FI105695B - Subtilisiinin analogeja, menetelmä niiden valmistamiseksi, niiden käyttö ja niitä koodaava DNA-sekvenssi - Google Patents

Description

. 1 105695

Subtilisiinin analogeja, menetelmä niiden valmistamiseksi, niiden käyttö ja niitä koodaava DNA-sekvenssi

Keksinnön taustaa 5 Tässä keksinnössä tarjotaan uusi luokka lämmönkes- täviä ja pH:n suhteen stabiileja subtilisiinin analogeja ja menetelmä sellaisten analogien valmistamiseksi. Tämä keksintö koskee subtilisiinin analogeja ja DNA-sekvenssiä. Tämä keksintö koskee erityisesti sellaisten subtilisiinin 10 analogien luokkaa, joissa on parantuneen kalsiuminsitomis-kyvyn antava muunnettu kalsiuminsitomiskohta ja Asn-Gly-sekvenssien, jotka ovat läsnä subtilisiinissa, kumman tahansa jäännöksen deleetio ja/tai korvaus. Keksintö koskee myös menetelmää kalsiuminsitomiskohdan omaavan Bacillus-15 subtilisiinin valmistamiseksi, jolla on parantunut läm-mönkestävyys ja pH-stabiilisuus, sekä subtilisiininanalo-gien käyttöä. Tämä keksintö koskee lisäksi pesuainevalmis-teita, jotka sisältävät sellaisia subtilisiineja, ja sellaisten subtilisiinien ja valmisteiden käyttöä puhdistus-20 tarkoituksiin.

Termi subtilisiini tarkoittaa ryhmää solujen ulkopuolisia aikalisiä sejriiniproteaaseja, joita tuottavat useat eri Bacillus-lajit. Näihin entsyymeihin viitataan myös Bacillus-seriiniproteaaseina, Bacillus-subtilisiinei-• 25 na tai bakteerien aikalisinä proteaaseina.

Bacillus-subtilisiinimolekyylit käsittävät yhden ainoan polypeptidiketjun, jossa on joko 274 jäännöstä (tyyppiä Carlsberg olevalla subtilisiinilla, jota tuottaa Bacillus licheniformis, ja subtilisiinilla, jota tuottaa 30 Bacillus subtilis -kanta DY) tai 275 jäännöstä (tyyppiä BPN' olevalla subtilisiinilla. jota tuottaa Bacillus amy--- loliquefaciens, bakteerin Bacillus subtilis aprA-geenin tuotteella ja bakteerin Bacillus mesentericus subtilisiinilla) . Kun tässä verrataan eri Bacillus-lajeilta 35 peräisin olevien subtilisiinien aminohapposekvenssejä, •« 2 105695 käytetään subtilisiinin BPN' sekvenssiä standardina. Esimerkiksi sellaisen sekvenssien rinnakkainasettamisen perusteella, joka antaa suurimman homologia-asteen subti-lisiini Carlsbergin ja subtilisiini BPN':n välille, ensik-5 si mainitun aktiivisessa kohdassa olevaan seriiniin viitataan seriininä 221, vaikka se sijaitsee aminohapposekvenssin asemassa 220. Samalla perusteella voidaan subtilisiini Carlsbergin aminohapposekvenssin aseman 220 sanoa "vastaavan" subtilisiini BPN':n asemaa 221. Katso esim. Nedkov et 10 ai., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 364, 1 537 - 1 540 (1983) .

Subtilisiini BPN':n röntgenrakenne (Wright et ai., Nature, 221, 235 (1969)) paljasti, että subtilisiinin katalyyttisen kohdan, joka käsittää aminohapot Asp42, His64 ja 15 Ser221, geometria on melkein identtinen nisäkkäiden se- riiniproteaasien (esim. kymotrypsiini) aktiivisen kohdan, joka käsittää jäännökset Asp102, His57 ja Ser195, geometrian kanssa. Kuitenkin Bacillus-seriiniproteaasien ja nisäkkäiden seriiniproteaasien väliset kaikki erilaisuudet osoit-20 tavat, että nämä kaksi proteolyyttisten entsyymien ryhmää eivät ole keskenään sukua.

Bacillus-subtilisiinien ryhmässä on saatavissa seu-raavien viiden subtilisiinin täydellinen aminohapposekvenssi: Carlsberg [Smith et ai., J. Biol. Chem. 243, 2 184 25 - 2 191 (1968)]; BNP' [Markland et ai., J. Biol. Chem., 242, 5 198 - 5 211 (1967)]; aprA-geenin tuote [Stahl et ai., J. Bacteriol. , 158, 411 - 418 (1984); DY Nedkov et ai., yllä] ja Bacillus mesentericus -subtilisiini [Svend-sen et ai., FEBS Letters, 196, 220 - 232 (1986)]. Subti- 30 lisiini Carlsberg ja subtilisiini BPN' (johon joskus viitataan subtilisiinina Novo) eroavat 84 aminohapon suhteen ja BPN':ssä olevan yhden lisäjäännöksen suhteen (subtilisiinin Carlsbergista puuttuu aminohappojäännös, joka vastaa subtilisiini BPN':n ja jäännöstä 56). Subtilisiini 35 DY käsittää 274 aminohappoa ja eroaa subtilisiini Carls- 3 105695 bergistä 32 aminohappoasemassa ja subtilisiini BPN':sta 82 aminohapon korvauksen ja yhden deleetion verran (subtilisiini DY:stä puuttuu aminohappojäännös, joka vastaa subtilisiini BPN':n aminohapposekvenssin kanssa. Vaikuttaa 5 siten siltä, että eri Bacillus-lajeilta peräisin olevien subtilisiinien aminohapposekvenssien välillä esiintyy laajaa homologiaa. Tämä homologia on täydellistä molekyylin eräillä alueilla ja erityisesti niillä, jotka osallistuvat katalyyttiseen mekanismiin ja substraatin sidontaan. Esi-10 merkkejä sellaisista sekvenssin invariansseista ovat primaarinen ja sekundaarin substraatinsitomiskohta, Ser125-Leu126-Gly127-Gly128 ja Tyr104, vastaavasti, ja reaktiivisen seriinin (221) ympärillä oleva sekvenssi Asn^-Gly^-Thr221-Met222-Ala223 .

15 Subtilisiinimolekyylit osoittavat ainutlaatuisia stabiiliusominaisuuksia. Vaikka subtilisiinit eivät ole täydellisen stabiileja laajalla pH-alueella, ne ovat suhteellisen vastustuskykyisiä denaturoitumiselle urea- ja guanidiiniliuosten vaikutuksesta ja niiden entsymaattinen 20 aktiivisuus säilyy jonkin aikaa 8 M ureassa. Liuoksissa, joiden pH on alle 4, subtilisiini menettää nopeasti ja palautumattomasta proteolyyttisen aktiivisuutensa. Gouna-ris et ai., Compt. Rend. Trav. Lab. Carlsberg, 35, 37 (1965) ovat osoittaneet, että subtilisiinin happodeakti- * 25 vaatio ei johdu yleisestä varausten vaikutuksesta ja poh tivat sen johtuvan muista muutoksista molekyylissä, kuten esimerkiksi histidiinijäännösten protonoitumisesta molekyylin sisäisissä, hydrofobisissaosissa. Bacillus-subti-lisiinit inaktivoituvat palautumattomasti vesiliuoksissa 30 nopeudella, joka riippuu suuressa määrin lämpötilasta ja pH:sta. pH-arvojen ollessa alle 4 tai yli 11 inaktivoitu-minen on hyvin nopeaa, kun taas väliltä 4,5 - 10,5 olevissa pH:issa nopeus, vaikka onkin paljon pienempi, lisääntyy liuoksen tullessa alkalisemmaksi. Tämän inaktivoitumisen 35 mekanismeja ei täysin tunneta, mutta on todisteita, jotka • · « 105695 viittaavat siihen, että itsepilkkoutuminen on ainakin osaksi syypää entsyymin epästabiiliuteen tällä pH-alueel-la. Yleensä on missä tahansa pH:ssa subtilisiinin deakti-voitumisnopeus sitä suurempi mitä korkeampi lämpötila on.

5 Proteaasien käyttö teollisuusprosesseissa, joissa vaaditaan proteiinien hydrolyysiä, on ollut rajoitettua johtuen entsyymien epästabiiliudesta käyttöolosuhteissa. Siten esimerkiksi trypsiinin sisällyttämisellä suurpesuai-neisiin (esim. Bio-38, Schnyder; Sveitsi) proteiinipitois-10 ten tahrojen poistamisen helpottamiseksi on hyvin vähäinen menestys, mikä epäilemättä johtui entsyymin epästabiiliudesta pesuolosuhteissa. Lisäksi on bakteerien aikalisiä proteaaseja, jotka sopivat yhteen pesuaineiden kanssa, käytetty pesuainevalmisteissa.

15 Koska monet teollisuusprosessit suoritetaan lämpö tiloissa, jotka ovat useimpien entsyymien stabiiliusalueen yläpuolella, erittäin lämmönkestävät proteaasit eivät tule ainoastaan olemaan edullisia eräitä teollisuusaloja varten, kuten esimerkiksi pesuaineteollisuutta ja karvojen 20 poistamista vuodista varten, joissa tapauksissa jo vaaditaan stabiileja proteaaseja, vaan voivat olla hyödyllisiä teollisuusaloilla, joissa käytetään kemiallisia keinoja proteiinien hydrolysoimiseksi, esim. kasvi- ja eläinprote-iinien hydrolyysissä keittotiivisteiden tuottamista var- • 25 ten.

Vaikka lämpöinaktivaatio voi olla tärkein entsyymien teollisuuskäyttöä rajoittava tekijä, myös muilla tekijöillä, kuten esimerkiksi tehokkuuden tarvitsemisella laajoilla pH-alueilla ja denaturoivien aineiden käytöllä 30 voi olla haitallinen vaikutus proteaasien teollisuusprosesseissa käytön suhteen. Sen vuoksi on toivottavaa stabiilius lämpötilan, pH:n, denaturoivien aineiden ja muiden eri teollisuusaloilla vaadittujen olosuhteiden suhteen .

35 • · s 105695

Muutamien viime vuosien aikana pesuainevalmisteiden kohdalla on tapahtunut suuria muutoksia, erityisesti fosfaattien korvaamisessa muilla tehoaineilla ja nestemäisten suurpesuaineiden kehittämisessä ympäristön ja kuluttajien 5 vaatimusten tyydyttämiseksi. Näiden muutosten johdosta kaivataan muutoksia perinnäisiin pesuaine-entsyymeihin. Aivan erityisesti on tullut tavoitteeksi käyttää prote-olyyttisiä entsyymejä, joilla on suurempi säilytyskestä-vyys nestemäisissä suurpesuaineissa sekä stabiilius ja 10 aktiivisuus laajemmilla pH- ja lämpötila-alueilla.

Yksi lähestymistapa sellaisten muunnettujen subti-lisiinien tuottamiseksi, jotka ovat hyödyllisiä pesu-ainevalmisteissa, on esitelty EP-patenttihakemuksessa no. 130 756, jossa mutaatioiden bakteerin Bacillus amyloli-15 quefaciens (B. amyloliquefaciens) subtilisiinissa asemissa Tyr'1, Asp32, Asn155, Tyr104, Met222 , Gly166, His64, Gly169, Phe189, Ser33, Ser221, Tyr217, Glu156 ja/tai Ala152 tunnistettiin antavan muuttuneen stabiiliuden, muuttuneen konformaation tai muutoksia entsyymin "jatkokäsittelyssä". Erityisesti väi-20 tettiin Met222 :n mutaation Ala:ksi tai Cys:ksi (jolla mutan-tilla esiintyy myös jyrkempi pH-optimi kuin villityypillä) tai Ser:ksi johtavan parantuneeseen hapetuskestävyyteen. Esitettiin, että Gly166:n korvaaminen jäännöksellä Ala, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Asn, Arg tai Vai muuttaisi entsyymin 25 kineettisiä parametrejä. Yksikään esitellyistä mutaatioista ei kuitenkaan tuota analogeja, joilla olisi suurempi stabiilius korkeissa lämpötiloissa tai jotka olisivat stabiileja laajemmalla pH-alueella kuin villityypin entsyymi.

Toisessa lähestymistavassa Thomas et ai., Nature, 30 318, 375-376 (1985) paljastivat, että subtilisiinin riip- i' puvuutta pH:sta voidaan muuttaa vaihtamalla Asp Ser:ksi subtilisiinin BPN' :n jaksossa Asp”-Gly100. Tämä vaihdos merkitsee pintavarauksen muutosta 14-15 Angströmin päässä aktiivisesta kohdasta. Thomas et ai. eivät kuitenkaan 35 tarjoa mitään osoitusta parannuksesta, kun ei tehdä pinta- * · 6 105695 varauksen muutosta, kuten tapauksessa, jossa yksi varaukseton jäännös korvataan toisella.

Kolmas lähestymistapa, joka on kuvattu samanaikaisesti haettavana olevassa US-patenttihakemuksessa S.N. 819 5 241, koskee Bacillus-seriiniproteaasien analogien luokkaa, jolle on tunnusomaista minkä tahansa proteaasissa läsnä olevien Asn-Gly-sekvenssien deleetio ja/tai muunnokset.

Keksinnön tiivistelmä Tämä keksintö tarjoaa sellaisten subtilisiinin ana-10 logien luokan, joilla on parantunut pH-stabiilius ja läm-mönkestävyys, minkä johdosta tällaiset analogit ovat erityisen hyödyllisiä pesuainevalmisteissa sekä muissa prosesseissa, joissa vaaditaan stabiileja proteaaseja. Tämän keksinnön mukaisilla subtilisiinin analogeilla on luonnos-15 sa esiintyvän Bacillus-subtilisiinin aminohapposekvenssi, jota on muunnettu (1) korvaamalla yksi tai useampia luonnossa esiintyvän Bacillus-subtilisiinin aminohapposekvenssissä läsnä olevassa kalsiuminsitomiskohdassa olevia aminohappo jäännöksiä negatiivisesti varautuneella aminoha-20 polla ja (2) poistamalla tai korvaamalla luonnossa esiintyvän Bacillus-subtilisiinin minkä tahansa aminohapposekvenssissä läsnä olevan Asn-Gly-sekvenssin kumpi tahansa jäännös. Keksinnön mukaiselle subtilisiinin analogille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. 25 Tämä keksintö koskee lisäksi subtilisiinin analogien käyttöä pesuainevalmisteissa. Keksinnön mukaisia subti-lisiininanalogeja käytetään puhdistustarkoituksiin.

