[go: up one dir, main page]

FI117939B - Polyamidi-oligonukleotidijohdoksia, niiden valmistus ja niiden käyttö - Google Patents

Polyamidi-oligonukleotidijohdoksia, niiden valmistus ja niiden käyttö Download PDF

Info

Publication number
FI117939B
FI117939B FI20051072A FI20051072A FI117939B FI 117939 B FI117939 B FI 117939B FI 20051072 A FI20051072 A FI 20051072A FI 20051072 A FI20051072 A FI 20051072A FI 117939 B FI117939 B FI 117939B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
group
dna
pna
formula
polyamide
Prior art date
Application number
FI20051072A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI20051072L (fi
Inventor
Eugen Uhlmann
Gerhard Breipohl
Original Assignee
Hoechst Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Ag filed Critical Hoechst Ag
Publication of FI20051072L publication Critical patent/FI20051072L/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI117939B publication Critical patent/FI117939B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/595—Polyamides, e.g. nylon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C07K14/003—Peptide-nucleic acids (PNAs)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Polyamides (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

x 117939
Polyamidi-oligonukleotidijohdoksia, niiden valmistus ja niiden käyttö Tämä keksintö koskee uusia polyamidi-oligonukleoti-5 dijohdoksia, joilla on arvokkaita fysikaalisia, biologisia ja farmakologisia ominaisuuksia. Niitä käytetään geenien ilmentymisen inhibiittoreina [antisense-oligonukleotidit, ribotsyymit, koodittavat (sense-) oligonukleotidit ja kol-moisssäikeen muodostavat oligonukleotidit], koettimina 10 nukleiinihappojen detektoimiseksi ja apuaineina molekyylibiologiassa .
Oligonukleotideilla on lisääntyvässä määrin käyttöä geenien ilmentymisen inhibiittoreina [G. Zon, Pharmaceutical Research 5 (1988) 539; J. S. Cohen, Topics in Molecu-15 lar and Structural Biology 1989, 12 (Macmillan Press); C.
Helene ja J. J. Toulme, Biochemica et Biophysica Acta 1049 (1990) 99; E. Uhlmann ja A. Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543]. Antisense-oligonukleotidit ovat nukleiinihap-pofragmentteja, joiden emässekvenssi on komplementaarinen 20 inhiboitavan mRNA:n suhteen. Kyseiset kohde-mRNA:t voivat olla solu- tai virusperäisiä tai peräisin muusta patogee-. . nisesta lähteestä. Sellulaarisina kohdesekvensseinä tule- φ 1 « • 1f .1 ' vat kysymykseen esimerkiksi reseptorien, soluadheesiopro- * · teiinien, entsyymien, immuunimodulaattoreiden, sytokiini- • · *··.1 25 en, kasvutekijöiden, ionikanavien tai onkogeenien sekvens- "2: sit. Virusten lisääntymisen inhibointia antisense-oligo- « 1 · nukleotidien avulla esimerkiksi HBV:n (hepatiitti B -vi- ruksen), HSV-l:n ja HSV-2:n (herpes simplex -virustyyppien I ja II), HIV:n (ihmisen immuunikatoviruksen) ja influens- 30 savirusten tapauksessa on kuvattu. Tällöin käytetään oli- .2·. gonukleotideja, jotka ovat komplementaarisia viruksen nuk- • · leiinihapon suhteen. Koodittavat nukleotidit sitä vastoin • · · 2 ” ovat sekvenssiltään sellaisia, että ne esimerkiksi sitovat > • · · ·...· ("sieppaavat") nukleiinihappoihin sitoutuvia proteiineja .1ί1. 35 tai nukleiinihappoja prosessoivia entsyymejä ja vähentävät • 1 · • · • · **♦ 2 117939 siten niiden biologista aktiivisuutta [C. Helene ja J. J. Toulme, Biochemica et Biophysica Acta 1049 (1990) 99].
Viruskohteina voidaan tässä yhteydessä mainita esimerkiksi käänteiskopioijaentsyymi, DNA-polymeraasi ja transakti-5 vaattoriproteiinit. Kolmoissäikeen muodostavien oligonuk-leotidien kohteena on yleensä DNA, ja siihen sitoutumisensa jälkeen ne muodostavat kolmoiskierrerakenteen. Samalla kun antisense-oligonukleotidien avulla yleensä estetään mRNA:n prosessointi (silmukointi) tai sen translaatio pro-10 teiiniksi, kolmoisssäikeen muodostavat oligonukleotidit inhiboivat DNA:n transkriptiota tai replikaatiota [C. Helene ja J. J. Toulme, Biochemica et Biophysica Acta 1049 (1990) 99 - 125; E, Uhlmann ja A. Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543], On kuitenkin myös mahdollista sitoa yksi-15 säikeisiä nukleiinihappoja ensimmäisessä hybridisoinnissa yhteen antisense-oligonukleotidin kanssa, jolloin muodostuu kaksoissäie, joka sitten toisessa hybridisoinnissa muodostaa kolmoisssäikeen muodostavan oligonukleotidin kanssa kolmisäikeisen rakenteen. Antisense-alue ja kol-20 moissäikeenmuodostusalue voivat tällöin sijaita joko kahdessa eri oligonukleotidissa tai samassa oligonukleotidis- j sa. Yksi synteettisten oligonukleotidien lisäsovellus ovat ♦ *♦ ;·φ ns. ribotsyymit, jotka ribonukleaasiaktiivisuutensa joh- • · ♦ dosta tuhoavat kohde-RNA:n [J. J. Rossi ja N. Sarver, **'. 25 TIBTECH 8 (1990) 179; Castanetto et ai., Critical Rev.
Eukar. Gene Expr. 2 (1992) 331].
• * * ϊ·: : Keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää hoi- • · · ·...* dossa myös aptameerimielessä. Aptameerit ovat oligomeeri- sia nukleiinihappoja tai niiden analogeja, jotka sitoutu- j ·., 30 vat suurella affiniteetilla proteiineihin. Aptameerien :***; paikallistaminen tapahtuu in vitro valikoimalla satunnais- • « * t.* . seoksesta [Famulok ja Szostak, Angew. Chem. 104 (1992) Φ · · 1001 - 1011] ja on toteutettu menestyksellisesti trombii- • · *·;·* niin sitoutuvan aptameerin tapauksessa [Bock et ai., 35 Nature 355 (1992) 564 - 566]. Tällöin menetellään siten, • · · • · • · • * * ' 3 117939 että aptameerin emässekvenssi määritetään seulomalla oli-gonukleotidiseos ja kyseinen emässekvenssi siirretään sitten polyamidi-oligonukleotidianalogeihin. Toinen mahdollisuus on koodittaa aptameerin sitoutuva alue identifioinnin 5 helpottamiseksi erillisellä sitoutumattomalla molekyylin osalla [Brenner ja Lerner, PNAS 89 (1992) 5381 - 5383].
DNA-diagnostiikassa käytetään sopivalla tavalla leimattuja nukleiinihappofragmentteja ns. DNA-koettimina, joiden on tarkoitus hybridisoitua spesifisesti detektoita-10 vaan nukleiinihappoon. Uuden kaksoissäikeen spesifistä muodostamista seurataan tällöin leimauksen avulla, joka edullisesti ei ole radioaktiivinen. Tällä tavalla on mahdollista todeta geneettisiä, pahanlaatuisia, virusten tai muiden patogeenien aiheuttamia sairauksia.
15 Luonnossa esiintyvässä muodossaan oligonukleotidit soveltuvat melko huonosti tai ovat täysin sopimattomia useimpiin mainituista sovelluksista. Niinpä niitä täytyy muuntaa kemiallisesti, jotta ne täyttävät määrätyt vaatimukset. Jotta oligonukleotideja voidaan käyttää biologi-20 sissa systeemeissä, esimerkiksi virusten lisääntymisen inhibointiin, niiden on täytettävä seuraavat vaatimukset: .*. : 1. Niillä täytyy olla in vivo, siis sekä seerumissa # · · ;·, * että solujen sisällä, riittävän suuri stabiilisuus.
• ·· 2. Niiden täytyy olla sellaisia, että ne kykenevät 25 läpäisemään solu- ja tumakalvon läpi.
3. Niiden täytyy sitoutua fysiologisissa olosuh- * ♦ · ϊ·ί · teissä emässpesifisesti kohdenukleiinihappoonsa, jotta • « · *...* niillä on inhibitorinen vaikutus.
DNA-koettimien tapauksessa kohdat 1-3 eivät ole : 30 vaatimuksena; kyseisten oligonukleotidien täytyy kuitenkin :***: olla sillä tavalla muunnettuja, että detektointi esimer- «·« . kiksi fluoresenssin tai kemilurninesenssin, kolorimetrises- * · « ' • · · *..* ti tai spesifisen värin perusteella on mahdollista [Beck • · *···* ja Köster, Anal. Chem. 62 (1990) 2258]. Oligonukleotidien 35 kemiallinen muuntaminen tapahtuu useimmiten niin, että • · · * ♦ • · »·· ,.. 4 1 1 7939 fosfaattirunkoa, riboosiyksikköä tai nukleosidiemästä muutetaan vastaavasti [J. S. Cohen, Topics in Molecular and Structural Biology 1989, 12 (Macmillan Press); E. Uhlmann ja A. Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543]. Toinen 5 usein käytetty menetelmä on valmistaa oligonukleotidi-5'-konjugaatteja antamalla 5'-asemassa sijaitsevan hydroksyy-liryhmän reagoida sopivien fosforylointireagenssien kanssa. Jos sitä vastoin muunnetaan kaikki nukleotidien väliset fosfaattiryhmät, oligonukleotidien ominaisuudet muut-10 tuvat usein jyrkästi. Esimerkiksi metyylifosfonaattien liukoisuus vettä sisältävään väliaineeseen pienenee voimakkaasti, kun taas oligonukleotideilla, joissa kaikki mainitut ryhmät on muunnettu tiofosfaateiksi, ei useinkaan ole sekvenssispesifistä vaikutusta.
15 Hiljattain on kuvattu polyamidinukleiinihappojoh doksia [Michael Egholm, Peter E. Nielsen, Rolf H. Berg ja Ole Buchardt, Science 254 (1991) 1497 - 1500; julkaisu W0 92/20 702; M. Egholm et ai., Nature 365 (1993) 566 - 568, P. Nielsen, Bioconjugate Chem 5 (1994) 3-7], jotka si- 20 toutuvat luonnollisina oligonukleotideina suurella affiniteetilla komplementaarisiin kohdesekvensseihin (DNA- tai : RNA-sekvensseihin) . Nämä ns. peptidi- tai polyamidinukle- • · · ' iinihapot (PNA) ovat DNA:n kanssa analogisia yhdisteitä,
• M
joissa deoksiriboosi-fosfaattirunko on korvattu polyamidi-25 oligomeerilla. Näillä yhdisteillä on luonnollisiin oligo-nukleotideihin verrattuina se etu, että ne ovat erittäin • · • 1 1 •1J · stabiileja seerumissa. Toisaalta niillä on kuitenkin seu- • « · raavia haitallisia ominaisuuksia: (1) Solut eivät ota niitä lainkaan vastaan tai ot- 30 tavat niitä vastaan vain määrinä, joita ei kyetä detektoi- :2 3’· maan. Koska antisense-oligonukleotidit ja kolmoissäikeen • · · .1 . muodostavat oligonukleotidit kykenevät kuitenkin olemaan • 1 1 • 1 1 *.,· aktiivisia ainoastaan solussa, PNA:t sellaisinaan eivät • · *·”1 sovellu geenien ilmentymisen inhibointiin in vivo.
«M • · · • · · · 2 • 1 3 117939 5 (2) PNA:illa on taipumus aggregoitua vettä sisältävässä liuoksessa, siis myös fysiologisissa olosuhteissa. Sen vuoksi ne liukenevat huonosti vettä sisältäviin puskuriliuoksiin eivätkä ole käytettävissä komplementaarisiin 5 sekvensseihin hybridisointiin.
(3) Lisäksi PNA:illa on suuri affiniteetti erilaisiin materiaaleihin, kuten SephadexR (Pharmacia-yhtiö) ja Bond ElutR (Varian-yhtiö) -tuotteisiin, joita voidaan käyttää oligomeerien puhdistuksessa, joten PNA:t ovat usein 10 vain huonoin saannoin eristettävissä.
(4) Yksi PNA:iden vakava lisäpuute on se, että ne eivät sitoudu komplementaarisiin nukleiinihappoihin yksiselitteisesti orientoituneina. Sen vuoksi sekvenssispesi-fisyys luonnollisten oligonukleotidien suhteen on pienen- 15 tynyt. Kun luonnolliset nukleiinihapot hybridisoituvat komplementaarisiin nukleiinihappoihin yleensä antiparal-leelisti orientoituneina, voivat PNA:t sitoutua sekä anti-paralleelisti että paralleelisti orientoituneina.
(5) Julkaisussa WO 92/20 702 on mainittu oligonuk-20 leotidi-PNA-konjugaatti (T) 7(5'-L-N) (t) 6-Ala (kuvio 25, korvaava sivu), jossa (T)7 tarkoittaa heptatymidylaattioli- ; gonukleotidia, joka on sitoutunut 5' -O-fosfaattiryhmänsä • «· ' ja 4-hydroksivoihapon (L) kautta PNA-heksatymidylaatin (t)7 • ·* ja alaniinin (Ala) primaariseen funktionaaliseen aminoryh- • * ***\ 25 mään (N) . Siinä ei ole kuvattu kyseisen yhdisteen syntee- «·*«· siä eikä mitään sen ominaisuuksia.
* · : (6) PNAiilla on soluviljelykokeissa pitoisuuksina, • · jotka ovat mikromoolien luokkaa litraa kohden, voimakkaasti sytotoksisia ominaisuuksia.
30 Emäspariutuvien nukleiinihapposäikeiden orientoitu- :**· minen määritellään seuraavasti [vrt. Egholm et ai., Nature / . 365 (1993) 566 - 568]: • · · • *« * * A) * · · · • · 5?----------3' DNA ap-kaksoissäie (ap = antiparalleeli) 35 3'----------5' DNA ’ • ♦ · • · · • ·♦ • · ··♦ 117939 6 B) 5'----------3' DNA p-kaksoissäie (p = paralleeli)
5’----------3' DNA
C) : ' 5 5'----------3' DNA ap-kaksoissäie (DNA.PNA)
C-----------n PNA
D) :' 5'----------3' DNA p-kaksoissäie (DNA.PNA)
N-----------.Q PNA
10 E) C----------N PNA 1 i .
5'----------3' DNA (Pu) ap.ap-kolmoissäie (DNA.DNA.PNA) 3'----------5' DNA (Pu = runsaspuriininen säie) F)
15 N----------C PNA
5'----------3' DNA (Pu) ap.p-kolmoissäie (DNA.DNA.PNA)
3'----------5' DNA
G)
N----------C PNA
20 5'----------3' DNA (Pu) ap.p-kolmoissäie (PNA.DNA.PNA)
C----------N PNA
H)
C----------N PNA
5'----------3* dna (Pu) ap-ap-kolmoissäie (PNA.DNA.PNA)
2 5 C----------N PNA
• · I) • · »
,* * N----------C PNA
• · : ·· 5’----------3' DNA (Pu) p.p-kolmoissäie (PNA.DNA.PNA)
N----------c PNA
30 K) • ·
. . C----------N PNA
• * · ••i ί 5'—--------3' DNA (Pu) p.ap-kolmoissäie (PNA.DNA.PNA)
: n----------c PNA
• · · joissa :·. 35 5' tarkoittaa oligonukleotidin 5'-päätä, * .···. ,3' tarkoittaa oligonukleotidin 3'-päätä, • * [·* N tarkoittaa PNA:n aminopäätä ja *. *: C tarkoittaa PNA:n karboksyylipäätä.
Tapaukset A - D ovat esimerkkejä antisense-oligo- t*|»f 40 meerien periaatteessa mahdollisista orientoitumistavoista.
• * ·
Tapaukset E - F kuvaavat mahdollisuuksia muodostaa koi- « « • « • ·· 7 1 1 7939 moissäie yksi- tai kaksisäikeisten nukleiinihappojen kanssa. Kaksi yksinkertaista PNA- tai DNA-säiettä voi tällöin olla kytkeytyneinä toisiinsa. Esimerkiksi tapauksessa E PNA:n N-pää on kytkeytynyt DNA:n 5'-päähän ja tapauksessa 5 F PNA:n C-pää on kytkeytynyt DNA:n 5'-päähän.
Tämän keksinnön päämääränä oli sen vuoksi saada aikaan polyamidi-oligonukleotidijohdoksia, joilla ei ole edellä mainittuja puutteita.
Keksintö koskee polyamidi-oligonukleotidijohdoksia, 10 joilla on kaava Ib / r---CHj-CHf-N —H j C C (0·),---( L 1 i ) ill * 0 · C 0 * r '- (Mu )„-- V * L 1 • * ·
»M
•f v • ·· -1 r -t ^ .··. (LI,)· CHj-CHj-N —HjC “ C- (0’)„---(tt ,) • : i n ’*·. o-c o ** ·:**; i J- iHl b-Q (Ib) : s B^<> -(«u)„—--f- «· ·
-ifL- J q J
/' * :·. 15 • ·· * .·*·. jolle on tunnusomaista, että • · ’** x tarkoittaa lukua 1 ja • « *. *: q = r = ljas = t = 0 tai ··· r = s = 1 ja q = t = 0 tai 20 q = r = s = ljat = 0; ·»« • · * · 117939 8 R2 tarkoittaa vetyä, hydroksyyliryhmää, Ci-is-alkok-syyliryhmää, halogeenia tai atsido- tai aminoryhmää; kukin B tarkoittaa, muista riippumattomasti, nuk-leotidikemiassa tavanomaista emästä; 5 aaltosulku tarkoittaa sitä, että R2 ja viereinen substituentti voivat sijaita 2'~ ja 3'-asemassa tai myös päinvastoin 3'- ja 2'-asemassa; jolloin polyamidirakenne sisältää vähintään yhden nukleosidiemäksen, joka on muu kuin tyrniini; 10 Nu tarkoittaa ryhmää, jolla on kaava (Ha) tai (Hb) , 51 '5'
/°V-B z°V-B
K w R2 R2 Y y U-P -V - u-P -V —'—
Il II
.·. : w w * «» lf • · · 117939 9 R4 tarkoittaa Ci-ie-alkyyliryhmää tai R3 ja R4 muodostavat yhdessä sen typpiatomin kanssa, johon ne ovat sitoutuneet, 5- tai 6-jäsenisen heterosykli-sen renkaan, joka voi lisäksi sisältää toisenkin hetero-5 atomin, joka voi olla 0, S tai N; V tarkoittaa oksi-, sulfanidyyli- tai iminoryhmää; W tarkoittaa okso- tai tioksoryhmää; ja Y tarkoittaa oksi-, sulfanidyyli-, metyleeni- tai iminoryhmää; 10 m · 0 - 20; o=0- 20; ' D' tarkoittaa ryhmää, jolla on kaava (IV), — N — CHj-CH5-N — H2C — C - h I n I o 0 - C (IV) ch2
B
.·. : 15 • · · * · ;·. jossa B on edellä esitetyn määritelmän mukainen; • ·* ,···, n =0 — 20; ’"*! p - 0 - 20; . . Li3 ja Li4 tarkoittavat kukin, toisistaan riippu- • * * ♦·* · 20 mattomasti, kaavan (V) mukaista rakennetta, «·· ' ' ' · . .
• · • » • · · [(V)-(G)-(G')]e (V) ·· • · ♦ ·· * ♦ ·· ί ί jossa · 25 ε on 1 - 5; • · · kukin V tarkoittaa, muista riippumattomasti, hap- • · T pea, NH-ryhmää, sidosta tai ryhmää, jolla on kaava (VI), ·φ· • * * • · · * ··· • * »·*
: I
117939 ίο u -Y-P -V - (VI)
II
w jossa U, V, W ja Y ovat edellä esitettyjen määritelmien mukaisia; 5 kukin G tarkoittaa, muista riippumattomasti, C1-12- alkaanidiyyliryhmää, joka voi haluttaessa olla substituoi-tu halogeenilla, aminoryhmällä, hydroksyyliryhmällä, Ci-ie-alkyyliryhmällä, Ci-is-alkoksyyliryhmällä, Ce-u-aryyliryh-mällä tai Cs-i4-aryyli-Ci-i8-alkyyliryhmällä; C6-i4-aryylidi-10 Ci-12-alkaanidiyyliryhmää tai ryhmää, jonka kaava on (CH2CH20) 5CH2CH2, jossa 6 voi olla 1 - 11, tai sidosta; ja G' tarkoittaa oksi-, sulfanidyyli- tai iminoryhmää, ryhmää -C(O)- tai -C(0)NH-, sidosta tai kaavan (VI) mukaista ryhmää, jossa U, V, W ja Y ovat edellä esitettyjen 15 määritelmien mukaisia; F ja F' ovat kytkeytyneet yhteen sidoksen välityksellä ja/tai • * F tarkoittaa ryhmää R°-(A)k-V- ja ; *·· F' tarkoittaa kaavassa (Ib) ryhmää V1-(A)i-R1, jossa •t4>: 20 R° tarkoittaa vetyä, Ci-ie-alkanoyyli-, Ci-ig-alkoksi- *:*·; karbonyyli-, C3-s-sykloalkanoyyli-, C7-is-aroyyli- tai C3-13- j heteroaroyyliryhmää tai ryhmää, joka edistää oligomeerin »«· · ,*··. soluunottoa tai toimii DNA-koettimen leimausryhmänä tai hybridisoitaessa oligomeeri kohdenukleiinihappoon tarttuu 25 viimeksi mainittuun niin, että tapahtuu sitoutuminen, sil-
loittuminen tai pilkkoutuminen; tai k:n ollessa nolla R
• 1 *;· on vety tai muodostaa yhdessä V:n kanssa ryhmän, jolla on :\j kaava (VII), , • · · » · • · • · · ···..
I · · • · · *·· • · • · ···
V
117939 11 Z-P -Z · ( V II )
II
w jossa Z ja Z' tarkoittavat toisistaan riippumattomasti hydroksyyliryhmää, merkaptoryhmää, Ci-22-alkoksyyli-5 ryhmää, Ci-ig-alkyyliryhmää, C6-2o-aryyliryhmää, C6-i4~aryyli-Ci-is-alkyyliryhmää, Ci-22-alkyylitioryhmää, ryhmää NHR3 tai NR3R4 tai ryhmää, joka edistää oligomeerin soluunottoa tai toimii DNA-koettimen leimausryhmänä tai hybridisoitaessa oligomeeri kohdenukleiinihappoon tarttuu viimeksi mainit-10 tuun niin, että tapahtuu sitoutuminen, silloittuminen tai pilkkoutuminen; ja R3, R4, V ja W ovat edellä esitettyjen määritelmien mukaisia; R1 tarkoittaa vetyä tai ryhmää Q°, jolloin R1 on ve-15 ty ainoastaan silloin, kun samanaikaisesti 1 = 0 ja kaavassa (Ib) q = 1 tai q = r = 0 ja ryhmässä F' = V1-(A)1-R1 V1 on ryhmä V; :\j A tarkoittaa luonnon tai luonnossa esiintymätöntä ·1·,, aminohappoa; • 20 Q° tarkoittaa hydroksyyliryhmää tai ryhmää OR', NH2 • · · tai NHR'', joissa • · • S' R' tarkoittaa Ci-is-alkyyliryhmää ja • · · "!.1 R' ' tarkoittaa Ci-is-alkyyliryhmää, Ci-is-aminoalkyy- **** liryhmää tai Ci_i8-hydroksialkyyliryhmää; ' 25 V on edellä esitetyn määritelmän mukainen; ja : 2 V1 tarkoittaa sidosta tai ryhmää V, jolloin vain • · · sellaisessa kaavassa (Ib), jossa q = 0 ja r = 1, V1 on ai- : na sidos; * 1 .···. k on 0 - 10 ja "2 30 . . 1 on 0 - 10; • · · sillä edellytyksellä, että 2 * ·· • · • 1 »t· 117939 12 a) jos kaavan (Ib) mukaisessa yhdisteessä t = 0 ja s = 1, niin L13 on sidos; ja b) jos kaavan (Ib) mukaisessa yhdisteessä s = t = 0, niin Li4 on sidos; 5 jolloin kullakin nukleotidilla voi olla D- tai L- konfiguraatio ja emäs voi esiintyä a- tai β-asemassa.
Edellä olevassa kaavassa Ib: R2 tarkoittaa vetyä, hydroksyyliryhmää, Ci-i8-alkok-syyliryhmää, edullisesti Ci-6-alkoksyyliryhmää, halogeenia, 10 kuten F:a tai Cl:a, edullisesti F;a, tai atsido- tai ami-noryhmää; kukin B tarkoittaa, muista riippumattomasti, nukleo-tidikemiassa tavanomaista emästä, esimerkiksi luonnollista emästä, kuten adeniinia, sytosiinia, tymiiniä, guaniinia, 15 urasiilia tai inosiinia, tai luonnossa esiintymätöntä emästä, kuten puriinia, 2,6-diaminopuriinia, 7-deatsaade-niinia, 7-deatsaguaniinia, N4N4-etanosytosiinia, N6N6-etano-2,6-diaminopuriinia, pseudoisosytosiinia, 5-metyylisytosii-nia, 5-fluoriurasiilia, 5-(C3-6_alkynyyli)urasiilia tai 5-20 (C3-6-alkynyyli)sytosiinia, tai niiden lääke-esiastemuotoa; U tarkoittaa hydroksyyliryhmää, merkaptoryhmää, j\i Ci-i8-alkyyliryhmää, edullisesti Ci-8-alkyyliryhmää, Ci-is- • · :*, alkoksyyliryhmää, edullisesti Ci-8-alkoksyyliryhmää, C6-20"· • ·« .···. aryyliryhmää, edullisesti C6-i2-aryyliryhmää, C6-i4~aryyli- • · 25 Ci-8-alkyyliryhmää, edullisesti C6-aryyli-Ci-4_alkyyliryhmää, , . tai ryhmää NHR3 tai NR3R4; • » 1 R3 tarkoittaa Ci-is-alkyyliryhmää tai Ci-4-alkoksi- • * *···’ Ci-4-alkyyliryhmää, edullisesti Ci-s-alkyyli- tai Ci-4-alkok- si-Ci-4-alkyyliryhmää ja erityisen edullisesti Ci-4-alkyyli- ·♦ • *·· 30 tai metoksietyyliryhmää ja
*♦· A
