[go: up one dir, main page]

FI117135B - Polyamidi-oligonukleotidijohdoksia, niiden valmistus ja niiden käyttö - Google Patents

Polyamidi-oligonukleotidijohdoksia, niiden valmistus ja niiden käyttö Download PDF

Info

Publication number
FI117135B
FI117135B FI951132A FI951132A FI117135B FI 117135 B FI117135 B FI 117135B FI 951132 A FI951132 A FI 951132A FI 951132 A FI951132 A FI 951132A FI 117135 B FI117135 B FI 117135B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
group
dna
pna
formula
groups
Prior art date
Application number
FI951132A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI951132L (fi
FI951132A0 (fi
Inventor
Eugen Uhlmann
Gerhard Breipohl
Original Assignee
Hoechst Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Ag filed Critical Hoechst Ag
Publication of FI951132A0 publication Critical patent/FI951132A0/fi
Publication of FI951132L publication Critical patent/FI951132L/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI117135B publication Critical patent/FI117135B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/595—Polyamides, e.g. nylon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C07K14/003—Peptide-nucleic acids (PNAs)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Polyamides (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Polyamidi-oligonukleotidijohdoksia, niiden valm niiden käyttö Tämä keksintö koskee uusia polyamidi-oligoi 5 dijohdoksia, joilla on arvokkaita fysikaalisia, b: ja farmakologisia ominaisuuksia. Niitä käytetäär ilmentymisen inhibiittoreina [antisense-oiigonuk! ribotsyymit, koodattavat (sense-) oligonukleotidi moisssäikeen muodostavat oligonukleotidit], k< 10 nukleiinihappojen detek toimi seksi ja apuaineina m< biologiassa.
Oligonukleotideilla on lisääntyvässä määri geenien ilmentymisen inhibiittoreina [G. Zon, Phai cal Research 5 (1988) 539; J. S. Cohen, Topics ii 15 lar and Structural Biology 1989, 12 (Macmillan Pi
Helene ja J. J. Toulme, Biochemica et Biophysica ; (1990) 99; E. Uhlmann ja A. Peyman, Chemical Re (1990) 543]. Antisense-oligonukleotidit ovat nukli pofragmentteja, joiden emässekvenssi on komplemei
20 inhiboitavan mRNA;n suhteen. Kyseiset kohde-mRNA
olla solu- tai virusperäisiä tai peräisin muusta : nisesta lähteestä. Seilulaarisinä kohdesekvensse: :v) vat kysymykseen esimerkiksi reseptorien, soluadh< * » teiinien, entsyymien, immuunimodulaattoreiden, s] . 25 en, kasvutekijöiden, ionikanavien tai onkogeenien / / sit. Virusten lisääntymisen inhibointia antisenj • · « nukleotidien avulla esimerkiksi HBV:n (hepatiitt • · » V * ruksen), HSV-l:n ja HSV-2:n (herpes simplex -viru! 1 ja II), HIV:n (ihmisen immuunikatoviruksen) ja : • · : 30 savirusten tapauksessa on kuvattu. Tällöin käytei 2 siten niiden biologista aktiivisuutta [C. Helene Toulme, Biochemica et Biophysica Acta 1049 {19!
Viruskohteina voidaan tässä yhteydessä mainita esi käänteiskopioijaentsyymi, DNA-polymeraasi ja ti 5 vaattoriproteiinit. Kolmoissäikeen muodostavien c leotidien kohteena on yleensä DNA, ja siihen sitoi sa jälkeen ne muodostavat kolmoiskierrerakenteen. kun antisense-oligonukleotidien avulla yleensä mRNA:n prosessointi (silmukointi) tai sen translaa 10 teiiniksi, kolmoisssäikeen muodostavat oligonul· inhiboivat DNA:n transkriptiota tai replikaati Helene ja J. J. Toulme, Biochemica et Biophysica 2 (1990) 99 - 125; E. Uhlmann ja A. Peyman, Chemical 90 (1990) 543]. On kuitenkin myös mahdollista sit 15 säikeisiä nukleiinihappoja ensimmäisessä hybridin yhteen antisense-oligonukleotidin kanssa, jolloin tuu kaksoissäie, joka sitten toisessa hybridit muodostaa kolmoisssäikeen muodostavan oligonul· kanssa kolmisäikeisen rakenteen. Antisense-alue 20 moissäikeenmuodostusalue voivat tällöin sijaita j dessa eri oligonukleotidissa tai samassa oligonukJ sa. Yksi synteettisten oligonukleotidien lisäsovel ns. ribotsyymit, jotka ribonukleaasiaktiivisuutei • * dosta tuhoavat kohde-RNA:n [J. J. Rossi ja N. 25 TIBTECH 8 (1990) 179; Castanetto et ai., Criti<
Eukar. Gene Expr. 2 (1992) 331].
* f *
Keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan käyt VΣ dossa myös aptameerimielessä. Aptameerit ovat oli siä nukleiinihappoja tai niiden analogeja, jotka • « · 30 vat suurella affiniteetilla proteiineihin. Aptameei • ti e • 4 \r «“» \ \ ^ i-i -I— ^4 wi ^ irs λ λ 4— ^ τ'-v -n +* mi * ^ τ 4— «· a τ t 1 4 h λ 4 «m Ί 1 m *· 11 3 että aptameerin emässekvenssi määritetään seuloma gonukleotidiseos ja kyseinen emässekvenssi siirret ten polyamidi-oligonukleotidianalogeihin. Toinen rr suus on koodittaa aptameerin sitoutuva alue identi 5 helpottamiseksi erillisellä sitoutumattomalla mc osalla [Brenner ja Lerner, PNAS 89 (1992) 5381 - 53 DNA-diagnostiikassa käytetään sopivalla leimattuja nukleiinihappofragmentteja ns. DNA-koe joiden on tarkoitus hybridisoitua spesifisesti det 10 vaan nukleiinihappoon. Uuden kaksoissäikeen sp muodostamista seurataan tällöin leimauksen avul] edullisesti ei ole radioaktiivinen. Tällä tavalla dollista todeta geneettisiä, pahanlaatuisia, viru muiden patogeenien aiheuttamia sairauksia.
15 Luonnossa esiintyvässä muodossaan oligonuk soveltuvat melko huonosti tai ovat täysin sopi useimpiin mainituista sovelluksista. Niinpä niiti muuntaa kemiallisesti, jotta ne täyttävät määräty mukset. Jotta oligonukleotideja voidaan käyttää 20 sissa systeemeissä, esimerkiksi virusten lisääntym hibointiin, niiden on täytettävä seuraavat vaatimuk 1. Niillä täytyy olla in vivo, siis sekä se * * että solujen sisällä, riittävän suuri stabiilisuus.
2. Niiden täytyy olla sellaisia, että ne k • « 25 läpäisemään solu- ja tumakalvon läpi.
• · * . 3. Niiden täytyy sitoutua fysiologisissa • · · ···/ teissä emässpesifisesti kohdenukleiinihappoonsa, * * · *·* * niillä on inhibitorinen vaikutus.
DNA-koettimien tapauksessa kohdat 1 - 3 e • * •J * 30 vaatimuksena; kyseisten oligonukleotidien täytyy k M» ϊ l olla sillä tavalla muunnettuna, että detektointi 4 11 fosfaattirunkoa, riboosiyksikköä tai nukleosidiemä tetaan vastaavasti [ J. S * Cohen, Topics in Molec' Structural Biology 1989, 12 {Macmillan Press); E.
ja A. Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543]. Toin 5 käytetty menetelmä on valmistaa oligonuklec konjugaatteja antamalla 5'-asemassa sijaitsevan hy liryhmän reagoida sopivien fosforylointireagenssien Jos sitä vastoin muunnetaan kaikki nukleotidien fosfaattiryhmät, oligonukleotidien ominaisuudet n 10 usein jyrkästi. Esimerkiksi metyylifosfonaattien li vettä sisältävään väliaineeseen pienenee voimakkaa taas oligonukleotideilla, joissa kaikki mainitut r muunnettu tiofosfaateiksi, ei useinkaan ole sek pesifistä vaikutusta.
15 Hiljattain on kuvattu polyamidinukleiinih doksia [Michael Egholm, Peter E. Nielsen, Rolf H. Ole Buchardt, Science 254 (1991) 1497 - 1500; jul 92/20 702; M. Egholm et ai., Nature 365 (1993) 56 P. Nielsen, Bioconjugate Chem 5 (1994) 3-7], jotk 20 tuvat luonnollisina oligonukleotideina suurella af tiliä komplementaarisiin kohdesekvensseihin (DNA-sekvensseihin). Nämä ns. peptidi- tai polyamidinukl • · :v. pot (PNA) ovat DNA:n kanssa analogisia yhdisteitä * · deoksiriboosi-fosfaattirunko on korvattu polyamidic 25 rilla. Näillä yhdisteillä on luonnollisiin oligon • · . . deihin verrattuina se etu, että ne ovat erittäin st * · « * · ψ ·*·/ seerumxssa. Toisaalta niillä on kuitenkin seuraavia • * * *·* ’ lisiä ominaisuuksia: (1) Solut eivät ota niitä lainkaan vastaan • * : 30 tavat niitä vastaan vain määrinä, joita ei kyetä d * * * ϊ ϊ maan. Koska anti spnsp-nl i eroni iki pnti di t ia knlmrn 5
Sen vuoksi ne liukenevat huonosti vettä sisältävii riliuoksiin eivätkä ole käytettävissä komplement sekvensseihin hybridisointiin.
(3) Lisäksi PNA:illa on suuri affiniteetti 5 siin materiaaleihin, kuten Sephadex* (Pharmacia-yl
Bond ElutR (Varian-yhtiö) -tuotteisiin, joita voida tää oligomeerien puhdistuksessa, joten PNA:t ονε vain huonoin saannoin eristettävissä.
(4) Yksi PNA:iden vakava lisäpuute on se, 10 eivät sitoudu komplementaarisiin nukleiinihappoihin litteisesti orientoituneina. Sen vuoksi sekvenssi syys luonnollisten oligonukleotidien suhteen on p nyt. Kun luonnolliset nukleiinihapot hybridisoituv. lementaarisiin nukleiinihappoihin yleensä antiparal 15 orientoituneina, voivat PNA:t sitoutua sekä antip listi että paralleelisti orientoituneina.
(5) Julkaisussa WO 92/20 702 on mainittu o leotidi-PNA-konjugaatti (T)η(5'-L-N) (t) 6-Ala (ku\ korvaava sivu), jossa (T)7 tarkoittaa heptatymidyla 20 gonukleotidia, joka on sitoutunut 5'-O-fosfaattiryh 4-hydroksivoihapon (L) kautta PNA-heksatymidylaatin alaniinin (Ala) primaariseen funktionaaliseen amin (N). Siinä ei ole kuvattu kyseisen yhdisteen syntee • * mitään sen ominaisuuksia.
• · 25 (6) PNArilla on soluviljelykokeissa pitois • · . . jotka ovat mikromoolien luokkaa litraa kohden, voim • 99 • f f ···/ sytotoksisia ominaisuuksia.
• · »
Emäspariutuvien nukleiinihapposäikeiden ori minen määritellään seuraavasti [vrt. Egholm et ai.
ΪΛ: 30 365 (1993) 566 - 568] : ··· : : A) 6 C) 5*----------3< DNA ap-kek*oi*»äJ* (DNA-PNA)
c-----------N PNA
D) 5 5·----------3· DNA p-kakeoiaaNi« (DNA·PNA)
N...........C PNA
E)
C----------N PNA
5’----------3* DNA (Pu) ap-ap-kolnoiaaAie (DNA·DNA·PNA) 10 3'----------5' DNA (Pu * runaaapuriininan aMle) F)
H----------C PNA
5*----------3' DNA (Pu) ap·p-kolaolaallie (DHA-DNAFNA)
3-----------5’ DNA
15 G)
N----------C PNA
5’----- 3* DNA (PU) ap.p-kolmoiaeäie (PNA·DNA-PNA)
C----------N PNA
H)
20 C----------N PNA
5·----------3’ DNA (Pu) ap-ap-kolnolsaAie (PNA·DNA·PNA)
C..........N PNA
I)
H----------C PHA
25 5'----------3’ DNA (Pu) p-p-kolmoiaaKie (PNA-DNA-PNA)
N----------C PNA
K) • * '
J*.·. c----------N PNA
• * \ 5*----------3’ DNA (Pu) p.ap-kolmoiaa*ie (PNA·DNA·PNA)
* * 30 N----------C PNA
:**: joissa : 5f tarkoittaa oligonukleotidin 51-päätä, • M · ;·;% 3' tarkoittaa oligonukleotidin 3'-päätä, N tarkoittaa PNA:n aminopäätä ja .^ 35 c tarkoittaa PNA:n karboksyylipäätä.
» · · *!·/ Tapaukset A - D ovat esimerkkejä antisen 7 PNA:n N-pää on kytkeytynyt DNA:n 5'-päähän ja taj F PNA:n C-pää on kytkeytynyt DNA:n 5'-päähän.
Tämän keksinnön päämääränä oli sen vuok aikaan polyamidi-oiigonukleotidijohdoksia, joill 5 edellä mainittuja puutteita.
Keksintö koskee polyamidi-oligonukleotidijc joilla on kaava I
F[ (DNA-Li )q( PNA-Li )r(DNA-Li )e( PNA)t]KF1 < 10 ja joille on tunnusomaista, että q, r, s ja t tarkoittavat toisistaan riij masti lukua 0 tai 1, jolloin kahden tai useammat käisen luvuista q, r, s ja t summa on vähintään 2 15 x on 1 - 20, edullisesti 1-5, erityiset sesti 1; DNA tarkoittaa nukleiinihappoa, kuten DN RNA:ta, tai sen tunnettua johdosta;
Li tarkoittaa DNA:n ja PNA:n välistä kova] 20 kytkentää, joka käsittää sidoksen tai orgaanisen joka sisältää ainakin yhden atomeista C, N, 0 ja PNA tarkoittaa polyamidirakennetta, joka • *ϊ ;v. ainakin yhden nukleosidiemäksen, joka on muu kuin
Ja * « ; 25 F ja F’ ovat pääteryhmiä ja/tai ovat kytfc * * . , toisiinsa kovalenttisella sidoksella (sykliset yhc * » · sekä niiden fysiologisesti hyväksyttäviä suoloja.
* * *
** * Lisäksi mainittakoon erityisesti kaavan I
polyamidi-oligonukleotidijohdokset, joissa x on • · · 30 manaikaisesti q = r = 1 ia s = t = 0 tai 8
Edullisia ovat yhdisteet, joilla on kaav
Ib, / 5 Γ---<N")n,-1
B B
fT iHj R2 C-0 0 I il (Lf , )---( D ) „ — CHj-CHj-H — CHj — C — 10 \ q --(«»).-1 ty· ’ is ;« R2 C-0 0
I II
(Li,)---(0)p - CH^-CHj-N — CH2 — C -
-I s L
20 • · / : / r n r • * :v. F---CHj-CHj-H H j C — C ΐ 0 )R---( L ij )
• ·* I II
o-c o R2
•H 25 “ R
• · ft O
• « « i * · ··· · ···
\* · ^ L J t L
: 30 *· · Γ -I g- * * *···* --(U .)- CH}-CH,-N -H-C — C- ( D ' ) _---fLI.) 9 joissa x tarkoittaa lukua 1-20, jolloin x:n olle rempi kuin 1 r s 1 Ja samanaikaisesti q - t -n = 0 - 5; 5 q, r, s ja t tarkoittavat toisistaan riip masti lukua 0 tai 1, jolloin kahden tai useamman käisen luvuista q, r, s ja t summa on vähintään 2
Rz tarkoittaa vetyä, hydroksyyliryhmää, syyliryhmää, edullisesti C1.6-alkoksyyliryhmää, haJ 10 kuten F:a tai Cl:a, edullisesti F;a, tai atsido-noryhmää; kukin B tarkoittaa, muista riippumattomas leotidikemiassa tavanomaista emästä, esimerkiksi lista emästä, kuten adeniinia, sytosiinia, tymiir 15 niiniä, urasiilia tai inosiinia, tai luonnossa es töntä emästä, kuten puriinia, 2,6-diaminopuriini atsa-adeniinia, 7-deatsaguaniinia, N4N4-etanosyt N6N6-etano-2,6-diaminopuriinia, pseudoisosytosiind tyylisytosiinia, 5-fluoriurasiilia, 5-(C3_6-alkynj 20 siiliä tai 5-(C3_6-alkynyyli) sytosiinia, tai niide esiastemuotoa; •\ : aaltosulku tarkoittaa sitä, että R2 ja viereinen *5 ;v. tuentti voivat sijaita 2’- ja 3*-asemassa tai my • « vastoin 3*- ja 2T-asemassa; • « ,25 Nu tarkoittaa ryhmää, jolla on kaava Ha t * · : 5 1 5 · »•I t ^ y i » *
Y-Γ \-T
30 >2 r~ .···. R R2 • · m m λ 10 joissa R2 ja B ovat edellä esitettyjen määritelmien muka U tarkoittaa hydroksyyliryhmää, merkaptoryhmää, Cx. liryhmää, edullisesti C^-alkyyliryhmää, C^-all 5 ryhmää, edullisesti Cj.g-alkoksyyliryhmää, C6_20-a] mää, edullisesti C6,12-aryyliryhmää, Cg.^-aryyli-Ci.g-ryhmää, edullisesti Cg-aryyli-C^-alkyyliryhmää, t, NHR3 tai NR3R4? R3 tarkoittaa C^g-alkyyliryhmää tai C^-alki 10 alkyyliryhmää, edullisesti C^.g-alkyyli- tai C^-alkyyliryhmää ja erityisen edullisesti C^-alk; metoksietyyliryhmää ja R4 tarkoittaa C^g-alkyyliryhmää, edullise alkyyliryhmää ja erityisen edullisesti C^-alkyj 15 tai R3 ja R4 muodostavat yhdessä sen typpiatomii johon ne ovat sitoutuneet, 5- tai 6-jäsenisen het< sen renkaan, joka voi lisäksi sisältää toisenkir atomin, joka voi olla 0, S tai N, kuten esimerkd 20 foliinirenkaan; V tarkoittaa oksi-, sulfanidyyli- tai imii • i !/·* W tarkoittaa okso- tai tioksoryhmää? ja Y tarkoittaa oksi-, sulfanidyyli-, metyle ·;··♦ iminoryhmää; 25 m = 0 - 20; • · : o = 0- 20; • · · D tarkoittaa ryhmää, jolla on kaava III, * · ·
B
: 30 CH»
.···. I
• · I
• M * A
11 D' tarkoittaa ryhmää, jolla on kaava IV, — N “ CHj-CHj-N — h,C —C - h I n I o o-c (i 5 | ch2 Θ jossa B on edellä esitetyn määritelmän mukainen; 10 n = 0 - 20; p = 0 - 20;
Lij, Li2, Li3 ja Li4 tarkoittavat kukin, t riippumattomasti, kaavan V mukaista rakennetta, 15 [(V )-(G)-(G1 2 3 )]6 (V) jossa e on 1 - 5, edullisesti 1-2; kukin V tarkoittaa, muista riippumattomasti, ha 20 ryhmää, sidosta tai ryhmää, jolla on kaava VI, . . u i:':; l : V -Y-p-v- (vi) ·:»: Il 25 1 • 1 fr «91 jossa U, V, W ja Y ovat edellä esitettyjen mää 2 • 9 m 3 1 mukaisia; kukin G tarkoittaa, muista riippumattonne ; 30 alkaanidiyyliryhmää, edullisesti C^-alkaanidiyy «99 ! ! H nlfA »1 Iraani Hi ττ-ττΊ i T~irhmH x m A hai uffaocca nila Kain 12 lä, tai C6-i4-aryyli-Ci-i8-alkyyliryhmällä, edullis aryyli-Ci-4-alkyyliryhmällä, substituoitu; Ce-i4“c Ci-12-alkaanidiyyliryhmää, edullisesti C6-aryyli-Ci nidiyyliryhmää, tai ryhmää, jonka kaava on (CH2CH2C 5 jossa δ voi olla 1 - 11, edullisesti 1-7, tai ja G' tarkoittaa oksi-, sulfanidyyli- tai imir ryhmää —C(0)— tai -C(0)NH-, sidosta tai kaavan VI ryhmää, jossa U, V, w ja Y ovat edellä esitettyje 10 telmien mukaisia; F ja F’ ovat kytkeytyneet yhteen sidoksen sellä {sykliset yhdisteet) ja/tai F tarkoittaa ryhmää R°- (A) k-V- ja F’ tarkoittaa kaavassa Ia ryhmää -(Q)i-R1 15 vassa Ib ryhmää V1-(Ä)i-R1, joissa kaavoissa R° tarkoittaa vetyä, Ci-ie-alkanoyyliryhmää, sesti Ce-is-ai kanoyyli ryhmää, Ci-is-alkoksikarbonyyl: sykloalkanoyyli-, C7-i5~aroyyli- tai Ca-n-heteroarc mää tai ryhmää, joka edistää oligomeerin soluuno 20 toimii DNA-koettimen leimausryhmänä tai hybridin oligomeeri kohdenukleiinihappoon tarttuu viimeksi tuun niin, että tapahtuu sitoutuminen, silloittum pilkkoutuminen; tai k: n ollessa nolla R° on vety « *