Tämän keksinnön mukaiset subtilisiinin analogit osoittavat parantunutta lämmönkestävyyttä ja pH-stabii-30 liutta suurentunutta spesifistä aktiivisuutta ja laajaa substraattispesifisyyttä, mikä lisää tällaisia analogeja sisältävien pesuaineseosten pesukykyä. Erityisesti tämän keksinnön mukaisilla subtilisiinin analogeilla on parempi lämmönkestävyys, suurempi pH-stabiilius ja suurempi spesi-35 finen aktiivisuus kuin "villin tyypin" subtilisiineilla.

• · 105695

Lisäksi tämä keksintö koskee DNA-sekvenssejä, jotka omaavat yllä kuvatun mukaisen subtilisiinin analogin koo-daavat kodonit. Keksinnön mukaiselle DNA-sekvenssille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 20 esitetään.

5 Tässä keksinnössä tarjotaan myös menetelmä subti lisiinin analogien tuottamiseksi, johon menetelmään sisältyy yllä kuvatun mukaisen subtilisiinin analogin koodaavan nukleiinihapon omaava isäntäsolu. Sellaisessa solussa voi subtilisiinin analogin koodaava nukleiinihappo olla kro-10 mosomaalinen tai ekstrakromosomaalinen. Isäntäsolu valitaan mieluimmin kannasta, jolta puuttuvat erittyvät prote-aasit, jonka johdosta tämän keksinnön mukaiset analogit voidaan eristää helposti. Keksinnön mukaiselle menetelmälle kalsiuminsitomiskohdan omaavan Bacillus-subtilisiinin 15 valmistamiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 21 esitetään.

Keksintö mahdollistaa subtilisiinien lämmönkestä-vyyden ja pH-stabiiliuden parantamisen muuntamalla kal-siuminsitomiskohtaa ja/tai korvaamalla muulla aminohapolla 20 kuin asparagiini Asn-Gly-sekvenssissä olevan asparagiinin ja erityisesti subtilisiinin aminohapposekvenssissä siinä asemassa oleva asparagiinijäännös, joka asema vastaa asemaa 218 taulukossa 1 esitetyssä aminohapposekvenssissä.

Piirrosten lyhyt kuvaus 25 Kuviossa 1 esitetään kaavamaisesti Asn-Gly-jäännös ten, kuten esimerkiksi taulukossa 1 esitetyn mukaisen subtilisiinin asemissa 218 ja 219 olevien, saattaminen ren-gasmuotoon, jolloin muodostuu anhydroaspartyyliglysiini, ja kuvataan myös sen, Emäksen katalysoima, hydrolyysi; 30 Kuvio 2 on Bacillus subtilis (B. subtilis) -kannan QB127 EcoRI - Kpnl-geenipalasen, joka sisältää aorA-gee-nin, osittainen restriktiokartta ja se sisältää aprA-gee-nin ja sen sivuilla olevien sekvenssien osittaisen rest-riktiokartan; 35 • • - - - 8 10569b

Kuvio 3 on plastnidin pAMBll osittainen restrik-tiokartta;

Kuvio 4 on juoksukaavio, joka kuvaa pAMB113:n rakentamisen vaiheita, joka plasmidi määrää [Ser] 218-subti-5 lisiinin synteesiä B. subtilis -isäntäsoluista;

Kuvio 5 on pAMB30-plasmidin osittainen restrik-tiokartta;

Kuviossa S esitetään pAMB106:n rakentaminen;

Kuviossa 7 esitetään M13 mp!8 dapr4:n rakentaminen. 10 Yksityiskohtainen kuvaus

Huomattakoon, että termi "subtilisiini" tarkoittaa tässä käytettynä entsyymin valmista, eritettyä muotoa, josta puuttuvat etu (leader) -sekvenssit, jotka lohkaistaan valmiista entsyymistä ennen erittämistä tai eritettä-15 essä. Edustavia subtilisiineja, joita voidaan muuntaa tämän keksinnön mukaisesti, ovat, mutta ne eivät rajoitu näihin, luonnossa esiintyvät subtilisiinit, joita edustavat subtilisiini Carlsbergin, subtilisiini BPN':n, bakteerin Bacillus subtilis aprA-geenin tuotteen, subtilisiini 20 DY:n ja bakteerin Bacillus mesentericus subtilisiinin aminohapposekvenssi. Subtilisiini Carlsbergin aminohapposekvenssin ovat kuvanneet Smith et ai, J. Biol. Chem., 243, 2 184 - 2 191 (1968). Subtilisiini BPN':n aminohap posekvenssin ovat kuvanneet Markland et ai., J. Biol. 25 Chem., 242, 5 198 - 5 211 (1967). Subtilisiini DY: n aminohapposekvenssin ovat kuvanneet Nedlov et ai., Hoppe-Seyler1 s Z. Physiol., Chem., 364, 1 537 - 1 540 (1983).

Bakteerin Bacillus mesentericus subtilisiinin aminohapposekvenssin ovat kuvanneet Svedsen et ai., FEBS Letters, 30 196, 220 - 232 (1986). Bakteerin Bacillus subtilis aprA- geenin tuotteen aminohapposekvenssin ovat kuvanneet Stahl et ai., J. Bacteriol., 158, 411 - 418 (1984). Sellaisten subtilisiinien aminohapposekvenssi sisällytetään tähän viitteenä. Sellaisille subtilisiineille on tunnusomaista, 35 että niissä on kalsiuminsitomiskohtia, jotka ovat tarpeellisia molekyylin stabilisoimiseksi.

• · 105695 Tämän keksinnön mukaisesti tarjotaan sellaisten subtilisiinin analogien luokka, joilla on parantunut kyky sitoa kalsiumia. Kalsiumia on käytetty stabiloimaan subti-lisiinia jauheissa ja nestemäisissä pesuaineissa, erityi-5 sesti sovellutuksissa, jotka vaativat korkeampia lämpötiloja. Tämä keksintö koskee subtilisiinimolekyylin kal-siuminsitomiskohdan muuntamista kalsiumin sitomisen lisäämiseksi. Tässä käytettynä ilmaisu "kalsiuminsitomiskohdan muuntaminen" tarkoittaa subtilisiinin aminohapposekvens-10 sissä läsnä olevan kalsiuminsitomiskohdan alueella olevan yhden tai useamman “aminohapon korvaamista negatiivisesti varautuneella aminohapolla, jonka johdosta tulokseksi saatu subtilisiinin analogi kykenee omaamaan yhden negatiivisen varauksen lisää. On todettu, että yksi subtilisiinissa 15 oleva kalsiuminsitomiskohta käsittää seuraavat aminohapot:

Asp41, Leu75, Asn76, Asn77, Ser78, Ile79, Gly80, Vai81, Thr208 ja Tyr214, jotka liittyvät taulukossa 1 esitettyyn aminohapposekvenssiin. Tässä, keksinnössä korvataan mieluimmin yksi tai useampia kalsiuminsitomiskohdassa läsnä olevista 20 aminohapoista sellaisella "negatiivisesti varautuneella" aminohapolla kuin Asp ja Glu, ja erityisen mielellään Asp. Huomattakoon, että vaikka kalsiuminsitomiskohdassa oleva Asp41 on negatiivisesti varautunut aminohappo, vaihdetaan yhdessä tämän keksinnön suoritusmuodossa Asp41 Glu41:ksi.

• 25 Muut suoritusmuodot koskevat muita vaihtoja kuin Asp41:n.

Yksi tämän keksinnön erityisen hyvänä pidetty toteutus käsittää subtilisiinin analogin, jossa Asn76 on muutettu Asp76: ksi . Eräs"”toinen suoritusmuoto käsittää Ile79: n muuttamisen Asp79:ksi. Eräs erityisen hyvänä pidetty toteu-30 tus käsittää subtilisiinin analogin, jossa Asn77 on muutettu Asp77:ksi. Tämän keksinnön aivan erityisen hyvinä pidetyt suoritusmuodot käsittävät yllä olevat erityisen hyvinä pidetyt kalsiuminsitomiskohdan muuntamiset ja Asn109:n ja Asn218:n korvaamisen .Ser109: llä ja Ser218:lla, poistaen siten 35 kaksi epästabiilia Asn-Gly-sekvenssiä.

• « ίο 105695

Yllä kuvattujen kalsiuminsitomiskohtien lisäksi subtilisiineissa voi olla yksi tai useampia lisäkalsiumin-sitomiskohtia. Tämän keksinnön patenttivaatimukset käsittävät yhden tai useamman tai kaikkien kalsiuminsitomiskoh-5 tien, jotka voivat olla läsnä subtilisiinissa, muuntamisen. Niiden kalsiuminsitomiskohtien lukumäärä missä tahansa nimenomaisessa subtilisiinissa, joita voidaan muuntaa, riippuu monista tekijöistä, so. erityisestä subtilisiinis-ta, subtilisiininanalogin nimenomaisesta käytöstä. Muita 10 potentiaalisia kalsiuminsitomiskohtia, joita voi olla läsnä subtilisiineissa, ovat seuraavat (1) Asp140 ja Pro172; (2) Pro14 ja Gin271; ja (3) Pro172 ja Glu195 tai Asp197. Kussakin molekyylissä läsnä oleva erityinen kalsiuminsitomiskohta riippuu muunnettavasta nimenomaisesta subtilisiinista. 15 Kuten on mainittu aikaisemmin, yhden tai useamman aminohapon korvaaminen yllä olevissa potentiaalisissa kal-siuminsitomiskohdissa johtaa subtilisiiniin, jolla on parantunut lämmönkestävyys ja pH-stabiilius. Tyypillisiä esimerkkejä korvaamisista ovat Asp140 Glu140:llä, Pro172 20 Asp172:lla, Pro14 Asp14 : llä, Gin271 Glu271: llä, Glu197 Asp197: llä.

Subtilisiinimolekyylin kalsiuminsitomiskohtien muuntamisen lisäksi pidetään parhaana poistaa tai korvata mikä tahansa subtilisiinissa läsnä oleva Asn-Gly-sekvens-si. Kuten on aikaisemmin paljastettu US-hakemuksessa S.N.

• 25 819 241, on Bacillus-subtilisiinien asemissa 109 - 110 ja erityisesti asemissa 218 - 219 oleva säilytetty sekvenssi Asn-Gly tunnistettu näiden aineiden pH-instabiiliudesta suuressa määrin vastuussa olevaksi tekijäksi. Epästabiilin elementin Asn21a-Gly219 poistamiseksi subtilisiinimolekyylis-30 tä esiteltiin joko Asn218:n korvaaminen millä tahansa muulla aminohapolla kuin asparagiini ja/tai Gly219:n vaihtaminen miksi tahansa muuksi aminohapoksi kuin glysiini. Samalla tavoin kuvattiin asemissa 109 - 110 olevan epästabiilin Asn-Gly-elementin muuntamisen antavan siinä kuvatuille 35 ' analogeille stabiiliutta.

• · 105695

Lisäksi, kuten aikaisemmin on mainittu, erityisen hyvänä pidetyllä tämän keksinnön mukaisella Bacillus-sub-tilisiinin analogien luokalla on aminohapposekvenssi, jossa kalsiuminsitomiskohdan muunnoksen lisäksi asemat, jotka 5 sisältävät Asn-Gly-sekvenssin Bacillus-subtilisiinissa, eivät sisällä Asn-Gly-sekvenssiä analogissa ja jossa erityisesti on vähemmän Asn-Gly-sekvenssejä kuin Bacillus-subtilisiinissa. Kaikkein mieluimmin asema, joka vastaa asemaa 218 taulukossa 1 esitetyssä aminohapposekvenssissä, 10 ei sisällä asparaginyylijäännöstä, vaan mieluummin sisältää erilaisen aminohapon jäännöksen, mieluimmin aminohapon, joka on valittu seriinin, valiinin, treoniinin, kys-teiinin, glutamiinin ja isoleusiinin joukosta. Mikäli as-paragiinin korvaaminen joillakin aminohapoilla voi häiritä aktiivisen kohdan konformaatiota (esim. johtuen eteerisestä esteestä, jonka aromaattisen aminohapon läsnäolo voi aiheuttaa, tai sellaisista tertiaarisen rakenteen muutoksista, joita voi proliinin läsnäolo), sellaisilla aminohapoilla korvaamista pidetään tavallisesti vähemmän suotava-2o na. Samoin mikäli asparagiinin korvaaminen muilla aminohapoilla voi tuoda varautuneen ryhmän (esim. asparagiinihap-po) aktiivisen kohdan läheisyyteen, pidetään tällaista substituutiota vähemmän suotavana. Nykyään erityisen hyvä- • nä pidettyä toteutusta kuvaa analogi, jossa on muunnettu 25 kalsiuminsitomiskohta_ ja subtilisiinin Asn-Gly-sekvenssin [Ser218]-muunnos. Vaihtoehtoisia keksinnössä mahdollisia analogitoteutuksia ovat sellaiset, joissa on muunnettu kalsiuminsitomiskohta^ ja joissa subtilisiini BPN':n tai aprA-qeenin tuotteen Asn109 on korvattu, mieluimmin se- 3o - .......

riinillä, ja joissa asemissa 110 ja/tai 219 olevat gly- siinijäännökset on korvattu erilaisilla aminohappojäännöksillä. Muiden subtilisiinien kohdalla subtilisiinien Carlsberg tai DY kalsiuminsitomiskohdan tai -kohtien muuntaminen ja jäännösten 62 kohdalla olevan Asn:n tai jään- 3 s nöksen 63 kohdalla olevan Gly:n korvaaminen sisältyvät ·. myös tämän keksinnön piiriin.