ί.φφϊ R tarkoittaa Ci-i8-alkyyliryhmää, edullisesti Ci-8- ,·[ : alkyyliryhmää ja erityisen edullisesti Ci-4-alkyyliryhmää • ·· tai ♦ · • · ' .¾ Λ *1* R ja R muodostavat yhdessä sen typpiatomin kanssa, ··» ·.♦ * 35 johon ne ovat sitoutuneet, 5- tai 6-jäsenisen heterosykli- ··· • · • · . 1 1 7939 13 sen renkaan, joka voi lisäksi sisältää toisenkin hetero-atomin, joka voi olla O, S tai N, kuten esimerkiksi mor-foliinirenkaan; ε on 1 - 5, edullisesti 1-2; 5 kukin G tarkoittaa, muista riippumattomasti, C1-12- alkaanidiyyliryhmää, edullisesti Ci-6-alkaanidiyyliryhmää, joka alkaanidiyyliryhmä voi haluttaessa olla halogeenilla, edullisesti F:11a tai Cl :11a, aminoryhmällä, hydroksyyli-ryhmällä, Ci-ie-alkyyliryhmällä, edullisesti Ci-s-alkyyliryh- 10 mällä, Ci-is-alkoksyyliryhmällä, edullisesti Ci-6-alkoksyyli- ryhmällä, Cg-u-aryyliryhmällä, edullisesti Ce-aryy li ryhmällä, tai C6-i4-aryyli-Ci-i8-alkyyliryhmällä, edullisesti C6-aryyli-Ci-4-alkyyliryhmällä, substituoitu; Ce-i4-aryylidi-Ci-12-alkaanidiyyliryhmää, edullisesti C6-aryyli-Ci_4-alkaani- 15 diyyliryhmää, tai ryhmää, jonka kaava on (CH2CH2O) jossa δ voi olla 1 - 11, edullisesti 1-7, tai sidosta; ja F ja F' ovat kytkeytyneet yhteen sidoksen välityksellä (sykliset yhdisteet); 20 R° tarkoittaa vetyä, Cii8-alkanoyyliryhmää, edulli sesti Ce-ie-alkanoyyliryhmää, Ci-is-alkoksikarbonyyli-, C3-8-sykloalkanoyyli-, C7-i5-aroyyli- tai C3-i3-heteroaroyyliryh- • · j*.## mää tai ryhmää, joka edistää oligomeerin soluunottoa tai * .···, toimii DNA-koettimen leimaus ryhmänä tai hybridisoitaessa • · 25 oligomeeri kohdenukleiinihappoon tarttuu viimeksi mainit- * · . . tuun niin, että tapahtuu sitoutuminen, silloittuminen tai • · ·
* · « Q
pilkkoutuminen; tai k:n ollessa nolla R on vety tai muo- • · *···* dostaa yhdessä V:n kanssa ryhmän, jolla on kaava VII, • ·
: *·· V
o 1 : : 2-P-Z * (VII)
ö II
3o w ····' • · · * · · * · ··· 117939 14 jossa Z ja Z' tarkoittavat toisistaan riippumattomasti hydroksyyliryhmää, merkaptoryhmää, Ci-22-alkoksyyliryhmää, edullisesti Ci2-i8_alkoksyyliryhmää, Ci-ie-alkyyliryhmää, edullisesti C^-is-alkyyliryhmää, C6-2o-aryyliryhmää, edulli-5 sesti Ce-ie-aryyliryhmää, C6-i4-aryyli-Ci-i8-alkyyliryhmää, edullisesti C6-aryyli-Ci-4-alkyyliryhmää, Ci-22-alkyylitioryh-mää, edullisesti Ci2-i8-alkyylitioryhmää, ryhmää NHR3 tai NR3r4 tai ryhmää, joka edistää oligomeerin soluunottoa tai toimii DNA-koettimen leimausryhmänä tai hybridisoitaessa 10 oligomeeri kohdenukleiinihappoon tarttuu viimeksi mainittuun niin, että tapahtuu sitoutuminen, siHoituminen tai pilkkoutuminen; ja A tarkoittaa luonnon tai luonnossa esiintymättömästä aminohaposta, edullisesti glysiinistä, leusiinista, 15 histidiinistä, fenyylialaniinista, kysteiinistä, lysiinis- tä, arginiinista, asparagiinihaposta, glutamiinihaposta, proliinista, tetrahydroisokinoliini-3-karboksyylihaposta, oktahydroindoli-2-karboksyylihaposta tai N-(2-aminoetyy-li)glysiinistä, peräisin olevaa ryhmää; 20 R1 tarkoittaa Ci-ia-alkyyliryhmää, edullisesti
Ci2-i8-alkyyliryhmää; ja ;**.» R' ' tarkoittaa Ci-ig-alkyyliryhmää, edullisesti • ·
Ci2-i8~alkyyliryhmää, Ci-ie-aminoalkyyliryhmää, edullisesti • · · .···, Ci2-i8~aminoalkyyliryhmää, tai Ci-is-hydroksialkyyli ryhmää, • * 25 edullisesti Ci2-i8-hydroksialkyyliryhmää.
• · , . Erityisen edullisia ovat sellaiset kaavojen Ia ja • · ·
Ib mukaiset yhdisteet, joissa sokerissa esiintyy β-asemas- * · *···* sa emäs.
Edullisia ovat varsinkin oligomeerit, joilla on • ♦ • *·· 30 kaava Ib, jossa V , V, Y ja W tarkoittavat kukin tio-, ok- • · * si-, okso- tai hydroksyyliryhmää; aivan erityisen edulli- .·* ; siä ne ovat, jos R2 on lisäksi vety.
• · ·
Edullisia ovat erityisesti myös kaavan Ib mukaiset * · "* oligomeerit, joissa ε = 1 ja ·'· * 35 L14 on * · · • · • · » 15 117939 a) ryhmä, jolla on kaava V, jossa V on happi, tai kaavan VI mukainen ryhmä, G on Ci-io-alkyleeniryhmä ja G' on ryhmä -CONH-; tai b) ryhmä, jolla on kaava V, jossa G ja V ovat si-5 doksia ja G' on kaavan VI mukainen ryhmä, jossa edullisesti U, V, W ja Y ovat happiatomeja tai U, W ja Y ovat happiatomeja ja V on iminoryhmä;
Li3 on a) ryhmä, jolla on kaava V, jossa V on iminoryhmä, 10 G on Ci-io-alkyleeniryhmä ja G' on kaavan VI mukainen ryhmä: b) ryhmä, jolla on kaava V, jossa V on iminoryhmä ja G ja G' ovat sidoksia; tai c) ryhmä, jolla on kaava V, jossa V on iminoryhmä, 15 G on Ci-io-alkyleeniryhmä ja G' on kaavan VI mukainen ryhmä, jossa edullisesti U, V, W ja Y ovat happiatomeja.
Aivan erityisen edullisia ovat oligomeerit, joilla on kaava Ib, joissa V, V, Y ja W tarkoittavat kukin tio-, oksi-, okso- tai hydroksyyliryhmää, R2 on vety.
20 Lisäksi edullisia ovat oligomeerit, joilla on kaava
Ib, joissa V, V, Y ja W tarkoittavat kukin tio-, oksi-, ·*·,· okso- tai hydroksyyli ryhmää, R2 on vety.
• · $·. Lisäksi edullisia ovat oligomeerit, joilla on kaava .···, ib, joissa aaltosulku tarkoittaa, että R2 sijaitsee 3'- * i ’”m· 25 asemassa (ks. kaava Hb) . Edullinen emäs on tällöin ade- • · . , niini.
• · »
Keksintö ei rajoitu a- ja β-D- tai a- tai β-L-ribo- • · *···* furanosidiin, a- ja β-D- tai a- tai β-L-deoksiribofurano- sidiin ja vastaaviin viisijäsenisen renkaan karbosyklisiin • · : *·* 30 analogeihin, vaan koskee myös oligonukleotidien kanssa • · ί.,.ϊ analogisia yhdisteitä, jotka ovat muodostuneet muista so- ,·. ; keriyksiköistä, esimerkiksi suurempirenkaisista tai pie- • · I./ nempirenkaisista sokereista tai asyklisistä, renkaiden • * *" välissä siltaryhmän sisältävistä tai muunlaisista sopivis- • · *
·.· ♦ 35 ta sokeri johdoksista. Lisäksi keksintö ei rajoitu kaavan I
♦ ·· • · • · »·· 117939 16 yhteydessä esimerkkeinä esitettyihin fosfaattiryhmiin, vaan koskee myös tunnettuja defosfojohdoksia.
Oligonukleotidiosa (DNA kaavassa I) voi siis olla monin tavoin luonnossa esiintyvistä rakenteista poikkea-5 via. Sellaisia muunnoksia, joita voidaan tehdä sinänsä tunnetuin menetelmin, ovat esimerkiksi seuraavat: a) Fosfaattisillan muunnokset
Esimerkkeinä mainittakoon tiofosfaatit (fosforotio-aatit), ditiofosfaatit (fosforoditioaatit), metyylifosfo-10 naatit, fosforiamidaatit, boranofosfaatit, fosfaattimetyy-liesterit, fosfaattietyyliesterit ja fenyylifosfonaatit. Edullisia muunnelmia fosfaattisillasta ovat tiofosfaatit, ditiofosfaatit ja metyylifosfonaatit.
b) Fosfaattisillan korvaus 15 Esimerkkeinä mainittakoon korvaus formaldehydiase- taalilla, 3'-tioformaldehydiasetaalilla, metyylihydroksyy-liamiinilla, oksiimilla, metyleenidimetyylihydratsoryhmäl-lä, dimetyylisulfonilla tai silyyliryhmillä. Edullista on korvaaminen formaldehydiasetaaleilla ja 3'-tioformaldehy-20 diasetaaleilla.
c) Sokerin muunnokset ;*·,· Esimerkkeinä mainittakoon a-anomeeriset sokerit, • \t 2 '-O-metyyliriboosi, 2 ' -O-butyylirihoosi, 2 ' -O-allyyliri- .···, boosi, 2'-fluori-2'-deoksiriboosi, 2 ' -amino-2 ' -deoksiri- • · 25 boosi, α-arabinofuranoosi ja sokerien kanssa analogiset « · . . karbosykliset yhdisteet. Edullisia muunnoksia ovat 2'-O- • t · *’·.* metyyliriboosilla ja 2 '-O-n-butyyliriboosilla tehtävät.
• * ***** d) Sellaiset emästen muunnokset, jotka eivät muuta
Watsonin-Crickin emäspariutumisen spesifisyyttä ·· : ’·· 30 Esimerkkeinä mainittakoon 5-propynyyli-2'-deoksi- ··· ϊ..β! uridiini, 5-propynyyli-2' -deoksisytidiini, 5-heksynyyli- ; 2' -deoksiuridiini, 5-heksynyyli-2' -deoksisytidiini, 5- • · · 1··\ fluori-2 '-deoksisytidiini, 5-fluori-2 ' -deoksiuridiini, 5- • · Ί* hydroksimetyyli-2'-deoksiuridiini, 5-metyyli-2'-deoksisy- ♦ ·* *.: * 35 tidiini ja 5-bromi-2'-deoksisytidiini. Edullisia muunnok- • · · ϊιβ#ϊ siä ovat 5-propynyyli-2 ' -deoksiuridiini, 5-heksynyyli-2 ' - 117939 17 deoksiuridiini, 5-heksynyyli-2'-deoksisytidiini ja 5-pro- pynyyli-2'-deoksisytidiini.
e) 3'—3’— ja 5'-5'-inversiot [esim. m. Koga et ai., J. Org. Chem. 56 (1991) 3757] 5 f) 5'- ja 3'-fosfaatit samoin kuin 5'- ja 3'-tio- fosfaat.it
Esimerkkejä ryhmistä, jotka edistävät soluunottoa, ovat erilaiset lipofiiliset ryhmät, kuten -O- (CH2>x-CH3, jossa x tarkoittaa kokonaislukua 6 - 18, -O- (CH2)n-CH=CH- 10 (CH2)m-CH3, jossa n ja m tarkoittavat toisistaan riippumattomasti kokonaislukua 6-12, -0- (CH2CH2O) 4- (CH2) 9-CH3, -0-(CH2CH20)8-(CH2)i3-CH3 ja -O- (CH2CH20) 7- (CH2) 15-CH3 mutta myös steroidiryhmät, kuten ko1esteryyliryhmä, ja vitamii-niryhmät, kuten vitamiini E, vitamiini A ja vitamiini D, 15 ja muut konjugaatit, jotka käyttävät hyväksi luonnossa esiintyviä kantajasysteemejä, kuten gallushappo, foolihap-po, 2-(N-alkyyli, N-alkoksi)aminoantrakinoni, sekä mannoo-sin konjugaatit ja sopivien reseptorien peptidit, jotka johtavat oligonukleotidien reseptorivälitteiseen endosy-20 toosiin, kuten EGF (epidermaalinen kasvutekijä), brady-kiniini ja PDGF (verihiutaleperäinen kasvutekijä). Lei- ·1·.· mausryhmillä tarkoitetaan fluoresoivia ryhmiä, esimerkiksi • · dansyyli- [1-(dimetyyliamino)naftyyli-5-sulfonyyli-], fluo-.·2 3. reseiini- ja kumariini johdoksia, tai esimerkiksi akri- aa 25 diinijohdosten kerniluminesoivia ryhmiä sekä ELISA: 11a de- • 1 . . tektoitavissa olevaa digoksigeniinisysteemiä, biotiini- * a a "·/ avidiinisysteemin välityksellä detektoitavissa olevaa bio- * a *···1 tiiniryhmää tai kytkentäryhmiä, jotka sisältävät sellaisia funktionaalisia ryhmiä, jotka mahdollistavat myöhemmin a1 : 1·· 30 tapahtuvan muuntamisen detektoitavissa olevilla ilmaisin- ·»· ί###ϊ ryhmillä, esimerkiksi aminoalkyylikytkentäryhmää, joka muun- .·) : netaan aktiivisella akridiniumesterillä kemiluminesenssi- * »· koettimeksi. Tyypillisiä leimausryhmiä ovat seuraavat: • 1 ···...
1· • · · 2 • · · 3 a · a·· ...
117939 18 °xöcy
H l/COOH
V
NH^^cH2-0 ' 0
Fluoreseiinijohdos CH,
l jC
Λ t
H H
5 • · · *· '· Akridiniumesteri »· • · ····.
ί: a x * 2 - 18, edullisesti 4 0 0 - ( c H 2)«" 0- *:**: TT j J R = H tai C^-alkyyli i.·’: TTcOOR "fluoreseiini", .···. (TJj kun X = 4 ja R = CH3) ·· • *·· 10 Fluoreseiini johdos .*·*. 0 ·:· A .
·. ·; R N»_,NH R = H tai aminoryhmää O suojaava ryhmä : 0 <·«
Biotiinikonjugaatti (= "biotiini", kun R = Fmoc) 117939 19 ..-0 H0 v /° Γ I I OH O 0
H
Digoksigeniinikonjugaatti 5 Oligonukleotidien kanssa analogiset yhdisteet, jot ka sitoutuvat tai liittyvät väliryhmiksi (interkaloituvat) nukleiinihappoihin ja/tai pilkkovat tai silloittavat ne, sisältävät esimerkiksi akridiini-, psoraleeni-, fenantri-diini-, naftokinoni-, daunomysiini- tai kloorietyyliamino-10 aryylikonjugaatteja. Tyypillisiä interkaloituvia ja silloittavia ryhmiä ovat seuraavat: ' • *
• * * / V
*. *: * · \ / * · \ „ / • ·♦ )—·—<
!***. . -0-(CH2) -( M
• · V / *·» r-( *"*: . V /) • · • · « • · · ***·'.' * * * 15 Akridiini johdos (x = 2 - 12, edullisesti 4) OCHj • · \ * » V \ : ** < // \ * · \ — / • · / \ -S-(CH2),-NH —O f • · · ) —/ *·* / \ .*··! V /) • · '— ( • · · \ ci * ♦ · * · · ♦ * · - (x = 2 - 12, edullisesti 4) 117939 20 CHj 1 _ /c"2x-(ch2),-x-
jTrY
O^O'y^O^cHj X = NH tax -0- chj
Trimetyylipsoraleenikonjugaatti (= "psoraleeni", kun x = 0) 5 Fenantroliinikonjugaatti °X&?
Psoraleenikonjugaatti 0
. . I
• · · II
• · · Λ .: * ίο ° • * « ·« ··* t · ( *...* Naftokmomkonjugaatti ····· • · • » : ooh o ***** c H 3 • **· [ If I [ ··. OCH, 0 OH 0
• · J
« · • ·· :/.j A~° r:i /fj ·;* ho λ—' .*:·. nh :.. \ • · • · 15 Daunomysiinijohdos 117939 21
Cl-CH2CH2\ _ /N \_|_/ ( CH2 ) x~°~
HjC7
. X
x = 1 - 18, x = alkyyli, halogeeni, N02, CN, -C-R
f»
O
C I - C H , C H , v __v C I - C H 2 C H 2
5 X
x = 1 - 18, x = alkyyli, halogeeni, N02, CN, -C-R
»» 0
Esimerkkeinä ryhmistä NR3R4, joissa R3 ja R1 muodostavat yhdessä sen typpiatomin kanssa, johon ne ovat sitou-10 tuneet, 5- tai 6-jäsenisen heterosyklisen renkaan, joka voi lisäksi sisältää toisenkin heteroatomin, mainittakoon : morfolinyyli- ja imidatsolinyyliryhmä.
Polyamidiosa (PNA kaavassa I) koostuu amidiyksi-, . köistä, jotka sisältävät ainakin yhden nukleosidiemäksen, * a a *· 2 15 joka on muu kuin tyrniini. Kyseiset polyamidirakenteet ovat a · ί 2 edullisesti muodostuneet esimerkiksi seuraavista rakenne- ··· :...· osista a - h, joissa f on 1 - 4, edullisesti 1 tai 2, ja q on 0 - 3, edullisesti 0-2: : a) aaa a :2·; 20
B
:·. ch2 : ·· 1 C=o
• · I
/1. NH — ( C H 2 ) f — C H 2 ~ N — ( C H 2) ,—CO
a a a * a aaa • a • a
Hyrup et ai., J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1993, 519 • · a a a a * • a a · 2 aaa 22 1 1 7939 8 b) I .
(ch2),
NH- CH-CO -NH —Cll2· CO
De Konig et al., Rec. Trav. Chi. 91 (1971) 1069 5 c)
B
(cM,
N H - CH~CH2-CH2-CH2 —CO
Huang et ai., J. Org. Chem. 56 (1991) 6007 10 d)
B
(CH2),
NH— CH2-C0”N-CHj—CO
• · *· *: Almarsson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90 (1993) !**·· 15 7518 ··· : : e) ... '
....: B
* * I
: CH2 ·♦· · .
·*· > c=0 NH —CH2 —CH2—CH—CHj —C0 • * • «ft • · *·;·* Froehler et al., kansainvälinen patenttijulkaisu 20 WO 93/10 820 (1991) • · • ft· • · * · • ft · • · · ft · * ft · • *·· • · ***** 23 '· 117939 f)
VL
nh-ch2-ch2-n X
CO
Froehler et ai., kansainvälinen patenttijulkaisu 5 WO 93/10 820 (1991) g) ,
B
: I
( C H 2 ) I ΓΛ NH-CH-CO-N λ cc h)
F
„--(<:Vf
Nil—(Cll ) ^ 2 8 ,·. ί 10 Lewis, Tetrahedron Lett. 34 (1993) 5697 * * · ;·, PNAiihin soveltuvia pääteryhmiä on kuvattu saman- • «· aikaisesti jätetyissä patenttihakemuksissa, joiden otsik- • · ***. koina ovat "PNA-Synthese unter Vervendung einer gegen schwache Säuren labilen Amino-Schutzgruppe" (HOE 94/F 060) * · « ί·ί ί 15 ja "PNA-Synthese unter Vervendung einer basenlabilen ·*·
Amino-Schutzgruppe" (HOE 94/F 059) .
Edullisia ovat polyamidirakenteet, jotka koostuvat ·· · j kohdan a mukaisista rakenteista. Erityisen edullisia vn- •***j meksi mainitut ovat siinä tapauksessa, että f = 1.
• m .*. 20 Kaavan Ib mukaisten polyamidi-oligonukleotidien * ·· t,,‘ valmistus tapahtuu kuin oligonukleotidien syntetisoinnin • · *···* tavoin liuoksessa tai edullisesti kiinteässä faasissa, mahdollisesti käyttämällä apuna automaattista syntetisoin-tilaitetta. Kaavan Ib mukaisen oligomeerin muodostus voi ··· 117939 24 tapahtua vaiheittain kondensoimalla perätysten PNA-yksikkö tai DNA-yksikkö, joka sisältää kulloinkin yhden nukleosi-diemäksen, sopivalla tavalla derivatisoituun kantajaan tai kasvavaan oligomeeriketjuun. Muodostus voi kuitenkin ta-5 pahtua myös fragmenteittain, jolloin ensin syntetisoidaan fragmentit polyamidi- ja oligonukleotidirakenteina, jotka sitten kytketään yhteen kaavan Ib mukaiseksi polyamidi-oligonukleotidiksi. Voidaan kuitenkin käyttää myös PNA:sta ja oligonukleotidista koostuvia rakenneosia, edullisesti 10 dimeerejä, joista sitten muodostetaan polyamidi-oligonuk-leotidijohdoksia nukleotidi- ja peptidikemiassa käytetyin menetelmin.
Oligonukleotidiosa muodostetaan ammattimiehelle tutuin menetelmin, kuten triesterimenetelmällä, H-fosfo-15 naattimenetelmällä tai fosforiamidiittimenetelmällä, edullisesti Caruthersin standardifosforiamidiittimenetelmällä [M. D. Matteucci ja M. H. Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 103 (1981) 3185]. Polyamidiosa voidaan valmistaa ammattimie helle tutuilla peptidikemian menetelmillä. Mikäli oligo-20 nukleotidiosaa ja polyamidiosaa ei valmisteta erikseen ja kytketä sen jälkeen yhteen, täytyy oligonukleotidi- ja • · ί/.ί polyamidirakenteen muodostamiseen käytettävien menetelmien olla keskenään yhteensopivia, jolloin yksi edullinen to- • •***j teutustapa poluamidiosan syntetisoimiseksi on tapa, jota • · · 25 on kuvattu samanaikaisesti jätetyssä patenttihakemukses- • ,*. sa, jonka otsikkona on "PNA-Synthese unter Vervendung einer • · ♦
gegen schwache Säuren labilen Amino-Schutzgruppe" (HOE
***** 94/F 060, DE-patenttijulkaisu 4 408 531.1).
,, Aina sen mukaan, ovatko q, r, s ja t 0 vai 1, syn- • · : ** 30 teesi aloitetaan oligonukleotidi- tai polyamidiosasta. Kaa- • · « *...* van Ib mukaisten yhdisteiden syntetisointi, joiden oli- :*·,· gonukleotidiosan 3'- ja/tai 5' -päätä on muunnettu, ta- • * .·**. pahtuu kyseisten muuntamisten osalta EP-hakemusjulkaisussa • · 0 552 766 (HOE 92/F 012) kuvatuin menetelmin (vrt. DNA:lle • · · 35 esitetty synteesikaavio). Polyamidiosan osalta kaavan Ib ·*** mukaisten yhdisteiden syntetisointi tapahtuu samanaikai- 25 117959 sesti jätetyssä patenttihakemuksessa, jonka otsikkona on "PNA-Synthese unter Vervendung einer gegen schwache Säuren labilen Amino-Schutzgruppe" (HOE 94/F 060), kuvatulla menetelmällä (vrt. DNA:lle esitetty synteesikaavio. DE-pa- 5 tenttijulkaisu 4 408 531.1).
Synteesikaavio DNA:La varten: [kiinnitysryhmä]-[polymeeri] 1. i PG-(Nu')-aktiv:n liittäminen 10 PG-(Nu')-[kiinnitysryhmä]-[polymeeri] 2. Ί suojausryhmän PG poisto H-(Nu')-[kiinnitysryhmä]-[polymeeri] 3. J, vaiheiden 1 ja 2 toisto n - 1 kertaa H-(Nu')n-[kiinnitysryhmä]-[polymeeri] 15 4, i R°-V-aktiv:n liittäminen R°-V-(Nu')n-[kiinnitysryhmä]-[polymeeri] 5. polymeerin ja suojausryhmien poisto R°-V-(Nu’)n 1 20 Synteesikaavio PNA:ta varten: [kiinnitysryhmä]-[polymeeri] :*·,· 1. ... i PG-(Q')-OH:n liittäminen * · PG-(Q')-[ kiinnitysryhmä] - [polymeeri] ♦ .
,···. 2. I· suojausryhmän PG poisto • * 25 H-(Q')-[kiinnitysryhmä] - [polymeeri] • » . . 3. 4 vaiheiden 1 ja 2 toisto 1-1 kertaa * · · *“,* H-(Q')i-[kiinnitysryhmä]-[polymeeri] *···* 4. J, PG- [B' /X] -OH:n liittäminen PG-[B'/X]-Q')i-[kiinnitysryhmä]-[polymeeri] ·· • '·· 30 5. 4, suojausryhmän PG poisto H- [B' /X] - (Q')i-[kiinnitysryhmä] - [polymeeri] ,·. : 6. 4, vaiheiden 4 ja 5 toisto n - 1 kertaa • ·· H- [B' /X] n- (Q') i- [kiinnitysryhmä] - [polymeeri] "* 7. 4, PG-(A')-OH:n liittäminen · 35 PG-(A')-[B'/X] n-(Q')l-[kiinnitysryhmä] - [polymeeri] • · · 8. i suojausryhmän PG poisto 117939 26 H- (A*) ~ [B' /X]n“ (Q') l- [kiinnitysryhmä] - [polymeeri] 9. 4, vaiheiden 7 ja 8 toisto k - 1 kertaa H- (A’) k- [B* /X] n- (Q1) l- [kiinnitysryhmä] - [polymeeri] 10. 4, ryhmän R° liittäminen 5 R°- (A’) k- [B’ /X] n- (Q* ) i- [kiinnitysryhmä] - [polymeeri] 11. i polymeerin ja suojausryhmien poisto R°- (A') k- [B' /X] n- (Q') i-Q°
Kaavioissa PG tarkoittaa suojausryhmää, edullisesti heikoilla 10 hapoilla pois lohkaistavissa olevaa suojausryhmää;
Nu' tarkoittaa nukleotidiyksikköä, jonka eksosyk-linen aminoryhmä on suojattu sopivalla suojausryhmällä;
Nu'-aktiv tarkoittaa nukleotidikemiassa tavanomaista aktivoitua johdosta, kuten esimerkiksi fosforiamidiitti-, 15 fosforihappodiesteri- tai H-fosfonaattijohdosta; ja A', B’ ja Q' tarkoittavat A:n, B:n ja Q:n mahdollisesti suojattuja muotoja.
Synteesikaavio PNA-DNA-hybridejä varten, jolla on kaava I, 20 F[(DNA-Li)q(PNA-Li)r(DNA-Li)s PNA)t]xF' (I) • ·
» t I
• * Φ • * ·*·., Kun q = r = s = t = l ja x = 1, synteesin kulku on .***. seuraava: • · ··» 25 1. 4- Pääteryhmän F' syntetisointi; mahdol- • » ; linen kytkentä polymeeriin pg-f' • · • « *** 2. ψ Suoj ausryhmän PG poisto H-F' ·· • · : ·· 30 3. i Polyamidirakenteen konjugointi » »· PNA-F' 4. 4, Kytkentäryhmän liittäminen .*••1 Li-PNA-F' ♦ · *·· Cl· * ' φ·# b. φ Nukleotidirakenteen konjugointi : 35 DNA-Li-PNA-F' · · · 6. 4, Kytkentäryhmän liittäminen 117939 27
Li — DNA— I.i · PNA-F' 7. i Vaiheiden 3-5 toisto DNA-Li-PNA-Li-DNA-Li-PNA-F' 8. J, Pääteryhmän F liittäminen 5 F-DNA-Li-PNA-Li-DNA-Li-PNA-F'
Kytkentäryhmien liittäminen voidaan jättää pois, mikäli PNA- tai DNA-yksiköissä esiintyy sopivia siirtymä-ryhmiä.
10 Havainnollistamismielessä esitetään synteesikaavio kaavan I mukaisille PNA-DNA-hybrideille, joka kaavio antaa esimerkin sellaisen hybridioligomeerin valmistuksesta, jossa q=r=s-t=l ja x = 1. Ensin syntetisoidaan pääte-ryhmä F' tunnetuin menetelmin ja kiinteäfaasisynteesin ta-15 pauksessa se kytketään polymeeriseen kantajaan (vaihe 1) . Suojausryhmän PG poiston (vaihe 2) jälkeen, joka toteutetaan edullisesti lievästi happamassa väliaineessa, poly-amidiyksikköjä kytketään yhteen (vaihe 3), kunnes saavutetaan haluttu PNA-osan pituus. Siirtyminen DNA-osaan voi 20 sitten tapahtua kytkentäyksikön liittämisen kautta (vaihe 4). Sen jälkeen tapahtuu nukleotidirakenteen konjugointi : kondensoimalla nukleotidiyksikköjä peräkkäin (vaihe 5), ;·, edullisesti tunnetulla fosforiamidiittimenetelmällä. Kyt- • · · kentäryhmän liittämisen jälkeen (vaihe 6), joka mahdollis- * · **’. 25 taa siirtymisen DNAista PNA:han, muodostetaan jälleen po- lyamidirakenne. Kytkentäryhmän liittäminen, joka mahdol- • · · : listaa siirtymisen PNA:sta DNA:han, uuden DNA-rakenteen ··« • · konjugointi (vaihe 7) ja pääteryhmän F liittäminen lopuksi (vaihe 8) tuottavat tulokseksi hybridimolekyylin [F-DNA- j 30 Li-PNA-Li-DNA-Li-PNA-F' ] . Kytkentäyksiköt voivat tällöin :***: sisältää myös nukleosidiemäksiä.
