FI120739B - Erittäin alkalinen proteaasi ja sen käyttö - Google Patents

Description

Erittäin alkalinen proteaasi ja san käyttö

Keksintö koskee voimakkaasti emäksistä proteaasia, sen käyttöä ammatillisilla tai teollisilla ja kotitalouden 5 alueilla samoin kuin mainitunlaisiin käyttöihin tarkoitettuja koostumuksia, jotka sisältävät tätä proteaasia.

Proteaasipitoisten koostumusten käyttö ammattimaisissa tai teollisissa käyttötarkoituksissa tai menettelyissä on tunnettua. Proteaaseja on käytetty jo kauan esimer-10 kiksi ammattipesuloissa esimerkiksi veren likaaman sairaa- lapyykin tai lihankäsittelylaitoksista tulevien suojavaatteiden puhdistamiseen. Nahankäsittelyalalla tehdään esimerkiksi nykykäytännön mukaisen nahanvalmistuksen yhteydessä karvojen poisto vuodista ja nahoista emäksisessä menettely-15 vaiheessa niin kutsutussa kalkitusseoksessa, joka luo edellytykset karvojen poistolle ja saa aikaan nahan tarvittavan liuotuksen parkitusta varten, yhä edelleen käyttäen osittain haitallisia kemikaaleja (esimerkiksi epäorgaanisia sulfideja). Viime aikoina on tosin jo ehdotettu myös ent-20 syymiavusteisia kalkitusmenettelyjä (karvanpoistomenettely- ... jä), erityisesti sellaisia, joissa käytetään trypsiinient- • · · ’ , syymejä tai sieni- tai bakteeriproteaaseja samoin kuin • · · *· / osittain myös karbohydrolaaseja; näitä entsymaattista kar- • · · *·*.* vanpoistomenetelmiä on kuitenkin otettu käyttöön lähes yk- ·· · · l : 25 sinomaan pieneläinten vuotien yhteydessä ja silloinkin vain ·.·,· rajoitetussa määrin. Suurten nautaeläinten nahkojen yhtey- • · Φ ί^ί ί dessä nämä entsymaattiset karvanpoistomenetelmät eivät sitä vastoin ole pystyneet tähän mennessä saavuttamaan suosiota, ennen kaikkea osittain puutteellisen karvanpoistovaikutuk-30 sen ja kollageeni-martiokalvon vahingoittumisen tai nahka- • · · / 4 aineksen liian voimakkaan hajoamisen vuoksi. On myös ko- • · · *· " keiltu emäksisten proteaasien osittaista käyttöä kalkitus- * * seoksessa yhdessä pienennettyjen kemikaali (esimerkiksi ·;··· sulfidi) -määrien kanssa kemikaalien aiheuttaman ympäristö- 35 kuormituksen vähentämiseksi. Kemikaalien (esimerkiksi sul- • · Φ · · fidin) osuutta voidaan kyllä pienentää selvästi käyttämällä 2 entsyymejä ja siten saavutetaan sangen hyviä pinta-alasaan-toja vähällä martionvedolla, mutta tällä tavalla valmistetuilla nahoilla on taipumus löyhään martioitumiseen, löyhään juonirakenteeseen ja karkeaan, osittain nukkautunee-5 seen martion ulkonäköön. Nahanvalmistusalalla (pääliotuk-sessa ja karvomiskalkituksessa) nykyisin jo käytettävillä tekniikan tasoa vastaavilla proteaaseilla yhä vielä vain heikko teho korkeiden pH-arvojen (11 - 13) vallitessa tai suhteellisen alhainen aktiivisuus nahastamoissa tavallisis-10 sa käsittelylämpötiloissa (28 - 30 °C) .

Ammattimaisissa tai teollisissa menettelyissä vallitsevien, kotitalouskäyttöön (esimerkiksi kotitalouspesu-aineena) verrattuna osittain ankarampien olosuhteiden vuoksi asetetaan mainitussa yhteydessä käytettäville proteaa-15 seille erityisen suuria vaatimuksia stabiiliuden, ekologisen hyväksyttävyyden ja tehon suhteen. Sen ohella, että proteaaseilla tulisi olla hyvä kestävyys ja aktiivisuus voimakkaasti emäksisten pH-arvojen vallitessa, tulisi niillä olla toisaalta myös hyvä lämpötilastabiilius, jotta 20 niillä saataisiin kulloisessakin käyttötarkoituksessa al- ... haisten pitoisuuksien vallitessa aikaan mahdollisimman pit- • · · 'l \ kään hyviä tuloksia ammattimaisissa/teollisissa menette- • · · *· lyissä vallitsevien osittain korkeiden lämpötilojen yhtey- V.: dessä, ja toisaalta määrättyjen käyttötarkoitusten (esimer- ·· · j *,· 25 kiksi nahanvalmistuksen) yhteydessä kuitenkin hyvä aktiivi- suus vielä suhteellisen alhaisissakin lämpötiloissa (noin ΓΓ: 30 °C) . Lisäksi käytettävien emäksisten proteaasien tulisi olla mahdollisimman epäherkkiä ammattimaisissa tai teolli- .*:*. sissa menettelyissä yleisten kemikaalien ja aineosien (esi- ♦ .···. 30 merkiksi tensidien, valkaisuaineiden tai desinfiointiaine!- • · *·* den, kemikaalien ym. aineosien) suhteen. Siksi yhä edelleen on tarvetta muille, ammattimaisiin ja teollisiin käyttötar- ***** koituksiin, esimerkiksi ammattimaisiin pyykinpesumenette- lyihin, ammattimaiseen' pintojen puhdistukseen tai nahan kä- ,···. 35 sittelyyn ja nahanvalmistukseen, soveltuville emäksisille • · proteaaseille.

3 Päämääränä oli siten löytää uusi, erityisesti ammattimaisiin tai teollisiin menettelyihin soveltuva emäksinen proteaasi, jolla tulisi lisäksi olla mahdollisuuksien mukaan etuja myös kotitalouskäytössä.

5 Nyt on havaittu, että jäljempänä esitettävää emäk sistä Bacillus-proteaasia voidaan käyttää tehokkaasti erilaisissa ammattimaisissa ja teollisissa menettelyissä. Keksintö koskee siten patenttivaatimuksissa esitettyä ja jäljempänä tarkemmin valaistavaa emäksistä proteaasia ja sen 10 käyttöä, erityisesti ammattimaisiin ja teollisiin menettelyihin tai myös kotitalouskäyttöön tarkoitetuissa koostumuksissa.

Keksintö koskee siten voimakkaasti emäksistä proteaasia, jolle on tunnusmerkillistä, että sen pohjana on ami-15 nohapposekvenssi, jonka homologisuusaste kuviossa 1 esitetyn aminohapposekvenssin kanssa on vähintään 95 %, edullisesti vähintään 98 %, ja joka eroaa tästä sekvenssistä kuvion 1 asemissa 42/114/115 tai kolmessa niiden suhteen homologisessa asemassa tapahtuneen kolminkertaisen mutaation 20 kautta siten, että kyseisissä asemissa esiintyvät aminoha- ... pot on vaihdettu arginiiniksi, jolloin aminohappojen luku- • · *;* * määrä, joka on yksi yhteen sekvensseissä (homologiset ase- • · ♦ '* " mat) osoittaa homologiaa %:na perustuen kuvion 1 sekvenssin • · V.· käsittävien aminohappojen kokonaismäärään.

·· · • 25 Kyseisen emäksisen Bacillus-proteaasin moolimassa on noin 26 000 - 28 000 g/mol mitattuna SDS-polyakryyliami-·*·*: digeelielektroforeesilla moolimassaltaan tunnettuja referens- siproteiineja vastaan. Analyyttisessä testissä liukoisten mallisubstraattien avulla määritetty pH-optimi on noin 10,5, .···. 30 jolloin pH-optimilla tarkoitetaan pH-aluetta, jolla prote- • ♦ *1* aasilla on korkein mahdollinen proteolyyttinen aktiivisuus.

pH-aktiivisuus on tällöin korkeampi kuin (kuvion 1 mukaisel-la) lähtöaineproteaasilla; optimi vaikutusalue ulottuu kau-emmas emäksiselle alueelle ja on pH-alueella 10,5 - 11,5.

• · .···. 35 Mainitulla keksinnön mukaisella emäksisellä Bacillus-prote- • · aasilla on myös hyvä pH- ja lämpötilastabiilius. Kyse on 4 siis erityisesti sangen voimakkaasti emäksisestä proteaa-sista, joka on tehokas pH-alueella, jota ei saavuteta tähänastisilla tekniikan tasoa vastaavilla proteaaseilla.

Homologisuudella kuviossa 1 esitetyn aminohappose-5 kvenssin kanssa tarkoitetaan tässä kyseisten aminohapposekvenssien rakenteellista sukulaisuutta kuviossa 1 esitetyn aminohapposekvenssin kanssa. Homologian määrittämiseksi rakenteellisesti toisiaan vastaavia kuvion 1 mukaisen aminohapposekvenssin ja siihen verrattavan aminohapposekvenssin 10 osia asetetaan päällekkäin siten, että saadaan aikaan aminohapposekvenssien maksimaalinen rakenteellinen yhdenmukaisuus, jolloin yksittäisten aminohappojen deleetion tai insertion aiheuttamat erot otetaan huomioon ja korjataan sekvenssien osien vastaavilla siirroilla. Sekvenssien kesken 15 yhdenmukaisten aminohappojen ("homologisten asemien") lukumäärä suhteessa kuvion 1 mukaisen sekvenssin sisältämien aminohappojen kokonaislukumäärään ilmoittaa tällöin prosentuaalisen homologisuuden. Sekvensseissä esiintyvät poikkeamat voivat johtua sekä aminohappovariaatioista, -inser-20 tioista että deleetioista. Vastaavasti on selvää, että käy- ... tettäessä kuvion 1 suhteen vähintään 95-%risesti homologi- • · · [ siä emäksisiä proteaaseja aminohappoasernat, jotka on mer- • · · *· *J kitty suhteessa kuvioon 1, tarkoittavat kulloinkin käytet- * · V.: tävän proteaasin sen suhteen homologisia asemia. Kuvion 1 *· · * *.! 25 suhteen homologisten proteaasien aminohapposekvensseissä ta- J#j4i pahtuneet deleetiot tai insertiot voivat johtaa aminohap- ·*·*: poasemien suhteelliseen siirtymiseen, niin että toisiaan vastaavien aminohappoasemien numeromerkintöjen ei tarvitse .*:·. olla identtisiä keskenään homologisten aminohapposekvenssi- • « · .···, 30 en homologisissa osissa, ts. aminohappoasemien kulloisessa- * ♦ *" kin numeroinnissa voi tapahtua vähäisiä siirtymiä.

