ES2986585T3 - Elementos reguladores de plantas y sus usos - Google Patents
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Abstract
La invención proporciona moléculas y construcciones de ADN recombinante, así como sus secuencias de nucleótidos, útiles para modular la expresión génica en plantas. La invención también proporciona plantas transgénicas, células vegetales, partes de plantas y semillas que comprenden las moléculas de ADN recombinante unidas operativamente a moléculas de ADN transcribibles heterólogas, así como métodos para su uso. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Elementos reguladores de plantas y sus usos
Campo de la invención
La invención se circunscribe al campo de la biología molecular de plantas y la ingeniería genética de plantas. Más específicamente, la invención se refiere a moléculas de ADN útiles para modular la expresión génica en plantas.Antecedentes
Los elementos reguladores son elementos genéticos que regulan la actividad génica a través de la modulación de la transcripción de una molécula de ADN transcribible unida operativamente. Tales elementos pueden incluir promotores, líderes, intrones y regiones 3' no traducidas y son útiles en el campo de la biología molecular de plantas y la ingeniería genética de plantas.
Breve descripción de la invención
La invención proporciona nuevos elementos reguladores génicos sintéticos para su uso en plantas. Asimismo, la invención proporciona moléculas y construcciones de ADN recombinante que comprenden los elementos reguladores. La presente invención también proporciona células de plantas, plantas y semillas transgénicas que comprenden los elementos reguladores sintéticos. En una forma de realización, los elementos reguladores sintéticos están unidos operativamente a una molécula de ADN transcribible heteróloga. La presente invención también proporciona procedimientos para usar los elementos reguladores sintéticos y procedimientos de preparación y uso de las moléculas de ADN recombinante que comprenden los elementos reguladores sintéticos y las células de plantas, plantas y semillas transgénicas que comprenden los elementos reguladores sintéticos unidos operativamente a una molécula de ADN transcribible.
Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en: (a) una secuencia con por lo menos 85% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NO: 1-3, en donde la secuencia de ADN tiene actividad reguladora de genes; (b) una secuencia que comprende cualquiera de SEQ ID NO: 1-3; y (c) un fragmento de cualquiera de SEQ ID NO: 1-3, en donde el fragmento tiene actividad reguladora génica; en donde la secuencia está unida operativamente a una molécula de ADN transcribible heteróloga. Por “molécula de ADN transcribible heteróloga” se quiere decir que la molécula de ADN transcribible es heteróloga con respecto a la secuencia de polinucleótidos a la que está unida operativamente. En formas de realización específicas, la molécula de ADN recombinante comprende una secuencia de ADN que tiene por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, o por lo menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de ADN de cualquiera de SEQ ID NO: 1-3. En formas de realización particulares, la secuencia de ADN comprende un elemento regulador. En algunas formas de realización, el elemento regulador comprende un promotor. En otras formas de realización adicionales, la molécula de ADN transcribible heteróloga comprende un gen de interés agronómico, tal como un gen capaz de proporcionar resistencia a los herbicidas en plantas o un gen capaz de proporcionar resistencia a las plagas de plantas en plantas. En otras formas de realización adicionales, la invención proporciona una construcción que comprende una molécula de ADN recombinante como se proporciona en la presente descripción.
En otro aspecto, en la presente descripción se proporcionan células de plantas transgénicas que comprenden una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en: (a) una secuencia con por lo menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NO: 1-3, en donde la secuencia de ADN tiene actividad reguladora de genes; (b) una secuencia que comprende cualquiera de SEQ ID NO: 1-3; y (c) un fragmento de cualquiera de SEQ ID NO: 1-3, en donde el fragmento tiene actividad reguladora génica; en donde la secuencia de ADN está unida operativamente a una molécula de ADN transcribible heteróloga. En determinadas formas de realización, la célula de planta transgénica es una célula de planta monocotiledónea. En otras formas de realización, la célula de planta transgénica es una célula de planta dicotiledónea.
Incluso en otro aspecto adicional, en la presente descripción se proporciona, además, una planta transgénica, o parte de la misma, que comprende una molécula de a Dn recombinante que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en: a) una secuencia con por lo menos 85% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NO: 1-3, en donde la secuencia de ADN tiene actividad reguladora de genes; b) una secuencia que comprende cualquiera de SEQ ID NO: 1-3; y c) un fragmento de cualquiera de SEQ ID NO: 1-3, en donde el fragmento tiene actividad reguladora génica; en donde la secuencia está unida operativamente a una molécula de ADN transcribible heteróloga. En formas de realización específicas, la planta transgénica es una planta descendiente de cualquier generación que comprende la molécula de ADN recombinante. En la presente descripción también se proporciona una semilla transgénica que comprende la molécula de ADN recombinante que produce dicha planta transgénica cuando es cultivada.
En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para producir un producto básico que comprende la obtención de una planta transgénica o parte de la misma que contiene una molécula de ADN recombinante de la invención y la producción del producto básico a partir de aquella. En una forma de realización, el producto básico es semillas, granos, partes de plantas, aceites y harinas procesadas.
Incluso en otro aspecto adicional, la invención proporciona un procedimiento para producir una planta transgénica que comprende una molécula de ADN recombinante de la invención, que comprende transformar una célula de planta con la molécula de ADN recombinante de la invención para producir una célula de planta transformada y regenerar una planta transgénica a partir de la célula de planta transformada.
Breve descripción de las secuencias
La SEQ ID NO:1 es una secuencia de ADN de un grupo de elementos de expresión reguladores sintéticos (EXP), EXP-At.GSP442.nno+At.Cyco:3, que comprende un promotor sintético (P-At.GSP442.nno:2), unido operativamente 5' a un líder sintético (L-At.GSP442.nno:1), unido operativamente 5' a un intrón (I-At.Cyco:2).
La SEQ ID NO:2 es una secuencia de promotor sintético, P-At.GSP442.nno:2.
La SEQ ID NO:3 es una secuencia de líder sintético, L-At.GSP442.nno:1.
La SEQ ID NO:4 es una secuencia de ADN de un EXP sintético, EXP-At.GSP571, que comprende un promotor sintético (P-At.GSP571.nno:5), unido operativamente 5' a un líder sintético (L-At.GSP57l.nno:1).
La SEQ ID NO:5 es una secuencia de promotor sintético, P-At.GSP571.nno:5.
La SEQ ID NO:6 es una secuencia de líder sintético, L-At.GSP571.nno:1.
La SEQ ID NO:7 es una secuencia de ADN de un grupo de elementos de expresión reguladores sintéticos (EXP), EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco:2, que comprende un promotor sintético (P-At.GSP571.nno:5), unido operativamente 5' a un líder sintético (L-At.GSP571.nno:1), unido operativamente 5' a un intrón (I-At.Cyco:2).
La SEQ ID NO:8 es una secuencia de ADN de un grupo de elementos de expresión reguladores sintéticos (EXP), EXP-At.GSP571.nno+At.GSI21.nno:10, que comprende un promotor sintético (P-At.GSP571.nno:5), unido operativamente 5' a un líder sintético (L-At.GSP571.nno:1), unido operativamente 5' a un intrón sintético (I-At.GSI21.nno:2).
La SEQ ID NO:9 es una secuencia de intrón sintético, I-At.GSI21.nno:2.
La SEQ ID NO:10 es una secuencia de ADN de un EXP sintético, EXP-At.GSP571.nno+At.GSI102.nno:1, que comprende un promotor sintético (P-At.GSP571.nno:5), unido operativamente 5' a un líder sintético (L-At.GSP571.nno:1), unido operativamente 5' a un intrón sintético (I-At.GSI102.nno:1).
La SEQ ID NO:11 es una secuencia de intrón sintético, I-At.GSI102.nno:1.
La SEQ ID NO:12 es una secuencia de ADN de un EXP sintético, EXP-At.GSP564, que comprende un promotor sintético (P-At.GSP564.nno:3), unido operativamente 5' a un líder sintético (L-At.GSP564.nno:1).
La SEQ ID NO:13 es una secuencia de promotor sintético, P-At.GSP564.nno:3.
La SEQ ID NO:14 es una secuencia de líder sintético, L-At.GSP564.nno:1.
La SEQ ID NO:15 es una secuencia de ADN de un EXP sintético, EXP-At.GSP564.nno+At.Cyco:2, que comprende un promotor sintético (P-At.GSP564.nno:3), unido operativamente 5' a un líder sintético (L-At.GSP564.nno:1), unido operativamente 5' a un intrón (I-At.Cyco:2).
La SEQ ID NO:16 es una secuencia de ADN de un EXP sintético, EXP-At.GSP564.nno+At.GSI17.nno:2, que comprende un promotor sintético (P-At.GSP564.nno:3), unido operativamente 5' a un líder sintético (L-At.GSP564.nno:1), unido operativamente 5' a un intrón sintético (I-At.GSI17.nno:1).
La SEQ ID NO:17 es una secuencia de intrón sintético, I-At.GSI17.nno:1.
La SEQ ID NO:18 es una secuencia de ADN de un EXP sintético, EXP-At.GSP564.nno+At.GSI102.nno:1, que comprende un promotor sintético (P-At.GSP564.nno:3), unido operativamente 5' a un líder sintético (L-At.GSP564.nno:1), unido operativamente 5' a un intrón sintético (I-At.GSI102.nno:1).
La SEQ ID NO:19 es una secuencia de ADN de un EXP sintético, EXP-At.GSP579, que comprende un promotor sintético (P-At.GSP579.nno:2), unido operativamente 5' a un líder sintético (L-At.GSP579.nno:1).
La SEQ ID NO:20 es una secuencia de promotor sintético, P-At.GSP579.nno:2.
La SEQ ID NO:21 es una secuencia de líder sintético, L-At.GSP579.nno:1.
La SEQ ID NO:22 es una secuencia de ADN de un EXP sintético, EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3, que comprende un promotor sintético (P-At.GSP579.nno:2), unido operativamente 5' a un líder sintético (L-At.GSP579.nno:1), unido operativamente 5' a un intrón sintético (I-At.GSI102.nno:1).
La SEQ ID NO:23 es una secuencia de ADN de un EXP sintético, EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco:1, que comprende un promotor quimérico sintético (P-At.GSP571/442, que está compuesto de un potenciador sintético (E-At.GSP571.nno:1) unido operativamente 5' a un promotor sintético (P-At.GSP442.nno:2)), unido operativamente 5' a un líder sintético (L-At.GSP442.nno:1), unido operativamente 5' a un líder (L-At.Cyco-1:1:2), unido operativamente 5' a un intrón (I-At.Cyco:2).
La SEQ ID NO:24 es una secuencia de potenciador sintético, E-At.GSP571.nno:1.
La SEQ ID NO:25 es una secuencia de ADN de un promotor quimérico sintético, P-At.GSP571/442, compuesto de un potenciador sintético (E-At.GSP571.nno:1) unido operativamente 5' a un promotor sintético (P-At.GSP442.nno:2). La SEQ ID NO:26 es una secuencia de ADN de un EXP sintético, EXP-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno:3, que comprende un promotor sintético (P-At.GSP576.nno:4), unido operativamente 5' a un líder sintético (L-At.GSP576.nno:2), unido operativamente 5' a un intrón sintético (I-At.GSI17.nno:1).
La SEQ ID NO:27 es una secuencia de promotor sintético, P-At.GSP576.nno:4.
La SEQ ID NO:28 es una secuencia de líder sintético, L-At.GSP576.nno:2.
La SEQ ID NO:29 es una 3' UTR sintética, T-Zm.GST59.nno:1.
La SEQ ID NO:30 es una secuencia de ADN de un EXP sintético, EXP-At.GSP221+At.Cyco:3, que comprende un promotor sintético (P-At.GSP221:3), unido operativamente 5' a un líder sintético (L-At.GSP221:1), unido operativamente 5' a un intrón (I-At.Cyco:2).
La SEQ ID NO:31 es una secuencia de promotor sintético, P-At.GSP221:3.
La SEQ ID NO:32 es una secuencia de líder sintético, L-At.GSP221:1.
La SEQ ID NO:33 es una secuencia de intrón, I-At.Cyco:2, derivada de un gen de la subunidad VIa de Citocromo c oxidasa deArabidopsis.
La SEQ ID NO:34 es una secuencia de 3' UTR, T-Mt.Sali3-2-1:2:1, derivada del gen Sali3 deMedicago truncatula.La SEQ ID NO:35 es una secuencia de 3' UTR, T-Mt.Oxr-1:2:1 derivada de un gen putativo de proteína oxidorreductasa (OXR) deMedicago truncatula.
La SEQ ID NO:36 es una secuencia de 3' UTR, T-Gb.FbL2:1, derivada del gen FbLate-2 deGossypium barbadense.La SEQ ID NO:37 es una secuencia de 3' UTR, T-Mt.RD22-1:2:1, derivada de un gen RD22 de proteína de respuesta a la deshidratación deMedicago truncatula.
La SEQ ID NO:38 es una secuencia de ADN de un EXP derivado de un gen de la subunidad VIa de Citocromo c oxidasa deArabidopsis,EXP-At.Cyco:1:1, que comprende un promotor (P-At.Cyco-1:1:2), unido operativamente 5' a un líder (L-At.Cyco-1:1:2), unido operativamente 5' a un intrón (I-At.Cyco-1:1:1).
La SEQ ID NO:39 es una secuencia de promotor, P-At.Cyco-1:1:2, derivada de un gen de la subunidad VIa de Citocromo c oxidasa deArabidopsis.
La SEQ ID NO:40 es una secuencia de líder, L-At.Cyco-1:1:2, derivada de un gen de la subunidad VIa de Citocromo c oxidasa deArabidopsis.
La SEQ ID NO:41 es una secuencia de intrón, I-At.Cyco-1:1:1, derivada de un gen de la subunidad VIa de Citocromo c oxidasa deArabidopsis.
La SEQ ID NO:42 es una secuencia codificante para 13-glucuronidasa (GUS) con un intrón procesable derivado del gen específico de tejido inducible por luz de la papa ST-LS1 (Acceso Genbank: X04753).
La SEQ ID NO:43 es una secuencia de ADN de un EXP, EXP-At.GSP442+L-I-At.Cyco, que comprende el promotor sintético, P-At.GSP442.nno:2, unido operativamente 5' al líder sintético, L-At.GSP442.nno:1, unido operativamente 5' al líder, L-At.Cyco-1:1:2, que está unido operativamente 5' al intrón, I-At.Cyco:2.
La SEQ ID NO:44 es una secuencia de ADN de la 3' UTR sintética, T-Zm.GST7.nno:2.
La SEQ ID NO:45 es una secuencia de ADN de un EXP, EXP-At.GSP576.nno+At.Cyco:1, que comprende el promotor sintético, P-At.GSP564.nno:3, unido operativamente 5' al líder sintético, L-At.GSP564.nno:1, que está unido operativamente 5' al intrón, I-At.Cyco:2.
La SEQ ID NO:46 es una secuencia de ADN del EXP, EXP-CaMV.35S, que comprende el promotor y líder 35S derivado del virus del mosaico de la coliflor.
La SEQ ID NO:47 es una secuencia de ADN del intrón, I-Zm.DnaK:1, derivado del gen 70 de la proteína de choque térmico (Hsp70) (DnaK) deZea mays.
La SEQ ID NO:48 es una secuencia de ADN de la 3' UTR, T-Os.LTP:1, derivada del gen similar a la Proteína de Transferencia de Lípidos (LTP) deOryza sativa.
La SEQ ID NO:49 es una secuencia codificante para la proteína fluorescente de luciferasa NanoLuc® (Promega, Madison, WI 53711), Nluc, que fue diseñada por evolución dirigida a partir de luciferasa de camarón de mar profundo(Oplophorus gracilirostris).
La SEQ ID NO:50 es una secuencia de ADN del EXP, EXP-At.Bglu21+At.Cyco:2, que comprende el promotor y líder de un gen 21 de beta-glucuronidasa deArabidopsis thaliana,unido operativamente 5' al intrón, I-At.Cyco-1:1:1. La SEQ ID NO:51 es una secuencia de ADN del EXP, EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3, que comprende un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor potenciado, unido operativamente 5' al líder del gen 70 de la proteína de choque térmico 70 (HSP70) dePetunia x hybrida.
La SEQ ID NO:52 es una secuencia de ADN del EXP, EXP-Gm.Sphas1:1:1, que comprende el promotor y líder del gen 7S alfa prima de la soja.
La SEQ ID NO:53 es una secuencia de ADN del EXP, EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1, que comprende un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor potenciado, unido operativamente 5' al intrón, I-Zm.DnaK:1.
La SEQ ID NO:54 es una secuencia de ADN que codifica una proteína de luciferasa (LUCIFERASE:1:3) derivada dePhotinus pyralis(luciérnaga).
La SEQ ID NO:55 es una secuencia de ADN de la 3' UTR, T-AGRtu.nos-1:1:13, derivada del gen de nopalina sintasa deAgrobacterium tumefaciens.
La SEQ ID NO:56 es una secuencia de ADN del EXP, EXP-CaMV.35S-enh-Lhcb1, que comprende un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor potenciado, unido operativamente 5' al líder de un gen de unión de clorofila a/b del complejo de captación de luz deTriticum aestivum(trigo).
La SEQ ID NO:57 es una secuencia de ADN que codifica una proteína de luciferasa (CR-Ren.hRenilla Lucife-0:0:1) derivada deRenilla reniformis(Pensamiento del Mar).