• * * . Hybridin F-DNA-Li-PNA-Li-F' (q = r = 1, s = t = 0) • · * I..’ syntetisoimiseksi toteutetaan ensin esimerkiksi vaiheet • · *"* 1 - 5 ja synteesi päätetään sitten toteuttamalla vaihe 8.
:T: 35 Hybridin F-PNA-Li-DNA-F' (r = s = 1, q = t = 0) :***; syntetisoimiseksi toteutetaan ensin esimerkiksi vaiheet • · · 117939 28 1 - 2 ja sen jälkeen vaiheet 5-6, mitä seuraa vaihe 3, ja synteesi päätetään toteuttamalla vaihe 8.
Hybridin F-PNA-Li-DNA-Li-PNA-F' (r = s = t = 1, q = 0) syntetisoimiseksi toteutetaan ensin vaiheet 1-6. 5 Vaiheen 3 toistamisen jälkeen synteesi päätetään toteuttamalla vaihe 8.
, Jos x on kaavassa I suurempi kuin 1, vaiheet 2-7 on mahdollisesti toistettava. Polymeeriketjun muodostuksen jälkeen täytyy PNA-DNA-hybridit irrottaa kantajasta kiin-10 teäfaasisynteesin tapauksessa ja mahdollisesti poistaa suojausryhmät emäksistä, aminohapposivuketjuista ja pääte-ryhmistä.
PNA- ja DNA-osa voidaan kuitenkin syntetisoida myös erikseen tunnetuin menetelmin ja kytkeä sen jälkeen yhteen 15 aktivoimalla ainakin toinen komponenteista sopivalla tavalla. PNA-osan aktivointi tapahtuu edullisesti karboksyy-liryhmän kautta, esimerkiksi muodostamalla aktiivinen esteri tai isotiosyanaatti, jonka annetaan sitten reagoida DNA-osassa esiintyvien reaktiivisten ryhmien kanssa, edul-20 lisesti funktionaalisen aminoryhmän kanssa. DNA-osan aktivointi tapahtuu esimerkiksi sinänsä tunnetulla bromisyaa-.·. : nikondensaatiolla, jossa aktivoidun funktionaalisen fos- ;·. * faattiryhmän annetaan reagoida DNA-osassa esiintyvän reak- ♦ ·♦ tiivisen ryhmän kanssa, edullisesti funktionaalisen amino- • · *’*, 25 ryhmän kanssa.
On yllättäen todettu, että kaavan Ib mukaisten • · ♦ ··· · oligomeerien soluunotto on paljon suurempaa kuin pelkkien • ♦ · : PNA:iden. Tämä parantunut soluunotto on aivan ratkaisevaa, koska antisense-oligomeerit ja kolmoissäikeen muodostavat i 30 oligomeerit kykenevät vaikuttamaan ainoastaan silloin, kun niiden otto soluihin on tehokasta. Myös niiden hybridisaa- ··· y. tiokäyttäytyminen on edullisempaa kuin pelkkien PNA:iden, * * * koska ne johtavat ensijaisesti antiparalleelin kaksoissäi- • · **"’ keen muodostamiseen. Normaaleihin oligonukleotideihin ver- • · · m.‘. : 35 rattuina niillä on parempi nukleaasinkestävyys, mikä ilme- nee suurempana biologisena aktiivisuutena. Sitoutumisaffi- • · · 29 ; 117939 niteetti komplementaarisiin nukleiinihappoihin on parempi kuin muilla nukleaaseja vastaan stabiileilla oligonukle-otideilla, kuten esimerkiksi tiofosfaateilla tai metyyli-fosfonaateilla. Luonnossa esiintyviin oligonukleotideihin, 5 jotka hajoavat nopeasti seerumissa vallitsevissa olosuhteissa, verrattuina keksinnön mukaisten yhdisteiden sitou-tumisaffiniteetti on vähintään yhtä hyvä ja useimmiten parempikin. Sitoutumisaffiniteetin kasvu on riippuvainen PNA-osan pituudesta. Pelkillä PNA:illa oli soluviljelyko-10 keissa sytotoksinen vaikutus pitoisuuksien ollessa suurempia kuin 5 pmol/l, kun taas keksinnön mukaiset yhdisteet eivät vahingoittaneet soluja. Lisäksi havaittiin, että PNA- ja DNA-osan emässekvenssistä riippuen kaavan Ib mukaiset yhdisteet estävät määrättyjen geenien, esimerkiksi 15 entsyymejä, reseptoreja tai kasvutekijöitä vastaavien geenien, ilmentymistä soluviljelmissä ja määrätyissä eläin-malliesimerkeissä.
PNA-DNA-oligomeerien tai PNA-RNA-oligomeerien lisäetuihin kuuluu mahdollisuus stimuloida solujen endonukle-20 aaseja, kuten esimerkiksi RNaasi H: ta ja RNaasi L:ää. Päinvastoin kuin PNA:t, kykenevät keksinnön mukaiset PNA- .·, · DNA-kimeerit, jotka sisältävät muutamia deoksiribonukleo- • · · ’ tidiyksikköjä, komplementaariseen kohde-RHA:hän sitoutumi- • · · sen jälkeen pilkkomaan viimeksi mainitun sekvenssispesifi- • * *** 25 sellä tavalla aktivoimalla sellulaarisen RNaasi H:n. Yksi keksinnön mukaisten oligomeerien erikoistoteutusmuoto on • · · : lisäksi muoto, joka koostuu PNA-osasta ja 2 ', 5 '-kytketystä ·...· oligoadenylaattiosasta, edullisesti tetra-adenylaatista tai sen kordysepiinianalogista, ja joka aktivoi sellulaa-30 risen RNaasi L:n.
·***: Tämä keksintö koskee aivan yleisesti kaavan Ib mu- · · . kaisten yhdisteiden käyttöä lääkkeen terapeuttisesti ak- * * * .
*,,* tiivisena komponenttina. Terapeuttisesti vaikuttavilla po- • · *···’ lyamidi-oligonukleotidi j ohdoksilla tarkoitetaan yleisesti 35 antisense-oligonukleotideja, kolmoiskierteen muodostavia • * · • · • · ··* 117939 30 oligonukleotideja, aptameereja ja ribotsyymejä, erityisesti antisense-oligonukleotideja.
Tämän keksinnön mukaisia lääkeaineita voidaan esimerkiksi käyttää virusten, esimerkiksi HIV:n, HSV-l:n, 5 HSV-2:n, influenssavirusten, VSV:n, hepatiitti B -viruksen tai papilloomaviruksen, aiheuttamien sairauksien hoitoon.
Keksinnön mukaisilla antisense-polyamidi-oligonuk-leotidijohdoksilla, jotka ovat tehokkaita kyseisiä kohteita vastaan, on esimerkiksi seuraavanlainen emässekvenssi.
10 PNA- ja DNA-osan pituutta ja sijaintia mainituissa sekvensseissä voidaan vaihdella sopivalla tavalla optimaalisten ominaisuuksien saavuttamiseksi.
a) HIV:tä vastaan esimerkiksi 5'-ACACCCAATTCTGAAAATG G-3' (I) tai 15 5'-A GGTCCCTGTTCGGGCGCC A-3' (II) tai 5'-GTCGACACCCAATTCTGAAAATGGATA A-3' (III) tai 5'-GCTATGTCGACACCCAATTCTGAA A-3' (IV) tai 20 5'-TCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCTTCCTG C C A (VI) : b) HSV-l:tä vastaan esimerkiksi • *♦ :·. * 5'-GCGGGGCTCCATGGGGGTC G-3' (VII) • ·· • · · • i • · "*. 25 Tämän keksinnön mukaiset lääkeaineet soveltuvat myös , ,* esimerkiksi syövän hoitoon. Tällöin voidaan käyttää esi- • · · •*j * merkiksi polyamidi-oligonukleotidisekvenssejä, jotka ovat • * *·*.* suuntautuneet syövän synnystä tai kasvainten kasvusta vas tuussa olevia kohteita vastaan. Sellaisia kohteita ovat ·· • *·· 30 esimerkiksi seuraavat: 1) Tuman onkoproteiinit, kuten esimerkiksi c-myc, .·) . N-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, PCNA, pl20 * * · I..* 2) Sytoplasman tai solukalvoon liittyvät onkopro- • · *:* teiinit, kuten esimerkiksi EJ-ras, c-Ha-ras, N-ras, rrg, • · » V · 35 bcl-2, cdc-2, c-raf-1, c-mos, c-src, c-abl ·*· • · * · *·* 117939 3i 3) Sellulaariset reseptorit, kuten esimerkiksi EGF-reseptori, c-erbA, retinoidireseptorit, proteiinikinaasia säätelevä alayksikkö, c-fms 4) Sytokiinit, kasvutekijät, ekstrasellulaarinen 5 matriksi, kuten esimerkiksi CSF-1, IL-6, IL-la, IL-lb, IL-2, IL-4, bFGF, myeloblastiini, fibronektiini
Keksinnön mukaisilla antisense-polyamidi-oligonuk-leotideilla, joilla on kaava Ib ja jotka ovat tehokkaita kyseisiä kohteita vastaan, on esimerkiksi seuraavanlainen 10 emässekvenssi: a) c-Ha-ras, esimerkiksi 5 ' -C AGCTGCAACCCAG C-3' (VIII) b) bFGF, esimerkiksi 5'-GGCTGCCATGGTCC C-3' (XXX) 15 c) c-myc, esimerkiksi 5'-GGCTGCTGGAGCGGGGCACA C-3' (IX) 5'-A AC GT T GAGGGGCA T-3' d) c-myb, esimerkiksi 5'-GTGCCGGGGTCTTCGGG C-3' (XI) 20 e) c-fos, esimerkiksi 5'-G GAGAACATCATGGTCGAAA G-3' (XII) I 5'-C C C G A G A A C A T C A T G G T C G A A G-3' (XIII) • · · 5'-GGGGAAAGCCCGGCAAGGG G-3' (XIV) • · · *... f) pl20, esimerkiksi • · 25 5'-CACCCGCCTTGGCCTCCCA C-3' (XV) g) EGF-reseptori, esimerkiksi : 5'-G G G A c t c c g g c g c a G C G C-3' (XVI) 5'-GGCAAACTTTCTTTTCCTC C-3' (XVII) h) p53-kasvainsuppressori, esimerkiksi ·*·.. 30 5' -G GGAAGGAGGAGGATGAG G-3' (XVIII) ;·**: 5'-GGCAGTCATCCAGCTTCGGA G-3'r (XIX) * · · .* . Keksinnön mukaiset lääkeaineet soveltuvat lisäksi • · · ; esimerkiksi sellaisten sairauksien hoitoon, joihin vaikut- • · *···* tavat integriinit tai solu-soluadheesioreseptorit, esimer- 35 kiksi VLA-4, VLA-2, ICAM, VCAM tai ELAM.
* · · · • · ...
• * · : 32 117939
Keksinnön mukaisilla antisense-polyamidi-oligonuk-leotidijohdoksilla, jotka ovat tehokkaita kyseisiä kohteita vastaan, on esimerkiksi seuraavanlainen emässekvenssi: a) VLA-4, esimerkiksi 5 5'-GCAGTAAGCATCCATAT C-3' (XX) b) ICAM, esimerkiksi 5'-CCCCCACCACTTCCCCTCT C-3' (XXI) 5'-C TCCCCCACCACTTCCCCT C-3' (XXII) 5'-GCTGGGAGCCATAGCGAG G-3' (XXIII) 10 c) ELAM-1, esimerkiksi 5'-ACTGCTGCCTCTTGTCTCAG G-3' (XXIV) 5'-CAATCAATGACTTCAAGAGTT C-3' (XXV) Tämän keksinnön mukaiset lääkeaineet soveltuvat myös esimerkiksi restenoosin ehkäisyyn. Tällöin voidaan 15 käyttää esimerkiksi polyamidi-oligonukleotidisekvenssejä, jotka ovat suuntautuneet proliferaatiosta ja migraatiosta vastuussa olevia kohteita vastaan. Sellaisia kohteita ovat esimerkiksi seuraavat: 1) Tuman transaktivaattoriproteiinit ja sykliinit, 20 kuten esimerkiksi c-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, sykliinit ja cdc2-kinaasi : - ;*.#j 2) Mitogeenit ja kasvutekijät, kuten esimerkiksi :·. * PDGF, bFGF, EGF, HB-EGF ja TGF-β • · · .···, 3) Sellulaariset reseptorit, kuten esimerkiksi • ♦ 25 bFGF-reseptori, EGF-reseptori ja PDGF-reseptori • m . . Keksinnön mukaisilla antisense-polyamidi-oligonuk- * · · leotideilla, joilla on kaava Ib ja jotka ovat tehokkaita *···* kyseisiä kohteita vastaan, on esimerkiksi seuraavanlainen emässekvenssi: • *·· 30 a) c-myb :"*i 5'-GTGTCGGGGTCTCCGGG C-3' (XXVI) .·! : b) c-myc r.Ij ' 5'-CACGTTGAGGGGCA T-3' (XXVII) • · *** c) cdc2-kinaasi 35 5'-GTCTTCCATAGTTACTC A-3' (XXVIII) • · · • · • m ··* , 117939 d) PCNA (rotan proliferoiva solutuma-antigeeni) 5'-GATCAGGCGTGCC T CAA A-3' (XXIX) Lääkeaineita voidaan käyttää esimerkiksi farmaseuttisten valmisteiden muodossa, jotka voidaan antaa esimer-5 kiksi tablettien, rakeiden, kovien tai pehmeiden gelatii-nikapseleiden, liuosten, emulsioiden tai suspensioiden muodossa. Lääkeaineiden sulkeminen liposomien sisään, jotka mahdollisesti sisältävät muitakin aineosia, kuten proteiineja, on myös yksi mahdollinen antotapa. Niitä voidaan 10 antaa myös peräsuolen kautta esimerkiksi peräpuikkojen muodossa tai parenteraalisesti esimerkiksi injektioliuosten muodossa. Farmaseuttisten valmisteiden aikaansaamiseksi kyseisiin yhdisteisiin voidaan yhdistää hoidollisesti inerttejä, orgaanisia ja epäorgaanisia kantaja-aineita. 15 Esimerkkejä sellaisista tabletteihin, rakeisiin ja koviin gelatiinikapseleihin soveltuvista kantaja-aineista ovat laktoosi, maissitärkkelys ja sen johdokset, talkki sekä steariinihappo ja sen suolat. Liuosten valmistukseen soveltuvia kantaja-aineita ovat vesi, polyolit, sakkaroosi, 20 inverttisokeri ja glukoosi. Sopivia kantaja-aineita injektoitaviin liuoksiin ovat vesi, alkoholit, polyolit, glyse- ;‘.#j roli ja kasviöljyt. Peräpuikkoihin soveltuvia kantaja- * · aineita ovat kasviöljyt, kovetetut öljyt, vahat, rasvat ja * * * .···, puoliksi nestemäiset polyolit. Farmaseuttiset valmisteet « · .!!!: 25 voivat sisältää myös säilytteitä, liuotteita, stabilointi- • · , , aineita, kostutteita, emulgointiaineita, makeutteita, väri- • · · "jt* aineita, mautteita, osmoottisen paineen muuttamiseen tar- • * *··** koitettuja suoloja, puskurointiaineita, päällystysaineita, hapettumisenestoaineita sekä mahdollisesti muita terapeut- ·· • *·· 30 tisesti aktiivisia aineita.
···
Edullisia antotapoja ovat topikaaliset annot, pai- .·] ; kalliset annot esimerkiksi katetrin avulla tai myös injek- * · · : m‘../ toinnit. Injektointia varten antisense-polyamidi-oligonuk- • · *** leotidijohdoksista muodostetaan nestemäinen liuos; edulli- ·»· V * 35 sesti ne sisällytetään fysiologisesti hyväksyttävään pus- ϊ l kuriliuokseen, kuten esimerkiksi Hankin liuokseen tai Rin- 117939 34 gerin liuokseen. Antisense-polyamidi-oligonukleotideista voidaan kuitenkin muodostaa myös kiinteitä formuloita, jotka liuotetaan tai suspendoidaan ennen käyttöä. Systee-misesti annettaessa annostus on edullisesti noin 0,01 -5 50 mg/kg ruumiinpainoa vuorokaudessa.
Tämä keksintö koskee aivan yleisesti kaavan Ib mukaisten yhdisteiden käyttöä DNA-koettimina tai alukkeina DNA-diagnostiikassa, erityisesti EP-hakemusjulkaisussa 0 602 524 (HOE 92/F 406) mainittuja geenikoettimien mukai-10 sessa mielessä, ja yleensäkin apuaineina molekyylibiologiassa.
Geenikoettimilla, joita kutsutaan myös DNA-koetti-miksi tai hybridisaatiokoettimiksi, on suuri merkitys tiettyjen geenien sekvenssispesifisen detektion kannalta. 15 Geenikoetin koostuu yleensä tunnistussekvenssistä ja sopivasta leimausryhmästä (label). Analysoitavassa näytteessä esiintyvän kohdesekvenssin määrityksen spesifisyyden, joka määritys toteutetaan komplementaarisen geenikoettimen kanssa tapahtuvan hybridisaation avulla, määräävät tunnis-20 tussekvenssi ja sen kemiallinen rakenne. PNA:illa on se etu oligonukleotideihin nähden, joilla on luonnossa esiin- .*.j tyvä rakenne, että niillä on suurempi affiniteetti kohde- * · sekvenssiä kohtaan. Hybridisaation spesifisyys on kuiten- * ·· ,···. kin pienempi, koska PNA:t voivat, päinvastoin kuin luon- • · 25 nossa esiintyvä DNA, sitoutua yksisäikeisiin nukleiinihap- Φ · . . poihin sekä paralleelista että antiparalleelisti orientoi- • · · *·|#: tuneina. Keksinnön mukaisilla PNA-DNA-oligomeereilla on • · *♦··* myös suurempi sitoutumisaf finiteetti, mutta ne suosivat voimakkaasti sitoutumista toivotulla antiparalleelilla ta- | *·· 30 valla.
• · ·
Valitsemalla geenikoettimen PNA- tai DNA-osa sopi- .♦] ; vasti voidaan lisäksi vaikuttaa positiivisesti erilaistu- • ·· l./ miskykyyn, koska emäspariutuminen PNA-osassa johtaa hybri- * · *V din sulamislämpötilan voimakkaampaan alenemiseen kuin DNA- ··· V * 35 osassa tapahtuva emäspariutuminen. Tämä on erityisen tär- ♦ ·· keätä erilaistumisen kannalta, joka tapahtuu pistemutaa- 117939 35 tioissa, jollaisia esiintyy esimerkiksi siirryttäessä pro-to-onkogeeneistä vastaaviin onkogeeneihin (patogeeninen tila). Patogeenisen ja ei-patogeenisen tilan erottaminen paremmin toisistaan on etu, jota voidaan hyödyntää myös 5 niin, että keksinnön mukaiset PNA-DNA-oligomeerit toimivat alukkeina, mikäli ne sisältävät DNA-osan 3'-asemassa vapaan funktionaalisen hydroksyyliryhmän. PNA:t sellaisinaan eivät toimi alukkeina polymeraaseille. On yllättäen todettu, että jo yksi PNA-DNA-oligomeerin päässä sijaitseva 10 nukleosidiyksikkö riittää käynnistämään DNA-polymeraasi-reaktion, esimerkiksi DNA-polymeraasin (Klenowin fragmentin) avulla. Kulloisenkin PNA-DNA-alukkeen rakenteen ja sen templaatin laadun mukaan, johon aluke hybridisoidaan sekvenssispesifisellä tavalla, voidaan käyttää erilaisia 15 polymeraaseja, Niihin kuuluvat yleisesti kaupan olevat polymeraasit, kuten esimerkiksi Taq-polymeraasi, Klenow-polymeraasi ja käänteiskopioijaentsyymi.
Yksi lisäetu luonnollisen oligonukleotidialukkeen käyttöön verrattuna on se, että PNA-DNA-alukkeen avulla 20 kopioitu nukleiinihapposäie, joka sisältää PNA-osan 5'- päässä, on stabiili 5'-eksonukleaaseja vastaan. Kaikki .*. : luonnossa esiintyvät DNA- tai RNA-sekvenssit voidaan siten * · ;·. pilkkoa 5' -eksonukleaaseilla sen vaikuttamatta PNA:ta si- • · · ... sältävään säikeeseen.
• « • · "*. 25 Yksi PNA-DNA-oligomeerien lisäetu on se, että nii- , ,* den avulla voidaan DNA-osassa toteuttaa myös muita bioke- II· ··· * miallisia reaktioita, jotka eivät ole mahdollisia itse *.·.* PNA:iden tapauksessa. Esimerkkejä sellaisista reaktioista ovat "3'-hännän" muodostus 3'-terminaalisella transferaa- • · • *·» 30 silla, DNA-kaksoissäiealueella tapahtuva pilkkominen rest- riktioentsyymillä sekä ligaasireaktiot. Esimerkiksi (PNA)- . (DNA)-OH-oligomeeri, joka sisältää 3'-asemassa vapaan hyd- • · · I..' roksyyliryhmän, voidaan luonnollista alkuperää olevaan • · komplementaariseen DNA-apusekvenssiin hybridisoinnin jäi-: 35 keen kytkeä yhteen toisen p-(DNA) - (PNA)-oligomeerin kans- • M • · • Φ 117939 36 sa, joka sisältää 5'-päässä nukleosidi-5'-fosfaatin, DNA-ligaasin ollessa läsnä.
(DNA)-(PNA)-(DNA)-oligomeereja on lisäksi mahdollista sisällyttää geeneihin, mikä ei ole PNA:iden tapauk-5 sessa toistaiseksi mahdollista.
Leimausryhmien liittäminen PNA-DNA-oligomeereihin tapahtuu sinänsä tunnetuin menetelmin, joita on esitetty oligonukleotideille tai peptideille. Leimausryhmän laatu voi vaihdella suuresti ja määräytyy pääasiallisesti käy-10 tettävän määritystavan mukaan. Tunnettuja tapoja geenikoe-tinmääritysten toteuttamiseksi ovat "Hybridization Protection", "Energy-Transfer" ja "Kissing Probes" -määritys. PNA-DNA-oligomeerit soveltuvat lisäksi erityisen hyvin "Strand Displacement" -määritykseen. Monissa tapauksissa 15 on edullista erottaa muodostunut hybridi ylimääräisestä geenikoettimesta magneettihiukkasten avulla. Keksinnön mukaisten PNA-DNA-geenikoettimien stabiilisuus on suurempi kuin tähänastisten DNA-koettimien.
"Polymeraasiketjureaktio" (PCR) ja "ligaasiketju-20 reaktio" (LCR) ovat sellaisia tekniikkoja kohteen ampli-fikaation aikaansaamiseksi, joissa keksinnön mukaisia oli-: gomeereja voidaan käyttää myös alukkeena. Erityisen edul- lisesti PNA-DNA-oligomeereja voidaan käyttää geenikoetti- • *« j..·^ minä " joulukuusi"-periaatteella, koska PNA-DNA-koettimet * * ***. 25 voivat silloin olla lyhyempiä kuin vastaavat DNA-koetti- .* met.
• · · ··* : Esimerkit • « · • ·
Aminohapoista käytettävät lyhenteet vastaavat pep-tidikemiassa tavanomaista kolmikirjaimista koodia, joka on * *·· 30 esitetty julkaisussa Europ. J. Biochem. 138 (1984) 9. Mui- ta lyhenteitä, joita käytetään, on lueteltu alla.
#·) . Aeg N-(2-aminoetyyli) glysyyli, -NH-CH2~CH2-NH- *:.*/ CH2-CO- • · *“* Aeg(aMe0Bz) N- (2-aminoetyyli) -N-{ [9- (N6-4-metoksibent- ·*· V · 35 soyyli)adenosyyli]asetyyli}glysyyli ··* • · • · ·* 117939 37
Aeg(cBz) N-(2-aminoetyyli)-N{ [1-(N4-bentsoyyli)syto- syyli]asetyyli}glysyyli
Aeg(cMe0Bz) N-(2-aminoetyyli)-N-{[1-(N4-4-metoksibent- soyyli)sytosyyli]asetyyli}glysyyli 5 Aeg(ctBuBz) N- (2-aminoetyyli) -N-{ [1- (N4-4-t-butyyli- bentsoyyli)sytosyyli]asetyyli}glysyyli Aeg(glBu) N- (2-aminoetyyli) -N-{ [9- (N2-isobutanoyyli) - guanosyyli]asetyyli}glysyyli
Aeg (g2-Ac,4'Dpc) N-(2-aminoetyyli)-N-[9-(N2-asetyyli-04-di-10 fenyylikarbamoyyli)guanosyyli]glysyyli
Aeg(t) N-(2-aminoetyyli)-N-[(1-tyminyyli)asetyy li] glysyyli
Bnpeoc 2,2-bis(4-nitrofenyyli)etoksikarbonyyli
Boc t-butoksikarbonyyli 15 BOI 2-(bentsotriatsol-1-yylioksi)-1,3-dimetyy- li-imidatsolidiniumheksafluorifosfaatti BOP (bentsotriatsol-l-yylioksi)tris(dimetyyli- amino)fosfoniumheksafluorifosfaatti
BroP bromitris(dimetyyliamino)fosfoniumheksa- 20 fluorifosfaatti BSA N,0-bis(trimetyylisilyyli)asetamidi :*·,· But t-butyyli • *
Bz bentsoyyli « .···, Bzl bentsyyli • ♦ 25 Cl-Z 4-klooribenstyylioksikarbonyyli
t I
. . CPG huokoslasi, jolla on säädelty huokoskoko • * DBU 1, 8-diatsabisyklo[5.4.0]undek-7-eeni • · *···* DCM dikloorimetaani
Ddz 3/5-dimetoksifenyyli-2-propyyli-2-oksikar- ·· i ’*· 30 bonyyli * * * :...ϊ DMF dimetyyliformamidi : Dmt di (4-metoksifenyyli) fenyylimetyyli • ·· .··*[ Dnpeoc 2-(2,4-dinitrofenyyli) etoksikarbonyyli *1* Dpc dif enyylikarbamoyyli * ·· V· 35 FAM fluoreseiiniryhmä • · · :...Σ Fm 9-fluorenyylimetyyli 38 1 1 7939
Fmoc 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli H-Aeg-OH N-(2-aminoetyyli)glysiini HAPyU 0- (7-atsabentsotriatsol-l-yyli)-1,1,3,3- bis(tetrametyleeni)uroniumheksafluorifos-5 faatti HATU 0-(7-atsabentsotriatsol-l-yyli)-1,1,3,3- tetrametyyliuroniumheksafluorifosfaatti HBTU 0-(bentsotriatsol-1-yyli)-1,1,3,3-tetrame- tyyliuroniumheksafluorifosfaatti 10 HOBt l-hydroksibentsotriatsoli HONSu N-hydroksisukkiini-imidi HOObt 3-hydroksi-4-okso-3,4-dihydrobentsotriat- siini iBu isobutanoyyli 15 MeOBz 4-metoksibentsoyyli
Mmt 4-metoksitrifenyylimetyyli
Moz 4-metoksibentsyylioksikarbonyyli MSNT 2,4,6-mesityleenisulfonyyli~3-nitro-l, 2,4- triatsolidi 20 Mtt (4-metyylifenyyli)difenyylimetyyli NBA nitrobentsyylialkoholi ,*. : NMP N-metyylipyrrolidiini * e ·
Obg N-(4-oksibutyyli)glysyyli, -O-(CH2) 4-NH- CH2-CO- ; • # **\ 25 Obg(t) N- (4-oksibutyyli) -N- [ (1-tyminyyli) asetyy- * · · * φ li]glysyyli ΐ Oeg N-(2-oksietyyli) glysyyli, -O-CH2-CH2-NH- CH2-CO-
Oeg(t) N-(2-oksietyyli)-N-[(1-tyminyyli)asetyyli]- • · j 30 glysyyli :***; Opeg N- (5-oksipentyyli) glysyyli, -0-(CH2) 5-NH- * * · . CH2-C0- I,.* Opeg(t) N-(5-oksipentyyli)-N-[ (1-tyminyyli) asetyy- * · *·"* li] glysyyli 35 Oprg N- (3-oksipropyyli) glysyyli, -O-(CH2) 3-NH- ch2-co- I 4 « 39 .
