ES2989087T3 - Mejoras en conjugados inmunogénicos - Google Patents
Mejoras en conjugados inmunogénicos Download PDFInfo
- Publication number
- ES2989087T3 ES2989087T3 ES19745001T ES19745001T ES2989087T3 ES 2989087 T3 ES2989087 T3 ES 2989087T3 ES 19745001 T ES19745001 T ES 19745001T ES 19745001 T ES19745001 T ES 19745001T ES 2989087 T3 ES2989087 T3 ES 2989087T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- conjugates
- serotypes
- nnaa
- antigen
- carrier polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/0216—Bacteriodetes, e.g. Bacteroides, Ornithobacter, Porphyromonas
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
- A61K39/092—Streptococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/095—Neisseria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
- A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medical Preparation Storing Or Oral Administration Devices (AREA)
Abstract
La presente solicitud divulga varias mejoras relativas a conjugados inmunogénicos que comprenden un polipéptido portador y un antígeno sacárido, en donde el antígeno sacárido está unido covalentemente al polipéptido portador a través de un residuo de aminoácido no natural en el mismo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Mejoras en conjugados inmunogénicos
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La respuesta inmunitaria a un antígeno de sacárido "débil" puede amplificarse mediante conjugación con un antígeno polipéptido portador "fuerte" conocido, como toxoide diftérico, toxoide tetánico, proteína Dde H.influenzaeo CRM197. La WO 2018/126229 (SutroVax, Inc., Foster City, California) divulga métodos, composiciones y técnicas para la producción de antígenos de vacuna conjugados usando polipéptidos portadores que incluyen un aminoácido no natural (nnAA). La química de unión ortogonal a través del nnAA permite la conjugación de antígenos con los polipéptidos portadores para producir conjugados inmunogénicos que son útiles para la inmunización.
Es un objeto de la invención proporcionar variantes y mejoras de tales métodos, composiciones y técnicas. Las variantes y mejoras descritas a continuación pueden aplicarse o combinarse con cualquiera de los métodos, composiciones o técnicas divulgados en la WO 2018/126229 o en las Solicitudes de Patente de Estados Unidos provisionales N° de serie 62/693,978 y 62/693,981, ambas presentadas el 4 de julio de 2018.
La WO2017/173415 describe proteínas portadoras a base de CRM-197 y la conjugación de dichas proteínas portadoras con polisacáridos capsulares de S.pneumoniae.La WO2017/173415 menciona la conjugación de CRM-197 modificado que comprende aminoácidos no naturales con polisacáridos, pero no divulga el número ni la ubicación de los aminoácidos no naturales en la proteína CRM-197, y no divulga una proteína portadora que esté libre de una secuencia dipeptídica Arg-Arg.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
En la presente se proporciona un polipéptido portador que comprende una secuencia de aminoácidos que (i) tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1; (ii) está libre de una secuencia dipeptídica Arg-Arg; y (iii) comprende residuos de aminoácidos no naturales (nnAA) sustituidos por K33, K212, K244, K264, K385 y K526 en la SEQ ID NO:1.
También se proporciona en la presente un conjugado inmunogénico que comprende dicho polipéptido portador conjugado a través de residuos de nnAA en el mismo con un antígeno.
También se proporciona en la presente una composición farmacéutica que comprende dos o más conjugados inmunogénicos diferentes de acuerdo con las reivindicaciones. También se proporciona en la presente dicha composición farmacéutica para su uso en la generación de una respuesta protectora de anticuerpos.
La composición farmacéutica puede proporcionarse en un recipiente estéril (por ejemplo, un vial). El recipiente puede contener una dosis unitaria de la composición farmacéutica. Se prefieren los recipientes estériles de vidrio.
La composición farmacéutica puede proporcionarse en un dispositivo de administración (por ejemplo, jeringuilla, nebulizador, pulverizador, inhalador, parche dérmico, etc.). El dispositivo de administración puede contener una dosis unitaria de la composición farmacéutica. El dispositivo de administración puede usarse para administrar la composición farmacéutica a un sujeto mamífero.
La composición farmacéutica puede proporcionarse en un recipiente herméticamente cerrado. Los recipientes adecuados para el cierre hermético incluyen, por ejemplo, un vial. El contenido es preferiblemente estéril en el punto de sellado hermético.
La composición farmacéutica puede proporcionarse en una jeringuilla que contenga entre 0,25 y 0,75 ml (por ejemplo, entre 0,3 y 0,75 ml, preferiblemente 0,5 ml) de la composición farmacéutica.
La composición farmacéutica puede comprender además un adyuvante de sal de aluminio, en donde: (i) el adyuvante de sal de aluminio es un adyuvante de hidróxido de aluminio o de fosfato de aluminio; (ii) la composición farmacéutica tiene un volumen de 0,25-0,75ml (por ejemplo, de 0,3-0,75ml, preferiblemente de 0,5ml).
La composición farmacéutica puede comprender además un adyuvante de fosfato de aluminio, en donde la concentración de iones de aluminio en la composición es de <300|jg/ml (por ejemplo, entre 100-300|jg/ml) o <2,5mg/ml. Lo ideal es que la concentración de iones de aluminio sea de <1,7mg/ml. Los conjugados dentro de la composición pueden adsorberse en el adyuvante de fosfato de aluminio.
El polipéptido portador no comprende la SEQ ID NO: 3.
El volumen de la composición farmacéutica puede ser de 0,25-1,25ml (por ejemplo, de 0,3-0,7ml, preferiblemente de 0,5ml). Esta composición puede incluir un adyuvante de fosfato de aluminio, y los conjugados dentro de la composición pueden adsorberse en el adyuvante de fosfato de aluminio.
La composición farmacéutica puede comprender un conservante.
En otra realización, la composición farmacéutica puede estar libre de conservantes.
La composición farmacéutica puede tener una osmolalidad de 200-400 mOsm/kg.
La composición farmacéutica puede comprender por lo menos un excipiente seleccionado del grupo que consiste en cloruro de sodio, ácido succínico y polisorbato 80. También puede incluir un adyuvante de sal de aluminio. También puede incluir un adyuvante de sal de aluminio. Esta composición puede incluir tanto cloruro sódico como polisorbato 80 como excipientes.
La composición farmacéutica puede comprendernconjugados inmunogénicos diferentes en donde: (i)nes un número entero de 3 a 50; y (ii) la cantidad total de polipéptido portador en losnconjugados inmunogénicos es menor o igual a3n|jg por dosis de la composición farmacéutica. En otra realización,nes un número entero de 3 a 50 y la concentración total de polipéptido portador en losnconjugados inmunogénicos es menor o igual a6njg /m l en la composición farmacéutica. En otra realización,nes un número entero de 3 a 50 y la cantidad total de antígeno de sacárido en losnconjugados inmunogénicos es menor o igual a3njg por dosis de la composición farmacéutica. En otra realización,nes un número entero de 3 a 50 y la concentración total de antígeno de sacárido en losnconjugados inmunogénicos es menor o igual a6njg /m l en la composición farmacéutica.
La cantidad media de polipéptido portador por conjugado puede ser de 1-4 jg por dosis de la composición farmacéutica.
La concentración media de polipéptido portador por conjugado puede ser de 2-8 jg/m l en la composición farmacéutica.
La cantidad media de antígeno de sacárido por conjugado puede ser de 1-4 jg por dosis de la composición farmacéutica.
La concentración media de antígeno de sacárido por conjugado puede ser de 2-8 jg/m l en la composición farmacéutica.
La composición farmacéutica puede comprendernconjugados inmunogénicos diferentes en donde: (i)nes un número entero de 3-50; y o (ii) la composición no contiene el o los polipéptidos portadores en forma no conjugada o (iii) la composición contiene el o los polipéptidos portadores en forma no conjugada, en donde la masa del o de los polipéptidos portadores en forma no conjugada en la composición es <10% de la masa de ese polipéptido portador en losnconjugados inmunogénicos.
La composición farmacéutica puede comprendernconjugados inmunogénicos diferentes en donde: (i)nes un número entero de 3-50; y o (ii) la composición no contiene los antígenos de sacáridos en forma no conjugada o (iii) la composición contiene por lo menos uno de los antígenos de sacáridos en forma no conjugada, en donde la masa total de los antígenos de sacáridos en forma no conjugada en la composición es del <40% (por ejemplo, <30%, <20%, o <10%) de la masa total de los antígenos de sacáridos en losnconjugados inmunogénicos.
La composición farmacéutica puede comprender 14 o más conjugados inmunogénicos diferentes, en donde la cantidad total de polipéptido portador por dosis es de <40jg.
La composición farmacéutica puede comprender 14 o más conjugados inmunogénicos diferentes, en donde: la concentración de polipéptido portador es de <80jg/ml.
Pueden prepararse una pluralidad de dosis unitarias de la composición farmacéutica mediante un proceso que comprende los pasos de preparar una composición a granel que comprende el conjugado inmunogénico y envasar dosis unitarias individuales de la composición a granel en una pluralidad de recipientes individuales. Este proceso se realiza idealmente de manera aséptica. Los recipientes individuales pueden sellarse después de haber envasado en ellos las dosis unitarias. Idealmente los recipientes individuales son jeringuillas.
La composición farmacéutica puede liofilizarse.
Cuando la composición farmacéutica comprende un adyuvante de sal de aluminio, puede prepararse mediante un proceso que comprende uno de (A) los pasos de adsorber por separado cada uno de los conjugados inmunogénicos en un adyuvante de sal de aluminio y, a continuación, mezclar los conjugados adsorbidos individuales entre sí (B) adsorber secuencialmente cada uno de los conjugados inmunogénicos al adyuvante de sal de aluminio o (C) preparar una mezcla de dos o más de los conjugados inmunogénicos (por ejemplo, todos ellos) y combinar esta mezcla con un adyuvante de sal de aluminio. El adyuvante puede ser un adyuvante de fosfato de aluminio.
Los polipéptidos portadores de acuerdo con la reivindicación 1 pueden proporcionarse suprimiendo o sustituyendo Arg-192 y/o Arg-193 de la SEQ ID NO: 1 por un aminoácido diferente. Los polipéptidos portadores reivindicados comprenden residuos de nnAA sustituidos por K33, K212, K244, K264, K385 y K526. El polipéptido portador CRM197 modificado de acuerdo con la reivindicación 1 puede usarse para preparar conjugados inmunogénicos de acuerdo con la reivindicación 7.
En otra realización, proporcionamos un conjugado inmunogénico que comprende un polipéptido portador y un antígeno de sacárido, en donde (i) el polipéptido portador comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4; y (ii) el antígeno de sacárido está unido covalentemente al polipéptido portador mediante por lo menos un residuo de nnAA dentro de la SEQ ID NO: 4. También proporcionamos una composición farmacéutica que comprende dos o más conjugados inmunogénicos diferentes que comprenden cada uno un polipéptido portador y un antígeno de sacárido, en donde (i) el polipéptido portador en cada conjugado comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4; y (ii) el antígeno de sacárido en cada conjugado está unido covalentemente con el polipéptido portador a través de por lo menos un residuo de nnAA dentro de la SEQ ID NO: 4.
La composición farmacéutica puede proporcionarse en una jeringuilla, en donde la jeringuilla es unajeringuilla no siliconada. La composición farmacéutica en la jeringuilla no siliconada tiene idealmente 13 o más conjugados neumocócicos diferentes de acuerdo con las reivindicaciones. A continuación se dan más detalles sobre las jeringuillas no siliconadas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA FIGURA
La FIG. 1 proporciona el título medio geométrico para cada uno de los 32 serotipos indicados en una vacuna 32-valente de la presente invención, con respecto a una formulación de polisacárido/alumbre y Prevnar-13™, como se describe en los ejemplos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Varios detalles de los métodos, composiciones y técnicas para la producción de antígenos conjugados se divulgan en la Publicación de Patente Internacional N° w O2018/126229.
Conjugados inmunogénicos
La invención se refiere de manera general a conjugados inmunogénicos. Estos conjugados comprenden un polipéptido portador de acuerdo con la reivindicación 1 que está enlazado covalentemente a un antígeno. Este enlace puede convertir un inmunógeno independiente de las células T (como un sacárido) en un inmunógeno dependiente de las células T, aumentando de este modo la respuesta inmunitaria que se provoca (particularmente en niños). Los conjugados usados en la presente incluyen enlaces covalentes que se forman entre un antígeno y un residuo de aminoácido no natural ('nnAA') dentro del polipéptido portador. Estos residuos de nnAA pueden proporcionar grupos funcionales que faciliten la reactividad con un antígeno de interés.
Típicamente, un único polipéptido portador estará enlazado a múltiples moléculas de antígeno. Los antígenos pueden tener un único grupo de enlace por molécula (por ejemplo, el extremo terminal reductor de un sacárido) para unirse a un polipéptido portador, o pueden tener múltiples grupos de enlace (por ejemplo, múltiples grupos éster de aldehído o cianato). Cuando una molécula de antígeno tiene múltiples grupos de enlace, esto lleva generalmente a la formación de conjugados reticulados o red de alto peso molecular, que implican enlaces entre múltiples polipéptidos portadores a través de los antígenos. En este caso se prefieren los conjugados reticulados (en particular para el neumococo) y, por lo tanto, también se prefieren los antígenos con múltiples grupos de enlace.
Se forman enlaces covalentes entre el antígeno y un residuo de nnAA dentro del polipéptido portador. Preferiblemente, el antígeno no se conjuga con un residuo de lisina en el polipéptido portador; más preferiblemente, el antígeno no se conjuga con un residuo de aminoácido natural en el polipéptido portador.
Los polipéptidos portadores útiles contienen un epítopo de células T. En la técnica se conocen varios de tales polipéptidos portadores, y dentro de las vacunas aprobadas se conoce el uso de toxoide diftérico (toxina tratada químicamente deCorynebacterium diphtheriae;Dt'), toxoide tetánico (toxina tetanospasmina tratada químicamente deClostridium tetani;’Tf), proteína D deHaemophilus influenzae('PD' o 'HiD'), el complejo proteico de la membrana externa del meningococo del serogrupo B ('OMPC'), y la toxina mutante CRM197de C.diphtheriae.
Los portadores de la presente invención se basan en CRM197. El CRM197 es bien conocido en la técnica (por ejemplo, véase Broker et al. 2011 Biologicals 39:195-204) y tiene la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1), donde el residuo subrayado (Glu-52) difiere de la toxina diftérica natural, por lo que la sustitución de G ly^G lu lleva a la pérdida de actividad enzimática tóxica en la proteína:
GADDWDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNEN
PLSGKAGGWKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRWLSLPFAE
GSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKT
KTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVN
VAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGF
AAYNFVESIINLFQWHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTP
LPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSE
KIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS
La invención no usa CRM197 nativo. En lugar de usarCRM197 que comprende la SEQ ID NO: 1, se usa una secuencia de aminoácidos modificada que (i) tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1; (ii) está libre de una secuencia dipeptídica Arg-Arg; y (iii) comprende residuos de nnAA sustituidos por K33, K212, K244, K264, K385 y K526 en la Se Q iD NO: 1. Estos polipéptidos portadores CRM197 modificados se describen con más detalle a continuación.
Aparte de CRM197, pueden usarse otras formas mutantes detoxificadas de toxina diftérica para hacer una proteína portadora de acuerdo con las reivindicaciones. Por ejemplo, también se ha usado un mutante doble K51E/E148K no tóxico como polipéptido portador en conjugados (Pecetta et al. 2016 Vaccine 34:1405-11) y pueden incorporarse residuos de nnAA en la secuencia de este mutante doble de la misma manera que en CRM197 al preparar una proteína portadora de acuerdo con las reivindicaciones.
