KR100237969B1

KR100237969B1 - 신규 프로테아제

Info

Publication number: KR100237969B1
Application number: KR1019930701077A
Authority: KR
Inventors: 아웃트룹 헬레; 담브만 클라우스; 아니타 아아슬링 도리트
Original assignee: 한센 핀 베네드; 노보 노르디스크 에이/에스; 안네 제헤르
Priority date: 1990-10-12
Filing date: 1991-10-11
Publication date: 2000-01-15
Anticipated expiration: 2011-10-11
Also published as: ATE122392T1; JPH06503717A; FI931630A0; US5358865A; KR930702515A; JP3126732B2; FI931630L; FI110434B; DE69109685D1; EP0552222B1; WO1992007067A1; ES2073174T3; EP0552222A1; DE69109685T2; DK246290D0

Abstract

본 발명은 호알칼리성 바실러스 종의 균주에서 얻어지는 세제 프로테아제의 분야에 관한 것이다. 더욱 특이하게 본 발명은 바실러스 종 J 20 균주에서 얻어지는 프로테아제에 관한 것이다.

더욱이 본 발명은 프로테아제의 제조방법, 세제 효소로서의 프로테아제 용도, 뿐만 아니라 본 발명의 프로테아제를 함유하는 세제 조성물 및 세제 부가물에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]

신규 프로테아제

[도면의 간단한 설명]

제1도는 STPP의 존재 및 부재시에서(■ J 20 ; □ J 20 + 0.1% STPP) 본 발명 효소의 단백질분해 활성(기질은 카제인이고 pH 9.5에서 수행) 및 온도와의 관계(상대적 활성도 %)를 나타내는 도면이고; 및

제2도는 본 발명 효소의 단백질분해 활성(기질은 카제인이고 25℃에서 수행) 및 pH와의 관계(상대적인 활성도 %)를 나타내는 도면이다.

[기술적 배경]

본 발명은 호알칼리성 바실러스 종의 균주에서 얻어지는 세제 프로테아제의 분야에 관한 것이다. 더욱 특이하게, 본 발명은 바실러스 종 J 20 균주에서 얻어지는 신규 알칼리성 프로테아제에 관한 것이다.

더욱이, 본 발명은 프로테아제의 제조방법, 세제 효소로서 프로테아제의 용도, 및 본 발명의 프로테아제를 함유하는 세제 부가물 및 세제 조성물에 관한 것이다.

[배경기술]

세제 효소는 20년 이상 시판되고 있으며 현재 전세계에서 걸쳐 분말 및 액체세제의 전형적인 세제 성분으로 잘 확립되어 있다.

저온세척을 선호하는 추세에 따라, 지난 수십년간 세척 효소의 소비가 증가하였다. 세제 조합물에 사용되는 효소에는 프로테아제, 리파제, 아밀라제, 셀롤라제, 및 다른 효소, 또는 이것들의 혼합물이 있다.

상업적으로 가장 중요한 것은 프로테아제이다. 세제 프로테아제는 자연계에 존재하는 프로테아제의 분리 및 세제 혼합물에서의 테스트를 통해 개발되어 왔다.

대부분의 세제 프로테아제는 바실러스 속의 구성원에서 얻어진다.

최근에 새로운 타입의 프로테아제 시판에 들어갔으며, 다양한 특징 조건에서 보다 나은 비용/성능 비를 제공하고 있다.

시판되는 프로테아제 제품의 예에는 ALCALASE^TM, ESPERASE^TM및 SAVINASE^TM이 있으며 덴마아크의 Novo Nordisk A/S가 전부 공급하고 있다.

다른 상업적 공급원으로부터 얻을 수 있는 이들 및 유사한 다른 효소 제품은 격리제(Sequestering agent), 계면활성제 및 붕산 나트륨 등이 표백제의 존재시에 8 내지 11의 pH값의 세제 용액에서 작용한다.

ALCALASE^TM프로테아제는 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)종의 균주에 의해 상산된다. ESPERASE^TM및 SVAINASE^TM프로테아제는 호알칼리성 바실리(Bacilli)균주의 배양을 통해 얻어진다.

