FI57973C - Anvaendning av ett proteolytiskt enzym i tvaettmedelskompositioner - Google Patents

Description

R3F1 M (11)KUWl.UTUSjULKAISU r n q n 7 LJ ' } UTLÄGGN I NCSSKRIFT O / 9 / 3 C /in Patentti myönnetty 10 11 1980 • ·<0λν· (45) ' ' Patent meddelat '*s v ' (51) Kv.lk?/Im.a.3 c 11 D 3/386 SUOMI—FINLAND pi) 781061 (22) HatanltpUvi — Anteicnlnpdtg 07-Oi.78 ^ ' (23) Alkupllvt—GIMgh«tsd«t l8.ll.75 (41) Tullut |ulklMk*l — Bllvlt affmtllg 07 · OU. 78 tatmtl-i. retcliterlhalNtut (♦« ..ΛΝΙω», „ 0„

Patent· och registerttyrelMn Antölun utlsgd och uti.ikrifun publktnd 31-07.80 “ (32)(33)(31) Pyydetty ttuoiktu»—B«ftrd prioritet 19.11.7*+

Iso-Britannia-Storbritannien(GB) 500*i*i/7*+ —' (71) Gist-Brocades nv, Wateringseweg 1, Delft, Alankonjaat-Nederländerna(NL) (72) Bauke Te Nijenhuis, Rijswijk-ZH, Alankomaat-Nederländerna(NL) (7*+) Berggren Oy Ab (5*+) Proteolyyttisen entsyymin käyttö pesuainekoostumuksissa -

Användning av ett proteolytiskt enzym i tvättmedelskomposit.ioner (62) Jakamalla erotettu hakemuksesta 7532*+7 (patentti 558U8) -Avdelad frän ansökan 7532*+7 (patent 5581+8) Tämä keksintö koskee uuden proteolyyttisen entsyymin, jolla on korkea aktiviteetti alkaalisella alueella, käyttöä pesuainekoostumuksissa.

Proteolyyttiset entsyymit, joilla on korkea aktiviteetti alkalisella alueella, ovat tunnettuja. Vedder kuvaa julkaisussa Antonie van Leeuwenhoek, 1^ (1934) 141-147, uutta mikro-organismia, jolle hän on antanut nimen Bacillus alcalophilus. Tämä mikro-organismi kykenee hajottamaan gelatiinia ja hemoglobiinia vahvasti aikaiisessa väliaineessa. Tämän mikro-organismin kyvyn voidaan katsoa johtuvan entsyymistä, kuten myöhemmät tutkimukset ovat osoittaneet (vrt. GB patentti 1 205 403). Korkean aktiviteetin aikalisissä väliaineissa omaavia entsyymejä on kuvattu myös useissa muissa julkaisuissa, mm. GB patentissa 1 243 784 ja NL hakemusjulkaisussa 72 07050, joissa esitetään useita Bacillus-sukuun kuuluvien jäsenten tuottamia proteolyyttisiä entsyymejä, jotka ovat käyttökelpoisia pesuainekoostumuksissa, jotka ovat normaalisti pesunesteeseen liuotettuina aikalisiä.

Tässä keksinnössä esitetään uusi entsyymi, joka sen lisäksi, että se korkean proteolyyttisen aktiviteettinsa vuoksi aikalisissä väli- 57973 aineissa on erittäin sopiva sisällytettäväksi pesuainekoostumuksiin, voidaan tuottaa hämmstyttävän korkeilla saannoilla käyttäen Bacillus nov. spec., jota nimitetään "PB 92". Saannot ovat korkeampia kuin esimerkiksi Bacillus firmus-kannalla (vrt. NL hakemusjulkaisu 72 07050) saadut. Toinen odottamaton keksinnön mukainen etu on, että entsyymi osoittaa hyvää pesutehoa perboraattipitoisissa pesu-koostumuksissa. Bacillus PB 92-kannan viljelmä on talletettu Delftin teknillisen korkeakoulun mikrobiologisessa laboratoriossa Hollannissa talletusmerkinnällä OR-60.

Keksinnön mukaisen proteolyyttisen entsyymin tunnusmerkit on esitetty oheisessa patenttivaatimuksessa.

