ES2655700T3

ES2655700T3 - ARN pequeños en fase

Info

Publication number: ES2655700T3
Application number: ES07837683.7T
Authority: ES
Inventors: Edwards Allen; Liang Guo; Sara E. Heisel; Sergey I. Ivashuta; Yuanji I. Zhang
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 2006-08-31
Filing date: 2007-08-31
Publication date: 2018-02-21
Anticipated expiration: 2027-08-31
Also published as: US20130232644A1; AU2007290367A1; CN101600798A; US9309512B2; WO2008027592A9; WO2008027592A3; US10301623B2; US8404928B2; WO2008027592A2; EP2059596B1; US20160168569A1; EP2059596A2; EP3287524A1; AU2007290367B2; US20080066206A1

Abstract

Una construcción de ADN recombinante para la supresión génica que comprende un promotor funcional en células vegetales, operativamente unido a ADN recombinante que codifica un transcrito precursor de ARN pequeño en fase sintético y que comprende una secuencia de nucleótidos de una secuencia molde de ARN pequeño en fase, en la que dicho promotor es heterólogo de dicho ADN recombinante y en la que dicha secuencia de molde de ARN pequeño en fase comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de la SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.9, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 69, y la secuencia de ADN que codifica la SEQ ID NO. 34, en la que dicho transcrito precursor de ARN pequeño en fase sintético preserva la estructura secundaria del transcrito de dicha secuencia molde de ARN pequeño en fase, en la que dicha estructura secundaria comprende ARN hibridado que forma una estructura plegada que incluye dos brazos antiparalelos de cadena sencilla, en la que un brazo es sustancial, pero no perfectamente, complementario con el otro brazo, en la que el emparejamiento de bases entre los dos brazos de la estructura replegada da como resultado un ARN de doble cadena sustancialmente pero no perfectamente que incluye apareamientos erróneos, en el que dicho ARN hibridado comprende al menos tres ARN bicatenarios pequeños en fase contiguos, en la que cada ARN bicatenario pequeño en fase comprende dos segmentos de ARN antiparalelo de aproximadamente 20 a aproximadamente 27 nucleótidos, cada uno con al menos un apareamiento erróneo entre dichos segmentos por lo que dichos apareamientos erróneos se distribuyen a lo largo de dicho ARN hibridado, y en la que en dicho transcrito de precursor de ARN pequeño en fase sintético, al menos uno de los segmentos de ARN se modifica para suprimir al menos un gen diana reemplazando los nucleótidos de un segmento de ARN de al menos uno de dichos ARN de doble cadena pequeños en fase en dicha secuencia de molde de ARN pequeño en fase por nucleótidos correspondientes a dicho al menos un gen diana, en la que dicho al menos un gen diana se selecciona de entre múltiples segmentos no consecutivos de un gen diana, múltiples alelos de un gen diana o múltiples genes diana de una o más especies, en la que al menos una de dichas dos cadenas antiparalelas de dicho ARN bicatenario pequeño en fase es aproximadamente un 95 % complementaria de dicho al menos un gen diana, y en la que dicho promotor es heterólogo de dicho ADN recombinante.

Description

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suprimir en la célula específica, en el que el ARN diana debe expresarse en células del eucariota multicelular distintas de la célula específica. El sitio de reconocimiento exógeno incluye una secuencia de ARN que es sustancialmente complementaria, o casi perfectamente complementaria, o incluso perfectamente complementaria, a un ARN pequeño en fase; el sitio de reconocimiento exógeno se hibrida con el ARN pequeño en fase, lo que conduce a la supresión o silenciamiento del ARN diana. El ARN pequeño en fase se puede transcribir a partir de un locus de ARN pequeño en fase endógeno o endógeno, o a partir de un locus de ARN pequeño en fase sintético que se expresa transgénicamente. En diversos aspectos de la construcción de ADN recombinante, el al menos un sitio de reconocimiento exógeno se localiza dentro de al menos uno de: (a) la región 5 'no traducida del ARN diana; (b) la región 3’ no traducida del ARN diana; y (c) el ARN objetivo.

En otros aspectos, el sitio de reconocimiento exógeno es reconocido y silenciado por un ARN pequeño en fase que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en de SEQ ID NOS. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, y 65. En aspectos preferentes, el sitio de reconocimiento exógeno es reconocido y silenciado por un ARN pequeño en fase que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en de SEQ ID NOS. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 35, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 60, 61, 62, 63, 64, y 65. En un aspecto particularmente preferente, el sitio de reconocimiento exógeno es reconocido y silenciado por un ARN pequeño en fase que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en de SEQ ID NOS. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 37, 38, 40, 41, 46, 61, 62, 63, 64, y 65.

CÉLULAS VEGETALES TRANSGÉNICAS NO NATURALES Y PLANTAS TRANSGÉNICAS

Un aspecto adicional de la presente invención proporciona una célula vegetal transgénica no natural que tiene en su genoma cualquiera de las construcciones de ADN recombinante de la presente invención. Por lo tanto, los inventores reivindican una célula de planta transgénica no natural que tiene en su genoma una construcción de ADN recombinante que codifica un transcrito que se pliega en ARN hibridado que se escinde en fase in vivo en múltiples ARN bicatenarios pequeños para la supresión génica. Los inventores también describen una célula de planta transgénica no natural que tiene en su genoma una construcción de ADN recombinante que incluye ADN que transcribe a: (a) una primera serie de segmentos de ARN contiguos, y (b) una segunda serie de segmentos de ARN contiguos, en donde primeras series de segmentos contiguos de ARN hibridan in vivo a la segunda serie de segmentos de ARN para formar ARN hibridado que se escinde en fase in vivo en múltiples ARN bicatenarios pequeños ("ARN pequeños en fase") para la supresión génica. Los inventores describen además una célula vegetal transgénica no natural que tiene en su genoma una construcción de ADN recombinante, que incluye un promotor unido operativamente a ADN que transcribe a ARN que incluye: (a) al menos un sitio de reconocimiento exógeno reconocible por un ARN pequeño en fase expresado en una célula específica de un eucariota multicelular, y (b) ARN objetivo que se va a suprimir en la célula específica, en la que el ARN diana se va a expresar en células del eucariota multicelular distintas de la célula específica.

También se proporcionan una planta transgénica no natural que contiene la célula de planta transgénica no natural de la presente invención, una planta transgénica no natural cultivada a partir de la célula de planta transgénica no natural de la presente invención, y una semilla transgénica no natural producida por la no -plantas transgénicas naturales La planta transgénica no natural de la presente invención incluye plantas de cualquier etapa de desarrollo, e incluye una planta regenerada transgénica no natural preparada a partir de las células de plantas transgénicas no naturales descritas en el presente documento, o una planta de progenie transgénica no natural (que puede ser una planta de progenie endogámica o híbrida) de la planta regenerada, o semilla transgénica no natural de dicha planta transgénica no natural. También se describe una semilla transgénica no natural que tiene en su genoma una construcción de ADN recombinante de la presente invención. Las células de plantas transgénicas no naturales, las plantas transgénicas no naturales y las semillas transgénicas no naturales se preparan por procedimientos bien conocidos en la técnica, como se describe a continuación bajo el título "Fabricación y uso de células vegetales transgénicas y plantas transgénicas".

La célula vegetal transgénica no natural puede incluir una célula vegetal aislada (por ejemplo, células vegetales individuales o células cultivadas en o sobre un medio de cultivo artificial), o puede incluir una célula vegetal en tejido indiferenciado (por ejemplo, callos o cualquier agregación de células vegetales) La célula de planta transgénica no natural puede incluir una célula vegetal en al menos un tejido diferenciado seleccionado del grupo que consiste en hoja (por ejemplo, pecíolo y hoja), raíz, tallo (por ejemplo, tubérculo, rizoma, estolón, bulbo y cormo) tallo (por ejemplo, xilema, floema), madera, semilla, fruta (por ejemplo, nuez, grano, frutos carnosos) y flor (por ejemplo, estambre, filamento, antera, polen, carpelo, pistilo, ovario, óvulos).

La planta vegetal transgénica no natural o la planta transgénica no natural de la invención puede ser cualquier célula de planta o planta de interés adecuada. Ambas células vegetales transformadas transitoriamente y establemente se describen en el presente documento. Se prefieren particularmente plantas transgénicas transformadas de manera estable. En muchas realizaciones preferentes, la planta transgénica no natural es una planta transgénica fértil a partir de la cual se puede recoger la semilla, y la memoria descriptiva describe además semilla transgénica no natural de tales plantas transgénicas, en donde la semilla también contiene preferentemente la construcción recombinante de la presente invención.