• « *.**: Keksinnön yhdessä edullisessa variantissa on ky- seessä voimakkaasti emäksinen proteaasi, jolle on tunnus-merkillistä, että sen pohjana on kuviossa 1 esitetyn amino- • · t...# 35 happosekvenssin kanssa olennaisesti identtinen aminohap- • * *** posekvenssi ja se eroaa tästä sekvenssistä kuvion 1 asemis- 5 sa 42/114/115 tapahtuneen kolminkertaisen mutaation kautta siten, että kyseisissä asemissa esiintyvät aminohapot on vaihdettu arginiiniksi. Ilmaus "olennaisesti identtinen" aminohapposekvenssi tarkoittaa tässä yhteydessä, että lu-5 kuun ottamatta mainittua kolminkertaista mutaatiota N42R/N114R/N115R vain muutama muu, ts. erityisesti vain korkeintaan 6 (vastaa homologia-astetta vähintään noin 98 %), aminohappoa voi poiketa kuvion 1 mukaisen sekvenssin aminohapoista. Keksinnön mukaisen voimakkaasti emäksisen 10 proteaasin pohjana oleva aminohapposekvenssi vastaa siten olennaisesti proteaaseja, joista voidaan käyttää nimitystä "subtilisiini 309" -tyyppi, koska tekniikan tasoa vastaavan tunnetun "subtilisiini 309:n" aminohapposekvenssi on identtinen kuviossa 1 esitetyn aminohapposekvenssin kanssa. Sen 15 kanssa lähes identtistä proteaasia, joka on asemaa 85 lukuun ottamatta yhtäpitävä kuvion 1 aminohapposekvenssin kanssa, kuvataan tekniikan tasoa käsittelevässä kirjallisuudessa Bacillus nov. species PB92 -peräisenä proteaasina (katso EP-hakemusjulkaisu 283 075). Bacillus PB92 -peräinen 20 proteaasi eroaa kuviossa 1 esitetystä aminohapposekvenssistä vain epäolennaisesta, siten että asemassa 85 oleva se- • · · *·* ’ riini on vaihtunut luonnollista tietä asparagiiniksi, ja • m ·.*·; sitä kutsutaan tässä siten "subtilisiini 309" -tyyppiseksi * · proteaasiksi. Yhtä toista "subtilisiini 309:n" kanssa olen- j 25 naisesti identtistä proteaasia, joka on viittä asemaa, 97, : 99, 101, 102 ja 157, lukuun ottamatta yhtäpitävä kuviossa 1 «*· esitetyn aminohapposekvenssin kanssa, kuvataan tekniikan tasoa käsittelevässä kirjallisuudessa Bacillus lentus -pe-räisenä proteaasina ("BLAP") (katso julkaisu W0 91/02 792 * · i "... 30 ja US-patenttijulkaisu 5 352 604) . Bacillus lentus -peräi- • · "* nen proteaasi "BLAP" eroaa kuviossa 1 esitetystä aminohap- i · ·.*·· posekvenssistä vain epäolennaisesti, siten että luonnoin- *:**: siä poikkeamia esiintyy viidessä asemassa: 97D, 99R, 101A, 1021 ja 157S. Yksi "BLAP"-variantti eroaa lisäksi siinä • · 35 suhteessa, että siinä on kuudes luonnollinen poikkeama, • · "* treoniini seriinin tilalla asemassa 3 (emäksinen proteaasi, 6 jota kuvataan samoin julkaisussa W0 91/02 792 ja US-pa- tenttijulkaisussa 5 352 604). Lyhenteet tarkoittavat seu-raavaa: D = Asp = asparagiinihappo, R = Arg = arginiini, A = Ala = alaniini, I = Ile = isoleusiini, S = Ser = serii-5 ni ja T = Thr = treoniini. Proteinaasi "BLAP" ja sen variantit, joissa on mutaatio Ξ3Τ, ovat siten noin 98-%:isesti homologisia kuvion 1 mukaisen aminohapposekvenssin kanssa, ja niitä kutsutaan sen mukaisesti myös "subtilisiini 309" -tyyppisiksi proteaaseiksi. Keksintö koskee siten edulli-10 sesti voimakkaasti emäksisiä proteaaseja, joissa esiintyy kolminkertainen mutaatio N42R/N114R/N115R ja joiden pohjana oleva aminohapposekvenssi on identtinen kuviossa 1 esitetyn aminohapposekvenssin kanssa tai eroaa siitä joko vain siten, että asemassa 85 seriini on vaihtunut luonnollista 15 tietä asparagiiniksi, tai vain viidessä asemassa luonnol lista tietä tapahtuneiden muutosten 97D/99R/101A/102I/157S tai vain kuudessa asemassa luonnollista tietä tapahtuneiden muutosten 3T/97D/99R/101A/102I/157S suhteen.

Keksinnön mukaisten proteaasien pohjana oleva emäk-20 sinen Bacillus-proteaasi (kuvion 1 mukainen aminohappose kvenssi) on saatavissa 28.7.1989 numerolla DSM-Nr. 5466 • * *·* * talletetusta Bacillus-kannasta; tätä kantaa koskevia li- • * *. *: säyksityiskohtia, erityisesti eristämistä, kuvataan EP-ha- * · ·.·.· kemusjulkaisussa 415 296. Keksinnön mukaisten proteaasimu- • · · • \ϊ 25 tanttien pohjana olevan proteaasin aseman 85 suhteen poikii*: keava mutantti on saatavissa vastaavasti viljelemällä Ball*· cillus nov. species PB92:a (mitä kuvataan EP-hakemusjul- kaisussa 283 075 tai sitä vastaavassa US-patenttijulkai-,*··, sussa 5 217 878) . Keksinnön mukaisten proteaasimutanttien • t * J··.' 30 pohjana olevan proteaasin asemien 97/99/101/102/157 tai 3/97/99/191/192/157 suhteen poikkeavia variantteja voidaan • · ·.’·· valmistaa vastaavasti viljelemällä Bacillus lentusta tai *!**! sopivan transformaation jälkeen myös Bacillus licheniformi- sissa (mitä kuvataan julkaisussa WO 91/02 792 tai sitä vas- t · ...t 35 taavassa US-patenttijulkaisussa 5 352 604) . Asema 85 -väri- • · *** antteja samoin kuin "BLAP"-variantteja voidaan kuitenkin 7 valmistaa myös proteaasista, jolla on kuviossa 1 esitetty aminohapposekvenssi, aiheuttamalla vastaavia pistemutaati-oita mainituissa asemissa. Edellä mainituista, keksinnön mukaisten proteaasimutanttien pohjana olevista "subtilisii-5 ni 309" -tyyppisistä proteaaseista voidaan saada aikaan sinänsä tunnetulla tavalla keksinnön mukaisia voimakkaasti emäksisiä proteaaseja, joissa esiintyy kolminkertainen mutaatio N42R/N114R/N115R, aiheuttamalla yhdistelmä- tai pe-räkkäispistemutaatioita "subtilisiini 309" -tyyppisen esi-10 asteproeaasin aminohapposekvenssissä. Mainitunlaisten pis-temutaatiomenettelyjen toteuttamista yksittäisten aminohap-poasemien kohdalla kuvataan EP-hakemusjulkaisussa 415 296 ja siinä esitettyä menettelyä voidaan käyttää kolminkertaisten mutaatioiden aikaansaantiin keksinnön mukaisten 15 proteaasien valmistamiseksi. Tätä koskevien edellä mainittujen hakemusjulkaisujen, erityisesti EP-hakemusjulkaisun 415 296 (tai sitä vastaavan US-patenttijulkaisun 5 352 603) sisältö mainitaan siksi tähän hakemukseen liittyvänä nimenomaisesti viitteenä.

20 Keksinnön yhdessä sangen edullisessa variantissa ,,, keksinnön mukainen voimakkaasti emäksinen proteaasi, jossa • *;* [ on kolminkertainen mutaatio N42R/N114R/N115R, johdetaan • · « *· " pohjana olevasta kanta DSM 5466 -peräisestä emäksisestä Ba- *.·,· cillus-proteaasista, jolla on kuvion 1 suhteen identtinen • * • V 25 perusaminohapposekvenssi. Lyhenteenomaisesti esitetyissä mu- ϊ_ϊβί taatioissa numerot viittaavat asemaan aminohapposekvenssis- :***: sä (katso kuvio 1) . Alkuperäinen aminohappo on merkitty nu- meron eteen ja aminohapposekvenssissä tapahtuneen mutaation seurauksena kyseiseen asemaan tuotu uusi aminohappo on mer- • · e···. 30 kitty numeron jälkeen. Aminohappojen ilmaisemiseen on va- • * *" littu yksikirjaiminen merkintätapa; N tarkoittaa tällöin • · ·.*'! asparagiinia (Asp) ja R arginiinia (Arg) . Vastaavat amino- *ϊ**ί happojen vaihdot voidaan - kuten jo edellä on mainittu - * saada aikaan sinänsä tunnetulla tavalla aminohapposekvens- • · 35 sissä aiheutetun pistemutaation kautta; tätä menettelyä ku- • · *** vataan esimerkiksi EP-hakemus julkaisussa 415 296.