["[· dostaa yhdessä V:n kanssa ryhmän, jolla on kaava VI
♦ · . 25 ***** v :T: 1-p-z* (vti)
II
« · W
1 · « • « « 13 mää, edullisesti C12_ie-alkyylitioryhmää, ryhmää NR3R4 tai ryhmää, joka edistää oligomeerin soluunc toimii DNA-koettimen leimausryhmänä tai hybridis oligomeeri kohdenukleiinihappoon tarttuu viimeksi 5 tuun niin, että tapahtuu sitoutuminen, silloitun pilkkoutuminen; ja R3, R4, V ja W ovat edellä esitettyjen määi mukaisia; R1 tarkoittaa vetyä tai ryhmää Q°, jolloin R1 on vt 10 astaan silloin, kun samanaikaisesti 1 - 0 ja kae t = 0 ja s = 1 ja Lilliä on kaavan V mukainen jossa VT on sidos, G on sidos, 6 = 1 ja G' on oks fanidyyli- tai iminoryhmä tai ryhmä, jolla on k
jossa U = Z; tai kaavassa Ib q = 1 tai q = r = C
15 mässä F' = V1 on ryhmä V; A ja Q tarkoittavat toisistaan riippumattomasti lv sesta tai luonnossa esiintymättömästä aminohaposl lisesti glysiinistä, leusiinista, histidiinistä, alaniinista, kysteiinistä, lysiinistä, argii 20 asparagiinihaposta, glutamiinihaposta, proliinisti hydroisokinoliini-3-karboksyylihaposta, oktahydrod | : karboksyylihaposta tai N-(2-aminoetyyli)glysiini »·..] räisin olevaa ryhmää; * » * \ Q° tarkoittaa hydroksyyliryhmää tai ryhmää OR', . 25 NHR'', joissa R' tarkoittaa C^g-alkyyliryhmää, edullises !·« 2 alkyyliryhmää; ja * Rf T tarkoittaa Cj_18-alkyyliryhmää, edullisesti C12.
liryhmää, C^^-aminoalkyyliryhmää, edullisesti C12.
! 30 alkyyliryhmää, tai C1_ie-hydroksialkyyliryhmää, edv 14 k on O - 10 ja 1 on O - 10; sillä edellytyksellä, että a) jos kaavan Ia mukaisessa yhdisteessä 5 s = 1 ja Li, on ryhmä (V )-<G)-(G*), jossa V’ on ] mukainen ryhmä, G on C2_12-alkyleeniryhmä ja G' on : niin ryhmässä F' = -(Qh-R1 1 on 0 - 10 ja R1 on i b) jos kaavan la mukaisessa yhdisteessä s niin Li2 on sidos; 10 c) jos kaavan Ib mukaisessa yhdisteessä s = 1, niin Li3 on sidos; ja d) jos kaavan Ib mukaisessa yhdisteessä s niin Li4 on sidos; jolloin kullakin nukleotidilla voi olla D- tai L-15 raatio ja emäs voi esiintyä a- tai β-asemassa.
Erityisen edullisia ovat sellaiset kaavoj Ib mukaiset yhdisteet, joissa sokerissa esiintyy J sa emäs, x - 1 ja 20 q = r = 1 ja s = t = 0 tai r = s = 1 ja q = t = 0 tai : q = r = s = 1 ja t = 0 tai r = s = t = 1 ja q = O.
Edullisia ovat varsinkin oligomeerit, j . 25 kaava Ia tai Ib, joissa V*, V, Y ja W tarkoittaa tio-, oksi-, okso- tai hydroksyyliryhmää; aivan < • t ♦ ··· · edullisia ne ovat, jos R on lisäksi vety.
:.· : Edullisia ovat erityisesti myös kaavojen mukaiset oligomeerit, joissa £ * 1 ja : 30 Lix ja Li4 ovat ***** a ^ ϋ Uaatfa TT -tnnna TT f nn 1 15
Uses ti U, V, W ja Y ovat happiatomeja tai U, W happiatomeja ja V on iminoryhmä;
Li2 ja Li3 ovat
a) ryhmiä, joilla on kaava V, jossa V on : 5 mä, G on Cj^j-alkyleeniryhmä Ja G1 on kaavan VI
ryhmä: b) ryhmiä, joilla on kaava V, jossa V on : mä ja G ja G' ovat sidoksia; tai
c) ryhmiä, joilla on kaava V, jossa Vf on : 10 mä, G on C^Q-alkyleeniryhmä ja G' on kaavan VI
ryhmä, jossa edullisesti U, V, W ja Y ovat happii Aivan erityisen edullisia ovat oligomeeri· on kaava Ia tai Ib, joissa V , V, Y ja W tarkoit kin tio-, oksi-, okso- tai hydroksyyliryhmää, R2 o 15 Lii tarkoittaa ryhmää -V-[CH2]nC(0)NH-, jossa V VI mukainen ryhmä, jossa U, V, W ja Y ovat happ tai Li2 tarkoittaa ryhmää -HN-[CH2]n(G')-, jossa i ja G' vastaa kaavaa VI, jossa U, V, W ja Y ovat ] meja.
20 Lisäksi edullisia ovat oligomeerit, joilla
Ia tai Ib, joissa V, V, Y ja W tarkoittavat kul j\: oksi-, okso- tai hydroksyyliryhmää, R2 on vety, koittaa ryhmää -0-[CH2]nC(0)NH- tai Li2 tarkoitti -HN-[CH2]n(G' )-, jossa n = 2 - 5 ja G* vastaa k< * * 25 jossa U, V, W ja Y ovat happiatomeja, ja q * 0 ji • * t - 1.
• · #
Lisäksi edullisia ovat oligomeerit, joilla *** * la tai Ib, joissa aaltosulku tarkoittaa, että R2 i 3 * -asemassa (ks. kaava Hb). Edullinen emäs or !«: : 30 adeniini.
I : Keksintö ei raloitu a- la R-n- tai a- tai J
16 keriyksikoista, esimerkiksi suurempirenkaisista tai pirenkaisista sokereista tai asyklisistä, renkaiden siltaryhmän sisältävistä tai muunlaisista sopivista johdoksista. Lisäksi keksintö ei rajoitu kaavan I y 5 sä esimerkkeinä esitettyihin fosfaattiryhmiin, vaa myös tunnettuja defosfojohdoksia.
Oligonukleotidiosa (DNA kaavassa I) voi s monin tavoin luonnossa esiintyvistä rakenteista poi Sellaisia muunnoksia, joita voidaan tehdä sinänsä t 10 menetelmin, ovat esimerkiksi seuraavat: a) Fosfaattisillan muunnokset Esimerkkeinä mainittakoon tiofosfaatit (fos aatit), ditiofosfaatit (fosforoditioaatit), met fonaatit, fosforiamidaatit, boranofosfaatit, fos f 15 tyyliesterit, fosfaattietyyliesterit ja fenyylifosf Edullisia muunnelmia fosfaattisillasta ovat tiofc ditiofosfaatit ja metyylifosfonaatit.
b) Fosfaattisillan korvaus
Esimerkkeinä mainittakoon korvaus for 20 diasetaalilla, 3’-tioformaldehydiasetaalilla, met roksyyliamiinilla, oksiimilla, metyleenidimetyylih •\J ryhmällä, dimetyylisulfonilla tai silyyliryhmillä.
• · IV. ta on korvaaminen formaldehydiasetaaleilla • ·* tiof ormaldehydiasetaaleilla.
• · 25 o) Sokerin muunnokset « · . . Esimerkkeinä mainittakoon a-anomeeriset * i · *··/ 2'-O-metyyliriboosi, 2'-O-butyyliriboosi, * · 9 *** allyyliriboosi, 21-fluori-2'-deoksiriboosi, 2'-a deoksiriboosi, a-arabinofuranoosi ja sokerien kanss * ♦ : 30 giset karbosykliset yhdisteet. Edullisia muunnoks 5 J 2 1 vvtiri boosi 1 1 λ is 2 ' -O-n-hnt- wl i ri hnn.q-i 1 1 ; * 17 2'-deoksiuridiini, 5-heksynyyli-2'-deoksisytidi fluori-2 *-deoksisytidiini, 5-£luori-2'-deoksiur±< hydroksimetyyli-21-deoksiuridiini, 5-metyyli-2'-( tidiini ja 5-bromi-2*-deoksisytidiini. Edullisia 5 siä ovat 5-propynyyli-2f-deoksiuridiini, 5-heksyi deoksiuridiini, 5-heksynyyli-2'-deoksisytidiini ; pynyyli-2'-deoksisytidiini.
e) 3'-3*- ja 5'-5*-inversiot [esim. M. Kog J. Org. Chem. 56 (1991) 3757] 10 f) 5f- ja 3'-fosfaatit samoin kuin 5'- ji fosfaatit
Esimerkkejä ryhmistä, jotka edistävät soli ovat erilaiset lipofiiliset ryhmät, kuten -0-( jossa x tarkoittaa kokonaislukua 6 - 18, -0-(CH3 15 (CH2)b-CH3, jossa n ja m tarkoittavat toisistaan r tomasti kokonaislukua 6 - 12, -0-(CH2CH20)4-(
-0- ( CH2CH20 )e- (CH2) 13-CH3 ja -O- ( CH2CH20 )7- ( CH2 )15-C
myös steroidiryhmät, kuten kolesteryyliryhmä, ja niryhmät, kuten vitamiini E, vitamiini A ja viti 20 ja muut konjugaatit, jotka käyttävät hyväksi esiintyviä kantajasysteemejä, kuten gallushappo, •\* po, 2-(N-alkyyli, N-alkoksi)aminoantrakinoni, sek * * :v« sin konjugaatit ja sopivien reseptorien peptidi • * johtavat oligonukleotidien reseptorivälitteis » * 25 dosytoosiin, kuten EGF (epidemiaa linen kasvuteki.
• * . . dykiniini ja PDGF (verihiutaleperäinen ka sv • « « ··’/ Leimausryhmillä tarkoitetaan fluoresoivia ryhmiä • * * ’** * kiksi dansyyli- [l-(dimetyyliamino)naftyyli-5-: li-3, fluoreseiini- ja kumariinijohdoksia, tai es * « : 30 akridiinijohdosten kemiluminesoivia ryhmiä sekä 1 « i J . _ i_ i__am__ 4 m _ mm i _ · mmm . 1 18 r ryhmillä, esimerkiksi aminoalkyylikytkentäryhm muunnetaan aktiivisella akridiniumesterillä ke senssikoettimeksi. Tyypillisiä leimausryhmiä ova vat: 5 °Υ!£0)Γ!Γ
H Jk^c°°H
10 NH CH,-0
V
o 15 Fluoreseiinijohdos CH, '<♦> 20 0 ? i·: $ 25 0^n-(ch2),-h- : :·: h h • •I · • · t • « · * , . Akridiniumesteri *··: : 30 «« t • ·
#** v — O _ 1 Q
* 19
O
Λ R"**_,NH R = H tai am: suojaava ryhi 0
Biotiinikonjugaatti (= "biotiini", kun R - F
1° j> HO ζβ
15 Γ Ί] T °H
0 0
H
20
Digoksigeniinikonjugaatti • « I I · • ·· « i \\i Oligonukleotidien kanssa analogiset yhdist ·:·*· ka sitoutuvat tai liittyvät väliryhmiksi (interka ····· 25 nukleiinihappoihin ja/tai pilkkovat tai silloitl : sisältävät esimerkiksi akridiini-, psoraleeni-, *··/ diini-, naftokinoni-, daunomysiini- tai klooriety *. · * aryylikonjugaatteja. Tyypillisiä interkaloituvia , loittavia ryhmiä ovat seuraavat: y ? 30 < · \ ) 20 OCHj
A
5
C I
(x = 2 - 12, edullisesti 4) 10 iH> I .ch2x-(ch2),-x-
0Α0^γ^0^οΗ5 x = NH
CK3 15 Trimetyylipsoraleenikonjugaatti (= "psoraleeni", 20
Fenantroliinikonjugaatti « · * * * • ♦♦ ♦ « *· « I I * Λ : \
····* I
;;::i 25 « · « ♦ « • · « • I « • * * * Psoraleenikonjugaatti : n : 30 m « *··. A ^ /NH\ 21
OOH O
5 OCH, 0 OH O
xS
HO ^-'
NH
10 x
Daunomysiinijohdos CI-CH2CH2\ » yO(CH2),-o- Η3<Γ
X
X» 1-18, X1 2 3 alkyyli, halogeeni, N02, CN, 20 CI-CH2CH2\ ,—.
«1 «4 / • C I - C H 2 C H 2 25 • m • i _ . . _ _ ^ ,1e x 1 1 - 18, x 1 alkyyli, halogeeni, N02, CN, 2 • · « ««« 4 Ψ · »
·' 1 Esimerkkeinä ryhmistä NR3R4, joissa R3 ja I
tavat yhdessä sen typpiatomin kanssa, johon ne o\j • · 1 3 2 30 tuneet, 5- tai 6-jäsenisen heterosyklisen renk #·· 22 edullisesti muodostuneet esimerkiksi seuraavista osista a - h, joissa f on 1 - 4, edullisesti 1 ta: on 0 - 3, edullisesti 0-2: a) 5 f CH2 c=o
NH — (CHa)f — CH2 — M — (CHa)f —CO
10
Hyrup et ai., J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1993, £ b)
B
15 (CH2),
N H — CH-CO— N H — CH2 — CO
De Konig et ai., Rec. Trav. Chi. 91 (1971) 1069 20 c)
B
* · I
.;*·[: N H — CH-CH2-CH2-CH2 — CO
* * 25 • Huang et ai., J. Org. Chem. 56 (1991) 6007 • · · **· · d) • · · ' _
• · · R
• · · u (CH2), • · | : 30 N H— CHCO-N—CH2“C0 ·** L • · • * 23
e) B
ch2 c=o
5 N H — C H 2 — CH j— CH—CHj —CO
Froehler et ai., kansainvälinen patenttijull 93/10 820 (1991) f)
10 VJ
y-cH
nh-ch2-ch2-n y.
^co
Froehler et ai., kansainvälinen patentti jull 15 93/10 820 (1991) g)
B
(CHJ,
20 NH-CH-CO-N X
| ^CO
\ : h) • t» 9
:η V
25 I
* « Acua -co : .·. N 1 e * · · e ··· · 1
... I
* · I
^-(cVf NH-(CH ) ; · 2 g : : : 30 * * * 24 ja "PNA-Synthese unter Vervendung einer bas< Amino-Schutzgruppe" (HOE 94/F 059).
Edullisia ovat polyamidirakenteet, jotka ] kohdan a mukaisista rakenteista. Erityisen edull; 5 meksi mainitut ovat siinä tapauksessa, että £ = .
Kaavan I mukaisten polyamidi-oiigonukleoti mistus tapahtuu kuin oligonukleotidien syntetisoi voin liuoksessa tai edullisesti kiinteässä faasi! dollisesti käyttämällä apuna automaattista synte 10 laitetta. Kaavan 1 mukaisen oligomeerin muodostui pahtua vaiheittain kondensoimalla perätysten PR tai DNA-yksikkö, joka sisältää kulloinkin yhden : diemäksen, sopivalla tavalla derivatisoituun kant kasvavaan oligomeeriketjuun. Muodostus voi kuit< 15 pahtua myös fragmenteittaan, jolloin ensin synte fragmentit polyamidi- ja oligonukleotidirakenteii sitten kytketään yhteen kaavan I mukaiseksi pölyä gonukleotidiksi. Voidaan kuitenkin käyttää myös P oligonukleotidista koostuvia rakenneosia, edullii 20 meerejä, joista sitten muodostetaan polyamidi-oli< tidijohdoksia nukleotidi- ja peptidikemiassa 1 .·. : menetelmin.
;v! Oligonukleotidiosa muodostetaan ammatt » # tutuin menetelmin, kuten triesterimenetelmällä, . 25 naattimenetelmällä tai fosforiamidiittimenetelmäl lisesti Caruthersin standardifosforiamidiittimen t · · ··* * [M. D. Matteucci ja M. H. Caruthers, J. Am. Chem.
* · · : (1981) 3185]. Polyamidiosa voidaan valmistaa ami helle tutuilla peptidikemian menetelmillä. Mikä] •J · 30 nukleotidiosaa ja polyamidiosaa ei valmisteta er ·’"· kvtkf»t:ä SPn iMIkppn vhtppn tMvtw nUnnrmlflpr 25 jonka otsikkona on "PNA-Synthese unter Vervendi. gegen schwache Säuren labilen Amino-Schutzgrup 94/F 060, DE-patenttijulkaisu 4 408 531.1).
Aina sen mukaan, ovatko q, r, s ja t 0 va: 5 teesi aloitetaan oligonukleotidi- tai polyamii Kaavan X mukaisten yhdisteiden syntetisointi oligonukleotidiosan 3'- ja/tai 5'-päätä on muunn< pahtuu kyseisten muuntamisten osalta EP-hakemusju 0 552 766 (HOE 92/F 012) kuvatuin menetelmin (vrt 10 esitetty synteesikaavio)· Polyamidiosan osalta mukaisten yhdisteiden syntetisointi tapahtuu sai sesti jätetyssä patenttihakemuksessa, jonka otsd "PNA-Synthese unter Vervendung einer gegen schwac labilen Amino-Schutzgruppe" (HOE 94/F 060), kuva-15 netelmällä (vrt. DNA:lie esitetty synteesikaavic tenttijulkaisu 4 408 531.1).
Synteesikaavio DNA:ta varten: [kiinnitysryhmä]-[polymeeri] 20 1. i PG-(Nu')-aktiv:n liittäminen PG-(NuT)-[kiinnitysryhmä]-[polymeeri] : 2. i suojausryhmän PG poisto t ** H-(Nu')-[kiinnitysryhmä]-[polymeeri] * » ' \ 3. I vaiheiden 1 ja 2 toisto n - . 25 H-(Nu' )n-[kiinnitysryhmä]-[polymeeri] : ! 4. i R°-V-aktiv:n liittäminen 1 « ··· * R°-V-(Nu' )n- [kiinnitysryhmä] - [polymeeri] ·.· · 5. i polymeerin ja suojausryhmien R°-V-(Nu' )n : 30
•«» I
____r»V!Ä «. ______* - 4 26 3. 1 vaiheiden 1 ja 2 toisto 1 - H- (Q' ) i-[ki innitysryhmä]-[polymeeri] 4. 1 PG-[Bf/X]-OH:n liittäminen PG- [B * /X] -Q1 )x- [kiinnitysryhmä] - [polymeeri 55. I suojausryhmän PG poisto H- [B' /X] - (Q' )j - [kiinnitysryhmä] - [polymeeri 6. i vaiheiden 4 ja 5 toisto n - H- [B' /X]n-(Q1 )i- [kiinnitysryhmä] - [polymeer 7. i PG-(A* )-OH:n liittäminen 10 PG-(A1 )-[B7X]n-(0' )1-[kiinnitysryhmä]-[po 8. i suojausryhmän PG poisto H-(A' )-[Β'/Χ]„-(0' >!-[kiinnitysryhmä]-[pol 9. I vaiheiden 7 ja 8 toisto k - H-(A’ Jk-iB’/Xln-CQ1 h-ikiinnitysryhmäj-ipo: 15 10. i ryhmän R° liittäminen R°-(A* )k-[BT/X]n“(Q' )i-[kiinnitysryhmä]-[pc | 11. i polymeerin ja suojausryhmien R°-(A')1,-[B'/X]n-(O,)i-Ö0
Kaavioissa 20 PG tarkoittaa suojausryhmää, edullisesti heikoill la pois lohkaistavissa olevaa suojausryhmää;
Nu* tarkoittaa nukleotidiyksikköä, jonka eksosykl noryhmä on suojattu sopivalla suojausryhmällä; • ·
Nu'-aktiv tarkoittaa nukleotidikemiassa tavanom.
• 4 . 25 tivoitua johdosta, kuten esimerkiksi fosforiam .* ,* fosforihappodiesteri- tai H-fosfonaattijohdosta; * · · A', Bf ja Q' tarkoittavat A:n, B:n ja Q:n mahd V : suojattuja muotoja.
Synteesikaavio PNA-DNA-hybridejä varten, : 30 kaava I, • » » 11 27 1. i Pääteryhmän F’ syntetisointi linen kytkentä polymeeriin PG-F1 2. i Suojausryhmän PG poisto 5 H-F' 3. i Polyamidirakenteen konjugoin PNA-F' 4. J. Kytkentäryhmän liittäminen
Li-PNA-F' 10 5. I Nukleotidirakenteen konjugoi DNA-Li-PNA-F* 6. i Kytkentäryhmän liittäminen
Li-DNA-Li-PNA-F* 7. i Vaiheiden 3-5 toisto 15 DNA-Li-PNA-Li-DNA-Li-PNA-F* 8. i Pääteryhmän F liittäminen F-DNA-Li-PNA-Li-DNA-Li-PNA-F *
Kytkentäryhmien liittäminen voidaan jätt 20 mikäli PNA- tai DNA-yksiköissä esiintyy sopivia : ryhmiä.
; Havainnollistamismielessä esitetään synte< ··./ kaavan X mukaisille PNA-DNA-hybrideille, joka kaa * · [ *. esimerkin sellaisen hybridioligomeerin valmis ] 25 jossa q = r = s = t = 1 ja x = 1. Ensin synte pääteryhmä Ff tunnetuin menetelmin ja kiinteäfaa • · ··· · sin tapauksessa se kytketään polymeeriseen kantaj *.· * he 1). Suojausryhmän PG poiston (vaihe 2) jälki toteutetaan edullisesti lievästi happamassa väli \wi : 30 polyamidiyksikköjä kytketään yhteen (vaihe 3), ku • * · vvtifaf aan kai 11 +-+*i i DM&^Aaan 4-ι***λ 04 4 ν+·ττ«ι 4 nnn 11 28
Kytkentäryhmän liittämisen jälkeen (vaihe 6), jok listaa siirtymisen DNA:sta PNA:hän, muodostetaai polyamidirakenne. Kytkentäryhmän liittäminen, jok listaa siirtymisen PNA:sta DNA:hän, uuden DNA-: 5 konjugointi (vaihe 7) ja pääteryhmän F liittämine (vaihe 8) tuottavat tulokseksi hybridimolekyylii Li-PNA-Li-DNA-Li-PNA-F']. Kytkentäyksiköt voivat sisältää myös nukleosidiemäksiä.