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En algunas realizaciones de la presente invención, la planta no natural es una planta transgénica no natural, y todas las células (con la posible excepción de células haploides) y los tejidos de la planta contienen la construcción de ADN recombinante de la presente invención. En otras realizaciones, la planta no natural no es completamente transgénica, pero incluye células o tejidos transgénicos no naturales y células o tejidos no transgénicos (por ejemplo, tejido transgénico injertado en tejido no transgénico). En un aspecto particular, la planta incluye un vástago no transgénico y un portainjerto transgénico que incluye la célula de planta transgénica, en donde el vástago no transgénico y el portainjerto transgénico se injertan juntos. Tales aspectos son particularmente útiles cuando la planta es una planta habitualmente cultivada vegetativamente como un injerto injertado en un portainjerto (en donde el injerto y el portainjerto pueden ser de la misma especie o variedad o de diferentes especies o variedades); ejemplos incluyen uvas (por ejemplo, uvas de vino y uvas de mesa), manzanas, peras, membrillo, aguacates, cítricos, frutas de hueso (por ejemplo, melocotones, ciruelas, nectarinas, albaricoques, cerezas), kiwis, rosas y otras plantas de agricultura u ornamentales importancia.

También se describen en el presente documento plantas no naturales que no son transgénicas en el sentido de que tienen ADN recombinante introducido en su genoma, pero son plantas no naturales que tienen un genoma que ha sido modificado artificialmente por medios distintos a la tecnología de ADN recombinante. Tales modificaciones artificiales de la secuencia genómica nativa incluyen inserciones, deleciones, sustituciones, cambios de marco, transposiciones, duplicaciones e inversiones. La modificación artificial de una secuencia genómica nativa se logra por cualquier medio, incluida la mutagénesis por sustancias químicas (tales como metanosulfonato, metanosulfonato de metilo, dietilsulfato), nitrosoguanidina y otros agentes alquilantes, análogos de base tales como 5-bromodesoxiuridina, agentes de interquelación tales como bromuro de etidio, agentes de reticulación tales como platino y agentes oxidantes tales como ácido nitroso o especies de oxígeno reactivo) o mutagénesis mediante tratamientos físicos (tales como exposición a luz ultravioleta, isótopos radiactivos o radiación ionizante). Tal mutagénesis puede ser aleatoria o no aleatoria (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio). La mutagénesis se puede llevar a cabo con plantas intactas, tejidos vegetales o células vegetales. Un ejemplo no limitante de mutagénesis es el tratamiento del polen de maíz con un agente alquilante. La mutagénesis generalmente se lleva a cabo en una población, después del cribado de esa población para permitir la selección de individuos que tienen la propiedad deseada. Estas plantas no naturales son útiles en formas similares a las descritas a continuación para plantas transgénicas; por ejemplo, pueden cultivarse para la producción de semillas u otras partes cosechables, o usarse para generar generaciones de progenie (incluyendo generaciones de híbridos).

Genes diana

Los ARN pequeños en fase y las construcciones de ADN recombinante que codifican tales se pueden diseñar para suprimir cualquier gen o genes diana. El gen diana puede ser una secuencia traducible (codificante), o puede ser una secuencia no codificante (tal como una secuencia reguladora no codificante), o ambas, y puede incluir al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en un gen diana eucariota, gen diana no eucariota, una secuencia de ADN precursora de microARN y un promotor de microARN. El gen diana puede ser nativo o endógeno de la célula (por ejemplo, una célula de una planta o animal) en la que se transcribe la construcción de ADN recombinante, o puede ser nativa de una plaga o patógeno de la planta o animal en el que el ADN recombinante la construcción se transcribe. El gen diana puede ser un gen exógeno, como un transgén en una planta. Un gen diana puede ser un gen nativo destinado a la supresión, con o sin expresión concurrente de un transgén exógeno, por ejemplo, incluyendo un elemento de expresión génica en la construcción de ADN recombinante a partir de la cual se transcriben los ARN pequeños en fase, o en un recombinante separado Constructo de ADN Por ejemplo, puede ser deseable reemplazar un gen nativo con un homólogo de transgén exógeno.

El gen diana puede incluir un único gen o parte de un solo gen que está destinado a la supresión, o puede incluir, por ejemplo, múltiples segmentos consecutivos de un gen diana, múltiples segmentos no consecutivos de un gen diana, múltiples alelos de un objetivo gen o múltiples genes diana de una o más especies. Un gen diana puede incluir cualquier secuencia de cualquier especie (incluidos los no eucariotas tales como bacterias y virus, hongos, plantas, incluyendo monocotiledóneas y dicotiledóneas, tales como plantas de cultivo, plantas ornamentales y plantas no domesticadas o silvestres, invertebrados tales como artrópodos, anélidos, nematodos y moluscos, y vertebrados como anfibios, peces, aves, mamíferos domésticos o salvajes e incluso humanos.

En un aspecto, el gen diana es exógeno a la planta en la que se transcribe la construcción de ADN recombinante, pero es endógeno a una plaga o agente patógeno (por ejemplo, virus, bacterias, hongos, oomicetos e invertebrados tales como insectos, nematodos y moluscos) de la planta. El gen diana puede incluir múltiples genes diana, o múltiples segmentos de uno o más genes. En un aspecto preferente, el gen o genes diana es un gen o genes de una plaga de invertebrados o patógeno de la planta. Estos aspectos son particularmente útiles para proporcionar plantas transgénicas que tienen resistencia a una o más plagas de plantas o patógenos, por ejemplo, resistencia a un nematodo como nematodo del quiste de soja o nematodo agallador, a un insecto plaga o al menos a un virus patógeno, bacteria u hongo.

El gen diana puede ser una secuencia traducible (codificante), o puede ser una secuencia no codificante (tal como una secuencia reguladora no codificante) o ambas. Los ejemplos de un gen diana incluyen una secuencia no traducible (no codificante), tal como regiones 5 'no traducidas, promotores, potenciadores u otras regiones transcripcionales no codificantes, regiones 3' no traducidas, terminadores e intrones. Los genes diana incluyen

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morfológicos macroscópicos o microscópicos, tasas de crecimiento, rendimiento, tasas reproductivas o de reclutamiento, resistencia a plagas o patógenos o resistencia al estrés biótico o abiótico (por ejemplo, estrés hídrico, estrés salino, estrés por nutrientes, calor o frío). Dichos procedimientos pueden usar mediciones directas de un rasgo fenotípico o ensayos proxy (por ejemplo, en plantas, estos ensayos incluyen ensayos de partes de plantas tales como ensayos de hojas o raíces para determinar la tolerancia al estrés abiótico). Los procedimientos incluyen medidas directas de resistencia a la plaga de invertebrados (por ejemplo, daño a tejidos de plantas) o ensayos indirectos (por ejemplo, ensayos de rendimiento de plantas, o bioensayos tales como el gusano de la raíz del maíz occidental (Diabrotica virgifera virgifera LeConte) bioensayo larval descrito en WO2005/110068 y US2006/0021087,

o el bioensayo de nematodos del quiste de soja descrito por Steeves et al. (2006) Funct. Plant Biol., 33: 991-999, donde se miden quistes por planta, quistes por raíz de gramo, huevos por planta, huevos por raíz de gramo y huevos por quiste.

Las construcciones de ADN recombinante de la invención pueden apilarse con otro ADN recombinante para impartir rasgos adicionales (por ejemplo, en el caso de plantas transformadas, rasgos que incluyen resistencia a herbicidas, resistencia a plagas, tolerancia a la germinación en frío, tolerancia al déficit de agua y similares) por ejemplo, al expresar o suprimir otros genes. Las construcciones para la disminución y el aumento coordinados de la expresión génica se describen en el documento US2004/0126845.

Las semillas de plantas fértiles transgénicas se pueden cosechar y usar para cultivar generaciones de progenie, incluidas las generaciones híbridas, de plantas transgénicas no naturales de la presente invención que incluyen la construcción de ADN recombinante en su genoma. Por lo tanto, además de la transformación directa de una planta con una construcción de ADN recombinante de la presente invención, se pueden preparar plantas transgénicas no naturales de la invención cruzando una primera planta que tiene el ADN recombinante con una segunda planta que carece de la construcción. Por ejemplo, el ADN recombinante puede introducirse en una línea de planta que es susceptible de transformación para producir una planta transgénica, que puede cruzarse con una segunda línea de planta para introgresar el ADN recombinante en la progenie resultante. Una planta transgénica de la invención puede cruzarse con una línea de planta que tiene otro ADN recombinante que confiere uno o más rasgos adicionales (tales como resistencia a herbicidas, resistencia a plagas o enfermedades, resistencia al estrés ambiental, contenido de nutrientes modificado y mejora del rendimiento) para producir plantas de progenie que tienen ADN recombinante que confiere tanto el comportamiento de expresión de secuencia objetivo deseado como el (los) rasgo (s) adicional (es).