12 105695

Johtuen Bacillus-mikro-organismien kyvystä erittää huomattavia määriä proteiineja ja koska niitä käytetään yleisesti pesuaineiden proteaasien tuottamiseen, ne ovat erityisen hyvänä pidettyjä isäntiä tämän keksinnön mu-5 kaisten subtilisiinin analogien tuottamisessa yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla. Koska useimmat Bacillus-lajit erittävät aikalisiä ja neutraaleja proteaaseja, pidetään parhaana järjestää mutaatioita B. subtilis-bakteerin endo-geenisten alkalisten ja neutraalien proteaasien geeneihin, 10 niin että B. subtilis voi tuottaa ja erittää muutettua subtilisiinia elatusaineessa, jossa ei ole muita proteaaseja. Tässä keksinnössä tarjotaan siten myös B. subti-lis-mutanttikantoja, joilla endogeenisten proteaasien synteesi on estynyt, mutta joilla on säilynyt kyky synte-15 tisoida ja erittää tässä esitettyjä subtilisiinin analogeja.

Kuten jäljempänä on kuvattu yksityiskohtaisemmin, todettiin, että tämän keksinnön mukaisten subtilisiinin analogien stabiilius pH:n ja lämmön suhteen ja stabiilius 20 pesuainevalmisteissa on huomattavasti parempi kuin villiä tyyppiä olevien aprA-geenintuote-subtilisiinin ja Carlsberg- subtilisiinin.

Keksinnön mukainen subtilisiinin analogi voidaan valmistaa seuraavan menetelmän mukaisesti: • 25 1) Edustavan subtilisiinigeenin aprA eristäminen bakteerista B. subtilis; 2) aprA-geenin kloonaaminen vektorissa, joka sallii oligonukleotidin avulla suoritetun kohdennetun mutagenee-sin käytön haluttujen muunnosten aikaansaamiseksi; 30 3) Kohdennettu mutageneesi ja tulokseksi saadun DNA:n sekvensointi halutun mutaation läsnäolon varmistamiseksi ; 4) Ilmentämisvektorin rakentaminen määräämään mutaation avulla muutetun entsyymin synteesiä B. subtilis -35 bakteerissa; • · 13 105695 5) Sellaisten mutaatioiden avulla muutettujen B. subtilis -kantojen aikaansaaminen, jotka eivät syntetisoi subtilisiinia eivätkä neutraalia proteaasia; 6) Solujen ulkopuolisessa kasvuliuoksessa olevan 5 entsyymin eristäminen ja sen puhdistaminen; 7) Menetelmien käyttäminen parannetun entsyymin koodaavan geenin liittämiseksi sellaisen B. subtilis -kannan kromosomiin, jolle on aikaisemmin aiheutettu mutaatioita endogeenisten proteaasien synteesin estämiseksi.

10 Tässä on käytäntönä osoittaa erityiset subtilisii- nin analogit esittämällä korvattu tai poistettu aminohappo suluissa. Esimerkiksi [Ser109] -subtilisiini tarkoittaa sub-tilisiinimolekyyliä, jossa on seriini aminohappoasemassa 109, ja [Ser109, Ser218]-subtilisiini tarkoittaa subti- 15 lisiinimolekyyliä, jossa on seriini aminohappoasemissa 109 ja 218.

Esimerkissä 1 eristetään subtilisiinin koodaava arpA-geeni B. subtilis -bakteerin genomista. Esimerkissä 2 suoritetaan aprA-geenille kohdennettu mutageneesi. Esimer-20 kissä 3 rakennetaan mutaation avulla muutetun aprA-geenin sisältävä ilmentämisyektori. Esimerkissä 4 valmistetaan [Ser109, Ser218]-subtilisiinin analogi. Esimerkissä 6 kuvataan [Asp76, Ser109, Ser218] -subtilisiinin analogi. Esimerkissä 7 kuvataan [Asp76, Asp77, Ser109, Ser218] -subtilisii-25 nin analogi. Esimerkissä 8 kuvataan [Asp76, Glu79, Ser109, Ser218] -subtilisiinin analogin valmistaminen. Esimerkissä 9 aikaansaadaan kaksi B. subtilis -mutanttikantaa, jotka eivät tuota todettavissa olevia solun ulkopuolisia prote-aaseja. Esimerkissä 10 kuvataan menetelmiä mutaation avul-30 la muutetun aprA-geenin integroimiseksi B. subtilis bak teerin kromosomiin. Esimerkissä li eristetään ja puhdistetaan villityyppi-ja mutantti-aprA-subtilisiineia. Esimerkeissä 12 - 14 verrataan [Ser218] -subtilisiinin lämmönkestä-vyyttä villityyppiä olevan aprA-geenin tuotteen lämmönkes-35 tävyyteen.

• «

• I

105695 Tämän keksinnön mukaisen subtilisiinin analogin lisäksi voivat tämän keksinnön mukaiset pesuainevalmisteet sisältää: (a) Vähintään yhtä pinta-aktiivista ainetta, joka 5 voi olla anioninen, ei-ioninen tai amfoteerinen tai veteen liukeneva saippua. Tyypillisesti käytetään anionista pinta-aktiivista ainetta (esim. lineaarista alkyyliaryylisul-fonaattia) seoksena ei-ionisen (esim. alkyylifenyylipoly-glykolieetteri) kanssa vastaavasti määrinä 5 - 30 ja 1 - 5 10 painoprosenttia pesuainevalmisteesta.

(b) Yhtä tai useampaa tehoainetta, joilla mieluimmin on samanaikaisesti sekvestrausvaikutus. Natriumtripo-lyfosfaatti, natriumsitraatti, natriumsilikaatti ja zeo-liitit ovat esimerkkejä sellaisista yhdisteistä, jotka 15 yleensä käsittävät 10 - 70 painoprosenttia pesuainevalmisteesta .

(c) Valkaisuainetta, mieluimmin sellaista perok-siyhdistettä, kuin esimerkiksi natriumperboraatti, jota on tyypillisesti lisätty 30 painoprosenttiin saakka valmis- 20 teestä käsittävänä määränä.

(d) Apuaineita, kuten esimerkiksi karboksimetyy-liselluloosaa, optisia kirkastusaineita ja hajusteita. Haluttaessa voidaan lisätä pH:n säätävää ainetta antamaan pesuliuokselle pH:n, joka on väliltä 8,0 - 10,5.

• 25 Pesuainevalmisteet sisältävät tehokkaan määrän yhtä tai useampaa tämän keksinnön mukaista subtilisiinin analogia. Tässä käytettynä tarkoittaa "tehokas määrä subtilisiinin analogia" sellaista subtilisiinin analogin määrää, joka tarvitaan antamaan määrätyssä pesuainevalmis-30 teessä tarvittavan entsymaattisen aktiivisuuden. Alan ta vallisen ammattitaidon omaavan on helppo ottaa selville sellaisia tehokkaita määriä ja ne perustuvat moniin tekijöihin, kuten esimerkiksi käytettävään nimenomaiseen subtilisiinin analogiin, puhdistuskäyttöön, pesuainevalmis-35 teen erityiseen koostumukseen, siihen, vaaditaanko nestemäinen vai kuiva valmiste, ja vastaaviin seikkoihin.

#

’ I

.15 105695

Keksinnön mukaista hiukkasmaista subtilisiinin analogi -valmistetta lisätään määränä, jonka on laskettu antavan vähintään entsyymiaktiivisuuden 0,1 Anson-yksikköä (Au, vide infra), mieluummin 0,5 - 2,5 AU 100 g:a kohden 5 pesuainevalmistetta. Tarvittaessa voidaan tasata 100 prosentiksi epäorgaanisen täyteaineen, mieluimmin natriumsul-faatin avulla.

Nestemäisiä pesuainevalmisteita voidaan valmistaa entsyymilietteistä, mieluimmin ei-vesiväliaineissa. Tyy-10 pillisesti voivat sellaiset lietteet käsittää suspension, jossa on hienoksi jauhettua subtilisiinin analogi -tiivistettä nestemäisess.ä ei-ionisessa pinta-aktiivisessa aineessa, esimerkiksi aineessa Tergitol 15 S 9, tai sellaisten pinta-aktiivisten .. aineiden seoksessa. Yleensä liete 15 sisältää myös yhtä tai useampaa epäorgaanista täyteainetta, kuten esimerkiksi hienoksi jauhettua natriumkloridia, haluttaessa seoksena suspension stabiloimisaineen, esimerkiksi höyrytetyn (fumed) piidioksidin (Aerosil 200) kanssa. Tergitol ja Aerosil ovat tavaramerkkejä.

20 Keksinnön mukaista subtilisiinin analogia lisätään määränä, jonka on laskettu antavan vähintään proteaasiak-tiivisuuden 0,1 AU, mieluummin 0,5 - 2,5 AU 100 g:a kohden nestemäistä pesuainevalmistetta.

Pesuainevalmisteet voidaan valmistaa tavanomaises-25 ti, esimerkiksi sekoittamalla komponentit keskenään. Vaihtoehtoisesti tehdään.esisekoitus, joka sekoitetaan sitten jäljellä olevien aineosien kanssa.

Kuvattujen hyvien stabiilius- ja aktiivisuusominai-suuksien johdosta keksinnön mukaisia subtilisiinin analo-30 geja voidaan käyttää kaikilla aloilla, joilla yleensä käytetään proteolyyttisiä entsyymejä. Erityisesti sitä voidaan käyttää pesuaineisiin ja puhdistusaineisiin tai tah-ranpoistoaineisiin, karvanpoistoaineena parkituksessa ja myös elintarviketeollisuudessa proteiinihydrolysaattien 35 valmistamiseen ja serologiassa epätäydellisten vasta-ai- 1 f * i 105695 neiden osoittamiseen. On erityisen edullista elintarviketeollisuudessa ja serologiassa käyttöä varten, että keksinnön mukaisilla subtilisiinin analogeilla on erinomainen stabiilius kiinteässä tai liuotetussa muodossa, niin että 5 ei ehkä tarvita fysiologisesti hyväksyttäviä määriä kal- siumioneja stabiloimaan subtilisiinin analogia vesiliuoksissa, toisin kuin muiden entsyymivalmisteiden kohdalla.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä lisää, vaikka on selvää, että keksintö ei rajoitu näihin erityi-10 siin esimerkkeihin.

Esimerkki 1 B. subtilis -kanta QB127 (trpC2 leuA8 sacUh200) [Le-pesant et ai., Molec. Gen. Genet., 118, 135 - 160 (1982)] hankittiin kokoelmasta the Bacillus Genetic Stock Center, 15 Ohio State University, Columbus, Ohio. Tämä kanta ylituot-taa solun ulkopuolisia seriini- ja metalliproteaaseja, a-amylaasia ja levaanisakkaraasia verrattuna isogeenisiin sacU1-kantoihin johtuen sacUh200-mutaation pleiotrooppises-ta vaikutuksesta [Lepesant et ai., teoksessa Schlessinger, 20 D., toim., Microbiology 1976, American Society for Microbiology, Washington, D.C., s. 65 (1976)]. Kanta QB127 on siten sopiva DNA-lähde subtilisiinin koodaavan aprA-geenin eristämistä varten.

B. subtilis -kannan QB127 soluista eristettiin ge-. 25 nomi-DNA noudattaen Saiton et ai. menetelmää, Biochim.

Biophys. Acta. 72, 619 - 629 (1963). Puhdistettua kro- mosomaalista DNA:a pilkottiin täydellisesti EcoRI-restrik-tioendonukleaasilla.

Tulokseksi saadut DNA-palaset eroteltiin alhaisen 30 sulamispisteen agaroosigeelissä elektroforeesin avulla ja .' eristettiin alueelta 4,4 - 8,0 kiloemästä (kb) olevat pa laset. Nämä palaset ligoitiin pCFM936:een (A.T.C.C.-no. 53 413 kokoelmasta the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland), Escherichia 35 colin (E. coli) plasmidiin, jolla esiintyy suurempia ko- • ·

- I

. i7 105695 piolukumääriä kohotetuissa lämpötiloissa ja joka antaa kanamysiiniresistenssin. Vektoria pilkottiin EcoRI:llä ja defosforyloitiin vasikan suolen alkalisen fosfataasin avulla ennen ligaatiota.

5 Ligaation tuotteet vietiin E. coli C600:aan (ATCC- no. 23 724 kokoelmasta the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland) ja sen jälkeen kun oli inkuboitu yön ajan L-agarilla, johon oli lisättiin 10 μg/ml kanamysiiniä, valittiin kanamysiinille 10 resistenttejä isäntäsoluja. Plasmidi-DNA:ta lisättiin in-kuboimalla valittuja isäntäsoluja 42 °C:ssa 4 tunnin ajan. Pesäkkeet siirrettiin sitten nitroselluloosasuodattimille ja käsiteltiin pesäkehybridisaatiomenetelmän mukaisesti, jonka ovat kuvanneet_ Grunstein et ai., Proc. Natl. Acad. 15 Sei. (USA), (72), 3 961 (1975).