Hybridin F-DNA-Li-PNA-Li-F' (q - r - 1, s 10 syntetisoimiseksi toteutetaan ensin esimerkiksi 1 - 5 ja synteesi päätetään sitten toteuttamalla Hybridin F-PNA-Li-DNA-F' (r = s - 1, q syntetisoimiseksi toteutetaan ensin esimerkiksi 1 - 2 ja sen jälkeen vaiheet 5-6, mitä seuraa 15 ja synteesi päätetään toteuttamalla vaihe 8.
Hybridin F-PNA-Li-DNA-Li-PNA-F' (r = s = t 0) syntetisoimiseksi toteutetaan ensin vaiheet 1 heen 3 toistamisen jälkeen synteesi päätetään tot la vaihe 8.
20 Jos x on kaavassa I suurempi kuin 1, vaib on mahdollisesti toistettava. Polymeeriketjun muo< jälkeen täytyy PNA-DNA-hybridit irrottaa kantaja • · teä faasi synteesin tapauksessa ja mahdollisesti suojausryhmät emäksistä, aminohapposivuketjuista • ♦ 25 ryhmistä.
I I
. . PNA- ja DNA-osa voidaan kuitenkin syntetis • · · ··/ erikseen tunnetuin menetelmin ja kytkeä sen jälke * · » * aktivoimalla ainakin toinen komponenteista sopi> valla. PNA-osan aktivointi tapahtuu edullisesti k • · : 30 liryhmän kautta, esimerkiksi muodostamalla aktii1 ··· • · i____f .___f ·___. . _______. . * ' , 29 faattiryhmän annetaan reagoida DNA-osassa ei reaktiivisen ryhmän kanssa, edullisesti funkti< aminoryhmän kanssa.
On yllättäen todettu, että kaavojen Ia j 5 kaisten oligomeerien soluunotto on paljon suurei pelkkien FNA:iden. Tämä parantunut soluunotto ratkaisevaa, koska antisense-oligomeerit ja kolmo: muodostavat oligomeerit kykenevät vaikuttamaan a: silloin, kun niiden otto soluihin on tehokasta. I 10 den hybridisaatiokäyttäytyminen on edullisempaa k kien PNA:iden, koska ne johtavat ensijaisesti ai leelin kaksoissäikeen muodostamiseen. Normaaleih: nukleotideihin verrattuina niillä on parempi nul kestävyys, mikä ilmenee suurempana biologisena ak' 15 tena. Sitoutumisaffiniteetti komplementaarisiin m happoihin on parempi kuin muilla nukleaaseja vas1 biileilla oligonukleotideilla, kuten esimerkiksi faateillä tai metyylifosfonaateilla. Luonnossa es: oligonukleotideihin, jotka hajoavat nopeasti s< 20 vallitsevissa olosuhteissa, verrattuina keksinnöt ten yhdisteiden sitoutumisaffiniteetti on vähinl :’.J hyvä ja useimmiten parempikin. Sitoutumisaf f inite^ • * TV. vu on riippuvainen PNA-osan pituudesta. Pelkillä oli soluviljelykokeissa sytotoksinen vaikutus p: • * ; 25 sien ollessa suurempia kuin 5 pmol/l, kun taas 1
« I
, , mukaiset yhdisteet eivät vahingoittaneet soluja, J j * havaittiin, että PNA- ja DNA-osan emässekvenssist.
* · *» *·* * en kaavan I mukaiset yhdisteet estävät määrätty nien, esimerkiksi entsyymejä, reseptoreja tai k« • »
: 30 jöitä vastaavien geenien, ilmentymistä soluviljeJ
: *: määrätvissä eläinmalliesimerkeissä.
30 DNA-kimeerit, jotka sisältävät muutamia deoksiri] tidiyksikköjä, komplementaariseen kohde-RHA:han s; sen jälkeen pilkkomaan viimeksi mainitun sekvenss; sellä tavalla aktivoimalla sellulaarisen RNaasi 1 5 keksinnön mukaisten oligomeerien erikoistoteutus lisäksi muoto, joka koostuu PNA-osasta ja oligoadenylaattiosasta, edullisesti tetra-aden: tai sen kordysepiinianaloglsta, ja joka aktivoi i risen RNaasi L:n.
10 Tämä keksintö koskee aivan yleisesti kaa^ kaisten yhdisteiden käyttöä lääkkeen terapeuttis tiivisena komponenttina. Terapeuttisesti vaikutta lyamidi-oligonukleotidijohdoksilla tarkoitetaan ; antisense-oligonukleotideja, kolmoiskierteen mu< 15 oligonukleotideja, aptameereja ja ribotsyymejä, e: ti antisense-oligonukleotideja.
Tämän keksinnön mukaisia lääkeaineita voi< merkiksi käyttää virusten, esimerkiksi HIV:n, HSV-2:n, influenssavirusten, VSV:n, hepatiitti B
20 tai papilloomaviruksen, aiheuttamien sairauksien
Keksinnön mukaisilla antisense-polyamidi-< • leotidijohdoksilla, jotka ovat tehokkaita kyseisi « # JV. ta vastaan, on esimerkiksi seuraavanlainen emäss» • ·* PNA- ja DNA-osan pituutta ja sijaintia mainitut • * 25 vensseissä voidaan vaihdella sopivalla tavalla op • * . . ten ominaisuuksien saavuttamiseksi.
• · · a) HIV:tä vastaan esimerkiksi 51 -A CACCCAATTCTGAAAATG G-3 ' (I 5’-AGGTCCCTGTTCGGGCGCC A-31 (i: • * 30 5t-gtcgacacccaattctgaaaat< ···
* · ft A V / J__ J
11 31 b) HSV-l:tä vastaan esimerkiksi 5f -G CGGGGCTCCATGGGGGTC G-3' (V] Tämän keksinnön mukaiset lääkeaineet se 5 myös esimerkiksi syövän hoitoon. Tällöin voidaar esimerkiksi polyamidi-oiigonukleotidisekvenssej i ovat suuntautuneet syövän synnystä tai kasvainten vastuussa olevia kohteita vastaan. Sellaisia kohti esimerkiksi seuraavat: 10 1) Tuman onkoproteiinit, kuten esimerkiks N-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, PCNA, pl20 2) Sytoplasman tai solukalvoon liittyvät teiinit, kuten esimerkiksi EJ-rasr c-Ha-ras, N-z bcl-2, cdc-2, c-raf-1, c-mos, c-src, c-abl 15 3) Sellulaariset reseptorit, kuten esimerk: reseptori, c-erbA, retinoidireseptorit, proteiin: säätelevä alayksikkö, c-fms 4) Sytokiinit, kasvutekijät, ekstraselli metriksi, kuten esimerkiksi CSF-1, IL-6, IL-la 20 IL-2, IL-4, bFGF, myeloblastiini, fibronektiini
Keksinnön mukaisilla antisense-polyamidi-c ·\βϊ leotideilla, joilla on kaava I ja jotka ovat ti * · :v. kyseisiä kohteita vastaan, on esimerkiksi seuraan • · emässekvenssi: t , 25 a) c-Ha-ras, esimerkiksi 5'-C AGCTGCAACCCAG C-3' (VIII) • a * *·* · b) bFGF, esimerkiksi V: 5'-G G C TGCCATGGTCC C-3' (XXX) c) c-myc, esimerkiksi I.:*: 30 5'-GGCTGCTGGAGCGGGGCACA C-3' ( S***: 5'-AACGT TGAGGGGCA T-3' 32 e) c-fos, esimerkiksi 5'-GGAGAACATCATGGTCGAAA G-3' i 5'-CCCGAGAACATCATGGTCGAA G-3 5' -G GGGAAAGCCCGGCAAGGG G-3’ (X: 5 f) pl20, esimerkiksi 5' -C ACCCGCCTTGGCCTCCCA C-3* (Xi g) EGF-reseptori, esimerkiksi 5’-G GGACTCCGGCGCAGCG C-3' (XVI) 5'-G GCAAACTTTCTTTTCCTC C-3' (X' 10 h) p53-kasvainsuppressori, esimerkiksi 5'-GGGAAGGAGGAGGATGAG G-3’ (XVi; 5'-G GCAGTCATCCAGCTTCGGA G-3'r Keksinnön mukaiset lääkeaineet soveltuva 1 esimerkiksi sellaisten sairauksien hoitoon, joihi 15 tavat integriinit tai solu-soluadheesioreseptorit kiksi VLA-4, VLA-2, ICAM, VCAM tai ELAM.
Keksinnön mukaisilla antisense-polyamidi-i leotidijohdoksilla, jotka ovat tehokkaita kyseisi ta vastaan, on esimerkiksi seuraavanlainen emäss< 20 a) VLA-4, esimerkiksi 5f-GCAGTAAGCATCCATAT C-3* (XX) : b) ICAM, esimerkiksi 5'-CCCCCACCACTTCCCCTCT c-3* (x; • * 51 -c tcccccaccacttcccct c-3’ (x;
25 5 '-G CTGGGAGCCATAGCGAG G-3' (XXI
, . c) ELAM-1, esimerkiksi *·· * 5'-ACTGCTGCCTCTTGTCTCAG G-3' V 5 5 ' -C AATCAATGACTTCAAGAGTT C-3 Tämän keksinnön mukaiset lääkeaineet s< : 30 myös esimerkiksi restenoosin ehkäisyyn. Tällöir käyttää esimerkiksi polyamidi-oiigonukleotidisek
V
33 1) Tuman transaktivaattoriproteiinit ja s] kuten esimerkiksi c-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, nit ja cdc2-kinaasi 2) Mitogeenit ja kasvutekijät, kuten es: 5 PDGF, bFGF, EGF, HB-EGF ja TGF-Ö 3) Sellulaariset reseptorit, kuten es: bFGF-reseptori, EGF-reseptori ja PDGF-reseptori
Keksinnön mukaisilla antisense-polyamidi-( leotideilla, joilla on kaava I ja jotka ovat t< 10 kyseisiä kohteita vastaan, on esimerkiksi seuraa^ emässekvenssi: a) c-myb 5'-G TGTCGGGGTCTCCGGG C-3' (XXVI) b) c-myc 15 5’-C ACGTTGAGGGGCA T-3’ (XXVII) c) cdc2-kinaasi 5'-GTCTTCCATAGTTACTC A-3T (XXVIi: d) PCNA (rotan proliferoiva solutuma-antii 51-G ATCAGGCGTGCCTCAA A-3' (XXIX) 20 Lääkeaineita voidaan käyttää esimerkiksi f; tisten valmisteiden muodossa, jotka voidaan anta< •N,: kiksi tablettien, rakeiden, kovien tai pehmeiden • » :v; nikapseleiden, liuosten, emulsioiden tai suspt muodossa. Lääkeaineiden sulkeminen liposomien sis * · 25 ka mahdollisesti sisältävät muitakin aineosia, ta * 4 . . teiineja, on myös yksi mahdollinen antotapa. Niit< i · · ··*/ antaa myös peräsuolen kautta esimerkiksi perä] * · *·’ * muodossa tai parenteraalisesti esimerkiksi injek* ten muodossa. Farmaseuttisten valmisteiden aikaan: • · * 30 si kyseisiin yhdisteisiin voidaan yhdistää hoid< 1*1 ! l inerttelä, orgaanisia ia enäoraaanisia kantana- 11 34 veltuvia kantaja-aineita ovat vesi, polyolit, sai inverttisokeri ja glukoosi. Sopivia kantaja-ainei toitaviin liuoksiin ovat vesi, alkoholit, polyoli roli j a kasviöljyt. Peräpuikkoihin soveltuvia 5 aineita ovat kasviöljyt, kovetetut öljyt, vahat, : puoliksi nestemäiset polyolit. Farmaseuttiset v< voivat sisältää myös säilytteitä, liuotteita, stal aineita, kostutteita, emulgointiaineita, makeutti riaineita, mautteita, osmoottisen paineen muui 10 tarkoitettuja suoloja, puskurointiaineita, pääi: neita, hapettumisenestoaineita sekä mahdollises terapeuttisesti aktiivisia aineita.
Edullisia antotapoja ovat topikaaliset ani kalliset annot esimerkiksi katetrin avulla tai my< 15 toinnit. Injektointia varten antisense-polyamidi-< leotidijohdoksista muodostetaan nestemäinen liuos sesti ne sisällytetään fysiologisesti hyväksyttää kuriliuokseen, kuten esimerkiksi Hankin liuokseen gerin liuokseen. Antisense-polyamidi-oligonukle< 20 voidaan kuitenkin muodostaa myös kiinteitä f oi jotka liuotetaan tai suspendoidaan ennen käyttöä •\J misesti annettaessa annostus on edullisesti noi • t 50 mg/kg ruumiinpainoa vuorokaudessa.
„,1· Tämä keksintö koskee aivan yleisesti kaa\ • 1 25 kaisten yhdisteiden käyttöä DNA-koettimina tai < , , DNA-diagnostiikassa, erityisesti EP-hakemusju: * ψ 1 ”5/ 0 602 524 (HOE 92/F 406) mainittuja geenikoettimi< f · 1 *·1 1 sessa mielessä, ja yleensäkin apuaineina moleky] giassa.
• 1 : 30 Geenikoettimilla, joita kutsutaan myös DNi 1 miksi tai hvbridisaatiokoettimiksi. on suuri SS 1 määritys toteutetaan komplementaarisen geeni! kanssa tapahtuvan hybridisaation avulla, määräävä tussekvenssi ja sen kemiallinen rakenne. PNA:il etu oligonukleotideihin nähden, joilla on luonnos 5 tyvä rakenne, että niillä on suurempi affiniteet sekvenssiä kohtaan. Hybridisaation spesifisyys oi kin pienempi, koska PNA:t voivat, päinvastoin ki nossa esiintyvä DNA, sitoutua yksisäikeisiin nukl· poihin sekä paralleelisti että antiparalleelisti < 10 tuneina. Keksinnön mukaisilla PNA-DNA-oligomeex myös suurempi sitouturaisaffiniteetti, mutta ne voimakkaasti sitoutumista toivotulla antiparallee valla.
Valitsemalla geenikoettimen PNA- tai DNA-< 15 vasti voidaan lisäksi vaikuttaa positiivisesti e miskykyyn, koska emäspariutuminen PNA-osassa joht din sulami s lämpötilan voimakkaampaan alenemiseen osassa tapahtuva emäspariutuminen. Tämä on erity keätä erilaistumisen kannalta, joka tapahtuu pi 20 tioissa, jollaisia esiintyy esimerkiksi siirryttä to-onkogeeneistä vastaaviin onkogeeneihin (pat tila). Patogeenisen ja ei-patogeenisen tilan er • * $V; paremmin toisistaan on etu, jota voidaan hyödyi * · niin, että keksinnön mukaiset PNA-DNA-oligomeerit • * ia". 25 alukkeina, mikäli ne sisältävät DNA-osan 3'-asei • * . paan funktionaalisen hydroksyyliryhmän. PNA:t sei eivät toimi alukkeina polymeraaseille. On yllättä • · · *·* * tu, että jo yksi PNA-DNA-oligomeerin päässä s nukleosidiyksikkö riittää käynnistämään DNA-pol; : 30 reaktion, esimerkiksi DNA-polymeraasin (Klenowin •t· • S tin) avulla. Kulloisenkin PNA-DNA-alukkeen rake 36 polymeraasit, kuten esimerkiksi Taq-polymeraasi, polymeraasi ja käänteiskopioijaentsyymi.
Yksi lisäetu luonnollisen oligonukleotid käyttöön verrattuna on se, että PNA-DNA-alukke« 5 kopioitu nukleiinihapposäie, joka sisältää PNA-päässä, on stabiili 5’-eksonukleaaseja vastaan luonnossa esiintyvät DNA- tai RNA-sekvenssit void pilkkoa 51-eksonukleaaseilla sen vaikuttamatta P1 sältävään säikeeseen.
10 Yksi PNA-DNA-oligomeerien lisäetu on se, i den avulla voidaan DNA-osassa toteuttaa myös mui miallisia reaktioita, jotka eivät ole mahdolli PNA:iden tapauksessa. Esimerkkejä sellaisista re ovat "3'-hännän" muodostus 31-terminaalisella tr 15 silla, DNA-kaksoissäiealueella tapahtuva pilkkomi riktioentsyymillä sekä ligaasireaktiot. Esimerkik (DNA)-OH-oligomeeri, joka sisältää 3'-asemassa va roksyyliryhmän, voidaan luonnollista alkuperää komplementaariseen DNA-apusekvenssiin hybridisoil 20 keen kytkeä yhteen toisen p-(DNA)-(PNA)-oligomee sa, joka sisältää 5’-päässä nukleosidi-5'-fosfaa : ligaasin ollessa läsnä.
(DNA)-(PNA)-(DNA)-oligomeereja on lisäksi 9 9 lista sisällyttää geeneihin, mikä ei ole PNA:ide; * · . 25 sessa toistaiseksi mahdollista.
/ / Leimausryhmien liittäminen PNA-DNA-oligoi • « « *·· · tapahtuu sinänsä tunnetuin menetelmin, joita on i»· u V * oligonukleotideille tai peptideille. Leimausryhi voi vaihdella suuresti ja määräytyy pääasiallis< ·.· 30 tettävän määritystavan mukaan. Tunnettuja tapoja < *·· ^___ ___________^___.______^ _________· , 37 1 geenikoettimesta magneettihiukkasten avulla. ] mukaisten PNA-DNA-geenikoettimien stabiilisuus on kuin tähänastisten DNA-koettimien.
"Polymeraasiketjureaktio” (PCR) ja "liga» 5 reaktio" (LCR) ovat sellaisia tekniikkoja kohtec fikaation aikaansaamiseksi, joissa keksinnön muka gomeereja voidaan käyttää myös alukkeena. Erityi! lisesti PNA-DNA-oligomeereja voidaan käyttää geei minä "joulukuusi"-periaatteella, koska PNA-DNA-] 10 voivat silloin olla lyhyempiä kuin vastaavat DNj met.
Esimerkit
Aminohapoista käytettävät lyhenteet vasta» tidikemiassa tavanomaista kolmikirjaimista koodia 15 esitetty julkaisussa Europ. J. Biochem. 138 (1984 ta lyhenteitä, joita käytetään, on lueteltu alla Aeg N-(2-aminoetyyli)glysyyli, -NH-CI
CH2-C0-
Aeg (a"*®*) N- (2-aminoetyyli) -N- { [ 9 - (N6-4-met< 20 soyyli)adenosyyli]asetyyli}glysyi
Aeg(cBl) N-(2-aminoetyyli J-NHl-^-bentsoy syyli]asetyyli}glysyyli ;v* Aeg(cMeOBz) N- (2-aminoetyyli) -N- {[ 1-(1^-4-met< * ψ
[ \ soyyli)sytosyyli]asetyyli}glysyyJ
. 25 Aeg(ctBuBz) N-(2-aminoetyyli)-N-{[l-(N4-4-t- bentsoyyli)sytosyyli3asetyyli}gli *·* 2 Aeg(g1Bu) N- (2-aminoetyyli)-N-{[9-(N2-isobut # * * V : guanosyyli]asetyyli}glysyyli
Aeg( g2-*0*4"0?0) n- (2-aminoetyyli) -N- [9 - (N2-asetyy j 30 fenyylikarbamoyyli)guanosyyli]gly
Aea(t) N-(2-aminoetwli )-N-[ (l-tvminvvl: 38 BOI 2-(bentsotriatsol-l-yylioksi)-1,3- li-imidatsolidiniumheksafluorifos BOP (bentsotriatsol-l-yylioksi )tris(d: amino)fosfoniumheksafluorifosfaat 5 BroP bromitris(dimetyyliamino)fosfonä fluorifosfaatti BSA N,0-bis(trimetyylisilyyli)asetami
But t-butyyli
Bz bentsoyyli 10 Bzl bentsyyli
Cl-Z 4-klooribenstyylioksikarbonyyli CPG huokoslasi, j olla on säädelty hi DBU 1,8-diatsabisyklo[5.4.0]undek-7-e DCM dikloorimetaani 15 Ddz 3,5-dimetoksi f enyyli- 2 -propyy 1 i - 2 - bonyyli DMF dimetyy1i formamidi
Dmt di(4-metoksifenyyli)fenyylimetyyJ
Dnpeoc 2-( 2,4-dinitrofenyyli)etoksikarbc 20 Dpc difenyylikarbamoyyli F AM f1uoreseiiniryhmä :*·.· Fm 9-fluorenyylimetyyli • · ί V. Fmoc 9 - f luorenyylimetyylioksikarbonyy3 H-Aeg-OH N-( 2-aminoetyyli )glysiini • * 25 HAPyU 0-( 7-atsabentsotriatsol-l-yyli) - • * . . bis(tetrametyleeni)uroniumheksaf; ;;j/ faatti ♦ ♦ · ’·* ’ HATU 0-( 7-atsabentsotriatsol-l-yyli)-! tetrametyyliuroniumheksafluorifos : 30 HBTU o-(bentsotriatsol-l-yyli)-l, 1,3,3- • 4 , Ί . lii ( - _ . . .
39 1 1 iBu isobutanoyyli
MeOBz 4-metoksibentsoyyli
Mmt 4-metoksitrifenyylimetyyli
Moz 4-metoksibentsyylioksikarbonyyli 5 MSNT 2,4,6-mesityleenisulfonyyli-3-niti triatsolidi
Mtt (4-metyylifenyyli Jdifenyylimetyyl NBA nitrobentsyylialkoholi NMP N-metyylipyrrolidiini 10 Obg N-(4-oksibutyyli)glysyyli, -0-( CH2-C0- 0bg(t) N- ( 4-oksibutyyli)-N-[(1-tyminyyl; li]glysyyli
Oeg N-(2-oksietyyli)glysyyli, -0-Ct 15 CH2-C0- 0eg(t) N-(2-oksietyyli)-N-[(1-tyminyyli)a giysyyii
Opeg N-(5-oksipentyyli)giysyyii, -0-( CH2-C0- 20 Opeg(t) N-( 5-oksipentyyli )-N-[ (1-tyminyyl: li]giysyyii
Oprg N-(3-oksipropyyli)glysyyli, -0- ( CH,-C0- • · Δ I * .,,,: 0Pr9( t) N-(3-oksipropyyli )-N- [ (1-tyminyyl: 25 li] giysyyii * « .e. Pixyl 9-(9-fenyyli)ksantenyyli *11/ PyBOP (bentsotriatsol-1-yylioksi )tripyr] * · ft * * fosfoniumheksafluorifosfaatti