Típicamente, en dicha reproducción para combinar rasgos, la planta transgénica que dona el rasgo adicional es una línea masculina y la planta transgénica que tiene los rasgos base es la línea femenina. La progenie de esta segregación cruzada tal que algunas de las plantas llevarán el ADN para ambos rasgos parentales y algunas llevarán ADN para un rasgo parental; tales plantas pueden identificarse por marcadores asociados con ADN recombinante parental. Las plantas progenie que llevan ADN para ambos rasgos parentales se pueden cruzar de nuevo en la línea parental femenina múltiples veces, e. por ejemplo, generalmente de 6 a 8 generaciones, para producir una planta de progenie con sustancialmente el mismo genotipo que una línea parental transgénica original, pero para el ADN recombinante de la otra línea parental transgénica.

Otro aspecto más es una planta transgénica no natural cultivada a partir de la semilla transgénica no natural descrita en el presente documento. La presente invención contempla plantas transgénicas cultivadas directamente a partir de semillas transgénicas que contienen el ADN recombinante así como generaciones de plantas de progenie, incluyendo líneas de plantas endogámicas o híbridas, hechas cruzando una planta transgénica cultivada directamente de semilla transgénica a una segunda planta no cultivada del mismo transgénico semilla.

El cruce puede incluir, por ejemplo, los siguientes pasos: (a) plantar semillas de la primera planta parental (por ejemplo, no transgénicas o transgénicas) y una segunda planta parental que es transgénica de acuerdo con la invención; (b) cultivar las semillas de la primera y la segunda plantas parentales en plantas que lleven flores; (c) polinizar una flor del primer progenitor con polen del segundo progenitor; y (d) cosechar las semillas producidas en la planta parental portadora de la flor fertilizada.

A menudo es deseable introgresar el ADN recombinante en variedades de elite, mi. gramo., por retrocruzamiento, para transferir un rasgo deseable específico de una fuente a una endogámica u otra planta que carece de ese rasgo. Esto se puede lograr, por ejemplo, al cruzar primero una endogamia superior ("A") (progenitor recurrente) con una endocriada donante ("B") (progenitor no recurrente), que porta el / los gen (es) apropiado (s) para el rasgo en cuestión, por ejemplo, una construcción preparada de acuerdo con la presente invención. La progenie de este cruce primero se selecciona en la progenie resultante para el rasgo deseado que se transferirá desde el padre "B" no recurrente, y luego la progenie seleccionada se acopla de nuevo al padre "A" superior recurrente. Después de cinco

o más generaciones de retrocruzamiento con selección para el rasgo deseado, la progenie es hemicigótica para los loci que controlan la característica que se transfiere, pero son como el progenitor superior para la mayoría o para casi todos los otros genes. La última generación de retrocruzamiento sería autofecundada para proporcionar una progenie que sea de reproducción pura para el (los) gen (es) que se está (n) transfiriendo. yo. mi., uno o más eventos de transformación.

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A través de una serie de manipulaciones de reproducción, una construcción de ADN seleccionada puede moverse de una línea a una línea completamente diferente sin la necesidad de una manipulación recombinante adicional. De este modo, se pueden producir plantas endogámicas que son verdaderas crías para uno o más constructos de ADN. Al cruzar diferentes plantas endogámicas, se puede producir una gran cantidad de híbridos diferentes con diferentes combinaciones de construcciones de ADN. De esta manera, se pueden producir plantas que tienen las propiedades agronómicas deseables frecuentemente asociadas con híbridos ("vigor híbrido"), así como las características deseables impartidas por uno o más constructos de ADN.

Los marcadores genéticos pueden usarse para ayudar en la introgresión de uno o más constructos de ADN de la invención de un fondo genético a otro. La selección asistida por marcador ofrece ventajas en relación con la mejora convencional, ya que se puede utilizar para evitar errores causados por variaciones fenotípicas. Además, los marcadores genéticos pueden proporcionar datos con respecto al grado relativo de germoplasma de élite en la progenie individual de una cruza particular. Por ejemplo, cuando una planta con un rasgo deseado que de otro modo tiene un fondo genético no agronómicamente deseable se cruza con un padre de élite, los marcadores genéticos pueden usarse para seleccionar una progenie que no solo posea el rasgo de interés, sino que también tenga un tamaño relativamente grande. proporción del germoplasma deseado De esta forma, se minimiza el número de generaciones requeridas para intrigar uno o más rasgos en un fondo genético particular. La utilidad de la selección asistida por marcador en la cría de plantas transgénicas no naturales de la presente invención, así como los tipos de marcadores moleculares útiles, tales como SSR y SNP, se discuten en los documentos WO 02/062129, US2002/0133852, US2003/0049616 y US2003/0005491.

En ciertas células de plantas transgénicas no naturales y plantas transgénicas no naturales de la invención, puede ser deseable expresar simultáneamente (o suprimir) un gen de interés mientras también se regula la expresión de un gen diana. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la planta transgénica contiene ADN recombinante que incluye una unidad de transcripción transgénica para expresar al menos un gen de interés y un elemento de supresión génica para suprimir un gen diana.

Por lo tanto, como se describe en el presente documento, las células de plantas transgénicas no naturales o plantas transgénicas no naturales se pueden obtener mediante el uso de cualquier procedimiento de transformación transitorio o estable, integrativo o no integrativo conocido en la técnica o divulgado actualmente. Las construcciones de ADN recombinante pueden transcribirse en cualquier célula o tejido vegetal o en una planta completa de cualquier etapa de desarrollo. Las plantas transgénicas pueden derivarse de cualquier planta de monocotiledóneas o dicotiledóneas, como plantas de interés comercial o agrícola, como plantas de cultivo (especialmente plantas cultivadas utilizadas para alimentación humana o animal), madera, fibra, pulpa o celulosa. produciendo árboles y plantas, plantas vegetales, plantas frutales y plantas ornamentales. Los ejemplos no limitantes de plantas de interés incluyen plantas de cultivo de granos (tales como trigo, avena, cebada, maíz, centeno, triticale, arroz, mijo, sorgo, quinoa, amaranto y alforfón); plantas de cultivo de forraje (tales como hierbas forrajeras y dicotiledóneas de forraje incluyendo alfalfa, veza, trébol y similares); plantas de semillas oleaginosas (como algodón, cártamo, girasol, soja, colza, colza, lino, maní y palma de aceite); nueces de árbol (tales como nuez, anacardo, avellana, nuez, almendra, macadamia, y similares); caña de azúcar, coco, palma datilera, aceituna, remolacha azucarera, té y café; árboles y plantas que producen madera, fibra, pulpa o celulosa (por ejemplo, algodón, lino, yute, ramio, sisal, kenaf, switchgrass y bambú); plantas de cultivos de hortalizas, tales como legumbres (por ejemplo, frijoles, guisantes, lentejas, alfalfa, maní), lechuga, espárrago, alcachofa, apio, zanahoria, rábano, mandioca, batata, ñame, cacao, café, té, las brasicas (para ejemplo, coles, col rizada, mostaza y otras brassicas de hoja, brócoli, coliflor, coles de Bruselas, nabo, colirrábano), cucurbitáceas comestibles (por ejemplo, pepinos, melones, calabazas de verano, calabazas de invierno), alliums comestibles (por ejemplo, cebollas, ajo, puerros, chalotes, cebollinos), miembros comestibles de las solanáceas (por ejemplo, tomates, berenjenas, patatas, pimientos, mollejas) y miembros comestibles de las Chenopodiaceae (por ejemplo, remolacha, acelga, espinaca, quinoa, amaranto); plantas frutales tales como manzana, pera, cítricos (por ejemplo, naranja, lima, limón, pomelo y otros), frutas de hueso (por ejemplo, albaricoque, melocotón, ciruela, nectarina), plátano, piña, uva, kiwi, papaya, aguacate, higo, mango y bayas; y plantas ornamentales que incluyen plantas con flores ornamentales, árboles y arbustos ornamentales, cubiertas ornamentales y hierbas ornamentales. Las plantas dicotiledóneas preferentes incluyen canola, brócoli, col, zanahoria, coliflor, repollo chino, pepino, frijoles secos, berenjena, hinojo, alubias, calabazas, lechugas, melones, okra, guisantes, pimientos, calabaza, rábanos, espinacas, calabaza, sandía, algodón, papa, quinoa, amaranto, trigo sarraceno, cártamo, soja, remolacha azucarera y girasol. Las monocotiledóneas preferentes incluyen trigo, avena, cebada, maíz (incluido maíz dulce y otras variedades), centeno, triticale, arroz, hierbas ornamentales y forrajeras, sorgo, mijo, cebollas, puerros y caña de azúcar, más preferentemente maíz, trigo y arroz.