Käytettiin oligonukleotidikoetinta sellaisten pesäkkeiden seulomalla löytämiseksi, jotka sisälsivät pCFM936:n subtilisiinigeenin. Koettimen, joka syntetisoi-i tiin käyttäen fosfiittimenetelmää, jonka ovat kuvanneet 20 Beaucage et ai., Tetrahedron Letters, 22, 1 859 - 1862 (1981), nukleotidisekyenssi oli 5' GCGCAAT CTGTT C CTTATGG C 3' 2 5 joka vastaa anrA-geenin tuotteen aminopäätettä (Wong et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 81, 1184 - 1188 (1984); Stahl et ai., J. Bacteriol., 158, 411 - 418 (1984). Käytettiin hybridisaatiolämpötilaa 55 °C ja kokonaismäärästä 30 400 identifioitiin 5 positiivista pesäkettä. Yhdestä posi- ’ tiivisesta pesäkkeestä saadulle plasmidi-DNA:lie annettiin nimitys pCFM936 apr2.

dPlasmidia pCFM936 apr2 pilkottiin pelkällä EcoRI:-llä, pelkällä Hindlll:llä ja molemmilla yhdessä. Subti-35 lisiinigeenin EcoRI-palasten koot olivat yhdenmukaisia 105695

Stahlin et ai. yllä, kuvaamien kanssa, mutta todettiin useita muuten kuvaamattomia HindiII-kohtia. Kuten tässä on kuvattu esimerkissä 3, kahta HindiII-kohdista käytettiin subtilisiinigeenin geneettisessä manipuloinnissa.

5 Pääteltiin, että B. subtilis QB127:n genomi-DNA:n suuri 6,5 kiloemäksen EcoRI-palanen sisälsi aprA-geenin, sen säätelysekvenssit ja siihen kuulumattomia sen sivuilla olevia sekvenssejä, varmistamalla, että restriktioentsyy-mien pilkkomistulokset olivat yhdenmukaisia Stahlin et 10 ai., yllä, ilmoittamien tulosten kanssa. Tämä vahvistettiin DNA:n sekvenssoinnin avulla käyttäen dideoksi-ketjun-päättymismenetelmää, jonka ovat kuvanneet Sanger et ai., J. Mol. Biol., 143, 161 - 178 (1980). 6,5 kiloemäksen Eco-RI-palasen 3,0 kiloemäksen EcoRI - Kpnl -osakappaleen, 15 joka on esitetty kuviossa 2, todettiin myös sisältävän aprA-geenin, sen säätelysekvenssit ja siihen kuulumattomia sen sivuilla olevia sekvenssejä. Vaikka Stahl et ai. ilmoittavat ja kyseisen julkaisun kuvion 1 kuvatekstissä mainitaan Kpnl - EcoRI-palasen olevan pituudeltaan 2,5 kb. 20 kuvion 1 mittakaavan ja siinä mittakaavan mukaan kuvatun palasen vertaaminen paljastavat, että myös Stahlilla et ai. Kpnl - EcoRI -palanen on huomattavasti suurempi kuin 2,5 kb.

Kloonausvektori Bacillus-isäntäsysteemejä varten, . 25 plasmidi pAMBll, rakennettiin seuraavalla tavalla. Plasmi- din pTG402 (Northern Regional Research Laboratories, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, kannan numero NRRL B-15264) pilkottiin osittain Rsal-rest-riktioendonukleaasilla. Palaset ligoitiin M13 mp!8:aan 30 (saatavissa laboratoriolta Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland luettelon numerona 8227SA), jota oli aikaisemmin pilkottu Hindi:11a. Ligaation tuotteet vietiin E. coli JM103:een (saatavissa toiminimeltä Pharmacia, Inc., Piscataway, New Jersey luettelon numerona 27-35 1545-01) transformaation avulla Mandelin et ai. menetelmän • i 105695 mukaan, J. Mol. Biol., 53, 154 (1970). Bakteriofaagiplak-keja suihkutettiin 0,5 M katekolilla (valmistettu tislattuun veteen) pTG402:sta peräisin olevan xvlE-geenin funktionaalisen ilmenemisen osoittamiseksi. xvlE-geeni koodaa 5 katekoli-2,3-dioksygeriäasin ja on hyödyllinen monissa eri organismeissa olevien promoottorien osoittamista varten [Zukowski et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 80, 1 101 - 1 105 (1983)].

xvlE-geeni siirrettiin sitten 1,0 kiloemäksen EcoRI 10 - PstI -palasena E. coli/B. subtilis -plasmidiin pHV33 (saatavissa kokoelmasta the American Type Culture Collection A.T.C.C. -39 217:nä) [Primrose et ai., Plasmid, 6, 193 - 201 (1981)], joka oli saatu R. Dedonderilta (Institut

Pasteur, Pariisi, Ranska). pHV33-plasmidia oli ennakolta 15 pilkottu EcoRI:llä ja PstI:llä. niin että xvlE:n sisältävä palanen tälle alueelle ligoituna inaktivoisi ampisil-liiniresistenssigeenin. Tulokseksi saatu plasmidi pAMB21 sisältää funktionaalisen xvlE-geenin E. coli -isän-täsoluissa, mutta vaatii promoottorin lisäämisen, jotta 20 xvlE ilmentyisi B. subtilis -isäntäsoluissa. pAMB21:n sisältävät E. coli -solut ovat resistenttejä tetrasykliinil-le (15 μg/ml) ja klöramfenikolille (20 μg/ml) , kun taas pAMB21:n sisältävät B. subtilis -solut ovat resistenttejä ainoastaan klöramfenikolille (5 μg/ml).

. 25 Bakteriofaagi lambdan t^-transkriptionterminaa- tiosekvenssi siirrettiin plasmidista pCFM936 (400 emäspa-rin PstI - Bglll -palasessa) pAMB21:n ainoana esiintyvään PstI-kohtaan. Rakennettiin synteettinen nukleotidi, jonka sekvenssi oli 5 ’ GATCTGCA 3 ', toop-palasen Bglll-pään liit- 30 tämiseksi vektorin......pAMB21 PstI-kohtaan. Saadulle plasmi- dille annettiin nimitys pAMB22, ja sillä oli pAMB21:n kanssa identtiset ominaisuudet. liitettyä transkription terminaattoria lukuunottamatta. pAMB22-plasmidi on hyödyllinen sellaisten vahvojen promoottorien osoittamista var-35 ten, jotka ovat funktionaalisia bakteerissa B. subtilis.

105695 pAMB22:sta saatu 1,4 kiloemäksen EcoRI - Bqlll-DNA-palanen, joka sisältää xylE:n ja t^in, eristettiin alhaisen sulamispisteen agaroosigeelistä restriktiopalasten elektroforeesin jälkeen. 1,4 kiloemäksen DNA-palanen li-5 goitiin plasmidiin pBD64 (saatavissa kokoelmasta Bacillus Genetic Stock Center, numero IE22), jota oli ennakolta pilkottu EcoRI:llä ja BamHI:llä. Tulokseksi saatu 5,3 kiloemäksen plasmidi pAMBll sisältää M13mpl8:n monen liitän-täkohdan (polylinker) -sekvenssin (EcoRI. Sstl. Xmal, Sma, 10 BamHI ja Xbal) vastavirtaan xvlE-geenistä. jota seuraa toop, kuten on esitetty kuviossa 3. pAMBll-plasmidi kykenee replikoi tumaan bakteerissa B. subtilis ja antaa isäntäsoluil-le resistenssin kloramfenikolia (5 μg/ml) ja/tai kana-mysiiniä (5 μg/ml) kohtaan.

15 Kuten on esitetty kuviossa 4, aprA:n sisältämä puh distettu EcoRI-Kpnl-palanen kloonattiin pAMBll:een, jolloin muodostui pAMBlll. Ligaation tuotteet vietiin B. subtilis MI112:een (arg-15 leuB thr5 recE4) saatavissa kokoelmasta Bacillus Genetic Stock Center numerona 1A423) 20 käyttäen protoplastintransformaatiomenetelmää, jonka ovat kuvanneet Chang et ai., Mol. Gen. Genet., 168, 111 - 115 (1979). B. subtilis MI112, jossa ei ole plasmidi-DNA:a, on pätevä proteaasien suhteen (Prt+-fenotyyppi), mutta eritetyt subtilisiinimäärät ovat melko pieniä. Kloramfenikolil-25 le resistenttejä (Cmr) transformantteja siirrettiin L-agar-maljoille, joihin oli lisätty 1,5 % (paino/tilavuus) kuorittua maitoa ja 5 Mg/ml kloramfenikolia, ja sitten inku-boitiin 37 °C:ssa.

Sen jälkeen kun oli inkuboitu 37 °C:ssa suunnilleen 30 16 tunnin ajan, plasmidin pAMBlll sisältävän MI112:n pe- *. säkkeet tuottivat kunkin pesäkkeen ympärille kirkkaan ke hän. Kehät aiheutti subtilisiinin proteolyyttinen vaikutus elatusaineessa lisänä olevan kuoritun maidon kaseiinikom-ponenttiin. Pelkän pAMBll-vektorin sisältävällä MI112:lla 35 ei ollut näkyvää kehää 16 tunnin inkuboinnin jälkeen, . 21 ' 105695 vaikka heikko kehä lopulta kehittyi sen jälkeen kun oli inkuboitu 40 tuntia 37 °C:ssa. pAMBlll:n sisältävät solut erottuivat selvästi pAMBll:n sisältävistä soluista kehien kokoeron perusteella. aprA-geenin kloonaaminen täysin 5 funktionaalisessa muodossa sai siten B. subtilis -bakteerin tuottamaan ja erittämään subtilisiinia suurena määränä.

Esimerkki 2

Kuten on esitetty kuviossa 4, 3,0 kiloemäksen EcoRI 10 - Koni -genominpalasta, jonka eristäminen on kuvattu esi merkissä 1, pilkottiin Hindlll:11a.jolloin muodostui kolme palasta: (1) 1,1 kiloemäksen EcoRI - Hindlll -palanen, joka sisälsi geenin säätelysekvenssejä aprA-geenin ilmenemistä varten, geenin "pre-pro"-alueen, joka on tar-15 peellinen subtilisiinin solun ulkopuolelle vientiä varten, ja valmiin subtilisiinin 49 ensimmäistä aminohappoa koodaavan DNA-sekvenssin; (2) 1,1 kiloemäksen Hindlll -

Hindlll -palanen, joka sisälsi subtilisiinin aminohapot 50 - 276 (karboksyylipää) koodaavat DNA-sekvenssit sekä tran-20 skriptionterminaatiosekvenssin ja 3'-ei-koodaavia sekvenssejä; ja (3) 0,8 kiloemäksen Hindlll - Kpnl -palanen, joka sisälsi 31-ei-koodaavia sekvenssejä.

HindiII-kohtien reunustama 1,1 kiloemäksen palanen kloonattiin bakteriofaagin M13mpl8 ainoaan HindiII-kohtaan ,· 25 DNA:n sekvensointia ja kohdennettua mutageneesiä varten.

Yksi rekombinanteista, jolle on annettu nimitys M13mpl8 apr2. tarjosi yksisäikeisen templaatti-DNA:n, joka tarvittiin aprA-geenin kohdennettua mutageneesiä varten.

aprA-geenin koodaava alue sekvensoitiin ja sek-30 venssitulokset on esitetty tässä taulukossa 1. Huomattakoon, että etu (leader) -alueen viiden ensimmäisen kodonin nimenomainen identtisyys on peräisin Stahlin et ai. yllä ja Wongin et ai., yllä, selostusten aprA-qeeniä koskevista sekvenssitiedoista ja että Stahlin et ai., julkaisuun, 35 yllä, verrattaessa esiintyy kodonisekvenssieroja aminohap- 105695 poasemissa 84 ja 85. Tarkemmin sanoen Stahl et ai., yllä, ilmoittavat aminohappoasemassa 84 olevan kodonin GTT (joka koodaa valiinin), kun sen sijaan taulukossa 1 esiintyy kodoni GTA (koodaa myös valiinin). Stahl et ai., yllä, 5 ilmoittavat myös aminohappoasemassa 85 olevan kodonin AGC (joka koodaa seriinin), vastakohtana taulukossa 1 olevalle kodonille GCG (joka koodaa alaniinin).

-105

Taulukko 1 23 105695

Met Arg Ser Lys Lys Leu Trp lie Ser Leu Leu Phe Ala GTG AGA AGC AAA AAA TTG TGG ATC AGC TTG TTG TTT GCG

5 Leu Thr Leu He Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala

TTA ACG TTA ATC TTT ACG ATG GCG TTC AGC AAC ATG TCT GCG

Gin Ala Ala Gly Lys Ser Ser Thr Glu Lys Lys Tyr Ile Val

CAG GCT GCC GGA AAA AGC AGT ACA GAA AAG AAA TAC ATT GTC

10

Gly Phe Lys Gin Thr Met Ser Ala Met Ser Ser Ala Lys Lys

GGA TTT AAA CAG ACA ATG AGT GCC ATG AGT TCC GCC AAG AAA

Lys Asp Val He Ser Glu Lys Gly Gly Lys Val Gin Lys Gin

AAG GAT GTT ATT TCT GAA AAA GGC GGA AAG GTT CAA AAG CAA

15

Phe Lys Tyr Val Asn Ala Ala Ala Ala Thr Leu Asp Glu Lys

TTT AAG TAT GTT AAC GCG GCC GCA GCA ACA TTG GAT GAA AAA

Ala Val Lys Glu Leu Lys Lys Asd Pro Ser Val Ala Tyr Val

GCT GTA AAA GAA TTG AAA AAA GAT CCG AGC GTT GCA TAT GTG

20 -1 +1

Glu Glu Asp His He Ala His Glu Tyr Ala Gin Ser Val Pro

GAA GAA GAT CAT ATT GCA CAT GAA TAT GCG CAA TCT GTT CCT

10

Tyr Gly He Ser Gin III. Lys Ala Pro Ala Leu His Ser Gin

25 TAT GGC ATT TCT CAA ATT AAA GCG CCG GCT CTT CAC TCT CAA

..: 20 ... 30

Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val He Aso Ser

GGC TAC ACA GGC TCT AAC GTA AAA GTA GCT GTT ATC GAC AGC

40

Gly He Asp Ser Ser His Pro Asd Leu Asn Val Arg Gly Glv

30 GGA ATT GAC TCT TCT CAT CCT GAC TTA AAC GTC AGA GGC GGA

50 60 ’ Ala Ser Phe Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Tvr Gin Asd Glv