117939
Oprg(t) N-(3-oksipropyyli)-N-[(1-tyminyyli)asetyy- . li]glysyyli
Pixyl 9-(9-fenyyli)ksantenyyli
PyBOP (bentsotriatsol-l-yylioksi)tripyrrolidino- 5 fosfoniumheksafluorifosfaatti
PyBroP bromitripyrrolidinofosfoniumheksafluorifos- faatti TAPipU 0-(7-atsabentsotriatsol-l-yyli)-1,1,3,3- bis(pentametyleeni)uroniumtetrafluoribo-10 raatti TBTU 0-(bentsotriatsol-l-yyli)-1,1,3,3-tetrame- tyyliuroniumtetrafluoriboraatti tBu t-butyyli tBuBz 4-(t-butyyli)bentsoyyli 15 TDBTU 0-(3,4-dihydro-4-okso-l,2,3-bentsotriatsin- 3-yyli)-1,1,3,3-tetrametyyliuroniumtetra-fluoriboraatti : TDO 2,5-difenyyli-2,3-dihydro-3-okso-4-hydrok- sitiofeenidioksidi 20 Teg N- (2-tioetyyli) glysyyli, -S-CH2-CH2-NH--CH2- CO- : Teg(t) N-(2-tioetyyli)-N-[ (1-tyminyyli) asetyyli] - • · * * glysyyli TFA trifluorietikkahappo 25 THF tetrahydrofuraani TNTU O-( 5-norborneeni-2,3-dikarboksimido)- * * · ί·* : 1, 1,3,3-tetrametyyliuroniumtetrafluoribo- raatti TOTU 0“{[syaani(etoksikarbonyyli)metyleeni]ami- * · • “·· 30 ηο}-1,1,3,3-tetrametyyliuroniumtetrafluori- :***: boraatti * · · . TPTU O-(1,2-dihydro-2-okso-l-pyridyyli)-1,1,3,3- • * · I..* tetrametyyliuroniumtetraf luoriboraatti * * **;·* Trt trityyli : 35 TSTU O- (N-sukkiini-imidyyli)-1,1,3,3- tetrameyyliuroniumtetraf luoriboraatti * * · 117939 40 Z bentsyylioksikarbonyyli MS (ES+) elektronisuihkumassaspektri (positiivinen ioni) MS (ES") elektronisuihkumassaspektri (negatiivinen 5 ioni) MS (DCI) desorptioionisaatiokemiallinen massaspektri MS (FAB) nopeilla atomeilla pommittamiseen perustuva massaspektri Esimerkki 1 10 l-hydroksi-6-[(4-metoksifenyyli)difenyylimetyyli- amino]heksaani (Mmt-hex) 6-aminoheksan-l-oli (1 g, 8,55 mmol) liuotetaan vedettömään pyridiiniin (7 ml) ja liuokseen lisätään tri- etyyliamiinia (0,2 ml). Tähän liuokseen lisätään 45 minuu- 15 tin aikana liuos, joka sisältää (4-metoksifenyyli)difenyy- limetyylikloridia (2,5 g, 8,12 mmol) vedettömässä pyridii- nissä (9 ml) . Reaktioliuosta lisäsekoitetaan 30 minuuttia lämpötilassa 22 °C, ja reaktio pysäytetään lisäämällä me- tanolia (3 ml). Liuos väkevöidään pyöröhaihduttimessa, ja 20 saatavalla jäännöksellä toteutetaan kolmesti yhteishaihdu- tus tolueenin kanssa pyridiinin poistamiseksi. Saatava : jäännös liuotetaan etyyliasetaattiin ja liuos pestään pe- • ·· * rätysten kylläisellä natriumvetykarbonaattiliuoksella, • s* vedellä ja kylläisellä kaliumkloridiliuoksella. Orgaaninen • · '**, 25 faasi kuivataan (Na2S04), suodatetaan ja väkevöidään ali- • ♦ * · * paineessa. Raakatuote puhdistetaan kromatografisesti sili- * ♦ · ί·ί · kageelilla käyttäen eluenttina heptaani-etyyliasetaatti- • * * *...· trietyyliamiiniseosta (49, 5:49, 5:1).
Saanto: 1,64 g 30 MS (FAB, NBA/LiCl): 396,3 (M + Li)\ 390,3 (M + H)+, 273,2 :***: (Mmt)+ « · · . Rf: 0,44 (heptaani-etyyliasetaattiseos, 1:1) • · • · · • · • · ··· * * · . -• · · . .
··# • · * · ··· 117939 41
Esimerkki 2 6-[(4-metoksifenyyli)difenyylimetyyliamino]heks-l- yylihemisukkinaatti (Mnt-hex-succ) l-hydroksi-6-[(4-metoksifenyyli)difenyylimetyyli-5 amino]heksaani (1,00 g, 2,57 mmol) liuotetaan vedettömään pyridiiniin (10 ml). Tähän liuokseen lisätään meripihka-happoanhydridiä (0,257 g, 2,57 mmol) ja 4,4-dimetyyliami-nopyridiiniä (31,3 mg, 0,257 mmol). Lämpötilassa 22 °C tehdyn 3 tunnin jälkeen lisätään lisää meripihkahappoan-10 hydridiä (25,7 mg, 0,257 mmol) ja 4,4-dimetyyliaminopyri-diiniä (62,6 mg, 0,56 mmol) ja liuosta pidetään 6 tuntia lämpötilassa 50 °C. Sen jälkeen kun liuosta on pidetty vielä 16 tuntia lämpötilassa 22 °C, se väkevöidään, jäännös sekoitetaan etyyliasetaattiin ja saatava liuos pestään 15 jääkylmällä sitruunahapon 5-%:isella vesiliuoksella. Orgaanisen faasin kuivauksen (Na2SOi) jälkeen liuos väkevöidään pyöröhaihduttimessa. Puhdistettaessa jäännös kromato-grafisesti silikageelillä käyttäen eluenttina CH2Cl2-tri-etyyliamiini-etyyliasetaattiseosta (50:1:49) ja sen jäl-20 keen dikloorimetaania, joka sisältää 5 % metanolia ja 1 % trietyyliamiinia, saadaan haluttua yhdistettä värittömänä ;*·.· öljynä.
' MS (ES"): 978,0 (2M - H)', 488,3 (M - H)' » i· \..t Rt: 0,30 (CH2Cl2-etyyliasetaattiseos, 1:1) *'*. 25 Esimerkki 3 , . 6-[(4-metoksifenyyli)difenyylimetyyliamino]heks-l- * * · · yylisukkinyyliamido-Tentagel (Mmt-hex-succ-Tenta- ···* gel)
TentagelR:n (Rapp Polymere) aminomuodon (0,5 g, 0,11 * k * *.. 30 mmol aminoryhmiä) annetaan turvota 10 minuuttia 4-etyyli- morfoliinissa (0,1 ml) ja DMF:ssä (5 ml). Sen jälkeen li- ,‘lz sätään liuos, joka sisältää 6-[(4-metoksifenyyli) difenyy- * · · limetyyliamino] heks-l-yylihemisukkinaattia (97,4 mg, 0,165 *” mmol), 4-etyylimorfoliinia (15,9 mg, 0,138 mmol, 17,4 ml) ί 35 ja TBTU:ta (52,9 mg, 0,165 mmol) DMF:ssä (3 ml), ja sus- pensiota ravistetaan 16 tuntia lämpötilassa 22 °C. Deriva- 117939 42 tisoitu Tentagel-kantaja erotetaan suodattamalla, pestään perätysten DMF:llä (3x3 ml), CH2Cl2:lla (3x1 ml) ja dietyylieetterillä (3x1 ml) ja kuivataan. Reagoimattomat funktionaaliset aminoryhmät suojataan käsittelemällä kan-5 tajaa 1 tunti seoksella, joka sisältää etikkahappoanhydri-diä, lutidiinia ja 1-metyyli-imidatsolia THF:ssä (1 ml). Valmis kantaja pestään CH2Cl2:lla (3x1 ml) ja dietyylieetterillä (3x1 ml) ja kuivataan alipaineessa. Kantajalle lastattu määrä (sisällytettyihin funktionaalisiin mono-10 metoksitrityyliryhmiin perustuen) on 168 mrnol.g"1.
Esimerkki 4 6-[(4-metoksifenyyli)difenyylimetyyliamino]heks-1-yylisukkinyyliamidopropyyli-huokoslasi (Mmt-hex- succ-CPG) 15 Valmistus tapahtuu vastaavalla tavalla, kuin esi merkissä 3 on kuvattu, mutta käyttämällä lähtömateriaaleina aminopropyyli-CPG: tä (Fluka-yhtiö) (55 nm; 1,0 g) ja liuosta, joka sisältää 6-[(4-metoksifenyyli)difenyylime-tyyliamino]heks-l-yylihemisukkinaattia (48,7 mg, 20 0,082 mmol), 4-etyylimorfoliinia (7,6 mg) ja TBTU:ta (26,4 mg, 0,082 mmol) DMF:ssa (3 ml). Lastattu määrä Mmt-,·, ; hex-succ-CPG: tä on 91 mrnol.g-1.
4 *· .. Esimerkki 5 • ♦ * ·· .
*... N- [ (4-metoksifenyyli) difenyylimetyyliamino] etyyli- • · **·] 25 N-{1- [N4- (4-t-butyylibentsoyyli) sytosyyli]asetyyli}- glysiini (Mmt-Aeg (ctBuBz)-OH) : N-[(4-metoksifenyyli) difenyylimetyyliamino] etyyli- ·***· 4 *...· N-{1- [N - (4-t-butyylibentsoyyli) sytosyyli] asetyyli}glysii- nin metyyliesteri (1,63 g, 2,28 mmol) liuotetaan dioksaa- 30 nin (10 ml) ja veden (1 ml) seokseen, ja liuokseen lisä- :***· tään lämpötilassa 0 °C pisaroittaan 1 N NaOH-liuosta • * · . (4,56 ml) samalla sekoittaen. 2 tunnin kuluttua pH sääde- · ♦ *;,]* tään arvoon 5 lisäämällä pisaroittain 1 N KHS04-liuosta, ja • · *···* saostuneet suolat erotetaan suodattamalla ja pestään sit- :T: 35 ten pienellä määrällä dioksaania. Yhdistetyt suodokset ;***· väkevöidään alipaineessa, ja jäännöksellä toteutetaan kah- 117939 43 desti yhteishaihdutus metanolin ja dikloorimetaanin kanssa. Näin saatava raakatuote puhdistetaan kromatografisesti silikageelillä käyttämällä hyväksi gradienttieluointia dikloorimetaanilla, joka sisältää 2 - 10 % metanolia ja 5 1 % trietyyliamiinia. Tuotetta sisältävät jakeet yhdiste tään ja väkevöidään alipaineessa. Yhä läsnä oleva ylimääräinen trietyyliamiini poistetaan yhteishaihdutuksella ; pyridiinin ja sen jälkeen tolueenin kanssa. Saadaan 0,831 g tuotetta lähes valkoisena vaahtona.
10 MS (ES-): 700, 7 (M - H)"
Rf: 0,28 (CH2Cl2-MeOH-seos, 9:1), 0,63 (CH2Cl2-MeOH-seos, 7:3)
Esimerkki 6 N-[(4-metoksifenyyli)difenyylimetyyliamino]etyyli-15 N-[(1-tyminyyli)asetyyli]glysiini (Mmt-Aeg(g)-OH)
Yllä kuvatun reaktion tuote liuotetaan dioksaanin (10 ml) ja veden (2 ml) seokseen. Liuos jäähdytetään lämpötilaan 0 °C ja lisätään pisaroittain 1 N natriumhydrok-siliuosta, kunnes saavutetaan pH-arvo 11. 2 tunnin rea- 20 gointiajan jälkeen reaktio päätetään ja liuoksen pH säädetään arvoon 5 lisäämällä varovasti 2 N KHS04-liuosta. Liuos Ϊ uutetaan kolmesti etyyliasetaatilla, ja yhdistetyt orgaa- * · ;·. niset faasit kuivataan natriumsulfaatilla ja väkevöidään • «· .···. alipaineessa. Näin saatava raakatuote puhdistetaan kroma- • 1 25 tografisesti silikageelillä käyttämällä hyväksi gradient- . , tieluointia dikloorimetaanilla, joka sisältää 5 - 10 % me- * 1 · "j/ tanolia ja 1 % trietyyliamiinia. Tuotetta sisältävät ja- * · *···1 keet yhdistetään ja väkevöidään alipaineessa. Yhä läsnä oleva ylimääräinen trietyyliamiini poistetaan yhteishaih- ·· • 1♦· 30 dutuksella pyridiinin ja sen jälkeen tolueenin kanssa, ί : Saadaan 1,065 g tuotetta värittömänä vaahtona.
.·1 : MS (ES ) : 1112,0 (2M - H)', 555,3 (M - H)-
Rf: 0,28 (CH2Cl2-MeOH-seos, 8:2) • · • 1 *·· * 1 · • · · * · · ·· • « * m • · · 44 1 1 7939
Esimerkki 7 N-[(4-metoksifenyyli)difenyylimetyyliamino]etyyli-N- { 9- [N2- (isobutanoyyli) guanosyyli] asetyyli Jglysiini (Mmt-Aeg (glBu) -OH) 5 N-[(4-metoksifenyyli)difenyylimetyyliamino]etyyli- N-{9- [N2-(isobutanoyyli)guanosyyli]asetyyli}glysiinin me-tyyliesteri (1,15 g, 1,72 mmol) liuotetaan dioksaaniin (10 ml), ja liuokseen lisätään 2,5 tunnin aikana lämpötilassa 0 °C pisaroittain natriumhydroksidin 1 M vesiliuos 10 (10,32 ml) viidessä erässä. Sen jälkeen kun liuoksen on annettu reagoida vielä 2 tuntia huoneenlämpötilassa, sen pH säädetään arvoon 5 lisäämällä pisaroittain kaliumvety-sulfaatin 2 M vesiliuosta. Saostuneet suolat erotetaan suodattamalla ja pestään sitten pienellä määrällä dioksaa-15 nia. Yhdistetyt suodokset haihdutetaan kuiviin alipaineessa, ja jäännöksellä toteutetaan kahdesti yhteishaihdutus etanolin kanssa ja kahdesti dikloorimetaani-metanoliseok-sen (1:1) kanssa. Puhdistus tehdään pylväskromatografises-ti silikageelillä käyttämällä hyväksi gradienttieluointia 20 dikloorimetaanilla, joka sisältää 10 - 20 % metanolia ja 1 % trietyyliamiinia. Tuote saadaan valkeana vaahtona.
: Saanto: 1,229 g ;·. * MS (ES") : 650, 3 (M - H)" * ·«
Rf: 0,25 (dikloorimetaani-metanoliseos, 8:2) ***. 25 Esimerkki 8 N-[(4-metoksifenyyli)difenyylimetyyliamino]etyyli-:·: ί N-{9- [N - (4-metoksibentsoyyli) adenosyyli]asetyyli}- glysiini (Mmt-Aeg (aMeOBz)-OH) N-[(4-metoksifenyyli)difenyylimetyyliamino]etyyli-ί *.. 30 N-{ 9- [N6- (4-metoksibentsoyyli) adenosyyli] asetyyli}glysiinin metyyliesteri (1,70 g, 2,38 mmol) liuotetaan dioksaaniin • · · . (10 ml), ja liuokseen lisätään 2,5 tunnin aikana lämpöti- * * * ^ * ·· *.,* lassa 0 °C pisaroittain natriumhydroksidin 1 M vesiliuos • · *·;** (10,32 ml) viidessä erässä. Sen jälkeen kun liuoksen on 35 annettu reagoida vielä 2 tuntia huoneenlämpötilassa, sen :***· pH säädetään arvoon 5 lisäämällä pisaroittain kaliumvety- 117939 45 sulfaatin 2 M vesiliuosta. Saostuneet suolat erotetaan suodattamalla ja pestään sitten pienellä määrällä dioksaa-nia. Yhdistetyt suodokset haihdutetaan kuiviin alipaineessa, ja jäännöksellä toteutetaan kahdesti yhteishaihdutus 5 etanolin kanssa ja kahdesti dikloorimetaani-metanoliseok-sen (1:1) kanssa. Puhdistus tehdään pylväskromatografises-ti silikageelillä käyttämällä hyväksi gradienttieluointia dikloorimetaanilla, joka sisältää 10 - 20 % metanolia ja 1 % trietyyliamiinia. Tuote saadaan valkeana vaahtona.
10 Saanto: 1,619 g MS (ES") : 698,3 (M - H)'
Rf: 0,10 (dikloorimetaani-metanoliseos, 8:2)
Esimerkki 9 N-[(4-metoksifenyyli)difenyylimetoksi]etyyli^N-15 [(1-tyminyyli)asetyyli]glysiini (Mmt-Oeg(t)-OH) N-[(4-metoksifenyyli)difenyylimetoksi]etyyliglysii- ni (0,5 g, 1,28 mmol) suspendoidaan DMF:ään (10 ml) ja suspensioon lisätään pisaroittain BSA:ta (0,47 ml, 1,92 mmol). Sen jälkeen lisätään perätysten trietyyliamiinia 20 (0,7 ml, 5,1 mmol) ja kloorikarboksimetyylitymiiniä (0,26 g, 1,28 mmol). Reaktioseosta sekoitetaan 4 tuntia .1.J huoneenlämpötilassa, sitten lisätään lisää kloorikarboksi- • 1 metyylitymiiniä (65 mg, 0,32 mmol) ja sekoitetaan vielä • ·♦ 16 tuntia. Liuote poistetaan sen jälkeen alipaineessa ja • · ***. 25 raakatuote puhdistetaan silikageelipylväässä käyttämällä t f hyväksi gradienttieluointia dikloorimetaanilla, joka si- • · · sältää 5 - 15 % metanolia ja 1 % trietyyliamiinia. Tuotet- • · *··.1 ta sisältävät jakeet yhdistetään ja väkevöidään alipai neessa. Saatava ruskehtava öljy liuotetaan pieneen määrään • 1 • 1·· 30 dikloorimetaania ja tuote saostetaan lisäämällä dietyyli- eetteriä. Tuote saadaan valkeana jauheena.
« · · ·" · Saanto: 0, 219 g MS (ES’) : 556, 3 (M - H)‘ *·;·1 Rf: 0,54 (CH2Cl2-MeOH-seos, 8:2) • · · • ♦ · *·· · 46 1 1 7939
Esimerkki 10 4-nitrofenyyli-4-(4,4'-dimetoksitrityylioksi)buty-raatti (Dmt-but-NPE) 4-hydroksivoihapon natriumsuola (1,26 g, 10 mmol) 5 liuotetaan vedettömään pyridiiniin (30 ml) ja liuokseen lisätään 4,4'-dimetoksitrityylikloridia (3,39 g, 3,05 mmol). 16 tunnin kuluttua lisätään 4-nitrofenolia (1,39 g, 10 mmol) ja N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidiä (2,06 g, 10 mmol), ja seosta sekoitetaan lämpötilassa 22 °C vielä 48 10 tuntia. Saostunut disykloheksyyliurea erotetaan suodattamalla ja pestään dikloorimetaanilla, suodos väkevöidään ja saatavalla jäännöksellä toteutetaan kahdesti yhteis-haihdutus tolueenin kanssa. Jäännös puhdistetaan silika-geelipylväässä (10 - 50 % etyyliasetaattia ja 1 % trietyy-15 liamiinia petrolieetterissä). Haluttu yhdiste saostuu lievästi kellertävän öljyn muodossa.
Saanto: 2,694 g MS (FAB, MeOH/NBA/LiCl): 534,2 (M + Li)+, 527,2 (M)+
Rf: 0,34 (petrolieetteri-etyyliasetaattiseos, 75:25) 20 Esimerkki 11
H-Oprg(t)-OH
Tyminyylietikkahappo (3,68 g) liuotetaan kuivaan ··, DMF-.ään (20 ml) ja liuokseen lisätään TOTU:ta (6,65 g) ja • ·· trietyyliamiinia (2,77 ml). Sen jälkeen seosta sekoitetaan * * **‘. 25 30 minuuttia huoneenlämpötilassa ja sitten se lisätään t / hitaasti pisaroittain liuokseen, joka koostuu (3-hydroksi- • t · ί·: ! propyyli) glysiinistä (5,32 g), vedestä (20 ml), DMF:stä Φ « · (20 ml) ja trietyyliamiinista (5,54 ml). Seosta sekoitetaan vielä 1 tunti huoneenlämpötilassa ja sitten se väke- • a ! *.· 30 voidaan pyöröhaihduttimessa alipaineessa. Jäännös sekoite- ;***: taan veteen, pH säädetään 1 N suolahappoliuoksella arvoon • at . 1,5 ja seos uutetaan etyyliasetaatilla. Vesifaasin pH sää- • ♦♦ *,.* detään kylläisellä natriumvetykarbonaattiliuoksella arvoon • a *···’ 5 ja se väkevöidään pyöröhaihduttimessa. Jäännökseen lisä- ί*:'; 35 tään etanolia (250 ml), ja tällöin saostuva natriumkloridi ;***: poistetaan imusuodattamalla. Suodos väkevöidään ja jäännös • ·· : 117939 : 47 puhdistetaan kromatografisesti silikageelillä käyttäen eluenttina dikloorimetaani-metanoli-etyyliasetaattiseosta (10:2:1), johon on lisätty 1 % trietyyliamiinia, ja sen jälkeen dikloorimetaani-metanoli-etyyliasetaattiseosta 5 (10:4:1), johon on lisätty 1 % trietyyliamiinia. Tuotetta sisältävät jakeet yhdistetään ja väkevöidään pyöröhaihdut-timessa alipaineessa. .
Saanto: 3,2 g
Rf: 0,15 [dikloorimetaani-metanoli-etyyliasetaattiseos 10 (10:2:1) + 1 % trietyyliamiinia] MS (ES+) : 300,2 (M + H)+
Esimerkki 12 Dmt-Oprg(t) -OH
H-Oprg(t)-OH (3,2 g) liuotetaan DMF:ään (40 ml), ja 15 liuokseen lisätään trietyyliamiinia (5,93 ml) ja lämpötilassa 0 °C pisaroittain 20 minuutin aikana liuos, joka sisältää DMt-Cl:a (7,25 g) dikloorimetaanissa (40 ml). Seosta sekoitetaan vielä 2 tuntia huoneenlämpötilassa, saostunut trietyyliamiinihydrokloridi poistetaan sitten 20 suodattamalla ja suodos väkevöidään pyöröhaihduttimessa alipaineessa. Jäännös sekoitetaan dikloorimetaaniin ja ;*·,· uutetaan vedellä, ja orgaaninen faasi kuivataan natrium- » · .**. sulfaatilla ja väkevöidään pyöröhaihduttimessa alipainees- ,···. sa. Raakatuote puhdistetaan silikageelillä käyttäen elu- • · 25 enttina dikloorimetaani-metanoli-etyyliasetaattiseosta • · . . (10:2:1), johon on lisätty 1 % trietyyliamiinia. Tuotetta » · » ·“/ sisältävät jakeet yhdistetään ja väkevöidään pyöröhaihdut- • · *···* timessa alipaineessa.
Saanto: 3,46 g • fr : **· 30 Rf: 0,28 [dikloorimetaani-metanoli-etyyliasetaattiseos (10:2:1) + 1 % trietyyliamiinia] ,\ · MS (ES+) : 602,4 (M + H) + ·*· ·..* Esimerkki 13 • ·
*.** H-Obg (t) -OH
IM
V * 35 Tyminyylietikkahappo (2,76 g) liuotetaan kuivaan * · · ί,,,ϊ DMF:ään (15 ml) ja liuokseen lisätään TOTU:ta (4,92 g) ja 117939 48 trietyyliamiinia (2,08 ml). Sen jälkeen seosta sekoitetaan 30 minuuttia huoneenlämpötilassa ja sitten se lisätään hitaasti pisaroittain liuokseen, joka koostuu (4-hydroksi-butyyli)glysiinistä (4,41 g), vedestä (10 ml), DMFistä 5 (10 ml) ja trietyyliamiinista (4,16 ml). Seosta sekoite taan vielä 3 tuntia huoneenlämpötilassa ja sitten se väke-vöidään pyöröhaihduttimessa alipaineessa. Jäännös sekoitetaan veteen, pH säädetään 1 N suolahappoliuoksella arvoon 1,5 ja seos uutetaan etyyliasetaatilla. Vesifaasin pH sää-10 detään kylläisellä natriumvetykarbonaattiliuoksella arvoon 5 ja se väkevöidään pyöröhaihduttimessa. Raakatuote puhdistetaan kromatografisesti silikageelillä käyttäen elu-enttina dikloorimetaani-metanoli-etyyliasetaattiseosta (10:2:1), johon on lisätty 1 % trietyyliamiinia. Tuotetta 15 sisältävät jakeet yhdistetään ja väkevöidään pyöröhaihduttimessa alipaineessa.
Saanto: 3,7 g
Rf: 0,11 [dikloorimetaani-metanoli-etyyliasetaattiseos (10:2:1) + 1 % trietyyliamiinia] 20 MS (ES+): 314,2 (M + H)+
Esimerkki 14 Dmt-Obg (t) -OH
i ·· H-Obg(t)-OH (3,6 g) liuotetaan DMF:ään (40 ml), ja • «e liuokseen lisätään trietyyliamiinia (9,5 ml) ja lämpöti- 4 · ***\ 25 lassa 0 °C pisaroittain 15 minuutin aikana liuos, joka • · 4 · · * * sisältää DMt-Cl:a (15,4 g) dikloorimetaanissa (40 ml).
: Seosta sekoitetaan vielä 2 tuntia huoneenlämpötilassa, m * · siihen lisätään lisää dikloorimetaania (40 ml), saostunut trietyyliamiinihydrokloridi poistetaan sitten suodattamal- i*\. 30 la ja suodos väkevöidään pyöröhaihduttimessa alipaineessa.
.***· Jäännös sekoitetaan dikloorimetaaniin ja uutetaan vedellä, ·«· ,· , ja orgaaninen faasi kuivataan natriumsulfaatilla ja väke- • · · *;4" vöidään pyöröhaihduttimessa alipaineessa. Raakatuote puh- • * *”·* distetaan silikageelillä käyttäen eluenttina dikloorime- 4 mm : 35 taani-metanoli-etyyliasetaattiseosta (15:1:1), johon on lisätty 1 % trietyyliamiinia. Tuotetta sisältävät jakeet 117939 49 yhdistetään ja väkevöidään pyöröhaihduttimessa alipainees-sa.
Saanto: 3,45 g
Rf: 0,29 [dikloorimetaani-metanoli-etyyliasetaattiseos 5 (10:2:1) + 1 % trietyyliamiinia] MS (ES+, LiCl) : 622,3 (M + Li) +
Esimerkki 15 2H-Opeg(t)-OH
Tyminyylietikkahappo (2,76 g) liuotetaan kuivaan 10 DMF:ään (15 ml) ja liuokseen lisätään TOTU:ta (4,92 g) ja trietyyliamiinia (2,08 ml). Sen jälkeen seosta sekoitetaan 30 minuuttia huoneenlämpötilassa ja sitten se lisätään hitaasti pisaroittain liuokseen, joka koostuu (5-hydroksi-pentyyli)glysiinistä (4,83 g), vedestä (10 ml), DMF:stä 15 (10 ml) ja trietyyliamiinista (4,16 ml). Seosta sekoite taan vielä 3 tuntia huoneenlämpötilassa ja sitten se väkevöidään pyöröhaihduttimessa alipaineessa. Jäännös sekoitetaan veteen, pH säädetään 1 N suolahappoliuoksella arvoon 1,5 ja seos uutetaan etyyliasetaatilla. Vesifaasin pH sää-20 detään kylläisellä natriumvetykarbonaattiliuoksella arvoon 5 ja se väkevöidään pyöröhaihduttimessa. Raakatuote puh-·*·,· distetaan kromatografisesti silikageelillä käyttäen elu- i · j*. enttina dikloorimetaani-metanoli-etyyliasetaattiseosta • * * ,···, (10:2:1), johon on lisätty 1 % trietyyliamiinia. Tuotetta * · 25 sisältävät jakeet yhdistetään ja väkevöidään pyöröhaihdut- • · . . timessa alipaineessa.
• · ·
Saanto: 3,34 g • · *···* Rt: 0,19 [dikloorimetaani-metanoli-etyyliasetaattiseos (10:2:1) + 1 % trietyyliamiinia] • '·· 30 MS (DCI) : 328,2 (M + H)+ *.„· Esimerkki 16
.·. : Dmt-Opeg (t) -OH
• ·» ,···[ H-Opeg(t)-OH (3,2 g) liuotetaan DMF:ään (40 ml), ja • · "* liuokseen lisätään trietyyliamiinia (6,77 ml) ja lämpöti- V : 35 lassa 0 °C pisaroittain 15 minuutin aikana liuos, joka \.,ϊ sisältää DMt-Cl:a (9,94 g) dikloorimetaanissa (40 ml).
5° ' · 117939
Seosta sekoitetaan vielä 2 tuntia huoneenlämpötilassa, siihen lisätään lisää dikloorimetaania (40 ml), saostunut trietyyliamiinihydrokloridi poistetaan sitten suodattamalla ja suodos väkevöidään pyöröhaihduttimessa alipaineessa.