Los epítopos de células T en polipéptidos portadores pueden unirse al MHC de clase II e interactuar con receptores de células T en la superficie de células T CD4+, potenciando de este modo las respuestas de anticuerpos contra antígenos o haptenos conjugados con los mismos (por ejemplo, véase Costantino et al. 2011, Expert Opin Drug Discov 6:1045-66). Micoli et al. (2018) Molecules 23, 1451 revisan varios polipéptidos portadores y los criterios para su selección. Tontini et al. (2016) Vaccine 34:4235-42 analizan estudios preclínicos de 28 polipéptidos portadores, incluyendo pruebas de su capacidad para inducir anticuerpos contra antígenos de sacáridos. Se han diseñado polipéptidos portadores de poliepítopos que contienen múltiples epítopos de células T CD4+ humanas ampliamente reactivos (es decir, inmunogénicos en el contexto de la mayoría de las moléculas humanas de MHC de clase II) de varios antígenos derivados de patógenos, por ejemplo, el polipéptido N19 y otros polipéptidos como se divulga en Falugi et al. (2001) Eur J 31:3816-24, Baraldo et al. (2004) Infect Immun 72:4884-7, y las Patentes de Estados Unidos 6.855.321 y 7.867.498. La capacidad de diseñar estos portadores de polipepítopos demuestra la capacidad de los expertos en la técnica para identificar epítopos de células T adecuados a partir de varias fuentes y también para usarlos para diseñar polipéptidos portadores eficaces. Véase también la solicitud de patente US2016-0101187. Se han descubierto epítopos de células T en portadores conocidos (por ejemplo, Tt, PD, CRM197). Se han usado con éxito varias toxinas bacterianas detoxificadas como portadores, por ejemplo Tt, Dt, la exotoxinade P.aeruginosa,las toxinas A y Bde C. difficile, etc.Se han usado muchos polipéptidos portadores diferentes para los sacáridos neumocócicos, por ejemplo CRM197 en Prevnar™, PD, Tt y Dt en Synflorix™, y varios péptidos en Velasco et al. (1995) Infect Immun 63:961-8. La invención usa un polipéptido portador que comprende una secuencia de aminoácidos que (i) tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1; (ii) está libre de una secuencia de dipéptdo Arg-Arg; y (iii) comprende residuos de nnAA sustituidos por K33, K212, K244, K264, K385, y K526 en la SEQ ID NO:1.
Los polipéptidos portadores que se usarán con la invención pueden prepararse en general usando las técnicas divulgadas en la sección 6 ("Métodos de producción de proteínas portadoras") de la WO2018/126229. Los portadores preferidos contienen nnAA fuera de por lo menos un epítopo de células T del portador. Si se desconocen las regiones de epítopos de células T para un portador, pueden identificarse los epítopos usando técnicas estándar, por ejemplo, véase Reece et al. (1993) IJ Immunol 151:6175-84, Beissbarth et al. (2005) Bioinformatics 21 Suppl 1: i29-37, Maciel Jr et al. (2008) Virol 378:105-17, Fridman et al. (2012) Oncoimmunol 1:1258-70,etc.(incluyendo enfoques empíricos y/o predictivos). También es posible confirmar que cualquier modificación particular de la secuencia de un polipéptido portador no elimina la respuesta de células T deseada a un antígeno conjugado, como los sacáridos de la presente. Un grupo preferido de portadores no contiene ninguna modificación, incluyendo la inserción o sustitución de un nnAA, dentro de un epítopo de células T. Los portadores particularmente preferidos también pueden tener un máximo de 10, 9, 8, 7 o 6 nnAAs.
En los conjugados inmunogénicos usados en la presente pueden incluirse varios antígenos. Típicamente, el antígeno es un sacárido. El término "sacárido" incluye polisacáridos que tienen 50 o más unidades de repetición, y oligosacáridos que tienen menos de 50 unidades de repetición. Típicamente, los polisacáridos tienen de aproximadamente 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95 unidades de repetición a aproximadamente 2.000 (a veces más) unidades de repetición y, opcionalmente, de aproximadamente 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1.000 unidades de repetición a aproximadamente 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.800 o 1.900 unidades de repetición. Los oligosacáridos tienen típicamente de aproximadamente 6, 7, 8, 9 o 10 unidades de repetición a aproximadamente 15, 20, 25, 30 o 35 y 40 o 45 unidades de repetición.
Los sacáridos útiles para su incorporación en conjugados inmunogénicos incluyen los que se encuentran en las bacterias. Pueden ser sacáridos no capsulares (como un exopolisacárido, por ejemplo, el exopolisacáridode S. aureus),pero preferiblemente son sacáridos capsulares bacterianos.
Los sacáridos capsulares bacterianos son sacáridos de alto peso molecular que se encuentran en la cápsula de bacterias Gram-positivas o Gram-negativas y pueden usarse como antígenos de vacunas. Tales sacáridos capsulares se preparan generalmente a partir de lisados de células completas o sobrenadantes de cultivo de la bacteria correspondiente mediante procesos que implican diafiltración, eliminación de proteínas, precipitación con etanol, eliminación de ácidos nucleicos y liofilización. Los sacáridos bacterianos usados con la invención pueden estar intactos tal y como se encuentran en las bacterias, o pueden ser fragmentos obtenidos a partir de sacáridos intactos, por ejemplo, obtenidos por hidrólisis de sacáridos purificados de las bacterias.
Los antígenos de sacáridos de interés particular incluyen, pero no se limitan a:
- Sacáridos capsulares deS.pneumoniae.A continuación se ofrecen detalles adicionales sobre los sacáridos capsulares de neumococo útiles como antígenos para la aplicación de la invención.
- Sacáridos deStreptococcus pyogenes:El antígeno puede ser un sacárido de S.pyogenes.En una realización, el antígeno es el sacárido capsular de S.pyogenes,que está compuesto de ácido hialurónico, un polímero de alto peso molecular en el que la unidad de repetición tiene la estructura:
H4)-p-D-GlcUAp-(1^3)-p-D-GlcpNAc-H]
que parece ser invariable entre los serotipos de S. pyogenes. En otra realización, el antígeno es un sacárido no capsular de S.pyogenes,como el sacárido de la pared celular del grupo A-strep, que comprende una estructura principal de unidades de poli-L-ramnopiranosilo conectadas por enlaces a-L-(1^-3) y a-L-(1^-2) alternos, a los que se unen residuos de N-acetil-p-D-glucosamina en la posición 3 de la estructura principal de ramnosa.
- Sacáridos capsulares deStreptococcus agalactiae:El antígeno puede ser un sacárido capsular deS.agalactiae(estreptococo del grupo B o GBS). Hay por lo menos 10 serotipos de GBS con distintas unidades de repetición de sacáridos capsulares (la, lb, II-IX), pero sólo unos pocos serotipos son comúnmente responsables de la enfermedad. Estos incluyen los serotipos la, Ib, II, III y V, y pueden prepararse conjugados de sacáridos capsulares de estos serotipos.
- Sacáridos capsulares deHaemophilus influenzae:El antígeno puede ser un sacárido capsular deH.
influenzae.Hay por lo menos 6 serotipos deH. influenzaecon estructuras químicas de sacáridos capsulares distintas (tipos a-f). Sin embargo, sólo el tipo a y el tipo b se consideran cepas de "alta virulencia", y el tipo preferido de sacárido capsularde H. influenzaepara su uso con la invención es el tipo b (Hib).
- Sacáridos capsulares deNeisseria meningitidis:El antígeno puede ser un sacárido capsular deN.meningitidis.Hay por lo menos 13 serogrupos deN.meningitidiscon estructuras químicas de sacáridos capsulares distintas (serogrupos A, B, C, E-29, H, I, K, L, W-135, X, Y, Z y Z'), pero sólo seis (A, B, C, W-135, X, Y) se consideran potencialmente mortales. El antígeno de sacárido se deriva útilmente de cualquiera de los serogrupos A, C, W135, X o Y.
- Sacáridos capsulares dePorphyromonas gingivalis:El antígeno puede ser un sacárido capsular derivado de uno de los seis serotipos K1, K2, K3, K4, K5 y K6 deP.gingivalis.
- Sacáridos capsulares deSalmonella typhi:El antígeno puede ser un sacárido Vi. Vi es el sacárido capsular deSalmonella typhi(el serovartyphideS.enterica).El sacárido Vi es un homopolímero lineal de un ácido hexosaminurónico, ácido a l ,4-N-acetilgalactos-aminourónico,que está acetilado en un 60-90% en la posición C-3.
- Sacáridos deStaphylococcus aureus:El antígeno puede ser un sacárido deS.aureus.El sacárido puede ser el exopolisacárido deS.aureus,que es una poli-N-acetilglucosamina (PNAG), o un sacárido capsular deS.aureus,que puede ser, por ejemplo,elserotipo 5, el serotipo 8 o el serotipo 336.
- Sacáridos de superficie deClostridium difficile:El antígeno puede ser un glicano de superficie deC.difficile,como PS-I o PS-II.
- Glucanos: El antígeno puede ser un glucano que contenga enlaces p-1,3 y/o enlaces p-1,6. Estos glucanos conjugados pueden ser útiles para provocar una respuesta inmunitaria antifúngica, por ejemplo contraCandida albicans.
Detalles adicionales sobre estos antígenos de sacáridos pueden encontrarse en la WO2018/126229.
Los antígenos a menudo no contienen intrínsecamente grupos funcionales que sean adecuados o ideales para la conjugación. Por lo tanto, puede ser necesario funcionalizar un antígeno antes de su conjugación con el nnAA. A continuación se ofrecen detalles adicionales sobre dicha funcionalización.
Sacáridos capsulares neumocócicos
Los antígenos preferidos para su uso con la invención son sacáridos capsulares deStreptococcus pneumoniae. S.pneumoniaees una bacteria Gram-positiva encapsulada que puede provocar neumonía, bacteriemia y meningitis. Hay por lo menos 90 serotipos distintos documentados deS.pneumoniae(véase, por ejemplo, Kalin, M. Thorax 1998;53:159-162) que portan sacáridos capsulares con estructuras de unidades de repetición específicas del serotipo. Como comprenderán los entendidos en la técnica, se ha propuesto que el serotipo 20 deS.pneumoniaese compone en realidad de dos serotipos estrechamente relacionados, cuyos polisacáridos capsulares son en gran medida de protección cruzada (Calix et al. 2012 J Biol Chem 287:27885-94). Por lo tanto, como se apreciaría adicionalmente por los expertos en la técnica, el serotipo 20 se refiere a un sacárido que se habría clasificado previamente en la técnica como serotipo 20, y por lo tanto podría ser estructuralmente 20A o 20B (a partir de una cepa que se habría clasificado previamente en la técnica como serotipo 20, pero podría ser genotípicamente 20A o 20B) como se divulga por Calixet al.Por ejemplo, la cepa usada para producir el polisacárido del serotipo 20 en Pneumovax™ (Merck) ahora se cree que es el serotipo 20A. En algunos casos, puede preferirse el serotipo 20A. En otros casos, puede preferirse el serotipo 20B. La prevalencia en una población diana podría ser una base para seleccionar entre estos serotipos. Sin embargo, como las cepas clasificadas como 20, 20A y 20B son serológicamente similares, son en gran medida de protección cruzada en una vacuna y la elección entre la cepa puede no ser crítica.
El antígeno usado con la invención puede ser un sacárido capsular de cualquiera de los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 7A, 7B, 7C, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10F, 10A, 10B, 10C, 11F, 11A, 11B, 11C, 11D, 12F, 12A, 12B, 13, 14, 15F, 15A, 15B, 15C, 16F, 16A, 17F, 17A, 18F, 18A, 18B, 18C, 19F, 19A, 19B, 19C, 20, 21 ,22F, 22A, 23F, 23A, 23B, 24F, 24A, 24B, 25F, 25A, 27, 28F, 28A, 29, 31, 32F, 32A, 33F, 33A, 33B, 33C, 33D, 34, 35F, 35A, 35B, 35C, 36, 37, 38, 39, 40, 41F, 41A, 42, 43, 44, 45, 46, 47F, 47A, o 48 (Henrichsen J Clin Microbiol 1995; 33:2759-2762). Sin embargo, sólo un subconjunto de estos serotipos son comúnmente responsables de la infección bacteriana de importancia clínica, por lo que el antígeno puede ser un sacárido capsular de cualquiera de los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 y 33Fde S.pneumoniae.Los serotipos 6C, 7C, 15A, 15C, 16F, 20A, 20B, 23A, 23B, 24B, 31, 34, 35B, 35F, 37 y 38 también se han convertido en motivo de preocupación clínica, por lo que el antígeno puede ser un sacárido capsular de uno de estos serotipos deS.pneumoniae.
Cuando la invención usa conjugados de diferentes serotipos de neumococo, se prefiere que incluya sacáridos de por lo menos 14 serotipos diferentesde S.pneumoniae(por ejemplo, de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, o más) Cuando una composición incluye 14 o más serotipos, estos incluyen preferiblemente los 13 serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F. Además de estos 13 serotiposde S.pneumoniae,una composición incluye preferiblemente uno o más de los serotipos 2, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15<b>, 17F, 20 (alternativamente, 20Ao 20B), 22F, y/o 33F. Alternativamente, además de los 13 serotipos anteriores, una composición incluye preferiblemente uno o más serotipos 2, 6C, 8, 9N, 10A, 12F, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 20, 20A, 20B, 22F, 23A, 23B, 24F, 24B, 31, 33F, 34, 35B, 35F y 38de S.pneumoniae.Una combinación útil de 15 o más (por ejemplo, 16 o más) serotipos incluye cada uno de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F y 33Fde S.pneumoniae,y también puede incluir el serotipo 8. Una combinación útil de 20 o más (por ejemplo, 21 o más) serotiposde S.pneumoniaeincluye cada uno de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F y 33F. Una combinación útil de 24 o más serotipos incluye cada uno de los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33Fde S.pneumoniae.