[발명의 요약]

본 발명은 우수한 세척능을 갖는 신규 세제 프로테아제를 제공한다.

첫째면에 있어서, 본 발명은 29kD의 겉보기 분자량; 8.8 부근의 pI ; pH 10 내지 12 범위의 초적 pH(25℃에서); 45 내지 65℃ 범위의 최적 온도(pH 9.5에서)를 갖는 프로테아제를 제공한다.

다른 면에 있어서, 본 발명은 29kD의 겉보기 분자량; 8.8부근의 pI ; pH 10 내지 12 범위의 초적 pH(25℃에서) ; 45 내지 65℃ 범위의 최적 온도(pH 9.5에서) ; 및 바실러스종 J 20, NCIMB No. 40262에서 얻어지는 프로테아제의 것과 동일하거나 부분적으로 동일한 면역학적 특성을 갖는 프로테아제를 제공한다.

더욱 특정한 면에 있어서, 프로테아제는 바실러스 종 j 20의 균주에서 얻어질 수 있다. 훨씬 더 특정한 면에 있어서, 프로테아제는 바실러스 종 J 20 NCIMB No. 40262, 또는 그것의 돌연변이체 또는 변종에서 얻어질 수 있다.

셋째 면에 있어서, 본 발명은 바실러스 종 J 20 균주의 생물학적으로 순수한 분리된 배양물을 제공한다. 더욱 특정한 면에 있어서, 바실러스 종 J 20, NCIMB No. 40262 균주, 또는 그것의 돌연변이체 또는 변종이 제공되어 있다.

넷째 면에 있어서, 본 발명은 탄소 및 질소원 및 무기염을 함유하는 적합한 영양 배지에서 바실러스 종 J 20의 프로테아제 생산 균주를 배양하여 원하는 효소를 회수하는 것으로 이루어지는 프로테아제 제조방법을 제공한다.

더욱 특정한 면에 있어서, 바실러스 종 J 20, NCIMB No. 40262, 또는 그것의 돌연변이체 또는 변종이 배양된다.

다섯째 면에 있어서, 세제 효소로서의 효소 용도가 청구되어 있다.

더욱 특정한 면에 있어서, 본 발명은 프로테아제를 함유하는 세제 조성물을 제공한다. 다른 한가지의 특정한 면에 있어서, 본 발명은 프로테아제를 함유하는 세제 부가물을 제공한다.

[발명의 상세한 설명]

[미생물]

본 발명의 효소를 생산할 수 있는 신규 미생물이 영국 특허 제1,243,784호에 기재된 호알칼리성 바실리의 선별방법에 의해 본질적으로 분리되었다.

그러한 한가지 배양물인 바실러스 종 J 20이 부다페스트 조약에 따라 1990년 2월 27일 NCIMB Ltd., 23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2, 1RY, 스코틀랜드, 영국에 스탁번호 NCIMB 40262로 기탁되어 있다.

본 발명의 미생물은 바실러스 속에 포함하는 호기성의 포자형성 박테리아다.

그것은 형태학적으로 직경이 0.6 내지 0.8 미크론이고 길이가 2 내지 3미크론인 운동성 간균으로 기재되어 있다.

포자는 원형 내지 타원형이고 중심에서 아말단(subterminal)까지 포자낭을 팽창시키지 않는다. 생장의 최적 온도는 35 내지 40℃이고, 생장의 최적 pH는 8.5 내지 10이고 pH 8 이하에서는 생장이 일어나지 않는다.

미생물은 영양 한천 사면배지상에서 노란색 콜로니를 형성하고 색소는 한천속으로 확산되지 않음이 관찰되었다.

본 발명의 미생물은 표 1에 기재된 테스트 결과를 통해 더욱 특성화될 수 있다.

[표 1]

[미생물의 배양]

본 발명의 미생물은 호기성 조건하에 다른 필수 영양분과 함께 동화가능한 탄소 및 질소를 함유하는 배지에서 배양될 수 있다. 배지는 공지된 기술의 지침에 따라 제조된다.