PyBroP bromi tripyrrolidinofosfoniumheksaf • · 5.5 : 30 faatti *·· • · m1> n ~ * /r, , , , . , . _ . .
40 tBu t-butyyli tBuBz 4-(t-butyyli)bentsoyyli TDBTU 0-(3,4-dihydro-4-okso-1,2,3-bentso 3-yyli )-1,1,3,3-tetrametyyliuron: 5 fluoriboraatti TDO 2,5-dif enyyli-2,3-dihydro-3 -okso-< sitiofeenidioksidi
Teg N-(2-tioetyyli)glysyyli, -S-CH2-Cl· C0- 10 Teg(t) N-(2-tioetyyli)-N-[(l-tyminyyli )as glysyyli TFA trifluorietikkahappo THF tetrahydrofuraani TNTU 0-(5-norborneeni-2,3-dikarboki 15 1,1,3,3-tetrametyyliuroniumtetra: raatti TOTU 0- { [ syaani (etoksikarbonyyli )metyl< ηο}-1,1,3,3-tetrametyyliuroniumtet boraatti 20 TPTU 0-( 1,2-dihydro-2-okso-l-pyridyyli) tetrametyyliuroniumtetrafluoriboi •\· Trt trityyli :\\ TSTU 0-(N-sukkiini-imidyyli )-1,1,3,3-t< * · * * liuroniumtetrafluoriboraatti * * 25 Z bent syyl ioksikarbonyyli * · . , MS (ES+) elektronisuihkumassaspektri (pos: * * * ’·· : ioni) ««« 7 9 9 9 *' * MS (ES’) elektronisuihkumassaspektri (neg< ioni) * :,:: 30 MS (DCI) desorptioionisaatiokemiallinen mas; • Λ . \ _ · ^ _ « « At» 11 41
Esimerkki 1 l-hydroksi-6- [ (4-metoksifenyyli) dif enyyli amino]heksaani (Mmt-hex) 6-aminoheksan-l-oli (1 g, 8,55 mmol) 1: 5 vedettömään pyridiiniin (7 ml) ja liuokseen lisäi etyyliamiinia (0,2 ml). Tähän liuokseen lisätään tin aikana liuos, joka sisältää (4-metoksifenyyli limetyylikloridia (2,5 g, 8,12 mmol) vedettömässä nissä (9 ml). Reaktioliuosta lisäsekoitetaan 30 i 10 lämpötilassa 22 °C, Ja reaktio pysäytetään lisäät tanolia (3 ml). Liuos väkevöidään pyöröhaihduttii saatavalla jäännöksellä toteutetaan kolmesti yhte: tus tolueenin kanssa pyridiinin poistamiseksi, jäännös liuotetaan etyyliasetaattiin ja liuos pe! 15 rätysten kylläisellä natriumvetykarbonaattilii vedellä ja kylläisellä kaliumkloridiliuoksella. O: faasi kuivataan (Na2S04), suodatetaan ja väkevöic paineessa· Raakatuote puhdistetaan kromatografise kageelillä käyttäen eluenttina heptaani-etyyliai 20 trietyyliamiiniseosta (49,5:49,5:1).
Saanto: 1,64 g
MS (FAB, NBA/LiC1) : 396,3 (M + Li)*, 390,3 (M + H
!\\ (Mmt )* * * # »
Rf: 0,44 (heptaani-etyyliasetaattiseos, 1:1) • * iB". 25 Esimerkki 2 • m . . 6- [ (4-metoksif enyyli) di f enyyl ime tyyli aniini * · ♦ yylihemisukkinaatti (Mmt-hex-succ) l-hydroksi-6-[(4-metoksif enyyli )difenyyld amino]heksaani (1,00 g, 2,57 mmol) liuotetaan ve< * * : 30 pyridiiniin (10 ml). Tähän liuokseen lisätään nu • * * :..,ί happoanhydridiä (0,257 g, 2,57 mmol) ja 4,4-dime1 42 lämpötilassa 50 °C. Sen jälkeen kun liuosta or vielä 16 tuntia lämpötilassa 22 °C, se väkevöidäi nös sekoitetaan etyyliasetaattiin ja saatava liuo; jääkylmällä sitruunahapon 5-%:isella vesiliuoksc 5 gaanisen faasin kuivauksen (Na2S04) jälkeen liuos dään pyöröhaihduttimessa. Puhdistettaessa jäännös grafisesti silikageelillä käyttäen eluenttina Ci etyyliamiini-etyyliasetaattiseosta (50:1:49) ja keen dikloorimetaania, joka sisältää 5 % metanoi: 10 trietyyliamiinia, saadaan haluttua yhdistettä vä] öljynä.
MS (ES"): 978,0 (2M - H)\ 488,3 (M - H)'
Rf: 0,30 (CH2Cl2-etyyliasetaattiseos, 1:1) Esimerkki 3 15 6-[(4-metoksifenyyli)difenyylimetyyliamin< yy1isukkinyy1iamido-Tentage1 (Mmt-hex-sui gel)
TentagelR:n (Rapp Polymer e) aminomuodon (0, mmol aminoryhmiä) annetaan turvota 10 minuuttia -20 morfoliinissa (0,1 ml) ja DMF:ssä (5 ml). Sen jäi sätään liuos, joka sisältää 6-[(4-metoksifenyyli limetyyliamino]heks-l-yylihemisukkinaattia (97,4 • · • V. mmol), 4-etyylimorfoliinia (15,9 mg, 0,138 mmol,
ja TBTUrta (52,9 mg, 0,165 mmol) DMF:ssä (3 ml), 25 pensiota ravistetaan 16 tuntia lämpötilassa 22 eC
• « • tisoitu Tentagel-kantaja erotetaan suodattamalla j;:V perätysten DMF:llä (3 x 3 ml), CH2Cl2:lla (3 x •# ' dietyylieetterillä (3 x 1 ml) ja kuivataan. Reago: funktionaaliset aminoryhmät suojataan käsittelen^ : 30 ta jaa 1 tunti seoksella, joka sisältää etikkahapp< *·* 5,..: diä, lutidiinia ia l-metwli-imidatsolia THF:ssc 11 43
Esimerkki 4 6- [ ( 4-metoksi f enyyli ) difenyy lime tyyli amine yylisukkinyyliamidopropyyli-huokosiasi ( succ-CPG) 5 Valmistus tapahtuu vastaavalla tavalla, k merkissä 3 on kuvattu, mutta käyttämällä lähtömate na aminopropyyli-CPG:tä (Fluka-yhtiö) (55 nm; 1 liuosta, joka sisältää 6-[(4-metoksifenyyli)dif€ tyyliamino]heks-l-yylihemisukkinaattia (48,7 mg 10 mmol), 4-etyylimorfoliinia (7,6 mg) ja TBTU:ta ( 0,082 mmol) DMF:ssa (3 ml). Lastattu määrä Mmt-t CPG:tä on 91 mmol-g'1.
Esimerkki 5 N-[(4-metoksifenyyli)di£enyylimetyyliaminc 15 N-{1- [N4- (4-t-butyylibentsoyyli)sytosyyli] ai glyeiini (Mmt-Aegic**1**) -OH) N-[(4-metoksifenyyli)difenyylimetyyliaminc N- {1- [N4- (4-t-butyylibentsoyyli) sytosyyli ] asetyyl d nin metyyliesteri (1,63 g, 2,28 mmol) liuotetaan 20 nin (10 ml) ja veden (1 ml) seokseen, ja liuokse tään lämpötilassa 0 °C pisaroittain 1 N NaOt (4,56 ml) samalla sekoittaen. 2 tunnin kuluttua i • · tään arvoon 5 lisäämällä pisaroittain 1 N KHS0A-lii • « saostuneet suolat erotetaan suodattamalla ja pest 25 ten pienellä määrällä dioksaania. Yhdistetyt s • · • väkevöidään alipaineessa, ja jäännöksellä toteutel • · · desti yhteishaihdutus metanolin ja dikloorimetaar * * * *·* sa. Näin saatava raakatuote puhdistetaan kromatogi silikageelillä käyttämällä hyväksi gradienttie : 30 dikloorimetaanilla, joka sisältää 2 - 10 % meta • * * Ϊ · 1 % trietvvliamiinia. Tuotetta sisältävät -takeet
V
44 MS (ES'): 700,7 (M - H)'
Rf: 0,28 (CH2Cl2-MeOH-seos, 9:1), 0,63 (CH2C12-Mi 7:3)
Esimerkki 6 5 N- [ (4-metoksifenyyli)difenyylimetyyliamim N-[(1-tyminyyli)asetyyli]glysiini (Mmt-Aei
Yllä kuvatun reaktion tuote liuotetaan d: (10 ml) ja veden (2 ml) seokseen. Liuos jäähdyte pötilaan 0 °C ja lisätään pisaroittain 1 N natrii 10 siliuosta, kunnes saavutetaan pH-arvo 11, 2 tur gointiajan jälkeen reaktio päätetään ja liuoksen tään arvoon 5 lisäämällä varovasti 2 N KHSÖ4-liuos uutetaan kolmesti etyyliasetaatilla, ja yhdistet; niset faasit kuivataan natriumsulfaatilla ja väl 15 alipaineessa. Näin saatava raakatuote puhdisteta; tografisesti silikageelillä käyttämällä hyväksi ; tieluointia dikloorimetäänillä, joka sisältää metanolia ja 1 % trietyyliamiinia. Tuotetta s jakeet yhdistetään ja väkevöidään alipaineessa, 1 20 oleva ylimääräinen trietyyliamiini poistetaan yh dutuksella pyridiinin ja sen jälkeen tolueenir :*·,! Saadaan 1,065 g tuotetta värittömänä vaahtona.
• · MS (ES'): 1112,0 (2M - H)·, 555,3 (M - H)' • ♦ ··.·: Rf: 0,28 (CH2Cl2-MeOH-seos, 8:2) 25 Esimerkki 7 • # N-[(4-metoksifenyyli)difenyylimetyyliamim **;. · N- { 9- [N2- (isobutanoyyli) guanosyyli] asetyyli # · (Mmt-Aeg (giBu) -OH ) N-[(4-metoksifenyyli)difenyylimetyyliamin< : 30 N-{9-[N2-(isobutanoyyli)guanosyyli]asetyyli>glysi #·· twliesteri il. 15 a. 1.72 mmol) liuotetaan di< * 45 pH säädetään arvoon 5 lisäämällä pisaroittain ka: sulfaatin 2 M vesiliuosta. Saostuneet suolat < suodattamalla ja pestään sitten pienellä määrällä nia. Yhdistetyt suodokset haihdutetaan kuiviin ai: 5 sa, ja jäännöksellä toteutetaan kahdesti yhteisi etanolin kanssa ja kahdesti dikloorimetaani-metai sen (1:1) kanssa. Puhdistus tehdään pylväskromatot ti silikageelillä käyttämällä hyväksi gradientti* dikloorimetaanilla, joka sisältää 10 - 20 % met£ 10 1 % trietyyliamiinia. Tuote saadaan valkeana vaal
Saanto: 1,229 g MS (ES-): 650,3 (M - H)'
Rf: 0,25 (dikloorimetaani-metanoliseos, 8:2) Esimerkki 8 15 N-[(4-metoksifenyyli)difenyylimetyyliamin< N- {9- [N*- ( 4-metoksibentsoyyli) adenosyyli las glysiini (Mrat-Aeg(a*“*) -OH) N-[(4-metoksifenyyli)difenyylimetyyliamin< I N-{9-[N6-( 4-metoksibentsoyyli)adenosyyli]asetyyli} 20 metyyliesteri (1,70 g, 2,38 mmol) liuotetaan di( (10 ml), ja liuokseen lisätään 2,5 tunnin aikana lassa 0 *C pisaroittain natriumhydroksidin 1 M i f*·*; (10,32 ml) viidessä erässä. Sen jälkeen kun lii: • · annettu reagoida vielä 2 tuntia huoneenlämpötila 25 pH säädetään arvoon 5 lisäämällä pisaroittain kai • · • · sulfaatin 2 M vesiliuosta. Saostuneet suolat < • 2 · \\V suodattamalla ja pestään sitten pienellä määrällä « · · * * nia. Yhdistetyt suodokset haihdutetaan kuiviin ai: sa, ja jäännöksellä toteutetaan kahdesti yhteisi !·* : 30 etanolin kanssa ja kahdesti dikloorimetaani-metai • · , - „ . t _ , , , , , .. .
46 11 MS (ES*): 698,3 (M - H)'
Rf: 0,10 (dikloorimetaani-metanoliseos, 8:2) Esimerkki 9 N- [ (4-metoksi fenyyli)difenyylimetoksi]etyy 5 tyminyyli)asetyyli]glysiini (Mmt-Oeg(t)-01 N- [ (4-me toksi fenyyli) dif enyylimetoksi] etyy ni (0,5 g, 1,28 mmol) suspendoidaan DMF:ään (1 suspensioon lisätään pisaroittain BSA:ta (0,47 mmol). Sen jälkeen lisätään perätysten trietyy! 10 (0,7 ml, 5,1 mmol) ja kloorikarboksimetyyl: (0,26 g, 1,28 mmol). Reaktioseosta sekoitetaan huoneenlämpötilassa, sitten lisätään lisää klooril metyyli tyrni iniä (65 mg, 0,32 mmol) ja sekoitets 16 tuntia. Liuote poistetaan sen jälkeen alipaii 15 raakatuote puhdistetaan silikageelipylväässä kä] hyväksi gradienttieluointia dikloorimetaanilla, sältää 5 - 15 % metanolia ja 1 % trietyyliamiinia ta sisältävät jakeet yhdistetään ja väkevöidäär neessa. Saatava ruskehtava öljy liuotetaan pieneei 20 dikloorimetaania ja tuote seostetaan lisäämällä < eetteriä. Tuote saadaan valkeana jauheena.
: Saanto: 0,219 g ♦ *» ^ ;.·! MS (ES"): 556,3 (M - H)' * Φ
Rf: 0,54 (CH2Cl2-MeOH-seos, 8:2) ^ . 25 Esimerkki 10 . . 4-nitrofenyyli-4-(4,41-dimetoksitrityyliol — :· raatti (Dmt-but-NPE) * Ψ 9 *·* * 4-hydroksivoihapon natriumsuola (1,26 g, liuotetaan vedettömään pyridiiniin (30 ml) ja : j.:’: 30 lisätään 4,4' -dimetoksitrityylikloridia (3,39 mmol). 16 tunnin kuluttua lisätään 4-nit-rnfennlia
V
47 ja saatavalla jäännöksellä toteutetaan kahdesti haihdutus tolueenin kanssa. Jäännös puhdistetaar geelipylväässä (10 - 50 % etyyliasetaattia ja 1 % liamiinia petrolieetterissä). Haluttu yhdiste sao 5 västi kellertävän öljyn muodossa.
Saanto: 2,694 g
MS (FAB, MeOH/NBA/LiCl): 534,2 (M + Li)*, 527,2 ( Rf: 0,34 (petrolieetteri-etyyliasetaattiseos, 75: Esimerkki 11 10 H-0prg(t)-0H
Tyminyylietikkahappo (3,68 g) liuotetaan DMFiään (20 ml) ja liuokseen lisätään TOTU:ta (6 trietyyliamiinia (2,77 ml). Sen jälkeen seosta se] 30 minuuttia huoneenlämpötilassa ja sitten se 15 hitaasti pisaroittain liuokseen, joka koostuu (3-] propyyli)glysiinistä (5,32 g), vedestä (20 ml), (20 ml) ja trietyyliamiinistä (5,54 ml). Seosta taan vielä 1 tunti huoneenlämpötilassa ja sitten vöidään pyöröhaihduttimessa alipaineessa. Jäännös 20 taan veteen, pH säädetään 1 N suolahappoliuoksel 1,5 ja seos uutetaan etyyliasetaatilla. Vesifaasi .·. : detään kylläisellä natriumvetykarbonaattiliuoksel :v. 5 Ja se väkevöidään pyöröhaihduttimessa. Jäännöks tään etanolia (250 ml), ja tällöin saostuva natrii • « . 25 poistetaan imusuodattamalla. Suodos väkevöidään j / / puhdistetaan kromatografisesti silikageelillä • · · ·;·#· eluent tina dikloorimetaani-metanoli-etyyliasetaa *·* * (10:2:1), johon on lisätty 1 % trietyyliamiinia j älkeen dikloorimetaani-metanoli-etyyliasetaa ·,· · 30 (10:4:1), johon on lisätty 1 % trietyyliamiinia.
: sisältävät lakeet vhdistetään 1a väkevöidään nvör< 48
Esimerkki 12
Dmt-Oprg(t)-OH
H-Oprg(t)-OH (3,2 g) liuotetaan DMF:ään (4 liuokseen lisätään trietyyliamiinia (5,93 ml) ja 5 lassa 0 eC pisaroittain 20 minuutin aikana lit sisältää DMt-Cl:a (7,25 g) dikloorimetaanissa Seosta sekoitetaan vielä 2 tuntia huoneenlämpö saostunut trietyyliamiinihydrokloridi poistetaa suodattamalla ja suodos väkevöidään pyöröhaihdi 10 alipaineessa. Jäännös sekoitetaan dikloorimeta uutetaan vedellä, ja orgaaninen faasi kuivataan sulfaatilla ja väkevöidään pyöröhaihduttimessa ai sa. Raakatuote puhdistetaan silikageelillä käytl enttina dikloorimetaani-metanoli-etyyliasetaa 15 (10:2:1), johon on lisätty 1 % trietyyliamiinia.
sisältävät jakeet yhdistetään ja väkevöidään pyöri timessa alipaineessa.
Saanto: 3,46 g
Rf: 0,28 [dikloorimetaani-metanoli-etyyliaseti 20 (10:2:1) + 1 % trietyyliamiinia] MS (ES+): 602,4 (M + H) + : Esimerkki 13 • 4«
H-0bg(t)-0H
S *
Tyminyylietikkahappo (2,76 g) liuotetaan ‘ ! 25 DMF:ään (15 ml) ja liuokseen lisätään T0TU:ta (4 / / trietyyliamiinia (2,08 ml). Sen jälkeen seosta sei * * * ••j · 30 minuuttia huoneenlämpötilassa ja sitten se • i » ’·* ‘ hitaasti pisaroittain liuokseen, joka koostuu (4-] butyyli)glysiinistä (4,41 g), vedestä (10 ml), ·.· · 30 (10 ml) ja trietyyliamiinista (4,16 ml). Seosta • Π Ä • a mml m! M O ^1.— ^ J — U.. J 1 — ._._._ J ^ _ J _ 49 5 ja se väkevöidään pyöröhaihduttimessa. Raakati distetaan kromatografisesti silikageelillä käytt enttina dikloorimetaani-metanoli-etyyliasetaa· (10:2:1), johon on lisätty 1 % trietyyliamiinia. 5 sisältävät jakeet yhdistetään ja väkevöidään pyörö timessa alipaineessa*
Saanto: 3,7 g
Rf: 0,11 [dikloorimetaani-metanoli-etyyliaset.
(10:2:1) + 1 % trietyyliamiinia] 10 MS (ES+): 314,2 (M + H)+
Esimerkki 14 Dmt-Obg(t)-OH
H-0bg(t)-0H (3,6 g) liuotetaan DMF:ään (4( liuokseen lisätään trietyyliamiinia (9,5 ml) ja 15 lassa 0 °C pisaroittain 15 minuutin aikana liu sisältää DMt-Cl:a (15,4 g) dikloorimetaanissa Seosta sekoitetaan vielä 2 tuntia huoneenlämpö siihen lisätään lisää dikloorimetaania (40 ml), i trietyyliamiinihydrokloridi poistetaan sitten suo< 20 la ja suodos väkevöidään pyöröhaihduttimessa alip< Jäännös sekoitetaan dikloorimetaaniin ja uutetaan ja orgaaninen faasi kuivataan natriumsulfaatilla vöidään pyöröhaihduttimessa alipaineessa. Raakati ♦ * distetaan silikageelillä käyttäen eluenttina dii • * • 25 taani-metanoli-etyyliasetaattiseosta (15:1:1), , , lisätty 1 % trietyyliamiinia. Tuotetta sisältävä « · · yhdistetään ja väkevöidään pyöröhaihduttimessa ai: • » » • sa ·
Saanto: 3,45 g • · * 30 Rf: 0,29 [ dikloor imet aani-me tanoli-e tyyli ase t< 9*9 11 50
Esimerkki 15
2H-Opeg(t)-OH
Tyminyylietikkahappo (2,76 g) liuotetaan DMF:ään (15 ml) ja liuokseen lisätään TOTU:ta (4, 5 trietyyliamiinia (2,08 ml). Sen jälkeen seosta se* 30 minuuttia huoneenlämpötilassa ja sitten se hitaasti pisaroittain liuokseen, joka koostuu (5-1 pentyyli)glysiinistä (4,83 g), vedestä (10 ml), (10 ml) ja trietyyliamiinista (4,16 ml). Seosta 10 taan vielä 3 tuntia huoneenlämpötilassa ja sitten vöidään pyöröhaihduttimessa alipaineessa. Jäännös taan veteen, pH säädetään 1 N suolahappoliuokselJ
1,5 ja seos uutetaan etyyliasetaatilla. Vesifaasii detään kylläisellä natriumvetykarbonaattiliuoksel 15 5 ja se väkevöidään pyöröhaihduttimessa. Raakata distetaan kromatografisesti silikageelillä käytt enttina dikloorimetaani-metanoli-etyyliasetaal (10:2:1), johon on lisätty 1 % trietyyliamiinia. sisältävät jakeet yhdistetään ja väkevöidään pyöri 20 timessa alipaineessa.
Saanto: 3,34 g
Rf: 0,19 [dikloorimetaani-metanoli-etyyliasetc :\\ (10:2:1) + 1 % trietyyliamiinia] MS (DC1): 328,2 (M + H)* # ; 25 Esimerkki 16
/ / Dmt-Opeg(t)-OH
* * » ··[· H-0peg(t)-OH (3,2 g) liuotetaan DMF:ään (41 *·* * liuokseen lisätään trietyyliamiinia (6,77 ml) ja lassa 0 °C pisaroittain 15 minuutin aikana liu ;.· * 30 sisältää DMt-Cl:a (9,94 g) dikloorimetaanissa * « · : : Spnsta RAkoi tp.taan vielä 2 tuntia hunnppnl ämrtf 51 ja orgaaninen faasi kuivataan natriumsulfaatilla vöidään pyöröhaihduttimessa alipaineessa. Raakati distetaan silikageelillä käyttäen eluenttina dii taani-metanoli-etyyliasetaattiseosta (15:1:1), 5 lisätty 1 % trietyyliamiinia. Tuotetta sisältävä yhdistetään ja väkevöidään pyöröhaihduttimessa ai: sa.