Las estructuras de las unidades de repetición de sacáridos capsulares comunes del serotipo neumocócico se describen en Joneset al.(Jones C et al. An Acad Bras Ciénc. 2005 Jun;77(2):293-324):
Tipo 1
H3)-D-AAT-a-Galp-(1^4)-a-D-GalpA(2/3OAc)-(1^3)-a-D-GalpA-(1^]
Tipo 2
H4)-p-D-Glcp-(1^3)-[a-D-GlcpA-(1^6)-a-D-Glcp-(1^2)]-a-L-Rhap-(1^3)-a-L-Rhap-(1^3)P-L-Rhap-(1^j
Tipo 3
H3)-p-D-GlcA-(1^4)-p-D-Glcp-(1^ ]
Tipo 4
[^■3)-p-D-ManpNAc-(1^3)-a-L-FucpNAc-(1^3)-a-D-GalpNAc-(1^4)-a-D-Galp2,3(S)Py-(1^] Tipo 5
[^4)-p-D-Glcp-(1^4)-[a-L-PnepNAc-(1^2)-p-D-GlcpA-(1^3)]-a-L-FucpNAc-(1^-3)-p-D-Sugp-(1 - ]
Tipo 6B
H2)-a-D-Galp-(1^3)-a-D-G lcp-(1^3)-a-L-Rhap-(1^4)-D-R ib-ol-(5^P^j
Tipo 9N
H4)-a-D-GlcpA-(1^3)-a-D-Glcp-(1^3)-p-D-ManpNAc-(1^4)-p-D-Glcp-(1^4)-a-D-GlcpNAc-(1^] Tipo 9V
H4)-a-D-GlcpA(2/3OAc)-(1^3)-a-D-Galp-(1^3)-p-D-ManpNAc(4/6OAc)-(1^4)-p-D-Glcp-(1^4)-a-D-Glcp-(1^]
Tipo 12F
H4)-[a-D-Galp-(1^3)]a-L-FucpNAc-(1^3)-p-D-GlcNAc-(1^4)-[a-D-Glc-(1^2)-a-D-Glc-(1^3)]-p-D -M anNAcA-^]
Tipo 14
[^4)-p-D-Glcp-(1^6)-[p-D-Galp-(1^4)]-p-D-GlcpNAc-(1^3)-p-D-Galp-(1^]
Tipo 18C
H4)-p-D-Glcp-(1^4)-[a-D-Glcp(6OAc)(1^2)][Gro-(1^P^3)]-p-D-Galp-(1^4)-a-D-Glcp-(1^3)-p-L-Rhap-(1^]
Tipo 19F
H4)-p-D-M anpNAc-(1^4)-a-D-G lcp-(1^2)-a-L-Rhap-(1^P^]
Tipo 23F
[^4)-p-D-G lcp-(1^4)-[a-L-Rhap-(1^2)]-[Gro-(2^P^3)]-p-D-Galp-(1^4)-p-L-Rhap-(1^] Un análisis más extenso de los sacáridos se encuentra en Geno et al. (2015) Clin. Microbiol. Rev. 28:871-99, en la que la Tabla 1 muestra las estructuras de 97 serotipos conocidos. Esta tabla también divulga la proporción de residuos de sacáridos que están acetilados cuando la acetilación no es completa.
El sacárido capsular puede estar O-acetilado. En algunas realizaciones, el sacárido capsular de los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 y 33F comprende un sacárido que tiene un grado de O-acetilación de entre el 10-100%, entre el 20-100%, entre el 30-100%, entre el 40-100%, entre el 50-100%, entre el 60-100%, entre el 70-100%, entre el 75-100%, 80-100%, 90-100%, 50-90%, 60-90%, 70-90% u 80-90%. En otras realizaciones, el grado de O-acetilación es mayor del 10%, mayor del 20%, mayor del 30%, mayor del 40%, mayor del 50%, mayor del 60%, mayor del 70%, mayor del 80%, mayor del 90% o aproximadamente del 100%. El grado de O-acetilación del sacárido puede determinarse mediante NMR de protones (véase, por ejemplo, Lemercinier & Jones (1996) Carbohydrate Research 296:83-96; Jones et al. (2002) J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30:1233-1247). Normalmente, el sacárido usado para preparar un conjugado conservará por lo menos el 50%(porejemplo, el 75%, o incluso el 100%) de los niveles de O-acetilación observados en el sacárido capsular de partida purificado a partir de una bacteria.
Los sacáridos capsularesde S.pneumoniaepueden obtenerse directamente de bacterias usando procedimientos de aislamiento conocidos por los expertos en la técnica (véanse, por ejemplo, los métodos divulgados en las Publicaciones de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340, y 2008/0102498 y WO 2008/118752). Como alternativa, pueden obtenerse de una fuente comercial (por ejemplo, ATCC).
Un antígeno de sacárido capsular neumocócico usado con la invención puede tener un peso molecular entre 10 kDa y 4.000 kDa, por ejemplo, entre 50 kDa y 3.000 kDa, o entre 100 kDa y 2.000 kDa. Por ejemplo, el peso molecular puede estar entre 100 kDa y 2.000 kDa; entre 100 kDa y 1.750 kDa; entre 100 kDa y 1.500 kDa; entre 100 kDa y 1.250 kDa; entre 100 kDa y 1.000 kDa; entre 100 kDa y 750 kDa; entre 100 kDa y 500 kDa; entre 200 kDa y 4.000 kDa; entre 200 kDa y 3.500 kDa; entre 200 kDa y 3.000 kDa; entre 200 kDa y 2.500 kDa; entre 200 kDa y 2.000 kDa; entre 200 kDa y 2.000 kDa; entre 200 kDa y 1.750 kDa; entre 200 kDa y 1.500 kDa; entre 200 kDa y 1.250 kDa; entre 200 kDa y 1.000 kDa; entre 200 kDa y 750 kDa; o entre 200 kDa y 500 kDa. Detalles y orientaciones adicionales con respecto a los pesos moleculares están disponibles en la U.S. N° de Serie 62/693,978.
El sacárido capsular está opcionalmente modificado químicamente con respecto al sacárido capsular que se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, el sacárido está opcionalmente des-Oacetilado (parcial o totalmente), des-N-acetilado (parcial o totalmente), N-propionado (parcial o totalmente), etc. La desacetilación se produce opcionalmente antes, durante o después de la activación, derivatización o conjugación, pero típicamente se produce antes de la conjugación.
Algunas realizaciones de la invención implican el uso de dos o más conjugados diferentes. En relación con los conjugados de sacárido capsular neumocócico, esto significa (cuando se usa un único tipo de polipéptido portador para cada conjugado) que cada conjugado "diferente" tiene un sacárido de un serotipo neumocócico diferente.
Conjugados multivalentes
Las composiciones farmacéuticas de la invención implican el uso de dos o más conjugados diferentes de acuerdo con las reivindicaciones. Estas realizaciones también se denominan multivalentes. Cuando dos conjugados cualesquiera se describen como "diferentes", o proporcionan valencias diferentes en una composición "multivalente", esto se refiere a una diferencia entre la combinación de polipéptido portador y antígeno en esos dos conjugados. Por ejemplo, cuando un único tipo de CRM197 modificado (por ejemplo, SEQ ID NO: 4) se conjuga con un sacárido capsular de un único serotipo de neumococo, el producto de la reacción contendrá muchos tipos de molécula diferentes (diferentes pesos moleculares, diferentes patrones de enlaces dentro de cada molécula, etc.), pero en la presente se consideran como un único conjugado. Los expertos en la técnica están familiarizados con esta heterogeneidad a nivel molecular y, de manera similar, definen los conjugados individuales de una vacuna por la combinación antígenoportador del conjugado particular, siendo otras propiedades (como el peso molecular) una media dentro de la composición del conjugado. Dos conjugados "diferentes" tienen un polipéptido portador diferente (es decir, tienen una secuencia de aminoácidos diferente) y/o un antígeno diferente (es decir, tienen una estructura antigénica diferente).
Por ejemplo, los antígenos de sacáridos capsulares pueden purificarse a partir de dos serotipos diferentes de neumococo. Estos dos sacáridos capsulares diferentes pueden conjugarse por separado con un polipéptido portador (que puede ser el mismo o diferente) para proporcionar dos conjugados diferentes. Por tanto, en relación con los conjugados de sacáridos capsulares bacterianos, la diferencia entre dos conjugados "diferentes" será típicamente que uno contiene sacárido capsular de un primer serotipo o serogrupo de una especie bacteriana, mientras que el otro contiene sacárido capsular de un segundo serotipo o serogrupo de esa especie bacteriana, por ejemplo, sacáridos capsulares de diferentes serotipos deSpneumoniae,o sacáridos capsulares de diferentes serogrupos deN.meningitidis.Dos conjugados también serían "diferentes" si incluyeran sacáridos capsulares antigénicamente distintos de múltiples especies bacterianas, por ejemplo, un conjugado de sacáridos Hib y un conjugado de sacáridos meningocócicos.
Las composiciones multivalentes preferidas de la invención incluyennconjugados de sacáridos inmunogénicos diferentes, en donde el antígeno de sacárido de cada uno de losnconjugados inmunogénicos es distinto del antígeno de sacárido de los otrosn-1conjugados inmunogénicos. Por ejemplo, si la composición incluye antígenos de una única especie bacteriana, puede haber sacáridos capsulares denserotipos onserogrupos diferentes de esa especie.
Esta nomenclatura en relación con "diferentes" conjugados se usa en el campo de las vacunas conjugadas. Por ejemplo, Glesby et al. (2015) J Infect Dis 212:18-27 menciona que la vacuna Prevnar™ PCV13 contiene '13 conjugados diferentes' porque incluye antígenos de sacáridos de 13 serotipos neumocócicos diferentes, conjugados por separado con CRM197. De manera similar la EP-A-2932979 hace referencia a "una composición inmunogénica que comprende 13 conjugados de polisacárido-proteína diferentes".
Por tanto, la vacuna PCV7 Prevnar™ tiene 7 conjugados diferentes, la vacuna PCV13 Prevnar™ tiene 13 conjugados diferentes, la vacuna Menveo™ tiene 4 conjugados diferentes, la vacuna Menactra™ tiene 4 conjugados diferentes, la vacuna Nimenrix™ tiene 4 conjugados diferentes, la vacuna Menitorix™ tiene 2 conjugados diferentes, la vacuna Menhibrix™ tiene 3 conjugados diferentes, la vacuna Synflorix™ tiene 10 conjugados diferentes, etc.
Las composiciones multivalentes de conjugados neumocócicos incluyen preferiblemente más de 13 conjugados diferentes, por ejemplo 14, 15, 20, 21, 24, 25 o más. Las opciones adecuadas de serotipos para estas composiciones >13-valentes se analizan más arriba.
Con respecto a las vacunas de alta valencia (por ejemplo, con más de 13 conjugados diferentes), a veces puede ser preferible usar más de un polipéptido portador para reducir la posibilidad de supresión del portador (por ejemplo, véase la WO98/51339 y la W o 2011/110241). Por ejemplo, en una vacuna multivalente que comprendenconjugados diferentes, un primer polipéptido portador se conjuga conn-yantígenos diferentes (por ejemplo, los sacáridos capsulares de diferentes serotipos o serogrupos bacterianos) y un segundo polipéptido portador se conjuga con losyantígenos restantes. De manera similar, podrían usarse tres, cuatro o más portadores con los n antígenos divididos entre ellos.
Aminoácidos no naturales
Como se ha mencionado anteriormente, los conjugados usados en la presente incluyen enlaces covalentes entre un antígeno y un grupo funcional dentro de un residuo de nnAA en el polipéptido portador. Las cadenas laterales de los residuos de nnAA pueden proporcionar grupos funcionales reactivos que son útiles para conjugar antígenos a sitios discretos en el polipéptido portador.
En términos generales, el nnAA puede ser cualquier aminoácido que pueda incorporarse en un polipéptido durante la traducción pero que no sea uno de los 20 aminoácidos comunes. Un nnAA puede incorporarse convenientemente a un polipéptido convirtiendo una molécula de ARNt de tal manera que su codón incorpore el nnAA en lugar del aminoácido natural cognado. Una técnica para conseguirlo implica usar un "codón de supresión", es decir, un triplete de nucleótidos que se introduce en una secuencia codificante en una posición deseada y es reconocido por un ARNt específico que puede reconocer un codón de parada natural (por ejemplo, un codón de parada ámbar, ocre u ópalo) pero permite que continúe la traducción, con la incorporación del nnAA (suprimiendo de este modo el codón de parada natural).
El residuo de nnAA puede ser cualquiera de los residuos de nnAA descritos en la presente, o cualquier otro que se haya identificado como compatible con la síntesis de proteínas basada en células o libre de células (véase, por ejemplo, Schultz et al. Annu Rev Biochem. 2010;79:413-44 particularmente las págs. 418-420; y Chin et al. Annu Rev Biochem. 2014;83:5.1-5.30). Lo ideal es que el nnAA no sea uno que surja de manera natural dentro de una célula por la modificación de uno de los 20 aminoácidos comunes (por ejemplo, pirolisina, selenocisteína, fosfotirosina, formilmetionina, etc.).
Los nnAA particularmente preferidos para su uso en la presente son aquellos que pueden incorporarse durante la traducción (en un sistema celular o libre de células) con una cadena lateral que proporciona un grupo funcional que no se encuentra en la cadena lateral de ninguno de los 20 aminoácidos de origen natural. Se conocen varias técnicas para incorporar tales aminoácidos en polipéptidos, por ejemplo, véase Young & Schultz (2010) J Biol Chem 285:11039-44, Maza et al. (2015) Bioconjugate Chem. 26:1884-9, y Zimmerman et al. (2014) Bioconjugate Chem. 25:351-61. La WO2018/126229 divulga en detalle cómo pueden incorporarse residuos de nnAA en polipéptidos portadores, por ejemplo, usando mezclas de expresión libres de células, pares de ARNt/aminoacil-ARNt sintetasa ortogonales específicos para el nnAA, codones de supresión,etc.Véase también la solicitud de patente de Estados Unidos US-2017/0267637.
El nnAA puede incluir un grupo químico adecuado para la reacción química "clic" con un grupo correspondiente en un antígeno de interés. Los grupos químicos adecuados para la química "clic" incluyen, pero no se limitan a azido (-N<3>), alquino (-C=C-), alqueno (-C=C-) y 1,2,4,5-tetrazina.
y grupos fosfina (por ejemplo, -P(Ph)<2>).
El nnAA puede ser cualquiera de los siguientes: ácido 2-amino-3-(4-azidofenil)propanoico (para-azido-L-fenilalanina o pAF), ácido 2-amino-3-(4-(azidometil)fenil)propanoico (para-azidometil-L-fenilalanina o pAMF), ácido 2-amino-3-(5-(azidometil)piridin-2-il)propanoico, ácido 2-amino-3-(4-(azidometil)piridin-2-il)propanoico, ácido 2-amino-3-(6-(azidometil)piridin-3-il)propanoico o ácido 2-amino-5-azidopentanoico.
El nnAA más preferido para su uso en la presente es el pAMF:
el pAMF proporciona una cinética de reacción muy favorable para la producción de conjugados (por ejemplo, mucho más rápida que el uso de pAF al reaccionar con un antígeno de carbohidrato que contiene alquinos en un método SPAAC).
El nnAA puede ser un ácido propanoico 2,3-disustituido que contenga: un sustituyente amino en la posición 2; y un sustituyente que contenga azido, un sustituyente que contenga 1,2,4,5-tetrazinilo, o un sustituyente que contenga etilo en la posición 3. Preferiblemente, un sustituyente en la posición 3 es un sustituyente que contenga azido, en particular un grupo azido terminal unido a un átomo de carbono en la posición 3 mediante un grupo de enlace. Preferiblemente, el sustituyente en la posición 3 es un sustituyente que contiene azido, en particular un sustituyente que contiene azido que comprende un grupo azido terminal unido al átomo de carbono en la posición 3 a través de un grupo de enlace. Por ejemplo, el grupo de enlace puede comprender una fracción de arileno opcionalmente sustituida y opcionalmente que contenga heteroátomos. Por ejemplo, el grupo de enlace puede comprender una fracción de arileno de 5 o 6 miembros que contenga de 0 a 4 heteroátomos y de 0 a 4 sustituyentes de anillo no de hidrógeno.
El nnAA puede tener la estructura de la fórmula XII:
W6
( W ^ Q l
O Ar
HO-V
^ H2 ( X I I )
en donde: Ar comprende un anillo aromático de 5 o 6 miembros que contiene opcionalmente por lo menos un heteroátomo; W5 se selecciona de alquileno C1-C10, -NH-, -O- y -S-; Q1 es cero o 1; y W6 se selecciona de azido, 1,2,4,5-tetrazinilo opcionalmente C-sustituido con un grupo alquilo inferior, y etinilo. En algunas realizaciones, Ar no contiene ningún heteroátomo, en cuyo caso el conector preferido es un grupo fenileno no sustituido (es decir, Ar es -C6H4-). En otras realizaciones, Ar contiene un heteroátomo de nitrógeno y por lo menos un heteroátomo adicional seleccionado entre N, O y S. Los heterociclos de nitrógeno ejemplares se describen infra y Ar puede ser, por ejemplo, una piridina o una piridazina. En una realización particularmente preferida, Q1 es 1, W5 es alquileno inferior y W6 es azido.