Descripción detallada de la invención
La invención proporciona elementos reguladores sintéticos que tienen actividad reguladora génica en plantas. Las secuencias de nucleótidos de estos elementos reguladores sintéticos se proporcionan como SEQ ID<n>O:1-3. Estos elementos reguladores sintéticos son capaces afectar la expresión de una molécula de ADN transcribible unida operativamente en tejidos de planta y, por lo tanto, regular la expresión génica de un transgén unido operativamente en plantas transgénicas. La invención también proporciona procedimientos para modificar, producir y utilizar moléculas de ADN recombinante que contienen los elementos reguladores sintéticos proporcionados. La invención también proporciona composiciones que incluyen células de plantas, plantas, partes de plantas y semillas transgénicas que contienen las moléculas de ADN recombinante de la invención, y procedimientos para prepararlas y utilizarlas.
Las siguientes definiciones y procedimientos se brindan con el objeto de definir mejor la presente invención y de guiar a las personas con capacitación ordinaria en la técnica en la práctica de la presente invención. A menos que se indique otra cosa, los términos deberán interpretarse de conformidad con el uso convencional por parte de las personas con capacitación ordinaria en la técnica relevante.
Moléculas de ADN
Tal como se utiliza en la presente descripción, el término “ADN” o “molécula de ADN” se refiere a una molécula de ADN de doble hebra de origen genómico o sintético, es decir, un polímero de bases de desoxirribonucleótidos o una molécula de ADN, leídos del extremo 5' (corriente arriba) al extremo 3' (corriente abajo). Tal como se utiliza en la presente descripción, el término “secuencia de ADN” se refiere a la secuencia de nucleótidos de una molécula de ADN. La nomenclatura usada en la presente descripción corresponde a la detallada en el Título 37 del Código de Regulaciones Federales de los Estados Unidos § 1.822, y que está detallada en las tablas del Estándar ST.25 de la WIPO (Organización Mundial de la Propiedad Intelectual) (1998), Apéndice 2, Tablas 1 y 3.
Tal como se utiliza en la presente descripción, una “molécula de ADN recombinante” es una molécula de ADN que comprende una combinación de moléculas de ADN que no aparecerían juntas de manera natural sin la intervención humana. Por ejemplo, una molécula de ADN recombinante puede ser una molécula de ADN compuesta de por lo menos dos moléculas de ADN heterólogas entre sí, una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN que se desvía las secuencias de ADN que existen en la naturaleza, una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN sintético o una molécula de ADN que ha sido incorporada en el ADN de una célula hospedante por transformación genética o edición génica.
Tal como se utiliza en la presente descripción, una "secuencia de nucleótidos sintética" o “secuencia de nucleótidos artificial” es una secuencia de nucleótidos cuya existencia en la naturaleza se desconoce, que no es natural o que no sucede sin la intervención humana. Los elementos reguladores génicos de la presente invención comprenden secuencias de nucleótidos sintéticas. Preferiblemente, las secuencias de nucleótidos sintéticas comparten escasa o nula homología extendida con las secuencias naturales. Homología extendida, en este contexto, se refiere en general a identidad de secuencia del 100% que se extiende hasta más de aproximadamente 25 nucleótidos de la secuencia contigua.
La referencia en esta solicitud a una “molécula de ADN aislada” o un término o expresión equivalente, pretende significar que la molécula de ADN es una que se presenta sola o en combinación con otras composiciones, pero no dentro de su ambiente natural. Por ejemplo, los elementos de ácidos nucleicos tales como una secuencia codificante, secuencia de intrón, secuencia de líder no traducida, secuencia de promotor, secuencia de la terminación de la transcripción, y similares, que se encuentran naturalmente dentro del ADN del genoma de un organismo no se consideran “aislados” en tanto el elemento esté dentro del genoma del organismo y en la ubicación dentro del genoma en la que se encuentra naturalmente. Sin embargo, cada uno de estos elementos, y las subpartes de estos elementos, se considerarían “aislados” dentro del alcance de esta revelación, si el elemento no está dentro del genoma del organismo y en la ubicación dentro del genoma en la que se encuentra naturalmente. En una forma de realización, el término “aislada” se refiere a una molécula de ADN que está por lo menos parcialmente separada de algunos de los ácidos nucleicos que normalmente flanquean a la molécula de ADN en su estado nativo o natural. Por consiguiente, las moléculas de ADN fusionadas a secuencias reguladoras o codificantes con las cuales normalmente no están asociadas, por ejemplo, como resultado de técnicas recombinantes, se consideran aisladas en la presente descripción. Tales moléculas son consideradas aisladas cuando están integradas en el cromosoma de una célula hospedante o presentes en una solución de ácido nucleico con otras moléculas de ADN, por el hecho de no encontrarse en su estado nativo. A los fines de esta revelación, cualquier secuencia de nucleótidos transgénica, es decir, la secuencia de nucleótidos del ADN insertado en el genoma de las células de una planta o bacteria, o presente en un vector extracromosómico, sería considerada una secuencia de nucleótidos aislada, sea que esté presente dentro del plásmido o estructura similar usada para transformar las células, dentro del genoma de la planta o bacteria, o presente en cantidades detectables en tejidos, progenie, muestras biológicas o productos básicos derivados de la planta o bacteria.
Tal como se utiliza en la presente descripción, el término “identidad de secuencia” se refiere al grado en que dos secuencias de polinucleótidos óptimamente alineadas o dos secuencias de polipéptidos óptimamente alineadas son idénticas. Un alineamiento de secuencia óptimo se genera alineando manualmente dos secuencias, por ejemplo, una secuencia de referencia y otra secuencia, para maximizar el número de aciertos de nucleótidos en el alineamiento de secuencia con inserciones, deleciones o huecos de nucleótidos internos apropiados. Tal como se utiliza en la presente descripción, el término “secuencia de referencia” se refiere a una secuencia de ADN provista como SEQ iD NO:1-3.
Tal como se utiliza en la presente descripción, el término “porcentaje de identidad de secuencia” o “porcentaje de identidad” o “% de identidad” es la fracción de identidad multiplicada por 100. La “fracción de identidad” para una secuencia óptimamente alineada con una secuencia de referencia es el número de aciertos de nucleótidos en el alineamiento óptimo, dividido por el número total de nucleótidos en la secuencia de referencia, por ejemplo, el número total de nucleótidos en toda la longitud de la secuencia de referencia completa. Por consiguiente, una forma de realización de la invención proporciona una molécula de ADN que comprende una secuencia que, cuando se alinea óptimamente con una secuencia de referencia provista en la presente descripción como cualquiera de SEQ ID NO:1-3, tiene por lo menos aproximadamente 85% de identidad, por lo menos aproximadamente 86% de identidad, por lo menos aproximadamente 87% de identidad, por lo menos aproximadamente 88% de identidad, por lo menos aproximadamente 89% de identidad, por lo menos aproximadamente 90% de identidad, por lo menos aproximadamente 91% de identidad, por lo menos aproximadamente 92% de identidad, por lo menos aproximadamente 93% de identidad, por lo menos aproximadamente 94% de identidad, por lo menos aproximadamente 95% de identidad, por lo menos aproximadamente 96% de identidad, por lo menos aproximadamente 97% de identidad, por lo menos aproximadamente 98% de identidad, por lo menos aproximadamente 99% de identidad, o por lo menos aproximadamente 100% de identidad con la secuencia de referencia. En otras formas de realización específicas adicionales, una secuencia que tiene un porcentaje de identidad con cualquiera de SEQ ID NO:1-3 puede ser definida como una que exhibe actividad promotora poseída por la secuencia de partida de la que deriva. Una secuencia que tiene un porcentaje de identidad con cualquiera de SEQ ID NO:1-3 puede comprender además un “promotor mínimo” que proporciona un nivel basal de transcripción y está compuesto de una caja TATA o secuencia equivalente para el reconocimiento y la unión del complejo de ARN polimerasa II para la iniciación de la transcripción.
Elementos reguladores
Los elementos reguladores tales como promotores, líderes (también conocidos como 5' UTR), potenciadores, intrones y regiones de terminación de la transcripción (o 3' UTR) cumplen una función integral en la expresión general de genes en células vivas. El término “elemento regulador”, tal como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una molécula de ADN que tiene actividad reguladora génica. El término “actividad reguladora génica”, tal como se utiliza en la presente descripción, se refiere a la capacidad de afectar la expresión de una molécula de ADN transcribible unida operativamente, por ejemplo, afectando la transcripción y/o traducción de la molécula de ADN transcribible unida operativamente. Los elementos reguladores, tales como promotores, líderes, potenciadores, intrones y 3' UTR, que funcionan en plantas son útiles para modificar fenotipos de plantas a través de ingeniería genética.
Tal como se utiliza en la presente descripción, una secuencia de “grupo de elementos de expresión reguladora” o “EXP” puede referirse a un grupo de elementos reguladores unidos operativamente, tales como potenciadores, promotores, líderes e intrones. Por ejemplo, un grupo de elementos de expresión reguladora puede estar compuesto, por ejemplo, por un promotor unido operativamente 5' a una secuencia de líder. Los EXP útiles en la práctica de la presente invención incluyen SEQ ID NO: 1.
Los elementos reguladores pueden ser caracterizados por su patrón de expresión génica, por ejemplo, efectos positivos y/o negativos tales como expresión constitutiva o expresión temporal, espacial, del desarrollo, tisular, ambiental, fisiológica, patológica, del ciclo celular y/o químicamente responsiva, y cualquier combinación de estas, así como por indicios cuantitativos o cualitativos. Tal como se utiliza en la presente descripción, un “patrón de expresión génica” es cualquier patrón de transcripción de una molécula de ADN unida operativamente en una molécula de ARN transcripto. La molécula de ARN transcripto puede ser traducida para producir una molécula de proteína o puede proporcionar una molécula de ARN antisentido u otra molécula de ARN regulador, tal como un ARN bicatenario (ARNbc), un ARN de transferencia (ARNt), un ARN ribosómico (ARNr), un microARN (miARN), y lo similar.
Tal como se utiliza en la presente descripción, el término “expresión de proteína” es cualquier patrón de traducción de una molécula de ARN transcripto en una molécula de proteína. La expresión de proteína puede ser caracterizada por sus cualidades temporales, espaciales, de desarrollo o morfológicas, así como por indicios cuantitativos o cualitativos.
Un promotor es útil como elemento regulador para modular la expresión de una molécula de ADN transcribible unida operativamente. Tal como se utiliza en la presente descripción, el término “promotor” se refiere en general a una molécula de ADN implicada en el reconocimiento y la unión de ARN polimerasa II y otras proteínas, como los factores de transcripción de actuación en trans, para iniciar la transcripción. Un promotor puede ser aislado inicialmente de la región no traducida 5' (5' UTR) de una copia genómica de un gen. Alternativamente, los promotores pueden ser moléculas de ADN producidas o manipuladas sintéticamente. Los promotores también pueden ser quiméricos. Los promotores quiméricos son producidos por la fusión de dos o más moléculas de ADN heterólogas. Los promotores útiles en la práctica de la presente invención incluyen elementos promotores comprendidos dentro de la SEQ ID NO: 2 o sus fragmentos o variantes. En formas de realización específicas de la invención, las moléculas de ADN reivindicadas y cualquiera de sus variantes o derivados revelados en la presente descripción, se definen además por comprender actividad promotora, es decir, son capaces de actuar como un promotor en una célula hospedante, tal como en una planta transgénica. En otras formas de realización específicas adicionales, un fragmento puede ser definido por exhibir actividad promotora poseída por la molécula promotora inicial de la cual deriva, o un fragmento puede comprender un “promotor mínimo” que proporciona un nivel basal de transcripción y está compuesto de una caja TATA o secuencia de ADN equivalente para el reconocimiento y la unión del complejo de ARN polimerasa II para la iniciación de la transcripción.
En una forma de realización, se proporcionan fragmentos de una secuencia de promotor revelada en la presente descripción. Los fragmentos de promotor pueden comprender actividad promotora, como se describió anteriormente, y pueden ser útiles por sí solos o en combinación con otros promotores y fragmentos de promotor, tal como en la construcción de promotores quiméricos, o en combinación con otros elementos de expresión y fragmentos de elementos de expresión. En formas de realización específicas, se proporcionan fragmentos de un promotor que comprenden por lo menos aproximadamente 50, por lo menos aproximadamente 75, por lo menos aproximadamente 95, por lo menos aproximadamente 100, por lo menos aproximadamente 125, por lo menos aproximadamente 150, por lo menos aproximadamente 175, por lo menos aproximadamente 200, por lo menos aproximadamente 225, por lo menos aproximadamente 250, por lo menos aproximadamente 275, por lo menos aproximadamente 300, por lo menos aproximadamente 500, por lo menos aproximadamente 600, por lo menos aproximadamente 700, por lo menos aproximadamente 750, por lo menos aproximadamente 800, por lo menos aproximadamente 900, o por lo menos aproximadamente 1000 nucleótidos contiguos, o más largos, de una molécula de ADN que tiene actividad promotora como se revela en la presente descripción. En determinadas formas de realización, la invención proporciona fragmentos de un promotor proporcionado en la presente descripción, que tiene la actividad de la secuencia de longitud completa. Los procedimientos para producir dichos fragmentos a partir de una molécula promotora inicial son bien conocidos en la técnica.
Las composiciones derivadas de cualquiera de los elementos promotores comprendidos dentro de cualquiera de SEQ ID NO:2, 5, 13, 20, 25, 27, 31 y 39, tal como deleciones internas o 5', por ejemplo, pueden ser producidas por el uso de procedimientos conocidos en la técnica para mejorar o modificar la expresión, que incluyen la remoción de elementos que tienen efectos positivos o negativos sobre la expresión; la duplicación de elementos que tienen efectos positivos o negativos sobre la expresión; y/o la duplicación o remoción de elementos que tienen efectos específicos del tejido o de la célula sobre la expresión. Las composiciones derivadas de cualquiera de los elementos promotores comprendidos dentro de cualquiera de SEQ ID NO:2, 5, 13, 20, 25, 27, 31 y 39 compuestos de deleciones 3' en las que está eliminado el elemento de caja TATA o su secuencia equivalente y la secuencia corriente abajo se pueden usar, por ejemplo, para elaborar elementos potenciadores. Se pueden hacer deleciones adicionales para eliminar todos los elementos que tienen efectos positivos o negativos, específicos del tejido, específicos de la célula o específicos del ritmo (tal como, sin ser limitativo, el ritmo circadiano) sobre la expresión. Cualquiera de los elementos promotores comprendidos dentro de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 5, 13, 20, 25, 27, 31 y 39 y fragmentos o potenciadores derivados de los mismos pueden usarse para elaborar composiciones quiméricas de elementos reguladores de la transcripción.
De acuerdo con la invención, un promotor o fragmento de promotor puede ser analizado para determinar la presencia de elementos promotores conocidos, es decir, características de la secuencia de ADN, tales como una caja TATA y otros motivos de sitios de unión de factores de transcripción conocidos. La identificación de tales elementos promotores conocidos puede ser utilizada por la persona experta en la técnica para el diseño de variantes del promotor que tengan un patrón de expresión similar al promotor original.
Tal como se utiliza en la presente descripción, el término “líder” se refiere a una molécula de ADN aislada del gen de región no traducida 5' (5' UTR) y definida en general como un segmento de nucleótidos entre el sitio de inicio de la transcripción (TSS, por sus siglas en inglés) y el sitio de inicio de la secuencia codificante de proteína. Alternativamente, los líderes pueden ser elementos de ADN producidos o manipulados sintéticamente. Un líder puede ser utilizado como elemento regulador 5' para modular la expresión de una molécula de ADN transcribible unida operativamente. Las moléculas de líder pueden ser usadas con un promotor heterólogo o con su promotor nativo. Los líderes útiles en la práctica de la presente invención incluyen SEQ ID NO:3, 6, 14, 21, 28, 32 y 40; o cualquiera de los elementos líderes comprendidos dentro de cualquiera de SEQ ID NO:1, 4, 7, 8, 10, 12, 15, 16, 18, 19, 22, 23, 26, 30, 43 y 45 o fragmentos o variantes de los mismos. En formas de realización específicas, dichas secuencias de ADN pueden ser definidas como capaces de actuar como un líder en una célula hospedante, que incluye, por ejemplo, una célula de planta transgénica. En una forma de realización, dichas secuencias son decodificadas como que comprenden actividad de líder.
Las secuencias líderes (también denominadas 5' UTR) presentadas como SEQ ID NO:3, 6, 14, 21, 28, 32 y 40 o cualquiera de los elementos líderes comprendidos dentro de cualquiera de SEQ ID NO:1, 4, 7, 8, 10, 12, 15, 16, 18, 19, 22, 23, 26, 30 y 43 pueden estar compuestos de elementos reguladores, o pueden adoptar estructuras secundarias que pueden tener efecto en la transcripción o traducción de una molécula de ADN transcribible unida operativamente. Las secuencias líderes presentadas como SEQ ID NO:3, 6, 14, 21, 28, 32 y 40 o cualquiera de los elementos líderes comprendidos dentro de cualquiera de SEQ ID NO:1, 4, 7, 8, 10, 12, 15, 16, 18, 19, 22, 23, 26, 30, 43 y 45 pueden usarse de acuerdo con la invención para preparar los elementos reguladores quiméricos que afectan la transcripción o traducción de una molécula de ADN transcribible unida operativamente.