Saanto; 3,6 g
Rf: 0,27 [dikloorimetaani-metanoli-etyyliaseti 10 (10:2:1) + 1 % trietyyliamiinia] MS (ES*, LiCl): 636,4 (M + LiΓ Esimerkki 17 5'-ATC GTC GTA TT-(but)-agtc-hex DNA-sekvenssi on osoitettu isoin kirjain 15 sekvenssi pikkukirjäimin (esimerkki kaaviossa 1 e; rakennetyypistä Xlla). PNA:t syntetisoidaan es: DNA-syntetisointilaitteessa Ecosyn D-300 (yhti dorf/Biotronik, Maintal) tai ABI 380B (yhtiö App! systems, Weiterstadt). DNA-osan synteesi toteutet 20 aatteessa tavanomaista fosforiamidiittimenetelmäi pallisia syntetisointisyklejä käyttäen. PNA-osan sointia varten peptidien synteesissä käytettävät :v. mät sovitetaan, kuten jäljempänä selitetään, yh1 [,.)· synteesisyklien kanssa.
9 9 25 · a 9 9 m · 9 I I 999 · 999 9 9 9 9 9 9 9 * · • 9 · 9 9 9 999 9 999 9 9 11 52
Kaavio 1 DNA-PNÄ-hydridimolekyy1it ' X ,·
i X J
Ϊ \°j 0 10 i—' . -'rvi \ r ο^ίχ e 15 ·λ|> ! ! V.
. '
j WT
20 iX
CH,
A
. . 0 ! Kaa- * · · " • · i .· (xi « ♦ ·
Kaava XII
[ 25 (Xlla, n = 1) * 1 » ♦ ♦ ♦ • · « M« 1 • I» I · · « · ♦ « • · » • » · 1·« « 11 53
Kaavio 2 PNA-DNA-hydridimolekyyli
HjHv ?
5 H°\ 8 ^ J
w Λ .
j-., j V
10 w loi j*.
y a ‘ u'r'\J ;^· y o^Su e 15 u—p — Vv B V," V°\)
Ä \ J W
rs, I
A. B w \ H\ )
20 rS
CH, :\: <A b
rv H\ J
·:··: | xo 25 1H’ oh Ki
0An/s^^0H
:h *«· # «·» • ♦ ·
Kaava X (Xa, V = O, Xb, V
• * • · « » · * M· · *·· • « • ♦ 54
Dmt-VN B’ 0 « i
5 /P
Rs/ V
Kaava VIII
____Ff__ 10 VIII a__NC-CH,CH,-0-__-N(i-C,H7),__ VIII b__CKj__-N(i-CaH,|,__
Vlll c____-N(i-C,H7),__ VIII d__CbH^-C(0)-S(CH,),-S -N-pyrrolidin-1 -yyli 15 VIII e__NC-CH,CH,-0-__-N(i-C7H7),__
1 VIII f NC-CH7CH7-0- -N(i-C7H7), I
Mm t - V \ B ’
< /n I
20 \ ) I X0 ch2
A
: ·: o /noh ft ft ft
t 25 Kaava IX
// (IXa, V = NH; IXb, V = O) • I 4 I « « l«t ft V 4 ft *·' * jossa n = 1 - 8, edullisesti 1-5, 30 ***** U .0 V D ' 55 γ 5 ο /
NC
10 Kaava XV
. Ύ ΎΝ ^Um ό /
UC
Kaava XVI
20 3 pmol CPG-kantajaa, jolle on lastattu es: mukaista yhdistettä Mmt-hex-succ (lastattu määrä ·*·.: g), käsitellään perätysten seuraavilla reagensse: • * j\\ PNA-osan (agtc-hex) synteesi: • · 1. Dikloorimetaani * · 25 2. 3 % trikloorietikkahappoa sisältävä dii • ♦ • . taani • * "!.* 3. Asetonitriili (abs. ) aa* ' 4. Asetonitriiliin tehty 4-etyylimorfoliii liuos (neutralointi) 2.2: 30 5. Asetonitriili-DMF-seokseen (9:1) tehty • e# (ctBuBa)-0H:n (esimerkistä 5) 0.4 M liuos; aseton: 56 7. Asetonitriili
Vaiheet 1-7, joita kutsutaan jäljempänä J tiosykliksi, toistetaan kolmesti PNA-osan muodosti jolloin vaiheessa 5 käytetään kulloinkin asianoma: 5 venssin edellyttämiä monomeeriyksikköjä (esimerkt 8).
Kytkentäryhmän liittäminen [agtc-hex -* (bi hex]: 8. Edellä esitetyt vaiheet 1-4 toisteta? 10 9. N-nitrofenyyli-4-(4,4'-dimetoksitrityyl tyraatti (esimerkistä 10) (105 mg) ja hydroksibenl soli (27 mg) kahdesti NEM:ssä DMF:ssä 15 tuntia.
10. Pesu DMF:llä 11. Pesu asetonitriilillä 15 12. Dikloorimetaani DNA-osan synteesi [(but)-agtc-hex -> 5'-AT( TT-(but)-agtc-hex]: 13. Asetonitriili (abs.)
14. 3 % trikloorietikkahappoa sisältävä diJ
20 taani 15. Asetonitriili (abs.) : 16 . 5 T-0-dimetoksitrityylitymidiini-3 *-( • · :V. sisältävä happo)-(S-syaanietyyli)esteridi-isoproi « diitti (10 pmol) ja tetratsoli (50 pmol) abs. ase1 ‘ J 25 Iissä (0,3 ml) / / 17. Asetonitriili ••j* 18. Seos, joka sisältää 20 % etikkahappoanl V ' 40 % lutidiinia ja 10 % dimetyyliaminopyridiiniä 19. Asetonitriili JJ · 30 20. Jodi [1,3 g THF-vesi-pyridiinisc f': 70:20;5 (V:V:V)1 11 57 (nukleosidiemäs)-3'-(fosforia sisältävä happo)-(i etyyli)esteridi-isopropyyliamidiittia.
Synteesin päättämisen jälkeen dimetoksitril mä poistetaan, kuten vaiheissa 1 - 3 on esitetty 5 meeri irrotetaan kantajasta 1,5 tunnin ammoniakk: lyllä ja samalla poistuvat B-syaanietyyliryhmät, lisiä aminoryhmiä suojäävien ryhmien poistamiset niakkipitoista liuosta pidetään 5 tuntia lämj 55 ÖC. Saatavasta 5'-ATC GTC GTA TT-(but)-agtc-he: 10 tuotteesta (325 OD260) saadaan polyakryyliamidiget roforeesin avulla puhdistetuksi 180 OD260. Poisl suolat BiogelR-pylväässä (Biorad-yhtiö) siitä saad täin puhdasta oligomeeria (50 OD260).
Esimerkki 18 15 5 1 -ATC GTC GTA TT- (Oeg(t)) -agtc-hex (esime: viossa 2 esitetystä rakennetyypistä Xa; mi
Oeg(t):n selitykseen, vrt. esimerkki 9)
Synteesi toteutetaan vastaavalla tavalla 1 merkissä 17, mutta vaiheessa 9 liitetään tällöin 20 hapon p-nitrofenyyliesterin sijasta kytkentäyksi 0eg(t)-0H (esimerkistä 9) vaiheessa 5 kuvatuissc teissä. Saatavasta 5'-ATC GTC GTA TT-(0eg(t))· ;v! -raakatuotteesta (235 OD260) saadaan polyakryyliamj * * elektroforeesin avulla puhdistetuksi 135 OD260. Pois . 25 sa suolat BiogelR-pylväässä (Biorad-yhtiö) siit£ erittäin puhdasta oligomeeria (20 OD260).
• ·ΐ · Esimerkki 19 • ·« V : N-ggg giS'NH-OT CsCJi9 TGG GGSGS T (HSV-l:ti vaikuttava sekvenssi) (esimerkki kaaviossa : 30 tystä rakennetyypistä XI; s tarkoittaa tiofc :***: siltaa: 5’NH-C tarkoittaa 5 1 -aminosvtidvl; 58 tavalla (vaiheet 13 - 20), jolloin tiofosfaattisiJ tapauksessa hapetus (vaihe 20) tehdään tetraetyyl. midisulfidillä (TETD; yhtiön Applied Biosystems : kaisema User Bulletin nro 65). Kytkentäyksikkönä 1 5 Dmt-suojattua5’-amino-5'deoksisytidylaatti-3 *-fo: diittiyksikköä, jolla on kaava Vlllf. Sen jälkeei soidaan PNA-yksiköt esimerkissä 17 esitettyjä vai 7 vastaavalla tavalla. Synteesin päättämisen jäi) gomeeri irrotetaan kantajasta 1,5 tunnin ammonia] 10 telyllä ja samalla poistuvat B-syaanietyyliryhmi syklisiä aminoryhmiä suojäävien ryhmien poistami: moniakkipitoista liuosta pidetään 5 tuntia läm] 55 eC. Vasta sitten poistetaan monometoksitrit: käsittelemällä oligomeeria 2 tuntia 80-%:isella i 15 polla lämpötilassa 22 *C. Tuote puhdistetaan pol; amidigeelielektroforeesin avulla ja siitä poiste lat Biogel“-pylväässä (Biorad-yhtiö).
Esimerkki 20 5f GCT CCA (0eg(t))gg ggg t-hex (< 20 kaaviossa 2 esitetystä rakennetyypistä Xa koittaa metyylifosfonaattisiltaa; mit; 0eg(t):n selitykseen, vrt. esimerkki 9) * · :v. Synteesi toteutetaan vastaavalla tavalla 1 ,βΛβ· merkissä 18, mutta metyylifosfonaattisiltojen (^ • « ββ#β· 25 tamiseksi DNA-reaktiosyklissä käytetään vastaavia . . fosfonaattiyksikköjä, joilla on kaava VIIIb.
"j/ Esimerkki 21 ♦ · « '** * GTs.sT GAG (but)Ggg cat-hex (c-i sense) (esimerkki kaaviossa 1 esitetystä • ♦ : 30 tyypistä Xlla; a a tarkoittaa ditiofosfaatl ·»· ♦ · . ..... . » 59
Esimerkki 22 N-cga g(5'NH-A)A CAT CA (Oeg(t)ggt cg-hea antisense) (5'NH-A tarkoittaa 5’-amino-5 adenosylaattiryhmää; mitä tulee Oeg(t):n 5 seen, vrt. esimerkki 9)
Synteesi toteutetaan vastaavalla tavalla ] merkissä 18, jolloin DNA-synteesin päätyttyä kond< esimerkkiä 13 vastaavalla tavalla 5' -aminonukleot mahdollistaa toisen PNA-osan konjugoinnin. Ensin 10 taan siis kuusi PNA-synteesisykliä ja sitten i kytkentäyksikkö (esimerkistä 9). Sen j älkeen to DNA-synteesisyklit, jolloin viimeisessä syklissä 1 kaavan Vlllf mukaista rakenneyksikköä. Sen jälkei toteutettu vielä neljä PNA-synteesisykliä, su< 15 irrotus kantajasta ja jatkokäsittely esimerkissä tulla tavalla.
Esimerkki 23 F-cga g(5 fNH-A)A CAT CAT GGT sCaG-0-CH2CH( ci6H33 (5 tarkoittaa 5' -amino-51 -deoks:
20 laattiryhmää; F tarkoittaa PNA:n aminopS
jaitsevaa fluoreseiiniryhmää; s tarkoitta* • '•J faattisiltaa) * «
Synteesi toteutetaan vastaavalla tavalla ] merkissä 19 mutta aloittamalla CPG-kantajasta, * » 25 sidottuna glyseroliheksadekyylieetteri. 12 DNA-: . . syklin toteutuksen jälkeen kondensoidaan kytken- * * * *·// Vlllf. Sen jälkeen kun on toteutettu vielä neljä • « · teesisykliä ja poistettu pääteasemassa sijatsi ryhmä, voidaan vapaat aminoryhmät muuntaa kvant: * » : 30 sesti 30-kertaisella ylimäärällä fluoreseiini-i! -Mä iFTTPl.
60
Esimerkki 24 3’-CCC TCT T-5’-(PEG)(PEG)-(Oeg(t)tg tgg g tarkoittaa tetraetyleeniglykolifosfaattir]
Synteesi toteutetaan, mitä PNA-osaan tulee 5 valla tavalla kuin esimerkissä 17. Sen jälkeen kui densoitu kuusi PNA-yksikköä, liitetään Mmt-Oeg(t) merkistä 9). Kytkentäryhmäksi kondensoidaan ensi DNA-synteesisykIissä on esitetty, kahteen kertas XV mukainen tetraetyleeniglykolijohdos, ennen ku: 10 tetaan DNA-osan synteesi päinvastaista orientoir päästä 3’-päähän) käyttäen. Sitä varten DNA-syni leissä käytetään vaiheessa 16 nukleosidi-3'-fo* diittien sijasta aina vastaavia kaavan XIV mukad leosidi-5'-fosforiamidiitteja, joita on kaupan. 15 tehtävä suojausten poisto ja loppukäsittely toi esimerkissä 17 kuvatulla tavalla.
Esimerkki 25
N-ccc tct t-(C6-link)(PEG)-3'-AAG AGG G
tarkoittaa tetraetyleeniglykolifosfaattiry 20 link on 6-aminoheksanolifosfaattiryhmä)
Synteesi toteutetaan vastaavalla tavalla ] ;\J merkissä 17 (DNA-synteesisykli) mutta aloittama * * jV. kantajasta, johon on sidottuna 3*-Q-Dmt-deoksigi 5'-O-sukkinaattiryhmän kautta. Sen jälkeen kun oi * * e · 25 soitu kuusi DNA-yksikköä kaavan XIV mukaisia rakei • , . köjä käyttäen, kondensoidaan kytkentäryhmäksi ens.
• · ♦
**// kertaan kaavan XV mukainen tetraetyleeniglykoJ
* f ennen kuin C6-link-ryhmän aikaansaamiseksi liitei van XVI mukainen fosforiamidiitti. Lisäksi teht « · : 30 jausten poisto ja loppukäsittely toteutetaan es: • * 4 A I____ _ λ___S 1 _ _ _ 1 ^ 61 siitä poistetaan suojaukset, puolet kantajaan : DNA-PNA-hybridistä erotetaan fluorensenssileimau! merkki 27) varten. Toiselle puolelle tehdään si poisto ja loppukäsittely esimerkissä 17 kuvatulla 5 Esimerkki 27 5*-FAM-TTT TTT TTT (but) ttt ttt-hex (FAM reseiiniryhmä)
Kantajaan sidotulle DNA-PNA-hybr idille (ei tä 26) tehdään fluorensenssileimaus toteuttamalla 10 13 - 20 esimerkissä 17 kuvatulla tavalla, jolloin sa 16 käytetään yhtiön Applied Biosystems vai fluoreseiinifosforiamidiittia.
Esimerkki 28 51-GGG GGG GGG (but) ttt ttt-hex 15 Synteesi toteutetaan vastaavalla tavalla 1 merkissä 17. Ennen kuin tuote irrotetaan kanta siitä poistetaan suoj aukset, puolet kantaj aan i DNA-PNA-hybridistä erotetaan fluorensenssileimau! merkki 29) varten. Toiselle puolelle tehdään si 20 poisto ja loppukäsittely esimerkissä 17 kuvatulla Otsikon mukainen yhdiste sitoutuu kolmoissäikeen i vana oligonukleotidina suurella affiniteetilla :v. soissäikeeseen, joka sisältää homopuriinijakson 5 [ψψ[: GGG GGG GGG-3 1.
25 Esimerkki 29
/ 5’-FAM-GGG GGG GGG (but) ttt ttt-hex (FAM
* · * reseiiniryhmä) V : Kantajaan sidotulle DNA-PNA-hybridille (es tä 28) tehdään fluorensenssileimaus toteuttaman* · 30 13 - 20 esimerkissä 17 kuvatulla tavalla, jolloin .···. — 1 * ___1 -· n J_____^______1 i 62
Esimerkki 30
Biotiini-Cp^GnJt GAA cat ca t(5’NH-G)G(0n C(0me)G(0me)-VitE (c-fos-antisense) [N(0i koittaa nukleotidiyksikköä N, joka sisält 5 metoksyyliryhmän; ^ tarkoittaa fenyylifosl siltaa; 5'NH-G tarkoittaa 5'-amino-5f-deot laattiryhmää)
Synteesi toteutetaan vastaavalla tavalla V merkissä 17 aloittamalla CPG:stä, johon on lastat 10 miinia E [MacKellar et ai., Nucleic Acids Res. 2( nro 13, 3411 - 11] ja johon liitetään neljään keri van Ville mukainen rakenneyksikkö DNA-synteesisy kaisesti. Kaavan VHIf mukaisen 5' -aminonukleotic liittämisen jälkeen kondensoidaan kuusi PNA-yksil· 15 synteesi syki in mukaisesti. Neutraloinnin jälkeen ] funktionaaliseen aminoryhmään fosforiamidiitti ti menetelmällä ja toistetaan DNA-synteesisykli koostumusta vastaavasti, jolloin fenyylifosfonaal jen tapauksessa käytetään vaiheessa 16 kaavan VI i: 20 siä rakenneyksikköjä. Viimeisenä liitetään päätei tiön Glen Research valmistamaa biotiinifosforian ·*·,· käyttäen. Synteesin päättämisen jälkeen oligc * » :v. poistetaan suojaukset esimerkissä 19 kuvatulla
jolloin lopuksi poistetaan dimetoksitrityyliryhmä 25 lemällä oligomeeria 2 tuntia 80-%:isella etikJ
. . lämpötilassa 22 °C.
* * ► : Esimerkki 31 • · ψ A CAT CA (Oeg(t) ggt cg-hex (c-fos-antiseni tulee Oeg(t):n selitykseen, vrt. esimerkki • i
: 30 Synteesi toteutetaan vastaavalla tavalla V
' : merkissä 18. Tällöin toteutetaan ensin viisi PNA-i 63
Esimerkki 32 A TAA TG (Oeg(t) tct cg-hex (vertailuolig< fosslle)
Synteesi toteutetaan vastaavalla tavalla ) 5 merkissä 18. Tällöin toteutetaan ensin viisi PNA-i sykliä ja sitten liitetään kytkentäyksikkö Oeg(t) kistä 9). Sen jälkeen toteutetaan kuusi DNA-syni liä. Tämän jälkeen suoritetaan irrotus kantajasti kokäsittely esimerkissä 18 kuvatulla tavalla.
10 Esimerkki 33 a cat cat ggt cg-hex (c-fos-antisense) Tämä puhdas PNA-oligomeeri valmistettiin ^ yhdisteeksi esimerkkiä 18 vastaavalla tavalla mui poikkeuksella, että toteutettiin 12 PNA-sykliä.
15 lisiä aminoryhmiä suojaavat ryhmät poistetaan aim pitoisessa liuoksessa (5 tuntia lämpötilassa 55 °< sitten poistetaan monometoksitrityyliryhmä käsiti oligomeeria 2 tuntia 80-%:isella etikkahapolla läi sa 22 °C.
20 Esimerkki 34 A (5-hexy-C)Ä(5-hexy-U) (5-hexy-C)A (Oeg(t •\$ hex (c-fos-antisense) (mitä tulee Oeg(t):n • i JV. seen, vrt. esimerkki 9; 5-hexy-C tarkoitti • ♦ synyylisytidiiniä; 5-hexy-U tarkoittaa 5-1 25 liuridiinia) • * . , Synteesi toteutetaan vastaavalla tavalla \ * · merkissä 31, mutta kondensaatioreaktiossa käytet * · * löin normaalien pyrimidiinifosforiamidiittien asianmukaisia (5-heksynyylipyrimidiininukleosidi • * :J : 30 amidiitteja.
* * * 4 64
Esimerkki 35 5' -FÄM-TT (but) ttt ttt-hex (FAM on fluoi ryhmä) Tämän PNA-DNA-oligomeerin syntetisointi toi 5 esimerkissä 27 kuvatulla tavalla, jolloin tosin k< daan ainoastaan kaksi tymidylaattiyksikköä.
Esimerkki 36 taa tae gae tea cta (5'HN-T) (51HN-T tarko; amino-51-deoksitymidiiniä) 10 Tämä PNA-DNA-oligomeeri, joka koostuu 15 1 köstä ja yhdestä nukleosidiyksiköstä, valmistett: keeksi DNA-polymeraasireaktiota varten. Tällöin a: kiinteäfaasikantajasta (aminoalkyyli-CPG), johon tuna 5'-monometoksitrityyliamino-5'-deoksitymidii 15 naattina 3'-asemassa sijaitsevan hydroksyyliryhmä ta. Sen jälkeen kun monometoksitrityyliryhraä on ] 3 % TCA:ta sisältävällä dikloorimetaanilla toteui PNA-sykliä esimerkissä 17 kuvatulla tavalla. Eks< aminoryhmiä suojaavat ryhmät poistetaan ammonia] 20 sessa liuoksessa (5 tuntia lämpötilassa 55 °C). Vi ten poistetaan monometoksitrityyliryhmä käsiti :\j oligomeeria 2 tuntia 80-%:isella etikkahapolla läi ·*·; sa 22 °C. Saadaan aikaan PNA-DNA-oligomeeri, joka « »
3' -asemassa vapaan hydroksyyliryhmän ja toimii DNJ
25 raasin (Klenow) alukkeena.
. . Esimerkki 37 • · · ::l.: p,-rA(2 ’ 5' )rA(2'5' )rA(2'5' )rA-väliryhaä- ( • · « ete ctg cgg-hex [ps tarkoittaa 5'-tiofosfi mää; väliryhmä tarkoittaa trietyleenigl] i.i i 30 faattia; rA on riboadenylaatti; (2'5') t; i · , * u . t u , . · · · ,f . , , _ 65 kytkentäyksikkö Mmt-Oeg(t)-0H (esimerkistä 9) va: kuvatuissa olosuhteissa, Mmt-ryhmä poistetaan 3-ί TCA:lla ja molekyyliin liitetään väliryhmä kä: kaupallista välikefosforiamidiittia Dmt-0-(CH 5 P(-OCH2CH2CN)N(i-C3H7)3 (yhtiö Eurogentech, ] (2 ’ 5')-kytketty tetra-adenylaatti muodostetaan es: 17 kuvatulla tavalla kaupallisen N6-bentsoyyli-! 3' -0-(t-butyylidimetyylisilyyli)adenosiini-2'-C etyylidi-isopropyyliaminof osf oriamidiitin (Millig< 10 Bedford, Yhdysvallat) avulla, jolloin kondens< pitenee 2x5 minuuttiin. Tetratsolin sijasta 1: reaktiossa käytetään tehokkaampaa aktivointia! etyylitiotetratsoli. Viimeisen Dmt-ryhmän poistoi oligomeerin 5’-OH-ryhmä fosfityloidaan bis(B-syi 15 si)di-isopropyyliaminofosfäänillä. Sen jälkeen ku ty hapetus TETDrllä, suojausten poisto ammonia silyyliryhmän poisto fluoridilla saadaan otsikon yhdistettä, joka stimuloi RNaasi L:ää.