GCA AGC TTC GTA CCT^TCT GAA ACA AAC CCA TAC CAG GAC GGC

70 oc Ser Ser His Gly Thr His Val Ala Gly Thr He Ala Ala Leu

AGT TCT CAC GGT ACG CAT GTA GCC GGT ACG ATT GCC GCT CTT

Taulukko 1 (j atkoa) 24 105695 80

Asn Asn Ser Ile Gly Vai Leu Gly Vai Ala Pro Ser Ala Ser

AAT AAC TCA ATC GGT GTT CTG GGC GTA GCG CCA AGC GCA TCA

5 90 100

Leu Tyr Ala Vai Lys Vai Leu Asp Ser Thr Gly Ser Gly Gin

TTA TAT GCA GTA AAA GTG CTT GAT TCA ACA GGA AGC GGC CAA

110

Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ser Asn

TAT AGC TGG ATT ATT AAC GGC ATT GAG TGG GCC ATT TCC AAC

10 120 130

Asn Met Asp Vai Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Thr Gly

AAT ATG GAT GTT ATC AAC ATG AGC CTT GGC GGA CCT ACT GGT

140

Ser Thr Ala Leu Lys Thr Vai Vai Asp Lys Ala Vai Ser Ser

TCT ACA GCG CTG AAA ACA GTC GTT GAC AAA GCC GTT TCC AGC

15 150

Gly Ile Vai Vai Ala Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Ser Ser

GGT ATC GTC GTT GCT GCC GCA GCC GGA AAC GAA GGT TCA TCC

160 170

Gly Ser Thr Ser Thr Vai Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Pro Ser

GGA AGC ACA AGC ACA GTC GGC TAC CCT GCA AAA TAT CCT TCT

20 180

Thr Ile Ala Vai Gly Ala Vai Asn Ser Ser Asn Gin Arg Ala

ACT ATT GCA GTA GGT GCG GTA AAC AGC AGC AAC CAA AGA GCT

190 200

Ser Phe Ser Ser Ala Gly Ser Glu Leu Asp Vai Met Ala Pro

25 TCA TTC TCC AGC GCA GGT TCT GAG CTT GAT GTG ATG GCT CCT

210

Gly Vai Ser Ile Gin Ser Thr Leu Pro Gly Gly Thr Tyr Gly

GGC GTG TCC ATC CAA AGC ACA CTT CCT GGA GGC ACT TAC GGC

220

Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Vai Ala Gly

30 GCT TAT AAC GGA ACG TCC ATG GCG ACT CCT CAC GTT GCC GGA

: 230 240 ' Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Thr Tro Thr Asn

GCA GCA GCG TTA ATT CTT TCT AAG CAC CCG ACT TGG ACA AAC

250 oc Ala Gin Vai Arg Aso Arg Leu Glu Ser Thr Ala Thr Tyr Leu

GCG CAA GTC CGT GAT CGT TTA GAA AGC ACT GCA ACA TAT CTT

Taulukko 1 (jatkoa) 25 105695 260 270

Gly Asn Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Vai Gin GGA AAC TCT TTC TAC TAT GGA AAA GGG TTA ATC AAC GTA CAA

5 275

Ala Ala Ala Gin OC

GCA GCT GCA CAA TAA TAGTAAAAAGAAGCAGGTTCCTCCATACCTGCT TCTTTTTATTTGTCAGCATCCTGATGTTCCGGCGCATTCTC

10 Bakteriofaagi M13 mRl8 apr2 kokoonpantiin liittämällä B. subtilis___QB127:n genomi-DNA:n 1,1 kiloemäksen suuruinen Hindlll - Hindlll -palanen, joka sisälsi aprA-subtilisiinin aminohapot 50 - 275 (karboksyylipääte) koo-daavat nukleotidisekvenssit sekä transkriptionterminaa-15 tiosekvenssin ja 3'-ei-koodaavia sekvenssejä, bakteriofaa- gin M13 mpl8 ainoana esiintyvään Hindlll-kohtaan. 3'-ei-koodaavien sekvenssien poistamiseksi järjestettiin Kpnl-restriktioendonukleaasikohta kohdennetun mutageneesin avulla transkriptionterminaatiosekvenssiä välittömästi 20 seuraavaan asemaan.

Kohdennettu mutageneesi suoritettiin noudattaen menetelmää, jonka ovat kuvanneet Norrander et ai., Gene, 26, 101 - 106 (1983). M13 mp!8 apr2:sta saatu yksisäikei-nen DNA liitettiin lämmitys -jäähdytys käsittelyn (an- : 25 nealing) avulla primer-kappaleeseen * * 5' TCCTGAGGTACCGGCGCATTC 3' joka syntetisoitiin noudattaen fosfiittimenetelmää, jonka 30 ovat kuvanneet BeaUcäge et ai., Tetrahedron Letters 22, 1 ·* 859 - 1 862 (1981) . Primer-kappale oli homologinen tällä alueella olevien nukleotidien kanssa, lukuunottamatta kah-' ta (merkitty tähdillä), joiden kohdalla tyrniini (T) oli vaihdettu guaniiniin (G) ja toinen tyrniini (T) oli vaih-35 dettu adeniiniin (A) , jolloin tälle alueelle muodostui Kpnl-kohta (alleviivattu).

105695

Primer-kappale liitettiin (annealing) M13 τηβίδ apr2 -DNA:hän lämmittäen 65 °C:ssa ja jäähdyttäen hitaasti suunnilleen 22 °C:een ja sitten polymerisoitiin 2 tunnin ajan 15 °C:ssa reaktioseoksessa, joka käsitti 12,5 μΐ liitos-5 seosta, 2,5 μΐ kutakin 10 mM yhdisteistä dATP, dCTP ja dGTP 20 μΐ 12 mM ATP:a, 0,1 μΐ Klenox-DNA-polymeraasia, 0,1 μΐ T4-DNA-ligaasia ja 13 μΐ steriiliä tislattua vettä. Tulokseksi saatu kaksisäikeinen, kovalenttisesti suljettu rengasmainen DNA vietiin E. coli JM103:een transfektion 10 avulla.

Bakteriofaagiplakit siirrettiin sitten Gene Screen™ (New England Nuclear, Beverly, Massachusetts) -hybridisaa-tiokalvoille. Plakit, jotka sisälsivät halutut emäsmuutok-set omaavaa DNA:a, tunnistettiin suorittamalla hybridisaa-15 tio sellaisen radioaktiivisesti merkittyyn (γ-32Ρ) syn teettisen oligonukleotidin kanssa, jota käytettiin yllä kuvatussa mutageenisessä primer-kappaletta hyödyntävässä reaktiossa. Hybridisaatio suoritettiin rajoittavassa lämpötilassa (65 °C) , jotta ainoastaan Kpnl-mutaation omaava 20 DNA hybridisoituisi synteettiseen oligonukleotidiin. Kpnl- mutaation läsnäolo myötävirtaan aprA-qeenistä DNA:ssa, joka oli saatu yhdestä ainoasta puhdistetusta, M13 mp!8 apr2 Kpnl:ksi nimitetystä plakista, vahvistettiin suorittamalla DNA:n sekvensointi käyttäen menetelmää, jonka ovat . 25 kuvanneet Sanger et ai., yllä, ja restriktioentsyymi- analyysi.

Poistettiin 1,1 kiloemäksen kappale, joka sisälsi suurimman osan 3'-ei-koodaavasta alueesta, pilkkomalla M13 mp!8 apr2 Kpnl:tä Kpnl:llä, uudelleenligoimalla pilkkomi-30 sen tuotteet konsentraatiossa 500 ng DNA/ml ja viemällä sitten ligaation tuotteet E. coli JM103:een transfektion avulla. Halutun 0,3 5 kiloemäksen deleetion omaavan DNA:n sisältävät bakteriofaagiplakit tunnistettiin restriktioen-donukleaasianalyysin avulla. Yhdestä sellaisesta plakista 35 saadulle bakteriofaagille annettiin nimitys M13 mp!8 apr4 27 105695 (kuvio 7). M13 mE18 apr4 tarjosi yksisäikeisen templaatti-DNA:n aprA-geenin kohdennettua mutageneesia varten, joka on kuvattu alla esimerkissä 3.

Esimerkki 3 5 Muutettujen subtilisiinigeenien B. subtilis-baktee- rissa ilmentämiseksi kokoonpantiin plasmidi pAMB106 muutetun geenin vektoriksi seuraavasti.

1) pAMBlll:ta pilkottiin Hindlll:11a. Poistettiin suurimman osan aprA-geenistä sisältävä 1,1 kiloemäksen 10 kappale uudelleenligoimalla pAMBlllm HindiII-pilkkomisen tuotteet konsentraatiossa noin 1 μg/ml. Tästä oli seurauksena pAMBHOn muodostuminen. kuten on esitetty kuviossa 4. pAMBHO-plasmidi sisältää geeninsäätelysekvenssejä subti-lisiinigeenin ilmentymistä varten, subtilisiinin erittymi-15 seen vaadittavan "pre-pro"-alueen ja DNA-sekvenssin, joka koodaa valmiin subtilisiinin 3'-ei-koodaavan alueen ja valmiin subtilisiinin ensimmäiset 49 aminohappoa.

2) Plasmidia pAMBHO pilkottiin samanaikaisesti BamHI:llä ja PstI:llä. Tällöin muodostui kahden kokoisia 20 DNA-palasia, 6,2 kb ja 1,0 kb. 1,0 kiloemäksen palanen sisältää katekoli-2,3-dioksygenaasin koodaavan xvlE-gee-nin,joka on peräisin Pseudomonas putida mt-2:n TOL-plasmi-dista (Zykowski et ai., yllä).

3) Suuremman, 6,2 kiloemäksen -BamHI - Pstl-kappa-25 leen annettiin itseligoitua yksisäikeisen synteettisen oligonukleotidin 5' GATCTGCA 3', joka oli syntetisoitu käyttäen Beaucagen et ai., yllä, kuvaamaa fosfiitti-menetelmää, ja T4-DNA-ligaasin availla. Ligaation tuotteet vietiin B. subtilis MI112:een (arg-15 leuB thr5 recE4) 30 (saatavissa kokoelmasta Bacillus Genetic Stock Center nu-merona 1A423) käyttäen protoplastintransformaatiomenetel-mää, jotka ovat kuvanneet Change et ai., Mol Gen. Genet., 168, 111 - 115 (179).

Kloramfenikolille resistenttejä (CmR) pesäkkeitä 35 seulottiin plasmidisisällyksen suhteen. 6,2 kiloemäksen 28 105695 plasmidi ρΑΜΒΙΟβ identifioitiin restriktioendonukle-aasianalyysin avulla. Se on identtinen plasmidin pAMBHO kanssa, paitsi että xvlE on poistettu (kuvio 6).

Koska pAMB106:sta puuttuu aprA-subt ilisiinin 5 aminohapot 50 - 275 koodaava DNA, se ei syntetisoi subti-lisiinia B. subtilis-isäntäsoluihin vietynä. Subtilisiinia syntetisoituu vasta loppuosan subtilisiinigeenistä, so. joko alkuperäisen DNA-sekvenssin tai analogia koodaavan sekvenssin, liittämisen jälkeen.

10 Esimerkki 4 [Seriini109] -subtilisiinin analogin valmistaminen

Bakteriofaagista M13 mpl8 saatu yksisäikeinen DNA liitettiin lämmitys - jäähdytys -käsittelyn (annealing) avulla primer-kappaleeseen 15 * 5' TGG ATT ATT AGC GGC ATT GAG TGG 3'

106 107 108 109 110 111 112 113 TRP ILE ILE SER GLY ILE GLU TRP

20 joka oli syntetisoitu käyttäen fosfiittimenetelmää, jonka ovat kuvanneet Beaucage et ai., yllä. Primer-kappale oli homologinen aprA-subtilisiinin aminohappojen 106 - 113 kodonit käsittävien nukleotidien kanssa, yhtä emäsmuutosta 25 lukuunottamatta (merkitty tähdellä), jossa A oli muutettu G-.ksi, jotta aikaansaataisiin transitio, joka vaihtaisi Asn109:n (kodoni AAC) Ser109:ksi (kodoni AGC).

Primer-kappale liitettiin (annealing) M13 mp!8 apr4 -DNA:han kuumentaen 65 °C:ssa ja antaen DNA:n hitaasti 30 jäähtyä suunnilleen 22 °C:een ja sitten polymerisoitiin, \ ligoitiin ja transfektoitiin kuten on kuvattu esimerkissä 2.

Bakteriofaagiplakit siirrettiin hybridisaatiokal-volle ja sitten ne, jotka sisälsivät halutun emäsmuutoksen 35 omaavan DNA:n, identifioitiin suorittamalla hybridisaatio 29 105695 sellaisen radioaktiivisesti merkityn (a-1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11P) oligonukleoti-din kanssa, jota oli käytetty yllä kuvatussa mutageenises-sa primer-kappaletta hyödyntävässä reaktiossa. Hybridisaatio suoritettiin 65 °C:ssa. Yksi positiivinen plakki 5 sisälsi bakteriofaagin, jolle annettiin nimitys M13 mpl8 apr4 [Ser109] . Tästä bakteriofaagista saatua kaksisäikeistä DNA:a pilkottiin Hindlll:11a ja Kpnlrllä samanaikaisesti ja sitten 750 emäsparin palanen, joka sisälsi aprA-subti-lisiinigeenin mutaation omaavan osan, ligoitiin 10 pAMB106:een, jota oli aikaisemmin pilkottu Hindlll:11a ja Koni:llä. Tulokseksi saatu plasmidi pAMB129 voidaan viedä sopiviin B. subtilis -isäntäsoluihin [Ser109]-subtilisiinin synteesiä ja erittämistä varten.