El nnAA puede ser un nnAA que contenga azido, como un nnAA de fórmula I:
en donde: D es -Ar-W3- o -W1-Y1-C(O)-Y2-W2-;cada uno de W1, W2 y W3 es independientemente un enlace sencillo o un alquileno inferior; cada X<1>es independientemente -NH-, -O- o -S-; cada Y1 es independientemente un enlace sencillo, -NH- o -O-; cada Y2 es independientemente un enlace sencillo, -NH-, -O- o un pirrolidinileno N-enlazado o C-enlazado; Ar es
y uno de Zi, Z2, y Z3 es -N- y los otros de Z1, Z2, y Z3 son independientemente -CH-.
En otras realizaciones, el nnAA tiene la fórmula II:
en donde W4 es alquileno C1-C10.
La preparación de aminoácidos que contienen azido de acuerdo con las fórmulas I y II se encuentra, por ejemplo, en Stafford et al. US2014-0066598A1, en particular los párrafos [0331]-[0333]. El proceso implica la sustitución de grupos hidroxilo por cloruro en derivados de los aminoácidos de arilo correspondientes usando cloruro de tionilo, seguido de desplazamiento nucleófilo del cloruro con azida. También se adquieren comercialmente aminoácidos adecuados que contienen cadenas laterales de arilo.
El nnAA puede ser un nnAA que contenga 1,2,4,5-tetrazina. Por ejemplo, la fórmula III:
V es un enlace sencillo, un alquileno inferior o -W1-W2-; uno de W1 y W2 está ausente o es un alquileno inferior, y el otro es -NH-, -O- o -S-; cada uno de Z1, Z2 y Z3 es independientemente -CH- o -N-; y X1 es independientemente -NH-, -O- o -S-; y R es un alquilo inferior.
La preparación de aminoácidos que contienen 1,2,4,5-tetrazina de acuerdo con la fórmula III se encuentra, por ejemplo, en Yang et al. US2016/0251336, en particular en los párrafos [0341]-[0377]. El proceso implica el acoplamiento de Negishi de un derivado protegido con amino/carboxilo del ácido (R)-2-amino-3-iodopropanoico con un bromuro de aminopiridilo para introducir Ar, seguido de reacción con un derivado de metiltio-1,2,4,5-tetrazina para introducir la fracción detetrazina en el aminoácido.
El nnAA puede ser un nnAA que contenga alquino. En una realización, este es un grupo propargilo. Una variedad de aminoácidos que contienen propargilo, incluyendo la síntesis de los mismos, se encuentran en Beatty et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 7364-7; Beatty et al. J. Am. Chem. Soc. 2005(127): 14150-1; Nguyen et al. JACS 2009 (131):8720-1. Dichos aminoácidos que contienen propargilo son adecuados para su incorporación en proteínas usando sistemas basados en células. En algunas realizaciones, el nnAA que contiene propargilo se selecciona del grupo que consiste en homopropargilglicina, etilfenilalanina y N6-[(2-propiniloxi)carbonil]-L-lisina.
Los nnAA usados en la presente son generalmente a-aminoácidos con un centro quiral en el a-carbono, y son preferiblemente L-estereoisómeros.
Un polipéptido portador usado con la invención incluye residuos de nnAA sustituidos por K33, K212, K244, K264, K385 y<k>526 en la SEQ ID NO: 1. Se prefieren polipéptidos portadores con menos de 10 residuos de nnAA.
Se prefiere incluir una única especie de nnAA en el polipéptido portador (por ejemplo, el único nnAA en el portador es el pAMF). Esto permite usar simultáneamente la misma química de conjugación en cada nnAA. Si se desea unir dos antígenos diferentes a una única molécula portadora, esto puede lograrse usando diferentes especies de nnAA dentro de un único portador y conjugando cada antígeno con un nnAA diferente, pero se prefiere la conjugación con una única especie de nnAA en un portador. Además, cuando se usan múltiples conjugados diferentes (por ejemplo, diferentes serotipos de neumococo), a veces se prefiere que cada conjugado incluya la misma especie única de nnAA. Además, cuando una composición incluye múltiples conjugados diferentes (por ejemplo, diferentes serotipos de neumococo), a veces se prefiere que cada conjugado incluya el mismo polipéptido portador.
Un nnAA puede incorporarse en un polipéptido portador por sustitución o por inserción (o por extensión C-terminal o N-terminal). Convenientemente, el nnAA puede sustituirse por un residuo de lisina en el polipéptido nativo. Por ejemplo, en CRM197 la sustitución puede producirse en una o más de las posiciones K24, K33,<k>37, K39, K212, K214, K227, K244, K264, K385, K522 y K526 en la SEQ ID NO: 1 o 2. Los polipéptidos portadores reivindicados comprenden un nnAA (por ejemplo, pAMF) sustituido en cada una de las posiciones K33,<k>212, K244, K264, K385 y K526 (y en una realización en ninguna otra posición).
los nnAA dentro de un polipéptido portador son idealmente residuos accesibles en superficie. Esto puede evaluarse usando una estructura 3D del polipéptido, o realizando una sustitución exhaustiva de aminoácidos naturales por nnAA seguido de pruebas de conjugación, para evaluar la utilidad de cada sitio.
Para conservar la función de un polipéptido portador se prefiere no incorporar un nnAA dentro de un epítopo activador de células T del polipéptido portador. El uso de nnAA permite la colocación selectiva de sitios para la conjugación y así pueden evitarse los epítopos activadores de células T de un polipéptido portador como sitios para la conjugación de antígenos. Como ya se ha mencionado, estos epítopos pueden identificarse fácilmente. Por ejemplo, los estudios sobre CRM197 realizados por Raju et al., Bixler et al., Leonard et al. y Pillai et al. (por ejemplo, Eur J Immunol. 1995 Dec;25(12):3207-14, WO89/06974) han identificado varios epítopos de células T, por ejemplo en los residuos P271-D290, V321-G383 y Q411-1457. Por lo tanto, se prefiere evitar la introducción de nnAA en estas regiones de la SEQ ID NO: 1.
Conjugación
La conjugación implica la formación de un enlace covalente entre el residuo de nnAA y el antígeno. Esto requiere un grupo funcional reactivo tanto en el nnAA como en el antígeno. Un nnAA para el polipéptido portador se elegirá generalmente porque ya tiene un grupo funcional adecuado (por ejemplo, el grupo azido de pAMF), pero los antígenos a menudo no contienen intrínsecamente grupos funcionales que sean adecuados o ideales para la conjugación. Por lo tanto, podría ser necesario funcionalizar un antígeno antes de su conjugación con el nnAA.
Información técnica detallada sobre la conjugación puede encontrarse en Bioconjugate Techniques (Greg T Hermanson, 3.a edición, 2013). La WO2018/126229 divulga en detalle cómo pueden funcionalizarse los antígenos y luego conjugarse con nnAA. Como se ha indicado anteriormente, los nnAA útiles incluyen un grupo funcional (por ejemplo, un grupo azido) que es adecuado para una reacción química de "clic" con un grupo funcional en el antígeno. Por tanto, lo ideal es que un antígeno funcionalizado incluya un grupo adecuado para tales reacciones de "clic".
En términos generales, la conjugación tiene lugar mediante un proceso que implica 3 pasos: (a) activación del antígeno; (b) derivatización opcional del antígeno activado (por ejemplo, con un conector o grupo nucleófilo) para introducir un grupo funcional reactivo que normalmente no está presente en el antígeno; y (c) conjugación del antígeno con el polipéptido portador a través de un grupo introducido en el paso (a) o, si está presente, en el paso (b). En algunas realizaciones, el paso (a) incluye un primer paso de eliminación de un grupo bloqueante en el antígeno, de tal manera que ciertos grupos funcionales (por ejemplo, hidroxilos, aminas, tioles) sean más accesibles para la activación. Aveces, los pasos (a)-(c) pueden producirse esencialmente de manera simultánea (por ejemplo, cuando se añade al antígeno una fracción reactiva como la N-hidroxisuccinimida), pero en otras realizaciones dos o más de los pasos (a)-(c) son discretos, con purificación opcional entre los pasos.
Como se ha indicado anteriormente, se prefieren los conjugados reticulados, por lo que también se prefiere introducir múltiples grupos funcionales reactivos por molécula de antígeno. Por ejemplo, pueden introducirse múltiples grupos éster de aldehído o cianato cuando se activa una molécula de sacárido. Estos grupos pueden derivatizarse, por ejemplo, para introducir un ciclooctano reactivo que puede reaccionar con grupos azido en el nnAA.
Un antígeno puede activarse usando varias químicas, incluyendo pero no limitadas a: oxidación con peryodato (por ejemplo para oxidar grupos hidroxilo en átomos de carbono adyacentes para dar grupos aldehído reactivos), por ejemplo como se describe en la WO2011/110531; cianilación por ejemplo usando 1-ciano-4-dimetilamino piridinio tetrafluoroborato (CDAP); activación con hidroxilo con 1,1-carbonildiimidazol (CDI) seguido de adición nucleófila; o desenmascaramiento de un aldehido intrínseco (por ejemplo, un extremo reductor de un sacárido).
La oxidación con peryodato y la cianilación con CDAP son dos técnicas de activación preferidas. Se ha demostrado que la oxidación con peryodato es útil para activar, entre otros, los serotipos neumocócicos 1, 2, 3, 7F, 8, 9N y 11A. La cianilación CDAP ha demostrado ser útil para activar, entre otros, los serotipos neumocócicos 3, 7F y 10A.
El antígeno activado puede conjugarse con un nnAA directamente, pero habitualmente el grupo activado se derivatiza para introducir un grupo funcional que muestre una mejor reactividad hacia el grupo funcional del nnAA. Por ejemplo, puede introducirse un grupo alquinilo. Un reactivo bifuncional con un grupo amino y un grupo alquino pueden reaccionar con un grupo aldehído que se ha introducido en un antígeno (por ejemplo, mediante aminación reductora), dejando de este modo un alquino colgante que puede reaccionar con un nnAA. Por ejemplo, pueden usarse reactivos bifuncionales que incluyan grupos funcionales amino y DBCO.
En una realización, el nnAA reacciona con un grupo alquilo en el antígeno (por ejemplo, un grupo propargilo). Un grupo alquino en un antígeno es ideal para reaccionar con un grupo azido en un nnAA, por ejemplo, usando las reacciones conocidas en la técnica como cicloadición azida-alquino catalizada por cobre (CuAAC), cicloadición azidaalquino catalizada por rutenio (RuAAC) o cicloadición azida-alquino 1,3-dipolar de Huisgen. El grupo alquinilo puede tener un contexto molecular que aumente su reactividad, por ejemplo, puede estar dentro de un anillo. Por ejemplo, el alquileno puede estar dentro de un anillo de ciclooctano (que opcionalmente incluye un heteroátomo), como un anillo de ciclooctano con tensión diarílica (por ejemplo, DBCO). Esta reacción puede ser una cicloadición [3+2] conocida en la técnica como cicloadición azida-alquino promovida por deformación (SPAAC). Para estas reacciones se dispone fácilmente de reactivos basados en DIFO y DBCO.
Los anillos que contienen alquinos útiles en las reacciones SPAAC incluyen el ciclooctano difluorado (DIFO) y dibenzociclooctinas. Estos están disponibles con grupos funcionales colgantes para enlazar con antígenos activados (por ejemplo, con un amino colgante para enlazar con un aldehído o un éster de cianato), por ejemplo usando cualquiera de los siguientes reactivos:
DBCO-PEGn-NH<2>
DBCO-PEGn-NH<2>
Ácidos carboxílicos DBCO
DBCO-NH<2>
Ácido carboxílico DIFO
El valor de "n" en "PEGn" representa el número de unidades de repetición de oxietileno. El valor de n se encuentra en el intervalo de 1-20, por ejemplo, entre 2-18, 3-16 o 4-14. Por tanto, n puede ser, por ejemplo, cualquiera de 4, 5, 11, 12 o 13.
Otras reacciones de química de clic que pueden usarse para la conjugación de un antígeno y un nnAA incluyen, pero no se limitan a, la ligación tetrazina-alqueno y la ligación de Staudinger entre una fosfina y una azida.
Un conjugado de la invención puede tener un peso molecular de por lo menos aproximadamente 750 kDa, por lo menos aproximadamente 1.000 kDa, o por lo menos aproximadamente 1.500 kDa, o más. En algunas realizaciones, el conjugado tiene un peso molecular de entre aproximadamente 750 kDa y aproximadamente 5.000 kDa. En algunas realizaciones, el conjugado tiene un peso molecular de entre aproximadamente 800 kDa y aproximadamente 2.800 kDa. En algunas realizaciones, el conjugado tiene un peso molecular de entre aproximadamente 850 kDa y aproximadamente 2.800 kDa. En algunas realizaciones, el conjugado tiene un peso molecular de entre aproximadamente 900 kDa y aproximadamente 2.800 kDa. En algunas realizaciones, el conjugado tiene un peso molecular de entre aproximadamente 950 kDa y aproximadamente 2.800 kDa. En algunas realizaciones, el conjugado tiene un peso molecular de entre aproximadamente 1.000 kDa y aproximadamente 2.800 kDa. El peso molecular de un conjugado se calcula mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) combinada con dispersión de luz láser multiángulo (MALS).
Los conjugados de la invención incluyen antígeno (por ejemplo, sacárido) y polipéptido portador, y la relación de peso de estos dos componentes puede usarse como parámetro para definir el conjugado. Las relaciones en peso de antígeno:portador más elevadas para los conjugados sacárido-portador permiten administrar más antígeno de sacárido con una menor cantidad de polipéptido portador. En el caso de las vacunas conjugadas antineumocócicas, la relación se encuentra típicamente en el intervalo de 0,3-3,0, pero puede variar con el serotipo y aspectos de la química de conjugación (Anexo 2: Recomendaciones para la producción y el control de vacunas conjugadas antineumocócicas; Serie de Informes Técnicos de la OMS, N° 927, 2005). La relación de la vacuna comercial Prevnar-13™ es de 0,9. Para las composiciones que incluyen conjugados de múltiples serotipos neumocócicos (por ejemplo, más de 13 serotipos), la relación para la composición completa es idealmente de más de 1,0 (es decir, un exceso de peso de antígeno de sacárido neumocócico) y es preferiblemente de 1,5 o más (por ejemplo, dentro del intervalo de 1,5-3,0, o preferiblemente 1,5-2,0).
Polipéptidos portadores CRM197 modificados
Como se ha mencionado anteriormente, los polipéptidos portadores de interés principal en la presente son formas modificadas de CRM197. Los polipéptidos portadores reivindicados comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia (por ejemplo, >95%, >96%, >97%, o preferiblemente >98%) con la SEQ ID NO: 1.