8

Keksinnön mukaisilla voimakkaasti emäksisillä Ba-cillus-proteaasimutanteilla N42R/N114R/N115R on epätavallisen hyvä aktiivisuus ammattimaisissa tai teollisissa käyttötarkoituksissa tavallisissa olosuhteissa, kuten korkeiden 5 pH-arvojen, korkeiden lämpötilojen ja lyhyiden käyttöaiko-jen yhteydessä. Keksinnön mukaisilla proteaasimutanteilla " on myös yllättävän hyvä kestävyys ammattimaisissa tai teol lisissa menettelyissä - esimerkiksi ammattimaisissa pyykin-pesumenettelyissä - yleisesti käytettävien formuloiden ai-10 neosien suhteen. Keksinnön mukaisia voimakkaasti emäksisiä Bacillus-proteaasimutantteja voidaan siksi käyttää edullisesti ammattimaisissa tai teollisissa menettelyissä, kuten esimerkiksi ammattimaisissa pyykinpesumenettelyissä, kaikenlaisessa ammattimaisessa pintojen puhdistuksessa ja na-15 hankäsittelymenettelyissä, kuten erityisesti esimerkiksi nahanvalmistuksessa. Keksinnön mukaisen proteaasin ammattimaista tai teollista käyttöä ammattipesulassa kuvataan tarkemmin esimerkiksi etuoikeudeltaan vastaavassa DE-patentti-hakemuksessa 4 411 223; keksinnön mukaista voimakkaasti 20 emäksistä Bacillus-proteaasimutanttia voidaan siten käyttää ... esimerkiksi ammattikäyttöön tarkoitetuissa suurissa rumpu- • · · *♦* " pesukoneissa tai täysin jatkuvasti tai jaksoittain toimi- φ φ ψ '· *: villa vastavirtapesulinjoilla. Keksinnön mukaista emäksistä • · :.V Bacillus-proteaasia lisätään tällöin niin kutsutun moniliu- ·· · • 25 osmenettelyn, esimerkiksi esipesusta ja varsinaisesta pe- tj*: susta koostuvan kaksiliuosmenettelyn, ollessa kyseessä eri- :*·*: tyisen edullisesti esipesuliuokseen. Esipesu voidaan täi- löin toteuttaa ammattimaisissa pyykinpesumenettelyissä ta-vanomaisissa olosuhteissa, esimerkiksi lämpötila-alueella • ♦ * .···. 30 30 - 70 °C sinänsä tunnetulla tavalla tässä pesussa taval- • ♦ “* lisesti käytettävien pesuainekomponenttien avulla. Runsaas- • * ti proteiinia sisältävien likojen, esimerkiksi sairaaloista tulevan paljon veritahroja sisältävän pyykin ja suurkeitti- öistä tai lihankäsittelylaitoksista tulevan pyykin, ollessa .*··. 35 kyseessä on mahdollista käyttää mainittuja proteaaseja hy- • · väliä menestyksellä ennen esipesua tehtävässä esihuuhtelus- 9 sa, jossa käytetään puhdasta kylmää tai kierrätettyä lämmintä vettä ja tässä yhteydessä muuten tavanomaisia pesu-ainekomponentteja. Keksinnön mukaisia emäksisiä Bacillus-proteaasimutantteja voidaan käyttää lisäksi edullisesti 5 myös muissa ammattimaisissa pyykinpesumenettelyissä, esi merkiksi määrättyjen tekstiili- ja likalajien mukaisesti määräytyvissä ammattimaisissa pyykinpesumenettelyissä, kuten esimerkiksi sairaalatekstiilien desinfiointipesussa. Tätä koskevia tarkempia yksityiskohtia esitetään DE-patent-10 tihakemuksessa 4 411 223.

Yksi muu tämän keksinnön puitteissa edullinen käyttöalue on (kovien) pintojen puhdistus ammattimaisissa tai teollisissa laitoksissa, edullisesti elintarvike- ja nau-tintoaineteollisuuden alalla teurastamoissa, suurkeittiöis-15 sa, grillaamoissa jne.

Kaikki pinnat, jotka joutuvat kosketukseen elintarvikkeen kanssa valmistuksen ja jatkokäsittelyn samoin kuin kuljetuksen yhteydessä, täytyy puhdistaa määrätyin aikavälein. Eri alueilla (esimerkiksi juoma-, säilyke- ja sokeri-20 teollisuudessa ja maidon-, lihan- ja rasvanjalostusteolli- ... suudessa) tapahtuu erilaista likaantumista. Näiden likojen • · · * , poistamiseen on tekniikan tason mukaisesti tarjolla suuri » » · *· *· valikoima erilaisia puhdistusaineita. Näiden puhdistusai- • · · '·*.* neiden täytyy poistaa ensi sijassa valkuaisaine-, rasva- ja ·· · : 25 hiilihydraattilikaa. Orgaanisen lian ohella syntyy myös !.·,! epäorgaanista likaa. Puhdistusaineet koostuvat siksi eri- :T: laisten, puhdistustapahtumassa määrättyjä tehtäviä täyttä vien komponenttien seoksesta. Niitä on myytävänä jauheina tai nesteinä, harvemmin myös tahnoina, ja käyttäjä joutuu, .**·. 30 harvoja poikkeuksia lukuun ottamatta, laimentamaan ne käyt- • · / töä varten pitoisuuteen 0,5 - 2 paino-%. Pintojenpuhdis- • « * ** " tusalalla käytetään erityispuhdistusaineissa erityisesti *** proteaaseja ja amylaaseja valkuaisaine- ja tärkkelyspitois- ta likaa varten. Keksinnön mukaisen proteaasikolmoismutan- .···. 35 tin käyttö on erityisen suositeltavaa mainitunlaisissa pin- « · · tojen puhdistukseen tarkoitetuissa puhdistusaineissa, sil- 10 loin kun likaantuneen materiaalin syöpymisherkkyys (erityisesti kevytmetallin, kuten alumiinin ja sen lejeerinkien, ollessa kyseessä) ei salli vahvempien, happamien tai emäksisten tuotteiden käyttöä, tai esimerkiksi myös kalvojen 5 puhdistamiseksi ultrasuodatuslaitoksissa (käänteisosmoosi).

Mainitunlaisten elintarviketeollisuudessa tapahtuvaan pintojen puhdistukseen tarkoitettujen erityispuhdis- tusaineiden tavallisia aineosia ovat (edellä jo mainittujen entsyymien ohella) erityisesti likaa irrottavat komponen-10 tit, jotka toimivat mainitunlaisten puhdistusaineiden likaa irrottavana pääaineosana ja ovat etupäässä emäksisiä, esimerkiksi natrium- tai kaliumhydroksidi, natrium- tai kaliumkarbonaatti, ortofosforihapon tai muiden, orgaanisten happojen emäksiset suolat samoin kuin natrium- tai kalium-15 vesilasilajit, joiden piidioksidi-alkalioksidisuhde on vaihteleva (Si02:Na20 = 0,7 - 3,3); muita aineosia ovat erityisesti rasvalian poistamiseen tarkoitetut pinta-aktiivi-suusaineet (anioniset tensidit, esimerkiksi rasva-alkoholi-sulfaattit, alkyylibentseenisulfonaatit samoin kuin myös 20 saippuat; lisäksi ionittomat rasva-alkoholi- ja alkyyli- ... fenoliglykolieetterit) ; korroosionestoaineet, erityisesti * · · *;* ] kevytmetallien, kuten alumiinin ja sen lejeerinkien, olles- • · · *· ” sa kyseessä pistekorroosion välttämiseksi, esimerkiksi • m • · · *.*.* emäksisellä alueella vesilasi ja happamalla alueella joukko • · · j *.· 25 happoon ja materiaaliin spesifisesti vaikuttavia inhibiit- !,·,! toreita; vaahtoamisenestoaineet, esimerkiksi parafiiniöljy ja silikonit, edullisesti erityiset etoksylaatio- ja pro-poksylaatiotuotteet.

Esimerkkeinä keksinnön mukaisen proteaasikolmoismu- » .···. 30 tantin käytöstä kovien pintojen puhdistuksen alueella mai- • · *·* nittakoon kaksi seuraava, kahdelle erityiskäyttöalueelle • · · *. *: tarkoitettua puhdistusainekoostumusta: • · m

Grillinpuhdistusaine: .···. 35 1,0 paino-% Walocel HT 30000 PFV:tä • · 0,1 paino-% Sequinon 40 Na 32:a 11 25 paino-% kaliumhydroksidiliuosta (50-painopro-senttistä) 4 paino-% Rewoteric AM VSF:tä 3 paino-% proteaasikolmoismutanttia 5 (aktiivisuus 300 000 DU/ml ± 5 %) 66,5 paino-% vettä

Painepesuaine: 5 paino-% rasva-alkoholieetterisulfaattia 10 (28-paino-%:ista) 10 paino-% Sequinon 40 Na 32:a 10 paino-% natriumhydroksidiliuosta (50-painopro- senttistä) 2 paino-% natriumkumeenisulfaattia (40-painopro-15 senttistä) 3 paino-% proteaasikolmoismutanttia (aktiivisuus 300 000 DU/ml ± 5 %) 70 paino-% vettä.