Esimerkki 5 15 [Seriini 109, seriini 218] -subtilisiinin analogin valmistaminen M13 mjol8 apr4 [Ser109] :stä saatu yksisäikeinen DNA liitettiin lämmitys-jäähdytys (annealing) -käsittelyn avulla primer-kappaleeseen: 20 * 5' GGC GCT TAT AGC GGA AC 3' = 215 216_217 218 219 220

GLY ALA TYR SER GLY THR

joka oli syntetisoitu käyttäen fosfiittimenetelmää, jonka 2 ovat kuvanneet Beaucage et ai., yllä. Primer-kappale oli 3 homologinen aprA-subtilisiinin aminohappojen 215 - 220 4 kodonit käsittävien nukleotidien kanssa yhtä emäsmuutosta 5 lukuunottamatta (merkitty tähdellä), jossa A oli muutettu 6 G:ksi, jotta aikaansaataisiin transitio, joka muuttaisi 7 *· Asn21B:n (kodoni AAC) Ser218:ksi (kodoni AGC) . Lämmitys- 8 jäähdytys -liittämisen, polymerisoinnin, ligaation, trans- 9 fektion ja positiivisten plakkien identifioinnin olosuh 10 teet olivat esimerkissä 2 kuvatun mukaiset. Yksi puhdis- 11 tettu plakki sisälsi bakteriofaagin, jolle annettiin nimi- 105695 tys M13 mpl8 apr4 [Ser109, Ser218] . Tästä bakteriofaagista saatua kaksisäikeistä DNA:a pilkottiin Hindi11:11a ja Koni:llä samanaikaisesti ja sitten 750 emäsparin palanen,-joka sisälsi kaksi mutaatiota, ligoitiin pAMB106:een, jota 5 oli aikaisemmin pilkottu Hindlll:11a ja Kpnl:llä. Tulokseksi saatu plasmidi pAMB130 voidaan viedä B. subtilis -isäntäsoluihin [Ser109, Ser218] -subtilisiinin synteesiä ja erittämistä varten.

Esimerkki 6 10 [Asp 76, Ser 109, Ser 218] -subtilisiinin analogin valmistaminen M13 mpl8 apr4 [Ser109, Ser218] :sta saatu yksisäikeinen DNA liitettiin lämmitys-jäähdytys (annealing) -käsittelyn avulla primer-kappaleeseen: 15 * 5' GCT CTT GAT AAC TCA ATC 3’

74 75 76 77 78 79 ALA LEU ASP ASN SER ILE

20 joka oli syntetisoitu käyttäen fosfiittimenetelmää, jonka ovat kuvanneet Beaucage et ai., yllä. Primer-kappale oli homologinen aprA-subtilisiinin aminohappojen 74 - 79 ko-donit käsittävien nukleotidien kanssa yhtä emäsmuutosta lukuun ottamatta (merkitty tähdellä), jossa A oli vaihdet-• 25 tu G:ksi, jotta aikaansaataisiin transitio, joka muuttaisi

Asn76:n (kodoni AAT) Asp76:ksi (kodoni GAT) .

Primer-kappale liitettiin (annealing) M13 mp!8 [Ser109, Ser 218]-DNA:han kuumentaen 65 °C:ssa ja antaen DNA:n hitaasti jäähtyä suunnilleen 22 °C:een ja polyme-30 risoitiin, ligoitiin ja transfektoitiin kuten on kuvattu *· esimerkissä 2 .

Bakteriofaagiplakit siirrettiin hybridisaatiokal-voille ja ne, jotka sisälsivät halutun emäsmuutoksen omaavan DNA:n, identifioitiin hybridisaation avulla kuten on 35 kuvattu esimerkissä 2, paitsi että hybridisaatio suoritet- * * i 105695 tiin 46 °C:ssa. Yksi positiivinen plakki sisälsi bakte-riofaagia, jolle annettiin nimitys M13 mp!8 apr4 [Asp76, Ser109, Ser218] . Bakteriofaagista saatua kaksisäikeistä DNA:a pilkottiin Hindulla ja Koni:llä samanaikaisesti ja sitten 5 750 emäsparin kappale, joka sisälsi aprA-subtilisiinigee- nin kolme mutaatiota, ligoitiin pAMB106:een,jota oli aikaisemmin pilkottu Hindlll:11a ja Koni:llä. Tulokseksi saatu plasmidi pAMB13l voidaan viedä B. subtilis-isän-täsoluihin [Asp76, Ser109, Ser218] -subtilisiinin synteesiä ja 10 erittämistä varten.

Esimerkki 7 [Asp76, Asp77, Ser109, Ser218] -subtilisiinin analogin valmistaminen M13 mpl8 apr4 [Asp76, Ser109, Ser218] :sta saatu yk- 15 sisäikeinen DNA liitettiin lämmitys-jäähdytys -käsittelyn avulla primer-kappaleeseen: * * 5' GCT CTT GAT GAT TCA ATC CGT 3' 74 75 76 77 78 79 80

20 ALA LEU ASP ASP SER ILE GLY

joka oli syntetisoitu käyttäen fosfiittimenetelmää, jonka ovat kuvanneet Beaucage et ai., yllä. Primer-kappale oli homologinen [Asp76, Ser109, Ser218] -subtilisiinin aminohappo-: 25 jen 74 - 80 kodonit käsittävien nukleotidien kanssa kahta emäsmuutosta lukuun ottamatta (merkitty tähdillä), joissa A oli vaihdettu G:ksi ja C oli vaihdettu T:ksi sellaisia transitioita varten,'“jotka muuttivat Asn77:n (kodoni AAC) Asp77:ksi (kodoni GAT) .

30 Primer-kappale liitettiin (annealing) M13 mp!8 apr4 V [Asp76, Ser109, Ser218]-DNA:hän kuumentaen 65 °C:ssa ja jääh dyttäen DNA hitaasti .suunnilleen 22 °C:een ja polymerisoi-tiin, ligoitiin ja transfektoitiin kuten on kuvattu esimerkissä 2 .

35 105695

Bakteriofaagiplakit siirrettiin hybridisaatiokal-voille ja ne, jotka sisälsivät halutut emäsmuutokset omaavan DNA:n, identifioitiin hybridisaation avulla, kuten on kuvattu esimerkissä 2, paitsi että hybridisaatio suoritet-5 tiin 45 °C:ssa. Yksipositiivinen plakki sisälsi bakte- riofaagia, jolle annettiin nimitys M13 mpl8 apr4 [Asp76, Asp77, Ser109, Ser218] . Tästä bakteriofaagista saatua kak- sisäikeistä DNA:a pilkottiin Hindlll:11a ja Kpnl:llä samanaikaisesti ja sitten 750 emäsparin palanen, joka sisäl-10 si anrA-subtilisiiniqeenin neljä mutaatiota, ligoitiin pAMB106 reen, jota oli aikaisemmin pilkottu Hindlll:11a ja Kpnl:llä. Tulokseksi saatu plasmidi pAMB132 voidaan viedä B. subtilis-isäntäsoluihin [Asp76, Asp77, Ser109, Ser218] subtilisiinin synteesiä ja erittämistä varten.

15 Esimerkki 8 [Asp76, Glu79, Ser109, Ser218] -subtilisiinin analogin valmistaminen M13 mpl8 apr4 [Asp76, Ser109, Ser218] :sta saatu yk- sisäikeinen DNA liitettiin lämmitys-jäähdytys -käsittelyn 20 avulla primer-kappaleeseen: *** 5' T GAT AAC TCA GAA GGT GTT CTG G 3' 75 76 77 78 79 80 81 82 83

ASP ASN SER GLU GLY VAL LEU

. : 25 joka oli syntetisoitu käyttäen fosfiittimenetelmää, jonka ovat kuvanneet Beaucage et ai., yllä. Primer-kappale oli homologinen [Asp76, Ser109, Ser218] -subtilisiinin aminohappojen 75 ja 83 osittaiset kodonit ja aminohappojen 76 - 82 30 koko kodonit käsittävien nukleotidien kanssa kolmea emäs-muutosta lukuun ottamatta (merkitty tähdillä), joissa A oli vaihdettu G:ksi, T oli vaihdettu A:ksi ja C oli vaihdettu A:ksi, mikä vaihtoi Ile79:n (kodoni ATC) Glu79:ksi (kodoni GAA).

35 105695

Primer-kappale liitettiin (annealing) M13 mpl8 at>r4 [Asp76, Ser109, Ser21B]-DNA:han kuumentaen 65 °C:ssa ja jääh-.dyttäen DNA hitaasti suunnilleen 22 °C:een ja polymerisoi-tiin, ligoitiin ja transfektoitiin kuten on kuvattu esi-5 merkissä 2. 1_____

Bakteriofaagiplakit siirrettiin hybridisaatiokal-voille ja sellaiset, jotka sisälsivät halutut emäsmuutok-set, identifioitiin hybridisaation avulla kuten on kuvattu esimerkissä 2, paitsi että hybridisaatio suoritettiin 45 10 °C:ssa. Yksi positiivinen plakki sisälsi bakteriofaagin, jolle annettiin nimitys M13 mpl8 apr4 [Asp76, Glu79, Ser109, Ser218] . Tästä bakteriofaagista saatua kaksisäikeistä DNA:a pilkottiin Hindllld:11a ja Kpnl:llä samanaikaisesti ja sitten 750 emäsparin palanen, joka sisälsi aprA-subti-15 lisiinigeenin neljä mutaatiota, ligoitiin pAMB106:een, jota oli aikaisemmin pilkottu Hindlll:11a ja Kpnl:llä. Tulokseksi saatu plasmidi pAMB133 voidaan viedä B. subti-lis -isäntäsoluihin [Asp76, Glu79, Ser109, Ser2l8] -subti-lisiinin synteesiä ja erittämistä varten.

20 Esimerkki 9

Koska useimmat Bacillus-lajit erittävät aikalisiä ja/tai neutraaleja proteaaseja ympäröivään kasvatusaineeseen, pidetään parempana järjestää mutaatioita B. subtilis -bakteerin endogeenisen alkalisen ja neutraalin proteaasin : 25 geeneihin niiden synteesin estämiseksi, niin että muutetut subtilisiinigeenit voivat mutanttisoluun vietynä tuottaa muutettuja subtilisiineja. jotka erittyvät sitten elatus-aineeseen, jossa ei ole muita sellaisia proteaaseja, jotka todennäköisesti häiritsivät vahingoittumattomien subti-30 lisiinin analogien eristämistä. Kaksi B. subtilis -mutant-·’ tikantaa BZ24 ja BZ25, jotka eivät tuota todettavissa ole via solun ulkopuolisia proteaaseja, aikaansaatiin seuraa-van menetelmän avulla:

Ensin plasmidivektori, joka kykeni replikoitumaan 35 E. colissa, mutta ei B. subtilis -bakteerissa, ellei se 105695 ollut integroitunut B. subtilis-bakteerin kromosomiin homologisen rekombinaation avulla, kokoonpantiin seuraavasti. Plasmidi pBD64 (Bacillus Genetic Stock Center, numero 1E22) pilkottiin täydellisesti Hpall ·. 11a. jolloin muodos-5 tui kolme, kooltaan 2,95 kb, 1,0 kb ja 0,75 kb olevaa palasta. Nämä palaset ligoitiin sitten seoksena plasmidiin pBR322 (A.T.C.C. 37017), jota oli aikaisemmin pilkottu

Clal:llä. Ligaation tuotteet vietiin E. coli C600:aan (saatavissa kokoelmasta the American Type Culture Collec-10 tion A.T.C.C.-23724:nä) transformaation avulla [Mandel et ai., J. Mol. Biol., 53, 154 (1970)]. Selektoitiin kloram-fenikolille (20 μg/ml) ja ampisilliinille (50 μg/ml) resistenttejä soluja. 12 transformantista eristettiin plasmidi -DNA alkalisen uuton menetelmän avulla, jonka ovat 15 kuvanneet Birnboim et ai., Nucleic Acids Res., 7, 1 513 -1 523 (1979), sitten pilkottiin yhdistelmällä HindiII ja

EcoRI inserttipalasten läsnäolon varmistamiseksi. Yhden sellaisen plasmidin, jolle on annettu nimitys pAMB30, todettiin sisältävän pBD64:n 1,0 ja 0,75 kiloemäksen Hpall-20 palaset pBR322:n Clal-kohdassa. Nämä palaset sisältävät kloramfenikoliasetyylitransferaasi (cat) -geenin, joka on funktionaalinen bakteereissa E. coli ja B. subtilis. Pilkkominen Bglll:11a ja, erikseen, Sau3A:11a vahvisti cat-geenin identtisyyden ja suunnan pAMB30:Ssä, kuten on esi- . ; 2 5 tetty kuviossa 5.

Koska pAMB30:stä puuttuu sellainen replikaation-aloituskohtasekvenssi, joka olisi funktionaalinen bakteerissa B. subtilis, se ei voi replikoitua autonomisena rep-likonina B. Subtilis -isäntäsoluissa. Toisaalta pAMB30 30 sisältää pBR322:sta peräisin olevan replikaationaloitus-'· " kohdan, joka on funktionaalinen E. colissa, joten plasmi- dia voidaan lisätä E. coli -isäntäsoluissa. Plasmidi pAMB30 on hyödyllinen vähintään kahdella tavalla. Ensinnäkin DNA-palanen, joka sisältää funktionaalisen replikaa-35 tionaloituskohdan B. subtilis -bakteerissa, voidaan tode- 105695 ta, kun se on kloonattu pAMB30:een siten että plasmidi replikoituu autonomisesti kromosomin ulkopuolisessa tilassa. Toiseksi plasmidi pAMB30 voi integroitua B. subtilis -bakteerin genomiin kohtaan, jossa on homologiaa kromosomin 5 ja pAMB30:een kloonatun B. subtilis -DNA:n välillä. Tämän ovat osoittaneet Haldenwang et ai., J. Bacteriol., 142, 90 - 98 (1980) ja Young, J. Gen Microbiol., 129, 1 497 - 1 512 (1983) käyttäen plasmidivektoreita, jotka muistuttivat pAMB30:tä, mutta eivät olleet sen kanssa identtisiä.