5 Jäännös sekoitetaan dikloorimetaaniin ja uutetaan vedellä, ja orgaaninen faasi kuivataan natriumsulfaatilla ja väkevöidään pyöröhaihduttimessa alipaineessa. Raakatuote puhdistetaan silikageelillä käyttäen eluenttina dikloorime-taani-metanoli-etyyliasetaattiseosta (15:1:1), johon on 10 lisätty 1 % trietyyliamiinia. Tuotetta sisältävät jakeet yhdistetään ja väkevöidään pyöröhaihduttimessa alipaineessa.
Saanto: 3,6 g
Rf: 0,27 [dikloorimetaani-metanoli-etyyliasetaattiseos 15 (10:2:1) + 1 % trietyyliamiinia] MS (ES+, LiCl): 636, 4 (M + Li)+ , .
Esimerkki 17 5'-ATC GTC GTA TT-(but)-agtc-hex DNA-sekvenssi on osoitettu isoin kirjaimin, PNA- 20 sekvenssi pikkukirjäimin (esimerkki kaaviossa 1 esitetystä rakennetyypistä Xlla). PNA:t syntetisoidaan esimerkiksi ·1·.· DNA-syntetisointilaitteessa Ecosyn D-300 (yhtiö Eppen- • 1 ϊ\φβ dorf/Biotronik, Maintal) tai ABI 380B (yhtiö Applied Bio- ,···, systems, Weiterstadt) . DNA-osan synteesi toteutetaan peri- • · 25 aatteessa tavanomaista fosforiamidiittimenetelmää ja kau- • « . , pallisia syntetisointisyklejä käyttäen. PNA-osan synteti- • # · **·,1 sointia varten peptidien synteesissä käytettävät menetel- • · ’··2 3 mät sovitetaan, kuten jäljempänä selitetään, yhteen DNA- synteesisyklien kanssa.
* • a· • · ··1 * # • · « • · · ··· • · • · ...
··· ··· • · · • · · ♦ 2 ♦ ♦ 3 117939
SI
Kaavio 1 DNA-PNA-hydridimolekyylit Γ 0 h ] U-p-Vv | N—4
S \-0;i A
V7 «V
·'= V
I 0^'N0. B
"ί> 0 »\ j , rs w Vy1 C H j Γ °A{{\ ® U-P-Vv 8 V :
C H j OH
0 nh Kaava XIII
• ♦ ϊ\β (xilla, n = 1) ♦
.***; Kaava XII
··#'· ’ (Xlla, n = 1) • · • · · • · # ···· • 1 · a · • · • · · • · • · • 1 · • · • 1 • ·1 • # • 1 1 • 1· • » ··· • · • 1 • · · · · • · « • 1 · · • · • · ·»· 52 1 1 7 9 3 9
Kaavio 2 PNA-DNA-hydridimolekyy1i H2NX ^ "vJ : p
Ϊ . \ J
: ^ .
-i-y V.
y o^'nn . b
U — P — V \ B u' VoU
w Xj P 'T'\y H\_J y : p °Tx°i : X ) b',-f ·· N— • ·· I u
J··.. P 0H Kaava XI
....: h • · • ·
:.: i Kaava X (Xa, V = O, Xb, V = NH
• · · • · t · c
*·· O
• 1 • · • ·1 * · · * · • · • · • · · ··· • · • 1 » · • 1 * · «· • · · • · · * « · • · • · • · · , 53 117939
Dm t-V\ B ' V,
0 R
; I
J
R5 NR6 Kaava Vili
R5 R6 R2 V
Villa NC-CH2CH2-O- -N(i-C3H7)2 H 0
VIII b CH3 -N(i-C3H7)2 HO
Ville C6H5 -N(i-C3H7)2 H O
VIII d C6H5-C(0)-S(CH2)2-S -N-pyrrolidin-1-yyli HO
Vili e NC-CH2CH2-O- -N(i-C3H7)2 OCH3 O
Vili f NC-CH2CH2-0- -Nii-C3H7)?_H NH
Mm t - V v B ’ '> j
I O
;*· * • *· O ' (OH • · • * · · *
·*". Kaava IX
5 (IXa, V = NH; IXb, V = 0) • · * * · • · · ,··[ jossa n = 1 - 8, edullisesti 1-5, • · • * * s νγ"\ν V·: ]—7 :...: / O-Dmf .:. nc • · · « · «
I.. Kaava XIV
* · « · ·»·
: . V
117939 54
p·^ 0 — Dm I
'.0 /
NC
Kaava XV
: "r" '
___(t .—^ _ Um I
0 H
./
Kaava XVI
3 pmol CPG-kantajaa, jolle on lastattu esimerkin 4 mukaista yhdistettä Mmt-hex-succ (lastattu määrä 91 μιηοΐ/ 5 g), käsitellään perätysten seuraavilla reagensseilla: *. 1: PNA-osan (agtc-hex) synteesi: ; 1·· 1. Dikloorimetaani ·1··}- 2. 3 % trikloonetikkahappoa sisältävä dikloonme- ·;·1: taani • 10 . 3. Asetonitriili (abs.)
,··1. 4. Asetonitriiliin tehty 4-etyylimorfoliinin 3,5 M
liuos (neutralointi) 5. Asetonitriili-DMF-seokseen (9:1) tehty Mmt-
Aeg (ctBuBz)-OH:n (esimerkistä 5) 0,4 M liuos; asetonitrii- t · *·;·1 15 liin tehty ByBOP:n 0,9 M liuos; asetonitriiliin tehty 4- ; etyylimorfoliinin 3,5 M liuos (kytkentäaika 10 minuuttia) 6. Vaihe 5 toistetaan neljästi.
• · · • · 1 ···:.
···'.
* ··· • · · · 117939 55 7. Asetonitriili
Vaiheet 1-7, joita kutsutaan jäljempänä PNA-reak-tiosykliksi, toistetaan kolmesti PNA-osan muodostamiseksi, jolloin vaiheessa 5 käytetään kulloinkin asianomaisen sek-5 venssin edellyttämiä monomeeriyksikköjä (esimerkeistä 5 - 8) .
Kytkentäryhmän liittäminen [agtc-hex (but)-agtc- hex] : 8. Edellä esitetyt vaiheet 1-4 toistetaan.
10 9. N-nitrofenyyli-4-(4,4'-dimetoksitrityylioksi)bu- tyraatti (esimerkistä 10) (105 mg) ja hydroksibentsotriat- soli (27 mg) kahdesti NEM:ssä DMF:ssä 15 tuntia.
10. Pesu DMFrllä 11. Pesu asetonitrillillä 15 12. Dikloorimetaani DNA-osan synteesi [(but)-agtc-hex —» 5'-ATC GTC GTA TT-(but)-agtc-hex]: 13. Asetonitriili (abs.) 14. 3 % trikloorietikkahappoa sisältävä dikloori- 20 metaani 15. Asetonitriili (abs.) ;*·.· 16. 5'-O-dimetoksitrityylitymidiini-3'-(fosforia sisältävä happo)-(β-syaanietyyli)esteridi-isopropyyliami- .···. diitti (10 pmol) ja tetratsoli (50 pmol) abs. asetonitrii- • · "*· 25 Iissä (0,3 ml) ···· ' * ' • · . , 17. Asetonitriili ♦ · ♦ *"/ 18. Seos, joka sisältää 20 % etikkahappoanhydridiä, • * *···* 40 % lutidiinia ja 10 % dimetyyliaminopyridiiniä THF:ssä 19. Asetonitriili • · • *·· 30 20. Jodi [1,3 g THF-vesi-pyridiiniseoksessa, 70:20:5 (V:V:V) ] .·] : Vaiheet 13 - 20, joita kutsutaan jäljempänä DNA- * »· reaktiosykliksi, toistetaan 10 kertaa nukleotidiosan muo- • · *” dostamiseksi, jolloin vaiheessa 16 käytetään kulloinkin • · · V1 35 asianomaista sekvenssiä vastaavaa 51-O-dimetoksitrityyli- • · * • · » · * « · 117939 56 (nukleosidiemäs)-3(fosforia sisältävä happo)-(β-syaani-etyyli)esteridi-isopropyyliamidiittia.
Synteesin päättämisen jälkeen dimetoksitrityyliryh-mä poistetaan, kuten vaiheissa 1 - 3 on esitetty. Oligo-5 meeri irrotetaan kantajasta 1,5 tunnin ammoniakkikäsitte-lyllä ja samalla poistuvat β-syaanietyyliryhmät. Eksosyk-lisiä aminoryhmiä suojäävien ryhmien poistamiseksi ammo-niakkipitoista liuosta pidetään 5 tuntia lämpötilassa 55 °C. Saatavasta 5'-ATC GTC GTA TT-(but)-agtc-hex -raaka-10 tuotteesta (325 OD260) saadaan polyakryyliamidigeelielekt-roforeesin avulla puhdistetuksi 180 OD260· Poistettaessa suolat BiogelR-pylväässä (Biorad-yhtiö) siitä saadaan erittäin puhdasta oligomeeria (50 OD260) ·
Esimerkki 18 15 5'-ATC GTC GTA TT-(Oeg(t))-agtc-hex (esimerkki kaaviossa 2 esitetystä rakennetyypistä Xa; mitä tulee Oeg(t):n selitykseen, vrt. esimerkki 9)
Synteesi toteutetaan vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 17, mutta vaiheessa 9 liitetään tällöin Dtm-voi-20 hapon p-nitrofenyyliesterin sijasta kytkentäyksikkö Mmt-Oeg(t)-OH (esimerkistä 9) vaiheessa 5 kuvatuissa olosuh- :*·.· teissä. Saatavasta 5'-ATC GTC GTA TT- (Oeg (t) )-agtc-hex * · j*.#> -raakatuotteesta (235 OD260) saadaan polyakryyliamidigeeli- .*··. elektroforeesin avulla puhdistetuksi 135 OD260· Poistettaes- • · 25 sa suolat BiogelR-pylväässä (Biorad-yhtiö) siitä saadaan • · erittäin puhdasta oligomeeria (20 OD260) · *".* Esimerkki 19 • Φ *'··* N-ggg g(5'NH-C)T CsCsAs TGG GGSGS T (HSV-l:tä vastaan vaikuttava sekvenssi) (esimerkki kaaviossa 2 esite- ·« : ·· 30 tystä rakennetyypistä XI; s tarkoittaa tiofosfaatti- * * · *...· siltaa; 5'NH-C tarkoittaa 5'-aminosytidylaattiryh- a··;.' .·. : mää; N tarkoittaa aminopäätä) ,···] Synteesi toteutetaan aloittamalla CPG-kantajasta, * · 'V johon on sidottuna 5'-Dmt-tymidiini 3'-päänsä kautta. En- ··· V * 35 sin toteutetaan DNA-osan synteesi esimerkissä 17 kuvatulla tavalla (vaiheet 13 - 20), jolloin tiofosfaattisiltojen (s) 57 117939 tapauksessa hapetus (vaihe 20) tehdään tetraetyylitiouraa-midisulfidillä (TETD; yhtiön Applied Biosystems Inc. julkaisema User Bulletin nro 65). Kytkentäyksikkönä käytetään Dmt-suojattua 5'-amino-5'deoksisytidylaatti-3'-fosforiami-5 diittiyksikköä, jolla on kaava VHIf. Sen jälkeen konden-soidaan PNA-yksiköt esimerkissä 17 esitettyjä vaiheita 1 -7 vastaavalla tavalla. Synteesin päättämisen jälkeen oli-gomeeri irrotetaan kantajasta 1,5 tunnin ammoniakkikäsit-telyllä ja samalla poistuvat β-syaanietyyliryhmät. Ekso-10 syklisiä aminoryhmiä suojaavien ryhmien poistamiseksi am-moniakkipitoista liuosta pidetään 5 tuntia lämpötilassa 55 °C. Vasta sitten poistetaan monometoksitrityyliryhmä käsittelemällä oligomeeria 2 tuntia 80-%:isella etikkaha-polla lämpötilassa 22 °C. Tuote puhdistetaan polyakryyli-15 amidigeelielektroforeesin avulla ja siitä poistetaan suolat BiogelR-pylväässä (Biorad-yhtiö).
Esimerkki 20 5' -GneGMeG GCT CCA (Oeg(t))gg ggg t-hex (esimerkki kaaviossa 2 esitetystä rakennetyypistä Xa; μθ tar- 20 koittaa metyylifosfonaattisiltaa; mitä tulee
Oeg(t):n selitykseen, vrt. esimerkki 9) :1·,· Synteesi toteutetaan vastaavalla tavalla kuin esi- • · merkissä 18, mutta metyylifosfonaattisiltojen (Me) muodos- ,···. tamiseksi DNA-reaktiosyklissä käytetään vastaavia metyyli- • · t“\ 25 fosfonaattiyksikköjä, joilla on kaava VHIb.
» . . Esimerkki 21 * · · "1.1 5' -Cs,sAs,sC GTs,sT GAG (but) Ggg cat-hex (c-myc-anti- • · *···’ sense) (esimerkki kaaviossa 1 esitetystä rakennetyypistä Xlla; s,s tarkoittaa ditiofosfaattisiltaa) ·· : 1·· 30 Synteesi toteutetaan vastaavalla tavalla kuin esi- • 1 « merkissä 17, mutta ditiofosfaattisiltojen muodostamiseen .1. : käytetään yksikköä VHId ja kyseisissä kohdissa hapetus • m m J./ (vaihe 20) tehdään TETD:llä.
• · ·♦· ··· • ♦ · ♦ · « · « • · • 1 ♦ ·· 117939 58
Esimerkki 22 N-cga g(5'NH-A)A CAT CA (Oeg(t)ggt cg-hex (c-fos-antisense) (5'NH-A tarkoittaa 5'-amino-5'-deoksi-adenosylaattiryhmää; mitä tulee Oeg(t):n selityk-5 seen, vrt. esimerkki 9)
Synteesi toteutetaan vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 18, jolloin DNA-synteesin päätyttyä kondensoidaan esimerkkiä 13 vastaavalla tavalla 5'-aminonukleotidi, joka mahdollistaa toisen PNA-osan konjugoinnin. Ensin toteute-10 taan siis kuusi PNA-synteesisykliä ja sitten liitetään kytkentäyksikkö (esimerkistä 9) . Sen jälkeen toteutetaan DNA-synteesisyklit, jolloin viimeisessä syklissä käytetään kaavan VUIf mukaista rakenneyksikköä. Sen jälkeen kun on toteutettu vielä neljä PNA-synteesisykliä, suoritetaan 15 irrotus kantajasta ja jatkokäsittely esimerkissä 19 kuvatulla tavalla.
Esimerkki 23 F-cga g (5'NH-A) A CAT CAT GGT sCsG-0-CH2CH (OH) CH2-0-C16H33 (5'NH-A tarkoittaa 5'-amino-51 -deoksiadenosy- 20 laattiryhmää; F tarkoittaa PNA:n aminopäässä si jaitsevaa fluoreseiiniryhmää; s tarkoittaa tiofos- :*·.· faattisiltaa) • · j*.^ Synteesi toteutetaan vastaavalla tavalla kuin esi- • ,··*, merkissä 19 mutta aloittamalla CPG-kanta j asta, johon on 25 sidottuna glyseroliheksadekyylieetteri. 12 DNA-synteesi- • * . . syklin toteutuksen jälkeen kondensoidaan kytkentäyksikkö "*/ VUIf. Sen jälkeen kun on toteutettu vielä neljä PNA-syn- • · *···* teesisykliä ja poistettu pääteasemassa sijatseva Mmt- ryhmä, voidaan vapaat aminoryhmät muuntaa kvantitatiivi-
M
: *” 30 sesti 30-kertaisella ylimäärällä fluoreseiini-isotiosya- ·...* naattia (FITC) .
• · * * · • * • · t · · « · • · * * · ····· * * · • * · • · ♦ • · *#* 117939 59
Esimerkki 24 3'-CCC TCT T-5'-(PEG)(PEG)-(Oeg(t)tg tgg g-hex (PEG tarkoittaa tetraetyleeniglykolifosfaattiryhmää)
Synteesi toteutetaan, mitä PNA-osaan tulee, vastaa-5 valla tavalla kuin esimerkissä 17. Sen jälkeen kun on kon-densoitu kuusi PNA-yksikköä, liitetään Mmt-Oeg(t)-OH (esimerkistä 9) . Kytkentäryhmäksi kondensoidaan ensin, kuten DNA-synteesisyklissä on esitetty, kahteen kertaan kaavan XV mukainen tetraetyleeniglykolijohdos, ennen kuin toteu-10 tetaan DNA-osan synteesi päinvastaista orientointia (5' — päästä 3'-päähän) käyttäen. Sitä varten DNA-synteesisyk-leissä käytetään vaiheessa 16 nukleosidi-3'-fosforiami-diittien sijasta aina vastaavia kaavan XIV mukaisia nuk-leosidi-5'-fosforiamidiitteja, joita on kaupan. Lisäksi 15 tehtävä suojausten poisto ja loppukäsittely toteutetaan esimerkissä 17 kuvatulla tavalla.
Esimerkki 25 N-ccc tct t- (C6-link) (PEG) -3' -AAG AGG G-5' (PEG tarkoittaa tetraetyleeniglykolifosfaattiryhmää; C6-20 link on 6-aminoheksanolifosfaattiryhmä)
Synteesi toteutetaan vastaavalla tavalla kuin esi- i*·.· merkissä 17 (DNA-synteesisykli) mutta aloittamalla CPG- • · kantajasta, johon on sidottuna 31-O-Dmt-deoksiguanosiini .···, 5' -O-sukkinaattiryhmän kautta. Sen jälkeen kun on konden- • · 25 soitu kuusi DNA-yksikköä kaavan XIV mukaisia rakenneyksik- • · . , köjä käyttäen, kondensoidaan kytkentäryhmäksi ensin yhteen • · · kertaan kaavan XV mukainen tetraetyleeniglykolijohdos, • * ’*··' ennen kuin C6-link-ryhmän aikaansaamiseksi liitetään kaa van XVI mukainen fosforiamidiitti. Lisäksi tehtävä suo- ·· : ’·· 30 jausten poisto ja loppukäsittely toteutetaan esimerkissä ··« :,,,ϊ 19 kuvatulla tavalla.
* : Esimerkki 26 • · · .·*·* 5'-TTT TTT TTT (but) ttt ttt-hex • « *1* Synteesi toteutetaan vastaavalla tavalla kuin esi- «·· V * 35 merkissä 17. Ennen kuin tuote irrotetaan kantajasta ja ·«· :.,.ί siitä poistetaan suojaukset, puolet kantajaan sidotusta 117939 60 DNA-PNA-hybridistä erotetaan fluorensenssileimausta (esimerkki 27) varten. Toiselle puolelle tehdään suojausten poisto ja loppukäsittely esimerkissä 17 kuvatulla tavalla. Esimerkki 27 5 5'-FAM-TTT TTT TTT (but) ttt ttt-hex (EÄM on fluo- reseiiniryhmä)
Kantajaan sidotulle DNA-PNA-hybridille (esimerkistä 26) tehdään fluorensenssileimaus toteuttamalla vaiheet 13-20 esimerkissä 17 kuvatulla tavalla, jolloin vaihees-10 sa 16 käytetään yhtiön Applied Biosystems valmistamaa fluoreseiinifosforiamidiittia.
Esimerkki 28 5'-GGG GGG GGG (but) ttt ttt-hex
Synteesi toteutetaan vastaavalla tavalla kuin esi-15 merkissä 17. Ennen kuin tuote irrotetaan kantajasta ja siitä poistetaan suojaukset, puolet kantajaan sidotusta DNA-PNA-hybridistä erotetaan fluorensenssileimausta (esimerkki 29) varten. Toiselle puolelle tehdään suojausten poisto ja loppukäsittely esimerkissä 17 kuvatulla tavalla. 20 Otsikon mukainen yhdiste sitoutuu kolmoissäikeen muodostavana oligonukleotidina suurella affiniteetilla DNA-kak-
:1·,· soissäikeeseen, joka sisältää homopuriini jakson 5 '-AAA AAA
• · GGG GGG GGG-3'.
• ·· .···. Esimerkki 29 • · 25 5' -FAM-GGG GGG GGG (but) ttt ttt-hex (FAM on f luo- • » . reseiiniryhmä) *“.1 Kantajaan sidotulle DNA-PNA-hybridille (esimerkis- • · *···1 tä 28) tehdään fluorensenssileimaus toteuttamalla vaiheet 13 - 20 esimerkissä 17 kuvatulla tavalla, jolloin vaihees- ·· : 1·· 30 sa 16 käytetään yhtiön Applied Biosystems valmistamaa • · 1 ί.,,ί fluoreseiinifosforiamidiittia.
• « • 1 · * 1 • » · * · • · · • · · • · · • · · Φ · • · ♦ · Φ m1 117939 61
Esimerkki 30
Biotiini-CpheGpheA GÄA cat ca t(5'NH-G)G(0me)U(0me) C(Ome)G(Ome)-VitE (c-fos-antisense) [N(Ome) tarkoittaa nukleotidiyksikköä N, joka sisältää 2' -O-5 metoksyyliryhmän; phe tarkoittaa fenyylifosfonaatti- siltaa; 5'NH-G tarkoittaa 5'-amino-5'-deoksiguany-laattiryhmää)
Synteesi toteutetaan vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 17 aloittamalla CPG:stä, johon on lastattu vita-10 miinia E [MacKellar et ai., Nucleic Acids Res. 20 (1992), nro 13, 3411 - 11] ja johon liitetään neljään kertaan kaavan Ville mukainen rakenneyksikkö DNA-synteesisyklin mukaisesti. Kaavan VHIf mukaisen 5'-aminonukleotidiyksikön liittämisen jälkeen kondensoidaan kuusi PNA-yksikköä PNA-15 synteesisyklin mukaisesti. Neutraloinnin jälkeen liitetään funktionaaliseen aminoryhmään fosforiamidiitti tunnetulla menetelmällä ja toistetaan DNA-synteesisykli DNA-osan koostumusta vastaavasti, jolloin fenyylifosfonaattisilto-jen tapauksessa käytetään vaiheessa 16 kaavan Ville mukai-20 siä rakenneyksikköjä. Viimeisenä liitetään pääteryhmä yhtiön Glen Research valmistamaa biotiinifosforiamidiittia :*·.· käyttäen. Synteesin päättämisen jälkeen oligomeerista • · poistetaan suojaukset esimerkissä 19 kuvatulla tavalla, • ,···, jolloin lopuksi poistetaan dimetoksitrityyliryhmä käsitte- 25 lemällä oligomeeria 2 tuntia 80-%:isella etikkahapolla • · . lämpötilassa 22 °C.
Esimerkki 31 * · *** A CAT CA (Oeg(t) ggt cg-hex (c-fos-antisense) (mitä tulee Oeg(t):n selitykseen, vrt. esimerkki 9) • · : ** 30 Synteesi toteutetaan vastaavalla tavalla kuin esi- • · · ·,,,· merkissä 18. Tällöin toteutetaan ensin viisi PNA-synteesi- : sykliä ja sitten liitetään kytkentäyksikkö Oeg(t) (esimer- • · ,···. kistä 9) . Sen jälkeen toteutetaan kuusi DNA-synteesisyk- • · liä. Tämän jälkeen suoritetaan irrotus kantajasta ja jät- ··· ·.* * 35 kokäsittely esimerkissä 18 kuvatulla tavalla.
• · · • * • · ··· 62 117939
Esimerkki 32 A TAA TG (Oeg(t) tct cg-hex (vertailuoligomeeri c-fos:lie)
Synteesi toteutetaan vastaavalla tavalla kuin esi-5 merkissä 18. Tällöin toteutetaan ensin viisi PNA-synteesi-sykliä ja sitten liitetään kytkentäyksikkö Oeg(t) (esimerkistä 9). Sen jälkeen toteutetaan kuusi DNA-synteesisyk-liä. Tämän jälkeen suoritetaan irrotus kantajasta ja jatkokäsittely esimerkissä 18 kuvatulla tavalla.
10 Esimerkki 33 a cat cat ggt cg-hex (c-fos-antisense) Tämä puhdas PNA-oligomeeri valmistettiin vertailu-yhdisteeksi esimerkkiä 18 vastaavalla tavalla mutta sillä poikkeuksella, että toteutettiin 12 PNA-sykliä. Eksosyk-15 lisiä aminoryhmiä suojaavat ryhmät poistetaan ammoniakki-pitoisessa liuoksessa (5 tuntia lämpötilassa 55 °C) . Vasta sitten poistetaan monoraetoksitrityyliryhmä käsittelemällä oligomeeria 2 tuntia 80-%:isella etikkahapolla lämpötilassa 22 1>C.
20 Esimerkki 34 A (5-hexy-C)A(5-hexy-G) (5-hexy-C)A (Oeg(t) ggt cg- hex (c-fos-antisense) (mitä tulee Oeg(t) ;n selityk- *\# seen, vrt. esimerkki 9; 5-hexy-C tarkoittaa 5-hek- ,··1, synyylisytidiiniä; 5-hexy-U tarkoittaa 5-heksynyy- .1[]; 25 liuridiinia) • # , . Synteesi toteutetaan vastaavalla tavalla kuin esi- • 1 1 * 1 1 merkissä 31, mutta kondensaatioreaktiossa käytetään täi- • 1 ’···1 löin normaalien pyrimidiinifosforiamidiittien sijasta asian mukaisia (5-heksynyylipyrimidiininukleosidi)fosforiamidiit- ·· :’·· 30 teja.
• · · • · • · • · φ • # * · · * · · • 1 » · · * · • 1 ««« • · · • · · * · · * · 1 * · • · ·»« 63
Esimerkki 35 117959 5'-FAM-TT (but) ttt ttt-hex (FAM on fluoreseiini- ryhmä) Tämän PNA-DNA-oligomeerin syntetisointi toteutetaan 5 esimerkissä 27 kuvatulla tavalla, jolloin tosin kondensoi-daan ainoastaan kaksi tymidylaattiyksikköä.
Esimerkki 36 taa tae gae tea cta (5ΉΝ-Τ) (5'HN-T tarkoittaa 51-amino-51-deoksitymidiiniä) 10 Tämä PNA-DNA-oligomeeri, joka koostuu 15 PNA-yksi- köstä ja yhdestä nukleosidiyksiköstä, valmistettiin aluk-keeksi DNA-polymeraasireaktiota varten. Tällöin aloitetaan kiinteäfaasikantajasta (aminoalkyyli-CPG), johon on sidottuna 5’-monometoksitrityyliamino-5’-deoksitymidiini sukki-15 naattina 3'-asemassa sijaitsevan hydroksyyliryhmänsä kautta. Sen jälkeen kun monometoksitrityyliryhmä on poistettu 3 % TCA:ta sisältävällä dikloorimetaanilla toteutetaan 15 PNA-sykliä esimerkissä 17 kuvatulla tavalla. Eksosyklisiä aminoryhmiä suojaavat ryhmät poistetaan ammoniakkipatoi-20 sessa liuoksessa (5 tuntia lämpötilassa 55 °C) . Vasta sitten poistetaan monometoksitrityyliryhmä käsittelemällä oligomeeria 2 tuntia 80-%:isella etikkahapolla lämpötilas- * · • *.t< sa 22 °C. Saadaan aikaan PNA-DNA-oligomeeri, joka sisältää • .·*·. 3'-asemassa vapaan hydroksyyliryhmän ja toimii DNA-poly- 25 meraasin (Klenow) alukkeena.
• * • . Esimerkki 37 • ♦ ♦ **!.* ps~rA(2'5 ') rA(2'5') rA(2'5' ) rA-väliryhmä- (Oeg(t) te • · **·* ete ctg cgg-hex [ps tarkoittaa 5 ' -tiofosfaattiryh- mää; väliryhmä tarkoittaa trietyleeniglykolifos- l ** 30 faattia; rA on riboadenylaatti; (2'5') tarkoittaa • · · sitä, että nukleotidien välinen sidos on muodostu- .*. : nut riboosin 2'- ja 5'-aseman välille] • «* ,···. Tämän yhdisteen syntetisointi toteutetaan vastaa- “* valla tavalla, kuin esimerkissä 18 on kuvattu, kondensoi- * · · V * 35 maila ensin 14 PNA-yksikköä. Sen jälkeen kun on liitetty • · · kytkentäyksikkö Mmt-Oeg (t) -OH (esimerkistä 9) vaiheessa 5 117939 64 kuvatuissa olosuhteissa, Mmt-ryhmä poistetaan 3-%:isella TCA:lla ja molekyyliin liitetään väliryhmä käyttämällä kaupallista välikefosforiamidiittia Dmt-O-(CH2CH2O) 3-0-P (-OCH2CH2CN) N (1-C3H7) 3 (yhtiö Eurogentech, Bryssel).
5 (2'5')-kytketty tetra-adenylaatti muodostetaan esimerkissä 17 kuvatulla tavalla kaupallisen N6-bentsoyyli-5'-O-Dmt-3'-0-(t-butyylidimetyylisilyyli)adenosiini-2'-0-syaani-etyylidi-isopropyyliaminofosforiamidiitin (Milligen-yhtiö, Bedford, Yhdysvallat) avulla, jolloin kondensaatioaika 10 pitenee 2x5 minuuttiin. Tetratsolin sijasta liittämis-reaktiossa käytetään tehokkaampaa aktivointiainetta 5-etyylitiotetratsoli. Viimeisen Dmt-ryhmän poiston jälkeen oligomeerin 5'-0H-ryhmä fosfityloidaan bis(β-syaanietok-si)di-isopropyyliaminofosfäänillä. Sen jälkeen kun on teh-15 ty hapetus TETD:llä, suojausten poisto ammoniakilla ja si-lyyliryhmän poisto fluoridilla saadaan otsikon mukaista yhdistettä, joka stimuloi RNaasi L:ää.