적합한 탄소원에는 자당, 글루코스 및 전분 등의 탄수화물 또는 곡물; 맥아; 쌀 및 당밀 등의 물질을 함유하는 탄수화물 등이 있다.

배지에 넣는 탄수화물의 농도는 매우 다양하여, 예컨대 최대 25% 및 최소 1 내지 5% 까지이나, 대개는 8 내지 10%가 적합할 것이며, 백분율은 등량의 글루코스로 계산된다.

영양 배지의 질소원은 무기 및/또는 유기 종류일 것이다.

적합한 무기 질소원은 질산염 및 암모늄 염이다.

매우 많은 수의 유기 질소원이 박테리아의 배양을 포함하는 발효 공정에 통상적으로 사용된다. 실례에는 콩가루; 목화 씨 가루; 땅콩 가루; 카제인; 옥수수; 콘 스팁 리커(corn steep liquor); 효모 추출물; 우레아 및 알부민 등이 있다.

그외에 영양 배지는 통상의 미량 물질을 또한 함유해야 한다.

본 발명의 신규 바실러스 종은 호알칼리성이므로 pH 8 이하에서는 생장할 수 없기 때문에, 배양은 바람직하게 알칼리성 pH 값에서 수행된다.

알칼리성 배지는 생장 배지를 멸균한 후 적합한 완충제 예컨대 탄산나트륨 또는 탄산나트륨 및 중탄산나트륨 혼합물을 첨가하여 제조할 수 있다.

탱크 발효조에서 배양하기 위해서는 인공 통기를 하는 것이 필요하다.

통기 속도는 통상적인 탱크 발효에 이용되는 것과 유사하다.

발효후, 액체 배지의 잡다한 물질을 제거하여 액체효소 농축물을 생산할 수 있으며, 원할 경우, 저온 증발 또는 역삼투에 의해 액체배지를 농축시킨다.

최종적으로 방부제가 농축물에 첨가될 것이다.

고체 효소제제는 Na₂O₄등의 염 또는 에탄올 또는 아세톤 등의 수-혼화성 용매로 침전시켜 정제된 및/또는 농축된 액체배지로부터 제조될 것이다.

또한 스프레이-건조등의 적합한 건조방법을 이용하여 액체배지의 물을 제거할 수 있다.

그와 같이 얻어진 프로테아제 제제이 단백질분해 활성은 대개 1 내지 50CPU/g이다.

[단백질분해 활성의 분석]

기질로 카제인을 이용하여 단백질분해 활성을 조사하였다.

1카제인 프로테아제 단위(Casein Protease Unit : CPU)는 25℃ 및 pH 9.5에서 30분간 배양하는 표준 조건에서 분단 1mM의 1차 아미노기를 방출하는 효소의 양(세린을 표준으로 비교하여 계산)으로 정의된다. 분석방법의 기재된 접책(folder)을 Novo Nordisk A/S, 덴마아크에 요구하여 구입할 수 있으며, 여기에 참고로 포함되어 있다.

[효소]

본 발명의 효소는 신규 세제 프로테아제이다.

그것은 탄소 및 질소원 및 무기염을 함유하는 적합한 영양배지에서 본 발명의 미생물, 바람직하게는 바실러스 종, J 20, NCIMB, No. 40262 또는 그것의 돌연변이체 또는 변종을 배양하여 얻을 수 있는 알칼리성 프로테아제이다.

효소는 또한 제조합 DNA-기술을 통해 얻어질 수 있다.

본 발명의 프로테아제는 하기 특성을 통해 설명될 수 있다.

[물리-화학적 특성]

SDS-PAGE로 결정된 분자량은 20kD이다.

LKB AmpholinePAG 플레이트상의 등전 접속(isoelectric focusing)으로 결정된 pI는 8.8이다. 프로테아제 활성은 PMSF, α-1-안티트립신 및 칠면조-난-백 프로테아제 저해제에 의해 저해된다.

EDTA 및 콩-단백질 저해제는 프로테아제 활성에 영향을 끼치지 않았다.