La SEQ ID NO: 1 incluye una secuencia dipeptídica Arg-Arg en las posiciones 192-193. En algunas circunstancias esta secuencia puede ser objeto de escisión proteolítica. Este sitio puede modificarse para evitar la escisión y mejorar el rendimiento. El polipéptido portador CRM197 modificado reivindicado está libre de una secuencia dipeptídica Arg-Arg. Por ejemplo, Arg-192 y/o Arg-193 de la SEQ ID NO: 1 pueden suprimirse o sustituirse por un aminoácido diferente. El polipéptido portador reivindicado comprende una secuencia de aminoácidos que (i) tiene por lo menos un 90% (por ejemplo >95%, >96%, >97%, o preferiblemente >98%) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1; (ii) está libre de una secuencia dipeptídica Arg-Arg; y (iii) comprende residuos de nnAA sustituidos por K33, K212, K244, K264, K385, y K526 en la SEQ ID NO: 1.
La SEQ ID NO: 2 difiere de la SEQ ID NO: 1 por tener una sustitución Arg^-Asn en la posición 193:
GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNE NPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPF AEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRNSVGSSLSCINLDWDVIR DKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAA WAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGEL VDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKI TAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVA FHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS
Por tanto, proporcionamos un polipéptido portador que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, en donde la SEQ ID NO: 2 se ha modificado para que incluya residuos de nnAA sustituidos por K33, K212, K244, K264, K385 y K526 (por ejemplo, SEQ ID NO: 4). El residuo Asn-193 de la SEQ ID NO: 2 preferiblemente no está sustituido por un nnAA. Este polipéptido portador puede usarse para preparar conjugados inmunogénicos (por ejemplo, de antígenos de sacáridos) a través del residuo o residuos de nnAA en el mismo.
En algunas realizaciones, estos polipéptidos portadores incluyen secuencias de aminoácidos en sentido ascendente y/o en sentido descendente de la SEQ ID NO: 1 o 2. Por tanto, por ejemplo, pueden incluir un residuo de metionina en sentido ascendente del residuo de aminoácido N-terminal de la SEQ ID NO: 1 o 2. Así, por ejemplo, pueden incluir un residuo de metionina en sentido ascendente del residuo de aminoácido N-terminal de la SEQ ID NO: 1 o 2. Este residuo de metionina puede estar formilado. Un residuo de metionina no está presente en esta posición en CRM197 de tipo salvaje, pero puede incluirse en la presente para iniciar la traducción (por ejemplo, en un sistema de síntesis de polipéptidos libre de células) sin requerir la secuencia líder nativa completa. En algunas realizaciones, un polipéptido portador incluye (i) ningún aminoácido en sentido ascendente del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 1 o 2, excepto una metionina opcional, y (ii) ningún aminoácido en sentido descendente del extremo C-terminal de la SEQ ID NO: 1 o 2.
Preferiblemente, sólo se sustituye una especie de residuo en la SEQ ID NO:1 por un nnAA, es decir, sólo se sustituyen residuos de Lys. Se prefiere que se use el mismo nnAA en cada posición de sustitución, por ejemplo, pAMF en cada posición de sustitución.
En la presente se describen, pero no se reivindican, polipéptidos portadores que comprenden la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o 2 con de 2 a 9 sustituciones por residuos de nnAA (por ejemplo, sustituciones Lys^nnAA, preferiblemente Lys^pAMF), por ejemplo, con de 2-8, 2-6, 3-8, 3-6, 4-9, 4-8, o 4-6 sustituciones de nnAA, por ejemplo, 4, 5 o 6 residuos de nnAA. Esto permite una unión más extensa de los antígenos al portador que el uso de un único nnAA, aumentando de este modo la relación antígeno: portador, a la vez que se evita una alteración excesiva de la secuencia y estructura nativas, que puede dar como resultado insolubilidad.
Los estudios estructurales de CRM197 revelan dos regiones 3D generales dentro de la SEQ ID NO: 1 o 2: la primera región va desde el extremo N-terminal hasta Asn-373; y la segunda región va desde Ser-374 hasta el extremo C-terminal. La primera de ellas corresponde aproximadamente a los dominios conocidos como "C" y "T" (catalítico y transmembrana), y la segunda al dominio "R" (unión al receptor). En la presente se describe, pero no se reivindica, un polipéptido portador que incluye por lo menos un nnAA en la primera región y por lo menos un nnAA en la segunda región, por ejemplo, por lo menos 2 nnAA en cada región, o por lo menos 3 nnAA en cada región. Esto permite que los antígenos conjugados se separen espacialmente cuando se unen al portador. También se describe en la presente, pero no se reivindica, un portador con 3 nnAA en la primera región y 3 nnAA en la segunda región.
La primera región contiene 27 residuos de Lys, y la segunda región contiene 12 residuos de Lys. Por lo tanto, en la presente se describen pero no se reivindican polipéptidos portadores en los que uno o más (por ejemplo, 3) residuos de Lys dentro de los 374 aminoácidos N-terminales y uno o más (por ejemplo, 3) residuos de Lys dentro de los 162 aminoácidos C-terminales de la SEQ ID NO: 1 o 2 se sustituyen con un nnAA, por ejemplo, dentro de pAMF.
También se describen en la presente, pero no se reivindican, portadores que contienen nnAA basados en CRM197 que tienen la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2 en la que uno o más de los residuos K24, K33, K37, K39, K212, K214, K227, K264, K385, K522 y K526 se sustituyen por un nnAA (como pAMF). Una de estas secuencias es la SEQ ID NO:3, en la que cada X representa un nnAA (preferiblemente el mismo nnAA, como pAMF):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQXGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLP FAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVI RDXTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAXQYLEEFHQTALEHPELSELXTVTGTNPVFAGANYA AWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGE LVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHXTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIK ITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHV AFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSXLSLFFEIKS(SEQ ID NO: 3)
El polipéptido portador de acuerdo con las reivindicaciones puede tener la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, en la que cada X representa un nnAA (preferiblemente el mismo nnAA, como pAMF):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQXGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLP FAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRNSVGSSLSCINLDWDVI RDXTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAXQYLEEFHQTALEHPELSELXTVTGTNPVFAGANYA AWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGE LVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHXTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIK ITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHV AFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSXLSLFFEIKS(SEQ ID NO: 4)
Las SEQ ID NO: 3 y 4 pueden estar muy bien expresadas en un sistema de síntesis de proteínas libre de células, a la vez que retienen una buena solubilidad y proporcionan buenas respuestas inmunogénicas cuando se conjugan con sacáridos capsulares neumocócicos. La SEQ ID NO: 4 carece del dipéptido Arg-Arg nativo.
Un polipéptido que consiste en la SEQ ID NO: 4, en el que cada X es pAMF, es otro polipéptido portador preferido para su uso con la invención.
La WO2018/126229 describe varios residuos de aminoácidos que son adecuados para la sustitución de nnAA (por ejemplo Lys-24, Lys-33, Lys-37, Lys-39, Lys-212, Lys-214, Lys-227, Lys-244, Lys-264, Lys-385, Lys-522, Lys-526, Phe-12, Phe-53, Phe-123, Phe-127, Phe-140, Phe-167, Phe-250, Phe-389, Phe-530, o Phe-531, numerados dea cuerdo con la SEQ ID NO: 1 en la presente). Otros residuos que pueden sustituirse son: Asp-211; Asp-295; Asp-352; Asp-392; Asp-465; Asp-467; Asp-507; Asp-519; Asn-296; Asn-359; Asn-399; Asn-481; Asn-486; Asn-502; Asn-524; Glu-240; Glu-248; Glu-249; Glu-256; Glu-259; Glu-292; Glu-362; Gln-252; Gln-287; Lys-212; Lys-218; Lys-221; Lys-229; Lys-236; Lys-264; Lys-299; Lys-385; Lys-456; Lys-474; Lys-498; Lys-516; Lys-522; Lys-534; Arg-377; Arg-407; Arg-455; Arg-460; Arg-462; Arg-472; Arg-493; Ser-198; Ser-200; Ser-231; Ser-233; Ser-239; Ser-261; Ser-374; Ser-381; Ser-297; Ser-397; Ser-451; Ser-475; Ser-494; Ser-495; Ser-496; Ser-501; Ser-505; Thr-253; Thr-265; Thr-267; Thr-269; Thr-293; Thr-386; Thr-400; Thr-408; Thr-469; y/o Thr-517. Los polipéptidos portadores reivindicados comprenden residuos de nnAA sustituidos por K33, K212, K244, K264, K385, y K526 en la Se Q ID NO:1.
También proporcionamos un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que (i) tiene por lo menos un 90% (por ejemplo, >95%, >96%, >97%, o preferiblemente >98%) de identidad de secuencia con la<s>E<q>ID NO: 1; (ii) está libre de una secuencia dipeptídica Arg-Arg; y (iii) comprende residuos de nnAA sustituidos por K33, K212 , K244, K264, K385, y K526 en la S<e>Q ID NO:1 ; y en donde el polipéptido tiene una metionina N-terminal y/o está en forma monomérica.
Estos polipéptidos portadores derivados de CRM197 pueden usarse de la misma manera para la conjugación en la que se ha usado CRM197 en el estado de la técnica (por ejemplo, véase Brokeret al.2011supra,WO2015/117093, etc.), pero con la mejora de permitir la conjugación específica del sitio a través del residuo o residuos de nnAA. Generalmente se usarán en forma monomérica, en lugar de asociarse con otras subunidades de CRM197 o derivadas de CRM197 para formar multímeros polipeptídicos. De manera similar, generalmente incluirán por lo menos un puente disulfuro, por ejemplo entre Cys-186 y Cys-201 (numerados de acuerdo con la SEQ ID NO: 1) y, opcionalmente, entre Cys-461 y Cys-471.
También proporcionamos un conjugado inmunogénico que comprende cualquiera de los polipéptidos portadores reivindicados conjugado a través de residuos de nnAA en el mismo con un antígeno de sacárido. Los polipéptidos portadores son particularmente útiles para conjugarse con sacáridos capsulares neumocócicos a través de resido o residuos de nnAA en los mismos. Los conjugados inmunogénicos preparados de esta manera pueden combinarse para formar composiciones multivalentes como se analiza en otras partes del presente documento.
Por tanto, proporcionamos un conjugado inmunogénico que comprende un polipéptido portador y un antígeno de sacárido, en donde (i) el polipéptido portador tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, por ejemplo, donde cada X es pAMF; y (ii) el antígeno de sacárido está unido covalentemente al polipéptido portador a través de por lo menos un residuo de nnAA dentro de la SEQ ID NO: 4. También proporcionamos una composición farmacéutica multivalente que comprende dos o muchos de tales conjugados inmunogénicos.
Por tanto, proporcionamos una composición farmacéutica que incluye múltiples conjugados diferentes (por ejemplo, diferentes serotipos de neumococo) en los que cada conjugado incluye un polipéptido portador que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4.
También proporcionamos un conjugado inmunogénico que comprende un polipéptido portador y un antígeno de sacárido, en donde (i) el polipéptido portador tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4; (ii) el antígeno de sacárido está unido covalentemente al polipéptido portador a través de por lo menos un residuo de nnAA dentro de la SEQ ID NO: 4; y (iii) el antígeno de sacárido es un sacárido capsular de cualquiera de los serotipos neumocócicos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F. Estos conjugados individuales pueden combinarse para hacer composiciones farmacéuticas multivalentes de la invención.
Adyuvantes
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir un adyuvante de sal de aluminio. El adyuvante puede mejorar la inmunogenicidad de los conjugados dentro de la composición farmacéutica. Los conjugados dentro de la composición pueden adsorberse en el adyuvante de sal de aluminio.
Los adyuvantes de sal de aluminio útiles incluyen, entre otros, los adyuvantes de hidróxido de aluminio y los adyuvantes de fosfato de aluminio. Estos adyuvantes se describen, por ejemplo, en los capítulos 8 y 9 de Vaccine Design... (1995) eds. Powell & Newman. ISb N: 030644867X. Plenum.
Los adyuvantes comúnmente conocidos como "hidróxido de aluminio" son típicamente sales de oxihidróxido de aluminio, que habitualmente son por lo menos parcialmente cristalinas. El oxihidróxido de aluminio, que puede representarse por la fórmula AlO(OH), puede distinguirse de otros compuestos de aluminio, como Al(OH)3, por espectroscopia infrarroja (IR), en particular por la presencia de una banda de adsorción a 1070cm-1 y un fuerte hombro a 3090-3100cirr1 (capítulo 9 de Powell & Newman). El grado de cristalinidad de un adyuvante de hidróxido de aluminio se refleja en la anchura de la banda de difracción a media altura (WHH), mostrando las partículas poco cristalinas un mayor ensanchamiento de la línea debido al menor tamaño de las cristalitas. El área superficial aumenta a medida que aumenta la WHH, y se ha observado que los adyuvantes con valores de WHH más altos tienen mayor capacidad de adsorción de antígenos. Los adyuvantes de hidróxido de aluminio presentan una morfología fibrosa (como se observa en las micrografías electrónicas de transmisión), por ejemplo, con partículas en forma de aguja de aproximadamente 2 nm de diámetro. El pI de los adyuvantes de hidróxido de aluminio suele ser de aproximadamente 11, es decir, el adyuvante tiene una carga superficial positiva a pH fisiológico. Se han registrado capacidades de adsorción de adyuvantes de hidróxido de aluminio de entre 1,8-2,6 mg de proteína por mg de Al+++ a pH 7,4.
Los adyuvantes comúnmente conocidos como "fosfato de aluminio" son típicamente hidroxifosfatos de aluminio, que a menudo también contienen una pequeña cantidad de sulfato (es decir, hidroxifosfato sulfato de aluminio). Pueden obtenerse por precipitación, y las condiciones de reacción y las concentraciones durante la precipitación influyen en el grado de sustitución del fosfato por el hidroxilo en la sal. Los hidroxifosfatos tienen generalmente una relación molar de PO^Al entre 0,3 y 1,2. Los hidroxifosfatos pueden distinguirse del AlPO4 estricto por la presencia de grupos hidroxilo. Por ejemplo, una banda del espectro IR a 3164cm-1 (por ejemplo, cuando se calienta a 200°C) indica la presencia de hidroxilos estructurales (capítulo 9 de Powell & Newman).
La relación molar de PO4/Al3+ de un adyuvante de fosfato de aluminio estará generalmente entre 0,3 y 1,2, preferiblemente entre 0,8 y 1,2, y más preferiblemente de 0,95+0,1. El fosfato de aluminio será generalmente amorfo, en particular para las sales de hidroxifosfato. Un adyuvante típico es el hidroxifosfato de aluminio amorfo con una relación molar PO4/Al entre 0,84 y 0,92, incluido a 0,6mg Al3+/ml. El fosfato de aluminio será generalmente particulado (por ejemplo, morfología en forma de placa como se ve en las micrografías electrónicas de transmisión, con partículas primarias en el intervalo de 50nm). Los diámetros típicos de las partículas están en el intervalo de 0,5-20|jm(porejemplo, aproximadamente 5-10jm) después de cualquier adsorción de antígeno. Se ha informado de capacidades de adsorción de entre 0,7-1,5 mg de proteína por mg de Al+++ a pH 7,4 para adyuvantes de fosfato de aluminio.
El punto de carga cero (PZC) del fosfato de aluminio está inversamente relacionado con el grado de sustitución del fosfato por el hidroxilo, y este grado de sustitución puede variar dependiendo de las condiciones de reacción y de la concentración de reactivos usados para preparar la sal por precipitación. La PZC también se altera cambiando la concentración de iones fosfato libres en la solución (más fosfato = PZC más ácido) o añadiendo un tampón, como un tampón de histidina (hace que el PZC sea más básico). Los fosfatos de aluminio usados de acuerdo con la invención tendrán generalmente un PZC de entre 4,0 y 7,0, más preferiblemente de entre 5,0 y 6,5, por ejemplo aproximadamente 5,7.