= 10 Plasmidia pAMB21 (kuvattu esimerkissä 1) pilkottiin I EcoRI:llä ja PstI:ΪΊΊΓ xvlE-aeenin eristämiseksi 1,0 ki- loemäksen palasessa.. Palanen ligoitiin pAMB30:een, jota oli aikaisemmin pilkottu EcoRI:llä ja PstI:llä. Ligaation tuotteet vietiin E..__coli C600:aan transformaation avulla. 15 Selektoitiin sellaisten kloramfenikolille resistenttien (20 μg/ml) isäntäsolujen saamiseksi, jotka olivat herkkiä ampisilliinille (50 μg/ml) johtuen pAMB21:n xvlE-palasen liittymisestä lpAMB30:n ampisilliiniresistenssin rakenne-geeniin. Tulokseksi. __ saadulla plasmidilla pAMB30/21 on 2 0 pAMB3On kanssa identtiset ominaisuudet, mutta siinä on lisäksi funktionaalinen xvlE-geeni.

Plasmidia pAMBHO, joka sisältää aprA-geenin, josta on poistettu valmiin .subtilisiinin viimeiset 226 aminohappoa koodaava alue, pilkottiin EcoRI:llä ja KPnl:llä. B.

. : 25 subtilis -DNA:n 1,9 kiloemäksen palanen, joka sisälsi gee nin säätelysekvenssejä aprA-geenin ilmentämistä varten, "pre-pro"-alueen, DNA-sekvenssin, joka koodaa valmiin sub-tilisiinin ensimmäiset 49 aminohappoa, ja 3'-ei-koodaavia sekvenssejä, ligoitiin pAMB30/21:een, jota oli aikaisemmin 30 pilkottu EcoRI:llä ia Kpnl:llä. Ligaation tuotteet vietiin E. coli C600:aan transformaation avulla. Useista transfor-manteista eristettiin plasmidi-DNA käyttäen Birnboimin et ai., yllä, alkalisen uuton menetelmää ja 1,9 kiloemäksen insertin läsnäolo vahvistettiin suorittamalla useita rest-35 riktioendonukleaaseilla pilkkomisia. Yksi sellainen plas- 105695 midi, jolle on annettu nimitys pAMB301, säilytettiin jatkokäyttöä varten.

B. subtilis -kannalla BGSC1A274 (Bacillus Genetic Stock Center) on mutaatio npr-kohdassa eikä se kykene 5 tuottamaan solun ulkopuolista neutraalia proteaasia. Plas-midi pAMB301 integroitiin B. subtilis BGSClA274:n genomiin kompetenttien solujen transformaation avulla [Spizizen, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 44, 1 072 - 1 078 (1958)].

Selektoitiin kloramfenikolille resistenttien (5 Mg/ml) 10 isäntäsolujen saamiseksi, jotka siirrettiin sitten steriilien hammastikkujen avulla L-agarille, johon oli lisätty 1,5 % (paino/tilavuus) kuorittu maito -jauhetta ja (5 μ9/ιτι1) kloramfenikolia. Niiltä soluilta, jotka eivät tuottaneet pesäkkeen ympärille kirkasta kehää, puuttui kyky 15 tuottaa solujen ulkopuolisia neutraaleja ja seriiniprote-aaseja johtuen npr-mutaation ja juuri lisätyn aprA-mutaa-tion yhdistelmästä. aprA-mutaatio oli valmiin subtilisii-nin viimeisten 226 aminohapon poistuminen johtuen villi-tyypin aprA-geenin korvaamisesta pAMB301:n sisältämällä 20 deleetion omaavalla versiolla. Yhdellä sellaisella kannalla, jolle on annettu nimitys BZ24, on Npr- APr- Cmr -fenotyyppi, joten se ei tuota todettavissa olevaa solujen ulkopuolisia neutraalia proteaasia eikä solujen ulkopuolista alkalista proteaasia ja on kloramfenikoliresistenssi pi- : 25 toisuudessa 5 μ$/πί1. Käytettiin Southern blot -tekniikkaa [Southern, J. Mol. Biol., 98, 503 - 517 (1975)] B. subtilis BZ24:n kromosomissa olevassa aprA-geenissä esiintyvän deleetion varmistamiseksi. B. subtilis BZ24:n viljely an-tibioottielatusaineessa (Antibiotic Medium) no. 3 (Penas-30 say Broth, Difco, Detroit, Michigan) antibioottiselektion « ' puuttuessa suunnilleen 32 sukupolven verran johti BZ24:n sellaisen johdannaiskannan eristämiseen, josta oli hävinnyt kloramfenikoliresistenssin isäntäsoluille antava cat-geeni johtuen sen epästabiiliudesta BZ24:n kromosomissa. 35 Tällaisen ilmiön ovat aikaisemmin havainneet Stahl et ai., • 105695 J. Bacteriol., 158, 411 - 418 (1984). Kloramfenikolille herkälle BZ24:n johdannaiselle annettiin nimitys BZ25, B. subtilis BZ25:llä on=Npr- Apr- -fenotyyppi, joten se ei tuota todettavissa olevaa solujen ulkopuolista neutraalia 5 proteaasia eikä solujen ulkopuolista alkalista proteaasia. Southern blot -tekniikan avulla vahvistettiin deleetion esiintyminen B. subtilis BZ25:n kromosomissa olevassa ap-rA-geenissä.

Koska B. subtilis BZ25 ei tuota todettavissa olevaa 10 solujen ulkopuolista neutraalia proteaasia eikä subti- lisiinia, se on hyödyllinen isäntäkanta plasmidi-DNA:n, kuten esimerkiksi pAMBH3:n viemiseksi muunnettujen subti-lisiinien tuottamista varten, jotka subtilisiinit voivat erittyä vailla muita proteaaseja olevaan ympäröivään kas-15 vatusaineeseen.

B. subtilis BZ25 ei tuota todettavissa olevia solujen ulkopuolisia proteaaseja, kun viljelmien supernatant-teja analysoidaan alla kuvatulla tavalla. B. subtilis BZ25/pAMB113, joka on plasmidin pAMB113 sisältävä BZ25 20 (plasmidi on viety sisään Changin et ai., yllä, proto- plastintransformaatiomenetelmän avulla) tuottaa huomattavia määriä [Ser218] -subtilisiiniä, kun viljelmien superna-tantteja analysoidaan kuvatulla tavalla.

Esimerkki 10 25 [Ser218] -subtilisiinigeenin integraation B. subtilis • — -bakteerin kromosomiin uskottiin olevan tehokas tapa lisätä tämän mutanttigeenin geneettistä stabiiliutta. Sellainen keino myös vähentää kloramfenokolin tarvetta fermen-taatiokasvatusaineessa, jota yhdistettä muuten tarvitaan 30 aikaansaamaan selehtiopaine plasmidi-DNA:n säilyttämiseksi kromosomin ulkopuolisessa tilassa. Sen vuoksi [Ser218] -sub-tilisiinigeeni yhdessä sen geenin säätelysekvenssien ja sivustoilla olevan, B. subtilis -bakteerin kromosomin kanssa homologisen DNA:n kanssa, eristettiin alhaisen su-35 lamispisteen agaroosigeelistä pAMBH3:n, jota oli pilkottu 105695

EcoRI:llä ja PstI:llä samanaikaisesti, elektroforeesin jälkeen. 4,0 kiloemäksen EcoRI - Pst-palanen (esitetty kuviossa 4) ligoitiin sitten pAMB30:een (esitetty kuviossa 5), jota oli pilkottu EcoRI:llä ja PstI:llä yhtäaikaises-5 ti. Ligaation tuotteet vietiin E. coli HB101:een (A.T.C.C. 33694) transformaation avulla. Suoritettiin selektio klo-ramfenikolille (20 μg/ml) resistenttien solujen saamiseksi. Neljästä transformantista, jotka täyttivät yllä olevat kriteerit, eristettiin plasmidi-DNA Birnboimin et ai., 10 yllä, alkalisen uuton menetelmällä ja sitä pilkottiin sitten EcoRI:llä ja PstI:llä samanaikaisesti. Kaikki neljä plasmidia sisälsivät 4,0 kiloemäksen insertin ja pAMB30:n jäljellä olevan 5,6 kiloemäksen osan. Yksi sellainen plas-midi, jolle on annettu nimitys pAMB302, puhdistettiin ja 15 säilytettiin jatkokäyttöä varten.

Toistetut yritykset integroida plasmidi pAMB302 B. subtilis BZ25:n kromosomiin kompetenssimenetelmän avulla (Spizizen, yllä) epäonnistuivat. Tämä voi johtua siitä, että BZ25-solut eivät tulleet kompetenteiksi käytetyllä 20 menetelmällä. Sen vuoksi pAMB302 vietiin B. subtilis BZ25 -soluihin käyttäen Changin et ai., yllä, protoplastin-transformaatiomenetelmää. Tämä tulos on erityisen merkittävä siksi, että tutkimuskannat, joissa integraatio on saatu aikaan, valittiin kompetenssimenetelmällä suoritetun : 25 transformaation perusteella. Kannat, jotka voivat olla « kykenemättömiä tulemaan kompetenteiksi, ja erityisesti teollisuuskannat, joita ei ole valittu kompetenssimenetelmällä suoritetun transformaation perusteella, voivat todennäköisemmin olla kykenemättömiä tulemaan kompetenteik-30 si.

·' Selektoitiin kloramfenikolille resistenttien (5 μg/ml) solujen saamiseksi, jotka solut siirrettiin sitten steriilien hammastikkujen avulla L-agarille, johon oli lisätty 1,5 % (paino/tilavuus) kuorittua maitoa ja 5 μg/ml 35 kloramfenikolia. Soluja inkuboitiin yön ajan 37 °C:ssa.

------ | 39 105695

Cmr-pesäkkeiden ympärillä havaittiin halkaisijaltaan erilaisia kirkkaita kehiä. Tämä osoittaa, että nämä solut tuottivat ja erittivät subtilisiinia. Yritettiin eristää plasmidi-DNA kahdeksasta tällaisesta pesäkkeestä alkaali-5 sen uuton menetelmällä. Plasmidi-DNA:ta ei todettu aga-roosigeeleissä, jotka oli värjätty etidiumbromidilla (1 μg/ml) DNA:n saamiseksi näkyväksi elektroforeesin jälkeen. Kromosomin ulkopuolisen plasmidi-DNA:n puuttuminen Cmr-soluista, jotka tuottivat subtilisiinia, oli vahva osoitus 10 siitä, että pAMB302 oli integroitunut B. subtilis -baktee-= rin kromosomiin. ~ * Useita tässaTTcokeessa saatuja pesäkkeitä eristettiin ja niille annettiin nimitykset BZ28, BZ29, BZ30, BZ31, BZ32 ja BZ33. TCutakin kantaa kasvatettiin yön ajan 15 37 °C:ssa voimakkaasti ravistaen aivo-sydäninfuusio-ela- tusaineessa (BHI, Difco), johon oli lisätty 5 μg/ml klo-ramfenikolia. Viljelmien supernatantit tutkittiin subti-lisiiniaktiivisuuden suhteen. B. subtilis -kannat BZ28, BZ29, BZ30, BZ31, BZ32 ja BZ33 tuottivat kaikki subti- 20 lisiinia ja erittivät sitä ympäröivään kasvatusaineeseen, jolloin jotkut kannat tuottivat enemmän kuin toiset. Nestemäisessä kasvuliemessä havaittu subtilisiinin määrä oli suoraan verrannollinen kuorittu maito -L-agar-maljoille havaitun kehän kokoon.. Koska näiden solujen erittämät sub-; 25 tilisiinimäärät erosivat toisistaan, oli useita pAMB302:n kopioita integroitunut kromosomiin tai oli tapahtunut geenin monistumista [Young, J. Gen. Microbiol., 129, 1 497 -1 512 (1983); Albertini et ai., J. Bacteriol., 162, 1 203 - 1 211 (1985)].

3 0 Esimerkkj. 11 BZ25/pAMBlll:sta saatu villityypin subtilisiini ja BZ25/pAMB131: stä saatu [Asp76, Ser109, Ser218] -subtilisiinin analogi eristettiin ja puhdistettiin seuraavasti. Kutakin kasvulientä sentrifugoitiin nopeudella 15 000 g 30 minuu-35 tin ajan ja kirkkaassa supernatantissa oleva proteiini 40 1 0 5 6 9 5 saostettiin (NH4) 2S04:11a (350 g litraa kohden). Saostuma koottiin sentrifugoimalla, sitä hierrettiin 75 % asetonin kanssa, suodatettiin ja kuivattiin tyhjössä.

Entsyymin puhdistamiseksi lisää liuotettiin kuivat-5 tu saostuma veteen ja liuos suodatettiin ja sitä dialysoi-tiin sitten 0,02 M natriumfosfaattipuskuriliuosta vastaan, jonka pH oli 6,3. Dialysoidun liuoksen annettiin kulkea karboksimetyyliselluloosapylvään (2,5 x 15 cm) lävitse nopeudella 2 ml minuutissa. Sen jälkeen kun pylvästä 10 oli pesty 0,02 M natriumfosfaatilla (pH 6,3), entsyymi eluoitiin samalla puskuriliuoksella, joka sisälsi 0,15 M NaCl:a. Huipun fraktiot yhdistettiin ja entsyymiä sisältävistä fraktioista, jotka oli tunnistettu sukkinyyli-L-alanyyli-L-alanyyli-L-prolyyli-L-fenyylialanyyli-p-nitro-15 anilidin (Vega Biochemicals) kanssa sekoitetun frak-tionäytteen värin muutoksen perusteella, saostettiin proteiini lisäämällä 2,5 tilavuutta asetonia. Saostuma koottiin sentrifugoimalla ja liuotettiin sitten 0,005 M kal-siumasetaattiin (noin 1 ml 10 mg:a kohden) . Saatua liuosta 20 dialysoitiin 4 °C:ssa vettä vastaan ja sitten lyofilisoi-t iin.