Esimerkki 38 20 ps-Co(2151)Co(2151)Co(2·51)Co-väliryhmä-( ctc ctg cgg-hex [ps tarkoittaa 5f-tiofosfi ·\· mää; väliryhmä tarkoittaa trietyleenigl] • * faattia; Co on kordysepiini (3'-deoksiadei (2'5') tarkoittaa sitä, että nukleotidier ' · * aa". 25 sidos on muodostunut 2'- ja 51-aseman väli s a
, . Synteesi toteutetaan vastaavalla tavalla J
• ψ * merkissä 37, mutta NÄ-bentsoyyli-5 -O-Dmt-31 -0-( t- aa* dimetyylisilyyli )adenosiini-21 -O-syaanietyylidi-if liaminofosforiamidiitin sijasta käytetään vasta • 9
; 30 bentsoyyli-5' -O-Dmt-kordysepiini-2' -0-syaanietyyJ
<«< • · — —J · j j j ^4.j _ / nu-.—..U4. j u » 11 66
Esimerkki 39 51-GG GGG GGG (Oeg(t)) ttt ttt ttt-hex
Synteesi toteutetaan vastaavalla tavalla 1 merkissä 18, jolloin yhdeksän PNA-kytkennän jäll· 5 densoidaan kytkentäyksikkö Mmt-Oeg(t)-OH (esimei vaiheessa 5 kuvatuissa olosuhteissa, joka yksikkö listaa kahdeksan gyanulaattiryhmän kondensoinnin keen. Tuloksena oleva PNA-DNA-oligomeeri sitoutuu säikeen muodostavana oligonukleotidina suurella a: 10 tiliä DNA-kaksoissäikeeseen, jossa esiintyy i 5'..AAAAAAAAAAGGGGGGGG..3', antiparalleelisti or: neena.
Esimerkki 40 PNA-DNA-hybridien karakterisointi
Karakterisointi tehdään HPLCrn, polyakry] geelielektroforeesin (PAGE) ja negatiivisiin ionc 5 rustuvan elektronisuihkumassaspektrometrian (ES-N
la. Tuotteet puhdistetaan edellä kuvatulla tavall jälkeen ne esiintyvät PAGE:ssa (20 % akryyliani! bisakryyliamidia ja 7 mol ureaa/1) yhtenäisenä vj nä. HPLC-ajot tehdään Merck-yhtiön valmistamissa J 10 faasipylväissä RP-18 (eluentti A: 0,1 % TFA:ta ä :\\ vesi, eluentti B: vesi-asetonitriiliseos suhtee * * lineaarinen gradientti) tai Dionex-yhtiön valm: PA-100-pylväässä (eluentti A: 20 mmol NaOH:a/l j< . . NaCl:a/l, eluentti B: 20 mmol NaOH:a/l ja » > 1 '11/ 15 NaCl:a/l; lineaarinen gradientti). ES-MS'-spekt • · * *·* varten PNA-DNA-hybridit muunnetaan ammoniumasc seostamalla tai muulla suolanvaihdolla ammoniumsi « * : Näyte otetaan liuoksesta, joka sisältää old ··* * ( 5 OD.^/ml) asetonitriili-vesiseoksessa (1:1). Mc 67
Esimerkki 41
Soluunoton ja stabiilisuuden määritys radi< sen leimauksen jälkeen Radioaktiivinen leimaus 5 Yleisesti käyttökelpoinen leimaus 35S-is( tapahtuu niin, että DNA-osaa syntetisoitaessa toi DNA-synteesisyklin aikana ainakin yksi hapetus ( esimerkissä 17) alkuainerikki-35:llä. PNA-DNA-! joissa esiintyy 51-asemassa vapaa hydroksyyliryt
10 daan leimata polynukleotidikinaasin avulla 32P
35S:llä sinänsä tunnetuin menetelmin. PNA-DNA-1 joissa esiintyy 3'-asemassa vapaa hydroksyyliryt daan leimata 3'-terminaalisella transferaasilla ti tavalla. Tässä esitetään esimerkkinä DNA-osan 5'-
15 Esimerkin 17, 18 tai 26 mukainen PNA-DNJ
(500 pmol), joka sisältää 5'-asemassa vapaan hyd] ryhmän, liuotetaan veteen (425 μΐ), liuos kuui lämpötilaan 90 °C ja jäähdytetään äkkiä. Sitten lOx kinaasipuskuria (50 μΐ) ja gamma-[32P]ATP:tä t 20 [35S]ATP;tä (50 μΐ, 6000 Ci/mmol) ja liuosta inkul tunti lämpötilassa 37 °C. Reaktio pysäytetään 1: •*.J 0,5 M EDTA-liuosta. Suolanpoisto tehdään Pharmac: :v. valmistaman NAPR-pylvään avulla.
* « \9m\ Soluunoton määritys • ·
25 Vero-soluja inkuboidaan 96-syvennyksisilJ
.*/ maljoilla DMEMrssä, joka sisältää 5 % FCS:ää, 2 * · · ••jj lämpötilassa 37 *C. Sen jälkeen kun elatusalusta : tettu, solut pestään vielä kahdesti seerum: DMEM:llä. Radioaktiivisesti leimattu oligomeeri # · · 30 käystä/min) laimennetaan leimaamattomalla olig< :* Ditoisuuteen 10 umol/1 seerumissa, ia solui a in] 68 DMEM:istä (merkintä: supernatantti 2) tehdään mit1 kelaskurilla. Sen j älkeen lisätään trypsiir (100 μΐ), odotetaan 30 sekuntia ja poistetaan sup€ ti. Solujen irrottamiseksi maljasta suoritetaan 3 5 inkubointi lämpötilassa 37 °C. Irrotetut solut sd Eppendorfin astioihin (koko 1,5 ml) ja niitä send daan 6 minuuttia nopeudella 2000 kierrosta/minuut pernatantti 3"). Kustakin supernatanteista 1 (5 v 3 (0,5 ml) tehdään erikseen mittaus tuikelaskuril 10 taustuloksista saadaan lasketuksi oligomeerin se pikomooleina 100 000 solua kohden, jolloin supern« osoittaa soluihin sitoutuneen oligomeerijakeen ja tanttien 1 ja 2 summa soluihin sitoutumattoman old j akeen.
15 Tulos:
Inkubointi Soluunotto (pmol oligomeeria/1'
aika (h) PNA-DNA-hybridi I
1 0,25 C
7 0,54 C
20 24 0,75 C
Oligomeerin stabiilisuutta soluja sisältävä • · tusalustässä koskeva tutkimus
Supernatantti in 1 (10 μΐ) sekoitetaan £ a 25 formamidia (5 μΐ, mukana ksyleeniä/glykolia ja bi , , lisinistä), seos kuumennetaan lämpötilaan 95 °C (i » I · ···/ seos laitetaan polyakryyliamidigeelille (20 % aki • · · ** * dia, 7 mol ureaa/1). Sen jälkeen kun geeli on l· sähkökentässä, geelissä esiintyvät vyöhykkeet ryhn • a : 30 autoradiografian avulla "stabiiliksi oligomeeri *· · * 2 "hadonneeksi oliaomeeriksi” (virheelliset vvöhvkh 69
Esimerkin 31 mukaisen PNA-DNA-oligomeerin tumisaika on kyseisissä olosuhteissa 32 h, kun ' taavan DNA-oligonukleotidin puoliintumisaika on ] Esimerkki 42 5 Soiuunoton määritys fluoresenssileimaukse: COS-solujen annetaan kasvaa petrimaljoisi Dulbeccon MEM-elatusalustalla, jota on täydennett (10 %) , kunnes pesäkkeet ovat kasvaneet yhteen. S tään kahdesti seerumittomalla DMEM:llä. Pintaa ra 10 petrimaljan keskeltä noin 1 cm2:n alueelta steriil avulla. Tälle alueelle levitetään tutkittavaa oligomeeriliuosta (0,1 mmol/1). Inkuboidaan C02-at: alla lämpötilassa 37 °C. Solut tutkitaan flucres roskoopilla 2, 4 ja 16 tunnin kuluttua. Sitä var 15 pestään neljästi seerumittomalla DMEM:llä ja objektiivilasilla, ja niitä arvioidaan fluoresens koopin tai vaihekontrastin avulla. Vertailukohdi DNA-hybridimolekyyleille tutkitaan fluoresenss PNA (ilman DNA-osaa) F-(but)-tttt ttt-hex. Sen jä 20 soluja on inkuboitu 2 tuntia kyseisen PNA:n kai 90 % soluista osoittaa merkkejä suurista morfo ;'-J muutoksista ja solukuolemista. Useimmissa soluiss * * ;V. vakuolien muodostumista. Plasmamembraanissa, sy ja tumassa ei ilmene lainkaan PNA:n vastaanotto! * » 25 PNA:n kanssa suoritetun 2 tunnin lisäinkuboinnii . . kaikki solut ovat kuolleet. Toisin käy keksinnön ] f « · DNA-PNA-oligomeerien tapauksessa. Jo sen jälkeen • » » * luja on inkuboitu 2 tuntia DNA-PNA-oligomeeriei ilmenee DNA-PNA-oligomeerien pistemäistä solu « · : 30 jakautumista. Solut eivät kuole pitemmänkään in «i« m * J 1_______ 70 tilansäätöohjelmaversion B5.1 (Hewlett Packard avulla. Mittaus tehdään nostamalla lämpötilaa a: nopeudella 0,5 eC/min ja käyttämällä puskurina joka sisältää 10 mmol HEPESiä/1 ja 140 mmol Ne 5 7,5). Oligomeeripitoisuus on 0,5 - 1 OD260/ml.
Esimerkin 17 tai 18 mukaiselle tuotteel tulos: T„ DNA:ta vas 5' -ATC GTC GTA T(0eg(t)a gtc-hex T„ - 51,5 *C 10 3'-TAG CAG CAT A AT CAG-5' antiparallee: 5’-ATC GTC GTA T(Oeg(t)a gtc-hex TH < 20 eC 5?-TAG CAG CAT A AT CAG-3' paralleeli
15 5'-ATC GTC GTA TT(but)a gtc-hex TM » 51,0 eC
3’-TAG CAG CAT AA T CAG-5' antiparallee:
5' -ATC GTC GTA TTA GTC-3' TM = 50,5 °C
3'-TAG CAG CAT AAT CAG-5' DNA*DNA antip, 20
5’-ATC GTC GTA TT (but) a gtc-hex TM < 20 °C
*\: 5’-TAG CAG CAT AA T CAG-3’ paralleeli • * 99 9 9 9 9 J * ·♦»*· 1 • 25 DNA: ta . .* Sekvenssi vastaan 9 9 9
5' -ACA TCA TGG TCG-3’ DNA ap 50,7 *C
: 3 1 -TGT AGT ACC AGC-5'
30 5f -ACA TCA tgg tcg-3' (PNA-DNA) ap 54,5 °C
99 9 a « Λ I mnm « χία C f 71
5'-aca tea tgg teg-3* PNA ap 58,8 °C
3'-TGT AGT ACC AGC-5'
5*-aca tea tgg tcg-3f PNA p 46,3 *C
5 5*-TGT AGT ACC AGC-3*
5 *-ACA TCA TGG TCG-3* S-DNA ap 46,7 °C
3*-TGT AGT ACC AGC-5* 10 TGG TCG tarkoittaa DNA-osaa, jossa kaikki i dien väliset sidokset ovat tiofosfaatin muodossa, ja ap:n määritelmiin tulee, ks. sivu 5.
Esimerkki 44
Viruksenvastaisen aktiivisuuden testaus 15 Testattavien aineiden viruksenvastäinen erilaisia ihmisille tauteja aiheuttavia herpe: vastaan tutkitaan soluviljelmäkoejärjestelyä ]
Testiä varten apinan munuaissoluja (Vero, 2*10s/m loidaan 96-syvennyksisillä mlkromaljoilla olevaan 20 pitoiseen Dulbeccon MEM-elatusalustaan (5 % naudi seerumia, FCS) ja inkuboidaan 24 tuntia lämpötila atmosfäärissä, joka sisältää 5 % C02:a. Seerum: :v. elatusalusta imetään sitten pois ja solut huuhdo • * [#i\ des ti seerumittomalla Dulbeccon MEM-elatusalust • * . 25 FCS:ää). Testattavat aineet esilaimennetaan vetei / / suuteen 600 pmol/l ja niitä säilytetään läm] ««· : -18 °C. Testiä varten tehdään lisälaimennuksia 1 ·♦* V * MEM-elatusalustaan (MEM = Minimal Essential Mediu: dottuihin soluihin lisätään kulloinkin 100 μΐ te: jj * 30 yhdisteen yksittäistä laimennosta yhdessä 100 μΐ ··· . _ _ .
m » -J i 1 UI?M a «am Ί . . a / a J ΠΟ O
72 VR734, HSV-2 G -kanta) pitoisuuksina, joilla soli tuhoutuu täydellisesti 3 vuorokaudessa. HSV-l:n ti sa infektion voimakkuus on 500 pesäkkeenmuodostu: (PFU) syvennystä kohden ja HSV-2:n tapauksessa 35( 5 vennys. Testausseokset sisältävät silloin 0,04 -testattavaa ainetta/1 MEM:ssä, jota on täydennel silliini G:llä (100 ky/ml) ja streptom; (100 mg/1). Kaikki kokeet tehdään kaksoismäärityl kuunottamatta vertailukokeita, joita tehdään 8 10 maljaa kohden. Testiseoksia inkuboidaan 17 tuntia lassa 37 °C atmosfäärissä, joka sisältää 5 % C02:a tavien aineiden sytotoksisuus määritetään 20 turo naisinkubointiajan jälkeen arvioimalla soluviljei roskooppisesti. Suurimmalla siedettävissä olevai: 15 sella (DTM) tarkoitetaan valmisteen suurinta pit< joka ei mainituissa koeolosuhteissa aiheuta vie. mikroskoopilla havaittavissa olevia soluvaurioita tystä varten lisätään sellainen määrä FCS:ää, lopulliseksi pitoisuudeksi tulee 4 %, ja inkuboii 20 ketään vielä 55 tuntia lämpötilassa 37 *C atmos joka sisältää 5 % C02:a. Käsittelemättömät verta tiot osoittavat sitten täyden sytopaattisen va * 4 :v« (CPE)· Mikroskooppisen arvioinnin jälkeen solu1 värjätään sitten neutraalilla punaisella värillä • » . 25 vitaa li värjäysmenetelmää (1966) vastaavalla tava^ * .
. . tatun aineen viruksenvastäinen vaikutus määrillää « * 1 *l\/ toriseksi minimipitoisuudeksi (MIC), joka vaadita » t t *·* * 30 - 60 % soluista saadaan suojatuksi viruksen i geeniseltä vaikutukselta. PNA-DNA-kimeerien aktii • * ·,· ; 30 aina parempi kuin vastaavien DNA-oligomeerien tai
• M
• 4 am 73
Esimerkki 45
Aktiivisuuden in vivo määritys: c-fos-pi ilmentymisen inhibitio rotassa Määritys tehdään, kuten Sandkuhler et ai.
5 vanneet lähteessä Proceedings of the VIth World on Pain, toimittajat Charlton ja Woolf, Elsevier( dam 1991, s. 313 - 318, selkäydinperfuusion avulli turaatilla nukutetuille Sprague-Dawley-rotille t< minektorni an jälkeen muodostetaan si likoni st a kaks: 10 nen säiliö antisense-oligomeerin soluunottoa väri nen kammio täytetään antisense-PNA-DNA-johdokse taas toinen kammio täytetään vertailuoligomeeri] mankin väkevyys 75 pmol/l). Perfusaatti vaihdet tunnin välein. 6 tunnin perfusoinnin jälkeen c-i 15 mentymistä stimuloidaan takajalkojen lämpökäs: (52 °C). c-fos:n ilmentymisen inhibitio voidaa immuunihistokemiallisesti asianmukaisilla kudoslt teillä. Esimerkin 31 mukainen c-fos-antisense-oli< tidi saa aikaan c-fos:n ilmentymisen voimakkaammai 20 tion kuin vastaava DNA-oligonukleotidi ja vastaavi kin 33 mukainen PNA-oligomeeri.
.*. : Esimerkki 46
• M
:\\ RNaasi H -määritys • « RNaasi H -aktiivisuuden määritystä varten 1 • * e 25 va PNA-DNA-oligomeeri (1,3 0D) liuotetaan yhdessä • · . . mentaarisen RNA-sekvenssin (0,5 OD; kohdesekvenss • * autoklavoituun veteen (50 μΐ), joka on käsitelty * * * (dietyylipyrokarbonaatilla), kuumennetaan 5 m: lämpötilaan 80 eC ja jäähdytetään sen jälkeen 15 • · * 30 kuluessa lämpötilaan 37 °C. Näin saadaan molemme : : meerit aluksi denaturoiduiksi. ia 1äähdvtvksen 74 ditiotreitolin (DTT, 1 μΐ) ja USB-yhtiön valmistat si H:n (2 μΐ, joka vastaa kymmentä yksikköä) kansi bointiseosta täydennetään autoklavoidulla, DEPC:J tellyllä vedellä halutun kokonaistilavuuden 100 μ: 5 tamiseksi. Näytteitä inkuboldaan lämpötilassa 37 ' tiikkatutkimusta varten liuoksesta otetaan näytt kellä 0 sekä 2 minuutin, 10 minuutin ja 1 tunnin (kunkin suuruus 20 μΐ), ne kuumennetaan 5 minuutd pötilaan 95 *C Ja pidetään lämpötilassa -70 °C ar 10 tiin saakka. RNaasi H:n aikaansaama RNA:n pilkkc tutkitaan geelielektroforeettisesti. ilmeni, ette ribonukleotidiyksikköjä sisältävät PNA-DNA-hybric voivat RNaasi H: n, jolloin komplementaarinen pilkkoutuu, kun taas PNA-DNA-oligomeeri selviyt 15 tiosta intaktina. PNA-DNA-oligomeerin tapauksessa tumisreaktio tapahtuu jonkin verran hitaammin kuii van oligodeoksiribonukleotidin tapauksessa, jolle pituus ja sekvenssi.
Esimerkki 47 20 HeLa-solu-uutteen valmistus, jossa esiintj L -aktiivisuutta :*·,· Sollujen endoribonukleaasi L:n aktiivisuud* * * tamiseksi 2 ', 5' -tetra-adenylaatti-PNA-DNA-konjuc * valmistettiin HeLa-solu-uute. Sitä varten 35 • * aaaa. 25 joissa kussakin on 20 ml elatusalustaa, joka sisä] • . , beccon MEM-elatusalustaa (Minimum Essential Me< » · * 10 % FCS:ää (naudan sikiön seerumia). Solut voidai • 4 · *·* ' talteen trypsiinikäsittelyn avulla. Nopeudella 1 ( rosta/minuutti sentrifugoinnin jälkeen saadaan V : 30 4 ml soluja. Niihin lisätään ensin 4 ml vettä ja • * · * « Ή n Irn 1 A ml nnolfnr^ 1 inne /R AQ n 75 pötilan ollessa 0 eC. Noin 8 ml:n solu-uutesupe: erotetaan ja säilytetään lämpötilassa -20 °C tutkimuksia varten.
Esimerkki 48 5 RNaasi L:n aktiivisuuden tutkiminen
Valmistetun uutteen endonukleaasi L -akti tutkimiseksi RNA-kohdesekvenssi (0,3 OD) kuumenna sin kulloisenkin PNA-DNA-oligomeerin kanssa 5 m lämpötilaan 80 °C ja jäähdytetään sen jälkeen hyb: 10 tia varten lämpötilaan 37 °C. Kaksoissäikeeseen taan kyseistä uutetta (20 μΐ), glyserolia (1, RNaasi L -puskuria ja seosta inkuboidaan läm 37 *C. Kokonaistilavuus on sen jälkeen 70 μ1· Ki: tutkimuksia varten liuoksesta otetaan pipetillä 15 hetkellä 0 sekä 20 minuutin ja 60 minuutin kulutt kuumennetaan 5 minuutiksi lämpötilaan 95 °C ents; naturoimiseksi. Näytteet kylmäkuivataan Speedvac-sa ja analysoidaan geelielektroforeettisesti. P1 tetra-adenylaattikonjugaatit tai niiden tetrakord; 20 analogit aktivoivat solujen RNaasi L:n, kun taas 1 yhdisteet, jotka eivät sisällä tetra-adenylaattii vät stimuloi RNaasi L:ää.
• *
Esimerkki 49 • · • · DNA-polymeraasireaktio • < 25 DNA-polymeraasireaktiossa templaattina to: • * . , raava 81-meerinen oligodeoksinukleotidi:
5' -GCC CCA GGG AGA agg caa ctg gac cga agg CGC TT
f « · '·* * AGG agt tca tag ctg ggc tcc CT a tag tga gtc gta : PNA-DNA-alukkeen sekvenssi on seuraava: • * IA * 30 H-taa tae gac tca cta (5NH-T)-OH-3'.
• SS
• ft ·___A _ · 1 « * « ......... - _ 76
MgCl2:a/l] oleva aluke (0,15 nmol) ja tempiaat nmol) laimennetaan vedellä (35 μΐ) ja hybridisoi· mentamalla lämpötilaan 95 °C ja jäähdyttämällä lisätään 2 mM dNTP-seosta (nukleosidi-51-trifos 5 10 μΐ) ja DNA-polymeraasia (Klenowin fragmenttia; inkuboidaan 0,5 tuntia sekä lämpötilassa 22 °C et Reaktioliuos analysoidaan sitten 10-%:isella pol; amidigeelillä (joka sisältää 1 % bisakryyliamidii keriksi lisätään pBR322~HaeI11-pilkkomisseosta. 10 vertailualukkeen kanssa antaa tulokseksi kaksi: DNA-fragmentin, jolla on odotettu suuruus suhteei keriin, kun taas PNA-DNA-alukkeesta syntyvä tuoti jonkin verran nopeammin. Molemmissa tapauksissa säie liikkuu geelielektroforeesissa oleellisesti i 15 kuin yksisäikeinen templaatti.
• « • · * • «« ♦ « ·· « « · « • * ♦ * • * * » * « · • · i t # 4 i«« i * · ·
• f I
• · • · « • · <· • *i i M# • m