Tal como se utiliza en la presente descripción, el término “intrón” se refiere a una molécula de ADN que puede ser aislada o identificada a partir de un gen y puede definirse en general como una región cortada y empalmada durante el procesamiento de ARN mensajero (ARNm) antes de la traducción. Alternativamente, un intrón puede ser un elemento de ADN producido o manipulado sintéticamente. Un intrón puede contener elementos potenciadores que efectúan la transcripción de genes unidos operativamente. Un intrón puede ser usado como elemento regulador para modular la expresión de una molécula de ADN transcribible unida operativamente. Una construcción puede comprender un intrón, y el intrón puede ser heterólogo, o no, con respecto a la molécula de ADN transcribible. Ejemplos de intrones conocidos en la técnica incluyen el intrón de actina del arroz y el intrón de HSP70 de maíz.
En las plantas, la inclusión de algunos intrones en las construcciones génicas genera un incremento de ARNm y acumulación de proteína con respecto a las construcciones que carecen del intrón. Este efecto ha sido denominado “potenciación mediada por intrones” (IME, por sus siglas en inglés) de la expresión génica. Se han identificado intrones que, se sabe, estimulan la expresión en plantas en genes de maíz (por ejemplo, tubA1, Adh1, Sh1 y Ubi1), en genes de arroz (por ejemplo, tpi) y en genes de plantas dicotiledóneas, como aquellos de petunia (por ejemplo, rbcS), papa (por ejemplo, st-ls1) y deArabidopsis thaliana(por ejemplo, ubq3 y pat1). Se ha demostrado que las deleciones o mutaciones dentro de los sitios de empalme de un intrón reducen la expresión génica, lo que indica que el corte y empalme podría ser necesario para IME. Sin embargo, IME en plantas dicotiledóneas ha sido mostrada por mutaciones puntuales dentro de los sitios de corte y empalme del gen pat1 deA. thaliana.Se ha demostrado que el uso múltiple del mismo intrón en una planta exhibe desventajas. En esos casos, es necesario tener una colección de elementos de control básicos para la construcción de elementos de ADN recombinante apropiados. Intrones representativos útiles en la práctica de la presente invención se presentan como SEQ ID NO:9, 11, 17, 33 y 41.
Tal como se utiliza en la presente descripción, los términos “molécula de terminación de la transcripción 3'”, “región no traducida 3'” o “3' UTR” se refieren a una molécula de ADN que se usa durante la transcripción a la región no traducida de la porción 3' de una molécula de ARNm. La región no traducida 3' de una molécula de ARNm puede ser generada mediante escisión específica y poliadenilación 3', también conocida como cola poliA. Una 3' UTR puede estar unida operativamente y ubicada corriente abajo de una molécula de ADN transcribible y puede incluir una señal de poliadenilación y otras señales reguladoras capaces de afectar la transcripción, el procesamiento de ARNm o la expresión génica. Se cree que las colas poliA funcionan en la estabilidad del ARNm y en la iniciación de la traducción. Ejemplos de moléculas de terminación de la transcripción 3' en la técnica son la región 3' de la nopalina sintasa; la región 3' de la hsp17 del trigo, la región 3' de la subunidad pequeña de rubisco del guisante, la región 3' de la E6 del algodón y la 3' UTR de la coixina.
Las 3' UTR típicamente resultan de utilidad beneficiosa para la expresión recombinante de moléculas de ADN específicas. Una 3' UTR débil tiene el potencial de generar ultralectura, que puede afectar la expresión de la molécula de ADN ubicada en los casetes de expresión vecinos. El control apropiado de la terminación de la transcripción puede prevenir la ultralectura en secuencias de ADN (por ejemplo, otros casetes de expresión) que se localizan corriente abajo y además pueden permitir el reciclado eficiente de la ARN polimerasa para mejorar la expresión génica. La terminación eficiente de la transcripción (liberación de la ARN polimerasa II del ADN) es un requisito previo para la reiniciación de la transcripción y, de ese modo, afecta directamente el nivel general de transcripción. Luego de la terminación de la transcripción, el ARNm maduro es liberado del sitio de síntesis y transportado en plantilla al citoplasma. Los ARNm eucariotas se acumulan como formas poli(A)in vivo,dificultando la detección de los sitios de terminación de la transcripción por procedimientos convencionales. Sin embargo, la predicción de 3' UTR funcional y eficiente a través de procedimientos de bioinformática es difícil, dado que no hay secuencias de ADN conservadas que permitan la fácil predicción de una 3' UTR eficiente.
Desde un punto de vista práctico, suele ser beneficioso que una 3' UTR usada en un casete de expresión posea las siguientes características. En primer lugar, la 3' UTR debería ser capaz de terminar en forma eficiente y efectiva la transcripción del transgén y prevenir la ultralectura del transcripto en la secuencia de ADN vecina, que puede comprender otro casete de expresión como en el caso de los casetes de expresión múltiples que residen en un ADN de transferencia (ADN-T), o el ADN cromosómico vecino en el que se ha insertado el ADN-T. En segundo lugar, la 3' UTR no debería causar una reducción de la actividad transcripcional impartida por el promotor, líder, potenciadores e intrones que se utilizan para conducir la expresión de la molécula de a Dn . Por último, en la biotecnología de plantas, la 3' UTR a menudo es utilizada para cebar reacciones de amplificación de ARN transcripto reverso extraído de la planta transformada, y se usa para: (1 ) comprobar la actividad transcripcional o la expresión del casete de expresión una vez integrado en el cromosoma de la planta; (2) confirmar el número de copias de inserciones dentro del ADN de la planta; y (3) confirmar la cigosidad de la semilla resultante después de la reproducción. La 3' UTR también se usa en reacciones de amplificación de ADN extraído de la planta transformada para caracterizar la integridad del casete insertado. Una 3' UTR útil en la práctica de la presente invención es presentada como SEQ ID NO:29, 34, 35, 36, 37 y 44.
Tal como se utiliza en la presente descripción, el término “potenciador” o “elemento potenciador” se refiere a un elemento regulador de actuación encis,también denominado elementocis,que confiere un aspecto del patrón de expresión general, pero que usualmente es insuficiente por sí solo para manejar la transcripción, de una molécula de<a>D<n>transcribible unida operativamente. A diferencia de los promotores, los elementos potenciadores en general no incluyen un sitio de inicio de la transcripción (TSS) o caja TATA o secuencia de ADN equivalente. Un promotor o fragmento de promotor puede comprender naturalmente uno o varios elementos potenciadores que afectan la transcripción de una secuencia de<a>D<n>unida operativamente. Un elemento potenciador también puede fusionarse a un promotor para producir un elementocisde promotor quimérico, que confiere un aspecto de la modulación general de la expresión génica. Un ejemplo de un elemento potenciador derivado del promotor sintético, P-At.GSP571.nno:5 (SEQ ID NO:5), es proporcionado como SEQ ID NO:24 (E-At.GSP571.nno:1).
Se considera que muchos elementos potenciadores promotores se unen a proteínas de unión a ADN y/o afectan la topología del ADN, produciendo conformaciones locales que permiten o restringen de manera selectiva el acceso de la ARN polimerasa a la plantilla de ADN o que facilitan la apertura selectiva de la doble hélice en el sitio de iniciación de la transcripción. Un elemento potenciador puede funcionar uniendo factores de la transcripción que regulan la transcripción. Algunos elementos potenciadores unen más de un factor de la transcripción, y los factores de la transcripción pueden interactuar con afinidades diferentes con más de un dominio potenciador. Los elementos potenciadores pueden ser identificados a través de una serie de técnicas, que incluyen el análisis de las deleciones, es decir, deleción de uno o varios nucleótidos del extremo 5' o internos a un promotor; análisis de las proteínas de unión a ADN usando huella de ADNasa I; interferencia por metilación; ensayos de cambio de movilidad electroforética; huella genómicain vivopor reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediada por ligación; y otros ensayos convencionales o por análisis de similitud de secuencias de ADN que usa motivos de elementosciso elementos potenciadores conocidos, como secuencia diana o motivo diana con procedimientos de comparación de secuencias de ADN convencionales, tales como BLAST. La estructura fina de un dominio potenciador puede ser estudiada adicionalmente por mutagénesis (o sustitución) de uno o varios nucleótidos o por otros procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Los elementos potenciadores pueden obtenerse por síntesis química o por aislamiento a partir de elementos reguladores que incluyen tales elementos, y pueden ser sintetizados con nucleótidos flanqueantes adicionales que contienen sitios de enzimas de restricción útiles para facilitar la manipulación de las subsecuencias. Por consiguiente, el diseño, la construcción y el uso de elementos potenciadores de acuerdo con los procedimientos revelados en la presente descripción para modular la expresión de moléculas de ADN transcribibles unidas operativamente están contemplados por la invención. Un potenciador representativo útil en la práctica de esta invención está presentado como SEQ ID NO:24.
Tal como se utiliza en la presente descripción, el término “quimérica” se refiere a una molécula de ADN individual producida por la fusión de una primera molécula de ADN a una segunda molécula de ADN, donde ni la primera ni la segunda molécula de ADN se hallarían normalmente en dicha configuración, es decir, fusionada a la otra. La molécula de ADN quimérica es, por consiguiente, una nueva molécula de ADN que de otro modo no se encontraría normalmente en la naturaleza. Tal como se utiliza en la presente descripción, el término “promotor quimérico” se refiere a un promotor producido mediante dicha manipulación de moléculas de ADN. Un promotor quimérico puede combinar dos o más fragmentos de ADN, por ejemplo, la fusión de un promotor a un elemento potenciador. Por consiguiente, el diseño, la construcción y el uso de promotores quiméricos de acuerdo con los procedimientos revelados en la presente descripción para modular la expresión de moléculas de ADN transcribibles unidas operativamente están contemplados por la presente invención. Un promotor quimérico representativo está presentado en la presente descripción como SeQ ID NO:25 (P-At.GSP571/442).
Los elementos reguladores quiméricos pueden estar diseñados para comprender varios elementos constituyentes que pueden ser unidos operativamente a través de varios procedimientos conocidos en la técnica, tales como la digestión y ligación con enzimas de restricción, la clonación independiente de la ligación, el ensamblado modular de productos de PCR durante la amplificación o la síntesis química directa del elemento regulador, así como otros procedimientos conocidos en la técnica. Los diversos elementos reguladores quiméricos resultantes pueden estar compuestos de los mismos, o de variantes de los mismos, elementos constituyentes, pero diferir en la secuencia de ADN o secuencias de ADN que comprenden la secuencia o secuencias de ADN de unión que permiten unir operativamente las partes constituyentes. En la invención, las secuencias de ADN provistas como SEQ ID NO:1-32 y SEQ ID NO:43-45 pueden proporcionar secuencias de referencia de elementos reguladores, en donde los elementos constituyentes que comprenden la secuencia de referencia pueden ser unidos por procedimientos conocidos en la técnica y pueden comprender sustituciones, deleciones y/o inserciones de uno o varios nucleótidos o mutaciones que suceden naturalmente en la transformación de células bacterianas y vegetales.
Tal como se utiliza en la presente descripción, el término “variante” se refiere a una segunda molécula de ADN, tal como un elemento regulador, que se encuentra en composición similar, aunque no idéntica, a una primera molécula de ADN, y en donde la segunda molécula de ADN aún mantiene la funcionalidad general, es decir, el mismo patrón de expresión, o similar, por ejemplo, a través de la actividad transcripcional más o menos equivalente, de la primera molécula de ADN. Una variante puede ser una versión más corta o truncada de la primera molécula de ADN o una versión alterada de la secuencia de la primera molécula de ADN, tal como una con sitios de enzimas de restricción diferentes y/o deleciones, sustituciones o inserciones internas. Una “variante” también puede abarcar un elemento regulador que tiene una secuencia de nucleótidos que comprende una sustitución, deleción o inserción de uno o varios nucleótidos de una secuencia de referencia, en donde el elemento regulador derivado tiene actividad de transcripción o traducción más o menos o equivalente que la correspondiente molécula reguladora progenitora. En la presente invención, se puede usar una secuencia de polinucleótidos provista como SEQ ID nO:1-32 y SEQ ID NO:43-45 para crear variantes que son similares en composición, aunque no idénticas, a la secuencia de ADN del elemento regulador original, manteniendo al mismo tiempo la funcionalidad general, es decir, el mismo patrón de expresión, o similar, que el elemento regulador original. La producción de dichas variantes de la invención está comprendida dentro del conocimiento de rutina de las personas con capacitación general en la técnica, a la luz de la revelación y está comprendida dentro del alcance de la invención.
La eficacia de las modificaciones, duplicaciones o deleciones descriptas en la presente descripción sobre los aspectos de expresión deseados de un transgén particular puede ser evaluada empíricamente en ensayos estables y transitorios en plantas, como los que se describen en los ejemplos de trabajo, a fin de validar los resultados, que pueden variar conforme a los cambios efectuados y al objetivo del cambio en la molécula de ADN inicial.
Construcciones
Tal como se utiliza en la presente descripción, el término “construcción” se refiere a cualquier molécula de ADN recombinante tal como un plásmido, cósmido, virus, fago o molécula de ADN o ARN lineal o circular, derivada de cualquier fuente, capaz de integración genómica o replicación autónoma, que comprende una molécula de ADN donde por lo menos una molécula de ADN ha sido ligada a otra molécula de a Dn de manera funcionalmente operativa, es decir, está unida operativamente. Tal como se utiliza en la presente descripción, el término “vector” se refiere a cualquier construcción que puede ser usada con el objeto de la transformación, es decir, la introducción de ADN o ARN heterólogo en una célula hospedante. Una construcción típicamente incluye uno o varios casetes de expresión. Tal como se utiliza en la presente descripción, un “casete de expresión” se refiere a una molécula de ADN que comprende por lo menos una molécula de a Dn transcribible unida operativamente a uno o varios elementos reguladores, típicamente por lo menos un promotor y una 3' UTR.
Tal como se utiliza en la presente descripción, el término “unida operativamente” se refiere a una primera molécula de ADN unida a una segunda molécula de ADN, en donde las primera y segunda moléculas de ADN están dispuestas en forma tal que la primera molécula de ADN afecta la función de la segunda molécula de ADN. Las dos moléculas de ADN pueden formar parte, o no, de una única molécula de ADN contigua y pueden ser, o no, adyacentes. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una molécula de ADN transcribible si el promotor modula la transcripción de la molécula de ADN transcribible de interés en una célula. Un líder, por ejemplo, está unido operativamente a la secuencia de ADN cuando es capaz de afectar la transcripción o traducción de la secuencia de ADN.
En una forma de realización, las construcciones de la invención pueden ser proporcionadas como construcciones de doble flanco de plásmido inductor de tumor (Ti) que tienen las regiones de flanco derecho (RB o AGRtu.RB) y de flanco izquierdo (LB o AGRtu.LB) del plásmido Ti aislado deAgrobacterium tumefaciensque comprende un<a>DN-T que, junto con las moléculas de transferencia proporcionadas por las células deA. tumefaciens,permiten la integración del ADN-T en el genoma de una célula de planta (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 6.603.061). Las construcciones también pueden contener los segmentos de ADN del esqueleto del plásmido que proporcionan la función de replicación y la selección de antibióticos en las células bacterianas, por ejemplo, un origen de replicación deEscherichia colital como ori322, un origen de replicación de amplio rango de hospedantes tal como oriV u oriRi, y una región codificante para un marcador seleccionable tal como Spec/Strp que codifica la Tn7 aminoglucósido adeniltransferasa(aadA)que confiere la resistencia a espectinomicina o estreptomicina o un gen marcador seleccionable de gentamicina (Gm, Gent). Para la transformación de plantas, la cepa bacteriana hospedante generalmente esA. tumefaciensABI, C58 o LBA4404, aunque en la invención pueden funcionar otras cepas conocidas por los expertos en la técnica de la transformación de plantas.
En la técnica son conocidos los procedimientos para ensamblar e introducir construcciones en una célula en forma tal que la molécula de ADN transcribible es transcripta a una molécula de ARNm funcional que es traducida y expresada como una proteína. Para la práctica de la invención, las composiciones y procedimientos convencionales para preparar y usar construcciones y células hospedantes son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los vectores típicos útiles para la expresión de ácidos nucleicos en plantas superiores son bien conocidos en la técnica e incluyen vectores derivados del plásmido Ti deAgrobacterium tumefaciensy el vector de control de transferencia de pCaMVCN.
Se pueden incluir varios elementos reguladores en una construcción, incluyendo cualquiera de los proporcionados en la presente descripción. Cualquiera de tales elementos reguladores puede ser proporcionado en combinación con otros elementos reguladores. Tales combinaciones pueden ser diseñadas o modificadas para producir rasgos reguladores deseables. En una forma de realización, las construcciones de la invención comprenden por lo menos un elemento regulador unido operativamente a una molécula de ADN transcribible unida operativamente a una 3' UTR.
Las construcciones de la invención pueden incluir cualquier promotor o líder proporcionado en la presente descripción o conocido en la técnica. Por ejemplo, un promotor de la invención puede ser unido operativamente a un líder heterólogo no traducido 5' tal como uno derivado de un gen de proteína de choque térmico. Alternativamente, un líder de la invención puede ser unido operativamente a un promotor heterólogo tal como el promotor transcripto 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor.