20 Keksinnön mukaisten voimakkaasti emäksisten prote- ... aasimutanttien yksi muu edullinen käyttöalue on nahankäsit- • · ; , tely, erityisesti nahanvalmistus. Keksinnön mukaista prote- • » · aasimutanttia käytetään tällöin erityisesti vuotien tai • · · *·*·* nahkojen karvanpoistomenettelyssä, jossa sillä on edulli- M · : V 25 sesti käyttöä pääliotus- ja/tai karvomiskalkitusmenettely-* vaiheissa.

:#ϊ : Keksinnön mukaiset proteaasimutantit soveltuvat erinomaisesti käytettäviksi nahanvalmistuksessa. Nahanval- ·*·*; mistus käsittää muun muassa seuraavat valmistusvaiheet: ."*. 30 a) lianpoistoliotus suolan, lian ja lannan poista- ··· • miseksi; • · · · *· b) pääliotus nahan turvottamiseksi ja vesiliukois- ····· * * ten proteiinien poistamiseksi; *;··· c) karvomi s kalkitus karvojen poistamiseksi ja vuo- .·**. 35 dan liottamiseksi parkitusta varten ja turvottamiseksi ··* 12 edelleen (nahakset); "nahaksella" tarkoitetaan tällöin saatua karvatonta, parkitusta varten liotettua nahkaa; d) kalkinpoisto ja peittaus orvaskesi- ja ihojään-nösten poistamiseksi samoin kuin pH-arvon alentamiseksi; 5 e) piklaus nahasten säätämiseksi happamiksi; f) kromiparkitus, ts. mineraaliparkitus kromi-, alumiini- tai zirkoniumsuoloilla.

Edellä mainittuja vaiheita seuraa yleensä neutralointi, mahdollisesti jälkiparkitus, värjäys ja rasvaus salo moin kuin kuivaus ja nahan viimeistely myyntikelpoisiksi tuotteiksi. Edellä mainitut työt, kuivausta ja viimeistelyä lukuun ottamatta, toteutetaan niin kutsutussa nahastamossa. Astioina käytetään tällöin haspeleita, ammeita ja betonimylly- tai pesukoneperiaatteella toimivia koneita. Entsyy-15 mejä käytetään edellä kuvatuissa toimenpiteissä piklaukseen asti, se mukaan luettuna. On ymmärrettävää, että parkitus-kemialliset menettelyt ja muut proteolyyttisten entsyymien käyttötarkoitukset, joissa pH on alueella 3 - 12, vaativat erilaisia entsyymejä yksittäisissä menettelyvaiheissa, kos-20 ka kullakin entsyymillä on spesifinen aktiivisuusalue pH:n ... suhteen. Entsyymituotteen pH:sta riippuvan vaikutusalueen • * · *;* [ laajuutta voidaan suurentaa huomattavasti valmistamalla pH- * · · *· " aktiivisuusalueeltaan erilaisista entsyymeistä seoksia na- • · · *.*.* hanvalmistusmenettelyä varten. Keksinnön mukaisia proteaa- • * · : 25 simutantteja voidaan käyttää edullisesti nahanvalmistukses- !,·,ϊ sa - mahdollisesti pääliotuksen ohella - erityisesti kar- vanpoistovaiheessa (kalkitusseoksessa). Keksinnön mukaisille mutanteille on tässä yhteydessä ominaista, että ne ta-kaavat optimaalisen tehokkuuden karvojen kiinnittymisestä .···. 30 vastaavien proteiinien liuotuksen suhteen pH-arvoon 12 asti • · • erityisesti myös teknisessä karvanpoistossa tavallisten ai- « · · *· *! haisten lämpötilojen (noin 28 - 30 °C) vallitessa. Edullis- *"*· ta karvanpoistovaikutusta tukee lisäksi keksinnön mukaisen ····· proteaasikolmoismutantin parannettu pH-stabiilius. Karvat .···, 35 ovat sangen helposti poistettavissa vuodista ja nahoista, • · ti· jotka on käsitelty käyttämällä keksinnön mukaista prote- 13 aasikolmoismutanttia, ja saavutetaan korkeita kokonaisirro-tusasteita (yli noin 99 %). Kuten osoitetaan esimerkeissä laboratoriomallikokeessa, ei karvojen poistamisessa kaapi" mella esiinny vaikeuksia. Keksinnön mukaisilla proteaasi-5 kolmoismutanteilla mahdollistetaan siten täydellinen ja vaurioita aiheuttamaton entsymaattinen karvojen poisto myös suurten nautaeläinten nahoista käytännöllisellä tavalla. Käytettäessä keksinnön mukaisia proteaasikolmoismutantteja kalkitusseoksessa voidaan lisäksi luopua suurimmalta osin 10 ympäristölle haitallisista kemikaaleista (esimerkiksi sul-fidista).

Keksintö koskee lisäksi aivan yleisesti ottaen ammattimaiseen ja/tai teolliseen käyttöön tarkoitettuja koostumuksia, jotka sisältävät edellä kuvattua keksinnön mu-15 kaista voimakkaasti emäksistä proteaasia ja muita, kulloisenkin käytön yhteydessä sinänsä tavanomaisia formulan aineosia. Mainitunlaiset keksinnön mukaiset koostumukset sisältävät esimerkiksi ammattimaisen ja/tai teollisen pinto-jenpuhdistuksen alueella seuraavia tyypillisiä aineosia: 20 emäksiä (esimerkiksi NaOH, KOH), anionisia ja ionittomia tensidejä, kompleksinmuodostajia, perhappivalkaisuaineita, • · · I . propeeniglykolia ym. orgaanisia liuotteita ja fosfonaatteja l *’ ym. buildereitä. Nahanvalmistusalalla tyypilliset koostu- < « · *·*·' mukset sisältävät formulan aineosina usein natriumsulfaat- »i • · · i ·* 25 tia, ammoniumsulfaattia, sahajauhoa yms. aineosia. Tällöin on kyse kiinteistä tuotteista, jotka koostuvat jauhemaisten • · · ϊ,ί * aineosien ja rakeistustuotteiden seoksista.

Sen ohella, että keksinnön mukaisilla voimakkaasti ;1; emäksisillä JSacillus-proteaasimutanteilla on edellä kuvat- .1. 30 tuja etuja ammattimaisissa ja/tai teollisissa käyttötarkoi- ·** / , tuksissa, on niillä lisäksi yllättäviä etuja myös kotitalo- • · · *· *· uspesu- ja -puhdistuainekoostumuksissa, jotka sisältävät * * keksinnön mukaista voimakkaasti emäksistä proteaasimutant- ·♦··· tia yhdistettynä toiseen, tekniikan tasoa vastaavaan tavan- 35 omaiseen "subtilisiini 309" -tyyppiseen proteaasiin (jossa ei esiinny kolminkertaista mutaatiota N42R/N114R/ N115R).

14

Keksinnön mukainen voimakkaasti emäksinen proteaasimutantti vaikuttaa tällöin seoksina kotitalousalalla yleisesti käytetyn proteaasin, erityisesti "subtilisiini 309" -tyyppisen proteaasin, kanssa positiivisesti kotitalouspesuaineen jäl-5 jellä olevaan pesutehoon varastoinnin jälkeen. Yhdistämällä mukaan keksinnön mukaista voimakkaasti emäksistä proteaasia parannetaan erityisesti tavanomaisten kotitalouspesuaine-tai kotitalouspuhdistusaineproteaasien varastointikestävyyttä pesu- tai puhdistusaineformuloiden tavanomaisten aineosien 10 läsnä ollessa. Koostumuksissa, jotka sisältävät tekniikan tasoa vastaavia tavanomaisia proteaaseja, tapahtuu huomattavasta aktiivisuushäviöstä aiheutuva pesutehon heikkeneminen, kun taas käytettäessä keksinnön mukaista proteaasikol-moismutanttia N42R/N114R/N115R tuotteilla on myyntitoimin-15 nan yhteydessä tavanomaisten varastointi- ja jakeluaikojen puitteissa kotitalouskäyttöön tarkoitettujen yleispesuainei-den yhteydessä vallitsevissa olosuhteissa (pH = 9,5 - 10,5, pesulämpötila erityisesti 30 - 60 °C) optimaalinen pesuak-tiivisuus, joka ylittää pelkästään tähän asti tunnettuja, 20 tekniikan tasoa vastaavia proteaaseja sisältävien koostu- ... musten pesuaktiivisuuden.

• » * *·* ‘ Keksintö koskee siten myös kotitalouspesu- ja koti- • · · *· talouspuhdistusainekoostumuksia, jotka sisältävät keksinnön • « ·.*,* mukaista voimakkaasti emäksistä proteaasimutanttia yhdis- ·· * • V 25 tettynä toiseen, "subtilisiini 309" -tyyppiseen proteaa- *_2^5 siin, jossa puolestaan ei esiinny kolminkertaista mutaatio- ta N42R/N114R/N115R. Keksinnön mukaiset edulliset kotitalo-uspesu- ja kotitalouspuhdistusainekoostumukset sisältävät keksinnön mukaista voimakkaasti emäksistä proteaasimutant-,···. 30 tia yhdistettynä toiseen proteaasiin, jonka aminohappose- • A 1 set, jotka sisältävät keksinnön mukaista voimakkaasti emäk- kvenssi on 95-%:isesti, edullisesti 98-%risesti, homologi- v · *. *i nen kuviossa 1 esitetyn aminohapposekvenssin kanssa, joi- loin tässä toisessa proteaasissa ei kuitenkaan esiinny koi-minkertaista mutaatiota N42R/N114R/N115R. Sangen edullisia ,···. 35 ovat kotitalouspesu- ja kotitalouspuhdistusainekoostumuk- v·· 15 sistä proteaasia, jonka pohjana oleva aminohapposekvenssi on olennaisesti identtinen kuviossa 1 esitetyn aminohapposekvenssin kanssa. Edullisia ovat tällöin sellaiset keksinnön mukaiset voimakkaasti emäksiset proteaasit, joissa 5 esiintyy mutaatio N42R/N114R/N115R ja joiden pohjana oleva aminohapposekvenssi on identtinen kuviossa 1 esitetyn aminohapposekvenssin kanssa tai eroaa siitä vain siten, että asemassa 85 on tapahtunut luonnollista tietä seriinin vaihtuminen asparagiiniksi.