Esimerkki 38
Ps-Co(2'5')Co(2'5')Co(2'5'>Co-väliryhmä-(Oeg(t)te 20 etc ctg cgg-hex [ps tarkoittaa 5'-tiofosfaattiryh- mää; väliryhmä tarkoittaa trietyleeniglykolifos-faattia; Co on kordysepiini (3'-deoksiadenosiini); ·1·.. (2'5') tarkoittaa sitä, että nukleotidien välinen .··1. sidos on muodostunut 2'- ja 5' -aseman välille]
Mt1 25 Synteesi toteutetaan vastaavalla tavalla kuin esi- • · ; ^ merkissä 37, mutta N6-bentsoyyli-5 ' -0-Dmt-3 ' -0- (t-butyyli- • · · *!!,1 dimetyylisilyyli) adenosiini-2 ' -O-syaanietyylidi-isopropyy- • « *·2 3 liaminofosforiamidiitin sijasta käytetään vastaavaa N6- bentsoyyli-5'-0-Dmt-kordysepiini-2'-0-syaanietyylidi-iso-‘ ” 30 propyyliaminofosforiamidiittia (Chemogen-yhtiö, Konstanz)
• M
:...· ja fluoridikäsittely jätetään pois.
* 1 • · · • · · ··· • · * · ··1 • · · • · · · · • « 2 • » 3
Esimerkki 39 . 65 117939 5'-GG GGG GGG (Oeg(t)) ttt ttt ttt-hex
Synteesi toteutetaan vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 18, jolloin yhdeksän PNA-kytkennän jälkeen kon-5 densoidaan kytkentäyksikkö Mmt-Oeg(t)-OH (esimerkistä 9) vaiheessa 5 kuvatuissa olosuhteissa, joka yksikkö mahdollistaa kahdeksan gyanulaattiryhmän kondensoinnin sen jälkeen. Tuloksena oleva PNA-DNA-oligomeeri sitoutuu kolmois-säikeen muodostavana oligonukleotidina suurella affinitee-10 tiliä DNA-kaksoissäikeeseen, jossa esiintyy sekvenssi 5'..AAAAAAAAAAGGGGGGGG..3’, antiparalleelisti orientoituneena.
Esimerkki 40 PNA-DNA-hybridien karakterisointi 15 Karakterisointi tehdään HPLC:n, polyakryyliamidi- geelielektroforeesin (PAGE) ja negatiivisiin ioneihin perustuvan elektronisuihkumassaspektrometrian (ES-MS”) avulla. Tuotteet puhdistetaan edellä kuvatulla tavalla, ja sen jälkeen ne esiintyvät PAGE:ssa (20 % akryyliamidia, 2 % 20 bisakryyliamidia ja 7 mol ureaa/1) yhtenäisenä vyöhykkeenä. HPLC-ajot tehdään Merck-yhtiön valmistamissa käänteis- : faasipylväissä RP-18 (eluentti A: 0,1 % TFArta sisältävä • · · • · vesi, eluentti B: vesi-asetonitriiliseos suhteessa 1:4; • «t lineaarinen gradientti) tai Dionex-yhtiön valmistamassa *’1, 25 PA-100-pylväässä (eluentti A: 20 mmol NaOH:a/l ja 20 mmol
NaCl:a/l, eluentti B: 20 mmol NaOH:a/l ja 1,5 mol • · 2 ·1··2 ; NaCl:a/l; lineaarinen gradientti). ES-MS'-spektrin ajoa • · 1 *...: varten PNA-DNA-hybridit muunnetaan ammoniumasetaat illa saostamalla tai muulla suolanvaihdolla ammoniumsuoloiksi.
• · • 2.. 30 Näyte otetaan liuoksesta, joka sisältää oligomeeria :3: (5 OD26o/ml) asetonitriili-vesiseoksessa (1:1). Menetelmän • · · .1 . tarkkuus on noin ±1,5 daltonia.
• · · • · · • · »mm· • 1 * · • · · • 1 · • » · « » · · · • 1 2 • · 3 • · · 117939 66
Esimerkki 41
Soluunoton ja stabiilisuuden määritys radioaktiivisen leimauksen jälkeen Radioaktiivinen leimaus 5 Yleisesti käyttökelpoinen leimaus 35S~isotoopilla tapahtuu niin, että DNA-osaa syntetisoitaessa toteutetaan DNA-synteesisyklin aikana ainakin yksi hapetus (vaihe 20 esimerkissä 17) alkuainerikki-35:llä. PNA-DNA-hybridit, joissa esiintyy 5'-asemassa vapaa hydroksyyliryhmä, voi-10 daan leimata polynukleotidikinaasin avulla 32P:llä tai 35S:llä sinänsä tunnetuin menetelmin. PNA-DNA-hybridit, joissa esiintyy 3'-asemassa vapaa hydroksyyliryhmä, voidaan leimata 3'-terminaalisella transferaasilla tunnetulla tavalla. Tässä esitetään esimerkkinä DNA-osan 5'-leimaus. 15 Esimerkin 17, 18 tai 26 mukainen PNA-DNA-hybridi (500 pmol), joka sisältää 5'-asemassa vapaan hydroksyyli-ryhmän, liuotetaan veteen (425 μΐ), liuos kuumennetaan lämpötilaan 90 °C ja jäähdytetään äkkiä. Sitten lisätään lOx kinaasipuskuria (50 μΐ) ja gamma-[32P]ATP:tä tai gamma-20 [35S]ATP:tä (50 μΐ, 6000 Ci/mmol) ja liuosta inkuboidaan 1 tunti lämpötilassa 37 °C. Reaktio pysäytetään lisäämällä j*.J 0,5 M EDTA-liuosta. Suolanpoisto tehdään Pharmacia-yhtiön • * ;·. valmistaman NAP -pylvään avulla.
• ·« 4 ,···, Soluunoton määritys * · 25 Vero-soluja inkuboidaan 96-syvennyksisillä mikro- . , maljoilla DMEM:ssä, joka sisältää 5 % FCS:ää, 24 tuntia • · · lämpötilassa 37 °C. Sen jälkeen kun elatusalusta on pois-*·..* tettu, solut pestään vielä kahdesti seerumittomalla DMEM:llä. Radioaktiivisesti leimattu oligomeeri (106 sy- • · • *·· 30 käystä/min) laimennetaan leimaamattomalla oligomeerilla :>4*: pitoisuuteen 10 pmol/l seerumissa, ja soluja inkuboidaan .·) . sen kanssa lämpötilassa 37 °C. 1, 7 ja 24 tunnin kuluttua * »· ' !..* otetaan kulloinkin 150 μ1:η näyte (merkintä: supernatantti * · "* 1). Mikromaljojen syvennyksissä olevat solut pestään tuo- V* 35 reellä DMEM:llä (300 μΐ) 7 kertaa, ja yhdistetyistä pesu-:>#4; DMEM:istä (merkintä: supernatantti 2) tehdään mittaus tui- 117939 67 kelaskurilla. Sen jälkeen lisätään trypsiiniliuosta (100 μΐ), odotetaan 30 sekuntia ja poistetaan supernatant-ti. Solujen irrottamiseksi maljasta suoritetaan 3 minuutin inkubointi lämpötilassa 37 °C. Irrotetut solut siirretään 5 Eppendorfin astioihin (koko 1,5 ml) ja niitä sentrifugoi-daan 6 minuuttia nopeudella 2000 kierrosta/minuutti ("su-pernatantti 3"). Kustakin supernatanteista 1 (5 μΐ), 2 ja 3 (0,5 ml) tehdään erikseen mittaus tuikelaskurilla. Mittaustuloksista saadaan lasketuksi oligomeerin soluunotto 10 pikomooleina 100 000 solua kohden, jolloin supernatantti 3 osoittaa soluihin sitoutuneen oligomeerijakeen ja superna-tanttien 1 ja 2 summa soluihin sitoutumattoman oligomeeri-jakeen.
Tulos: 15 Inkubointi Soluunotto (pmol oligomeeria/105 solua)
aika (h) PNA-DNA-hybridi DNA
1 0,25 0,36 7 0,54 0, 57 24 0,75 0,78 20
Oligomeerin stabiilisuutta soluja sisältävässä ;*·.· elatusalustassa koskeva tutkimus * ·
Supernatanttiin 1 (10 μΐ) sekoitetaan 80-%:ista .··*. formamidia (5 μΐ, mukana ksyleeniä/glykolia ja bromifeno- 25 lisinistä) , seos kuumennetaan lämpötilaan 95 °C (5 min) ja • * , . seos laitetaan polyakryyliamidigeelille (20 % akryyliami- "*,* dia, 7 mol ureaa/1) . Sen jälkeen kun geeli on kehitetty • · '···* sähkökentässä, geelissä esiintyvät vyöhykkeet ryhmitellään autoradiografian avulla "stabiiliksi oligomeeriksi" tai n m : *" 30 "hajonneeksi oligomeeriksi" (virheelliset vyöhykkeet).
• · · ·*...* Esimerkin 2 6 mukainen PNA-DNA-oligomeeri on 24 : tunnin inkubointiajan jälkeen 69-%:isesti stabiili ja DNA- ,·.·! oligomeeri 3-%:isesti stabiili.
* · T Esimerkin 31 mukaisen PNA-DNA-oligomeerin puoliin- • ·· V : 35 tumisaika on kyseisissä olosuhteissa 32 h, kun taas vas- • · · taavan DNA-oligonukleotidin puoliintumisaika on noin 2 h.
Esimerkki 42 117939 68
Soluunoton määritys fluoresenssileimauksen jälkeen COS-solujen annetaan kasvaa petrimaljoissa (5 cm) Dulbeccon MEM-elatusalustalla, jota on täydennetty FCS:llä 5 (10 %), kunnes pesäkkeet ovat kasvaneet yhteen. Solut pes tään kahdesti seerumittomalla DMEM:llä. Pintaa raaputetaan petrimaljän keskeltä noin 1 cm2:n alueelta steriilin neulan avulla. Tälle alueelle levitetään tutkittavaa PNA-DNA-oligomeeriliuosta (0,1 mmol/1) . Inkuboidaan CC>2-atmosfäärin 10 alla lämpötilassa 37 °C. Solut tutkitaan fluoresenssimik-roskoopilla 2, 4 ja 16 tunnin kuluttua. Sitä varten solut pestään neljästi seerumittomalla DMEM:llä ja peitetään objektiivilasilla, ja niitä arvioidaan fluoresenssimikro-skoopin tai vaihekontrastin avulla. Vertailukohdaksi PNA-15 DNA-hybridimolekyyleille tutkitaan fluoresenssileimattu PNA (ilman DNA-osaa) F-(but)-tttt ttt-hex. Sen jälkeen kun soluja on inkuboitu 2 tuntia kyseisen PNA:n kanssa, yli 90 % soluista osoittaa merkkejä suurista morfologisista muutoksista ja solukuolemista. Useimmissa soluissa ilmenee 20 vakuolien muodostumista. Plasmamembraanissa, sytosolissa ja tumassa ei ilmene lainkaan PNA:n vastaanottoa. Pelkän .*. ! PNA:n kanssa suoritetun 2 tunnin lisäinkuboinnin jälkeen • · kaikki solut ovat kuolleet. Toisin käy keksinnön mukaisten » ·* ,···. DNA-PNA-oligomeerien tapauksessa. Jo sen jälkeen, kun so- * * 25 luja on inkuboitu 2 tuntia DNA-PNA-oligomeerien kanssa, • · . , ilmenee DNA-PNA-oligomeerien pistemäistä solunsisäistä • · * *;|t: jakautumista. Solut eivät kuole pitemmänkään inkuboinnin • * *···' jälkeen.
Esimerkki 43 • ’·· 30 Sulamislämpötilojen määritys
Sulamislämpötilat määritetään diodijonospektrofoto- .·[ ; metrin HP 8452A, Peltier-elementin HP 89090A ja HP-lämpö- • ·· tilansäätöohjelmaversion B5.1 (Hewlett Packard -yhtiö) • · *" avulla. Mittaus tehdään nostamalla lämpötilaa asteittain • · · : 35 nopeudella 0,5 °C/min ja käyttämällä puskurina liuosta, »·· • · • · ··· ; ; 69 1 1 7939 joka sisältää 10 mmol HEPESiä/1 ja 140 mmol NaCl/1 (pH 7,5). Oligomeeripitoisuus on 0,5 - 1 OD26o/ml.
Esimerkin 17 tai 18 mukaiselle tuotteelle saatu tulos: 5 Tm DNA:ta vastaan 5' -ATC GTC GTA T(Oeg(t)a gtc-hex TM = 51,5 °C 3'-TAG CAG CAT A A T CAG-5' antiparalleeli 5'-ATC GTC GTA T(Oeg(t)a gtc-hex TM < 20 °C 10 5'-TAG CAG CAT A AT CAG-3' paralleeli
5'-ATC GTC GTA TT(but)a gtc-hex TM = 51,0 °C
3'-TAG CAG CAT AA T CAG-5' antiparalleeli
15 5'-ATC GTC GTA TTA GTC-3' TM = 50,5 °C
3'-TAG CAG CAT AAT CAG-5' DNA.DNA antiparalleeli
5'-ATC GTC GTA TT(but)a gtc-hex TM < 20 °C
5'-TAG CAG CAT AA T CAG-3' paralleeli 20
Tm Tm SNA: ta DNA: ta vastaan :1 2 3. Sekvenssi vastaan (T = U) • 1·
. 5' -ACA TCA TGG TCG-3' DNA ap 50,7 °C 48,6 °C
25 3' -TGT AGT ACC AGC-5' • 1 • · • 4 1
:;;t: 5'-ACA TCA tgg tcg-3' (PNA-DNA) ap 54,5 °C 54,7 °C
3'-TGT AGT ACC AGC-5' «·
• ’·· 30 5'-ACA TCA tgg tcg-3' (PNA-DNA) p 20 »C < 20 °C
5'-TGT AGT ACC AGC-3 ' • · · • ...
· · 2 * ··
5'-aca tea tgg tcg-3' PNA ap 58,8 °C 66,6 °C
**:1’ 3'-TGT AGT ACC AGC-5' 3 V : 35
t>#<: 5'-aca tea tgg tcg-3' PNA p 46,3 °C 44,8 °C
117939 70 5'-TGT AGT ACC AGC-3'
5'-ACA TCA TGG TCG-3' S-DNA ap 46,7 °C 43,8 °C
3'-TGT AGT ACC AGC-5' 5 TGG TCG tarkoittaa DNA-osaa, jossa kaikki nukleotidien väliset sidokset ovat tiofosfaatin muodossa. Mitä p:n ja ap:n määritelmiin tulee, ks. sivu 5.
Esimerkki 44 10 Viruksenvastaisen aktiivisuuden testaus
Testattavien aineiden viruksenvastainen vaikutus erilaisia ihmisille tauteja aiheuttavia herpesviruksia vastaan tutkitaan soluviljelmäkoejärjestelyä käyttäen.
Testiä varten apinan munuaissoluja (Vero, 2.105/ml) inoku- 15 loidaan 96-syvennyksisillä mikromaljoilla olevaan seerumi- pitoiseen Dulbeccon MEM-elatusalustaan (5 % naudan sikiön
seerumia, FCS) ja inkuboidaan 24 tuntia lämpötilassa 37 °C
atmosfäärissä, joka sisältää 5 % CCkra. Seerumipitoinen elatusalusta imetään sitten pois ja solut huuhdotaan kah- 20 desti seerumittomalla Dulbeccon MEM-elatusalustalla (ei FCS:ää). Testattavat aineet esilaimennetaan veteen pitoi- j\j suuteen 600 pmol/l ja niitä säilytetään lämpötilassa • · ;·. -18 °C. Testiä varten tehdään lisälaimennuksia Dulbeccon • ·· .···, MEM-elatusalustaan (MEM = Minimal Essential Medium) . Huuh- • · φ"\ 25 dottuihin soluihin lisätään kulloinkin 100 μΐ testattavan • · , . yhdisteen yksittäistä laimennosta yhdessä 100 μ1:η kanssa 1*1 ·*· * seerumitonta Dulbeccon MEM-elatusalustaa (ei FCS:ää) . Sen • * · ' ' • · jälkeen kun soluja on inkuboitu 3 tuntia lämpötilassa 37 °C atmosfäärissä, joka sisältää 5 % C02:a, niihin ruis- ·* : *·· 30 kutetaan herpes simplex -virustyyppiä 1 (ATCC VR733, HSV-1 F -kanta) tai herpes simplex -virustyyppiä 2 (ATCC VR734, .·! : HSV-2 G -kanta) pitoisuuksina, joilla solukasvusto tuhou- * · · tuu täydellisesti 3 vuorokaudessa. HSV-l:n tapauksessa • · infektion voimakkuus on 500 pesäkkeenmuodostusyksikköä V : 35 (PFU) syvennystä kohden ja HSV-2:n tapauksessa 350 PFU/sy- ·*· vennys. Testausseokset sisältävät silloin 0, 04 - 80 pmol 117939 71 testattavaa ainetta/1 MEM:ssä, jota on täydennetty penisilliini G:llä (100 ky/ml) ja streptomysiinillä (100 mg/1). Kaikki kokeet tehdään kaksoismäärityksinä lukuunottamatta vertailukokeita, joita tehdään 8 kutakin maljaa kohden.
5 Testiseoksia inkuboidaan 17 tuntia lämpötilassa 37 °C atmosfäärissä, joka sisältää 5 % CCkia. Testattavien aineiden sytotoksisuus määritetään 20 tunnin kokonaisinku-bointiajan jälkeen arvioimalla soluviljelmiä mikroskoop-pisesti. Suurimmalla siedettävissä olevalla annoksella 10 (DTM) tarkoitetaan valmisteen suurinta pitoisuutta, joka ei mainituissa koeolosuhteissa aiheuta vielä mitään mikroskoopilla havaittavissa olevia soluvaurioita. Määritystä varten lisätään sellainen määrä FCS:ää, että sen lopulliseksi pitoisuudeksi tulee 4 %, ja inkubointia jat-15 ketään vielä 55 tuntia lämpötilassa 37 °C atmosfäärissä, joka sisältää 5 % CO2: a. Käsittelemättömät vertailuinfekt-iot osoittavat sitten täyden sytopaattisen vaikutuksen (CPE). Mikroskooppisen arvioinnin jälkeen soluviljelmät värjätään sitten neutraalilla punaisella värillä Finterin 20 vitaalivärjäysmenetelmää (1966) vastaavalla tavalla. Testatun aineen viruksenvastainen vaikutus määrillään inhibi- :1 2 3·.· toriseksi minimipitoisuudeksi (MIC), joka vaaditaan, jotta * · i1. 30 - 60 % soluista saadaan suojatuksi viruksen sytopato- • 1 .♦··. geeniseltä vaikutukselta. PNA-DNA-kimeerien aktiivisuus on • · 25 aina parempi kuin vastaavien DNA-oligomeerien tai PNA-oli- • ♦ * . gomeerien.
• ♦ · • · · ♦ · · • · • · ♦·· • · • ♦· ··· • · * · ·«· • ♦ • · · • 1« • · • 1 1 ♦ · ♦ ♦ »· · ♦ • ·· • ♦ · ♦ 1 ♦ · · • · 2 • · 3 . 72 117939
Esimerkki 45
Aktiivisuuden in vivo määritys: c-fos-proteiinin ilmentymisen inhibitio rotassa ' Määritys tehdään, kuten Sandkuhler et ai. ovat ku- 5 vanneet lähteessä Proceedings of the VIth World Congress on Pain, toimittajat Charlton ja Woolf, Elsevier, Amsterdam 1991, s. 313 - 318, selkäydinperfuusion avulla. Barbituraatilla nukutetuille Sprague-Dawley-rotille tehdyn la-minektomian jälkeen muodostetaan silikonista kaksikammioi-10 nen säiliö antisense-oligomeerin soluunottoa varten. Toinen kammio täytetään antisense-PNA-DNA-johdoksella, kun taas toinen kammio täytetään vertailuoligomeerilla (kummankin väkevyys 75 pmol/l). Perfusaatti vaihdetaan aina tunnin välein. 6 tunnin perfusoinnin jälkeen c-fos:n il-15 mentymistä stimuloidaan takajalkojen lämpökäsittelyllä (52 °C). c-fos:n ilmentymisen inhibitio voidaan todeta immuunihistokemiallisesti asianmukaisilla kudosleikenäyt-teillä. Esimerkin 31 mukainen c-fos-antisense-oligonukleo-tidi saa aikaan c-fos:n ilmentymisen voimakkaamman inhibi-20 tion kuin vastaava DNA-oligonukleotidi ja vastaava esimerkin 33 mukainen PNA-oligomeeri.
:*·,· Esimerkki 46 ♦ · Ϊ*. RNaasi H -määritys • I* .·*·, RNaasi H -aktiivisuuden määritystä varten tutkitta- • · 25 va PNA-DNA-oligomeeri (1,3 OD) liuotetaan yhdessä komple- • * . , mentaarisen RNA-sekvenssin (0,5 OD; kohdesekvenssi) kanssa t « i autoklavoituun veteen (50 μΐ), joka on käsitelty DEPC:llä • · ’···* (dietyylipyrokarbonaatilla), kuumennetaan 5 minuutiksi lämpö tilaan 80 °C ja jäähdytetään sen jälkeen 15 minuutin kulu- ·· : ’·· 30 essa lämpötilaan 37 °C. Näin saadaan molemmat oligomeerit • · * :#<>ϊ aluksi denaturoiduiksi, ja jäähdytyksen jälkeen oligomee- : rit muodostavat sekvenssispesifisellä tavalla nukleiini- « · · ..·/ happokaksoissäikeen.
* · *1* Testiä varten kyseistä RNA.PNA-DNA-kaksoissäiettä • t· V : 35 inkuboidaan RNaasi H:lie soveltuvan lOx puskurin (10 μΐ), • · · ϊ.,.ϊ ditiotreitolin (DTT, 1 μΐ) ja USB-yhtiön valmistaman RNaa- 117939 73 si H:n (2 μΐ, joka vastaa kymmentä yksikköä) kanssa. Inku-bointiseosta täydennetään autoklavoidulla, DEPC:llä käsitellyllä vedellä halutun kokonaistilavuuden 100 μΐ saavuttamiseksi. Näytteitä inkuboidaan lämpötilassa 37 °C. Kine-5 tiikkatutkimusta varten liuoksesta otetaan näytteet hetkellä 0 sekä 2 minuutin, 10 minuutin ja 1 tunnin kuluttua (kunkin suuruus 20 μΐ), ne kuumennetaan 5 minuutiksi lämpötilaan 95 °C ja pidetään lämpötilassa -70 °C analysointiin saakka. RNaasi H:n aikaansaama RNA:n pilkkoutuminen 10 tutkitaan geelielektroforeettisesti. Ilmeni, että deoksi-ribonukleotidiyksikköjä sisältävät PNA-DNA-hybridit aktivoivat RNaasi H:n, jolloin komplementaarinen RNA-säie pilkkoutuu, kun taas PNA-DNA-oligomeeri selviytyy reaktiosta intaktina. PNA-DNA-oligomeerin tapauksessa pilkkou-15 tumisreaktio tapahtuu jonkin verran hitaammin kuin vastaavan oligodeoksiribonukleotidin tapauksessa, jolla on sama pituus ja sekvenssi.
Esimerkki 47
HeLa-solu-uutteen valmistus, jossa esiintyy RNaasi 20 L -aktiivisuutta
Solujen endoribonukleaasi L:n aktiivisuuden kohot- :*.· tamiseksi 2 ', 5'-tetra-adenylaatti-PNA-DNA-konjugaateilla vai- • · • \e mistettiin HeLa-solu-uute. Sitä varten 35 pulloon, joissa • .*·*. kussakin on 20 ml elatusalustaa, joka sisältää Dulbeccon 25 MEM-elatusalustaa (Minimum Essential Medium) ja 10 % • · .^ FCS:ää (naudan sikiön seerumia). Solut voidaan kerätä tai- • · * teen trypsiinikäsittelyn avulla. Nopeudella 1 000 kierros- » · *···* ta/minuutti sentrifugoinnin jälkeen saadaan kerätyksi 4 ml soluja. Niihin lisätään ensin 4 ml vettä ja 3 minuutin ku- ·* : *·* 30 luttua 4 ml puskuriliuos A:ta (5,48 g HEPESiä, 15,5 g • * · ·.„* KCl:a, 2,488 g Mg-asetaattia, 1234 μΐ 2-merkaptoetanolia : ja 1 1 vettä) solujen hajottamiseksi. Sen jälkeen liuosta .···, sentrifugoidaan 30 minuuttia ultrasentrifugissa nopeudella • · *"* 30 000 kierrosta/minuutti (noin 100 000 G) lämpötilan oi- « · · V : 35 lessa 0 °C. Noin 8 ml:n solu-uutesupernatantti erotetaan ja ··· • · • · ··♦ 74 117939 säilytetään lämpötilassa -20 °C seuraavia tutkimuksia varten.
Esimerkki 48 RNaasi L:n aktiivisuuden tutkiminen 5 Valmistetun uutteen endonukleaasi L -aktiivisuuden tutkimiseksi RNA-kohdesekvenssi (0,3 OD) kuumennetaan ensin kulloisenkin PNA-DNA-oligomeerin kanssa 5 minuutiksi lämpötilaan 80 °C ja jäähdytetään sen jälkeen hybridisoin-tia varten lämpötilaan 37 °C. Kaksoissäikeeseen sekoite-10 taan kyseistä uutetta (20 yl), glyserolia (1/2 μΐ) ja RNaasi L -puskuria ja seosta inkuboidaan lämpötilassa 37 °C. Kokonaistilavuus on sen jälkeen 70 μΐ. Kinetiikka-tutkimuksia varten liuoksesta otetaan pipetillä näytteet hetkellä 0 sekä 20 minuutin ja 60 minuutin kuluttua, ja ne 15 kuumennetaan 5 minuutiksi lämpötilaan 95 °C entsyymin de-naturoimiseksi. Näytteet kylmäkuivataan Speedvac-laittees-sa ja analysoidaan geelielektroforeettisesti. PNA-2',5'- tetra-adenylaattikonjugaatit tai niiden tetrakordysepiini-analogit aktivoivat solujen RNaasi L:n, kun taas vastaavat 20 yhdisteet, jotka eivät sisällä tetra-adenylaattiosaa, eivät stimuloi RNaasi L:ää.
:*·.· Esimerkki 49 • * DNA-polymeraasireaktio ♦ .···. DNA-polymeraasireaktiossa templaattina toimii seu- • · 25 raava 81-meerinen oligodeoksinukleotidi:
5 ' -GCC CCA GGG AGA AGG CAA CTG GAC CGA AGG CGC TTG TGG AGA
I * · AGG AGT TCA TAG CTG GGC TCC CTA TAG TGA GTC GTA TTA-3' • · *···* PNA-DNA-alukkeen sekvenssi on seuraava: H-taa tae gae tea eta (5NH-T)-OH-3'.
«» : *·· 30 Vertailualukkeena käytetään vastaavaa oligodeoksi- • * *
ί,.,ί nukleotidia, jonka sekvenssi on 5'-TAA TAC GAC TCA CTA
: TAG-3 ' .
• Φ* lOx PCR-puskurissa [500 mmol KCl:a/l, 100 mmol *ϊ Tris.HCl:a/l (pH 9), 1 % Triton X-100:aa, 15 mmol V* 35 MgCl2:a/l] oleva aluke (0,15 nmol) ja templaatti (0,15 *·· nmol) laimennetaan vedellä (35 μΐ) ja hybridisoidaan kuu- 117939 75 raentamalla lämpötilaan 95 °C ja jäähdyttämällä. Sitten lisätään 2 mM dNTP-seosta (nukleosidi-5'-trifosfaatteja; 10 μΐ) ja DNA-polymeraasia (Klenowin fragmenttia; 3 μΐ) ja inkuboidaan 0,5 tuntia sekä lämpötilassa 22 °C että 37 °C.
5 Reaktioliuos analysoidaan sitten 10-%:isella polyakryyli-amidigeelillä (joka sisältää 1 % bisakryyliamidia). Mark-keriksi lisätään pBR322-HaeIII-pilkkomisseosta. Reaktio vertailualukkeen kanssa antaa tulokseksi kaksisäikeisen DNA-fragmentin, jolla on odotettu suuruus suhteessa mark-10 keriin, kun taas PNA-DNA-alukkeesta syntyvä tuote liikkuu jonkin verran nopeammin. Molemmissa tapauksissa kaksois-säie liikkuu geelielektroforeesissa oleellisesti nopeammin kuin yksisäikeinen templaatti.
Φ · • · · φ · · • · ·· • φφ « • · · « • ♦ ··· • · • · · ··· ··· · .
·«· · • φ φ1φ ΙΦ • 1 φ φφ **» • φ φ φφφ φ • · • · φ • ·· φφφ φ · ® · φφφ φ φφφ φ·· ...
• · 1 φ # φ φ φ φ··