Los casetes de expresión también pueden incluir una secuencia codificante de péptido de tránsito que codifica un péptido que es útil para el direccionamiento subcelular de una proteína unida operativamente, particularmente a un cloroplasto, leucoplasto u otra organela de plástido; mitocondria; peroxisoma; vacuola; o una localización extracelular. Muchas proteínas localizadas en cloroplastos son expresadas a partir de genes nucleares como precursores y son dirigidas al cloroplasto por un péptido de tránsito al cloroplasto (CTP, por sus siglas en inglés). Ejemplos de tales proteínas de cloroplasto aisladas incluyen, sin carácter limitativo, aquellas asociadas con la subunidad pequeña (SSU, por sus siglas en inglés) de ribulosa-1,5,-bisfosfato carboxilasa, ferredoxina, ferredoxina oxidorreductasa, proteína I y proteína II del complejo de captación de luz, tiorredoxina F y enolpiruvil shikimato fosfato sintasa (EPSPS). Los péptidos de tránsito al cloroplasto están descriptos, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 7.193.133. Ha sido demostrado que las proteínas no cloroplásticas puede ser dirigidas al cloroplasto a través de la expresión de un CTP heterólogo unido operativamente al transgén que codifica una proteína no cloroplástica.
Moléculas de ADN transcribibles
Tal como se utiliza en la presente descripción, el término “molécula de ADN transcribible” se refiere a cualquier molécula de ADN capaz de ser transcripta en una molécula de ARN, que incluye, sin limitaciones, aquellas que tienen secuencias codificantes de proteínas y aquellas que producen moléculas de ARN que tienen secuencias útiles para la supresión de genes. El tipo de molécula de ADN puede incluir, sin limitaciones, una molécula de ADN de la misma planta, una molécula de ADN de otra planta, una molécula de ADN de un organismo diferente, o una molécula de ADN sintético, tal como una molécula de ADN que contiene un mensaje antisentido de un gen, o una molécula de ADN que codifica una versión artificial, sintética o modificada de algún otro modo, de un transgén. Las moléculas de ADN transcribibles representativas para su incorporación en construcciones de la invención incluyen, por ejemplo, moléculas de ADN o genes de una especie diferente de la especie en la que está incorporada la molécula de ADN o genes que se originan de la misma especie o que están presentes en la misma especie, pero que se incorporan en células receptoras mediante procedimientos de ingeniería genética en lugar de las técnicas de reproducción clásicas.
Un “transgén” se refiere a una molécula de ADN transcribible heteróloga de una célula hospedante por lo menos con respecto a su ubicación en el genoma de la célula hospedante y/o una molécula de ADN transcribible incorporada artificialmente en el genoma de una célula hospedante en la generación actual de la célula o en alguna precedente.
Un elemento regulador, tal como un promotor sintético de la invención, puede ser unido operativamente a una molécula de ADN transcribible heteróloga. Tal como se utiliza en la presente descripción, el término “heteróloga” se refiere a la combinación de dos o más moléculas de ADN cuando dicha combinación no se halla normalmente en la naturaleza. Por ejemplo, las dos moléculas de ADN pueden ser derivadas de especies diferentes y/o las dos moléculas de ADN pueden ser derivadas de genes diferentes, por ejemplo, genes diferentes de la misma especie o genes iguales de especies diferentes, o una de las moléculas de ADN podría ser sintética y no encontrarse en la naturaleza. Un elemento regulador es heterólogo con respecto a una molécula de a Dn transcribible unida operativamente si dicha combinación no se halla normalmente en la naturaleza, es decir, la molécula de ADN transcribible no aparece naturalmente unida al elemento regulador en forma operativa.
La molécula de ADN transcribible puede ser en general cualquier molécula de ADN para la que se desea la expresión de un transcripto. Dicha expresión de un transcripto puede resultar en la traducción de la molécula de ARNm resultante y, por ende, la expresión de la proteína. Alternativamente, por ejemplo, una molécula de ADN transcribible puede ser diseñada para provocar finalmente la disminución de la expresión de un gen o proteína específicos. En una forma de realización, esto se puede lograr usando una molécula de ADN transcribible orientada en la dirección antisentido. La persona con conocimientos de rutina en la técnica está familiarizada con el uso de la tecnología antisentido. De esta manera se puede regular negativamente cualquier gen y, en una forma de realización, se puede diseñar una molécula de ADN transcribible para la supresión de un gen específico a través de la expresión de una molécula de ARNbc, ARNip o miARN.
Por consiguiente, una forma de realización de la invención es una molécula de ADN recombinante que comprende un elemento regulador de la invención, tal como las que se proporcionan como SEQ ID NO:1-32 y SEQ ID NO:43-45, unido operativamente a una molécula de ADN transcribible heteróloga, de manera de modular la transcripción de la molécula de ADN transcribible a un nivel deseado o en un patrón deseado cuando la construcción es integrada al genoma de una célula de planta transgénica. En una forma de realización, la molécula de ADN transcribible comprende una región codificante de proteína de un gen y, en otra forma de realización, la molécula de ADN transcribible comprende una región antisentido de un gen.
Genes de interés agronómico
Una molécula de ADN transcribible puede ser un gen de interés agronómico. Tal como se utiliza en la presente descripción, el término “gen de interés agronómico” se refiere a una molécula de ADN transcribible que, cuando es expresada en un tejido, célula o tipo celular de planta particular confiere una característica deseable. El producto de un gen de interés agronómico puede actuar dentro de la planta con el objeto de provocar un efecto en la morfología, fisiología, crecimiento, desarrollo, rendimiento, composición del grano, perfil nutricional, resistencia a enfermedades o plagas, y/o tolerancia ambiental o química de la planta, o puede actuar como agente pesticida en la dieta de una plaga que se alimenta de la planta. En una forma de realización de la invención, un elemento regulador de la invención es incorporado en una construcción en forma tal que el elemento regulador se une operativamente a una molécula de ADN transcribible que es un gen de interés agronómico. En una planta transgénica que contiene dicha construcción, la expresión del gen de interés agronómico puede conferir un rasgo agronómico beneficioso. Un rasgo agronómico beneficioso puede incluir, por ejemplo, sin limitaciones, tolerancia a los herbicidas, control de insectos, rendimiento modificado, resistencia a enfermedades, resistencia a patógenos, crecimiento y desarrollo de la planta modificados, contenido de almidón modificado, contenido de aceite modificado, contenido de ácidos grasos modificado, contenido de proteína modificado, maduración del fruto modificada, nutrición animal y humana potenciada, producciones de biopolímeros, resistencia a los estreses ambientales, péptidos farmacéuticos, cualidades de procesamiento mejoradas, sabor mejorado, utilidad de producción de semillas híbridas, producción de fibras mejorada y producción de biocombustibles deseable.
Ejemplos de genes de interés agronómico conocidos en la técnica incluyen, sin carácter limitativo, aquellos para la resistencia a los herbicidas (Patentes de Estados Unidos No. 6.803.501, 6.448.476, 6.248.876, 6.225.114, 6.107.549, 5.866.775, 5.804.425, 5.633.435 y 5.463.175), rendimiento incrementado (Patentes de Estados Unidos No. USRE38.446, 6.716.474, 6.663.906, 6.476.295, 6.441.277, 6.423.828, 6.399.330, 6.372.211, 6.235.971, 6.222.098 y 5.716.837), control de insectos (Patentes de Estados Unidos No. 6.809.078, 6.713.063, 6.686.452, 6.657.046, 6.645.497, 6.642.030, 6.639.054, 6.620.988, 6.593.293, 6.555.655, 6.538.109, 6.537.756, 6.521.442, 6.501.009, 6.468.523, 6.326.351, 6.313.378, 6.284.949, 6.281.016, 6.248.536, 6.242.241, 6.221.649, 6.177.615, 6.156.573, 6.153.814, 6.110.464, 6.093.695, 6.063.756, 6.063.597, 6.023.013, 5.959.091, 5.942.664, 5.942.658.
5.880.275, 5.763.245 y 5.763.241), resistencia a las enfermedades fúngicas (Patentes de Estados Unidos No.
6.653.280, 6.573.361, 6.506.962, 6.316.407, 6.215.048, 5.516.671, 5.773.696, 6.121.436, 6.316.407 y 6.506.962), resistencia a los virus (Patentes de Estados Unidos No. 6.617.496, 6.608.241, 6.015.940, 6.013.864, 5.850.023 y 5.304.730), resistencia a los nematodos (Patente de Estados Unidos N.° 6.228.992), resistencia a las enfermedades bacterianas (Patente de Estados Unidos N^ 5.516.671), cultivo y desarrollo de plantas (Patentes de Estados Unidos No. 6.723.897 y 6.518.488), producción de almidón (Patentes de Estados Unidos No. 6.538.181, 6.538.179, 6.538.178, 5.750.876, 6.476.295), producción de aceites modificados (Patentes de Estados Unidos No. 6.444.876, 6.426.447 y 6.380.462), alta producción de aceites (Patentes de Estados Unidos No. 6.495.739, 5.608.149, 6.483.008 y 6.476.295), contenido de ácidos grasos modificado (Patentes de Estados Unidos No. 6.828.475, 6.822.141, 6.770.465, 6.706.950, 6.660.849, 6.596.538, 6.589.767, 6.537.750, 6.489.461 y 6.459.018), alta producción de proteínas (Patente de Estados Unidos N.° 6.380.466), maduración de los frutos (Patente de Estados Unidos N^ 5.512.466), nutrición animal y humana mejorada (Patentes de Estados Unidos No. 6.723.837, 6.653.530, 6.541.259, 5.985.605 y 6.171.640), biopolímeros (Patentes de Estados Unidos No. USRE37.543, 6.228.623, 5.958.745. y 6.946.588), resistencia a los estreses ambientales (Patente de Estados Unidos N^ 6.072.103), péptidos farmacéuticos y péptidos secretables (Patentes de Estados Unidos No. 6.812.379, 6.774.283, 6.140.075 y 6.080.560), características de procesamiento mejoradas (Patente de Estados Unidos N^ 6.476.295), digestibilidad mejorada (Patente de Estados Unidos N^ 6.531.648), baja rafinosa (Patente de Estados Unidos N^ 6.166.292), producción industrial de enzimas (Patente de Estados Unidos N^ 5.543.576), sabor mejorado (Patente de Estados Unidos N^ 6.011.199), fijación del nitrógeno (Patente de Estados Unidos 5.229.114), producción de semillas híbridas (Patente de Estados Unidos N^ 5.689.041), producción de fibras (Patentes de Estados Unidos No.
6.576.818, 6.271.443, 5.981.834 y 5.869.720) y producción de biocombustibles (Patente de Estados Unidos N^ 5.998.700).
Alternativamente, un gen de interés agronómico puede afectar las características o fenotipos antes mencionados de la planta mediante la codificación de una molécula de ARN que provoca la modulación dirigida de la expresión génica de un gen endógeno, por ejemplo, por antisentido (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 5.107.065); inhibición de ARN (“iARN”, que incluye la modulación de la expresión génica a través de mecanismos mediados por miARN, ARNip, ARNip de actuación entrans,ARNp en fases, por ejemplo, como se describe en las solicitudes publicadas U.S. 2006/0200878 y U.S. 2008/0066206, y en la solicitud de patente de Estados Unidos 11/974.469); o mecanismos mediados por cosupresión. El ARN también podría ser una molécula de ARN catalítico (por ejemplo, una ribozima o un riborregulador(riboswitchen inglés; véase, por ejemplo, U.S. 2006/0200878) diseñado para escindir un producto de ARNm endógeno deseado. En la técnica son conocidos los procedimientos para la construcción e introducción de construcciones en una célula en forma tal que la molécula de ADN transcribible sea transcripta en una molécula que es capaz de provocar la supresión génica.
Marcadores seleccionables
Con los elementos reguladores de la invención también pueden usarse transgenes marcadores seleccionables. Tal como se utiliza en la presente descripción, el término “transgén marcador seleccionable” se refiere a cualquier molécula de ADN transcribible cuya expresión en una planta, tejido o célula transgénica, o su ausencia, pueden ser detectadas selectivamente o calificadas de alguna manera. Los genes marcadores seleccionables y sus técnicas asociadas de selección y detección, para emplear en la práctica de la invención son conocidos en la técnica e incluyen, sin carácter limitativo, moléculas de ADN transcribibles que codifican 13-glucuronidasa (GUS), proteína fluorescente verde (GFP, por sus siglas en inglés), proteínas que confieren resistencia a los antibióticos, y proteínas que confieren tolerancia a los herbicidas. Un ejemplo de un transgén marcador seleccionable se proporciona como SEQ ID NO:42.
Transformación celular
La invención también está dirigida a un procedimiento para producir células y plantas transformadas que comprenden uno o varios elementos reguladores unidos operativamente a una molécula de ADN transcribible. El término “transformación” se refiere a la introducción de una molécula de ADN en un hospedante receptor. Tal como se utiliza en la presente descripción, el término “hospedante” se refiere a bacterias, hongos o plantas, incluso cualquier célula, tejido, órgano o progenie de las bacterias, hongos o plantas. Los tejidos y células de planta de interés particular incluyen protoplastos, callos, raíces, tubérculos, semillas, tallos, hojas, vástagos, embriones y polen.
Tal como se utiliza en la presente descripción, el término “transformado/a” se refiere a una célula, tejido, órgano u organismo en el cual se ha introducido una molécula de ADN extraña, tal como una construcción. La molécula de ADN introducida puede ser integrada en el ADN genómico de la célula, tejido, órgano u organismo receptor, en una forma tal que la molécula de ADN introducida es heredada por los descendientes. Una célula u organismo “transgénico” o “transformado” también puede incluir progenie de la célula u organismo y progenie producida a partir de un programa de reproducción que emplee dicho organismo transgénico como progenitor en un cruzamiento y que exhiba un fenotipo alterado como resultado de la presencia de una molécula de ADN extraña. La molécula de ADN introducida también puede ser introducida transitoriamente en la célula receptora, en una forma tal que la molécula de ADN introducida no sea heredada por la progenie posterior. El término “transgénico/a” se refiere a una bacteria, hongo o planta que contiene una o varias moléculas de ADN heterólogas.
Existen muchos procedimientos de introducción de moléculas de ADN en células de plantas que los expertos en la técnica conocen bien. El proceso comprende en general las etapas de seleccionar una célula hospedante adecuada, transformar la célula hospedante con un vector, y obtener la célula hospedante transformada. Los procedimientos y materiales para transformar células de plantas mediante la introducción de una construcción de planta en el genoma de una planta en la práctica de esta invención pueden incluir cualquiera de los procedimientos bien conocidos y demostrados. Los procedimientos adecuados incluyen, sin carácter limitativo, infección bacteriana (por ejemplo,Agrobacterium),vectores binarios BAC (Cromosoma Artificial Bacteriano, por sus siglas en inglés), suministro directo de ADN (por ejemplo, a través de transformación mediada por PEG, captación de ADN mediada por deshidratación/inhibición, electroporación, agitación con fibras de carburo de silicio y aceleración de partículas revestidas de ADN) y edición génica (por ejemplo, sistemas CRISPR-Cas), entre otros.
Esta revelación además contempla que los elementos de expresión sintéticos revelados pueden ser diseñados genéticamentein plantamediante el uso de diversos procedimientos de edición génica conocidos en la técnica. Estas tecnologías que se usan para la edición genómica incluyen, sin carácter limitativo, ZFN (nucleasa de dedos de zinc), meganucleasas, TALEN (nucleasas efectoras similares al activador de la transcripción), y sistemas CRISPR (siglas en inglés de Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas) /Cas (acrónimo en inglés de Asociado a CRISPR). Estos procedimientos de edición genómica pueden usarse para modificar la secuencia de los elementos de expresión dentro de una célula de planta a una secuencia diferente.
Células hospedantes pueden ser cualquier célula u organismo, tal como una célula de planta, célula de alga, algas, célula de hongo, hongos, célula bacteriana o célula de insecto. En formas de realización específicas, las células hospedantes y las células transformadas pueden incluir células de plantas de cultivo.
Una planta transgénica consiguientemente puede ser regenerada a partir de una célula de planta transgénica de la invención. Usando autopolinización o técnicas convencionales de reproducción, se pueden producir semillas a partir de esta planta transgénica. Estas semillas y la planta descendiente resultante desarrollada a partir de esas semillas contendrán la molécula de ADN recombinante de la invención y, por lo tanto, serán transgénicas.
Las plantas transgénicas de la invención pueden autopolinizarse para proporcionar semillas de plantas transgénicas homocigotas de la invención (homocigotas respecto de la molécula de ADN recombinante) o cruzarse con plantas no transgénicas o plantas transgénicas diferentes para proporcionar semillas de plantas transgénicas heterocigotas de la invención (heterocigotas respecto de la molécula de ADN recombinante). Tanto las plantas transgénicas homocigotas como las heterocigotas en la presente descripción son denominadas “plantas descendientes” o “plantas de progenie”. Las plantas de progenie son plantas transgénicas que descienden de la planta transgénica original y que contienen la molécula de ADN recombinante de la invención. Las semillas producidas usando una planta transgénica de la invención pueden ser cosechadas y utilizadas para desarrollar generaciones de plantas transgénicas, es decir, plantas de progenie de la invención, que comprenden la construcción de esta invención y que expresan un gen de interés agronómico. Descripciones de los procedimientos de reproducción que se usan comúnmente para diferentes cultivos pueden consultarse en alguna de las varias obras de referencia como, por ejemplo, Allard,Principies of Plant Breeding,John Wiley & Sons, NY, U. de CA, Davis, CA, 50-98 (1960); Simmonds,Principies of Crop Improvement,Longman, Inc., NY, 369-399 (1979); SneepyHendriksen,Plant breeding Perspectives,Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation (1979); Fehr,Soybeans: Improvement, Production and Uses,2.a Edición, Monografía, 16:249 (1987); Fehr,Principies of Variety Development, Theory and Technique,(Vol. 1) yCrop Species Soybean(Vol. 2), Iowa State Univ., Macmillan Pub. Co., NY, 360-376 (1987).