10 Keksinnön mukaisissa käyttötarkoituksissa ja koos tumuksissa tulisi edullisesti käyttää sellaisia keksinnön mukaisia emäksisiä Bacillus-proteaasivalmisteita, joiden entsyymiaktiivisuus on 50 000 - 1 000 000 DU/g entsyymival-mistetta. "DU" tarkoittaa tällöin entsymaattista aktiivi-15 suutta Delft-yksikköinä, jolloin 1 000 DU vastaa proteo- lyyttistä aktiivisuutta, joka 2~painoprosenttisen entsyymi-liuoksen tilavuuden ollessa 1 ml antaa tulokseksi kaseiinin hajotuksen jälkeen ekstinktioeron (valon kulkumatka 1 cm; 275 nm; määritys sokeakoenäytettä vastaan) 0,4000. Keksin-20 nön mukaisia emäksisiä Bacillus-proteaasivalmisteita voi- ... daan tällöin käyttää ammattimaisissa tai teollisissa menet- • · · *·* ] telyissä tavanomaisissa formuloissa yksittäin tai halutta- • · · *. *ϊ essa myös yhdistettyinä muihin kyseisellä ammatti- tai te- • « :.V ollisuudenalalla tai kotitalousalueella yleisesti käytettä- ·· · • \ί 25 viin proteaaseihin tai muihin sinänsä tavanomaisiin entsyy- J meihin, kuten esimerkiksi amylaaseihin, lipaaseihin, sellu- ·*;*· laaseihin, pektinaaseihin, nukleaaseihin, oksidoreduktaa- seihin jne. Mainittujen Bacillus-proteaasien osuuden kek- .···. sinnön mukaisista formuloista tulisi, valmisteen kokonais- « · · 30 kuiva-aineesta laskettuna, olla edullisesti 0,1-5 paino-%, • * *Γ erityisesti 0,2-2 paino-%.

• * ·,*·; Keksinnön mukaiset koostumukset voidaan erilaisia * *ϊ**ϊ käyttöalueita varten saattaa sinänsä tunnetulla tavalla jauhemuotoon, esimerkiksi rakeiden tai pellettien muotoon, • ♦ β···# 35 jotka voidaan mahdollisesti myös varustaa päällysteellä.

• ·

Hyvän stabiiliutensa ansiosta keksinnön mukaisia Bacillus- 16 proteaasimutantteja voidaan käyttää myös nestemäisissä formuloissa .

Keksinnön mukaisella voimakkaasti emäksisellä Ba~ cillus-proteaasimutantilla on yllättävän hyvät ominaisuudet 5 ammattimaisissa tai teollisissa menettelyissä tavallisissa olosuhteissa - kuten voimakkaasti emäksisten pH-arvojen, esimerkiksi yli 11,0, samoin kuin mahdollisesti korkeiden, 70 °C:seen ulottuvien, lämpötilojen vallitessa. Tämä on sitäkin yllättävämpää siitä syystä, että verrattuna tavan-10 omaiseen kotitalouskäyttöön on ammattimaisessa tai teollisessa käytössä useimmiten käytettävissä vain suhteellisen lyhyitä käyttöaikoja. Hyvän lämpötilastabiiliuden ohella on keksinnön mukaisilla voimakkaasti emäksisillä Bacillus-proteaasimutanteilla mainitussa yhteydessä erityisesti hyvä 15 entsyymin stabiilius ammatti- tai teollisuuskäyttöön tai myös kotitalousalueelle tarkoitetuissa koostumuksissa yleisesti käytettävien aineosien läsnä ollessa. Keksinnön mukainen voimakkaasti emäksinen Sacillus-proteaasimutantti kestää yllättävän hyvin myös ammatti- tai teollisuussekto-20 rilla tai kotitalousalueella yleisiä valkaisuaineita, jollaisia käytetään esimerkiksi desinfioivissa ammattipesuai- • · · *·* * neissa sairaala-alalla tai yleisesti myös kotitalouspesuai- V*: neissa.

• ·

Piirustusten kuvaus !*·’: 25 Kuvio 1: • ♦

Bacillus alcalophilus HA 1 (DSM 5466) -peräisen ·*·*. emäksisen proteaasin aminohapposekvenssin (SEQ ID NO: 1) sekvenssilistaus ·.· Kuvio 2: * · · • · · 1··Λ 30 Proteaasimutantin pH-optimi verrattuna mutatoimat- • ♦

*” tomaan lähtöaineproteaasiin lämpötilassa T = 50 °C

·.*·· Kuvio 3: *:**: Proteaasimutantin lämpötilaoptimi verrattuna mutani.· toimattomaan lähtöaineproteaasiin pH-arvon 11 vallitessa • · ··· • « • · *·· 17

Kuvio 4:

Proteaasimutantin varastointikestävyys verrattuna mutatoimattomaan lähtöaineproteaasiin standardipesuaineessa (suljetut pahvirasiat) 5 Kuvio 5:

Proteaasimutantin puhdistusteho verrattuna muta-toimattomaan lähtöaineproteaasiin, kun pH = 11,4 ja T = 15 - 60 °C.

Bacillus alcalophilus HA 1 (DSM 5466) -peräisen 10 emäksisen proteaasin kuviossa 1 esitetyn aminohapposekvenssin sekventointia määrittämällä vastaava nukleotidisekvens-si kuvataan EP-hakemusjulkaisun 415 296 esimerkeissä 1-4. Kanta, joka on nimetty Bacillus alcalophilus HAl:ksi on talletettu 28.7.1989 kokoelmaan die Deutsche Sammlung von 15 Mikroorganismen (DSM) numerolla DSM 5466 (osoite: DMS-

Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmBH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Saksa).

Esimerkkejä

Seuraavien esimerkkien tarkoituksena on valaista 20 keksintöä sen suoja-alaa kuitenkaan rajoittamatta.

Esimerkki 1 ··« • Φ · *·* * Aminohapposekvenssiin aiheutetulla mutaatiolla muun- • · *.*•1 netun emäksisen proteaasin valmistus • · %·,· Sellaisen emäksisen proteaasin valmistus, joka ero- { *t! 25 aa Bacillus alcalophilus HA 1 (DSM 5466) -peräisen emäksi- ;ϊ|ϊ sen proteaasin kuviossa 1 esitetystä aminohapposekvenssistä ·*·*· aminohappovaihtojen N42R, N114R ja N115R suhteen, toteutet- tiin sinänsä tunnetulla tavalla vastaavan proteaasigeenin .···, DNA-osasekvenssien kohdennetun mutageneesin kautta. Numerot « · · I·. 30 viittaavat tässä yhteydessä vastaavaan asemaan kuviossa 1 • · *" esitetyssä aminohapposekvenssissä, ja asemanumeroa edeltää • · *,**: alkuperäinen aminohappo ja seuraa sekvenssiin tuotu amino- *!"! happo ilmaistuina sinänsä tunnetulla yksikirjainkoodilla.

Menetelmää kohdistetun mutageneesin toteuttamiseksi yksit- • φ t...t 35 täismutaatioiden ollessa kyseessä kuvataan perusteellisesti • « **’ EP-hakemus julkaisun 415 296 esimerkeissä 5 - 18. Lisäksi 18 viitattakoon julkaisun EP 503 346 esimerkkeihin, joissa kuvataan menettelyä yksittäismutaatioiden aikaansaamiseksi.

Menettely käsitti periaatteessa seuraavat sinänsä tunnetut menettelyvaiheet:

5 Luonnosta eristetystä Bacillus alcalophilus HA

l:stä (DSM 5466) eristettiin Saiton et ai. menetelmällä [Biochim. Biophys. Acta 72 (1963) 619 - 629] kromosomi-DNA ja hydrolysoitiin se osittain restriktioendonukleaasilla Sau3A. Restriktiofragmentit erotettiin elektroforeesilla ja 10 eristettiin fragmentit, joiden koko oli 3-8 kiloemästä.

Bacillus alcalophilus HA l:stä saadut eristetyt ja koon mukaan valikoidut DNA-fragmentit yhdistettiin sinänsä tunnetun plasmidin pUB 110 vektori-DNA:hän in vitro sinänsä tunnetulla tavalla. Saadulla in vitro -uudelleenyhdistetyllä 15 DNA:11a transformoitiin kannan Bacillus subtilis BD224 (Bacillus Genetic Stock Center 1A46) protoplasteja S. Changin ja N. Cohenin [Mol. Gen. Genet. 168 (1979) 111 - 115] ku vaamalla menetelmällä. Transformantit valikoitiin neomysii-niä sisältävillä maljoilla. Yhdestä kloonista eristettiin 20 plasmidi-DNA Maniatisin et ai. käsikirjan mukaisesti (Ma- niatis et ai. = T. Maniatis, E. F. Fritsch, J- Sambrook, M· 9 9 r • · i ' Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor • » V*: Laboratory 1982) . Tämän plasmidin sisältämän B. alcalophi- • · J,V lus -DNA-peräisen fragmentin koko oli 4,1 ke, ja se sisälsi ϊ25 Bacillus alcalophilus HA 1 (DSM 5466) -peräistä voimakkaasti : :*: emäksistä proteaasia vastaavan täydellisen DNA-sekvenssin ;*·*· (vertaa EP-hakemusjulkaisun 415 296 esimerkkeihin 1 ja 2) .