프로테아제는 소수성 아미노산의 C-말단에서 사람 인슐린을 절단한다.

특이하게 사람 인슐린은 하기 아미노산 사이가 절단된다; A-사슬의 Leu1₃-Tyr₁₄; 및 B-사슬의 Leu₁₁-Va_l12, Leu₁₅-Tyr₁₆및 Cys₁₉-Gly₂₀(Cys는 이황화물).

카제인을 기질로 하여 온도-활성 관계를 조사하였다.

상기의 단백질분해 활성에 대한 분석법을 변형하여 이용하였다.

배양 온도를 15 내지 60℃ 사이에서 다양하게 하였다.

효소 반응은 0.1% 소디움 트리풀리포스테이트(STPP)의 존재 및 부재시에 수행하였다. 결과가 표 1에 나타나 있다. 단백질은 최저 15℃ 내지 최고 70℃의 온도, 및 45 내지 65℃ 범위에서의 최적 온도(STPP의 부재시); 더욱 특이하게는 55 내지 65℃; 60℃ 부근의 온도에서 단백질분해 활성을 지닌다.

7 내지 11의 pH 범위에서 미리결정된 pH 값으로 조정된 완충제를 사용하여, 활성의 pH 의존성을 동일한 방법으로 조사하였다.

결과가 표 2에 나타나 있다. 효소는 6 내지 11의 pH 값에서 단백질분해 활성을 지녔으며, 최적 pH는 pH 10 내지 pH 12의 범위 ; 11부근이다.

본 발명의 프로테아제는 유럽 및 미국형 세제에서 과붕산업 및 NOBS 등의 표백제가 존재하는 세척 조건 및 존재하지 않는 세척 조건하에 40℃에서 60분간 안정한다.

[면역화학적 특성]

교차-반응 동일성 테스트를 통해 면역화학적 특성을 면역학적으로 조사할 수 있다. 동일한 테스느는 공지된 오크터로니(Ouchterlony) 이중 면역확산 방법, 또는 엔. 에이치. 악셀센(N. H. Axelson) ; Handbook of Immunoprecipitation-in-G디 Techniques; Blackwell Scientific Publication (1983), 5장 및 14장의 직렬 교차된 면역전기영동으로 수행될 것이다.)

“항원 동일성” 및 “부분적 동일성”용어가 동일한 책의 5장, 19장 및 20장에 기재되어 있다.

상기 방법에 따라 본 발명의 정제된 프로테아제 토끼를 면역화시켜 단일특이성 항혈청을 생산하였다. 면역유발원을 프룬드(Freund)의 보조제와 혼합하여 2주마다 토끼에 피하주사하였다.

총 8주간의 면역기간 후에 항혈청을 얻었고 엔, 에이치, 악셀센의 상기 문헌에 기재된 바와 같이 그것으로부터 면역 글로불린을 제조하였다.

오크티로니 이중 면역확산 테스트에서 본 발명의 프로테아제와 공지된 알칼리성세린 프로테아제 ALCALASE^TM, SAVINASE^TM, ESPERASE^TM, 서브틸리신 BPN' 및 프로테아제 API-21 간의 교차반응이 관찰되지 않았다.

[세제 조성물]

본 발명의 세제 조성물은 하나 또는 그 이상의 계면활성제를 포함할 것이며, 음이온성, 비-이온성, 양이온성, 양성 또는 쌍성-이온성 타입 또는 이것들의 혼합물에 속할 것이다. 전형적인 음이온성 계면활성제의 예에는 선형의 알칼 벤젠술포네이트(LAS); 알킬 술페이트(AS); 알파 올레핀 술포네이트(AOS); 알코올 에톡시 술페이트(AES) 및 중성 지방산의 알칼리 금속염 등이 있다. 비-이온성 계면활성제의 예에는 알킬 폴리에틸렌 글리콜 에테르;노닐페놀 폴리에틸렌 글리콜 에테르;자당 및 글루코스의 지방산 에스테르; 및 폴리에톡실화 알킬 글루코시드의 에스테르 등이 있다.

