:1.95 22 Ala : Phe : His : Trp : Arg 1.006:0.997:0.993:2.008:0.996 23 Glu : Ala : Phe : His : Trp 15 1.012:0.992:1.029:1.042:1.924 24 His: Trp: Ala: Phe: Glu 1.02:1.94:1.00:1.01:1.02 25 His: Trp: Ala: Phe:L-Arg 1.07:1.93:1.01:0.99:1.04 26 His : Trp: Ala: Phe: Lys 1.023:1.97:1.00:0.95:1.05 27 His: Trp: Ala: Phe: Lys 0.99:2.06:0.95:0.99:1.01 28 His: Trp: Ala: Phe: Orn 25 1.04:2:02:0.96:0.97:0.86 29 His: Trp: Vai: Phe: Lys 1.04:1.95:0.94:1.03:1.04 30 Ser : Phe : Lys : His : Trp 0.921:1.018:1.040:1.015:2.003

Claims

77251 75
1. Kasvuhormonia vapauttavien penta- ja heksapepti-dien valmistuksessa käytettävä välituote, tunnettu 5 siitä, että sen kaava on (Pr)r-B1-D-Trp-B3-Trp-B5-B6-® I jossa r on 0 tai 1;
10 Pr on t-butoksikarbonyyliryhmä (tai butoksikarbonyyli); B3 on His(Tos), Tyr(BrZ), p-kloori-(tai p-halogeeni)-Phe, 0-metyyli-(tai 0-(C^-C^)-alkyyli)-Tyr(BrZ), tai 3-N-metyy-li- (tai C1-C4)alkyyli)His, kun r on 1, tai desamino-Tyr, kun r on 0; 15 on Ala, Gly, Vai tai Ser(Bzl); ja Bc-B, on D-Phe, D-His(Tos), D-Tyr(Brz), D-p-kloori(tai halo- D Π geeni)Phe, D-Phe-Met, D-Phe-Thr(Bzl), D-Phe-Glu- Y^-Bzl, D-Phe-Gln, D-Phe-Asn, D-Phe-Lys(C1Z), D-Phe-Phe, D-Phe-Gln-ONP, D-Phe-Arg(Tos), D-Phe-HomoArg(Tos), tai D-Phe-Orn(Z); 20 sillä edellytyksellä, että B^ ei ole Tyr(Brz),kun on Ala, Gly, Vai tai Ser(Bzl) ja Bg-Bg on D-Phe, D-Tyr(BrZ), D-Phe-Gln, D-Phe-Thr(Bzl) tai D-Phe-Lys(C1Z); jolloin BrZ on o-bromibentsyylioksikarbonyyli; Bzl on bentsyyli; 25 "f -Bzl on Y*-bentsyyliesteri; C1Z on o-klooribentsyylioksikarbonyyli; ONP on nitrofenyyliesteri; Tos on p-tolueenisulfonyyli; ja Z on bentsyylioksikarbonyyli; ja 30 ® on p-metyylibentshydryyliamiini- tai hydroksimetyyli- hartsi.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen välituote, tunnettu siitä, että se on (S) Boc-His(Tos)-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe- ,
35 Boc-Tyr(BrZ)-D-Trp-Ala-Trp-D-His(Tos)-®, Boc-His (Tos)-D-Trp-Ala-Trp-D-His (Tos) -®, 76 77251 Boc-His (Tos)-D-Trp-Ala-Trp-D-Tyr (BrZ) -®, Boc-Tyr(BrZ)-D-Trp-Ala-Trp-D-p-Cl-Phe-®, (K) Boc-p-Cl-Phe-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe- , 3(p-OH-fenyyli)propaanihappo-D-Trp-Ala-Trp-D-P-
5 Cl-Phe-®, _ (k) Boc-Tyr(BrZ)-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Met-^, Boc-Tyr(BrZ)-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Thr(Bzl)-®, Boc-Tyr (BrZ) -D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Glu- Y'-bentsyyli- . . φ esterl ' (g)
10 Boc-Tyr(BrZ)-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Asn-^, Boc-His(Tos)-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys(C1Z)-®, Boc-Tyr(BrZ)-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Glu-\^-Bzl-®, Boc-Tyr(BrZ)-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Phe-^, Boc-Tyr(BrZ)-D-Trp-Gly-Trp-D-Phe-Gln-ONP-
15 Boc-His(Tos)-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys(G1Z) -®, Boc-His(Tos)-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Arg(Tos) , Boc-His(Tos)-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Gln-ONP-^, Boc-His(Tos)-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Glu-iT-Bzl-®, Boc-His(Tos)-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-HomoArg(Tos) -®,
20 Boc-3-N-Me-His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys(C1Z)-®, Boc-His(Tos)-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys(C1Z)-®, Boc-His(Tos)-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Orn(Z)- , Boc-His(Tos)-D-Trp-Val-Trp-D-Phe-Lys(C1Z) -®, tai Boc-His(Tos)-D-Trp-Ser(Bzl)-Trp-D-Phe-Lys(C1Z) 25 · joissa ^ on p-metyylibentshydryyliamiini- tai hydroksimetyyli-hartsi . 77 77251