El objetivo final en la transformación de plantas es producir plantas que sean útiles para el hombre. A este respecto, las plantas transgénicas no naturales de la invención se pueden usar virtualmente para cualquier propósito que se considere valioso para el productor o el consumidor. Por ejemplo, uno puede desear cosechar la planta transgénica en sí, o cosechar semillas transgénicas de la planta transgénica para propósitos de plantación, o se pueden hacer productos a partir de la planta transgénica o sus semillas tales como aceite, almidón, etanol u otros productos de fermentación, animales piensos o alimentos para humanos, productos farmacéuticos y diversos productos industriales. Por ejemplo, el maíz se usa ampliamente en las industrias de alimentos y piensos, así como en aplicaciones industriales. Se puede encontrar un análisis más detallado de los usos del maíz, por ejemplo, en Las patentes de Estados Unidos 6,194,636, 6,207,879, 6,232,526, 6,426,446, 6,429,357, 6,433,252, 6,437,216 y

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Ejemplos

Ejemplo 1

Este ejemplo describe el ADN que codifica un transcrito que se pliega en ARN hibridado que se escinde en fase in vivo en múltiples ARN bicatenarios pequeños para la supresión génica. Más específicamente, este ejemplo proporciona secuencias de ácidos nucleicos, obtenidas a partir de plantas de cultivo de monocotiledóneas, que son útiles para hacer una única molécula de ADN recombinante que codifica un transcrito que se pliega en ARN hibridado que se escinde en fase in vivo en múltiples ARN bicatenarios pequeños para la supresión génica, independientemente de una ARN polimerasa dependiente de ARN.

Varias bibliotecas de ARN se clonaron a partir de arroz maduro (Oryza sativa) grano y de varios maíces (Zea mays) tejidos mediante secuenciación de alto rendimiento (Margulies et al. (2005) Nature, 437: 376-380) Entre las secuencias más abundantes clonadas de grano de arroz maduro y raíz de maíz, 32 DAP (días después de las polinizaciones) y 39 granos DAP fueron siete ARN de 21 mer (SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, y SEQ ID NO. 7), listado en Tabla 1.

Tabla 1

SEQ ID NO.: Número de clon Secuencia de ADN Especie / Tejido*

1: 141121 grano de arroz, raíz de maíz, grano de maíz 32DAP y 39DAP

2: 297263 grano de arroz, grano de maíz 32 DAP

3: 1196700 grano de arroz, grano de maíz 32DAP

4: 880479 grano de arroz, grano de maíz 32 DAP

5: 1275002 grano de arroz, grano de maíz 32DAP

6: 1379342 grano de arroz, raíz de maíz, hoja de maíz, grano de maíz 32DAP y 39DAP

7: 544819 grano de arroz, raíz de maíz, grano de maíz 32DAP y 39DAP

* DAP, días después de la polinización

Estos siete ARN de 21 unidades, cuando se alinearon con el genoma del arroz en el locus Os6g21900, se localizaron en dos regiones adyacentes que contenían siete y seis ARNip de 21 nt alineados de extremo a extremo, respectivamente, y formando una estructura replegada única representada en la figura 1. No hay ARNip de este gen estaban presentes en otras bibliotecas, y solo un número muy pequeño se secuenciaron a partir de la región de bucle putativo entre los brazos de la estructura replegada. Los resultados de secuenciación adicionales indicaron que esta estructura replegada contenía al menos otros tres ARN potenciales de 21 meros (en fase con y distal a los primeros siete 21-mers y bucle), aunque se predijo que los ARN pequeños resultarían de in vivo la escisión de estos ARN bicatenarios pequeños en fases adicionales se clonó solo a bajas abundancias.

Aunque se identificaron muchas variantes de ARN pequeños, solo una única fase única de 21 nucleótidos (21 nt) de la cadena positiva fue respaldada por la información de secuencia (Tabla 2) La "plenitud de fase" indica cuántas fases de 21 nt están ocupadas por ARN pequeños secuenciados en ambas cadenas; por ejemplo, una plenitud de

0.5 para la trama 7.0 con una longitud de fase de 8 indica que las ocho tramas de 21 nt están ocupadas en la cadena positiva, pero ninguna está ocupada en la cadena negativa hipotética. La "unicidad de fase" representa un puntaje de probabilidad para ARN pequeños en fases, que tiene en cuenta la ocupación de fase y la abundancia de ARN pequeños en cada fase. El marco 16.1 y el marco 7.0 representan cada lado de la estructura replegada (representada en la figura 1, con los primeros siete pequeños ARN en fase mostrados) y sus abundantes ARN pequeños en fase; la fase es muy compatible (unicidad> 0,97) para esta estructura, mientras que todas las demás fases potenciales de ARN pequeño no se soportaron suficientemente por los datos de secuencia (unicidad <0,005).

Tabla 2

Marco: Inicio (número de fase) Longitud de fase Fase de plenitud Unicidad de fase Abundancia de ARN pequeño Copias promedio

16,1: 5099(1), 5120(2), 5141(3), 5162(4), 5183(5), 5204(6), 5246(8) 8 0,43 0,9963 344, 89484, 3393, 3121, 10455, 71, 31 15271

7,0: 3620(1), 3641(2), 3662(3), 3683(4), 3704(5), 3725(6), 3746(7), 3767(8) 8 0,5 0,9717 67, 6875, 1289, 3, 151, 7, 67, 11619 2510

19,0: 3611(1), -3630(2), -3651(3), 3653(3), -3693(5), -3714(6), -3735(7), 3737(7), -3756(8), 3758(8) 8 0,62 0,0049 27, 1, 1, 59, 1, 3, 6, 2, 1, 1 10

16,0: 3629(1), 3650(2), 3671(3), -3711(5), 3713(5) 5 0,5 0,0013 1, 5, 2, 2, 2 2

4,0: 3638(1), 3680(3), 3722(5), -3741(6), 3764(7) 7 0,35 0,0011 17, 1, 2, 2, 1 5

18,0: -5120(1), 5122(1),-5141(2), 5164(3), 5185(4) 4 0,62 0,001 1, 15, 1, 73, 17 21

6,0: 3640(1), 3661(2), 3682(3), 3724(5), 3745(6), 3766(7) 7 0,42 0,0008 9, 3, 1, 1, 2, 2 3

15,0: 5140(1), 5161(2), 5182(3), 5203(4) 4 0,5 0,0007 1, 71, 4, 4 20

14,0: 3669(1), 3711(3), 3753(5) 5 0,3 0,0006 1, 6, 1 3

11,0: 5199(1), 5220(2), 5262(4) 4 0,37 0,0004 1, 3, 1 2

20,0: 3654(1), 3675(2),-3736(5), 3780(7) 7 0,28 0,0003 2, 2, 1, 2 2

3,0: 3637(1), 3658(2), 3700(4), 3721(5), -3740(6) 6 0,41 0,0003 2, 1, 2, 1, 1 1

La secuencia genómica y los precursores putativos para la estructura replegada de Oryza sativa se da en las SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, y SEQ ID NO. 11. Una secuencia de ADN genómico (SEQ ID NO. 9) Se 5 predijo que incluiría la secuencia de ADNc, la secuencia intrónica y los brazos replegados como se muestra en la figura 2, y varias versiones empalmadas alternativamente de esta transcripción se encontraron en las bases de datos de ADNc. Una abundante transcripción empalmada alternativamente (SEQ ID NO. 10) indica la eliminación de la mitad de la estructura replegada, probablemente evitando la producción de ARN pequeño. Una etiqueta de secuencia expresada (SEQ ID NO. 11) se identificó como la representación de la secuencia complementaria a SEQ 10 ID NO. 10. Una caja CANATA canónica (indicada por los nucleótidos en caja en la figura 2) se encuentra 34 bases aguas arriba del sitio de inicio de transcripción predicho en SEQ ID NO. 8, evidencia de que este es el De buena fe 5' fin de la transcripción De este modo, una estructura replegada única se transcribe desde un promotor y forma, independientemente de una ARN polimerasa dependiente de ARN, el ARN hibridado que se escinde en fase in vivo en múltiples ARN bicatenarios pequeños para la supresión génica. Alternativamente, dos (o más) variantes de corte

15 y empalme transcritas del mismo promotor, cada una contiene uno de cada uno de los brazos de la estructura replegada, y se unen en trans, independientemente de una ARN polimerasa dependiente de ARN, para formar el ARN hibridado que se escinde en fase in vivo en múltiples ARN pequeños de doble cadena.