또한 본 발명의 세제 조성물은 당업계의 공지된 다른 세제 성분, 예컨대 빌더(builder), 표백제, 표백 활성제, 항-부식제, 격리제, 오물-재침전 방지제, 향료, 효소 및 표백제를 위한 안정화제, 조제, 보조물, 광택제, 거품 촉진제, 착화제, 충전재, 직물유연제 등을 포함할 것이다.

본 발명의 세제 조성물은 제이. 팔베(J. Falbe)가 기재한 바와 같이 실질적으로 제조된다[Falbe, J : Surfactants in Consumer Products. Theory, Technology and Application ; Springer Verlag 1987, 특히 “Frame formulations for liquid/powder heavy-duty detergents”의 제목이 붙은 부분을 참조하라].

현재 본 발명의 세제 조성물은 세척액 리터당 0.0005 내지 0.5 CPU의 단백질 효소에 해당하는 양의 효소 제제를 포함할 것으로 생각된다.

본 발명의 세제 조성물은 통상적인 형태, 예컨대 분말, 액체 등으로 제조될 수 있다.

본 발명의 세제 조성물은 유리하게 다른 기원의 프로테아제 뿐만 아니라 통상적으로 세제 조성물에 포함되는 하나 또는 그 이상의 다른 효소, 예컨대 리파제; 아밀라제; 셀룰라제; 및/또는 퍼옥시다제를 포함할 것이다.

본 발명의 프로테아제는 세제 프로테아제를 함유하는 분리된 부가물로 첨가되거나 또는 다른 세제 효소를 함유하는 조합된 부가물로 첨가되어 세제 조성물에 포함될 것이다.

본 발명의 부가물, 예컨대 분리된 부가물 및 조합된 부가물은 과립, 액체, 슬러리 등으로 제조될 것이다. 세제에 부가되는 바람직한 조합물은 비분진성(non-dusting) 과립, 액체, 특히 안정화된 액체, 슬러리, 또는 보호된 효소이다.

비분진성 과립은 예를 들어 영국 특허 제1,362,365호 또는 미국특허 제4,106,991호에 따라 제조될 것이며, 당업계에 공지된 방법에 따라 선택적으로 코팅될 것이다.

세제 효소는 과립화전 또는 후에 혼합될 것이다. 예를 들어 액체 효소 제제는 확립된 방법에 따라 프로필렌 글리콜; 당 또는 당 알코올; 젖산 또는 붕산등이 폴리올의 첨가에 의해 안정화될 것이다. 다른 효소 안정화제가 당업계에 잘 공지되어 있다. 보호된 효소는 유럽 특허출원 제238,216호에 개시된 방법으로 제조될 것이다.

하기 실시예는 더 나아가서 본 발명을 예시한다.

[실시예 1]

바실러스 종 J 20을 하기 성분(리터당)의 배지 100㎖을 함유하는 차폐된 500㎖ 삼각 플라스크에 넣고 25℃로 회전 진동 테이블(300 r.p.m)에서 배양하였다.

배지의 전분을 α-아밀라제로 액화시킨 후 배지를 120℃에서 45분간 가열하여 멸균하였다.

멸균후 1M 세스키탄산 나트륨 용액 10㎖을 첨가하여 배지의 pH를 9.7로 조정하였다.

5일간 배양한 후 상기된 방법을 이용하여 배양물의 단백질분해 활성을 조사하였다. 배양후 액체배지의 효소 활성은 120CPU/ℓ였다.

[실시예 2]

순수한 효소 제제를 하기와 같이 제조하였다 :

실시예 1에 기재된 바와 같이 제조한, 발효된 액체 배양물을 원심분리하여 고체물질을 제거하였다. 원심분리물(Centrifugate)에 아세톤 1/2 부피를 첨가하고 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 원심분리물에 총 2 부피의 아세톤을 더 첨가하였다.

침전물을 원심분리로 제거하고 하기 완충제에 용해시켰다 :

0.1M 붕산 ; 0.01M 디메틸글루타르산 ; 0.002M 염화칼슘; pH 7.0으로 조정.