Plasmidi, joka sisälsi Bacillus alcalophilus HA 1 (DSM 5466) -peräistä voimakkaasti emäksistä proteaasia vas- • · · l··' 30 taavan täydellisen DNA-sekvenssin, pilkottiin Avalrllä. Yk- • ♦ *“ sisäikeiset päät täydennettiin sinänsä tunnetulla tavalla • * ·/*· (Maniatis et ai., s. 114) DNA-kaksoissäikeeksi. Kun tämä *·**ϊ DNA oli sitten pilkottu Xbal:llä, eristettiin N-terminaa- <#4.j linen 1 618 emäsparia käsittävä fragmentti ja kloonattiin * * 35 se sinänsä tunnetulla tavalla vektoriin pBS. Tuloksena ole- • · va vektori sisälsi kuvion 1 esittämää aminohapposekvenssiä 19 koodittavan DNA:n N-terminaalisen pään (vertaa EP-hakemus-julkaisun 415 296 esimerkkiin 5).

Vastaavalla tavalla muodostettiin vektori, joka sisälsi vastaavaa proteaasia koodittavan DNA-fragmentin 5 658 emäsparia käsittävän C-terminaalisen pään. Tämän teke miseksi täydellisen DNA-sekvenssin sisältävä plasmidi pilkottiin restriktioendonukleaaseilla Xbal ja Asp718 ja kloonattiin tunnetun vektorin pBS vastaavaan katkaisukohtaan (vertaa EP-hakemusjulkaisun 415 296 esimerkkiin 7).

10 Kohdennetut mutaatiot toteutettiin C-terminaalisen tai N-terminaalisen pään sisältävässä DNA-osasekvenssissä T. A. Kunkelin [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82 (1985) 488 - 492] kuvaamalla "alukelaajennusmenetelmällä". Tämän tekemiseksi vastaavat vektorit muutettiin ensin urasiloi-15 duiksi yksisäikeisiksi analogeikseen sinänsä tunnetulla tavalla viljelemällä jommallakummalla vektorilla transformoituja E. coli CJ236 -bakteereja, jotka infektoitiin lisäksi apufaagilla M13 K07 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornia) . Bakteeri E. coli CJ236 on sinänsä tunnettu mutant-20 ti, josta puuttuu urasiili-N-glykosylaasi ja joka vektorien replikaation yhteydessä sisällyttää tymidiinin sijasta • · » urasiilinukleotidin DNA-sekvenssiin. Urasiloituja vektorei- • · ♦ ·. *; ta voidaan käyttää sinänsä tunnetulla tavalla kohdennetuis- • · ·.*,· sa mutageneesireaktioissa in vitro, koska urasiilipitoinen • 25 yksisäikeinen DNA, joka on toiminut templaattina mutatoitu- ϊ jen DNA-säikeiden aikaansaamiseksi, voidaan eliminoida kä- ·** ** ·*·*· sittelemällä urasiili-N-glykosylaasilla. Mainittujen apu- faagien käyttö oli välttämätöntä vaippaproteiinien synteti-soimiseksi muodostunutta urasiloitua yksisäikeistä vektori- • · « ^ 30 DNA:ta varten. Vaipallinen urasiloitu yksisäikeinen vekto- ♦ · *Γ ri-DNA erittyi transformoidun isäntäorganismin E. coli • · ·.**; CJ236 ulkopuolelle, ja se eristettiin sitten kasvualustas- *·**· ta.

* C-terminaalista tai N-termmaalista päätä vastaavat • · 35 eristetyt, urasiloidut yksisäikeiset DNA-vektorit hybridi- *** soitiin sellaisten synteettisten oligonukleotidien kanssa, 20 jotka sisälsivät mutaatiokohdat ja toimivat samalla aluk-keina seuraavassa täydentämisessä mutaation sisältäväksi täydelliseksi DNA-kaksoissäikeeksi. Tässä yhteydessä käytetyt synteettiset oligonukleotidit valmistettiin sinänsä 5 tunnetulla tavalla S. L. Beaucagen ja M, H. Caruthersin menetelmillä [Tetrahedron Letters 22 (1981) 1859 - 1862].

Toisen DNA-säikeen synteesi toteutettiin sinänsä tunnetulla tavalla käyttämällä T4-DNA-polymeraasia ja tekemällä sen jälkeen ligaatio T4-DNA-ligaasin avulla [Kunkel et ai., 10 Methods in Enzymol. 154 1987) 367 - 382]. Muodostetulla kaksisäikeisellä vektori-DNA:11a transformoitiin E. coli MC 1061 ja mutatoituneet vektorit indentifioitiin tarkistamalla vastaavat, synteettisten oligonukletidien tuomat tai poistamat ainutkertaiset restriktioendonukleaasitunnistus-15 kohdat.

Esimerkiksi kahden mutaation aikaansaamiseksi joko proteaasi-DNA:n N-terminaalisessa tai C-terminaalisessa osassa toistettiin menettely ensimmäisen mutaation aikaansaannin jälkeen samalla tavalla käyttämällä toista synteet-20 tistä oligonukleotidia toisen mutaation tuomiseksi sekvens- ... siin.

• · » *;* ] Valmistettiin ilmentymisvektoreita, joissa oli mu- • * · *· '· taatioita proteaasi-DNA:n N-terminaalisessa tai C-terminaa- *.V lisessa osassa, pilkkomalla kohdennetulla mutageneesilla ·· · • V 25 aikaansaadut DNA-sekvenssit restriktioendonukleaaseilla ja ί#ί#ί ligatoimalla vektori-DNA: n kanssa, joka sisälsi DNA-sek- :*·*· venssin vastaavan toisen terminaalisen osan samoin kuin kaikki ilmentymisen vaatimat elementit. Saadut vektorit olivat täydellisiä ilmentymisvektoreita, joissa oli sopiva ,···. 30 lukukehys vastaavasti mutatoidun proteaasin ilmentämistä • · "* varten. Tällaisten ilmentymisvektoreiden valmistus tapahtui EP-hakemusjulkaisun 415 296 esimerkissä 16 perusteellisesti * *·"· kuvatun menetelmän mukaisesti. Seuraavaa kolminkertaista ♦ ....j mutaatiota varten valmistettiin vastaavalla tavalla ilmen- • · .···, 35 tymisvektori DSM 5466 Mut. N42R/N114R/N115R.

• « ««« 21

Kolminkertaisesti mutatoitu voimakkaasti emäksinen proteaasi valmistettiin transformoimalla B. subtilis BD 224 edellä mainitulla ilmentymisvektorilla sinänsä tunnetulla tavalla ja viljelemällä sitä. Kolminkertaisesti mutatoitu 5 voimakkaasti emäksinen proteaasi eristettiin tunnetuin menetelmin transformoidun ja viljellyn kannan viljelmäsuper-natanteista. Yksityiskohtaisia tietoja mutatoitujen prote-aasien eristysmenetelmistä esitetään EP-hakemusjulkaisun 415 296 esimerkeissä 16 ja 18, joiden mukaisesti tässä yh- 10 teydessä toimittiin.

Bacillus alcalophilus HA l:een (DSM 5466) perustuvaa, aminohapposekvenssissä olevan kolminkertaisen mutaation kautta muunnettua emäksistä proteaasia käytettiin esimerkeissä 2-4 kuvattavissa kokeissa.

15 Keksinnön mukaisen kolminkertaisen mutantin käyttöä ja etuja ammattimaisen pyykinpesun alueella kuvataan perusteellisesti rinnakkaisessa ja tässä etuoikeuden pohjana olevassa DE-patenttihakemuksessa 4 411 223, johon siksi vain viitataan tässä.

20 Keksinnön mukaisen proteaasimutantin muita ominai- ... suuksia esitetään esimerkissä 5.

• * * I , Esimerkki 2 » · « *· · Keksinnön mukaisen kolminkertaisen proteaasimutan- • · · *·*.* tin karvanpoisto-ominaisuuksien määrittäminen • · · : *.* 25 Esipuhdistus:

Naudannahka kastellaan pitämällä 1 tunti kaksinker- :#Γ: täisessä vesimäärässä (naudannahan mukaan laskettuna), joka sisältää 0,1 % Marlipal 013/939:ää, suunnilleen lämpötilas- ;*·*; sa 28 - 30 °C. Naudannahka leikataan sitten paloiksi, joi- .·*·, 30 den mitat ovat noin 20 x 60 cm, ja säilytetään lämpötilassa • · · / t -20 °C. Varastopaloista leikataan koepaloja, joiden mitat * · Φ *· " olivat noin 20 x 7 cm, valutetaan ne ja kuivataan sitten **’* paperipyyhkeillä. Koepaloja liikutellaan 120 minuuttia 0,5 % ··..! natriumkarbonaattia sisältävässä liuoksessa ja 0,1 % .*·*, 35 15 minuuttia. Rekisteröidään massan kasvu.