La evidencia recolectada apoya este locus como un nuevo tipo de elemento regulatorio (supresión) mediado por ARN. diferente a trans-activos ARNip, todos los múltiples pequeños ARN bicatenarios se derivan de la transcripción

20 de ARN original o más cadena del precursor, independientemente de una ARN polimerasa dependiente de ARN y sin un sitio diana de miARN que inicia la producción de ARN bicatenario. A diferencia de los microARN, el locus está escindido in vivo a múltiples ARN pequeños en fase abundante, y (como se describe a continuación en el Ejemplo 5), este procedimiento requiere DCL4 (o un ortólogo DCL4) y no DCL1. Por lo tanto, los inventores denominan este locus novedoso como un locus de "ARN pequeño en fase".

La expresión de este locus de ARN pequeño en fase particular parece estar restringida principalmente al grano maduro tanto en maíz como en arroz, lo que indica una función endógena relacionada con la represión de los genes implicados en la maduración o mantenimiento del estado embriogénico en el grano maduro. Se predijeron objetivos putativos para cada uno de los siete ARN pequeños en fases (SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID 5 NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, y SEQ ID NO. 7), siguiendo las pautas de predicción objetivo descritas en Allen et al. (2005) Cell, 121: 207-221. Ejemplos no limitantes de estos objetivos, que incluyen miembros de la familia de transportadores de potasio de alta afinidad HAK2, se proporcionan en Tabla 3; los loci de maíz correspondientes de la base de datos pública, Maize Assembled Genomic Island (disponible en línea en magi.plantgenomics.iastate.edu, ver Fu et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 102: 12282-12287)

10 también se proporcionan.

Tabla 3

SEQ ID NO.: Número de clon Secuencia de ADN Gen diana (arroz) Locus de maíz * Valor E

3: 1196700 Dominio de proteína quinasa Os01g12300 MAGI4_89402 3,00E-24

MAGI4_122217: 7,00E-19

MAGI4_104144: 1,00E-17

MAGI4_99444: 1,00E-14

MAGI4_39748: 2,00E-14

MAGI4_22926: 3,00E-14

Cadena pesada de miosina Os12g17310: MAGI4_70672 0

MAGI4_141564: 0

5: 1275002 Transportador de tipo ABC-2 Os09g29660 MAGI4_27534 2,00E-22

Transportador de potasio 7 Os01g70940: MAGI4_99444 0

Proteína de absorción de potasio Os09g27580: MAGI4_99444 3,00E-68

Proteína del canal de cloruro Os08g38980: MAGI4_25450 e-127

* disponible públicamente en magi,plantgenomics,iastate,edu

Ejemplo 2

Este ejemplo describe una construcción de ADN recombinante que incluye un promotor ligado operablemente a ADN

15 que transcribe ARN que incluye: (a) al menos un sitio de reconocimiento exógeno reconocible por un ARN pequeño en fase expresado en una célula específica de un eucariota multicelular, y (b) diana ARN que se va a suprimir en la célula específica, en el que el ARN diana debe expresarse en células del eucariota multicelular distintas de la célula específica. Más específicamente, este ejemplo describe una construcción de ADN recombinante que incluye ADN que transcribe ARN que contiene un sitio de reconocimiento exógeno que corresponde a al menos un ARN pequeño

20 en fase derivado de un locus de ARN pequeño en fase endógeno.

Las construcciones de ADN recombinante se diseñaron para incluir un elemento de expresión génica para la expresión de un gen de interés (en este ejemplo no limitante, el gen indicador, beta-glucuronidasa, "GUS"), y un sitio de reconocimiento (sitio diana) correspondiente a al menos un ARN pequeño en fase de la presente invención (por ejemplo, uno o más de SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, y 25 SEQ ID NO. 7 como se describe en el Ejemplo 1). Se pueden diseñar construcciones de ADN recombinante similares, en las que se incluye un sitio de reconocimiento (sitio diana) correspondiente a al menos un ARN pequeño en fase de la presente invención para regular la expresión de un elemento de expresión génica para la expresión de un gen de interés (que puede ser secuencia traducible o codificante o secuencia no codificadora, incluida la secuencia reguladora), e. g., los descritos bajo el encabezado "Genes diana", o alternativamente para regular la 30 expresión de un elemento de supresión génica (por ejemplo, sentido, antisentido, combinaciones de sentido y antisentido, repeticiones en tándem de sentido o de antisentido)., microARN, ARNip y cualquier otra construcción

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diseñada para reducir la expresión de un gen diana).

Una construcción de control (pMON94320) con un promotor 35S que dirige la expresión de GUS y un terminador Hsp17 incluye la secuencia parcial SEQ ID NO. 12, con un sitio de inserción (indicado en letra negrita en la figura 3B) localizado entre la secuencia de codificación GUS y el terminador Hsp17. Se diseñaron tres constructos adicionales basados en esta construcción de control, conteniendo cada uno al menos un sitio de reconocimiento correspondiente a un ARN pequeño en fase de la presente invención. La primera construcción (pMON100574) incluyó la secuencia parcial SEQ ID NO. 13, que contenía uno de los ARN pequeños en fase de 21 meros (SEQ IDNO. 6) descrito en el Ejemplo 1, incorporado en la orientación de sentido en el sitio de inserción (Figura 3C). La segunda construcción (pMON100575) incluyó la secuencia parcial SEQ ID NO. 14, que contenía uno de los ARN pequeños en fase de 21 meros (SEQ ID NO. 6) descrito en el Ejemplo 1, incorporado en la orientación antisentido (es decir, como un sitio de reconocimiento correspondiente a SEQ ID NO. 6 en la orientación de sentido) en el sitio de inserción (Figura 3D). La tercera construcción (pMON100576) incluyó la secuencia parcial SEQ ID NO. 15, que contenía dos de los ARN pequeños en fase de 21 meros (SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO. 6) descrito en el Ejemplo 1, ambos incorporados en la orientación antisentido (es decir, como sitios de reconocimiento correspondientes a SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO. 6 en la orientación de sentido) en el sitio de inserción (Figura 3E).

El tejido de maíz de los granos en desarrollo se analizó por transferencia Northern usando una sola sonda con la secuencia CGGCGTTCTCTTGGTGGGGCA (SEQ ID NO. 16, yo. e., la secuencia antisentido de SEQ ID NO. 6). Los resultados, representados en la figura 4, indicó la transcripción del locus de ARN pequeño en fase de maíz endógeno, especialmente en embriones en desarrollo y en menor medida en endospermas en desarrollo, corroborando aún más los resultados de clonación dados en Tabla 1.

Los embriones zigóticos de maíz (21-22 días después de la polinización) se transformaron con los constructos de ADN recombinante mediante bombardeo de partículas, usando aproximadamente 0,5 microgramos de ADN administrados con una inyección de una pistola de partículas de helio. El tejido bombardeado se incubó durante 24 o 48 horas en una cámara oscura de crecimiento a una temperatura de 26 grados Celsius. Los embriones se tiñeron en solución de ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-glucurónico (24 horas a 37 grados Celsius) seguido de la limpieza del tejido teñido en etanol al 70 %. La expresión del gen de interés (GUS) codificado por el elemento de expresión génica se indicó por el nivel de tinción en los embriones; Se predijo que la expresión de GUS sería silenciada por el locus de ARN pequeño en fase endógena de maíz. Como se predijo, la expresión de GUS se silenció en los embriones transformados con las construcciones (pMON100575 y pMON100576) que contenían al menos un sitio de reconocimiento correspondiente a un ARN pequeño en fase de la presente invención. (Figura 3A). El silenciamiento observado en los embriones transformados con pMON100574 se debió presumiblemente a la transcripción endógena antisentido presente en baja abundancia como se observó en las bibliotecas de ARN de arroz clonado (ver Tabla 2 para abundancias de ARN pequeños clonados).