Claims (13)

  1. 77
  2. 1, Polyamidi-oligonukleotidijohdokset, jc kaava (Ia), 5 / f---(·<«)„—|^ fr' R1 C»0 O
  3. 1 II ( t I , }---{&),, CH^-CHj-M — CHj — C (li V N --<»»>.— R2 C «0 0 I II ( L I , )---( D)p - CHj-CHj-K — CH, — C-- L J t L J j / • · • ♦ * * SS .1 .* jossa J * * * \ x on 1 ja * * 10 q=r=ljas=t=0 tai * * r==s = ljaq = t = 0 tai e a : q = r = s = 1 ja t = 0; **· « V i R tarkoittaa vetyä, hydroksyyliä, halogeenia, atsidoa tai aminoa; ♦ ·*· 15 B tarkoittaa muista riippumattomasti nukl< Mi a miassa tavanomaista emästä, ia aaltosulku tarkoitt 78 Nu tarkoittaa ryhmää, jolla on kaava (Hb), 5' 5' H u I RJ R* r ί I I u-p-v- u-p-v — II II W W (Ilo) (Mb) 5 joissa R2 ja B ovat edellä esitettyjen määritelmie siä; | U tarkoittaa hydroksyyliä, merkaptoa, Ci_ liä, Ci-is-alkoksia, Cg-20-aryyliä, C6-i4~aryyli-Ci_8-10 tai ryhmää NHR3 tai NR3R4; (i( · R3 tarkoittaa Ci-ia-alkyyliä tai Ci-4-alk< alkyyliä ja • * · • ·[ R4 tarkoittaa Ci_18-alkyyliä tai R3 ja R4 muodostavat yhdessä sen typpiatomir ·*#! ** * 15 johon ne ovat sitoutuneet, 5- tai 6-jäsenisen heti * * S.: · sen renkaan, joka voi lisäksi sisältää toisenkin hi V : min, joka voi olla O, S tai N; V tarkoittaa oksi-, sulfanidyyli- tai imino • ·*· W tarkoittaa okso- tai tioksoryhmaä; ja ··· * .···, 20 Y tarkoittaa oksi-, sulfanidyyli-, metyle 4 79 e ch2 c-o I M <" - CH2-CH2-N — CH2 — C — H - H jossa B on edellä esitetyn määritelmän mukainen; n = 0 - 20; p = 0 - 20;
  4. 5 Lii ja Li2 tarkoittavat kukin, toisistaan ri tomasti, kaavan (V) mukaista rakennetta, [ (V1 ) - (G) - (G1) ] ε (V) 10 jossa s on 1 - 5; V' tarkoittaa happea, NH-ryhmää, sidosta mää, jolla on kaava (VI), u • * I !.··' I •vl -Y-p-V- (VI) : ·: n • · 15 w * • « }j’| jossa U, V, W ja Y ovat edellä esitettyjen määrite] ·*·*· kaisia; G tarkoittaa Ci_i2-alkaanidiyyliä, joka voi : 20 essa olla halogeenilla, aminolla, hydroksyylillä, * i t ]*··* kyylillä, Ci-ig-alkoksilla, C6-i4~aryylillä tai C6_i, 80 ta ryhmää, jossa U, V, W ja Y ovat edellä esitetty ritelmien mukaisia; F ja F' ovat kytkeytyneet yhteen kovalentt: välityksellä (sykliset yhdisteet) tai F ja F' ova 5 ryhmiä, jotka edistävät soluunottoa, jotka mahdollistavat leimauksen, jotka sitoutuvat nukleiinihappoihin tai kytkeväl pilkkovat tai verkkouttavat niitä tai 10 F tarkoittaa ryhmää R°-(A)]t-V- ja F' tarkoittaa kaavassa (Ia) ryhmää -(Q)i-R1, R° tarkoittaa vetyä, Ci-1B-alkanoyyli-, Ci_i8-karbonyyli-, C3-8-sykloalkanoyyli-, C7-i5-*aroyyli- t heteroaroyyliryhmäa tai ryhmää, joka edistää oi: 15 soluunottoa tai toimii DNA-koettimen leimausryhr hybridisoitaessa oligomeeri kohdenukleiinihappoon viimeksi mainittuun niin, että tapahtuu sitoutumir loittuminen tai pilkkoutuminen; tai k:n ollessa no. vety tai muodostaa yhdessä V:n kanssa ryhmän, jolla 20 va (VII), .·.: v • ·· • * ·· * I * · * I : i-p _—-1 - (vii) - Il w s • « « * :|Γ: jossa Z ja Z' tarkoittavat toisistaan riippumattoina 25 roksyyliä, merkaptoa, Ci_22-alkoksia, Ci-ie-alkyyli ί aryyliä, C6_i4-aryyli-Ci-i8-alkyyliä, Ci_22-alkyylitioa «···. N HR tai NR R tai ryhmää, joka edistää oligome» 81 R1 tarkoittaa vetyä tai ryhmää Q°, jolloin F ty ainoastaan silloin, kun samanaikaisesti 1 = 0 ja sa (Ia) t = 0 ja s = 1 ja Liirllä on kaavan (V) rakenne, jossa V on sidos, G on sidos, e = 1 ja G 5 si-, sulfanidyyli- tai iminoryhmä tai ryhmä, jolla (VI), jossa U = Z; A ja Q tarkoittavat toisistaan riippuma luonnollisesta tai luonnossa esiintymättömästä amin peräisin olevaa ryhmää;
  5. 10 Q° tarkoittaa hydroksyyliryhmää tai ryhmää tai NHR'1, joissa R' tarkoittaa Ci-ie-alkyyliä ja R* ' tarkoittaa Ci_18-alkyyliä, Ci-i8-aminoalky Ci-is-hydroksialkyyliä; 15. on edellä esitetyn määritelmän mukainen; k on 0 - 10 ja 1 on 0 - 10; sillä edellytyksellä, että a) jos kaavan (Ia) mukaisessa yhdisteessä 20 s = 1 ja Lii on ryhmä (V ) - (G) - (G' ), jossa V oi (VI) mukainen ryhmä, G on C2-i2-alkyleeni ja G' on : ryhmässä F1 = -(Q)i-R1 1 on 0 - 10 ja R1 on ryhmä Q°; i ·· :·β.' b) jos kaavan (Ia) mukaisessa yhd • * s = t - 0, niin L12 on sidos; . 25 jolloin kullakin nukleotidilla voi olla D- tai L- raatio ja emäs voi esiintyä a- tai β-asemassa. *** : 2. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset polyamid • ψ 9 V : nukleotidijohdokset, joilla on kaava (Ia), t u r siitä, että emäs esiintyy β-asemassa. f 30 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaiset po oligonukleotidijohdokset, jolloin pääteryhmät, jot 82 -0- (CH2Cti20) 7- iCH2) 15-CH3 mutta myös steroidiryhmät kolesteryyliryhmä, tai vitamiiniryhmät, kuten vita] vitamiini A ja vitamiini D, ja muut konjugaatit käyttävät hyväksi luonnossa esiintyviä kantajasys 5 kuten gallushappo, foolihappo, 2-(N-alkyyli, N-alkc noantrakinoni, sekä mannoosin konjugaatit ja sopi1 septorien peptidit, jotka johtavat oligonukleotidie torivälitteiseen endosytoosiin, kuten EGF (epider kasvutekijä), bradykiniini ja PDGF (verihiutale 10 kasvutekijä); ja pääteryhmät, jotka mahdollistavat sen, valitaan fluoresoivista ryhmistä, esimerkiksi li-(N=dimetyyli-l-aminonaftyyli-5-sulfonyyli-), flu ni- tai kumariini johdoksista, tai esimerkiksi ak johdosten kemiluminesoivista ryhmistä, ELISA:11a d 15 tavissa olevasta digoksigeniinisysteemistä, bioti diinisysteemin välityksellä detektoitavissa oleva; tiiniryhmästä tai muista kytkentäryhmistä, jotka si sellaisia funktionaalisia ryhmiä, jotka mahdollista hemmin tapahtuvan muuntamisen detektoitavissa olev 20 maisinryhmillä, esimerkiksi aminoalkyylikytkentär joka muunnetaan aktiivisella akridiniumesterillä k ; nesenssikoettimeksi; ja pääteryhmät, jotka sito * * · ··,·] kytkevät ja/tai pilkkovat tai verkkouttavat nukle * * * \ poja, valitaan akridiini-, psoraleeni-, fenantr e 25 naftokinoni-, daunomysiini- tai kloorietyyliamin konjugaateista. • · * * 4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukais : amidi-oligonukleotidijohdokset, jolloin A ja Q muista riippumatta ryhmästä glysiini, leusiini, h :j*: 30 ni, fenyylialaniini, kysteiini, lysiini, arginiin: :***: ragiinihappo, glutamiinihappo, proliini, tetrahvd S3 tyrniini, guaniini, urasiili, inosiini tai ei-luonn set puriini, 2,6-diaminopuriini, 7-deatsa-adeniin: atsaguaniini, N4N4-etanosytosiini, N6N6-etano-2,6-puriini, pseudoisosytosiini, 5-metyylisytosiini, 5 5 urasiili, 5- (C3-Ce) -alkynyyliurasiili ja 5-(C3-C6)-lisytosiini tai niiden esiastemuodot.
  6. 6. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksen 1 kaisten polyamidi-oligonukleotidijohdosten valmista tunnettu siitä, että sopivalla tavalla derivat 10 kantajaan tai kasvavaan oligomeeriketjuun kondensoi rätysten PNA-yksikkö tai DNA-yksikkö, joka sisält loinkin yhden nukleosidiemäksen.
  7. 7. Jonkin patenttivaatimuksn 1-5 mukais< amidi-oligonukleotidijohdokset tarkoitettuina käyte 15 lääkeaineina.
  8. 8. Patenttivaatimuksen 1-5 mukaiset po oligonukleotidijohdokset tarkoitettuina käytettävi] keaineina hoidettaessa virusten aiheuttamia sairau sairauksia, joihin vaikuttavat integriinit tai so 20 adheesioreseptorit, syövän hoidossa tai restenoosi] syssä. * 9. Lääke, joka sisältää jonkin patenttivaa • ** .1 .* 1-5 mukaista polyamidi-oligonukleotidijohdosta. • · * • \ 10. Jonkin patenttivaatimusten 1-5 mukais * 25 amidi-oligonukleotidijohdokset tarkoitettuina käyte * * geenikoettimina. • ·
  9. 11. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukais « * · * amidi-oligonukleotidi johdokset, tunnettu siiti niissä esiintyy ainakin toisessa päässä nukleosidi : 30 joka sisältää 3'-asemassa hydroksyyliryhmän. t 12. fiöQn n kr>^t l πιτιλλ-τί t- \/<3 nl i rrr>— nnlunnV 84
  10. 13. Geenikoetinmääritys oligo- tai polynul· kohteen (RNA:n tai DNA; n) määrittämiseksi, tui siitä, että käytetään patenttivaatimuksen 11 mukai kettä.
  11. 14. Patenttivaatimuksen 12 tai 13 mukaine koetinmääritys, tunnettu siitä, että kohde mä£ hybridisaation avulla kohteen amplifikaation jälkee: 9 9 • ft · 9 9 9 9 9 99 · 9*9 m m 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9« 9 9 · 9 99 9 9 99 9 9 9 9 · 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 85 Fatentkrav
FI951132A 1994-03-14 1995-03-10 Polyamidi-oligonukleotidijohdoksia, niiden valmistus ja niiden käyttö FI117135B (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4408528A DE4408528A1 (de) 1994-03-14 1994-03-14 Peptid-Oligonucleotid-Derivate, deren Herstellung und Verwendung
DE4408528 1994-03-14