Claims (11)

1. Polyamidi-oligonukleotidijohdokset, joilla on kaava (Ib), 5 / r—--CH.-CHj-N -M.C — C- ( 0 ' )---(Uj) 1 11 2 o-c o R i.. M 1 "'M I-(Mu).-- \ L ‘ r i r Λ ( l· i 4 ) CHj-CHj-M ~HjC C- (0->„---(LIj) I II o-c o * f“‘ .-G Cbl B 0 -{«»)«---r‘ r V* • · • · f *· " tunnettu siitä, että • * i *·· x tarkoittaa lukua 1 ja ϊ.,,ί 10 q = r = ljas = t = 0 tai *:··: r = s = 1 ja q = t = 0 tai :·*· q = r = s = 1 ja t = 0; Ml » R2 tarkoittaa vetyä, hydroksyyliryhmää, Ci-i8_alkok- • · · . syyliryhmää, halogeenia tai atsido- tai aminoryhmää; 15 kukin B tarkoittaa, muista riippumattomasti, nuk- • *· *... leotidikemiassa tavanomaista emästä; * « *"* aaltosulku tarkoittaa sitä, että R2 ja viereinen • · !/·· substituentti voivat sijaita 2'- ja 3'-asemassa tai myös päinvastoin 3'- ja 2'-asemassa; ··· ,*5·^ 20 jolloin polyamidirakenne sisältää vähintään yhden * · · nukleosidiemäksen, joka on muu kuin tyrniini; * S ·»· 117939 Nu tarkoittaa ryhmää, jolla on kaava (Ha) tai (Hb) , 5 · 5 » /VB /°vB K W R2 R2 r y u-p-v- u-p —— v- w w (Ilo) (Mb) 's joissa R2 ja B ovat edellä esitettyjen määritelmien mukaisia; U tarkoittaa hydroksyyliryhmää, merkaptoryhmää, .·. : 10 Ci-is-alkyyliryhmää, Ci-is-alkoksyyliryhmäa, C6-2o-aryyliryh- * · · • · ;·. mää, C6_14-aryyli-Ci-8-alkyyliryhmää tai ryhmää NHRJ tai • · * NR3R4; φ · ♦ · ^ ***. R tarkoittaa Ci-ie-alkyyliryhmää tai Ci_4-alkoksi-C1-4- alkyyliryhmää ja * * * ·’·! · 15 R tarkoittaa Ci-is-alkyyliryhmää tai R3 ja R4 muodostavat yhdessä sen typpiatomin kanssa, johon ne ovat sitoutuneet, 5- tai 6-jäsenisen heterosykli- • · | *·· sen renkaan, joka voi lisäksi sisältää toisenkin hetero- :***; atomin, joka voi olla O, S tai N; • · « s] .20 V tarkoittaa oksi-, sulfanidyyli- tai iminoryhmää; • * * W tarkoittaa okso- tai tioksoryhmää; ja ·;*’ Y tarkoittaa oksi-, sulfanidyyli-, metyleeni- tai • « · ! ί: iminoryhmää; : : m - 0 20; ·*·' 78 1 17939 o = O - 20; D' tarkoittaa ryhmää, jolla on kaava (IV), — N — CH3-CH2-N — H,C —C - H I II I o o -c (iv) c H 2 B 5 jossa B on edellä esitetyn määritelmän mukainen; n = 0 - 20; p = 0 - 20; L13 ja Li4 tarkoittavat kukin, toisistaan riippu- 10 mattomasti, kaavan (V) mukaista rakennetta, [(V')“(G)-(G')]e (V) jossa : 15 ε on 1 - 5; * ·· • · :·. kukin V tarkoittaa, muista riippumattomasti, hap- pea, NH-ryhmää, sidosta tai ryhmää, jolla on kaava (VI), • · ·** ♦ ♦ . . U * * * I .·♦·. I *“*’ -Y-P-v- (vi) * · Il ί ·· w • · · : 20 jossa U, V, W ja Y ovat edellä esitettyjen määri-telmien mukaisia; • * * kukin G tarkoittaa, muista riippumattomasti, Οχ_χ2-alkaanidiyyliryhmää, joka voi haluttaessa olla substituoi- * · *···* 25 tu halogeenilla, aminoryhmällä, hydroksyyliryhmällä, Cx-xa- 79 ' 1 1 7939 alkyyliryhmällä, Cx-ig-alkoksyyliryhmällä, C6-i4-aryyliryh-mällä tai C6-i4-aryyli~Ci-i8-alkyyliryhmällä; C6-i4-aryylidi-Ci-12-alkaanidiyyliryhmää tai ryhmää, jonka kaava on (CH2CH20)5CH2CH2, jossa δ voi olla 1 - 11, tai sidosta; ja 5 G' tarkoittaa oksi-, sulfanidyyli- tai iminoryhmää, ryhmää -C(O)- tai -C(0)NH-, sidosta tai kaavan (VI) mukaista ryhmää, jossa U, V, W ja Y ovat edellä esitettyjen määritelmien mukaisia; F ja F' ovat kytkeytyneet yhteen sidoksen välityk-10 sellä ja/tai F tarkoittaa ryhmää R°-(A)k“V- ja F' tarkoittaa kaavassa (Ib) ryhmää V1-(A)i-R1, jossa R° tarkoittaa vetyä, Ci_i8-alkanoyyli-, Ci-i8-alkoksi-karbonyyli-, C3-8-sykloalkanoyyli-, C7-i5-aroyyli- tai C3_i3-15 heteroaroyyliryhmää tai ryhmää, joka edistää oligomeerin soluunottoa tai toimii DNA-koettimen leimausryhmänä tai hybridisoitaessa oligomeeri kohdenukleiinihappoon tarttuu viimeksi mainittuun niin, että tapahtuu sitoutuminen, sil-loittuminen tai pilkkoutuminen; tai k:n ollessa nolla R° 20 on vety tai muodostaa yhdessä V:n kanssa ryhmän, jolla on kaava (VII), • · V • · · » • f · * 1 I • · I « φ I ;···! z—p — z · (vh) Il . . w • · · • 1 · • « · · ·1· *"·1 jossa Z ja Z' tarkoittavat toisistaan riippumatto- 25 masti hydroksyyliryhmää, merkaptoryhmää, Ci-22-alkoksyyli- ί 1· ryhmää, Ci-i8-alkyyliryhmää, C6-2o-atyyliryhmää, C6-i4-aryyli- « · « Ci-is-alkyyliryhmää, Ci_22-alkyylitioryhmää, ryhmää NHR3 tai NR R tai ryhmää, joka edistää oligomeerin soluunottoa tai .···, toimii DNA-koettimen leimausryhmänä tai hybridisoitaessa • · "1 30 oligomeeri kohdenukleiinihappoon tarttuu viimeksi mainit- • 1 1 tuun niin, että tapahtuu sitoutuminen, silloittuminen tai * · · :.,,i pilkkoutuminen; ja 117939 so R3, R4, V ja W ovat edellä esitettyjen määritelmien mukaisia; R1 tarkoittaa vetyä tai ryhmää Q°, jolloin R1 on vety ainoastaan silloin/ kun samanaikaisesti 1 = 0 ja kaavas-5 sa (Ib) q = 1 tai q = r = 0 ja ryhmässä F' = V1-(A) i-R1 V1 on ryhmä V; A tarkoittaa luonnon tai luonnossa esiintymätöntä aminohappoa; Q° tarkoittaa hydroksyyliryhmää tai ryhmää OR', NH2 10 tai NHR'', joissa R' tarkoittaa Ci-ig-alkyyliryhmää ja R' ' tarkoittaa Ci_i8-alkyyliryhmää/ Ci-is-aminoalkyy-liryhmää tai Ci_i8“hydroksialkyyliryhmää; V on edellä esitetyn määritelmän mukainen; ja 15 V1 tarkoittaa sidosta tai ryhmää V, jolloin vain sellaisessa kaavassa (Ib), jossa q = 0 ja r = 1, V1 on aina sidos; k on 0 - 10 ja 1 on 0 - 10; 20 sillä edellytyksellä, että a) jos kaavan (Ib) mukaisessa yhdisteessä t = 0 ja : s = 1, niin Li3 on sidos; ja • * ;·, b) jos kaavan (Ib) mukaisessa yhdisteessä ♦ ·* *... s = t = 0, niin L14 on sidos; • · 25 jolloin kullakin nukleotidilla voi olla D- tai L- konfiguraatio ja emäs voi esiintyä a- tai β-asemassa.
• · · ··· * 2. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset polyamidi-oligo- nukleotidi johdokset, joilla on kaava (Ib), tunnettu siitä, että emäs esiintyy β-asemassa. ·♦ • *♦· 30
3. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisten polyamidi-oligonukleotidijohdosten valmistamiseksi, tun- . nettu siitä, että sopivalla tavalla derivatisoituun kan- • · * I..* tajaan tai kasvavaan oligomeeriketjuun kondensoidaan perä- tysten PNA-yksikkö tai DNA-yksikkö, joka sisältää kulloin- • · * ί#: : 35 kin yhden nukleosidiemäksen. • « · • · * · ··· 117939
1 1 7939
4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaiset polyamidi-oligonukleotidijohdokset tarkoitettuina käytettäviksi lää- ! keaineina.
5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaiset polyamidi-5 oligonukleotidijohdokset tarkoitettuina käytettäviksi lääkeaineina hoidettaessa virusten aiheuttamia sairauksia tai sairauksia, joihin vaikuttavat integriinit tai solu-solu-adheesioreseptorit, syövän hoidossa tai restenoosin ehkäisyssä. 10
6. Lääke, joka sisältää patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaista polyamidi-oligonukleotidijohdosta.
7. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaiset polyamidi-oligonukleotidi johdokset tarkoitettuina käytettäviksi gee-nikoettimina.
8. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaiset polyamidi- oligonukleotidi johdokset, tunnettu siitä, että niissä esiintyy ainakin toisessa päässä nukleosidiyksikkö, joka sisältää 3'-asemassa hydroksyyliryhmän, ja että ne on tarkoitettu käytettäväksi alukkeena.
9. Geenikoetinmääritys oligo- tai polynukleotidi- kohteen (RNA:n tai DNA: n) määrittämiseksi, tunnettu siitä, että käytetään patenttivaatimuksen 7 mukaista gee- • · nikoetinta homogeenisessa tai heterogeenisessa määrityk- • · 1 2 3 *··. sessä. • · *’1, 25
10. Geenikoetinmääritys oligo- tai polynukleotidi- . , kohteen (RNA:n tai DNA:n) määrittämiseksi, tunnettu » · 1 5 siitä, että käytetään patenttivaatimuksen 8 mukaista alu- *··.' kettä.
11. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen geeni- • 1·· 30 koetinmääritys, tunnettu siitä, että kohde määritetään hybridisaation avulla kohteen amplifikaation jälkeen. * · • 1 · ' • · 1 * 1 * 1 ··· · · • · i 2 • · « 3 • · ·1· ' 82 117939
FI20051072A 1994-03-14 2005-10-24 Polyamidi-oligonukleotidijohdoksia, niiden valmistus ja niiden käyttö FI117939B (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4408528A DE4408528A1 (de) 1994-03-14 1994-03-14 Peptid-Oligonucleotid-Derivate, deren Herstellung und Verwendung
DE4408528 1994-03-14