Los sitios de reconocimiento correspondientes a ARN pequeños en fase son útiles para regular la expresión de un transgén en una construcción que incluye al menos un sitio de reconocimiento de este tipo. Por lo tanto, esta memoria descriptiva proporciona una construcción de ADN recombinante que incluye un promotor unido operativamente al ADN que transcribe a ARN que incluye: (a) al menos un sitio de reconocimiento exógeno reconocible por un ARN pequeño en fase expresado en una célula específica de un eucariota multicelular, y) el ARN objetivo se suprime en la célula específica, en el que el ARN diana debe expresarse en células del eucariota multicelular distintas de la célula específica. La memoria descriptiva incluye una construcción de ADN recombinante que incluye un transgén y al menos un sitio de reconocimiento que corresponde a uno o más ARN pequeños en fase de la presente invención, útiles para la expresión de ese transgén en tejidos distintos de aquellos en los que se expresan los ARN pequeños en fase, y supresión del transgén en los tejidos donde se expresan los ARN pequeños en fase. Por ejemplo, SEQ ID NO. 6 se ha demostrado que se expresa en el grano de arroz (Ejemplo 1) y en el grano de maíz (este ejemplo); una construcción que contiene un transgén (por ejemplo, un gen de tolerancia a herbicidas tal como 5-enolpiruvililshikimato-3-fosfato sintasa) y al menos un sitio de reconocimiento correspondiente a SEQ ID NO. 6 es útil para la supresión del transgén en al menos arroz o maíz.

Ejemplo 3

Este ejemplo describe una construcción de ADN recombinante que incluye ADN que transcribe a: (a) una primera serie de segmentos de ARN contiguos, y (b) una segunda serie de segmentos de ARN contiguos, en donde la primera serie de segmentos de ARN contiguos hibrida in vivo a la segunda serie de segmentos de ARN para formar ARN hibridado que se escinde en fase in vivo en múltiples ARN bicatenarios pequeños ("ARN pequeños en fase") para la supresión génica. Preferentemente, el ARN hibridado se produce independientemente de una ARN polimerasa dependiente de ARN. La construcción de ADN recombinante de la presente invención puede incluir un locus de ARN pequeño en fase sintética (que puede transcribirse en un transcrito más larga o más corta que la transcrita a partir de un locus de ARN pequeño en fase de origen natural), diseñado para escindirse in vivo y en fase en cualquier número de ARN pequeños en fases para la supresión de uno o más genes diana.

Este ejemplo proporciona un aspecto de una construcción de ADN recombinante que incluye secuencias de ácido nucleico derivadas de plantas de cultivo de monocotiledóneas, que transcribe a un ARN que contiene una estructura replegada individual escindible in vivo y en fase a múltiples ARN bicatenarios pequeños para la supresión génica,

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supresión génica modificada está dirigida por un promotor específico de endosperma apropiado, tal como una zeína de maíz o un promotor B32 (nucleótidos 848 a 1259 del número de acceso de GenBank X70153, véase también Hartings et al. (1990) Plant Mol. Biol., 14: 1031-1040) Se diseñan construcciones de ARN pequeños en fase sintética adicionales de una manera similar para silenciar genes diana múltiples, tales como combinaciones de genes endógenos (por ejemplo, LKR / SDH, GLABRA1, DWARF4 y CLAVATA) o transgenes (por ejemplo, genes informadores tales como GUS o GFP), o marcadores seleccionables tales como un gen que imparte tolerancia a antibióticos o herbicidas).

Ejemplo 4

Este ejemplo describe un transcrito de ARN que se pliega en ARN hibridado que se escinde en fase in vivo en múltiples ARN bicatenarios pequeños para la supresión génica, en donde el ARN hibridado se produce independientemente de una ARN polimerasa dependiente de ARN. Más específicamente, este ejemplo proporciona secuencias de ácidos nucleicos, obtenidas de plantas de monocotiledóneas, que son útiles para hacer una construcción de ADN recombinante que codifica un transcrito que se pliega en ARN hibridado que se escinde en fase in vivo en múltiples ARN bicatenarios pequeños para la supresión génica, independientemente de una ARN polimerasa dependiente de ARN.

Siguiendo los procedimientos descritos en detalle en el Ejemplo 1, se identificó un segundo locus de "ARN pequeño en fase" a partir del arroz (Oryza sativa) bibliotecas maduras de ARN de grano y plántula. Este locus, LOC_Os12g42380.1 | 11982.m08017, tenía la secuencia de ADN

GATTCTCCCCTGCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCTCAATCGGGCGAAGCCGCCCTCGCCGCC GTCGCGGCGGCGGCGGCGAGGGCGAGCTCCTGCGAGAGATCCTCCGCCGCCTCATGCCTCG CGCGCGCGCTCCCGCTCCCGCTCTCGCCTGCAGTATTTGTTCCATTGCCGCGCACCACTTTCC GGTGGGCGGCGGGCAATGCTAGGGGTTAAGAGACCTTCTCTCCCCGAGATGGAGGCGCCGG GCGGCGCGGCGGGGGACGCGGAGGAGGAAGTTGATGCCCGGATCCGCTGGGTTCCATGGTG GCTGCTATGGAATGGTGGAATTGCTTGGATGGCCACGAAGGGGATCGACGCCAATTGTTTGG CGACCTCTACGATAGAATCGCGTCGAGTCGGGGTGTTCTTTCCTGTTATTACTAGAAGTAGTT GAATTTCGTGATTGAACACACAAGGAAGCTTGATATCGCGTCGGGGGTGTTCTTTCCTGTTA TTACTAGATGTAGTTGGGTTTCGTGATTGAACACCTAAGGAAAGGAAGCTTGATAAATGGAA GATAGTCCAGCAAGTTTTGAAGATGATAGAAAATTTGAGCGCGTCGTAGTAACTGTCGTCCA CGATCACGTCCAGTGTTGTTCATGGCATGGGGGATGGAGTCAGGATCCTTGAGGCGTCTGCT CCTGTTGCACTGCTTCATGCCTTTCCTGCCTTCTAGGATGCTTAAGATGGTTGCGAAGTCAGG TGCTTGGGAGTTCATGAAGCGGTCATAATCAATTTCGCTCTCTGTAGTACTTTCTCTGGTGTC TTCCCCGTTGCTTCCTTTTGGAAGAAAAGCGTCCTTTAGAATCTCTTGAGAGAGTGCACTTTC TCCCTCTCCTGCCATCAGTAGTGCCTTTATTTTCGCTTGGTTTCCGCATCATCAGGTGGCACTT ATAGAAATTATTTTATGGAGGAAAAAGCATTGTATGGCATGATAGAAATATCCTTATGGATA AAACTAGGACACTTGCAAGTGTTCAATGGGAGTCACCTTACCTTTTTTGCCTACCTGTCTGCA TTTCATGAATGGGATTCCTTCTCCTGCGCCGGTGCTGTCTTCTCAAATGGGAAATGGAGGCA AGCATCTGCCCTGTTCCATGGTGGCAGCCATGGAATGATGGGATTTCTTTGATGGTCATAAA GGAGATCAAAACCAACGGTTGGCAATCTCTGCAGGGATGATGAACCAGGCTTGTAATATCT GTTGCTGATTTCTTTGGAAGACATAACGGCAAGCTTCATGGGGCACGATGGATTTCAGATGG TTGCTTCAGCCATGTCTCAAGATTCAGTTGATGGACCTCAAGTTTCTGGGTGCAGTGCCACG AGTCTTGGTCAGCCCAAGAGTAAGCGCAGGACTGGTGACAAGGCAAGAGGGGAGAAGAAG GCACTCAAAGTTAAGATTAACCTTGCCAGCCCGGCCAAAAAAATTAAGAAAAGTAGCAAAA AGAAGGGCAAAAAGGGCACTGTTGCTGGCAGGATAGGGAGAAAATGCACTCTCTCAAGAGA TTCTAAAGGGCGCTTTCTTCCAAGAGAGAGTAAGGGGGGAGACATCGGAGGAAATGCTACA GAGAGTGAAGTTGATTATGACCGCTTCATGAACTTTCAGGCACCTGACTTCGCTACCATCTT AAGTATTTTGAAAGGCTGGAAAGGCATGAAGCAATGTAACAAGATCAGGCGCCTCAAGGAT CCTGACTTCGTCCCTCTCATGAACGTCATGAGCAACACTGGATATGTGACCGAGGATGATGG TCACTATGATGTGCTGAAAGTCTTGATGCATGCAGATGGCTGGTCTGCATAGTGATTCAAGC TCTCAAATCAAAACATTCAGGCCTATGGCCTTGTTGCTAGAACAGTGGTTTCTTCTTTCACCT TTAAAACTTGATGGACTTTGTTCCATTTATCTTAGAAATTTTGTTGCCCTTGAGTCCGGTGGA TATGTACTGGAGTATGCTATACTGGGTGATTTAATGGTGATAATGTTAAATCTTGATACTAGT TCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ ID NO. 33), y un puntaje de unicidad de fase de 0,959, altamente favorable al transcrito de ARN predicho que tiene la secuencia AGUCCAGCAAGUUUUGAAGAUGAUAGAAAAUUUGAGCGCGUCGUAGUAACUGUCGUCCA CGAUCACGUCCAGUGUUGUUCAUGGCAUGGGGGAUGGAGUCAGGAUCCUUGAGGCGUCU GCUCCUGUUGCACUGCUUCAUGCCUUUCCUGCCUUCUAGGAUGCUUAAGAUGGUUGCGAA GUCAGGUGCUUGGGAGUUCAUGAAGCGGUCAUAAUCAAUUUCGCUCUCUGUAGUACUUU CUCUGGUGUCUUCCCCGUUGCUUCCUUUUGGAAGAAAAGCGUCCUUUAGAAUCUCUUGAG AGAGUGCACUUUCUCCCUCUCCUGCCAUCAGUAGUGCCUUUAUUUUCGCUUGGUUUCCGG CAAAAAGGGCACUGUUGCUGGGAGGAUAGGGAGAAAAUGCACUCUCUCAAGAGAUUCUA AAGGGCGCUUUCUUCCAAGAGAGAGUAAGGGGGGAGACAUCGGAGGAAAUGCUACAGAG AGUGAAGUUGAUUAUGACCGCUUCAUGAACUUUCAGGCACCUGACUUCGCUACCAUCUUA AGUAUUUUGAAAGGCUGGAAAGGCAUGAAGCAAUGUAACAGAUCAGGCGCCUCAAGGAU