La concentración de iones de aluminio en una composición para administración a un paciente es preferiblemente menor de 2,5mg/ml, por ejemplo <2 mg/ml, <1 mg/ml, etc. Una concentración máxima preferida es <1,7mg/ml. El intervalo de Al+++ en una composición de la invención puede ser de 0,3-1mg/ml o de 0,3-0,5mg/ml. Se prefiere un máximo de 0,85mg/dosis.
En solución, tanto los adyuvantes de fosfato de aluminio como los de hidróxido de aluminio tienden a formar agregados porosos estables de 1-10|jm de diámetro. Una composición puede incluir una mezcla tanto de un adyuvante de hidróxido de aluminio como de un adyuvante de fosfato de aluminio.
Cuando una composición incluye múltiples conjugados y cada uno de ellos se adsorbe a un adyuvante de sal de aluminio, cada conjugado puede adsorberse a una sal de aluminio individualmente y luego mezclarse, o cada uno de ellos puede añadirse en secuencia a una sal de aluminio, formando de este modo la composición conjugada mezclada. También puede usarse una mezcla de ambos enfoques.
Excipientes para composiciones farmacéuticas
Las composiciones farmacéuticas de la invención generalmente incluyen uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Un análisis exhaustivo de dichos excipientes puede encontrarse en Handbook of Pharmaceutical Excipients (ed. Rowe et al.), 6a edición 2009.
Las composiciones farmacéuticas se presentan preferiblemente en forma acuosa, en particular en el punto de administración, pero también pueden presentarse en formas secas (por ejemplo, como liofilizados, etc.) que pueden convertirse en formas acuosas para su administración.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir un tampón o agente de ajuste del pH. El tampón puede seleccionarse del grupo que consiste en un tampón de fosfato, un tampón de acetato, un tampón de histidina, un tampón de citrato, un tampón de succinato, un tampón de Tris, un tampón de HEPES, etc. Las sales tampón se incluirán típicamente en el intervalo de 5-20mM.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir una sal fisiológica, como una sal de sodio, por ejemplo, para controlar la tonicidad. Es típico el cloruro de sodio (NaCl), que puede estar presente de 1-20 mg/ml, por ejemplo 10±2 mg/ml o 9 mg/ml. Otras sales que pueden estar presentes son el cloruro potásico, el dihidrógeno fosfato potásico, el fosfato disódico deshidratado, el cloruro magnésico, el cloruro cálcico, etc. Otras sales útiles pueden tener cationes de sodio, potasio o amonio y aniones de cloruro, citrato, ascorbato, borato, fosfato, bicarbonato, sulfato, tiosulfato o bisulfito.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir un ácido orgánico, como el ácido acético o el ácido succínico. Esto puede formar parte de un sistema tampón.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir un alcohol de azúcar como manitol o sorbitol. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir un azúcar como la sacarosa o la glucosa.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir un surfactante. Los surfactantes adecuados incluyen, entre otros, polisorbato 20, polisorbato 80 y dodecil sulfato sódico (SDS). En algunas realizaciones, el agente tensioactivo está presente a una concentración comprendida entre el 0,0003% y el 0,3% (p/p), por ejemplo, del 0,01%-0,03%. El polisorbato 80 es un surfactante preferido.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir un conservante como el tiomersal o el 2-fenoxietanol. Se prefiere que una composición esté sustancialmente libre de (por ejemplo, <10 jg/m l) material mercurial, por ejemplo, libre de tiomersal. Se prefieren las composiciones que no contienen mercurio. La inclusión de un conservante puede ser particularmente útil cuando una composición incluye un adyuvante de sal de aluminio porque su insolubilidad significa que la composición es generalmente una suspensión que tiene una apariencia turbia que puede enmascarar el crecimiento bacteriano contaminante. Un conservante también es particularmente útil si una composición se va a usar más de una vez, por ejemplo, en un vial multidosis. A menudo, sin embargo, una composición farmacéutica puede estar libre de conservantes.
Las composiciones farmacéuticas pueden tener una osmolalidad entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, por ejemplo, de 240-360 mOsm/kg, o de 290-310 mOsm/kg.
Las composiciones farmacéuticas típicamente tienen un pH de 5,0 a9,5,por ejemplo, de 5,0 a 8,0 o de 6,0 a 8,0.
Las composiciones farmacéuticas son preferiblemente no pirogénicas, por ejemplo, contienen <1 EU (unidad de endotoxina, una medida estándar) por dosis, y preferiblemente <0,1 EU por dosis.
Las composiciones farmacéuticas pueden tener una osmolalidad de 200-400 mOsm/kg, por ejemplo, de 240 360 mOsm/kg, o de 280-320 mOsm/kg.
Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas no contienen gluten.
Las composiciones farmacéuticas son adecuadas para su administración a pacientes animales (y, en particular, humanos), y por tanto incluyen usos tanto en humanos como veterinarios.
Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse en forma de dosis unitaria. En algunas realizaciones, una dosis unitaria puede tener un volumen de 0,1-1,0 ml, por ejemplo, aproximadamente 0,25 ml o, preferiblemente, aproximadamente 0,5 ml. Tales volúmenes son ideales para la inyección en humanos.
Niveles de conjugado
Las composiciones farmacéuticas reivindicadas incluyen múltiples conjugados inmunogénicos diferentes de acuerdo con las reivindicaciones. Las vacunas meningocócicas conjugadas autorizadas actualmente incluyen sacáridos capsulares de 4 serogrupos diferentes, y las vacunas neumocócicas conjugadas autorizadas incluyen sacáridos capsulares de 7, 10 o 13 serotipos diferentes. Por tanto, una composición de la invención puede incluir, por ejemplo, de 3 a 50 conjugados diferentes (por ejemplo, 14, 15, 20, 21, 24, 25, o más). Por ejemplo, cada uno de estos conjugados puede incluir un sacárido capsular de un serotipo o serogrupo diferente de la misma especie bacteriana (por ejemplo, múltiples serogrupos meningocócicos o múltiples serotipos neumocócicos).
La composición farmacéutica reivindicada incluyenconjugados inmunogénicos diferentes. La cantidad total de polipéptido portador en esosnconjugados puede ser de menso de o igual a3n|jg por dosis. En otras palabras, la cantidad media de polipéptido portador por conjugado puede ser de menos de 3 jg . La cantidad total puede ser, por ejemplo, den-2,5njg por dosis.
En otra realización, la cantidad total de antígeno de sacárido en esosnconjugados puede ser de menos de o igual a4,4njg por dosis. En otras palabras, la cantidad media de sacárido por conjugado puede ser de menos de 4,4jg. La cantidad total puede ser, por ejemplo, de0,4n-4,4njg por dosis,es decir,de1,1n-2,2n.
En otra realización, la concentración total de polipéptido portador para esosnconjugados puede ser de menos de o igual a6njg/ml. En otras palabras, la concentración media de polipéptido portador por conjugado puede ser de menos de 6jg/ml. La concentración total puede ser, por ejemplo, den-4njg/ml.
En otra realización, la concentración total de antígeno de sacárido para esosnconjugados puede ser menor de o igual a8,8njg/ml. En otras palabras, la concentración media de sacárido por conjugado puede ser de menos de 8,8 jg/ml. La concentración total puede ser, por ejemplo, de0,8n-8,8njg/ml, por ejemplo de 2,2n-4,4njg/ml.
En algunas realizaciones, la cantidad total de polipéptido portador conjugado en una dosis unitaria de una composición farmacéutica multivalente de la invención puede ser de 4-128jg, por ejemplo, de 8-64jg, o de 16-48jg. La concentración del polipéptido portador conjugado en una composición farmacéutica multivalente de la invención puede ser de 8-256jg/ml, por ejemplo, de 16-128jg/ml, o de 32-96jg/ml.
En algunas realizaciones, la cantidad total de antígeno de sacárido conjugado en una dosis unitaria de una composición farmacéutica multivalente de la invención puede ser de 10-120jg, por ejemplo, de 20-90jg, o de 30-60jg. La concentración de antígeno de sacárido conjugado en una composición farmacéutica multivalente de la invención puede ser de 20-240jg/ml, por ejemplo, de 40-180jg/ml, o de 60-120jg/ml.
Componentes no conjugados
Como se ha indicado anteriormente, la composición farmacéutica reivindicada incluye múltiples conjugados inmunogénicos diferentes de acuerdo con las reivindicaciones, por ejemplo, de 3 a 50 conjugados diferentes (por ejemplo, 14, 15, 20, 21, 24, 25 o más). Por ejemplo, cada uno de estos conjugados puede incluir un sacárido capsular de un serotipo o serogrupo diferente de la misma especie bacteriana.
En algunas realizaciones, la composición está libre de polipéptidos portadores de los conjugados en forma no conjugada. En otras realizaciones, hay un bajo nivel de polipéptido o polipéptidos portadores no conjugados, siempre que la masa del polipéptido o polipéptidos portadores no conjugados en la composición sea <10% (por ejemplo <5% o <2%) de la masa del polipéptido o polipéptidos portadores en los n conjugados inmunogénicos de la composición en su conjunto.
En algunas realizaciones, la composición está libre de los sacáridos de los conjugados en forma no conjugada. En otras realizaciones, hay un bajo nivel de sacárido no conjugado, siempre que la masa del sacárido no conjugado en la composición sea <10% (por ejemplo, <5% o <2%) de la masa total de sacáridos en los n conjugados inmunogénicos de la composición.
Recipientes, dispositivos de administración, etc.
Las composiciones farmacéuticas que incluyen conjugados inmunogénicos pueden envasarse en recipientes estériles, dispositivos de administración,etc.La esterilidad puede mantenerse sellando herméticamente un recipiente para hacerlo hermético al aire. Los recipientes adecuados incluyen, entre otros, viales, jeringuillas, nebulizadores, pulverizadores, inhaladores, parches dérmicos,etc.Se prefieren los viales y las jeringuillas.
Las composiciones inmunogénicas a menudo están contenidas dentro de viales. El vial está hecho preferiblemente de un material plástico o, preferiblemente, de vidrio. Un vial se sella después de ser llenado, y el sello puede romperse en el punto de uso. Preferiblemente, el vial se esteriliza antes de añadirle una composición y, a continuación, se sella. Para evitar problemas con pacientes sensibles al látex, los viales pueden sellarse con un tapón libre de látex, y se prefiere la ausencia de látex en todo el material de envasado. Lo ideal es que el vial incluya una única dosis unitaria de una composición, pero a veces puede incluir más de una dosis (un vial "multidosis"), por ejemplo, 10 dosis. Los viales preferidos son de vidrio incoloro.
Un vial puede tener un tapón (por ejemplo, un cierre Luer) adaptado de tal manera que pueda insertarse una jeringuilla en el tapón para facilitar la transferencia de material entre el vial y la jeringuilla (en ambas direcciones). Una vez se haya extraído la jeringuilla del vial, puede acoplarse una aguja y administrarse la composición a un sujeto. Preferiblemente, el tapón se encuentra dentro de un sello o una cubierta, de tal manera que hay que retirar el sello o la cubierta para poder acceder al tapón. Un vial puede tener un tapón que permita la extracción aséptica de su contenido, particularmente en el caso de los viales multidosis.
Las composiciones pueden estar contenidas dentro de dispositivos de administración, listas para su administración a un sujeto. La composición puede transferirse al dispositivo de administración en el punto de uso (por ejemplo, desde un vial), o puede introducirse en el dispositivo de administración en la etapa de fabricación (por ejemplo, en forma de jeringuilla precargada).
Una jeringuilla usada con la invención puede estar hecho de vidrio o de plástico (por ejemplo, hecha de un polímero de cicloolefina o de un copolímero de cicloolefina). Una jeringuilla (en particular una jeringuilla de vidrio) puede ser una jeringuilla siliconada. También pueden usarse jeringuillas no siliconadas, por ejemplo, con el sistema i-Coating™ de Terumo, disponible en sus jeringuillas PLAJEX™, o usando jeringuillas Daikyo CZ™ que tienen un copolímero de etileno-tetrafluoroetileno (ETFE), o usando una jeringuilla TriboGlide™ que tiene un perfluoropoliéter (PFPE). En lugar de siliconización pueden usarse películas de carbono (por ejemplo, véase JP2001190665). Las jeringuillas libres de silicona también se divulgan en la JP2011212183. Puede usarse una jeringuilla no siliconada que incluya un tapón de émbolo como el divulgado en la EP-A-0375778, es decir, en donde el tapón tiene una capa de elastómero termoplástico que está cubierta, por lo menos en parte, por una capa de resina termoplástica de bajo coeficiente de fricción dinámica.
Cuando una composición está contenida en una jeringuilla, la jeringuilla puede tener una aguja acoplada, para inyectar el contenido de la jeringuilla en un sujeto o en un recipiente. La jeringuilla puede suministrarse con una aguja ya acoplada. Si la aguja no está acoplada, puede suministrarse una aguja separada con la jeringuilla para su montaje y uso, o puede obtenerse una aguja por separado. Dicha aguja debe ser estéril en el momento de su uso y puede estar enfundada. Pueden usarse agujas de seguridad. Son típicas las agujas de calibre 23 de 1 pulgada, las de calibre 25 de 1 pulgada y las de calibre 25 de 5/8 de pulgada. Pueden usarse agujas de 1^ -11^ pulgada, de calibre 22 25. Si la jeringuilla y la aguja se envasan por separado, entonces es preferible que la aguja esté equipada con un protector de caucho butílico.
Las jeringuillas pueden estar provistas de etiquetas despegables en las que puede imprimirse un número de lote y la fecha de caducidad del contenido, para facilitar el mantenimiento de registros. El émbolo de una jeringuilla puede tener un tapón para evitar que el émbolo se extraiga accidentalmente durante la aspiración. Las jeringuillas pueden tener un tapón y/o émbolo de goma de látex, pero pueden usarse gomas sin látex, por ejemplo, goma de clorobutilo sin látex o goma de isopreno-bromobutilo sin látex. La jeringuilla tendrá generalmente un capuchón para sellar la punta antes de colocar la aguja, y el capuchón está hecho preferiblemente de caucho butílico,por ejemplo, caucho isopreno bromobutilo sin látex. Algunas jeringuillas útiles son, por ejemplo, las comercializadas con el nombre comercial "Tip-Lok"™.
Los recipientes pueden marcarse para mostrar un volumen de media dosis, por ejemplo, para facilitar la administración a niños. Por ejemplo, una jeringuilla que contiene una dosis de 0,5 ml puede tener una marca que indique un volumen de 0,25 ml. La propia jeringuilla puede tener un volumen mayor que la dosis, por ejemplo, puede usarse una jeringuilla de 1 ml para contener una dosis de 0,5 ml de una composición farmacéutica. Las jeringuillas desechables o precargadas contienen habitualmente una dosis única de vacuna.
Cuando se usa un recipiente de vidrio (por ejemplo, una jeringuilla o un vial), se elabora preferiblemente con vidrio de borosilicato y no con vidrio de cal sodada.
Puede envasarse un recipiente (por ejemplo, en la misma caja) con un prospecto que incluya detalles de la vacuna, por ejemplo, instrucciones de administración, detalles de los antígenos contenidos en la vacuna, etc. Las instrucciones también pueden contener advertencias como, por ejemplo, tener a mano una solución de adrenalina en caso de reacción anafiláctica tras la vacunación, etc. Los envases múltiples pueden ir juntos, por ejemplo, en la misma caja.
Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse en forma de dosis unitaria, con una única dosis por recipiente (por ejemplo, por jeringuilla o por vial). En lugar de fabricar cada dosis unitaria individualmente, se prepara una composición a granel y se extraen las dosis unitarias y se envasan individualmente dentro de sus recipientes. Por tanto, por ejemplo, se extraen una pluralidad de dosis unitarias del producto a granel y cada dosis unitaria se coloca en un recipiente separado, por ejemplo, en una jeringuilla o un vial.
Provocar respuestas inmunitarias
Un conjugado inmunogénico puede administrarse a un sujeto mamífero para provocar una respuesta inmunitaria protectora contra el antígeno de dicho conjugado. Se administrará en forma de una composición farmacéutica. Las composiciones reivindicadas incluyen múltiples conjugados inmunogénicos diferentes de acuerdo con las reivindicaciones, de tal manera que se pueden provocar respuestas inmunitarias protectoras contra muchos antígenos simultáneamente.
En la presente se proporciona una composición farmacéutica que comprende dos o más conjugados inmunogénicos diferentes de acuerdo con las reivindicaciones, para su uso en la generación de una respuesta de anticuerpos protectora.
La capacidad de provocar una respuesta inmunitaria protectora significa que pueden usarse los conjugados, por ejemplo, para proporcionar inmunización activa para la prevención de la enfermedad invasiva provocada porS.pneumoniae,para la prevención de la otitis media provocada porS.pneumoniae,para la prevención de la neumonía provocada porS.pneumoniae,para la inmunización activa de sujetos en riesgo de exposición aN.meningitidispara prevenir la enfermedad invasiva,etc.
Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse en varias formas. Por ejemplo, las composiciones pueden prepararse como inyectables, por ejemplo, como soluciones o suspensiones líquidas. Son típicos los inyectables para administración intramuscular. Se prefiere un volumen de inyección de aproximadamente 0,5 ml para los humanos. Por lo tanto, un volumen de dosis unitaria preferido es de aproximadamente 0,5 ml. La administración por inyección intramuscular es típica, por ejemplo, en la cara anterolateral del muslo en bebés, o en el músculo deltoides del brazo en niños pequeños, niños y adultos.
Los conjugados se administrarán típicamente de acuerdo con un programa de dosis múltiples. Pueden usarse dosis múltiples en un programa de inmunización primaria y/o en un programa de inmunización de refuerzo. La administración de más de una dosis (típicamente dos dosis) es particularmente útil en pacientes inmunológicamente no tratados. Las dosis múltiples se administrarán típicamente con un intervalo de por lo menos 1 semana (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, etc.).
General
El término "que comprende" abarca tanto "que incluye" como "que consiste en", por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y.
El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico x es opcional y significa, por ejemplo, x±10%.
La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente",por ejemplo, una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, puede omitirse la palabra "sustancialmente" en la definición de la invención.
El término "identidad de secuencia" en el contexto de dos secuencias de aminoácidos se refiere a dos secuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima sobre una ventana de comparación, como se mide usando un algoritmo de comparación de secuencias (por ejemplo, BLASTP). El porcentaje de identidad se determina sobre la secuencia de referencia de longitud completa divulgada en la presente, como la secuencia de referencia expuesta en la SEQ ID NO:1 o 2. El método para calcular la identidad de secuencia tal como se proporciona en la presente es el programa BLASTP que tiene sus valores predeterminados establecidos en una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase, por ejemplo, Henikoff & Henikoff, 1989, Proc Natl Acad Sci USA 89:10915). Véase, por ejemplo, la herramienta de alineación BLAST disponible en la WWW enblast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgio en cualquier otro sitio.
El término "alquilo inferior", como se usa en la presente, y a menos que se especifique lo contrario, se refiere a un hidrocarburo saturado lineal o ramificado que tiene de uno a seis átomos de carbono, es decir, alquilo de C1 a C6. En ciertas realizaciones, el grupo alquilo inferior es un hidrocarburo primario, secundario o terciario. El término incluye fracciones tanto sustituidas como no sustituidas. Véase también la US-2014/0066598. El término "alquileno inferior" se refiere a un radical alquileno de un alquilo inferior.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el significado entendido comúnmente. Los profesionales pueden consultar Green & Sambrook (eds.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012), y Ausubel, F. M., et al., Current Protocols in Molecular Biology (Suplemento 99), John Wiley & Sons, Nueva York (2012), y Plotkin, S.A., Orenstein, W.A., & Offit, P.A., Vaccines, 6a ed, Elsevier, Londres (2013).
Los métodos para la síntesis libre de células se describen en Spirin & Swartz (2008) Cell-free Protein Synthesis, Wiley-VCH, Weinheim, Alemania. Los métodos para la incorporación de aminoácidos no naturales en proteínas usando síntesis libre de células se describen en Shimizu et al. (2006) FEBS Journal, 273, 4133-4140 y también en Chong (2014) Curr Protoc Mol Biol. 108:16.30.1-11.
EJEMPLOS
La invención se ilustra en los siguientes ejemplos. Los ejemplos se llevan a cabo usando técnicas bien conocidas y rutinarias para los expertos en la técnica, salvo que se describa lo contrario en detalle.
Ejemplos de la WO2018/126229
Los ejemplos de la WO2018/126229 describen con todo detalle la síntesis de fracciones de eCRM de sitio único (por ejemplo, K11TAG). Estas se expresaron en un extracto de síntesis de proteínas libre de células (CFPS), y se incorporó pAMF en lugar de Lys natural.
También se expresaron variantes de CRM que contenían múltiples nnAA por polipéptido, con diferentes números de sustituciones Lys-pAMF por proteína. En general se descubrió que un número más alto de sustituciones daba portadores que llevaban a conjugados de mayor MW pero los portadores tenían menor solubilidad. Los portadores con seis residuos de pAMF proporcionaban en general tanto una buena solubilidad (>>50mg/ml) como inmunogenicidad. La alta solubilidad fue sorprendente porque la sustitución de residuos de Lys cargados en la secuencia nativa por residuos de pAMF hidrófobos aumentó la hidrofobicidad de CRM197, que es una proteína cuya hidrofobicidad ya se ha informado que afecta a su solubilidad. Por tanto, se demostró que es posible mantener los mismos sitios de unión que se han usado en conjugados de CRM197 conocidos (concretamente, residuos de Lys) sin provocar insolubilidad cuando se pierden los residuos cargados.
Se observó un conjunto particularmente útil de 6 sustituciones Lys-pAM F usando K34, K213, K245, K265, K386 y K527 (numerados de acuerdo con la SEQ ID NO: 3). Esta combinación de sitios para la sustitución de pAMF es sorprendentemente eficaz, en particular porque las sustituciones individuales en las posiciones K245 y K527 llevaron a niveles de expresión relativamente pobres.
Este conjunto de seis sustituciones puede combinarse con la alteración del dipéptido Arg-Arg en los residuos 192-193 de la SEQ ID NO: 1 (RR^-RN) para proporcionar SEQ ID NO: 4, donde cada X es pAMF.
Los ejemplos de la WO2018/126229 describen además protocolos generales para la activación de sacáridos con metaperyodato de sodio, para la derivatización de polisacáridos oxidados con peryodato con DBCO, para la activación de sacáridos con<c>D<a>P y para la conjugación de sacáridos-DBCO con eCRM. Véase también la U.S. N° de Serie 62/693,978.
Composición inmunogénica multivalente
Se preparó una combinación de conjugados para cada uno de los 24 serotipos neumocócicos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F usando el derivado de CRM197 de la SEQ ID NO: 4 (con X=pAMF) como polipéptido portador en cada conjugado. La inmunogenicidad de esta composición multivalente se confirmó usando un esquema de 3 dosis en grupos de 7 conejos, mediante inyección intramuscular de 0,25ml de vacuna. Cada dosis incluía 24|jg de sacárido (1|jg por serotipo), dando una concentración de 96jg/ml.
A continuación, se preparó una combinación de conjugados para cada uno de los 32 serotipos neumocócicos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23A, 23B, 23F, 31, 33F y 35B y se confirmó la inmunogenicidad de manera similar.
Con propósitos de comparación, también se probó la vacuna conjugada Prevnar™ 13-valente, junto con una vacuna no conjugada 24-valentes compuesta por la vacuna Pneumovax™ 23-valente suplementada con polisacárido no conjugado del serotipo 6A. Estas tres composiciones tenían dosis equivalentes de polisacáridos por serotipo (excepto para el 6B, donde el Prevnar™ incluye una dosificación doble), lo que implicaba diluir Prevnar™ y Pneumovax™. Las tres composiciones incluían adyuvante de fosfato de aluminio (60jg de Al+++ por dosis), lo que implicaba añadir el adyuvante a Pneumovax™. Las composiciones no contenían conservantes.
La composición conjugada 24-valente incluía una cantidad menor de polipéptido portador que en la vacuna Prevnar-13™ aprobada, a pesar de que también incluye sacáridos capsulares de 11 serotipos adicionales. La proporción global en peso del sacárido capsular con respecto al polipéptido portador en la composición conjugada 24-valente era aproximadamente el doble de la observada en Prevnar™.
Se midieron las respuestas de IgG y OPA en los conejos. Después de la tercera dosis, ambas respuestas fueron mucho mayores en los conejos que recibieron las dos vacunas conjugadas que en los que recibieron la vacuna no conjugada. Además, las respuestas de IgG y OPA con la composición 24-valente fueron comparables a las obtenidas con Prevnar™ en los 13 serotipos cubiertos por la vacuna aprobada, pero además fueron superiores frente a los 11 serotipos que no están incluidos en Prevnar™. Sorprendentemente, no hubo pruebas de supresión epitópica inducida por el portador usando la composición 24-valente.
La FIG. 1 muestra el título medio geométrico para cada uno de los 32 serotipos en la composición conjugada 32-valente en relación con la formulación de polisacárido/alumbre y Prevnar-13™.
La composición conjugada multivalente puede envasarse útilmente en una jeringuilla estéril precargada para que pueda distribuirse fácilmente en forma de dosis unitaria, y pueda entonces administrarse en el punto de uso sin necesidad de transferir el contenido de un vial a una jeringuilla para inyección, etc.
Posiciones sustituibles en CRM197
Basándose en el trabajo divulgado en la WO2018/126229, una variedad de residuos Asp, Asn, Glu, Gln, Lys, Arg, Ser y Thr dentro de la secuencia nativa de CRM197 (SEQ ID NO: 1) se sustituyeron individualmente con pAMF mutando sus codones a TAG y expresando la proteína a 25°C en un sistema libre de células en el que este codón es reconocido por un ARNt que incorpora el nnAA. Los polipéptidos mutantes se expresaron con una metionina en el extremo N-terminal y con una etiqueta de hexahistidina en sentido descendente unida mediante un conectortripéptido Gly-Ser-Gly. Se evitaron los residuos en Asn270-Ile289, Ala320-Glu349 y Phe410-His-449 debido a los epítopos de células T reconocidos en estas regiones (véase más arriba).
La eficiencia de la expresión se evaluó comprobando la incorporación de 14C-Leu en las proteínas mutantes, considerando tanto la proteína total como la proteína soluble. En general, las mutaciones en el dominio catalítico de CRM197 llevaron a niveles de expresión reducidos en relación con la secuencia de CRM197 no modificada, y los mutantes con los mejores niveles de expresión implicaron generalmente sustituciones en sentido descendente de Arg-193, que puede usarse para delimitar el final del dominio catalítico.
Los mejores 72 mutantes mostraron niveles de expresión aumentados de proteínas totales y solubles y tenían sustituciones en los siguientes residuos, enumerados de acuerdo con la SEQ ID NO: 1: Ser-198, Ser-200, Asp-211, Lys-212, Lys-218, Lys-221, Lys-229, Ser-231, Ser-233, Lys-236, Ser-239, Glu-240, Glu-248, Glu-249, Gln-252, Thr-253, Glu-256, Glu-259, Ser-261, Lys-264, Thr-265, Thr-267, Thr-269, Gln-287, Glu-292, Thr-293, Asp-295, Asn-296, Ser-297, Lys-299, Asp-352, Asn-359, Glu-362, Ser-374, Arg-377, Ser-381, Lys-385, Thr-386, Asp-392, Ser-397, Asn-399, Thr-400, Arg-407, Thr-408, Ser-451, Arg-455, Lys-456, Arg-460, Arg-462, Asp-465, Asp-467, Thr-469, Arg-472, Lys-474, Ser-475, Asn-481, Asn-486, Arg-493, Ser-494, Ser-495, Ser-496, Lys-498, Ser-501, Asn-502, Ser-505, Asp-507, Lys-516, Thr-517, Asp-519, Lys-522, Asn-524, y Lys-534.
LISTA DE SECUENCIAS
SEQ ID NO: 1 (CRM197 nativo)
GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFY STDNKYDAAGY SVDNE NPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPF AEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIR DKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAA WAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGEL VDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKI TAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVA FHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS
SEQ ID NO: 2 (CRM197 con sustitución Arg-Asn)
GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFY STDNKYDAAGY SVDNE NPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPF AEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRNSVGSSLSCINLDWDVIR DKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAA WAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGEL VDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKI TAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVA FHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS
SEQ ID NO: 3 (CRM197 con 6 sitios de nnAA preferidos y extremo N-terminal Met)
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQXGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFY STDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLP FAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVI RDXTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAXQYLEEFHQTALEHPELSELXTVTGTNPVFAGANYA AWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGE LVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHXTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIK ITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHV AFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSXLSLFFEIKS
SEQ ID NO: 4 (CRM197 con Arg-Asn substn, 6 sitios de nnAA preferidos, y extremo N-terminal Met)
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQXGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFY STDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLP FAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRNSVGSSLSCINLDWDVI RDXTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAXQYLEEFHQTALEHPELSELXTVTGTNPVFAGANYA AWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGE LVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHXTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIK ITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHV AFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSXLSLFFEIKS
Claims (18)
1. Un polipéptido portador que comprende una secuencia de aminoácidos que (i) tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1; (ii) está libre de una secuencia dipeptídica Arg-Arg; y (iii) comprende residuos de aminoácidos no naturales (nnAA) sustituidos por K33, K212, K244, k264, K385, y K526 en la SEQ ID NO: 1.
2. El polipéptido portador de la reivindicación 1, en donde Arg-193 de la SEQ ID NO: 1 está sustituido por un aminoácido diferente, como Asn.
3. El polipéptido portador de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el polipéptido portador comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95%, por lo menos un 96%, por lo menos un 97% o por lo menos un 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1.
4. El polipéptido portador de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el polipéptido portador comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.
5. El polipéptido portador de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde los residuos de nnAA incluyen un grupo funcional que es adecuado para una reacción química de "clic" con un grupo funcional en un antígeno.
6. El polipéptido portador de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde cada nnAA es ácido 2-amino-3-(4-(azidometil)fenil)propanoico.
7. Un conjugado inmunogénico que comprende el polipéptido portador de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, conjugado a través de residuos de nnAA en el mismo con un antígeno.
8. El conjugado inmunogénico de la reivindicación 7, en donde el antígeno tiene un grupo alquino que se conjuga con el nnAA a través de un grupo azido.
9. Un conjugado inmunogénico que comprende el polipéptido portador de cualquiera de las reivindicaciones 4-6 y un antígeno de sacárido, en donde (i) el polipéptido portador comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4; y (ii) el antígeno de sacárido está unido covalentemente al polipéptido portador mediante por lo menos un residuo de nnAA dentro de la SEQ ID NO: 4.