Entsyymin ominaisuudet (a) pH/aktiviteetti-riippuvaisuus PH/aktiviteetti-riippuvaisuuden määrittämiseksi noudatettiin Anson-hemoglobiinimenetelmää (vrt. J. Gen. Physiology, 22 (1939), 79-89) mahdollisimman tarkasti. Anson'in viitteessä lähemmin määrittelemättä jätetyt yksityiskohdat esitetään alla:

Substraattivalmiste: Anson'in mukainen naudan hemoglobiini-proteaasi- substraatti, lyofilisoitu, puhdas, tuottaja: SERVA, Heidelberg,

Saksa.

Substraattiliuos: Edellä mainittu hemoglobiini sekoitettiin veden kanssa 22-%:ksi (p/til) liuokseksi. Täsä vastavalmistetusta väke- ~ västä liuoksesta tehtiin laimennettu liuos, joka sisälsi 8 ml 1-n NaOH:ta, 72 ml vettä, 36 g virtsa-ainetta ja 10 ml väkevää liuosta.

Tätä alkalista liuosta pidettiin 60 minuuttia 25°C:ssa hemoglobiinin — denaturoimiseksi. Lisättiin puskuriliuoksia (kts. alla), virtsa-ainetta ja mertiolaattia, pH säädettiin, samaten tilavuus niin, että hemoglobiinipitoisuudeksi saatiin 2,2 %.

pH-vertailuliuokset saatiin Merck'iltä, Darmstadt, Saksa (puskuri-Titrisol 8,00, 9,00, 10,00, 11,00 ja 12,00).

Käytettiin PHILIPS-digitaali-pH-mittaria (PW 9408). pH 8 substraatti-liuoksen puskurikoostumus oli trypsiinimäärityksessä kuvatun mukainen. Muiden puskuriliuosten koostumukset olivat julkaisun Dawson et ai.: "Data for Biochemical Research", toinen painos (1969), 3 57973

Oxford, s. 475 lähtien, mukaiset. Komponentteja lisättiin substraat-tiliuokseen, kunnes saatiin alla esitetyt lopulliset pitoisuudet; pH-alue 8,3 - 10,3: glysiini - NaOH 0,05-m pH-alue 10,8 - 11,3: Na2HP04 - NaOH 0,025-m pH-alue 11,7 - 12,5: KC1 - NaOH 0,05-m

Entsyymi!iuos: Vesiliuokset tehtiin juuri ennen käyttöä; suoritettiin laimennus väkevyyteen 200 DU/ml. Ilmaisu DU tarkoittaa Delft Units, joka viittaa menetelmään entsyymiaktiviteetin määrittämiseksi, joka menetelmä on kuvattu GB patentissa 1 353 317.

_ Inkubaatio: Jokainen analyysi käsitti kaksi määritystä ja yhden sokean kokeen. Substraatti ja entsyymi-liuokset pantiin vesihauteeseen 25°C:seen. Substraattiliuosten pH:t määritettiin Ingold HA-elektrodil-la ja myös käyttäen Ingold LOT-elektrodia pH-arvoilla alle 11,0. Vertailuliuoksina käytettiin aina Titrisol-liuoksia. 2,5 ml:aan sentrifugiputkeen vietyä substraattiliuosta lisättiin 0,5 ml entsyy-miliuosta; riittävä sekoitus varmistettiin sekoittamalla välittömästi nupilla varustetulla lasisauvalla. Sokeakoetta, jossa ei ollut entsyymiä, inkuboitiin samoin.

Inkubaatio lopetettiin 10 minuutin kuluttua lisäämällä 5 ml 0,3-n trikloorietikkahappoa; sokeaan kokeeseen lisättiin 5 ml trikloori-etikkahappoliuosta ja 0,5 ml entsyymiliuosta. Trikloorietikkahappo-~ liuos lisättiin ZIPPETTE'llä (Jencons, Hemel Hempstead, Hertfordshire).