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI951132A0 FI951132A0 (fi) 1995-03-10
FI951132L FI951132L (fi) 1995-09-15
FI117135B true FI117135B (fi) 2006-06-30

Family

ID=6512694

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI951132A FI117135B (fi) 1994-03-14 1995-03-10 Polyamidi-oligonukleotidijohdoksia, niiden valmistus ja niiden käyttö
FI20051072A FI117939B (fi) 1994-03-14 2005-10-24 Polyamidi-oligonukleotidijohdoksia, niiden valmistus ja niiden käyttö

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20051072A FI117939B (fi) 1994-03-14 2005-10-24 Polyamidi-oligonukleotidijohdoksia, niiden valmistus ja niiden käyttö

Country Status (14)

Country Link
EP (2) EP1113021B1 (fi)
JP (1) JP4620810B2 (fi)
KR (1) KR100416864B1 (fi)
CN (1) CN100379756C (fi)
AT (2) ATE220070T1 (fi)
AU (1) AU698210B2 (fi)
CA (1) CA2144475C (fi)
DE (3) DE4408528A1 (fi)
DK (2) DK0672677T3 (fi)
ES (2) ES2179080T3 (fi)
FI (2) FI117135B (fi)
HK (2) HK1012003A1 (fi)
NO (1) NO314664B1 (fi)
PT (2) PT672677E (fi)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998003542A1 (en) * 1996-07-24 1998-01-29 Buchardt, Dorte Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US6710164B1 (en) 1993-11-22 2004-03-23 Peter E. Nielsen Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US6150510A (en) 1995-11-06 2000-11-21 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Modified oligonucleotides, their preparation and their use
DE4438918A1 (de) * 1994-11-04 1996-05-09 Hoechst Ag Modifizierte Oligonukleotide, deren Herstellung sowie deren Verwendung
DE19502912A1 (de) * 1995-01-31 1996-08-01 Hoechst Ag G-Cap Stabilisierte Oligonucleotide
PT739898E (pt) * 1995-03-13 2002-03-28 Aventis Pharma Gmbh Mono-esteres de acidos fosfonucleicos processo para a sua preparacao e sua utilizacao
DE19532553A1 (de) * 1995-09-04 1997-03-06 Hoechst Ag Verfahren zur Herstellung substituierter N-Ethyl-Glycinderivate
GB2324534B (en) * 1996-01-06 2000-05-10 Danbiosyst Uk Composition for delivery of nucleic acid to a cell
ES2221942T3 (es) * 1996-05-24 2005-01-16 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Reactivo y metodo para inhibir la expresion de n-ras.
IL127244A (en) * 1996-05-31 2005-11-20 Allelix Neuroscience Inc Substituted amines, methods of their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US6191165B1 (en) 1996-05-31 2001-02-20 Allelix Neuroscience Inc. Pharmaceutical for treatment of neurological and neuropsychiatric disorders
DE19637339A1 (de) * 1996-09-13 1998-03-19 Hoechst Ag Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren
DE69829760T3 (de) 1997-09-12 2016-04-14 Exiqon A/S Bi- und tri-zyklische - nukleosid, nukleotid und oligonukleotid-analoga
WO1999034014A2 (en) * 1997-12-23 1999-07-08 Roche Diagnostics Gmbh A method for the determination of a nucleic acid
US5952202A (en) * 1998-03-26 1999-09-14 The Perkin Elmer Corporation Methods using exogenous, internal controls and analogue blocks during nucleic acid amplification
DE19935303A1 (de) 1999-07-28 2001-02-08 Aventis Pharma Gmbh Oligonukleotide zur Inhibierung der Expression von humanem eg5
US6316230B1 (en) * 1999-08-13 2001-11-13 Applera Corporation Polymerase extension at 3′ terminus of PNA-DNA chimera
US7205105B2 (en) 1999-12-08 2007-04-17 Epoch Biosciences, Inc. Real-time linear detection probes: sensitive 5′-minor groove binder-containing probes for PCR analysis
DE10019135A1 (de) 2000-04-18 2001-10-31 Aventis Pharma Gmbh Polyamidnukleinsäure-Derivate, Mittel und Verfahren zu ihrer Herstellung
US7348146B2 (en) 2003-10-02 2008-03-25 Epoch Biosciences, Inc. Single nucleotide polymorphism analysis of highly polymorphic target sequences
WO2005043127A2 (en) 2003-10-28 2005-05-12 Epoch Biosciences, Inc. Fluorescent probes for dna detection by hybridization with improved sensitivity and low background
DE102006034319A1 (de) * 2006-07-21 2008-01-31 Ugichem Gmbh Chirale mit Phosponsäurester- oder Phosphonsäure- substituierte Verbindungen
EP2781523A1 (en) 2013-03-18 2014-09-24 Miltenyi Biotec GmbH Lipophilic oligonucleotide analogs

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0383803B1 (en) * 1987-10-28 2000-05-03 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates
WO1993024511A1 (en) * 1992-05-29 1993-12-09 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates
US5138045A (en) * 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
DK51092D0 (da) * 1991-05-24 1992-04-15 Ole Buchardt Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf
US5646261A (en) * 1992-01-22 1997-07-08 Hoechst Aktiengesellschaft 3'-derivatized oligonucleotide analogs with non-nucleotidic groupings, their preparation and use
IL104461A (en) * 1992-01-22 2001-05-20 Hoechst Ag Oligonucleotide analogs, their preparation and pharmaceutical compositions containing them

Also Published As

Publication number Publication date
DE59510252D1 (de) 2002-08-08
ES2179080T3 (es) 2003-01-16
ATE335760T1 (de) 2006-09-15
JP4620810B2 (ja) 2011-01-26
JPH07278179A (ja) 1995-10-24
HK1038568A1 (en) 2002-03-22
NO314664B1 (no) 2003-04-28
EP1113021A2 (de) 2001-07-04
FI20051072L (fi) 2005-10-24
EP0672677A2 (de) 1995-09-20
EP0672677B1 (de) 2002-07-03
NO950955D0 (no) 1995-03-13
EP0672677A3 (de) 1996-01-17
PT672677E (pt) 2002-11-29
DE59511061D1 (de) 2006-09-21
ATE220070T1 (de) 2002-07-15
DK0672677T3 (da) 2002-10-28
HK1012003A1 (en) 1999-07-23
CN100379756C (zh) 2008-04-09
FI117939B (fi) 2007-04-30
AU1479895A (en) 1995-09-21
AU698210B2 (en) 1998-10-29
EP1113021A3 (de) 2001-07-11
KR950032265A (ko) 1995-12-20
CA2144475C (en) 2010-06-08
CA2144475A1 (en) 1995-09-15
DK1113021T3 (da) 2006-12-11
DE4408528A1 (de) 1995-09-28
PT1113021E (pt) 2006-12-29
EP1113021B1 (de) 2006-08-09
CN1112126A (zh) 1995-11-22
KR100416864B1 (ko) 2006-01-27
FI951132L (fi) 1995-09-15
NO950955L (no) 1995-09-15
ES2269239T3 (es) 2007-04-01
FI951132A0 (fi) 1995-03-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI117135B (fi) Polyamidi-oligonukleotidijohdoksia, niiden valmistus ja niiden käyttö
JP3335634B2 (ja) Ｐｎａ−ｄｎａ−ｐｎａキメラ高分子
AU706470B2 (en) Phosphonomonoester nucleic acids, process for their preparation, and their use
JP3717081B2 (ja) オリゴヌクレオチド類似体、その製造法および用途
US7550582B2 (en) Polyamide nucleic acid derivatives and agents, and processes for preparing them
JP3831407B2 (ja) メチルホスホン酸エステル、その製造方法およびその使用
De Napoli et al. A new solid-phase synthesis of oligonucleotides 3′-conjugated with peptides
US7485421B2 (en) Polyamide-oligonucleotide derivatives, their preparation and use
JP5149475B2 (ja) 負電荷を有するペプチド核酸誘導体、薬剤ならびにその製造方法
EP1295892A1 (en) Antisense molecules and method of controlling expression of gene function by using the same
EP1295891A1 (en) Nucleoside derivatives
WO1995031572A1 (en) Aminohydrocarbon phosphonate oligonucleotides and uses therefor

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 117135

Country of ref document: FI

MM Patent lapsed