10. El conjugado inmunogénico de cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en donde el antígeno es un sacárido capsular bacteriano; por ejemplo, un sacárido capsular de una bacteria seleccionada del grupo que consiste enStreptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiaeyPorphyromonas gingivalis.
11. El conjugado inmunogénico de cualquiera de las reivindicaciones 7-10, en donde el antígeno es un sacárido capsular de un serotipode S. pneumoniaeseleccionado del grupo que consiste en 1,2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31, y 33F.
12. El conjugado inmunogénico de cualquiera de las reivindicaciones 7-10, en donde el antígeno es un sacárido capsular de un serotipode S. pneumoniaeseleccionado del grupo que consiste en 6C, 7C, 15A, 15C, 16F, 20A, 20B, 23A, 23B, 24B, 31, 34, 35B, 35F, 37 y 38.
13. El conjugado inmunogénico de cualquiera de las reivindicaciones 7-12, en donde el conjugado tiene un peso molecular de por lo menos 500kDa.
14. El conjugado inmunogénico de la reivindicación 13, en donde el conjugado tiene un peso molecular entre 900kDa y SMDa.
15. Una composición farmacéutica que comprende dos o más conjugados inmunogénicos diferentes de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-12.
16. La composición farmacéutica de la reivindicación 15, en donde los conjugados inmunogénicos son conjugados de serotipos neumocócicos, y en donde la proporción de sacárido neumocócico con respecto al polipéptido portador (p/p) para la composición es mayor de 1.
17. La composición farmacéutica de la reivindicación 15 o de la reivindicación 16, en donde la composición farmacéutica comprende:
conjugados de sacáridos capsulares de 2 o más serotipos neumocócicos diferentes seleccionados del grupo que consiste en los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 y 33F;
conjugados de sacáridos capsulares de 14 o más serotipos neumocócicos diferentes seleccionados del grupo que consiste en los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 y 33F;
conjugados de sacáridos capsulares de 15 o más serotipos neumocócicos diferentes seleccionados del grupo que consiste en los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 y 33F;
conjugados de sacáridos capsulares de 20 o más serotipos neumocócicos diferentes seleccionados del grupo que consiste en los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 y 33F;
conjugados de sacáridos capsulares de 21 o más serotipos neumocócicos diferentes seleccionados del grupo que consiste en los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 y 33F;
conjugados de sacáridos capsulares de 24 o más serotipos neumocócicos diferentes seleccionados del grupo que consiste en los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 y 33F;
conjugados de sacáridos capsulares de 25 o más serotipos neumocócicos diferentes seleccionados del grupo que consiste en los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 y 33F;
conjugados de sacáridos capsulares de 4 o más serogrupos meningocócicos diferentes seleccionados del grupo que consiste en los serogrupos A, C, W135, X e Y; o
conjugados de sacáridos capsulares de 2 o más serotipos diferentesde P.gingivalesseleccionados del grupo que consiste en los serotipos K1, K2, K3, K4, K5 y K6.
18. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15-17 para su uso en la generación de una respuesta protectora de anticuerpos.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201862693981P | 2018-07-04 | 2018-07-04 | |
| PCT/US2019/040131 WO2020009993A1 (en) | 2018-07-04 | 2019-07-01 | Improvements in immunogenic conjugates |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2989087T3 true ES2989087T3 (es) | 2024-11-25 |
Family
ID=67439412
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES19745001T Active ES2989087T3 (es) | 2018-07-04 | 2019-07-01 | Mejoras en conjugados inmunogénicos |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP3817775B1 (es) |
| JP (2) | JP7399934B2 (es) |
| KR (1) | KR20210042904A (es) |
| CN (1) | CN112543649A (es) |
| AU (1) | AU2019299836A1 (es) |
| BR (1) | BR112020026899A2 (es) |
| CA (1) | CA3105361A1 (es) |
| DK (1) | DK3817775T3 (es) |
| EA (1) | EA202190168A1 (es) |
| ES (1) | ES2989087T3 (es) |
| IL (1) | IL279855A (es) |
| MX (1) | MX2020014118A (es) |
| PH (1) | PH12020552282A1 (es) |
| SG (1) | SG11202012905PA (es) |
| WO (1) | WO2020009993A1 (es) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA3191005A1 (en) | 2020-08-10 | 2022-02-17 | Inventprise, Inc. | Multivalent pneumococcal glycoconjugate vaccines containing emerging serotype 24f |
| EP4200268A4 (en) | 2020-08-19 | 2024-10-16 | Vaxcyte, Inc. | CARRIER PROTEIN POLYSACCHARIDE CONJUGATION PROCESS |
| GB202108648D0 (en) * | 2021-06-17 | 2021-08-04 | Inst De Medicina Molecular Joaeo Lobo Antunes | CRM197 protein carrier |
Family Cites Families (40)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988010130A1 (en) | 1987-06-19 | 1988-12-29 | Terumo Kabushiki Kaisha | Medical instrument and production thereof |
| AU634153B2 (en) | 1988-02-01 | 1993-02-18 | Wyeth Holdings Corporation | T-cell epitope as carriers molecule for conjugate vaccines |
| FR2763244B1 (fr) | 1997-05-14 | 2003-08-01 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Composition vaccinale multivalente a porteur mixte |
| GB9808932D0 (en) | 1998-04-27 | 1998-06-24 | Chiron Spa | Polyepitope carrier protein |
| JP2001190665A (ja) | 2000-01-14 | 2001-07-17 | Terumo Corp | シリンジ |
| AU2001249389A1 (en) * | 2000-03-22 | 2001-10-03 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Modified blood clotting factors and methods of use |
| GB0502095D0 (en) * | 2005-02-01 | 2005-03-09 | Chiron Srl | Conjugation of streptococcal capsular saccharides |
| US7955605B2 (en) | 2005-04-08 | 2011-06-07 | Wyeth Llc | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
| US20070184072A1 (en) | 2005-04-08 | 2007-08-09 | Wyeth | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
| CN113198013B (zh) | 2005-04-08 | 2024-02-20 | 惠氏有限责任公司 | 多价肺炎球菌多糖－蛋白质缀合物组合物 |
| US7709001B2 (en) | 2005-04-08 | 2010-05-04 | Wyeth Llc | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
| EP3466982B1 (en) | 2005-04-08 | 2020-06-17 | Wyeth LLC | Separation of contaminants from streptococcus pneumoniae polysaccharide by ph manipulation |
| BRPI0615420A2 (pt) * | 2005-09-01 | 2011-05-17 | Novartis Vaccines & Diagnostic | vacinação múltipla que inclui meningococo do sorogrupo c |
| EA014107B1 (ru) * | 2005-12-22 | 2010-10-29 | Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. | Вакцина, содержащая конъюгаты капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae |
| US8414899B2 (en) * | 2006-04-11 | 2013-04-09 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Vaccines comprising multimeric HSP60 peptide carriers |
| BR122019021950B8 (pt) | 2006-10-10 | 2021-07-27 | Wyeth Corp | métodos para a redução ou remoção de impurezas protéicas de um lisado ou centrado celular de streptococcus pneumoniae compreendendo polissacarídeos sorotipo 3 |
| ES2922132T3 (es) | 2007-03-23 | 2022-09-08 | Wyeth Llc | Procedimiento abreviado de purificación para la producción de polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae |
| JP5959201B2 (ja) * | 2008-12-10 | 2016-08-02 | ザ スクリプス リサーチ インスティテュート | 化学的に反応性の非天然アミノ酸を使用するキャリア−ペプチド接合体の製造 |
| CA2756533A1 (en) * | 2009-03-24 | 2010-09-30 | Novartis Ag | Combinations of meningococcal factor h binding protein and pneumococcal saccharide conjugates |
| IT1398927B1 (it) * | 2009-06-25 | 2013-03-28 | Consorzio Interuniversitario Per Lo Sviluppo Dei Sistemi A Grande Interfase Csgi | Espressione batterica di un gene artificiale per la produzione di crm197 e derivati. |
| GB201003924D0 (en) | 2010-03-09 | 2010-04-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Immunogenic composition |
| GB201003922D0 (en) | 2010-03-09 | 2010-04-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Conjugation process |
| JP2011212183A (ja) | 2010-03-31 | 2011-10-27 | Terumo Corp | プレフィルドシリンジ |
| WO2012163289A1 (zh) * | 2011-06-01 | 2012-12-06 | 厦门大学 | 包含白喉毒素无毒突变体crm197或其片段的融合蛋白 |
| RU2636350C2 (ru) * | 2011-11-07 | 2017-11-22 | Новартис Аг | МОЛЕКУЛА, СОДЕРЖАЩАЯ SPR0096 и SPR2021 |
| ES2728864T3 (es) | 2012-08-31 | 2019-10-29 | Sutro Biopharma Inc | Aminoácidos modificados que comprenden un grupo azido |
| EP2903650B1 (en) | 2012-10-02 | 2018-04-04 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Nonlinear saccharide conjugates |
| KR20140075196A (ko) | 2012-12-11 | 2014-06-19 | 에스케이케미칼주식회사 | 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물 |
| US10287330B2 (en) * | 2012-12-27 | 2019-05-14 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Methods and compositions relating to CRM197 |
| ITMI20130142A1 (it) * | 2013-01-31 | 2014-08-01 | Biosynth Srl | Vaccini glicoconiugati comprendenti unita' di base di un costrutto molecolare esprimente epitopi multipli incorporati |
| EP3055298B1 (en) | 2013-10-11 | 2020-04-29 | Sutro Biopharma, Inc. | Modified amino acids comprising tetrazine functional groups, methods of preparation, and methods of their use |
| PL3055321T3 (pl) * | 2013-10-11 | 2019-02-28 | Sutro Biopharma, Inc. | SYNTETAZY tRNA DOŁĄCZAJĄCE AMINOKWAS NIENATURALNY DLA PARA-METYLOAZYDO-L-FENYLOALANINY |
| RU2771293C2 (ru) * | 2014-01-21 | 2022-04-29 | Пфайзер Инк. | Иммуногенные композиции, содержащие конъюгированные капсульные сахаридные антигены, и их применение |
| PL3096783T3 (pl) * | 2014-01-21 | 2021-12-13 | Pfizer Inc. | Polisacharydy otoczkowe streptococcus pneumoniae i ich koniugaty |
| MX371453B (es) * | 2014-01-21 | 2020-01-29 | Pfizer | Polisacaridos capsulares de streptococcus pneumoniae y conjugados de los mismos. |
| DK3099800T3 (da) | 2014-01-31 | 2021-01-11 | Fina Biosolutions Llc | Ekspression og oprensning af crm197 og beslægtede proteiner |
| EP3177324A1 (en) * | 2014-08-05 | 2017-06-14 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Carrier molecule for antigens |
| JP7164200B2 (ja) * | 2016-03-31 | 2022-11-01 | ポゴナ， エルエルシー | サッカライド－ポリペプチドコンジュゲートの組成物およびその使用の方法 |
| MX2019003593A (es) * | 2016-09-30 | 2019-06-10 | Biological E Ltd | Composiciones de vacuna neumococica multivalente que comprenden conjugados de polisacaridos y proteinas. |
| IL317054A (en) * | 2016-12-30 | 2025-01-01 | Vaxcyte Inc | Polypeptide-antigen conjugates with unnatural amino acids |
-
2019
- 2019-07-01 EP EP19745001.8A patent/EP3817775B1/en active Active
- 2019-07-01 BR BR112020026899-2A patent/BR112020026899A2/pt unknown
- 2019-07-01 ES ES19745001T patent/ES2989087T3/es active Active
- 2019-07-01 JP JP2021500060A patent/JP7399934B2/ja active Active
- 2019-07-01 WO PCT/US2019/040131 patent/WO2020009993A1/en active Application Filing
- 2019-07-01 DK DK19745001.8T patent/DK3817775T3/da active
- 2019-07-01 CA CA3105361A patent/CA3105361A1/en active Pending
- 2019-07-01 MX MX2020014118A patent/MX2020014118A/es unknown
- 2019-07-01 KR KR1020217003324A patent/KR20210042904A/ko active Pending
- 2019-07-01 EP EP24197275.1A patent/EP4483896A3/en active Pending
- 2019-07-01 CN CN201980044169.8A patent/CN112543649A/zh active Pending
- 2019-07-01 SG SG11202012905PA patent/SG11202012905PA/en unknown
- 2019-07-01 EA EA202190168A patent/EA202190168A1/ru unknown
- 2019-07-01 AU AU2019299836A patent/AU2019299836A1/en active Pending
-
2020
- 2020-12-29 PH PH12020552282A patent/PH12020552282A1/en unknown
- 2020-12-30 IL IL279855A patent/IL279855A/en unknown
-
2023
- 2023-12-06 JP JP2023206041A patent/JP2024037805A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA202190168A1 (ru) | 2021-06-07 |
| JP2021530468A (ja) | 2021-11-11 |
| EP4483896A2 (en) | 2025-01-01 |
| BR112020026899A2 (pt) | 2021-03-30 |
| PH12020552282A1 (en) | 2021-06-28 |
| MX2020014118A (es) | 2021-06-18 |
| EP3817775B1 (en) | 2024-09-04 |
| AU2019299836A1 (en) | 2021-02-25 |
| EP3817775A1 (en) | 2021-05-12 |
| CN112543649A (zh) | 2021-03-23 |
| SG11202012905PA (en) | 2021-01-28 |
| CA3105361A1 (en) | 2020-01-09 |
| WO2020009993A1 (en) | 2020-01-09 |
| EP4483896A3 (en) | 2025-04-02 |
| IL279855A (en) | 2021-03-01 |
| DK3817775T3 (da) | 2024-09-16 |
| KR20210042904A (ko) | 2021-04-20 |
| JP7399934B2 (ja) | 2023-12-18 |
| JP2024037805A (ja) | 2024-03-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103209708B (zh) | 免疫原性组合物 | |
| ES2658851T3 (es) | Vacunas de matriz de proteína y métodos de preparación y administración de tales vacunas | |
| JP2022105155A (ja) | 多糖類－タンパク質コンジュゲートを含む多価肺炎球菌ワクチン組成物 | |
| ES2700824T3 (es) | Procedimientos y composiciones de glucoconjugación | |
| DK171420B1 (da) | Kovalent-modificeret bakterielt polysaccharid/protein-konjugat, fremgangsmåde til fremstilling deraf og præparat omfattende et polysaccharid/protein-konjugat | |
| JP6808658B2 (ja) | 多価肺炎球菌コンジュゲートワクチン | |
| ES2760536T3 (es) | Composiciones y métodos para mejorar la inmunogenicidad de los conjugados de polisacárido-proteína | |
| IE58977B1 (en) | Covalently-modified neutral bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such plysaccharides and immunogenic proteins, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates | |
| ES2812523T3 (es) | Conjugación de polisacáridos capsulares de Staphylococcus aureus de tipo 5 y de tipo 8 | |
| JP2024037805A (ja) | 免疫原性複合体の改良 | |
| JP2013504588A (ja) | 免疫原性の高いタンパク質マトリックスワクチン | |
| EA048282B1 (ru) | Усовершенствования в иммуногенных конъюгатах | |
| CN110064053A (zh) | 蛋白质基质疫苗及这种疫苗的制备和给药方法 | |
| EA040051B1 (ru) | Композиции поливалентной пневмококковой вакцины, содержащие конъюгаты полисахарид-белок | |
| EA048146B1 (ru) | Композиции поливалентной пневмококковой вакцины, содержащие конъюгаты полисахарид-белок |