Las plantas transformadas pueden ser analizadas para determinar la presencia del gen o de los genes de interés y el nivel y/o perfil de expresión conferido por los elementos reguladores de la invención. Las personas capacitadas en la técnica están al tanto de los numerosos procedimientos disponibles para el análisis de plantas transformadas. Por ejemplo, los procedimientos para el análisis de las plantas incluyen, sin carácter limitativo, transferencias de Southern o transferencias northern, enfoques basados en la PCR, análisis bioquímicos, procedimientos de detección selectiva fenotípica, evaluaciones de campo y ensayos de inmunodiagnóstico. La expresión de una molécula de ADN transcribible se puede medir empleando reactivos y procedimientos TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA) como los describe el fabricante y tiempos de ciclos de PCR determinados usando la Matriz de Prueba TaqMan®. Alternativamente, pueden usarse los reactivos y procedimientos Invader® (Third Wave Technologies, Madison, WI) como los describe el fabricante, para evaluar la expresión transgénica.
La invención también proporciona partes de una planta de la invención. Las partes de planta incluyen, sin carácter limitativo, hojas, tallos, raíces, tubérculos, semillas, endospermo, óvulo y polen. Las partes de planta de la invención pueden ser viable, no viables, regenerables y/o no regenerables. La invención también incluye y proporciona células de plantas transformadas que comprenden una molécula de ADN de la invención. Las células de plantas transformadas o transgénicas de la invención incluyen células de plantas regenerables y/o no regenerables.
La divulgación también proporciona un producto básico producido a partir de una planta transgénica o parte de la misma que contiene la molécula de ADN recombinante de la invención. Los productos básicos de la divulgación contienen una cantidad detectable de ADN que comprende una secuencia de a Dn seleccionada del grupo integrado por SEQ ID NO:1-32 y SEQ ID NO:43-45. Tal como se utiliza en la presente descripción, un “producto básico” se refiere a cualquier composición o producto que está compuesto de material derivado de una planta, semilla, célula de planta o parte de planta transgénica que contiene la molécula de ADN recombinante de la invención. Los productos básicos incluyen, sin carácter limitativo, semillas, granos, partes de plantas y harinas procesados. Un producto básico de la invención contendrá una cantidad detectable de ADN correspondiente a la molécula de ADN recombinante de la invención. La detección de uno o varios de estos ADN en una muestra puede ser suficiente para determinar el contenido o la fuente del producto básico. Puede emplearse cualquier procedimiento de detección estándar para moléculas de ADN, que incluye los procedimientos de detección revelados en la presente descripción. La invención podrá ser comprendida más fácilmente a través de las referencias a los siguientes ejemplos, que se brindan a título ilustrativo y que no pretenden ser limitantes de la invención, excepto que así se especifique. Las personas capacitadas en la técnica deberán apreciar que las técnicas reveladas en los siguientes ejemplos representan técnicas que los inventores descubrieron que funcionan bien en la práctica de la invención. Sin embargo, las personas capacitadas en la técnica sabrán apreciar, a la luz de la presente revelación, que pueden efectuarse numerosos cambios en las formas de realización específicas que se revelan y aun así obtener un resultado igual o similar sin apartarse del alcance de la invención. Por lo tanto, todo asunto declarado o mostrado en los dibujos que se acompañan deberá interpretarse como ilustrativo y en ningún caso limitante.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Diseño, síntesis y clonación de elementos reguladores sintéticos
Los elementos reguladores que se brindan en la Tabla 1 son nuevos elementos de expresión sintéticos diseñados a través de procedimientos algorítmicos. Estos elementos reguladores sintéticos diseñados por computadora fueron sintetizados químicamente y clonados para elaborar grupos de elementos de expresión reguladores sintéticos (EXP). Se diseñaron bastante más de 1000 elementos reguladores sintéticos y se ensayaron en protoplastos de soja y plantas de soja transformadas establemente, para identificar aquellos elementos reguladores sintéticos que proporcionaban las características deseadas, tales como niveles de expresión y patrones de expresión de proteínas. Los elementos reguladores sintéticos descriptos en la Tabla 1 proporcionan diversos patrones de expresión útiles en el manejo de la expresión de muchas diferentes secuencias codificantes y ARN de interferencia de interés agronómico.
Los elementos reguladores sintéticos diseñados por computadora no tienen homología extendida con ninguna secuencia de ácido nucleico conocida de las que existen en la naturaleza. Los EXP sintéticos y los correspondientes promotores, líderes, intrones y 3' UTR están presentados en la Tabla 1. Los EXP sintéticos fueron clonados usando procedimientos conocidos en la técnica en vectores binarios de transformación de plantas, unidos operativamente a una secuencia codificante de 13-glucuronidasa (GUS), y los vectores fueron usados para evaluar los niveles y patrones de expresión proporcionados por los EXP sintéticos en plantas de soja, algodón y maíz transformadas establemente.
El análisis del sitio de inicio de la transcripción (TSS) de los elementos reguladores sintéticos y las uniones de corte y empalme de intrón/exón puede llevarse a cabo usando tejido de planta transformada. En pocas palabras, las plantas son transformadas con los vectores de expresión en planta que comprenden los fragmentos de ADN clonados unidos operativamente a una molécula de ADN transcribible heteróloga. Luego, se usa el 5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends (Sistema de Amplificación Rápida de Extremos de ADNc 5' RACE), Versión 2.0 (Invitrogen, Carlsbad, California 92008) para confirmar el TSS de los elementos reguladores sintéticos y las uniones de corte y empalme de intrón/exón mediante el análisis de la secuencia de ADN de los transcriptos de ARNm producidos.
Tabla 1. Grupos de elementos de expresión reguladores transcripcionales sintéticos, promotores, líderes, intrones y 3' UTR.
Ejemplo 2
Análisis de los EXP sintéticos, EXP-At.GSP442.nno+At.Cyco:3 y EXP-At.GSP221+At.Cyco:3, que conducen la expresión de GUS en plantas de soja establemente transformadas
Se transformaron plantas de soja con vectores, específicamente vectores de expresión en plantas, que contienen grupos de elementos reguladores que conducen la expresión del transgén de 13-glucuronidasa (GUS). Las plantas obtenidas fueron analizadas para determinar la expresión de la proteína GUS, a fin de evaluar el efecto de los grupos de elementos reguladores seleccionados sobre la expresión.
Las plantas de soja fueron transformadas con construcciones de expresión de GUS en plantas que comprenden el EXP endógeno, EXP-At.Cyco:1:1 (SEQ ID NO:38), y dos EXP sintéticos, EXP-At.GSP442.nno+At.Cyco:3 (SEQ ID NO:1) y EXP-At.GSP221+At.Cyco:3 (SEQ ID NO:30). EXP-At.Cyco:1:1 (SEQ ID NO:38) está derivada de un gen de la subunidad VIa de Citocromo c oxidasa deArabidopsisy está compuesto por el promotor, P-At.Cyco-1:1:2 (SEQ ID NO:39), unido operativamente 5' al líder, L-At.Cyco-1:1:2 (SEQ ID NO:40), que está unido operativamente 5' a un intrón, I-At.Cyco-1:1:1 (SEQ ID NO:41). EXP-At.GSP442.nno+At.Cyco:3 (SEQ ID NO:1) y EXP-At.GSP221+At.Cyco:3 (SEQ ID NO:30) comprendían, cada uno, un promotor y líder sintéticos unidos operativamente 5' al intrón, I-At.Cyco:2 (SEQ ID NO:33). La secuencia de I-At.Cyco:2 (<s>E<q>ID NO:33) es idéntica a la secuencia de I-At.Cyco-1:1:1 (SEQ ID NO:41), con la salvedad de que hay dos nucleótidos después del sitio de corte y empalme del intrón incluidos en la secuencia de I-At.Cyco-1:1:1. Ambos intrones I-At.Cyco cortan y empalman lo mismo.
Los elementos reguladores fueron clonados en vectores de expresión en planta de base usando procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Los vectores de expresión en planta resultantes contenían una región de flanco derecho deAgrobacterium tumefaciens(B-AGRtu.flanco derecho), un primer casete de selección de transgén que se usa para seleccionar células de plantas transformadas que confiere resistencia al antibiótico espectinomicina; un segundo casete de transgén para evaluar la actividad del elemento regulador, que comprendía una secuencia EXP unida operativamente 5' a una secuencia codificante para 13-glucuronidasa (GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1:1:1, SEQ ID NO:42) que contenía un intrón procesable derivado del gen específico de tejido inducible por luz de la papa ST-LS1 (Acceso Genbank: X04753), unido operativamente 5' a una 3' UTR del gen FbLate-2 deGossypium barbadense(T-Gb.FbL2:1, SEQ ID NO:36), y una región de flanco izquierdo deAgrobacterium tumefaciens(B-AGRtu.flanco izquierdo).
Se transformaron células de plantas de soja mediante transformación mediada porAgrobacteriumusando estas construcciones de vectores de transformación binarios, que es bien conocida en la técnica. Las células de plantas transformadas obtenidas fueron inducidas a formar plantas de soja enteras.
El análisis histoquímico de GUS se utilizó para el análisis de la expresión cualitativa y cuantitativa de las plantas transformadas. Se incubaron secciones de tejido entero con solución de tinción de GUS X-Gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-glucurónido) (1 miligramo/mililitro) durante una cantidad de tiempo apropiada, se enjuagaron y se inspeccionaron visualmente en busca de la coloración azul. La actividad de GUS se determinó cualitativamente por inspección visual directa o por inspección con microscopio usando órganos y tejidos de planta seleccionados.
Para el análisis cuantitativo de la expresión de GUS, se extrajo proteína total de tejidos seleccionados de plantas de soja transformadas. Se usó 1 microgramo de proteína total con el sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-p-D-glucurónido (MUG) en un volumen total de reacción de 50 microlitros. El producto de la reacción, 4 -metilumbeliferona (4-MU), alcanza la fluorescencia máxima a pH elevado, donde se ioniza el grupo hidroxilo. La adición de una solución básica de carbonato de sodio simultáneamente detiene el ensayo y ajusta el pH para cuantificar el producto fluorescente. La fluorescencia se midió con excitación a 365 nm, emisión a 445 nm, usando un Fluoromax-3 con Lectora Micromax, con ancho de ranura fijada a excitación 2 nm y emisión 3 nm. Los valores están indicados en unidades de nmol de GUS/hora/mg de proteína total.
Los siguientes tejidos fueron muestreados para determinar la expresión de GUS en la generación R0; raíz, hoja sumidero y hoja fuente de estadio V5; raíz, hoja-pecíolo, hoja fuente y flores de estadio R1; semilla inmadura y vaina de estadio<r>3; semilla-cotiledón de estadio R5; y semilla-embrión y semilla-cotiledón de estadio R8. La Tabla 2 muestra la expresión cuantitativa media de GUS para cada uno de los tejidos muestreados dirigidos por los grupos de elementos reguladores EXP evaluados, en donde “ND” indica que la expresión en un tejido particular no fue determinada.
Tabla 2. Expresión cuantitativa media de GUS en plantas de soja establemente transformadas dirigidas por grupos de elementos reguladores sintéticos y el EXP endógeno, EXP-At.Cyco:1:1.
Como se aprecia en la Tabla 2, cada uno de los grupos de elementos reguladores sintéticos tiene un patrón de expresión único en los tejidos muestreados, en comparación con el EXP endógeno. Por ejemplo, el promotor sintético At.GSP442, P-At.GSP442.nno:2 (SEQ ID NO:2), y líder, L-At.GSP442.nno:1 (SEQ ID NO:3), de EXP-At.GSP442.nno+At.Cyco:3 (SEQ ID NO:1) proporciona niveles superiores de expresión de GUS en todos los órganos ensayados con respecto al EXP-At.Cyco:1:1 endógeno (SEQ ID NO:38), que comprende una secuencia de intrón idéntica. El análisis del TSS demostró un TSS congruente. El intrón estaba correctamente extirpado en el ARNm resultante, tal como se esperaba. Por otra parte, el promotor sintético de At.GSP221, P-AT.GSP221:3 (SEQ ID NO:31), y líder, L-At.GSP221:1 (SEQ ID NO:32), de EXP-At.GSP221+At.Cyco:3 (SEQ ID NO:30) también proporciona niveles más altos de expresión constitutiva en la mayoría de los órganos ensayados, con respecto al EXP-At.Cyco:1:1 endógeno, y demuestra un TSS congruente. Sin embargo, el TSS de EXP-At.GSP221+At.Cyco:3 no fue localizado en la ubicación prevista -había múltiples elementos TATA potenciales. Esto da lugar a preocupaciones potenciales en relación a múltiples transcriptos, lo que podría producir múltiples secuencias codificantes. En tal sentido, EXP-At.GSP221+At.Cyco:3 no se consideró aceptable para usar en la conducción de la expresión transgénica en plantas dicotiledóneas transformadas establemente. Esto muestra una de las complejidades que presenta el diseño de los elementos de expresión sintéticos. Numerosos elementos sintéticos fueron ensayados en el desarrollo y la identificación de los elementos de expresión sintéticos, pero solamente un pequeño subconjunto proporcionó las características y la actividad reguladora deseables, lo que da idea de la complejidad que conlleva el diseño de elementos reguladores transcripcionales sintéticos eficaces.
Como se aprecia en la Tabla 2, el promotor sintético, P-At.GSP442.nno:2 (SEQ ID NO:2) y L-At.GSP442.nno:1 (SEQ ID NO:3) comprendido dentro de EXP-At.GSP442.nno+At.Cyco:3 (SeQ ID NO:1) puede conducir la expresión transgénica constitutiva de un transgén unido operativamente en una planta de soja establemente transformada.Ejemplo 3
Análisis del promotor y líder sintético At.GSP571 y los intrones sintéticos At.GSI21 y At.GSI102, que conducen la expresión de GUS en plantas de soja establemente transformadas
Se transformaron plantas de soja con vectores, específicamente vectores de expresión en planta que contienen grupos de elementos reguladores que conducen la expresión del transgén de 13-glucuronidasa (GUS). Las plantas obtenidas fueron analizadas para determinar la expresión de la proteína GUS, a fin de evaluar el efecto de los grupos de elementos reguladores seleccionados sobre la expresión.
Las plantas de soja fueron transformadas con construcciones de expresión de GUS en plantas, que comprendían los EXP sintéticos, EXP-At.GSP571 (SEQ ID NO:4), EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco:2 (SEQ ID NO:7), EXP-At.GSP571.nno+At.GSI21.nno:10 (SEQ ID NO:8) y EXP-At.GSP571.nno+At.GSI102.nno:1 (SEQ ID NO:10). Cada uno de los EXP sintéticos comprendía el promotor sintético de At.GSP571 (SEQ ID NO:5) y líder (SEQ ID NO:6). EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco:2 comprendía el intrón endógeno deArabidopsis,I-At.Cyco:2 (SEQ iD NO:33). EXP-At.GSP571.nno+At.GSI21.nno:10 y EXP-At.GSP571.nno+At.GSI102.nno:1 comprendían los intrones sintéticos, I-At.GSI21.nno:2 (SEQ ID NO:9) y I-At.GSI102.nno:1 (SEQ ID NO:11), respectivamente. Los vectores binarios de transformación de plantas eran similares a los descriptos en el Ejemplo 2, con la excepción de que cada uno de los vectores del EXP At.GSP571 comprendía la 3' UTR, T-Mt.Sali3-2-1:2:1 (SEQ ID NO:34), derivada del gen Sali3 deMedicago truncatula.
El análisis cuantitativo y cualitativo de la expresión de GUS se llevó a cabo como se describió en el Ejemplo 2. Las muestras de tejidos usadas para el análisis fueron las mismas que las descriptas en el Ejemplo 2. La Tabla 3 muestra la expresión cuantitativa media de GUS para cada uno de los tejidos muestreados dirigidos por los elementos reguladores del EXP sintético evaluado, en donde “ND” indica que la expresión en un tejido particular no fue determinada.
Tabla 3. Expresión cuantitativa media de GUS en plantas de soja establemente transformadas dirigidas por elementos reguladores sintéticos.
Como se aprecia en la Tabla 3, el promotor y líder sintético de At.GSP571 proporcionan expresión constitutiva en todos los órganos ensayados. La expresión más alta fue en la hoja y semillas. El análisis del TSS demostró un TSS congruente. La unión operativa de una secuencia de intrón alteró la expresión en muchos de los órganos, lo que proporcionó un medio para la “sintonía fina” de la expresión constitutiva. Se observaron diferencias en la expresión al unir operativamente los intrones sintéticos, I-At.GSI21.nno:2 (SEQ ID NO:9) y I-At.GSI102.nno:1 (SEQ ID N<o>:11). Los intrones sintéticos mejoraron la expresión en algunos tejidos, pero se diferenciaron en el nivel de mejoramiento en cada órgano. Por ejemplo, el mejoramiento usando el intrón sintético I-At.GSI21.nno:2 en la vaina R3 fue superior al mejoramiento que se observó usando el intrón sintético I-At.GSI102.nno:1 y el intrón endógeno I-At.Cyco:2 respecto de EXP-At.GSP571. La expresión solo fue mejorada ligeramente por los tres intrones unidos operativamente en el pecíolo R1. En las flores R1, I-At.GSI21.nno:2 y I-At.Cyco:2 mejoraron la expresión, de los cuales I-At.GSI21.nno:2 proporcionó un alto nivel de mejoramiento de la expresión y I-At.Cyco:2 proporcionó un nivel moderado de mejoramiento. Resulta interesante que I-At.GSI102.nno:1 redujo la expresión en las flores R1.