• · «·· 22 Ά. Esipuhdistettujen nahkojen turvotus (veden vastaanotto)

Inkubointiliuos: 0,5 % natriumkarbonaattia, 0,1 %

Marlipalia (nahan mukaan laskettuna), kaksinkertainen määrä 5 vettä (nahan mukaan laskettuna)

Inkubointiaika: 120 min Inkubointilämpötila: 28 °C Entsyymi: Optimase L660 10 Tes- Entsyymiannostus Massa in- Massa Erotus, ti [g/100 kg [AADU/ kuboinnin ennen in- massan nahkaa] kg] jälkeen kubointia kasvu tg] [g] [g] [%1 1 6,08 37470 729,53 701,59 27,940 4,0 15 B. Karvanpoisto

Inkubointiliuos: 7,1 g/1 Ca(OH)2:a (200 % naudanna- han mukaan laskettuna)

Inkubointiaika: 24 tuntia

20 Inkubointilämpötila: 30 °C

... Sekoitus: Inkuboinnin alussa 2 tunti jatkuvasti Li- • · · ‘ , nitest-koneessa ja lopussa 3,5 tuntia jatkuvasti • · · *· pH-arvo: alussa 12,48, lopussa 12,45 • · · • · · Φ • t ♦ :*,· 25 Kupin Proteaasi Entsyymi anno s tus Irtoaminen ί,·,ί nro [g/100 kg [AADU/kg nahasta* nahkaa] nahkaa] 1 Sokea koe _ _ 3 .*:*. 2 Sokea koe 3 · · . - .·*·. 30 3 Mutantti 310, 81 925 188 1 · *“ 4 Mutantti 310,81 925 188 1 ♦ • « · • ·· • · *’**· Mutantti = käytetty proteaasikolmoismutantti N42R/N114R/ N115R, jonka aktiivisuus on 300 000 DU/ml (± 5 %) .···. 35 *1: Karvojen helppo ja täydellinen poistuminen • · ··· 23 2: Karvojen lähes täydellinen poistuminen, nahalla kuitenkin vielä (paakkuisia) jäännöksiä 3: Karvoja irtoaa vain sangen vähän tai ei ollenkaan 5 Kommentti: Koepalat olivat työvaiheen A jälkeen pehmeitä ja sienimäisiä; työvaiheen B jälkeen koepalat olivat "kumimai-siksi kovettuneita".

Esimerkki 3

Koepalojen alkuperä: lehmä, selkäosa 10 Esipuhdistus:

Nahka kastellaan pitämällä 1 tunti kaksinkertaisessa vesimäärässä (nahan mukaan laskettuna), joka sisältää 0,1 % Marlipal 0 13/939:ää, suunnilleen lämpötilassa 28 - 30 °C. Nahka leikataan sitten paloiksi, joiden mitat 15 ovat noin 20 x 60 cm, ja säilytetään lämpötilassa -20 °C. Varastopaloista leikataan koepaloja, joiden mitat ovat noin 20 x 7 cm, valutetaan ne ja kuivataan sitten paperipyyh-keillä. Koepaloja liikutellaan 120 minuuttia 0,5 % natrium-karbonaattia sisältävässä liuoksessa ja 0,1 % 15 minuuttia. 20 Rekisteröidään massan kasvu.

... Tehdään 3 testiä seuraavassa esitettävissä olosuh- • · · l . teissä • · · '· A. Esipuhdistettujen nahkojen turvotus (veden vas- *.1.1 taanotto) ·· · • V 25 Inkubointiliuos: 0,5 % natriumkarbonaattia, 0,1 % ί.ϊ,ϊ Marlipalia (nahan mukaan laskettuna), kaksinkertainen määrä vettä (nahan mukaan laskettuna) *

Inkubointiaika: 120 min .1". Inkubointilämpötila: 28 °C

.···, 30 Entsyymi: Optimase L660 • ·· Φ • 1 • · · • · · • i • · · *** • 1 • · «·· 24

Te s- Entsyymi annos tus Idassa in- Massa Erotus, ti [g/100 kg [AADU/ kuboinnin ennen in- massan nahkaa] kg] jälkeen kubointia kasvu

[g] [g] [g] [%J

5 1** 15,89 20060 715,98 732,58 -16,60 -2,3 2 3,26 20122 905,27 866,22 39,05 4,5 3 3,32 20476 338,39 342,25 -3,26 -1,1 **Koepalat ovat olleet 1,5 tuntia jääkaapissa vaiheiden A 10 ja B välissä.

B. Karvanpois to

Inkubointiliuos: 7,1 g/1 Ca(OH)2:a (200 % naudanna-han mukaan laskettuna)

Inkubointiaika: 24 tuntia 15 Inkubointilämpötila: 30 °C

Sekoitus: Inkuboinnin alussa 2 tuntia jatkuvasti

Linitest-koneessa ja lopussa 3,5 tuntia jatkuvasti pH~arvo: Alussa Lopussa

Testi 1 12,48 12,46 20 Testi 2 12,55 12,53

Testi 3 12,5 12,5 M· ' ' • · » V Testin 1 tulokset: • t ·.**: Käytetty proteaasi: N42R/N114R/N115R, jonka aktii- V.* visuus on 300 000 DU/ml (± 5 %) ·· ♦ : * ! 25 • Kupin Entsyymiannostus Irtoaminen

• SS

nro [g/100 kg nahkaa] [AADU/kg nahkaa] nahasta* 1 _ _ 3 ... 2 3 30 3 31,2 92 745 1,4 **:·* 4 31,2 92 745 1,2 • · • i • ·· • * *:*·: Kommentti: Karvat poistuivat pituuden suhteen yhte- näisesti, jäljelle jäi kuitenkin noin 1-3 mm:n sänki.

• · ··· • · • · ··· 25

Testin 2 tulokset: Käytetty proteaasi: N42R/N114R/N115R, jonka aktiivisuus on 300 000 DU/ml (± 5 %) 5 Kupin Entsyymiannostus Irtoaminen nro [g/100 kg nahkaa] [AADU/kg nahkaa] nahasta* 1 10,1 29 969 2,2 2 50,3 149 844 1,8 3 100,7 299 688 2,0** 10 4 151,0 449 531 1,4** **Niskaosa, jossa karvat ovat tiukemmin kiinni Testin 3 tulokset: Käytetty proteaasi: N42R/N114R/N115R, jonka aktiivisuus on 300 000 DU/ml (± 5 %) 15

Kupin Entsyymiannostus Irtoaminen nro [g/100 kg nahkaa] [AADU/kg nahkaa] nahasta* 1 151,3 450 294, 1,2 2 100,9 300 196 1,4 20 3 50,4 150 098 1,6 *··

• I I

**’ * *Testien 1-3 selitykset • · · ** *· 1: Karvojen helppo ja täydellinen poistuminen ® · · *.*.* 2: Karvojen lähes täydellinen poistuminen, nahalla kuiten- • t ♦ j V 25 kin vielä (paakkuisia) jäännöksiä 3: Karvoja irtoaa vain sangen vähän - ei ollenkaan ··· • · · • * ·

Esimerkki 4 A: Pääliotus ♦ * ♦ .*·*. 30 Naudannahka (massa): 1 886,25 g (esipuhdistus esi- t merkeissä 2 ja 3 esitetyn kaltainen • · · *· *ί Ruhon osa: vatsa ***** Seos: Vesi 3 772,50 g ·:··: Na2C03: 9,43 g ,*··, 35 Tensidi: 1,89 g Marlipalia • »· 26

Entsyymi: 0,3046 g Optimase L660:ä

Vastaa: 9 9582 AADU/kg naudannahkaa

Massa 4 tunnin reaktion jälkeen: 2 039,5 g

Massa kasvu: 8,1 paino-% 5 pH-arvo 4 tunnin reaktion jälkeen: 10,21 B. Karvanpoisto Vesi: 3 059,25 g

Ca(OH)2: 20, 40 g

Entsyymi: 6,9352 g proteaasimutanttia, jonka 10 aktiivisuus on 150 000 DU/ml (± 5 %),

Vastaa: 539 878 AADU/kg naudannahkaa pH-arvo 17,25 tunnin inkuboinnin jälkeen: 12,75 Karvanpoiston optinen arviointi:

Karvat olivat poistettavissa sangen helposti, pois-15 tettaessa koepala rummusta karvat poistuivat jo palan joutuessa kosketukseen aukon reunan kanssa. Jäljelle jäi 2-3 kohtaa, joiden kunkin pinta-ala oli noin 2 cm2; ne eivät aiheuttaneet vaikeuksia käytettäessä kaavinta.

Esimerkki 5 20 Seuraavassa valaistaan vielä joitakin keksinnön mu- ... kaisen kolmoismutantin olennaisia ominaisuuksia.

• · « * a) Määritettiin keksinnön mukaisen kolmoismutantin ♦ ♦ ♦ *· *· aktiivisuuden riippuvuus pH-arvosta käyttäen vertailuainee- • ·*· *·*.* na mutaatioita sisältämätöntä lähtöaineproteaasia seuraavissa ·· · i *.· 25 olosuhteissa: substraatti = asetyylikaseiini, T = 50 °C, •JJ reaktioaika = 10 min, fosfaatti-boraattipuskuri. Havaittu ΓΓ: pH-arvosta riippuva suhteellinen prosentuaalinen aktiivi suus (aktiivisuuden määritellään olevan 100 % pH-arvon 8,5 vallitessa) esitetään kuviossa 2. Keksinnön mukaisella .···. 30 kolmoismutantilla on lähtöaineproteaasiin verrattuna sei- • · t·9 västi parantunut aktiivisuus korkeampien pH-arvojen valli- *. *i tessa, pH-alueella 10 - 12.