Seosta sekoitettiin voimakkaasti nupilla varustetulla lasisauvalla, joka vielä oli sentrifugiputkessa. Putket asetettiin vesihauteeseen _ 2°C:seen.

pH-poikkeamia inkubaation aikana seurattiin mittaamalla pH inkubaa-tion alussa ja lopussa käyttäen LOT-elektrodia inkubaatio-pH-arvoissa alle 11,0 ja HA-elektrodia pH-arvoissa yli 11,0. pH-poikkeama oli alle 0,1 pH-yksikköä entsyymiliuoksia inkuboitaessa, jotka sisälsivät 50 DU/ml tai alle, ja alle 0,15 pH-yksikköä entsyymiliuoksia inkuboitaessa, joiden entsyymipitoisuus oli 200 tai 500 DU/ml. Keskiarvot määritettiin käyttäen perustana Ingold HA-arvoja.

Linkoaminen: Kun putkia oli pidetty vähintään 30 minuuttia 2°C:ssa, lingottiin kiihtyvyydellä 6000 g.

57973 Värin muodostuminen: Värinmuodostus suoritettiin vesihauteessa 25°C:ssa; 5 ml päällä olevaa nestettä lisättiin 10 ml:aan 0,5-n NaOHrta, ja seosta sekoitettiin välittömästi käyttäen VORTEX-GENIE-sekoittajaa (Scient. Industr., USA). Tasan 2 minuutin kuluttua seokseen lisättiin 3 ml fenolireagenssia Zippette'n avulla ja koko ajan sekoittaen. Fenolireagenssi oli Merck'in Folin-Ciocalteus fenolireagenssi laimennettuna 2 tilavuudella vettä.

Väri liuotettiin tasan 6 minuuttia fenolireagenssi-lisäyksen jälkeen Zeiss M4 QIII spektrofotometrillä, jossa oli automaattinen auk- _ ko 750 nm:ssä. Vertailuna oli värin muodostuminen tyrosiiniliuok- -7 sessa, joka sisälsi 8 x 10 ekvivalenttia tyrosiinia 5 mltssa 0,2-n HCl:ää, jossa oli 0,5 % (til/til) formaldehydiä. Vertailu^ näytteen värinkehitys tarkistettiin säännöllisin aikavälein, mutta poikkeamat keskiarvosta eivät koskaan ylittäneet 1 %:a missään laimennetun fenolireagenssin erässä.

Entsyymi osoitti seuraavanlaista proteolyyttistä aktiviteettia: pH 8,3 8,8 9,4 9,8 10,3 10,8 11,3 11,7 12,5

suhteellinen aktiviteetti 85 87 91 88 87 94 91 99 lOO

(b) Elektroforeesitutkimus

Entsyymin ominaisuuksia voidaan lisäksi luonnehtia zymogrammimene- _ telmän avulla, joka perustuu kiekkoelektroforeesiin polyakryyli-amidigeelissä ja silmämäärin havaittuun aktiviteettiin. Menetelmän ovat kuvanneet Zuidweg et ai., Biotech, and Bioeng. 14 (1972), _ 685-714, ja sillä voidaan suoraan verrata valmisteita. Suoritettiin vertailu keksinnön mukaisen entsyymin (a), Bacillus-kannan, joka on talletettu National Collection of Type Cultures in London merkillä NCTC 4553, vrt. GB patentti 1 205 403 tuottaman proteaasin (b), kaupallisesti saatavan proteolyyttisen entsyymin MAXATASE:n (Gist-Brocades N.V., Delft, Hollanti) (c) ja kaupallisesti saatavan alkalisen proteaasin ESPERASE:n (Novo Terapeutisk Laboratorium A/S, Kööpenhamina, Tanska) (d) kesken, (vrt. liitteenä olevaa piirrosta).

Vain pääkomponentit on esitetty. Elektroforeettisessa erotuksessa käytetty puskurisysteemi oli systeemi E, joka sisälsi tris-pusku-ria (so. 2-amino-2-hydroksimetyyli-l,3-propaanidiolia ja boorihap- 57973 poa), ja silmämäärin tehty havainto aktiviteetista suoritettiin immersio-kontaktitekniikalla, joka on kuvattu Zuidweg'in et ai. artikkelissa.