El análisis de los ARNm resultantes mostró el procesamiento apropiado y consistente de los elementos intrónicos. El promotor sintético P-At.GSP571.nno:5 (SEQ ID NO:5) y líder L-At.GSP571.nno:1 (SEQ ID NO:6) comprendidos dentro de EXP-At.GSP571 (SEQ ID NO:4) proporcionan la expresión constitutiva de un transgén unido operativamente en plantas de soja establemente transformadas. Los EXP sintéticos, EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco:2 (SeQ ID NO:7), que comprende el intrón I-At.Cyco:2 deArabidopsis(SEQ ID NO:33), y EXP-At.GSP571.nno+At.GSI21.nno:10 (SEQ ID NO:8) y EXP-At.GSP571.nno+At.GSI102.nno:1 (SEQ ID NO:10) que comprenden los intrones sintéticos I-At.GSI21.nno:2 (SEQ ID NO:9) y I-At.GSI102.nno:1 (SEQ ID NO:11), respectivamente, proporcionan patrones de expresión constitutiva únicos en plantas de soja establemente transformadas. Los intrones sintéticos I-At.GSI21.nno:2 (SEQ ID NO:9) y I-At.GSI102.nno:1 (SEQ ID NO:11) proporcionan expresión potenciada o modulada en muchos de los órganos de planta cuando están unidos operativamente a EXP-At.GSP571 (SEQ ID NO:4). Estos patrones de expresión únicos pueden usarse para controlar transgenes específicos en los que el patrón de expresión específico de uno de los cuatro EXP de At.GSP571 es altamente deseable.
Ejemplo 4
Análisis del promotor y líder sintético de At.GSP564 y los intrones sintéticos de At.GSI17 y At.GSI102, que controlan la expresión de GUS en plantas de soja establemente transformadas
Se transformaron plantas de soja con vectores, específicamente vectores de expresión en planta que contienen grupos de elementos reguladores que controlan la expresión del transgén de 13-glucuronidasa (GUS). Las plantas obtenidas fueron analizadas para determinar la expresión de la proteína GUS, a fin de evaluar el efecto de los grupos de elementos reguladores seleccionados sobre la expresión.
Las plantas de soja fueron transformadas con construcciones de expresión de GUS en plantas, que comprendían los EXP sintéticos, EXP-At.GSP564 (SEQ ID NO:12), EXP-At.GSP564.nno+At.Cyco:2 (SEQ ID NO:15), EXP-At.GSP564.nno+At.GSI17.nno:2 (SEQ ID NO:16) y EXP-At.GSP564.nno+At.GSI102.nno:1 (SEQ ID NO:18). Cada uno de los EXP sintéticos comprendía el promotor sintético P-At.GSP564.nno:3 (SEQ ID NO:13) y líder sintético L-At.GSP564.nno.1 (SEQ ID NO:14). EXP-At.GSP564.nno+At.Cyco:2 comprendía el intrón deArabidopsis,I-At.Cyco:2 (SEQ ID NO:33). EXP-At.GSP564.nno+At.GSI17.nno:2 y EXP-At.GSP564.nno+At.GSI102.nno:1 comprendían los intrones sintéticos, I-At.GSI17.nno:1 (SEQ ID NO:17) y I-At.GSI102.nno:1 (SEQ ID NO:11), respectivamente. Los vectores binarios de transformación de plantas fueron similares a los descriptos en el Ejemplo 2, con la salvedad de que cada uno de los vectores del EXP de At.GSP564 comprendía la 3' UTR, T-Mt.Oxr-1:2:1 (SEQ ID NO:35), derivada de un gen putativo de proteína oxidorreductasa (OXR) deMedicago truncatula.
Se llevó a cabo el análisis cuantitativo y cualitativo de la expresión de GUS como se describió en el Ejemplo 2. Las muestras de tejidos usadas para el análisis fueron las mismas que se describieron en el Ejemplo 2. La Tabla 4 muestra la expresión cuantitativa media de GUS para cada uno de los tejidos muestreados controlados por los elementos reguladores del EXP sintético evaluado, en donde “ND” indica que la expresión en un tejido particular no fue determinada.
Tabla 4. Expresión cuantitativa media de GUS en plantas de soja establemente transformadas controladas por
Como se aprecia en la Tabla 4, el promotor y líder sintético de At.GSP564 proporcionan expresión constitutiva en todos los órganos ensayados. La expresión más alta fue en la hoja y semillas. El análisis del TSS mostró un TSS congruente. La unión operativa de una secuencia de intrón alteró la expresión en muchos de los órganos, lo que proporcionó un medio para la “sintonía fina” de la expresión constitutiva. Se observaron diferencias en la expresión al unir operativamente los intrones sintéticos I-At.GSI17.nno:1 (SEQ ID NO:17) y I-At.GSI102.nno:1 (SEQ ID N<o>:11). Los intrones sintéticos mejoraron la expresión en algunos tejidos respecto de EXP-At.GSP564, pero se diferenciaron en el nivel de mejoramiento en cada órgano. Por ejemplo, el mejoramiento usando el intrón sintético I-At.GSI102.nno:1 en la hoja fuente V5 fue superior al mejoramiento que se observó usando el intrón sintético I-At.GSI17.nno:1. En raíz<r>1, el mejoramiento usando el intrón sintético I-At.GSI17.nno:1 fue superior al mejoramiento conferido por el intrón sintético I-At.GSI102.nno:1. Ambos intrones sintéticos proporcionaron un mayor mejoramiento de la expresión en la hoja fuente R1, que el intrón endógeno I-At.Cyco:2.
El análisis de los ARNm resultantes mostró el procesamiento apropiado y consistente de los elementos intrónicos. El promotor sintético de At.GSP564, P-At.GSP564.nno.3 (SEQ ID NO:13), y líder L-At.GSP564.nno:1 (SEQ ID NO:14) que comprendían EXP-At.GSP564 (SEQ ID NO:12) proporcionan la expresión constitutiva de un transgén unido operativamente en plantas de soja establemente transformadas. Los EXP sintéticos, EXP-At.GSP564.nno+At.Cyco:2 (SEQ ID NO:15), que comprende el intrón deArabidopsisI-At.Cyco:2 (SEQ ID NO:33), y EXP-At.GSP564.nno+At.GSI17.nno:2 (SEQ ID NO:16) y EXP-At.GSP564.nno+At.GSI102.nno:1 (SEQ ID NO:18), que comprenden los intrones sintéticos I-At.GSI17.nno:1 (SEQ ID NO:17) y I-At.GSI102.nno:1 (SEQ ID NO:11), respectivamente, proporcionan patrones de expresión constitutiva únicos en plantas de soja establemente transformadas. Los intrones sintéticos I-At.GSI17.nno:1 (SEQ ID NO:17) y I-At.GSI102.nno:1 (SEQ ID NO:11) proporcionan expresión transgénica potenciada o modulada en muchos de los órganos de la planta al unirse operativamente a EXP-At.GSP564 (SEQ ID NO:12). Estos patrones de expresión únicos pueden usarse para controlar transgenes específicos en los que el patrón de expresión específico de uno de los cuatro EXP de At.GS564 es altamente deseable.
Ejemplo 5
Análisis del EXP sintético, EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3, que controla la expresión de GUS en plantas de soja establemente transformadas
Se transformaron plantas de soja con vectores, específicamente vectores de expresión en planta que contienen un grupo de elementos reguladores sintéticos que conducen la expresión del transgén de 13-glucuronidasa (GUS). Las plantas obtenidas fueron analizadas para determinar la expresión de la proteína GUS, a fin de evaluar el efecto del grupo de elementos reguladores sintéticos seleccionado sobre la expresión.
Las plantas de soja fueron transformadas con una construcción de expresión de GUS en plantas, que comprendía el EXP sintético, EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3 (SEQ ID NO:22). EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3 comprende EXP-At.GSP579 (SEQ ID NO:19) compuesto por el promotor y líder de At.GSP (SEQ ID NO:20 y 21, respectivamente), unidos operativamente 5' al intrón sintético I-At.GSI102.nno:1 (SEQ ID NO:11). El casete de transgén de GUS también comprende la 3' UTR, T-Mt.RD22-1:2:1 (SEQ ID NO:37) derivada de un gen de la proteína de respuesta a la deshidratación RD22 deMedicago truncatula.
El análisis cuantitativo y cualitativo de la expresión de GUS se llevó a cabo como se describió en el Ejemplo 2. Las muestras de tejidos usadas para el análisis fueron las mismas que se describieron en el Ejemplo 2. La Tabla 5 muestra la expresión cuantitativa media de GUS para cada uno de los tejidos muestreados controlados por el EXP sintético EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3, en donde “ND” indica que la expresión en un tejido particular no fue determinada.
Tabla 5. Expresión cuantitativa media de GUS en plantas de soja establemente transformadas controladas por EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3.
Como se aprecia en la Tabla 5, EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3 (SEQ ID NO:22) proporciona expresión constitutiva en plantas de soja establemente transformadas. El promotor sintético P-At.GSP579.nno:2 (SEQ ID NO:20) y líder L-At.GSP579.nno:1 (SEQ ID NO:21) comprendidos dentro de EXP-At.GSP579 (SEQ ID NO:19) conducen la expresión constitutiva de un transgén unido operativamente. Sobre la base de los ejemplos previos, en los que el intrón sintético I-At.GSI102.nno:1 (SEQ ID NO:11) se unió operativamente a otros promotores sintéticos constitutivos, se puede inferir que I-At.GSI102.nno:1 potenció o moduló la expresión constitutiva impartida por EXP-At.GSP579 en por lo menos algunos de los órganos muestreados.
Ejemplo 6
Análisis del EXP sintético, EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco:2, que conduce la expresión de GUS en plantas de algodón transformadas establemente
Se transformaron plantas de algodón con un vector, específicamente un vector de expresión en planta que contiene un grupo de elementos reguladores sintéticos que conduce la expresión del transgén de 13-glucuronidasa (GUS). Las plantas obtenidas fueron analizadas para determinar la expresión de la proteína GUS, a fin de evaluar el efecto del grupo de elementos reguladores sintéticos sobre la expresión.
Se usó un vector binario de planta que comprendía el EXP sintético EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco:2 (SEQ ID NO:7), similar al que se describe en el Ejemplo 3, para transformar plantas de algodón en forma estable. El casete de transgén de GUS comprendía EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco:2 unido operativamente 5' a una secuencia codificante de 13-glucuronidasa (GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1:1:1, SEQ ID NO:42) que contenía un intrón procesable derivado del gen específico de tejido inducible por luz de la papa ST-LS1 (Acceso Genbank: X04753), unido operativamente 5' a una 3' UTR del gen FbLate-2 deGossypium barbadense(T-Gb.FbL2:1, SEQ ID NO:36). Los eventos de algodón transformado obtenidos fueron cultivados y se muestrearon y ensayaron muestras de tejidos derivadas de Hoja de 4.° Nodo; Pecíolo, Hoja Sumidero y Hoja Fuente de 8.° Nodo; Brácteas del cuadro y Yema del cuadro Prefertilización; Antera y Ovario de Flor en la Floración; y Pared Capsular de 8 Días Después de la Polinización (DAP, por sus siglas en inglés), para determinar la expresión cualitativa y cuantitativa de GUS.
La Tabla 6 muestra la expresión cuantitativa media de GUS para cada uno de los tejidos muestreados controlados por el EXP sintético, EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco:2.
Tabla 6. Expresión cuantitativa media de GUS en plantas de algodón transformadas establemente controladas por EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco:2.
Como se aprecia en la Tabla 6, EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco:2 se expresó en todos los tejidos muestreados. La expresión más alta fue en la Hoja de 4.° Nodo y la más baja, en la Antera en Floración. La expresión en Hoja Sumidero y Fuente de 8^ Nodo fueron relativamente iguales y aproximadamente la mitad que la de la Hoja de 4^ Nodo. La expresión también fue alta en la Pared capsular. La Tabla 6 muestra que el promotor P-At.GSP571.nno:5 (SEQ ID NO:5) puede conducir la expresión constitutiva en plantas de algodón transformadas establemente. El intrón I-At.Cyco:2 (SEQ ID NO:33) dentro de EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco:2 potenció la expresión del promotor P-At.GSP571.nno:5 en plantas de soja establemente transformadas, como se muestra en el Ejemplo 3.
Ejemplo 7
Análisis del promotor sintético quimérico P-At.GSP571/442 que conduce la expresión de GUS en plantas de soja establemente transformadas
Se transformaron plantas de soja con vectores, específicamente vectores de expresión en planta que contenían grupos de elementos reguladores conductores de la expresión del transgén de 13-glucuronidasa (GUS). Las plantas obtenidas fueron analizadas para determinar la expresión de la proteína GUS, a fin de evaluar el efecto de los grupos de elementos reguladores sintéticos seleccionados sobre la expresión.
Las plantas de soja fueron transformadas con un vector binario de planta que comprendía el EXP sintético, EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco:1 (SEQ ID NO:23), compuesto del promotor sintético quimérico P-At.GSP571/442 (SEQ ID NO:25) que comprende un potenciador sintético E-At.GSP571.nno:1 (S<e>Q ID NO:24) derivado del promotor sintético P-At.GSP57l.nno:5 (SEQ ID NO:5) unido operativamente 5' al promotor sintético P-At.GSP442.nno:2 (SEQ ID NO:2) y unido operativamente 5' con el líder sintético L-At.GSP442.nno:1 (SEQ ID NO:3), unido operativamente 5' al líder L-At.Cyco-1 :1:2 (SEQ ID NO:40), unido operativamente 5' al intrón I-At.Cyco:2 (S<e>Q ID NO:33). El casete del transgén de GUS comprendía EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco:1 unido operativamente 5' a una secuencia codificante de 13-glucuronidasa (GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1:1:1, SEQ ID NO:42) que contiene un intrón procesable derivado del gen específico de tejido inducible por luz de la papa ST-LS1 (Acceso Genbank: X04753), unido operativamente 5' a la 3' UTR sintética T-Zm.GST59.nno:1 (SEQ ID nO:29).
También se construyó un vector binario de planta que se usó para comparar la actividad del promotor quimérico. El vector comprendía un EXP, EXP-At.GSP442+L-I-At.Cyco (SEQ ID No :43), que está compuesto del promotor sintético P-At.GSP442.nno:2 (SEQ ID NO:2) unido operativamente 5' al líder sintético L-At.GSP442.nno:1 (SEQ ID NO:3), unido operativamente 5' al líder L-At.Cyco-1:1:2 (SEQ ID NO:40), unido operativamente 5' al intrón I-At.Cyco:2 (SEQ ID NO:33). Los vectores binarios son similares a los descriptos en los Ejemplos 2-6, con la excepción de que cada casete de transgén de GUS tiene la 3' UTR sintética T-Zm.GST59.nno:1 (SEQ ID NO:29) unida operativamente 3' a la secuencia codificante de GUS.
Las plantas de soja fueron transformadas con los dos vectores binarios. Se tomaron muestras de tejidos de órganos seleccionados en estadios de desarrollo específicos y se ensayaron para determinar la expresión cualitativa y cuantitativa de GUS. La Tabla 7 muestra la expresión cuantitativa media de GUS para cada uno de los tejidos muestreados controlados por los EXP sintéticos, EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco:1 y Ex P-At.GSP442+L-I-At.Cyco.
Tabla 7. Expresión cuantitativa media de GUS en plantas de soja establemente transformadas controladas por EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco:1 y
EXP-At.GSP442+L-I-At.Cyco.
Como se aprecia en la Tabla 7, la adición del potenciador sintético E-At.GSP571.nno:1 potenció la expresión en muchos de los tejidos muestreados. Ambos EXP proporcionaron expresión constitutiva en las plantas de soja establemente transformadas. La 3' UTR sintética, T-Zm.GST59.nno:1, funcionó de manera similar a una 3' UTR nativa en la provisión de la terminación y poliadenilación correctas del transcripto.
Ejemplo 8
Análisis del promotor sintético quimérico P-At.GSP571/442 que conduce la expresión de GUS en plantas de algodón transformadas establemente
Se transformaron plantas de algodón con un vector, específicamente un vector de expresión en plantas que contenía un grupo de elementos reguladores sintéticos conductores de la expresión del transgén de 13-glucuronidasa (GUS). Las plantas obtenidas fueron analizadas para determinar la expresión de la proteína GUS, a fin de evaluar el efecto del grupo de elementos reguladores sintéticos seleccionado sobre la expresión.