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FI20051072L FI20051072L (fi) 2005-10-24
FI117939B true FI117939B (fi) 2007-04-30

Family

ID=6512694

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI951132A FI117135B (fi) 1994-03-14 1995-03-10 Polyamidi-oligonukleotidijohdoksia, niiden valmistus ja niiden käyttö
FI20051072A FI117939B (fi) 1994-03-14 2005-10-24 Polyamidi-oligonukleotidijohdoksia, niiden valmistus ja niiden käyttö

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI951132A FI117135B (fi) 1994-03-14 1995-03-10 Polyamidi-oligonukleotidijohdoksia, niiden valmistus ja niiden käyttö

Country Status (14)

Country Link
EP (2) EP1113021B1 (fi)
JP (1) JP4620810B2 (fi)
KR (1) KR100416864B1 (fi)
CN (1) CN100379756C (fi)
AT (2) ATE220070T1 (fi)
AU (1) AU698210B2 (fi)
CA (1) CA2144475C (fi)
DE (3) DE4408528A1 (fi)
DK (2) DK0672677T3 (fi)
ES (2) ES2179080T3 (fi)
FI (2) FI117135B (fi)
HK (2) HK1012003A1 (fi)
NO (1) NO314664B1 (fi)
PT (2) PT672677E (fi)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998003542A1 (en) * 1996-07-24 1998-01-29 Buchardt, Dorte Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US6710164B1 (en) 1993-11-22 2004-03-23 Peter E. Nielsen Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US6150510A (en) 1995-11-06 2000-11-21 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Modified oligonucleotides, their preparation and their use
DE4438918A1 (de) * 1994-11-04 1996-05-09 Hoechst Ag Modifizierte Oligonukleotide, deren Herstellung sowie deren Verwendung
DE19502912A1 (de) * 1995-01-31 1996-08-01 Hoechst Ag G-Cap Stabilisierte Oligonucleotide
PT739898E (pt) * 1995-03-13 2002-03-28 Aventis Pharma Gmbh Mono-esteres de acidos fosfonucleicos processo para a sua preparacao e sua utilizacao
DE19532553A1 (de) * 1995-09-04 1997-03-06 Hoechst Ag Verfahren zur Herstellung substituierter N-Ethyl-Glycinderivate
GB2324534B (en) * 1996-01-06 2000-05-10 Danbiosyst Uk Composition for delivery of nucleic acid to a cell
ES2221942T3 (es) * 1996-05-24 2005-01-16 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Reactivo y metodo para inhibir la expresion de n-ras.
IL127244A (en) * 1996-05-31 2005-11-20 Allelix Neuroscience Inc Substituted amines, methods of their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US6191165B1 (en) 1996-05-31 2001-02-20 Allelix Neuroscience Inc. Pharmaceutical for treatment of neurological and neuropsychiatric disorders
DE19637339A1 (de) * 1996-09-13 1998-03-19 Hoechst Ag Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren
DE69829760T3 (de) 1997-09-12 2016-04-14 Exiqon A/S Bi- und tri-zyklische - nukleosid, nukleotid und oligonukleotid-analoga
WO1999034014A2 (en) * 1997-12-23 1999-07-08 Roche Diagnostics Gmbh A method for the determination of a nucleic acid
US5952202A (en) * 1998-03-26 1999-09-14 The Perkin Elmer Corporation Methods using exogenous, internal controls and analogue blocks during nucleic acid amplification
DE19935303A1 (de) 1999-07-28 2001-02-08 Aventis Pharma Gmbh Oligonukleotide zur Inhibierung der Expression von humanem eg5
US6316230B1 (en) * 1999-08-13 2001-11-13 Applera Corporation Polymerase extension at 3′ terminus of PNA-DNA chimera
US7205105B2 (en) 1999-12-08 2007-04-17 Epoch Biosciences, Inc. Real-time linear detection probes: sensitive 5′-minor groove binder-containing probes for PCR analysis
DE10019135A1 (de) 2000-04-18 2001-10-31 Aventis Pharma Gmbh Polyamidnukleinsäure-Derivate, Mittel und Verfahren zu ihrer Herstellung
US7348146B2 (en) 2003-10-02 2008-03-25 Epoch Biosciences, Inc. Single nucleotide polymorphism analysis of highly polymorphic target sequences
WO2005043127A2 (en) 2003-10-28 2005-05-12 Epoch Biosciences, Inc. Fluorescent probes for dna detection by hybridization with improved sensitivity and low background
DE102006034319A1 (de) * 2006-07-21 2008-01-31 Ugichem Gmbh Chirale mit Phosponsäurester- oder Phosphonsäure- substituierte Verbindungen
EP2781523A1 (en) 2013-03-18 2014-09-24 Miltenyi Biotec GmbH Lipophilic oligonucleotide analogs

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0383803B1 (en) * 1987-10-28 2000-05-03 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates
WO1993024511A1 (en) * 1992-05-29 1993-12-09 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates
US5138045A (en) * 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
DK51092D0 (da) * 1991-05-24 1992-04-15 Ole Buchardt Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf
US5646261A (en) * 1992-01-22 1997-07-08 Hoechst Aktiengesellschaft 3'-derivatized oligonucleotide analogs with non-nucleotidic groupings, their preparation and use
IL104461A (en) * 1992-01-22 2001-05-20 Hoechst Ag Oligonucleotide analogs, their preparation and pharmaceutical compositions containing them

Also Published As

Publication number Publication date
DE59510252D1 (de) 2002-08-08
ES2179080T3 (es) 2003-01-16
ATE335760T1 (de) 2006-09-15
JP4620810B2 (ja) 2011-01-26
JPH07278179A (ja) 1995-10-24
HK1038568A1 (en) 2002-03-22
NO314664B1 (no) 2003-04-28
EP1113021A2 (de) 2001-07-04
FI20051072L (fi) 2005-10-24
EP0672677A2 (de) 1995-09-20
EP0672677B1 (de) 2002-07-03
NO950955D0 (no) 1995-03-13
EP0672677A3 (de) 1996-01-17
PT672677E (pt) 2002-11-29
DE59511061D1 (de) 2006-09-21
ATE220070T1 (de) 2002-07-15
DK0672677T3 (da) 2002-10-28
HK1012003A1 (en) 1999-07-23
CN100379756C (zh) 2008-04-09
AU1479895A (en) 1995-09-21
AU698210B2 (en) 1998-10-29
EP1113021A3 (de) 2001-07-11
KR950032265A (ko) 1995-12-20
CA2144475C (en) 2010-06-08
CA2144475A1 (en) 1995-09-15
DK1113021T3 (da) 2006-12-11
DE4408528A1 (de) 1995-09-28
PT1113021E (pt) 2006-12-29
EP1113021B1 (de) 2006-08-09
CN1112126A (zh) 1995-11-22
KR100416864B1 (ko) 2006-01-27
FI951132L (fi) 1995-09-15
FI117135B (fi) 2006-06-30
NO950955L (no) 1995-09-15
ES2269239T3 (es) 2007-04-01
FI951132A0 (fi) 1995-03-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI117939B (fi) Polyamidi-oligonukleotidijohdoksia, niiden valmistus ja niiden käyttö
US7550582B2 (en) Polyamide nucleic acid derivatives and agents, and processes for preparing them
JP3831407B2 (ja) メチルホスホン酸エステル、その製造方法およびその使用
US7485421B2 (en) Polyamide-oligonucleotide derivatives, their preparation and use
AU2001246536B2 (en) Polyamide nucleic acid derivatives, agents and methods for producing the same

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 117939

Country of ref document: FI

MM Patent lapsed