CCUGACUUCGUCCCUCUCAUGAACGUCAUGAGCAACACUGGAUAUGUGACCGAGGAUGAU GGUCACUAUGAUGUGCUGAAA (SEQ ID NO. 34) y que contiene la secuencia y la estructura replegada única como se muestra en la figura 6. Figura 7A representa la abundancia de ARNip en transcripciones por un cuarto de millón de secuencias ("tpq") a lo largo de toda la secuencia (alrededor de 2 kilobases)y la figura 7B representa una

5 vista ampliada de la región de ARNip y la fase de 21 nucleótidos de la pequeña abundancia de ARN de este locus.

Al igual que con el locus de ARN pequeño en fases descrito en el Ejemplo 1, el locus teniendo SEQ ID NO. 33 fue predicho para transcribir a ARN (SEQ ID NO. 34) formando ARN hibridado independientemente de una ARN polimerasa dependiente de ARN y ser escindible in vivo en fase en múltiples ARN pequeños de doble cadena. A diferencia de los ARNip de acción trans, todos los múltiples ARN bicatenarios pequeños derivan del transcrito de

10 ARN original o más del precursor, independientemente de una ARN polimerasa dependiente de ARN y sin un sitio objetivo de miARN que inicia la producción de ARN de doble cadena.. A diferencia de los microARN, el locus está escindido in vivo a múltiples ARN pequeños en fase abundante, y (como se describe a continuación en el Ejemplo 5), este procedimiento requiere DCL4 o un ortólogo DCL4 y no DCL1.

Datos sobre los ARN pequeños en fase de este locus (SEQ ID NO. 33) se proporcionan en Tabla 4. La mayoría de

15 estos ARN pequeños en fase se clonaron a partir de las bibliotecas de ARN de arroz pequeño, y varios también se identificaron en el maíz (Zea mays) Librerías de ARN preparadas a partir de granos (32 días después de la polinización y 39 días después de la polinización) y raíz (etapa V9), lo que indica que existe un locus de ARN pequeño en fase similar en el maíz. La transcripción (SEQ ID NO. 34) predicho a partir de este locus (SEQ ID NO. 33) también incluye la secuencia de flanqueo 5'

20 AGUCCAGCAAGUUUUGAAGAUGAUAGAAAAUUUGAGCGCGUCGUAGUAACUGUC GUCCACGA (SEQ ID NO. 66) y 3’ secuencia flanqueante GAGGAUGAUGGUCACUAUGAUGUGCUGAAA (SEQ ID NO. 67) así como una secuencia de espaciador UUUAUUUUCGCUUGGUUUCCGGCAAAAAGGG (SEQ ID NO. 68) localizado entre los brazos 5 'y 3' de la estructura replegada, que incluye un giro de 3 nucleótidos. Figura 6 representa la posición relativa de cada pequeño ARN a lo largo de los brazos 5 'y 3' de la estructura de ARN hibridado (replegada) (SEQ ID

25 NO. 34) pronosticado desde el lugar del arroz (SEQ ID NO. 33). La mayoría, pero no todos, de estos ARN pequeños son 21-mers. El pequeño ARN predicho para ser codificado por SEQ ID NO. 59 contiene 27 nucleótidos, que incluyen un gran bulto de 8 nucleótidos desapareados; se predice que la modificación de esta secuencia para que este pequeño ARN esté más cerca de dos vueltas helicoidales (aproximadamente 21 nucleótidos) da como resultado el procesamiento de este pequeño ARN.

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Ejemplo 5

Este ejemplo describe el ADN que codifica un transcrito que se pliega en ARN hibridado que se escinde en fase in vivo en múltiples ARN bicatenarios pequeños ("ARN pequeños en fase") para la supresión génica, en donde el ARN hibridado se produce independientemente de una ARN polimerasa dependiente de ARN. El locus de sARN de fase OS06g21900 (descrito en el Ejemplo 1 y con la estructura parcial representada en la figura 1) es procesado in vivo a ARN pequeños de múltiples fases; todos los múltiples pequeños ARN bicatenarios se derivan de la cadena positiva del precursor, que los distingue de trans-actuando ARNip. Y, a diferencia de los microARN, el locus contiene múltiples ARN pequeños en fases abundantes. Este ejemplo proporciona una caracterización adicional de un locus de ARN pequeño en fase como claramente distinto de los microARN canónicos y trans-activos ARNip.

El locus de sARN en fases Os06g21900, localizado en el cromosoma 6 de arroz, se caracterizó adicionalmente. Un precursor de 898 nucleótidos que se mapeó a este locus se secuenció a partir del clon de biblioteca LIB4833-001R1-N1-G10 y se encontró que tenía la secuencia de ADN

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la transcripción correspondiente contenía los ARN pequeños en fase (ver Ejemplo 1) distribuido entre dos regiones a lo largo de la transcripción (Figura 8A). Este locus contiene dos exones (exones 2 y 3, indicados por las regiones sombreadas) que forman una estructura larga, imperfecta y plegada que contiene ocho ARN de doble cadena pequeños de 21 nucleótidos, separados por un intrón de ~1.2 kB (Figura 8B). No se encontraron ARN pequeños que coincidieran con el Exón 1, ni ninguna secuencia diana de miARN que pudiera iniciar un trans-se identifica la fase de ARN i activa (ver Allen et al. (2005) Cell, 121: 207-221; Vaucheret (2005) Sci. STKE, 2005, e43; y Yoshikawa et al. (2005) Genes Dev., 19: 2164-2175) El análisis de transferencia de gel de ARN del ARN pequeño en fase más abundante confirmó que la expresión era específica del grano de arroz (Figura 8C). Ninguno de los dos pequeños ARN en fase más abundantes ("P7", SEQ ID NO. 6, y "P4", SEQ ID NO. 3) fue detectado en plántulas de arroz o en otras especies de plantas probadas.

Los ARN pequeños en fase forman una nueva clase de ARN pequeños reguladores que difieren de los microARN canónicos (miARN) y trans-actuando ARNip. Los ARN pequeños en fase descritos en el presente documento son en cierta medida una reminiscencia de miR163 en Arabidopsis en el que se secuenciaron dos fases de ARNip con un solo ARN pequeño (miR163 en sí mismo) acumulándose significativamente; ver Allen et al. (2004) Nat. Genet., 36: 1282-1290; y Kurihara y Watanabe (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 101: 12753-12758. Sin embargo, los ARN pequeños en fase difieren claramente de miR163 en que se procesan múltiples ARN pequeños en fase abundante y pueden aislarse a partir de un solo transcrito. El locus de ARN pequeños en fase es una estructura replegada imperfecta, extendida, única (por ejemplo, los loci representados en la figura 1, la figura 6, o Figura 8B), y por lo tanto también es claramente diferente de la trans-actuando sici loci identificados en Arabidopsis, que requieren una ARN polimerasa dependiente de ARN (RDR6) para generar el ARN bicatenario a partir del cual se procesan los ARNip en fase.