Las plantas de algodón fueron transformadas con un vector binario de plantas que comprende el EXP sintético, EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco:1 (SEQ ID NO:23), que está compuesto del promotor sintético quimérico P-At.GSP571/442 (SEQ ID NO:25) que comprende un potenciador sintético E-At.GSP571.nno:1 (SEQ ID NO:24) derivado del promotor sintético P-At.GSP571.nno:5 (SEQ ID NO:5) que está unido operativamente 5' al promotor sintético P-At.GSP442.nno:2 (SEQ ID NO:2) y está unido operativamente 5' al líder sintético, L-At.GSP442.nno:1 (SEQ ID NO:3), unido operativamente 5' al líder L-At.Cyco-1:1:2 (SEQ ID NO:40), que está unido operativamente 5' al intrón I-At.Cyco:2 (SEQ ID NO:33). El casete de transgén de GUS comprendía EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco:1 unido operativamente 5' a una secuencia codificante de 13-glucuronidasa (GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1:1:1, SEQ ID NO:42) que contiene un intrón procesable derivado del gen específico de tejido inducible por luz de la papa ST-LS1 (Acceso Genbank: X04753), unido operativamente 5' a la 3' UTR sintética, T-Zm.GST59.nno:1 (SEQ ID NO:29). Los eventos de algodón transformado obtenidos fueron cultivados y se tomaron muestras y se ensayaron muestras de tejido derivadas de Hoja de 4.° Nodo; Pecíolo, Hoja Sumidero y Hoja Fuente de 8^ Nodo; Brácteas del cuadro y Yema del cuadro Prefertilización; Antera y Ovario de Flor en la Floración; y Pared capsular de 8 Días Después de la Polinización (DAP), para determinar la expresión cualitativa y cuantitativa de GUS.
La Tabla 8 muestra la expresión cuantitativa media de GUS para cada uno de los tejidos muestreados controlados por el EXP sintético, EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco:1, en donde “bdl” significa por debajo del límite de detección.
Tabla 8. Expresión cuantitativa media de GUS en plantas de algodón transformadas establemente controladas por EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco:1.
Como se aprecia en la Tabla 8, EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco:1 (SEQ ID NO:23) pudo conducir la expresión constitutiva de GUS en los tejidos muestreados. Se determinó que la expresión en el pecíolo se hallaba por debajo de los límites de detección. La expresión más alta fue en la Hoja Fuente de 8^ Nodo. La expresión resultó relativamente igual en la Antera y el Ovario de Flor en la Floración. Asimismo, la 3' UTR sintética T-Zm.GST59.nno:1 (SEQ ID NO:29) funcionó de manera similar a una 3' UTR nativa en la provisión de la terminación y poliadenilación correctas del transcripto.
Ejemplo 9
Análisis del EXP sintético, EXP-At.GSP576.nno+At.Cyco:1, que conduce la expresión de GUS en plantas de soja establemente transformadas
Se transformaron plantas de soja con un vector, específicamente un vector de expresión en plantas que contiene un grupo de elementos reguladores sintéticos que conducen la expresión del transgén de 13-glucuronidasa (GUS). Las plantas obtenidas fueron analizadas para determinar la expresión de la proteína GUS, a fin de evaluar el efecto del grupo de elementos reguladores sintéticos seleccionado sobre la expresión.
Las plantas de soja fueron transformadas con un vector binario de plantas que comprende el EXP sintético, EXP-At.GSP576.nno+At.Cyco:1 (SEQ ID NO:45). El casete de transgén de GUS también comprendía la 3' UTR del gen FbLate-2 deGossypium barbadense(T-Gb.FbL2:1, SEQ ID NO:36), unido operativamente 3' a la secuencia codificante de GUS. Los eventos de soja transformada obtenidos fueron cultivados y se muestrearon y ensayaron muestras de tejido de órganos seleccionados de varios estadios de desarrollo para determinar la expresión cualitativa y cuantitativa de GUS. La expresión de GUS en plantas de soja establemente transformadas controladas por EXP-At.GSP576.nno+At.Cyco:1, está presentada en la Tabla 9.
Tabla 9. Expresión cuantitativa media de GUS en plantas de soja establemente transformadas controladaspor EXP-At.GSP576.nno+At.Cyco:1.
Como se aprecia en la Tabla 9, EXP-At.GSP576.nno+At.Cyco:1 (SEQ ID NO:45) proporcionó expresión constitutiva en plantas de soja establemente transformadas. El promotor sintético P-At.GSP576.nno:4 (SEQ ID NO:27) y líder L-At.GSP576.nno:2 (SEQ ID NO:28) conducen la expresión constitutiva de un transgén unido operativamente. A partir de los ejemplos previos en los que el intrón I-At.Cyco:2 (SEQ ID NO:33) estaba unido operativamente a otros promotores sintéticos constitutivos, se puede inferir que I-At.Cyco:2 potenció o moduló la expresión constitutiva impartida por P-At.GSP576.nno:4 en por lo menos algunos de los órganos muestreados.
Ejemplo 10
Análisis del EXP sintético, EXP-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno:3, que conduce la expresión de GUS en plantas de soja establemente transformadas
Se transformaron plantas de soja con vectores, específicamente vectores de expresión en planta que contienen grupos de elementos reguladores que conducen la expresión del transgén de 13-glucuronidasa (GUS). Las plantas obtenidas son analizadas para determinar la expresión de la proteína GUS, a fin de evaluar el efecto de los grupos de elementos reguladores seleccionados sobre la expresión.
Las plantas de soja son transformadas con vectores binarios de planta que comprenden el EXP sintético, EXP-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno:3 (SEQ ID NO:26), o bien el EXP, EXP-At.Cyco:1:1 (SEQ ID NO:38). Los casetes de transgén de GUS también comprenden la 3' UTR del gen FbLate-2 deGossypium barbadense(T-Gb.FbL2:1, SEQ ID NO:36) unido operativamente 3' a la secuencia codificante de GUS. Los eventos de soja transformada obtenidos son cultivados y se muestrean y ensayan muestras de tejido de órganos seleccionados de varios estadios de desarrollo para determinar la expresión cualitativa y cuantitativa de GUS. La expresión de GUS en las plantas de soja establemente transformadas, conducida por EXP-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno:3, es comparada con la expresión conducida por EXP-At.Cyco:1:1. La expresión de GUS en plantas de soja establemente transformadas controladas por EXp-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno:3 es prueba de la capacidad del promotor sintético P-At.GSP576.nno:4 (SEQ ID NO:27) y líder L-At.GSP576.nno:2 (SEQ ID NO:28) para conducir la expresión constitutiva de un transgén unido operativamente.
Como se demostró en los Ejemplos 9 y 11, el promotor sintético P-At.GSP576.nno:4 (SEQ ID NO:27) y líder L-At.GSP576.nno:2 (SEQ ID NO:28) conducen la expresión constitutiva de un transgén unido operativamente. Como se demostró en el Ejemplo 4, el intrón sintético I-At.GSI17.nno:1 (SEQ ID NO:17) potenció o moduló la expresión transgénica en muchos de los órganos de la planta al unirse operativamente a EXP-At.GSP564 (SEQ ID NO:12). De igual modo, se puede esperar perfectamente que la expresión del promotor sintético P-At.GSP576.nno:4 y líder LAt.GSP576.nno:2 resulte potenciada o modulada de manera similar.
Ejemplo 11
Análisis del EXP sintético, EXP-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno:3, que conduce la expresión de GUS en plantas de algodón transformadas establemente
Se transformaron plantas de algodón con un vector, específicamente un vector de expresión en plantas que contiene un grupo de elementos reguladores sintéticos que conduce la expresión del transgén de 13-glucuronidasa (GUS). Las plantas obtenidas fueron analizadas para determinar la expresión de la proteína GUS, a fin de evaluar el efecto del grupo de elementos reguladores sintéticos seleccionado sobre la expresión.
Las plantas de algodón fueron transformadas con un vector binario que comprende el EXP sintético, EXP At.GSP576.nno+At.GSI17.nno:3 (SEQ ID NO:26), tal como se describió previamente en el Ejemplo 10. Los casetes de transgén de GUS también comprendían la 3' UTR del gen FbLate-2 deGossypium barbadense(T-Gb.FbL2:1, SEQ ID NO:36) unido operativamente 3' a la secuencia codificante de GUS. Los eventos de algodón transformado obtenidos fueron cultivados y se muestrearon y ensayaron muestras de tejido derivadas de Hoja de 4.° Nodo; Pecíolo, Hoja Sumidero y Hoja Fuente de 8^ Nodo; Brácteas del cuadro y Yema del cuadro Prefertilización; Antera y Ovario de Flor en la Floración; y Pared capsular de 8 Días Después de la Polinización (DAP) para determinar la expresión cualitativa y cuantitativa de GUS.
La Tabla 10 muestra la expresión cuantitativa media de GUS para cada uno de los tejidos muestreados controlados por el EXP-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno:3 sintético.
Tabla 10. Expresión cuantitativa media de GUS en plantas de algodón transformadas establemente controladas por EXP-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno:3.
Como se aprecia en la Tabla 10, EXP-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno:3 (SEQ ID NO:26) condujo la expresión constitutiva del transgén de GUS en plantas de algodón transformadas establemente. La expresión más alta fue en la Hoja del 4^ Nodo, Hoja Fuente de 8^ Nodo y Pared capsular de 8 DAP. El promotor sintético P-At.GSP576.nno:4 (SEQ ID NO:27) y líder L-At.GSP576.nno:2 (SEQ ID NO:28) son capaces de conducir la expresión constitutiva de un transgén unido operativamente en plantas de algodón transformadas establemente. Como se demostró en el Ejemplo 4, el intrón sintético I-At.GSI17.nno:1 (SEQ ID NO:17) potenció o moduló la expresión del transgén en muchos de los órganos de la planta al unirse operativamente a EXP-At.GSP564 (SEQ ID<n>O:12). De igual modo, se puede esperar perfectamente que la expresión del promotor sintético P-At.GSP576.nno:4 y líder L-At.GSP576.nno:2 resulte potenciada o modulada de manera similar en plantas de algodón transformadas establemente.
Ejemplo 12
Elementos potenciadores derivados del elemento regulador
Los potenciadores son derivados de los elementos promotores presentados como SEQ ID NO: 2, 5, 13, 20, 25, 27, 31 y 39. El elemento potenciador puede estar compuesto de uno o varios elementos reguladorescisque, cuando se unen operativamente 5' o 3' a un elemento promotor, o se unen operativamente 5' o 3' a elementos potenciadores adicionales que están unidos operativamente a un promotor, pueden potenciar o modular los niveles de expresión de una molécula de ADN transcribible, o proporcionar la expresión de una molécula de ADN transcribible en un tipo celular u órgano de planta específicos o en un determinado punto de tiempo del desarrollo o del ritmo circadiano. Los potenciadores se elaboran eliminando la caja TATA o elementos funcionalmente similares y toda secuencia corriente debajo de los promotores que permita la iniciación de la transcripción a partir de los promotores presentados como SEQ ID NO: 2, 5, 13, 20, 25, 27, 31, y 39 o sus fragmentos. Por ejemplo, el potenciador sintético E-At.GSP571.nno:1 (SEQ ID NO:24) fue derivado del promotor sintético P-At.GSP571.nno:5 (SEQ ID NO:5) y consiste en los nucleótidos 1 a 422 de P-At.GSP571.nno:5, eliminando la secuencia corriente abajo 3' que también contiene la caja TATA del promotor sintético.
Puede ser necesario un refinamiento adicional del elemento potenciador y se convalida empíricamente. Por otra parte, la posición del elemento potenciador respecto de otros elementos dentro de un grupo de elementos reguladores quiméricos también se determina en forma empírica, dado que el orden de cada elemento dentro del grupo de elementos reguladores quiméricos puede impartir efectos diferentes, dependiendo de las posiciones relativas de cada elemento. Algunos elementos promotores tendrán múltiples cajas TATA o elementos tipo caja TATA y potencialmente múltiples sitios de inicio de la transcripción. En estas circunstancias, puede ser necesario identificar en primer término dónde está ubicado el primer TSS y luego empezar el diseño de los potenciadores usando el primer TSS para prevenir que ocurra la potencial iniciación de la transcripción dentro de un elemento potenciador putativo.
Los elementos potenciadores, derivados de los elementos promotores sintéticos presentados como SEQ ID NO: 2, 5, 13, 20, 25, 27, 31 y 39, son clonados usando procedimientos conocidos en la técnica para unirse operativamente 5' o 3' a un elemento promotor, o unirse operativamente 5' o 3' a elementos potenciadores adicionales que están unidos operativamente a un promotor. Alternativamente, los elementos potenciadores pueden ser clonados, usando los procedimientos conocidos en la técnica, para proporcionar un elemento potenciador más grande compuesto de dos o más copias del potenciador y clonado usando procedimientos conocidos en la técnica para unirse operativamente 5' o 3' a un promotor elemento, o unirse operativamente 5' o 3' a elementos potenciadores adicionales que están unidos operativamente a un promotor, produciendo un elemento regulador transcripcional quimérico. Los elementos potenciadores también pueden clonarse empleando procedimientos conocidos en la técnica para unirse operativamente 5' a un elemento promotor derivado de un organismo de diferente género, o para unirse operativamente 5' o 3' a elementos potenciadores adicionales derivados de organismos de otro género que están unidos operativamente a un promotor derivado de un organismo del mismo género o de un género diferente, lo que resulta en un elemento regulador quimérico. Un vector de transformación de plantas de expresión de GUS se puede construir usando procedimientos conocidos en la técnica similar a las construcciones descriptas en el Ejemplo 2 en que los vectores de expresión en plantas obtenidos contienen una región de flanco derecho deAgrobacterium tumefaciens(B-AGRtu.flanco derecho), un primer casete de selección de transgén que se usa para seleccionar células de plantas transformadas que confiere resistencia al antibiótico espectinomicina; y un segundo casete de transgén para poner a prueba el elemento potenciador que comprende el elemento potenciador unido operativamente 5' o 3' a un elemento promotor o unido operativamente 5' o 3' a elementos potenciadores adicionales que, a su vez, están unidos operativamente a un promotor que está unido operativamente 5' a un elemento líder, unido operativamente a una secuencia codificante de 13-glucuronidasa (GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1:1:1, SEQ ID NO:42) que contiene un intrón procesable derivado del gen específico de tejido inducible por luz de la papa ST-LS1 (Acceso Genbank: X04753), unido operativamente a una región de terminación 3', y una región de flanco izquierdo deA. tumefaciens(B-AGRtu.flanco izquierdo). Los plásmidos resultantes son utilizados para transformar plantas de soja o plantas de otro género a través de los procedimientos descriptos en los ejemplos. Alternativamente, las células de protoplastos derivadas de plantas de soja o de otro género son transformadas usando procedimientos conocidos en la técnica para llevar a cabo ensayos transitorios.
La expresión de GUS conducida por un elemento regulador que comprende uno o varios potenciadores es evaluada en ensayos estables o transitorios con plantas, para determinar los efectos del elemento potenciador sobre la expresión de una molécula de ADN transcribible. Se pueden llevar a cabo modificaciones a uno o varios elementos potenciadores o la duplicación de uno o varios elementos potenciadores sobre la base de la experimentación empírica y la regulación de la expresión génica resultante que se observa usando cada composición de elementos reguladores. La modificación de las posiciones relativas de uno o varios potenciadores en los elementos reguladores o reguladores quiméricos resultantes puede afectar la actividad transcripcional o la especificidad del elemento regulador o regulador quimérico y se determina empíricamente para identificar los mejores potenciadores para el perfil de expresión transgénica deseado dentro de la planta de soja o de otro género.
Ejemplo 13
Análisis del efecto sobre la expresión de GUS impartida por la 3' UTR sintética, T-Zm.GST7.nno:2, en plantas de soja establemente transformadas
Se transformaron plantas de soja con un vector, específicamente vectores de expresión en planta que contienen grupos de elementos reguladores que conducen la expresión del transgén de 13-glucuronidasa (GUS). Las plantas obtenidas fueron analizadas para determinar la expresión de la proteína GUS, a fin de evaluar el efecto de los elementos reguladores seleccionados sobre la expresión.
Las plantas de soja fueron transformadas con dos vectores binarios que comprendían EXP-At.GSP571 (SEQ ID NO:4) que conduce la expresión de GUS. Los casetes de transgén de GUS también comprendían la 3' UTR endógena T-Mt.Sali3-2-1:2:1 (SEQ ID NO:34) o la 3' UTR sintética, T-Zm.GST7.nno:2 (SEQ ID N<o>:44). La expresión de la proteína GUS fue medida cuantitativamente en los órganos de plantas de soja transformadas establemente, transformadas con las dos construcciones. Se comparó la expresión de GUS entre las construcciones. La siguiente Tabla 11 muestra la expresión media de GUS modulada por la 3' UTR sintética T-Zm.GST7.nno:2, respecto de la 3' UTR endógena T-Mt.Sali3-2-1:2:1, en donde “nd” significa “no determinado/a” y “bdl” significa “por debajo del límite de detección”.
Tabla 11. Expresión cuantitativa media de GUS en plantas de soja establemente transformadas.
Como se aprecia en la Tabla 11, la 3' UTR sintética T-Zm.GST7.nno:2 atenuó la expresión respecto de la 3' UTR, T-Mt.Sali3-2-1:2:1, en todos los tejidos ensayados. El grado de atenuación varió para cada tejido desde 1,5 veces en Raíces R1 hasta 7,4 veces en Hoja Sumidero V5. El uso de una 3' UTR para atenuar la expresión en plantas transformadas establemente es de gran utilidad. Por ejemplo, se puede usar una 3' UTR en combinación con otros elementos reguladores tales como promotores, líderes e intrones, para la expresión de sintonía fina de un transgén, particularmente aquellos donde la alta expresión puede dar lugar a efectos fenotípicos de apagado que son perjudiciales para la planta transformada. El análisis del transcripto de GUS obtenido confirmó la terminación apropiada del transcripto impartida por la 3' UTR sintética, T-Zm.GST7.nno:2. La 3' UTR sintética T-Zm.GST7.nno:2 es capaz de modular la expresión y de terminar correctamente la transcripción en plantas de soja establemente transformadas.