이 용액을 친화 크로마토그래피하여 효소를 분리하였다.

단백질분해 활성을 지닌 분획을 모아서 농축하고 UF-셀(cell)에서 완충제로 세척한 후 냉동건조시켰다.

액체 배양물 1ℓ에서 얻은 수율은 25.6CPU/g의 1.2g이었다.

SDS-PAGE로 판정한 결과 순도는 90% 이상이었다.

이 실시예에 따라 제조한 효소 제제의 특성이 본 명세서의 앞부분에 언급되어 있으며 이제까지 참고되었다.

[실시예 3]

[세척능]

0.001 : 0.01 및 0.10 CPU/ℓ의 효소 농도에서 테스트를 수행하였으며, 효소 제제는 실시예 1 내지 2에 따라 제조한 것이다.

면직물에 혼합하여 얼룩을 만든 후(올리브 기름; 젤라틴; 인디안 잉크; 카올린) 40℃에서 등온으로 15분동안 세척능 테스트를 수행하였다.

시판되는 미국형 액체 세제 1.5g/ℓ를 사용하였다.

세제를 약 6°dH(German Hardness) 물에 용해시켰으며 pH는 7.83으로 측정되었다. 직물/세척액 비는 세척액 리터당 직물 10g이었다.

세척이 완료되었을 때 pH는 7.7로 변해 있었다.

세척에 이어서, 직물을 흐르는 수돗물로 씻은 후 공기중에서 건조시켰다.

460nm에서 확산반사율(%R)를 조사하였다.

세척능의 척도로 미분 확산반사율, △R을 이용하였는데 효소를 첨가하여 세척한 후의 확산반사율에서 효소를 첨가하지 않고 세척한 후의 확산반사율을 뺀값이다.

이들 테스트 결과가 표 3에 나타나 있다.

[표 3]

본 발명의 효소, J 20의 세척능, 미분, 확산반사율, △R은 시판되는 미국형 액체세제에서 세척한 후 측정하였다.

미분 확산반사율 값은 본 발명의 프로테아제가 우수한 세착력을 갖고 있음을 보여 준다.

Claims

하기의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 프로테아제: (a) 29kD의 겉보기 분자량; (b) 약 8.8의 pl ; (c) 약 pH 11의 최적 pH(25℃에서); (d) 47 내지 63℃범위에서의 최적 온도 (pH 9.5에서); 및 (e) 바실러스 종 J 20, NC1MB No. 40262에서 얻어지는 프로테아제의 면역화학적 특성과 동일한 면역화학적 특성.
제1항에 있어서, 상기 프로테아제는 바실러스 종 J 20 균주에서 얻어지는 것을 특징으로 하는 프로테아제.
제2항에 있어서, 바실러스 종 J 20, NCIMB No. 40262에서 얻어지는 것을 특징으로 하는 프로테아제.
생물학적으로 순수하게 분리된 바실러스 종 J 20 균주.
제4항에 있어서, 상기 균주는 바실러스 종 J 20, NCIMB No. 40262, 또는 그것의 돌연변이체 또는 변종인 것을 특징으로 하는 균주.
제1항 내지 제3항중의 어느 한 항의 프로테아제의 제조방법에 있어서, 탄소 및 질소원 및 무기염을 함유하는 적합한 영양 배지에서 바실러스 종 J 20의 프로테아제 생산 균주를 배양하여 그 효소를 회수하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서, 바실러스 종 J 20, NCIMB No. 40262이 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항의 프로테아제를 함유하는 것을 특징으로 하는 세제 조성물.
제8항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 다른 효소, 특히 리파제, 아밀라제, 셀롤라제, 또는 퍼옥시다제를 더 함유하는 것을 특징으로 하는 세제 조성물.
제1항 내지 제3항중의 어느 한 항의 프로테아제를 함유하는 세제 부가물에 있어서, 과립, 바람직하게는 비분진성 과립, 액체, 특히 안정화된 액체, 슬러리, 또는 보회된 효소의 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는 부가물.