La estructura replegada extendida del locus de ARN pequeño en fase Os06g21900 sugiere que este precursor no se procesa a través de la vía canónica de miARN. La naturaleza gradual de los ARN en fases pequeñas indica además que son el resultado del procesamiento por DCL4 o un ortólogo DCL4 en lugar de por DCL1. Para confirmar adicionalmente que los ARN pequeños en fase descritos en el presente documento son únicos y distintos de los microARN canónicos (miARN) y trans-activo ARNip, la longitud completa de ADNc Os06g21900 phased small locus

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ARN se transformó en Arabidopsis thaliana Columbia (Col-0) ecotipo y mutantes dcll-7 (un knock-out de DCL1) y dcl4-1 (un knock-out DCL4). Se extrajo el ARN y se analizaron las transferencias usando sondas correspondientes a ARN pequeños en fase "P7". (SEQ ID NO. 6), y "P5" (SEQ ID NO. 4), un miARN canónico (miR173) y un trans-activo ARNip (ta-siR255) (Figura 8D).

Los ARN pequeños de 21 nucleótidos en fase se expresaron en gran medida en eventos de transformación de Col-0 y dcl1-7, pero en el dcl4-1 mutante, sARN en fase de 21 nucleótidos estaban ausentes, observándose sólo pequeños ARN débiles de 24 nucleótidos (similar a lo que se observó para ta-siR255). Estos datos son consistentes con la función de DCL4 en el procesamiento de ARN pequeños en fase, pero, a diferencia de trans-ARNip que actúan, no se requirió un sitio de iniciación de miARN en el caso de los loci de ARN pequeños en fase descritos en el presente documento. Estos datos también demostraron que el locus de ARN pequeño en fase de una planta de cultivo de monocotiledóneas se procesó de manera eficiente en una planta dicotiledónea. Por lo tanto, los sARN en fase se procesan a través de vías distintas de las de los microARN canónicos (miARN) y trans-activos ARNip. Como se describe en otros ejemplos descritos en el presente documento, el locus de ARN pequeño en fase es útil como molde para diseñar una construcción de ADN recombinante que codifica un transcrito que se pliega en ARN hibridado que se escinde en fase in vivo en múltiples ARN bicatenarios pequeños para la supresión génica, o alternativamente como un molde para diseñar una construcción de ADN recombinante que incluye ADN que transcribe: (a) una primera serie de segmentos de ARN contiguos, y (b) una segunda serie de segmentos de ARN contiguos, donde la primera serie de segmentos contiguos de ARN hibrida in vivo a la segunda serie de segmentos de ARN para formar ARN hibridado que se escinde en fase in vivo en múltiples ARN bicatenarios pequeños ("ARN pequeños en fase") para la supresión génica.

Ejemplo 6

Este ejemplo describe una construcción de ADN recombinante que incluye ADN que transcribe a: (a) una primera serie de segmentos de ARN contiguos, y (b) una segunda serie de segmentos de ARN contiguos, en donde la primera serie de segmentos de ARN contiguos hibrida in vivo a la segunda serie de segmentos de ARN para formar ARN hibridado que se escinde en fase in vivo en múltiples ARN bicatenarios pequeños ("ARN pequeños en fase") para la supresión génica.

Este ejemplo proporciona un aspecto de una construcción de ADN recombinante que incluye secuencias de ácido nucleico derivadas de plantas de cultivo de monocotiledóneas, que transcribe a un ARN que contiene una estructura replegada individual escindible in vivo y en fase a múltiples ARN bicatenarios pequeños para la supresión génica, independientemente de una ARN polimerasa dependiente de ARN. Este ejemplo es una construcción de ADN recombinante diseñada para suprimir múltiples genes diana. El locus de ARN pequeño en fase Os06g21900 (ver Ejemplo 1) se modificó para suprimir tres genes diana de la siguiente manera: nucleótidos de los ARN pequeños en fase con los identificadores 1196700 (SEQ ID NO. 3), 1379342 (SEQ ID NO. 6), y 544819 (SEQ ID NO. 7) fueron reemplazados, respectivamente, con nucleótidos correspondientes a un segmento de los genes GL1, IDA y LFY de Arabidopsis thaliana. La secuencia resultante fue

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Esta secuencia se sintetizó, se subclonó en un vector binario de dicotiledónea (pMON97890) que incluía un marcador seleccionable de resistencia al glifosato, y se transformó en Arabidopsis thaliana usando una técnica de 5

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inmersión floral como se describe por Clough y Bent (1998), Plant J., 16: 735-743. Los eventos resultantes se seleccionan usando glifosato, y las plantas seleccionadas se criban para los fenotipos esperados, i. e., pérdida de tricomas por supresión de GL1 (Marks y Feldmann (1989) Plant Cell, 1: 1043-1050), prevención de la abscisión de pétalos mediante supresión de IDA (Butenko et al. (2003) Plant Cell, 15: 2296-2307), y la conversión de flor en hoja por supresión de LFY (Schwab et al. (2006) Plant Cell, 18: 1121-1133).

Ejemplo 7

Este ejemplo describe una construcción de ADN recombinante que incluye ADN que transcribe a: (a) una primera serie de segmentos de ARN contiguos, y (b) una segunda serie de segmentos de ARN contiguos, en donde la primera serie de segmentos de ARN contiguos hibrida in vivo a la segunda serie de segmentos de ARN para formar ARN hibridado que se escinde en fase in vivo en múltiples ARN bicatenarios pequeños ("ARN pequeños en fase") para la supresión génica. Más específicamente, este ejemplo describe una construcción de ADN recombinante que transcribe al ARN escindido in vivo en fase en ARN pequeños en fase para la supresión génica de múltiples virus en las plantas.

Los ARN pequeños en fase se diseñaron para dirigirse a regiones altamente homólogas de geminivirus, tospovirus y un potexvirus de importancia económica que infectan al tomate. Estos virus incluyen el virus del rizado de la hoja amarilla del tomate (aislado de la República Dominicana), el virus de Nueva Delhi del rizado de la hoja del tomate, el virus del rizado de la hoja del tomate, el virus de la vena amarilla de Pepper huasteco, el mosaico del pimiento dorado, Pepino virus del mosaico, virus del marchitamiento manchado del tomate, virus de la necrosis del brote del maní, y Pimiento virus de la clorosis. Las regiones homólogas permiten un conjunto limitado de ARN pequeños en fase para controlar muchos virus; adicionalmente, se predice que estas regiones conservadas tienen menos probabilidades de desarrollar resistencia debido a cambios en la base que impedirían o evitarían la supresión por ARN pequeños en fase. La puntuación de Reynolds, la asimetría funcional y las propiedades de los miARN se tuvieron en cuenta al seleccionar las secuencias diana para la supresión. Se utilizan ARN pequeños de fases múltiples para mejorar el silenciamiento y prevenir la resistencia.

En este ejemplo, las secuencias de nucleótidos para suprimir múltiples dianas virales se usaron para reemplazar las secuencias nativas (es decir, segmentos de cada uno de los 21 nucleótidos contiguos) de los abundantes ARN pequeños en fase derivados de una secuencia de armazón (el ADNc de Os06g21900, SEQ ID NO. 69), con nucleótidos adicionales cambiados cuando sea necesario para preservar la estructura secundaria como se encuentra en la transcripción del precursor nativo. Los segmentos de reemplazo de 21 nucleótidos incluyeron dos secuencias para suprimir geminivirus, TGGTACAACGTCATTGATGAC (SEQ ID NO. 71) y TGGACCTTACATGGCCCTTCA (SEQ ID NO. 72), una secuencia para suprimir potexvirus, TAATTGTGCAGCTCATCACCC (SEQ ID NO. 73), y tres secuencias para suprimir tospovirus (una para cada segmento de estos virus tripartitos), TAGATGGGAAATATAGATATC (SEQ ID NO. 74, dirigirse al segmento M de tospovirus), TGCTTATATGTATGTTCTGTA (SEQ ID NO. 75, dirigirse al segmento L de tospovirus) y TCAAGAGTCTTTGAAAGAAAG (SEQ ID NO. 76, dirigirse al segmento S de tospovirus). Los segmentos de reemplazo se incorporaron a una secuencia de ADN que codifica un precursor de ARN pequeño en fase sintético (es decir, un transcrito de ARN que se escindió). in vivo en fase en ARN pequeños en fase para la supresión génica de múltiples virus en plantas),

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