Piirroksesta nähdään, että keksinnön mukainen entsyymi koostuu ainakin kahdesta komponentista ja sen koostumus on erilainen kuin muiden entsyymivalmisteiden.

(c) Aminohappokoostumus w Määritettiin kahden pääkomponentin A ja B aminohappokoostumus (kts.

liitteenä olevia piirroksia). Koostumus on esitetty taulukossa yhdessä useiden muiden tunnettujen entsyymivalmisteiden aminohappo-koostumusten kanssa: (1) Subtilisin Carlsberg, kts. Delange ja

Smith, J. Biol. Chem. 243 (1968) 2134; (2) Bacillus sacchariticus' in tuottama entsyymi,käytetty vertailuyhdisteenä US patentissa 3 622 458; (3) Bacillus firmus1 in tuottama entsyymi, kts. NL patentti 72 07050 ja (4) B 221:n tuottama entsyymi, kts. K. Horikoshi, Agr. Biol. Chem. 35 (1971) 1407.

Määritysten virherajojen voidaan katsoa olevan + 10 % esitetyistä arvoista.

Taulukosta nähdään edelleen entsyymien molekyylipainot sekä iso-elektriset pisteet.

6 57973

Keksinnön mukainen

Amino- entsyymi happo (1) (2) (3) (4) Komp (A) Komp. (B) LYS 9 6 4 6 6 6 HIS 5 5 6 8 7 6 ARG 4 3 6 8 9 8 ASP 28 20 23 29 27 28 THR 19 14 14 18 16 16 SER 32 37 22 23 30 30 _ GLU 12 12 14 16 15 15 PRO 9 10 12 16 12 13 GLY 36 25 30 39 31 33 ALA 42 27 32 45 36 36 ~

CYS 0 0 0 0 O O

VAL 31 20 21 27 22 22 MET 5 3 2 4 3 3 ILEU 10 12 7 9 8 9 LEU 16 12 16 22 18 18 TYR 13 9 6 7 7 6 PHE 4 2 2 2 2 2 TRY 13-5 3 3

Mol.

paino 27,300 22,700 26,000 30,000 25,500 25,500

Isoelek- trinen piste 9,3 75-8,0 11,0 9,4 10,5 10,5

Taksonomia —

Taksonomiset määritykset suoritettiin julkaisun Smith, Gordon ja Clark, "Aerobic Sporeforming Bacteria", U.S. Dept, of Agr.,

Monograph No. 16 (1952) mukaan. Bacillus PB 92:n itiönmuodostus voidaan saada aikaan viljelemällä lyofilisoituja 65 vrk vanhoja TSB-agar viljelmiä (Tryptonisoijaliemi, valmistaja Oxoid) TSB-agarilla.

Morfologia (a) Vegetatiiviset solut: (liikkuvat) sauvat, päät pyöristetyt, yleensä yksitellen, mutta myös lyhyinä 2-8 sauvan ketjuina. Joskus esiintyy erittäin pitkiä ketjuja, joiden pituus on lOOO yU tai yli.

5 7 9 7 3 (b) Sporangit: Joskus hieman turvonneet.

(c) Itiöt: 0,6-0,8 x 1,0-1,3 ^u; ellipsoiden muoto; paksuseinäi siä subterminaalista parasentraaliin.

(d) Varjomuodot: melko useita; myös keskellä normaalien solujen muodostamaa ketjua.

Muita ominaisuuksia Maksimikasvulämpötila: 50°C.

Gram-positiivinen; pakollisesti aerobinen.

^ Kasvu ravintoagarilla pH 7,2:ssa: kasvun alku hieman hitaampi kuin pH 9,4:ssä. Pesäkkeiden reunat pH 7,2:ssa yhtenäiset, mutta pH 9,4:ssä käpertyneet lankamaisiksi.

^ Ei pigmentin muodostusta tyrosiini-agarilla pH 9,5:ssä.

Heikko tärkkelyshydrolyysi perunatärkkelys/ravintoagarilla pH 9,5:ssä.

Vahva gelatiinin nesteytys gelatiini/ravintoagarilla pH 9,5:ssä. Selvä kaseiinin hajottaminen maitoagarilla pH 8,4:ssä.