Ejemplo 14
Análisis de las 3' UTR sintéticas T-Zm.GST7.nno:2 y T-Zm.GST59.nno:1 en la expresión de GUS en células de protoplastos de maíz
Se transformaron protoplastos de hoja de maíz con vectores, específicamente vectores de expresión que contienen los elementos reguladores de prueba que conducen la expresión del transgén de 13-glucuronidasa (GUS). Los protoplastos de hoja de maíz transformados que se obtuvieron fueron analizados para determinar la expresión de la proteína GUS a fin de evaluar el efecto de los elementos reguladores seleccionados sobre la expresión.
Los protoplastos de maíz, derivados de tejido foliar, fueron transformados con vectores de expresión que comprendían los elementos de expresión sintéticos y comparados con los elementos de expresión conocidos en la técnica. Se construyeron dos vectores de expresión para comprobar la actividad de las 3' UTR sintéticas T-Zm.GST7.nno:2 (SEQ ID NO:44) y T-Zm.GST59.nno:1 (SEQ ID NO:29) y también se construyeron dos vectores de expresión de construcción. Cada una de las cuatro construcciones comprendía un casete de transgén que comprendía el promotor y líder constitutivo EXP-CaMV.35S (SEQ ID NO:46) unido operativamente 5' al intrón I-Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO:47), unido operativamente 5' a una secuencia codificante de GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1:1:1 (SEQ ID NO:42). Los vectores de expresión usados para comprobar las 3' UTR sintéticas comprendían T-Zm.GST7.nno:2 o T-Zm.GST59.nno:1 unidos operativamente 3' a la secuencia codificante de GUS. Un vector de control comprendía la 3' UTR T-Os.LTP:1 (SEQ ID NO:48) unida operativamente 3' a la secuencia codificante de GUS. El otro vector de control carecía de una 3' UTR.
Un plásmido usado en la cotransformación de los protoplastos y la normalización de los datos también fue construido usando procedimientos conocidos en la técnica. Comprendía un casete de transgén compuesto de EXP-CaMV.35S (SEQ ID NO:46) unido operativamente 5' a una secuencia codificante que codificaba la proteína fluorescente de luciferasa NanoLuc® (Promega, Madison, WI 53711), Nluc (SEQ ID No :49), que estaba unida operativamente 5' a una 3' UTR, T-Os.LTP:1 (SEQ ID NO:48).
Los protoplastos de hoja de maíz fueron transformados usando un procedimiento de transformación basado en PEG, similar a los conocidos en la técnica. Las células de protoplastos fueron transformadas en un formato de 96 pocillos. Se usaron 12 microgramos del ADN de vector de prueba o ADN de vector de control y 6 microgramos del ADN de vector NanoLuc®, para transformar 3,2 X 105 protoplastos por pocillo. Después de la transformación, los protoplastos fueron incubados a 25°C en oscuridad durante 16 a 20 horas. Luego de la incubación, los protoplastos fueron lisados y el lisado fue usado para medir la luciferasa y la expresión de GUS. Para lisar las células, se peletizaron las células de la placa mediante centrifugación, se lavaron, se resuspendieron en un volumen más pequeño y se transfirieron a tubos pocillos en tiras. Los tubos fueron centrifugados nuevamente y se aspiró el sobrenadante, descartando el pellet celular de protoplastos. El pellet celular fue resuspendido en tampón QB (100 mM KPO4, pH 7,8; 1 mM EDTA; 1% Triton X-100; 10% Glicerol; 1 mM DTT). Las células fueron lisadas mediante pipeteo enérgico de las células varias veces, agitando a vórtice los tubos y dejando incubar los tubos en hielo durante 5 minutos. Luego, se centrifugó el lisado para peletizar el desecho celular. El lisado resultante fue transferido entonces a una placa limpia. La actividad de luciferasa se sometió a ensayo utilizando el Sustrato de Ensayo con Luciferasa Nano-Glo® (Promega, Madison, WI 53711) en tampón QB. En pocas palabras, se mezcló un pequeño volumen de lisado, tampón QB y la solución de Sustrato de Ensayo con Luciferasa Nano-Glo® /QB en placas de 96 pocillos blancos. Luego, se midió la fluorescencia usando una lectora de placas PHERAstar® (BMG La Bt ECH Inc., Cary, NC 27513). La actividad de GUS se sometió a ensayo usando el sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-p-D-glucurónido (MUG) en un volumen total de reacción de 50 microlitros. El producto de la reacción, 4-metilumbeliferona (4-MU), alcanza la fluorescencia máxima a pH elevado, donde se ioniza el grupo hidroxilo. La adición de una solución básica de carbonato de sodio simultáneamente detiene el ensayo y ajusta el pH para cuantificar el producto fluorescente. Se mezcló una alícuota de lisado con una alícuota de MUG disuelto en tampón QB y se incubó a 37°C. Se extrajo una pequeña alícuota de la mezcla de reacción de lisado /MUG y se añadió a un tampón de detención en tres puntos de tiempo diferentes: (1) inmediatamente después de mezclar la reacción de lisado/MUG como “Cero Minutos de Tiempo”, (2) veinte minutos, y (3) sesenta minutos. La fluorescencia se midió con excitación a 355 nm, emisión a 460 nm, usando una lectora de placas PHERAstar® (BMG LABTECH Inc., Cary, NC 27513).
Se usaron por lo menos dos placas en la transformación, con 4 a 8 transformaciones por placa para cada vector de expresión. Para cada placa, se transforma cada construcción en 4 a 8 pocillos. Se extrae una alícuota de cada transformación para el ensayo con MUG y se deriva “nM de MUG hidrolizado” de la curva estándar en placa. También se extrae una alícuota de cada transformación para la lectura con NanoLuc® (NanoLuc® RLU (unidades relativas de luz)). La media de nM de MUG hidrolizado / NanoLuc® RLU para cada vector de expresión se normaliza con respecto al vector de expresión EXP-CaMV.35S/ I-Zm.DnaK:1/ T-Os.LTP:1 que se fija como 100%. La Tabla 12 muestra el promedio de la media de todas las placas usadas en la transformación de cada vector de expresión que comprendía las 3' UTR sintéticas T-Zm.GST7.nno:2 y T-Zm.GST59.nno:1, y los controles.
Tabla 12. Promedio de la media de nM de MUG hidrolizado / NanoLuc® RLU para cada vector de expresión.
Como se aprecia en la Tabla 12, el vector de expresión sin 3' UTR proporcionó menos expresión que el control T-Os.LTP:1. La expresión fue potenciada por las 3' UTR sintéticas T-Zm.GST7.nno:2 y T-Zm.GST59.nno:1, en comparación con el control T-Os.LTP:1. El análisis de los transcriptos demostró la terminación apropiada impartida por las 3' UTR sintéticas T-Zm.GST7.nno:2 y T-Zm.GST59.nno:1. Las 3' UTR sintéticas T-Zm.GST7.nno:2 y T-Zm.GST59.nno:1 son capaces de modular la expresión y terminar correctamente la transcripción en células de protoplastos de hojas de maíz transformado.
Ejemplo 15
Análisis de elementos reguladores que controlan GUS en protoplastos de hoja de algodón
Se transformaron protoplastos de hoja de algodón con vectores, específicamente vectores de expresión que contenían grupos de elementos reguladores que controlan la expresión del transgén de 13-glucuronidasa (GUS). Los protoplastos de hoja de algodón transformado obtenidos fueron analizados para determinar la expresión de la proteína GUS, a fin de evaluar el efecto de los grupos de elementos reguladores seleccionados sobre la expresión. Los protoplastos de algodón derivados de tejido foliar fueron transformados con vectores de expresión que comprendían elementos de expresión sintéticos y comparados con los elementos de expresión conocidos en la técnica. Se llevaron a cabo experimentos separados para comprobar la actividad de los EXP, EXP-At.GSP571 (SEQ ID NO:4), EXP-At.GSP571.nno+At.GSI21.nno:10 (SEQ ID NO:8), EXP-At.GSP571.nno+At.GSI102.nno:1 (SEQ ID NO:10), EXP-At.GSP564.nno+At.GSI17.nno:2 (SEQ ID NO:16) y EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3 (SEQ ID NO:22). Los elementos de expresión fueron clonados en vectores de expresión y unidos operativamente a una secuencia codificante de GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1:1:1 (SEQ ID NO:42), que comprendía un intrón procesable. Los vectores de expresión de control comprendían configuraciones diferentes de elementos de expresión conocidos. Asimismo, se construyeron dos plásmidos para usar en la cotransformación y la normalización de los datos, usando procedimientos conocidos en la técnica. Cada plásmido contenía una secuencia codificante de luciferasa específica que era conducida por una secuencia de EXP constitutivo. El vector de planta pFLUC comprendía un casete de transgén con un promotor constitutivo unido operativamente 5' a un intrón, (EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1, SEQ ID NO:53), unido operativamente 5' a una secuencia codificante de luciferasa de luciérnaga(Photinus pyralis)(LUCIFERASE:1:3, SEQ ID NO:54), unida operativamente 5' a una 3' UTR del gen de nopalina sintasa deAgrobacterium tumefaciens(T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO:55). El vector de planta pRLUC comprendía un casete de transgén con una secuencia de EXP constitutivo (EXP-CaMV.35S-enh-Lhcb1, SEQ ID NO:56), unida operativamente 5' a una secuencia codificante de luciferasa de pensamiento del mar(Renilla reniformis)(CR-Ren.hRenilla Lucife-0:0:1, SEQ ID NO:57), unida operativamente 5' a una 3' UTR del gen de nopalina sintasa deAgrobacterium tumefaciens(T-AGRtu.nos-1:1:13,<s>E<q>ID NO:55).
Los protoplastos de hoja de algodón fueron transformados usando un procedimiento de transformación basado en PEG, conocido en la técnica. Las células de protoplastos fueron transformadas con los plásmidos, pFLUC y pRLUC, y una cantidad equimolar de los vectores de expresión de EXP. Las mediciones de<g>U<s>y luciferasa se llevaron a cabo colocando alícuotas de una preparación lisada de células transformadas como ya se señaló, en dos bandejas diferentes de pocillos pequeños. Una bandeja se usó para las mediciones de GUS, y una segunda bandeja se usó para llevar a cabo un ensayo dual con luciferasa, empleando el sistema de ensayo de informantes de luciferasa dual (Promega Corp., Madison, WI; ver, por ejemplo, Promega Notes Magazine, No: 57, 1996, p.02). Las mediciones de las muestras se basaron en múltiples transformaciones similares a la presentada en el Ejemplo 14. Los valores medios de GUS/FLUC fueron calculados de manera similar al Ejemplo l4, pero no fueron normalizados respecto de los vectores de EXP de control.
Los EXP, EXP-At.GSP571 (SEQ ID NO:4), EXP-At.GSP571.nno+At.GSI21.nno:10 (SEQ ID NO:8) y EXP-At.GSP571.nno+At.GSI102.nno:1 (SEQ ID NO:10), fueron clonados en vectores de expresión en plantas unidos operativamente 5' a una secuencia codificante de GUS (SEQ ID NO:42), unida operativamente 5' a la 3' UTR, T-Mt.Sali3-2-1:2:1 (SEQ ID NO:34). Se construyeron dos vectores de expresión en planta de control con el EXP, EXP-At.Bglu21+At.Cyco:2 (SEQ ID NO:50), conocido por expresarse pobremente en protoplastos de hoja de algodón, y el EXP, EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3 (SEQ iD NO:5l), conocido por expresarse bien en protoplastos de hoja de algodón. Los EXP de control fueron unidos operativamente a la misma secuencia de GUS y 3' UTR. Por otra parte, un vector de expresión en plantas que comprendía un casete de transgén de GUS que comprendía el EXP, EXP-At.GSP571 (SEQ ID NO:4), unido operativamente a GUS comprendía la 3' UTR sintética, T-Zm.GST7.nno:2 (SEQ ID NO:44) para evaluar la actividad de la 3' UTR sintética. Los valores medios de GUS/FLUC para múltiples transformaciones se presentan en la Tabla 13.
Tabla 13. Valores medios de GUS/FLUC de protoplastos de hoja de algodón transformado
Como se aprecia en la Tabla 13, los EXP, EXP-At.GSP571 (SEQ ID NO:4), EXP-At.GSP571.nno+At.GSI21.nno:2 (SEQ ID NO:8) y EXP-At.GSP571.nno+At.GSI102.nno:1 (<s>E<q>ID NO:10) demostraron expresión en células de protoplastos de hoja de algodón. La 3' UTR sintética T-Zm.GST7.nno:10 (SEQ ID NO:44) funcionó de manera similar a la 3' UTR endógena T-Mt.Sali3-2-1:2:1.
Se clonó el EXP, EXP-At.GSP564.nno+At.GSI17.nno:2 (SEQ ID NO:16), en un vector de expresión en plantas unido operativamente 5' a una secuencia codificante de GUS (SEQ ID NO:42), unida operativamente 5' a la 3' UTR endógena T-Mt.Oxr-1:2:1 (SEQ ID NO:35). Se construyeron dos vectores de expresión en planta de control con el EXP, EXP-Gm.Sphas1:1:1 (SEQ ID NO:52), conocido por expresarse pobremente en protoplastos de hoja de algodón, y el EXP, EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3 (SEQ ID NO:51), conocido por expresarse bien en protoplastos de hoja de algodón. Los EXP de control fueron unidos operativamente a la misma secuencia de GUS y 3' UTR. Los valores medios de GUS/FLUC para múltiples transformaciones se presentan en la Tabla 14.
Tabla 14. Valores medios de GUS/FLUC de protoplastos de hoja de algodón transformado
Como se aprecia en la Tabla 14, el EXP sintético EXP-At.GSP564.nno+At.GSI17.nno:1 (SEQ ID NO:16) demostró expresión en protoplastos de células de hoja de algodón.
Se clonó el EXP, EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3 (SEQ ID NO:22), en un vector de expresión en plantas unido operativamente 5' a una secuencia codificante de GUS (SEQ ID NO:42), unida operativamente 5' a la 3' UTR endógena T-Mt.RD22-1:2:1 (SEQ ID NO:37). Se construyeron dos vectores de expresión en planta de control con el EXP, EXP-Gm.Sphas1:1:1 (SEQ ID NO:52), conocido por expresarse pobremente en protoplastos de hoja de algodón, y el EXP, EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3 (SEQ ID NO:51), conocido por expresarse bien en protoplastos de hoja de algodón. Los EXP de control fueron unidos operativamente a la misma secuencia de GUS y 3' UTR. Los valores medios de GUS/FLUC para múltiples transformaciones se presentan en la Tabla 15.
Tabla 15. Valores medios de GUS/FLUC de protoplastos de hoja de algodón transformado
Como se aprecia en la Tabla 15, el EXP sintético EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3 (SEQ ID NO:22) demostró expresión en protoplastos de células de hoja de algodón.
Habiendo ilustrado y descrito los principios de la presente invención, debería ser evidente para los expertos en la materia que la invención puede modificarse en su disposición y detalle sin apartarse de dichos principios. Reivindicamos todas las modificaciones que se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones.
Claims (13)
1. Una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en:
a) una secuencia con por lo menos 85% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NO: 1-3, en donde la secuencia de ADN tiene actividad reguladora de genes;
b) una secuencia que comprende cualquiera de SEQ ID NO: 1-3; y
c) un fragmento de cualquiera de SEQ ID NO: 1-3, en donde el fragmento tiene actividad reguladora génica.
2. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 1, en donde la secuencia de ADN está unida operativamente a una molécula de ADN transcribible heteróloga.
3. La molécula de ADN recombinante de cualquiera de las reivindicaiones 1 o 2, en donde la secuencia de ADN a) tiene por lo menos 90 por ciento de identidad de secuencia con la secuencia de ADN de cualquiera de SEQ ID NO:1-3; o
(b) tiene al menos un 95 por ciento de identidad de secuencia con la secuencia de ADN de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-3.
4. La molécula de ADN recombinante de cualquiera de las reivindicaiones 2 o 3, en donde la molécula de ADN transcribible heteróloga comprende un gen de interés agronómico.
5. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 4, en la que el gen de interés agronómico confiere tolerancia a herbicidas o resistencia a plagas en las plantas.
6. Una célula vegetal transgénica que comprende la molécula de ADN recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. La célula vegetal transgénica de la reivindicación 6, en la que dicha célula vegetal transgénica es una célula vegetal monocotiledónea o una célula vegetal dicotiledónea.
8. Una planta transgénica, o parte de la misma, que comprende la molécula de ADN recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
9. Una planta descendiente de la planta transgénica de la reivindicación 8, o una parte de la misma, en donde la planta descendiente o parte de la misma comprende la molécula de ADN recombinante.
10. Una semilla transgénica, en donde la semilla comprende la molécula de ADN recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
11. Un procedimiento para producir un producto básico, que comprende la obtención de una planta transgénica o parte de la misma de acuerdo con la reivindicación 8 y la producción del producto básico a partir de la misma.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en donde el producto básico es concentrado de proteína, aislado de proteína, granos, almidón, semillas, harinas gruesas, harina, biomasa o aceite de semillas.
13. Un procedimiento de expresión de una molécula de ADN transcribible que comprende la obtención de una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 8 y el cultivo de la planta, en donde está expresado el ADN transcribible.
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