# *·**· b) Määritettiin keksinnön mukaisen kolmoismutantin ....: aktiivisuuden riippuvuus lämpötilasta käyttäen vertailuai- • · .··*. 35 neena mutaatioita sisältämätöntä lähtöaineproteaasia seu- Λ Λ raavissa olosuhteissa: substraatti = asetyylikaseiini, 27 pH = 11. Havaittu lämpötilasta riippuva suhteellinen prosentuaalinen aktiivisuus (aktiivisuuden määritellään olevan 100 % pH-arvon 8,5 ja lämpötilan 50 °C vallitessa) esitetään kuviossa 3. Keksinnön mukaisella kolmoismutantilla on 5 valitun korkean pH-arvon vallitessa lähtöaineproteaasiin verrattuna selvästi parantunut aktiivisuus lämpötila-alueella 45 - 58 °C.

c) Määritettiin keksinnön mukaisen kolmoismutantin varastointikestävyys (shelf life) mutaatioita sisältämättö- 10 mään lähtöaineproteaasiin verrattuna varastointiajän funktiona säilyttämällä standarditäyspesuainetta suljetuissa pahvirasioissa seuraavissa olosuhteissa: T = 30 °C, suh teellinen kosteus 60 % (RH = relative humidity). Keksinnön mukaisen kolmoismutantin varastoinnin jälkeen havaittu pro-15 sentuaalinen jäännösaktiivisuus (laskettuna alkuaktiivisuu-desta = 100 %) on selvästi korkeampi kuin lähtöaineproteaa-sin vastaava arvo, ja sen stabiilius on siten parempi. Tuloksia valaistaan kuviossa 4.

d) Keksinnön mukaisen kolmoismutantin hyvän puhdis- 20 tusvaikutuksen (pinnan puhdistus) osoittamiseksi määritet- .···, tiin pesuteho lähtöaineproteaasiin verrattuna erilaisten • · · I . entsyymipitoisuuksien vallitessa seuraavissa olosuhteissa: * ·* ;,* Standardipesuainepohja; pH = 11,4 (6 g/1); testikangas = * · · [·*·* EMPA 117, T = 60 °C. Tuloksia (heijastavuusero), joita saa- • · · ϊ ·’ 25 tiin käytetyn entsyymimäärän (mg/1) funktiona, valaistaan • ·’· kuviossa 5, joka osoittaa keksinnön mukaisen proteaasin pa- ··· V : remmuuden korkean pH ja korkean lämpötilan vallitessa.

e) Keksinnön mukaisen kolmoismutantin ja tekniikan iV: tasoa vastaavien pesuaineproteaasien (tässä "subtilisiini .***. 30 309" -tyyppinen lähtöaineproteaasi) yhdistelmän edullisuu- • t· / , den osoittamiseksi tehtiin seuraavat kokeet, joissa saatiin • · · ** " esitetyt tulokset.

*···· * * Koe 1 ·;»·! Keksinnön mukaisen kolmoismutantin suhteellinen pe- .*·*. 35 suteho verrattuna mutaatioita sisältämättömään lähtöaine- • * *·· proteaasiin (kumpikin varustettu päällysteellä) ennen koti- 28 talouskäyttöön tarkoitetun yleistäyspesuaineen varastointia ja sen jälkeen. Kyseessä on 2 testikankaasta määritetty keskimääräinen pesuteho annostuksen ollessa sama aktiivisuuden suhteen.

5 Proteaasi Ennen 6 viikkoa kestäneen varastointia varastoinnin (35 °C, RH 80 %) jälkeen Lähtöaineproteaasi 97,15 28,15

Kolmoismutantti 66,22 50,72 10 N42R/N114R/N115R 61,60 50,79

Koe 2 Jäännösaktiivisuus ja jäännöspesuteho, kun keksinnön mukaista kolmoismutanttia tai lähtöaineproteaasia on 15 säilytetty pesujauheessa lämpötilassa 30 °C RH:n ollessa 60 % (RH = relative humidity = suhteellinen kosteus); pH-arvo oli ennen pesua kussakin tapauksessa 10,2.

Varastointiaika A B C D

20 0 viikkoa 100,0 24,50 100,0 22,99 ... 1 viikko 92, 4 — 100,0 * . 2 viikkoa 86, 9 — 94,6 *· “· 4 viikkoa 75,1 — 86,0 V.: 6 viikkoa 60, 9 14,98 70,8 21, 63 *· » : V 25 ί,·,ί Testikangas; veri/maito/tussi (EMPA117) % dR: Testikudoksen (entsyymipitoinen pesuaine) heijas- tusarvon ja entsyymittömällä peruspesuaineella pestyn tes- tikankaan heijastusarvon erotus • * · -* .·*·, 30 Entsyymiannostus: aktiivisuudeltaan sama • · ]·* A = jäännösaktiivisuus (%), lähtöaineproteaasi *. *! B = pesuteho (% dR) , lähtöaineproteaasi t C = jäännösaktiivisuus (%), kolmoismutantti ....: D = pesuteho (% dR) , kolmoismutantti ··· • · • ·

• M

29 Määritelmiä:

Optimase L660 = B. licheniformis -peräinen emäksinen pro- teaasi

Marlipal = polyeteeniglykoli-isotridekyylieetteri 5 Walocel = 2-hydroksietyyliselluloosaeetteri

Sequinon = [[bis[2-[bis(fosfonometyyli)amino]etyyli] amino]metyyli]fosfonihappo, natriumsuola Rewoteric = imidatsoliinipohjäinen amfolyytti AADU = Autoanalyzer Delf Units (automaattisen 10 analysointilaitteen Delf-yksikkö) EMPA117 = verellä, maidolla ja tussilla liattu poly- esteri-puuvillatestikangas (Eidgenössische Materialpriifungsanstalt, Sveitsi) .

··· • i i • φ · • · • » · • »« • « • · Φ « · • · · · ·1 2 3 · • · 1 • · • · • · t » · · *·· ·« • ♦ · • · · ··· • ♦ » « · · ·1· • · • » ·«· • · • 1 ·

• M

* « · 2 ···

• V

• · 3

Claims (10)

1. Voimakkaasti emäksinen proteaasi, tunnet-t u siitä, että sen pohjana on aminohapposekvenssi, joka on 5 vähintään 95-%:isesti, edullisesti vähintään 98-%:isesti, homologinen kuviossa 1 esitetyn aminohapposekvenssin kanssa, ja se eroaa tästä kuvion'1 asemissa 42/114/115 tai kolmessa, kussakin tapauksessa näiden asemien suhteen homologisessa asemassa tapahtuneen kolminkertaisen mutaation vuoksi 10 siten, että kyseisissä asemissa olevat aminohapot on vaihdettu arginiiniksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen voimakkaasti emäksinen proteaasi, tunnettu siitä, että sen pohjana on kuviossa 1 esitetyn aminohapposekvenssin kanssa olennaises- 15 ti identtinen aminohapposekvenssi ja se eroaa tästä kuvion 1 asemissa 42/114/115 tapahtuneen kolminkertaisen mutaation vuoksi siten, että kyseisissä asemissa olevat aminohapot on vaihdettu arginiiniksi.

3. Patenttivaatimuksen 21 mukainen voimakkaasti emäk- 20 sinen proteaasi, tunnettu siitä, että pohjana oleva aminohapposekvenssi on identtinen kuviossa 1 esitetyn ami- • · « *·* * nohapposekvenssin kanssa tai eroaa siitä vain siinä suh- *. *: teessä, että asemassa 85 seriini on vaihtunut luonnollista • · i.V tietä asparagiiniksi, tai vain seuraavissa asemissa luon- j**[: 25 nollista tietä tapahtuneiden muutosten 97D/99R/101A/ • ·*: 102I/157S tai luonnollista tietä tapahtuneiden muutosten 3T/97D/99R/101A/102I/157S suhteen.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukaisen voi- .•j*. makkaasti emäksisen proteaasin käyttö ammattimaisissa tai * · · 30 teollisissa käyttötarkoituksissa.

• · ”* 5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukaisen voi- • · V*: makkaasti emäksisen proteaasin patenttivaatimuksen 4 mukai- *:**: nen käyttö pintojen puhdistukseen ammattimaisesti toimivis- sa tai teollisuuslaitoksissa, edullisesti teurastamoissa, ... 35 elintarvike- ja nautintoaineteollisuudessa, suurkeittiöissä • · *** ja grillaamoissa.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukaisen voimakkaasti emäksisen proteaasin patenttivaatimuksen 5 mukainen käyttö nahanvalmistusmenettelyissä, erityisesti menettelyissä karvojen poistamiseksi vuodista tai nahoista.

7. Ammattimaiseen ja/tai teolliseen käyttöön tar koitettuja koostumuksia, tunnetut siitä, että ne sisältävät jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukaista voimakkaasti emäksistä proteaasia ja kulloisenkin käytön yhteydessä sinänsä tavanomaisia muita formulan aineosia.

8. Kotitalouspesu- ja kotitalouspuhdistusainekoos- tumus, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin patenttivaatimuksista 1 - 3 mukaista voimakkaasti emäksistä proteaasia yhdistettynä toiseen "subtilisiini 309" -tyyppiseen proteaasiin, jossa ei esiinny kolminkertaista mutaa-15 tiota N42R/N114R/N115R.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen kotitalouspesu-ja kotitalouspuhdistusainekoostumus, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin patenttivaatimuksista 1-3 raukaista voimakkaasti emäksistä proteaasia yhdistettynä toiseen 20 proteaasiin, jonka aminohapposekvenssi on 95-prosenttises- ... ti, edullisesti 98-prosenttisesti, homologinen kuviossa 1 • · · * . esitetyn aminohapposekvenssin kanssa, mutta jossa toisessa • · · '· proteaasissa ei kuitenkaan esiinny kolminkertaista mutaa- :.V tiota N42R/N114R/N115R. ·· · i 1.· 25

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen kotitalouspesu- ja kotitalouspuhdistusainekoostumus, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 3 mukaista voimakkaasti emäksistä proteaasia yhdistettynä toiseen proteaasiin, ·“1. jonka aminohapposekvenssi on identtinen kuviossa 1 esitetyn .1·1. 30 aminohapposekvenssin kanssa tai eroaa siitä vain siinä suh- • · ··· • teessä, että asemassa 85 seriini on vaihtunut luonnollista • 1 · *· 1: tietä asparagiiniksi. • ••M • · · • · · • · • · *·«