Ei kasvua tai ei olennaista kasvua glukoosi- tai mannitoli-agarilla, jossa nitraatti on ainoa typpilähde.

Nitraattipelkistys positiivinen nitraatti/ravintoliemessä pH 9,5:ssä.

Eristäminen

Keksinnön mukaista entsyymiä tuottava mikro-organismi eristettiin maanäytteestä Sambiasta erityisellä eristysmenetelmällä pH-alueella ^ 8,0-9,5.

Fermentaatio w Bacillus PB 92:ri tuottama entsyymi saadaan viljelemällä tätä Bacillusta aerobisesti ja ottamalla entsyymi talteen tavallisella tavalla.

Hyvien entsyymisaantojen saamiseksi ovat tarpeen viljelyväliaineet, jotka sisältävät hyvin assimiloituvia hiililähteitä, kuten glukoosia, sakkaroosia, dekstriinejä ja tärkkelystä, orgaanista alkuperää olevaa typpilähdettä, kuten kaseiinia, hiivaa ja soijajauhoa. Lisäksi on edullista lisätä tietty määrä kalsium- ja magnesiumsuo-loja ja useita eri hivenalkuaineita.

Fermentaation aikana on tarpeen hyvä ilmastointi. Väliaineen pH pidetään sopivasti välillä 6,5-10, edullisesti 7-9. Fermentaatio-lämpötila on sopivasti 37°C.

8 57973

Kun otetaan huomioon kaikki varotoimet, voidaan saada erittäin 5 korkeita saantoja (esimerkiksi 8 x 10 DU proteaasiaktiviteetti käytetyn glukoosin g:aa kohti). Saanto on riittävän korkea entsyymin taloudelliseen tuottamiseen.

Entsyymin talteenotto

Entsyymi otetaan talteen fermentaatioliemestä tavallisella tavalla.

Liemi suodatetaan mikro-organismien ja liukenemattoman aineksen poistamiseksi. Kuivia pesuainekoostumuksia varten entsyymi tavallisesti saostetaan lisäämällä suodokseen veden kanssa sekoittuvia or- —" gaanisia liuottimia tai epäorgaanisia suoloja, kuten Na2S04 tai (NH.)_S0,. Tuotannon taloudellisuuden vuoksi suodoksen tilavuus 4 & 4 ensin pienennetään haihduttamalla ennen liuottimien tai suolojen -- lisäystä. Nestemäisiin pesuainekoostumuksiin voidaan käyttää suodatettua lientä tai uudelleen liuotettua entsyymiä.

Saostamisen jälkeen entsyymi erotetaan suodattamalla tai linkoamalla, ja saatu kakku kuivataan.

Pesuainekoostumus

Entsyymi voidaan sisällyttää pesuainekoostumukseen tavallisella tavalla. Koostumukseen käytetty entsyymimäärä vastaa yleensä määrää, joka antaa lopulliselle pesu ainekoostumukselle proteolyytti-sen aktiviteetin noin 100-5000 DU/g, edullisesti 500-1000 DU/g. Proteolyyttisen aktiviteetin määritys on kuvattu GB patentissa 1 353 317.

Keksinnön mukaista entsyymiä sisältävät pesuainekoostumukset sisältävät lisäksi ainakin yhtä detergenttiä. Pesuainekoostumuksissa käytetyt detergentit ovat samoja, joita tavallisesti käytetään entsymaattista aktiviteettia omaavissa pesuainekoostumuksissa. Yleensä voidaan käyttää ionittomia ja anionisia pinta-aktiivisia yhdisteitä, kuten vesiliukoisia saippuoita, anionisia, ionittomia, amfolyyt-tisiä ja kahtaisionisia detergenttejä. Esimerkki tavallisesti käytetystä detergentistä on dodekyylibentscenisulfonaatti. Yksinään tai seoksina käytettyjen detergenttien määrä on tavallisesti noin 4-20 % pesuainekoostumuksesta.