Esimerkki 12

Puhdas subtilisiini tai subtilisiinin analogi lisättiin FPLC Superose 12 -pylvääseen ja ehyenä (ei pilk-: 25 koutuneena) proteiinina eluoituva materiaali yhdistettiin liuoksessa, jossa oli 20 mM MES, 0,1 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 6,3. Arvioitavia villityypin subtilisiinin tai tämän keksinnön mukaisen subtilisiinin analogin näytteitä inku-boitiin 10 minuutin ajan samassa puskuriliuoksessa, pus-30 kuriliuoksessa, jossa oli lisäksi 3 % SDS:a, tai liuoksessa, jossa oli 20 mM MES, 0,1 M NaCl:a, 5 mM CaCl2:a, ja 15 mM EDTA:a, ilmoitetussa lämpötilassa. Näytteitä jäähdytettiin huoneen lämpötilaan 5 minuutin ajan ja niitä tutkittiin sitten 20 minuutin ajan huoneen lämpötilassa 35 (20 °C) Tris-HCl:ssa, pH 8,0, jossa oli 0,6 % atsokaseii- nia, proteolyyttisen aktiivisuuden määrittämiseksi. Kun- 105695 kin näytteen proteolyyttinen aktiivisuus on ilmaistu prosentteina joko villityypin tai analogin alkuperäisestä aktiivisuudesta 20 °C:ssa 10 mM CaCl2:ssa ja on esitetty taulukossa 2.

5

Taulukko 2

Villitvvppiä oleva subtilisiinin proteolyyttinen aktiivisuus

10 Lämpötila 0 % SDS 3 % SDS 0 % SDS + 15 mM EDTA

20 100 8 100 35 100 0 62 50 95 0 37 70 14 0 14 15 100 00 0

Esimerkin 5 TAsp76, Ser1091 -subtilisiinin analogin aktiivisuus

20 Lämpötila 0 % SDS 3 % SDS 0 % SDS + 15 mM EDTA

20 100 55 91 50 100 12 94 100 50 5 . : 25 Esimerkki 13

Vahingoittumattomia subtilisiineja saatiin FPLC:n avulla käyttäen Superose 12 -pylvästä. Vahingoittumattomia subtilisiineja inkuboitiin 30 minuutin ajan huoneen lämpötilassa (20 °C) liuoksessa, jossa oli 15 mM 30 MES, 0,05 M NaCl, pH 6,3, ja joka sisälsi joko 4 mM CaC12:a tai 4 mM EDTA?a ja vaihtelevan määrän SDS:a. Entsyymin proteolyyttinen aktiivisuus määritettiin sitten inkuboimalla 20 minuutin ajan liuoksessa, jossa oli 0,6 % atsokaseiinia Tris-HCl:ssa, pH 8,0. Kunkin näytteen arvi-35 oitu proteolyyttinen aktiivisuus on esitetty taulukossa 3 prosentteina näytteen alkuperäisestä aktiivisuudesta olo- 42 105695 suhteissa O % SDS:a ja 10 mM Ca2+:a.

Taulukko 3

Villitvvppiä olevan subtilisiinin proteolvvttinen 5 aktiivisuus

% SDS 4 mM Ca2* 4 mM EDTA

0 100 94 0,1 100 76 10 0,25 100 45 0,50 76 13 0,75 63 3 1,0 60 0 2.0 29 0 15 3,0 17 0 TAsp76. Ser109. Ser2181 -subtilisiinin analogin proteolvvttinen aktiivisuus

20 % SDS 4 mM Ca2* 4 mM EDTA

0 100 95 0,1 100 95 0,25 100 86 0,50 100 81 ; 25 0,75 96 79 1.0 96 78 2.0 86 69 3.0 71 65 30 Esimerkki 14 ’·' Arvioitiin [Asp76, Ser109, Ser218] -subtilisiinin ana login, [Asp76, Glu79, Ser109, Ser218] -subtilisiinin analogin ja subtilisiini Carlsbergin stabiiliutta kolmessa lämpötilassa (25 °C, 37 °C ja 50 °C) kahdessa puskuriliuokses-35 sa (0,06 M natriumfosfaattl, pH 9,0, tai 0,12 M natrium-glysinaatti, pH 11,0). Tulokset on esitetty taulukossa 4 105695 entsyymien puoliaikana määritellyissä olosuhteissa. Taulukko 4 A. Liuoksessa 0,12 M natriumglysinaatti, pH 11,0 + 5 0,2 % SDS.

Subtilisi ini t„ (25°C) t,, (37°C) t,, (50°C) (päivää) .(tuntia) (tuntia) 10 [Asp76, Ser109, Ser218] -analogi 110 35,2 6,7 subtilisiini Carlsberg 2 8,4 0,53 15 [Asp76, Glu79, Ser109,

Ser218]-analogi 154 35,3 7,8 B. Liuoksessa 0,06 M natriumfosfaatti, pH 9,0 + 0,2 % SDS.

20

Subtilisiini tM (25°C) tM (37°C) t,, (50°) (tuntia) (tuntia) (tuntia) [Asp76, Ser109, Ser218] 25 -analogi 79,2 16,0 0,52 subtilisiini Carlsberg 17,3 2,4 0,18 [Asp76, Glu79, Ser109, 30 Ser218] -analogi 86,3 22,0 0,96 < ____ • !_____i:_ ' - 44 105695 C. Liuoksessa 0,12 M natriumglysinaatti, pH 11,0 + 5 mM EDTA.

Subtilisiini tv (25°C) t,t (37°C) tM (50°C) 5 (tunti) (tuntia) (tuntia) [Asp76, Ser109, Ser218] -analogi 28,7 1,87 0,25 10 subtilisiini Carlsberg 24 1,71 0,45 [Asp76, Glu79, Ser109,

Ser218]-analogi 21,5 1,42 0,20 15 D. Liuoksessa 0,06 M natriurafosfaatti, pH 9,0 + 5 mM EDTA.

Subtilisiini t„ (25°C) t,f (37°C) t„ (50°C) (tuntia) (tuntia) (tuntia) 20 [Asp76, Ser109, Ser218] -analogi 27,4 1,75 0,23 subtilisiini Carlsberg 26,3 1,68 0,32 25 [Asp76, Glu79, Ser109,

Ser218]-analogi 19,7 1,36 0,17

Vaikka tämä keksintö on kuvattu erityisen hyvinä 30 pidettyjen suoritusmuotojen avulla, on selvää, että alan ·’ asiantuntijoille tulee mieleen muunnoksia ja parannuksia.

Siten oletetaan, että jäännösten korvaaminen muissakin kalsiumsitomiskohdissa kuin tässä kuvatuissa nimenomaisissa kalsiuminsitomiskohdissa voi myöskin parantaa sta-35 biiliutta. Oletetaan aikaansaatavan lisäparannuksia stabiiliuteen tekemällä sellaisia substituutioita muissa 45 105695 entsyymeissä, joissa on Asn-Gly-sekvenssi, ja muissa proteiineissa, jotka sisältävät tämän sekvenssin. Lisäksi oletetaan, että tämän keksinnön mukaisella subtilisiinin analogilla on parempia ominaisuuksia kuin villityyppiä 5 olevilla subtilisiineilla pesuainevalmisteissa, kuten esimerkiksi niissä, jotka on esitelty US-patentissa no. 3 732 170; US-patentissa no. 3 749 671 ja US-patentissa no. 3 790 482, jotka kaikki sisällytetään tähän viitteenä.

Lisäksi monet teollisuuden prosessit suoritetaan 10 käytännön syistä lämpötiloissa, jotka ovat useimpien entsyymien stabiiliuslämpötila-alueen yläpuolella. Sen vuoksi vaikka tässä on korostettu pesuainekäyttömahdollisuuk-sia, uskotaan että tämän keksinnön mukaiset lämmönkestä-vät subtilisiinin analogit eivät ole edullisia ainoastaan 15 tietyillä sellaisilla, teollisuuden aloilla kuin esimerkiksi pesuaineteollisuus, jotka jo vaativat stabiileja subtilisiineja, vaan voivat myös olla hyödyllisiä teollisuuden aloilla, joissa käytetään kemiallisia keinoja proteiinien hydrolysoimiseksi, esim. kasvi- ja eläinproteii-20 nien hydrolyysissä keittotiivisteiden tuottamista varten.

Tarkoitus on sen vuoksi, että tämä keksintö käsittää kaikki sellaiset......muunnokset ja parannukset, jotka sisältyvät tämän keksinnön patenttivaatimuksissa määriteltyyn suojapiiriin.

2 5

Claims (22)

46 105695

1. Subtilisiinin analogi, tunnettu siitä, että sillä on luonnossa esiintyvän Bacillus-subtilisiinin 5 aminohapposekvenssi, jota on muunnettu: (1) korvaamalla yksi tai useampia luonnossa esiintyvän Bacillus-subtilisiinin kalsiuminsitomiskohdassa läsnä 41 75 76 77 78 olevista aminohapoista Asp , Leu , Asn , Asn , Ser , Ile7^, Gly®^, Vai®·1·, Thr^® ja Tyr^^ aminohapolla Asp tai

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen susbtilisiinin analogi, tunnettu siitä, että analogi on ryhmästä, jonka muodostavat subtilisiini Carlsberg, subtilisiini DY, subtilisiini BPN', ja bakteerin Bacillus subtilis aprA--subtilisiini, valitun luonnossa esiintyvän Bacillus-subti-20 lisiinin analogi.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen subtilisiinin ana- 7 6 logi, tunnettu siitä, että siinä on Asn korvattu Asp76:11a.

. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen subtilisiinin ana- 77 25 logi, tunnettu siitä, että siinä on Asn korvattu 77 Asp :llä.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen subtilisiinin ana- 79 logi, tunnettu siitä, että siinä on Ile korvattu 79 Glu :llä.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen subtilisiinin ana- 76 logi, tunnettu siitä, että siinä on Asn korvattu 76 77 77 Asp :11a ja Asn on korvattu Asp :llä.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen subtilisiinin ana- 76 logi, tunnettu siitä, että siinä on Asn korvattu 7 c. 7Q 7Q

35 Asp :11a ja Ile korvattu Glu :llä. 47 105695

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen subtilisiinin analogi, tunnettu siitä, että siinä Asn-Gly-sekvenssi in sisältyvä Asn-jäännös on korvattu erilaisen aminohapon jäännöksellä.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen subtilisiinin ana logi, tunnettu siitä, että Asn-Gly-sekvenssiin sisältyvä Asn-jäännös on korvattu Ser-jäännöksellä.

10 Ile79, Gly80, Vai81, Thr208 ja Tyr214 aminohapolla Asp tai Glu; j a (2) poistamalla tai korvaamalla luonnossa esiintyvän Bacillus-subtilisiinin minkä tahansa Asn-Gly-sekvenssin toinen tai molemmat Asn- ja Gly-aminohapoista erilaisella, 15 neutraalilla alifaattisella aminohapolla.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen subtilisiinin analogi, t u n n e b t u siitä, että aseman 109 Asn- 10 jäännös on korvattu jSer-jäännöksellä.

10 Glu; ja (2) poistamalla tai korvaamalla luonnossa esiintyvän Bacillus-subtilisiinin minkä tahansa Asn-Gly-sekvenssin toinen tai molemmat Asn- ja Gly-aminohapoista erilaisella, neutraalilla alifaattisella aminohapolla.

11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen subtilisiinin analogi, tunnettu siitä, että aseman 218 Asn-jäännös on korvattu Ser-jäännöksellä.

12. Patenttivaatimuksen 9 mukainen subtilisiinin 15 analogi, tunnettu siitä, että asemien 109 ja 218 Asn-jäännös on korvattu Ser-jäännöksellä.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen subtilisiinin analogi, t u n n ett u siitä, että se on valittu ryh- 76 109 218 mästä, jonka muodostavat [Asp , Ser , Ser J-subtili-77 109 218 20 siini, [Asp , Ser , Ser ]-subtilisiini, [Glu79, Ser189, Ser218]-subtilisiini, [Asp , Asp , Ser , Ser J-subtilisiini 3a [Asp76, Glu79, Ser109, Ser21®]-subtilisiini.

14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen subtilisiinin 25 analogi, tunnettu siitä, että muunnettavalla Ba- cillus-subtilisiinilla on luonnossa esiintyvä aminohappo-sekvenssi, joka on esitetty taulukossa 1.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen subtilisiinin 76 109 218 analogi [Asp , Ser , Ser ]-subtilisiini.

16. Patenttivaatimuksen 14 mukainen subtilisiinin 77 109 218 analogi [Asp , Ser , Ser ]-subtilisiini.

17. Patenttivaatimuksen 14 mukainen subtilisiinin 7 n 109 21R analogi [Glu , Ser , Ser ]-subtilisiini.

18. Patenttivaatimuksen 14 mukainen subtilisiinin 35 analogi [Asp76, Asp77, Ser109, Ser218]-subtilisiini. • · 48 105695

19. Patenttivaatimuksen 14 mukainen subtilisiinin analogi [Asp76, Glu79, Ser109, Ser218]-subtilisiini.

20. DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa subtilisiinin analogin, jolla on luonnossa esiinty- 5 vän Bacillus-subtilisiinin aminohapposekvenssi, jota on muunnettu: (1) korvaamalla yksi tai useampia luonnossa esiintyvän Bacillus-subtilisiinin kalsiuminsitomiskohdassa läsnä 41 75 76 77 78 olevista aminohapoista Asp , Leu , Asn , Asn , Ser ,

21. Menetelmä kalsiuminsitomiskohdan omaavan Bacillus-subtilisiinin valmistamiseksi, jolla on parantunut läm-mönkestävyys ja pH-stabiilisuus, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 20 mukainen DNA-sekvenssi viedään 20 bakteeri-isäntäsoluun, jossa se saatetaan ilmentymään ja mainittu Bacillus-subtilisiini otetaan talteen.

22. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen subtilisiinin analogin käyttö pesuainevalmisteessa. w m 105695