Pesuainekoostumukset voivat lisäksi sisältää muita sinänsä tunnet tuja yhdisteitä, joita yleensä käytetään proteolyyttistä aktivi- 57973 teettia omaavissa pesuainekoostumuksissa. Ne sisältävät tavallisesti kompleksisia fosfaatteja, esimerkiksi alkalimetallitripoly-fosfaattia tai alkalimetallipyrofosfaattia, edullisesti noin 40-50 % pesuainekoostumuksen painosta. Lisäksi tai vaihtoehtoisesti pesuainekoostumukseen voidaan sisällyttää esim. alkalimetalli-syaanitriasetaattia ja alkalimetallisitraattia, joiden vaikutus pesuainekoostumuksissa on monimutkainen, tärkeimmän vaikutuksen ollessa veden pehmentäminen. Muita tavallisesti lisättyjä yhdisteitä ovat esimerkiksi alkalimetallisilikaatti, tavallisesti 1-10 —- paino-%, heikosti alkaliset yhdisteet, kuten alkalimetallibikarbo- naatti, tavallisesti 20 paino-%:iin asti, täyteaineet, esimerkiksi alkalimetallisulfaatti, ja muut lisäaineet, kuten karboksimetyylisel-luloosa, hajusteet ja optiset kirkasteet. Vielä eräs tavallisesti lisätty yhdiste on aikaiimetalliperboraatti, varsinkin natrium-perboraatti, ja on huomattava, että keksinnön mukaisella entsyymillä on havaittu olevan odottamattoman hyvä pysyvyys perboraattien yhteydessä.

Pesuainekoostumukset voidaan valmistaa tavallisella tavalla, kuten sekoittamalla yhteen aineosat, tai valmistamalla ensin esiseos, joka sitten sekoitetaan muiden komponenttien kanssa. Entsyymi sekoitetaan edullisesti esiseokseksi yhden tai useamman muun komponentin kanssa, esimerkiksi täyteaineen kanssa etukäteen määrätyn entsymaattisen aktiviteetin omaavan väkevöitteen valmistamiseksi, joka väkevöite voidaan sekoittaa muiden haluttujen komponenttien ^ kanssa.

Keksintöä valaistaan seuraavilla esimerkeillä:

Esimerkki I

Bacillus PB 92:n viljely Käytettiin seuraavaa väliainetta:

Hiiva (laskettu kuiva-aineeksi) 22 g/1 K2HP04-3H20 5 g/1

MgS04.7H20 0,05 g/1

CaCl2 0,05 g/1

FeS04.7H20 0,005 g/1

MnS04-4H20 0,005 g/1 10 __ 57973 Väliaineen aineosat liuotettiin 90 %:iin lopullisesta tilavuudesta ja steriloitiin pH 7,0:ssa lämpötilassa 120°C tunnin ajan.

Ymppiviljelmä saatiin lisäämällä Bacillus PB 92 vinoviljelmää 100 ml:aan Trypticase-soijakasvulientä (Oxoid), johon steriloinnin jälkeen (20 minuuttia 120°C:ssa) lisättiin 4 ml 1-m natriumkarbonaattia. Ymppiviljelmää inkuboitiin 30°C:ssa 24 tuntia ravis-tuskoneessa.

Väliaine ympättiin 37°C:ssa pH 8,0:ssa 1 tilavuudella ymppiviljel- ^ mää 100 tilavuutta kohti väliainetta. Pääfermentaatio suoritettiin 37°C:ssa sekoitetuissa fermentoreissa, jotka oli varustettu pH-mittauslaitteella, vaahdonestolaitteella ja laitteella liuenneen hapen pitoisuuden jatkuvaksi mittaamiseksi ja hapen sitoutumisnopeu-den mittaamiseksi. 17 tuntia ymppäämisen jälkeen lisättiin tunnin ajan 120°C:ssa steriloitua 30-%:ista glukoosiliuosta väliaineen lopullisen pitoisuuden saamiseksi 30 g:ksi glukoosia litraa kohti.

Saadut tulokset osoittivat proteolyyttisen entsyymin saannoksi 8 x lO^DU käytettyä glukoosi-grammaa kohti.

NL hakemusjulkaisussa 72 07050 esimerkissä 1 on kuvattu fermentaa-tiokoe, jossa saatiin lopulliseksi saannoksi 11 x 10^ DU/eLatuslie-militra (50 Anson-yksikköä vastaa suunnilleen 11 x 10 DU). Käytetty hiilihydraattimäärä vastaa noin 75 g glukoosia elatusliemen litraa kohti. Proteaasisaanto kulutettua glukoosigrammaa kohti NL hakemusjulkaisun 72 07050 esimerkissä on siten 1,5 x 105 DU. Tämän keksinnön mukainen saanto on siten noin 5-kertainen.

Keksinnön mukaista entsyymiä sisältävän pesukoostumuksen tehon osoittamiseksi suoritettiin pesukokeita seuraavalla tavalla: (1) Kangaskoepalat: EMPA-116 (liattu verellä, maidolla ja tussil la) , valmistaja: Eidgenössische Material Prilfungs- und Versuchsanstalt fur Industrie, Bauwesen und Gewerbe, St. Gallen, Sveitsi. Koepaloja varastoitiin pimeässä ja ilmatiiviisti. Pesukoetta varten tarpeelliset palat silmämäärin arvioiden 5 x 5 cm leikattiin tasaisesta kankaan osasta.

11 5 7 9 7 3 (2) Pesuliuos: 4 g/1 perboraattipitoista kaupallisesti saatavaa pesuainetta, jossa ei ollut entsyymiä, litraa kohti "synteettistä vesijohtovettä" (STW), jonka kovuus saksalaisen asteikon mukaan oli 15°DH, joka vesi valmistettiin seuraavasti: 10 ml 2-%:sta CaCl2:n (pro analyysi) liuosta tislatussa vedessä lisättiin 10 mlraan 0,656-%:ista MgC^-liuosta tislatussa vedessä 1000 ml:n mittapullossa. Liuokset sekoitettiin huolella. Sitten lisättiin 10 ml 2,l-%:ista NaHCO^-liuosta (pro analyysi), ja liuokset sekoitettiin jälleen, mittapullo täytettiin sitten tislatulla _ vedellä 1000 ml:ksi.

(3) Koe: 300 ml:n Erlenmeyer-pulloihin lisättiin kuhunkin 250 ml pesuliuosta. Sitten lisättiin entsyymimäärät, jotka vastasivat 0, 250, 500 ja 1000 DU/g pesuainekoostumusta (kaksoiskokeet). Erlenmeyer-pullot asetettiin ravistettuun termostaattiin 45°C:seen, jossa ne saivat lämmetä, jolloin niitä samalla sekoitettiin. Sitten jokaiseen Erlenmeyer-pulloon vietiin kangaspala, ja pulloa ravisteltiin 45°C:ssa tasan tunnin ajan.

Pesun jälkeen pesuliuos dekantoitiin, ja lisättiin 250 ml STW:tä. Pullot suljettiin kumitulpilla ja niitä ravisteltiin voimakkaasti tasan minuutin ajan.

Kangaspalat koottiin dekantterilasiin, jossa ne huuhdottiin hitaasti valuvalla vesijohtovedellä. Viimeisen kangaskappaleen lisäyksestä — lukien huuhtomista jatkettiin noin 10 minuuttia. Kangaspalat sai vat kuivua ilmassa pimeässä käärittyinä valkeaan puhtaaseen pyyhkeeseen.

Kuivumisen jälkeen heijastus mitattiin ZEISS ELREPHO remissiomitta-rilla suodattimena 1 kankaan molemmilta puolilta käyttäen vertailuna MgO:ta. Keskiarvot laskettiin verrattuna täysin puhtaaksi pestyyn kangaspalaan, jonka heijastus oli 65,8 % MgO:hon verrattuna.

Keksinnön mukaisen entsyymin vertailu MAXATASE'n ja ESPERASE'n kanssa (aikalisiä proteaaseja, joita valmistavat Gist-Brocades N.V., Delft, Hollanti, ja Novo Terapeutish Laboratorium A/S, Kööpenhamina, Tanska).

Pesukokeet suoritettiin yllä esitetyllä tavalla pH 9,7:ssä. Tulokset olivat seuraavat: