ES2986360T3

ES2986360T3 - Proteínas de unión a antígeno que se unen a PD-L1

Info

Publication number: ES2986360T3
Application number: ES17745008T
Authority: ES
Inventors: Heyue Zhou
Original assignee: Yuhan Corp
Current assignee: Yuhan Corp
Priority date: 2016-01-29
Filing date: 2017-01-27
Publication date: 2024-11-11
Anticipated expiration: 2037-01-27
Also published as: KR20190026642A; EP3408400A4; IL260846B; AU2017212717B2; CL2018002034A1; US20170218066A1; US10919964B2; SG11201806496SA; EP3408400A1; MX2022011659A; JP2022095910A; CN109715821B; JP7140867B2; EP3408400B1; US20210147539A1; EP3408400C0; MX2018009228A; US20190092861A1; CN116333124A; IL260846A

Abstract

Se han descrito anticuerpos de la clase IgG anti-PD-L1 que tienen una capacidad mejorada para fabricarse con mayores rendimientos. Más específicamente, se han descrito anticuerpos humanos que se unen a PD-L1, fragmentos de unión a PD-L1 que se pueden fabricar con mayores rendimientos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de unión a antígeno que se unen a PD-L1

Solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 62/288.912, presentada el 29 de enero de 2016.

Listado de secuencias

La presente solicitud contiene un listado de secuencias que se ha enviado electrónicamente en formato ASCII. Dicha copia ASCII, creada el 27 de enero de 2017, se denomina 126036-06620_ST25.txt y tiene un tamaño de 8,0 kilobytes.

Campo técnico

La presente divulgación proporciona anticuerpos de clase IgG anti-PD-L1 que tienen una capacidad mejorada para fabricarse con rendimientos más altos. Más específicamente, la presente divulgación proporciona anticuerpos humanos que se unen a PD-L1 y fragmentos de unión a PD-L1.

Antecedentes de la invención

El ligando de muerte programada 1 (PD-L1) es una proteína transmembrana de tipo 1 de 40 kDa. PD-L1 (el ADNc de PD-L1 humano está compuesto por la secuencia de bases mostrada por el n.° de registro de EMBL/GenBank NM_001267706 y el ADNc de PD-L1 de ratón está compuesto por la secuencia de bases mostrada por NM_021893), que es un ligando de PD-1, se expresa en las denominadas células presentadoras de antígeno tales como monocitos activados y células dendríticas. Estas células presentan moléculas de interacción que inducen una variedad de señales inmunoinductoras para linfocitos T, y PD-L1 es una de estas moléculas que inducen la señal inhibidora ligándose a PD-1. Se ha revelado que la ligación de PD-L1 suprimió la activación (proliferación celular e inducción de diversas producciones de citocinas) de linfocitos T que expresan PD-1. La expresión de PD-L1 se ha confirmado no sólo en células inmunocompetentes, sino también en un cierto tipo de líneas celulares tumorales (líneas celulares derivadas de leucemia monocítica, líneas celulares derivadas de mastocitos, líneas celulares derivadas de carcinomas hepáticos, líneas celulares derivadas de neuroblastos y líneas celulares derivadas de carcinomas de mama) (Nature Immunology (2001), vol. 2, edición 3, págs. 261-267).

La muerte programada 1 (PD-1) es un miembro de la familia de receptores CD28, que incluye CD28, CTLA-4, ICOS, PD-L1 y BTLA. El miembro inicial de la familia, CD28, se descubrió por el efecto funcional sobre el aumento de la proliferación de células T tras la adición de anticuerpos monoclonales (Hutloffet al.(1999) Nature 397:263-266; Hansenet al.(1980) Immunogenics 10:247-260). Se han identificado dos ligandos de glucoproteína de superficie celular para PD-1, PD-L1 y PDL-2, y se ha demostrado que regulan por disminución la activación de células T y se produce secreción de citocinas tras la unión a PD-1 (Freemanet al.(2000) J. Exp. Med. 192:1027-34; Latchmanet al.(2001) Nat. Immunol. 2:261-8; Carteret al.(2002) Eur. J. Immunol. 32: 634-43; Ohigashiet al.(2005) Clin. Cancer Res. 11: 2947-53). Tanto PD-L1 (B7-H1) como<p>D-L2 (B7-DC) son homólogos de B7 que se unen a PD-1. También se ha demostrado que la expresión de PD-L1 en la superficie celular está regulada por incremento a través de la estimulación con IFN-g.

Se ha encontrado expresión de PD-L1 en varios cánceres murinos y humanos, incluido carcinoma de pulmón, ovario y colon humano y diversos mielomas (Iwaiet al.(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:12293-7; Ohigashiet al.(2005) Clin. Cancer Res. 11: 2947-53). Se ha sugerido que PD-L1 desempeña un papel en la inmunidad tumoral aumentando la apoptosis de clones de células T específicas de antígeno (Donget al.(2002) Nat. Med. 8:793-800). También se ha sugerido que PD-L1 podría estar implicado en la inflamación de la mucosa intestinal y la inhibición de PD-L1 suprime la enfermedad de consunción asociada con colitis (Kanaiet al.(2003) J. Immunol. 171:4156-63). El documento US 2013/323249 describe proteínas de unión a antígeno que se unen a PD-L1.

Sumario de la invención

Los aspectos y realizaciones de la presente invención se exponen en las reivindicaciones.

Las referencias a métodos de tratamiento en los párrafos posteriores de esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.

La presente divulgación encontró que un anticuerpo (denominado H6B1L) divulgado en la solicitud de patente estadounidense n.° 2013-0323249 (13/907.685 presentada el 31 de mayo de 2013) como SEQ ID NO. 213 de tipo natural para la cadena pesada y SEQ ID NO. 214 para la cadena ligera no podía fabricarse en cantidad suficiente en ciertas condiciones dada la fragmentación amino terminal. Por tanto, la presente divulgación proporciona anticuerpos H6B1L variantes que pueden fabricarse, en particular, en células CHO sin fragmentación de la cadena ligera.

La presente divulgación proporciona un anticuerpo completamente humano de una clase IgG que se une a un epítopo de PD-L1, que tiene una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos un 95 % idéntica a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO. 1, y que tiene una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos un 95 % idéntica a las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO. 2 y SEQ ID NO. 3. Preferiblemente, el anticuerpo completamente humano tiene tanto una cadena pesada como una cadena ligera en donde el anticuerpo tiene una secuencia de dominio variable de cadena pesada/cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2 (denominado H6B1L-EM en el presente documento) y SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 3 (denominado H6B1L-EV en el presente documento).

La presente divulgación proporciona un fragmento de anticuerpo completamente humano Fab, que tiene una región de dominio variable de una cadena pesada y una región de dominio variable de una cadena ligera, en donde la secuencia de dominio variable de cadena pesada es al menos un 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 1, y que tiene una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos un 95 % idéntica a las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO. 2 y SEQ ID NO. 3. Preferiblemente, el fragmento Fab de anticuerpo completamente humano tiene tanto una región de dominio variable de cadena pesada como una región de dominio variable de cadena ligera en donde el anticuerpo tiene una secuencia de dominio variable de cadena pesada/cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2 y SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 3.

La presente divulgación proporciona un anticuerpo humano de cadena sencilla, que tiene una región de dominio variable de una cadena pesada y una región de dominio variable de una cadena ligera y una conexión de enlazador peptídico de las regiones de dominio variable de cadena pesada y cadena ligera, en donde la secuencia de dominio variable de cadena pesada es al menos un 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 1, y que tiene una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos un 95 % idéntica a las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO. 2 y SEQ ID NO. 3. Preferiblemente, el anticuerpo de cadena sencilla completamente humano tiene tanto una región de dominio variable de cadena pesada como una región de dominio variable de cadena ligera, en donde el anticuerpo de cadena sencilla completamente humano tiene una secuencia de dominio variable de cadena pesada/cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2 y SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 3.

La presente divulgación proporciona además un método para tratar un amplio espectro de cánceres de mamíferos o un amplio espectro de enfermedades inflamatorias y enfermedades autoinmunitarias, que comprende administrar una cantidad eficaz de un polipéptido anti-PD-L1, en donde el polipéptido anti-PD-L1 se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo completamente humano de una clase IgG que se une a un epítopo de PD-L1, un fragmento de anticuerpo completamente humano Fab, que tiene una región de dominio variable de una cadena pesada y una región de dominio variable de una cadena ligera, un anticuerpo humano de cadena sencilla, que tiene una región de dominio variable de una cadena pesada y una región de dominio variable de una cadena ligera y una conexión de enlazador peptídico de las regiones de dominio variable de cadena pesada y cadena ligera, y combinaciones de los mismos;

en donde el anticuerpo completamente humano tiene una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos un 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 1, y que tiene una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos un 95 % idéntica a las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO. 2 y SEQ ID NO. 3;

en donde el fragmento de anticuerpo completamente humano Fab tiene la secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos un 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 1, y que tiene la secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos un 95 % idéntica a las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID n O. 2 y SEQ ID NO. 3; y

en donde el anticuerpo humano de cadena sencilla tiene la secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos un 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 1, y que tiene la secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos un 95 % idéntica a las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO. 2 y SEQ ID NO. 3. La región variable de cadena pesada puede comprender un dominio CDR1, un dominio CDR2 y un dominio CDR3 como se expone en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7.

Según la divulgación, el anticuerpo completamente humano tiene tanto una cadena pesada como una cadena ligera en donde el anticuerpo tiene una secuencia de dominio variable de cadena pesada/cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2 (denominado H6B1L-EM en el presente documento) y SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 3 (denominado H6B1L-EV en el presente documento). Preferiblemente, el fragmento Fab de anticuerpo completamente humano tiene tanto una región de dominio variable de cadena pesada como una región de dominio variable de cadena ligera en donde el anticuerpo tiene una secuencia de dominio variable de cadena pesada/cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2 (denominado H6B1LEM en el presente documento) y SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 3 (denominado H6B1L-EV en el presente documento). Preferiblemente, el anticuerpo de cadena sencilla completamente humano tiene tanto una región de dominio variable de cadena pesada como una región de dominio variable de cadena ligera, en donde el anticuerpo de cadena sencilla completamente humano tiene una secuencia de dominio variable de cadena pesada/cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2 y SEQ ID NO. 1/SEQ ID N<o>.3.

La divulgación proporciona además un anticuerpo completamente humano de una clase IgG que se une a un epítopo de PD-L1, en donde el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO. 1, y comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO. 2 o SEQ ID NO. 3.

La divulgación proporciona además un anticuerpo completamente humano de una clase IgG que se une a un epítopo de PD-L1, en donde el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende un dominio CDR1, un dominio CDR2 y un dominio CDR3 como se expone en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7, respectivamente, y comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO. 2 o SEQ ID NO. 3.

El anticuerpo completamente humano de la invención puede ser, en ciertas realizaciones, una IgG1 o una IgG4.

En una realización, la invención también incluye una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-PD-L1 (o fragmento del mismo) de la invención, y un portador farmacéuticamente aceptable.

La divulgación también incluye un método para tratar a un sujeto humano que tiene cáncer o una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria, comprendiendo dicho método administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo completamente humano, fragmento Fab o scFv anti-PD-L1. En una realización, el amplio espectro de cánceres de mamífero que va a tratarse se selecciona del grupo que consiste en cánceres de ovario, colon, mama, pulmón, mielomas, tumores del SNC derivados de neuroblastos, leucemias monocíticas, leucemias derivadas de células B, leucemias derivadas de células T, linfomas derivados de células B, linfomas derivados de células T, tumores derivados de mastocitos y combinaciones de los mismos. En una realización, la enfermedad autoinmunitaria o enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en inflamación de la mucosa intestinal, enfermedad de consunción asociada con colitis, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, infecciones víricas, artritis reumatoide, osteoartritis, psoriasis, enfermedad de Crohn y enfermedad inflamatoria intestinal.

Según la divulgación, el anticuerpo o fragmento se produce en una célula huésped de mamífero, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO).

Breve descripción de las figuras

Las figuras 1A y 1B muestran una comparación de picos de espectrometría de masas de las cadenas ligeras para el anticuerpo H6B1L de tipo natural original en el gráfico superior (figura 1A) y el presente anticuerpo variante H6-B1L-EM en el gráfico inferior (figura 1B). Como se describe en la figura 1B, no se detectó fragmento de cadena ligera (LC) para la cadena ligera de H6B1LEM en comparación con la cadena ligera parental. Los anticuerpos descritos en la figura 1 se produjeron en células CHO.

Descripción detallada

Definiciones

Una “proteína de unión a antígeno” es una proteína que comprende una porción que se une a un antígeno y, opcionalmente, una porción de armazón o marco que permite que la porción de unión a antígeno adopte una conformación que promueve la unión de la proteína de unión a antígeno al antígeno. Los ejemplos de proteínas de unión a antígeno incluyen anticuerpos, fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, una porción de unión a antígeno de un anticuerpo), derivados de anticuerpo y análogos de anticuerpo. La proteína de unión a antígeno puede comprender, por ejemplo, un armazón proteico alternativo o armazón artificial con CDR injertadas o derivados de CDR. Tales armazones incluyen, pero no se limitan a, armazones derivados de anticuerpos que comprenden mutaciones introducidas para, por ejemplo, estabilizar la estructura tridimensional de la proteína de unión a antígeno, así como armazones completamente sintéticos que comprenden, por ejemplo, un polímero biocompatible. Véase, por ejemplo, Korndorferet al.,2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, volumen 53, tema 1: 121-129; Roqueet al.,2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654. Además, pueden usarse miméticos de anticuerpos peptídicos (“PAM”), así como armazones basados en miméticos de anticuerpos que utilizan componentes de fibronectina como armazón.

Una proteína de unión a antígeno puede tener, por ejemplo, la estructura de una inmunoglobulina de origen natural. Una “inmunoglobulina” es una molécula tetramérica. En una “inmunoglobulina intacta” (que tiene una estructura de cadena pesada y ligera como la de una inmunoglobulina de origen natural), cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena “ligera” (aproximadamente 25 kDa) y una cadena “pesada” (aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes se unen por una región “J” de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región “D” de aproximadamente 10 aminoácidos más. Véase, en general, Fundamental Immunology cap. 7 (Paul, W., ed., 2a ed.

Raven Press, N.Y. (1989)). Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo de manera que una inmunoglobulina intacta tiene dos sitios de unión. Debe observarse que el término “inmunoglobulina de origen natural” no se refiere a la fuente de la inmunoglobulina, sino más bien a la estructura global de la inmunoglobulina.

Las regiones variables de las cadenas de inmunoglobulina de origen natural presentan la misma estructura general de regiones marco relativamente conservadas (FR) unidas por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de complementariedad o CDR. Desde el extremo N al extremo C terminal, tanto las cadenas ligeras como pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio es según las definiciones de Kabatet al.en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, publicación de los NIH n.° 91-3242, 1991. Otros sistemas de numeración para los aminoácidos en cadenas de inmunoglobulina incluyen IMGT.RTM (sistema de información internacional ImMunoGeneTics; Lefrancet al.,Dev. Comp. Immunol. 29: 185-203; 2005) y AHo (Honegger y Pluckthun, J. Mol. Biol. 309(3):657-670; 2001).

Los anticuerpos pueden obtenerse a partir de fuentes tales como suero o plasma que contienen inmunoglobulinas que tienen especificidad antigénica variada. Si tales anticuerpos se someten a purificación por afinidad, pueden enriquecerse para una especificidad antigénica particular. Tales preparaciones enriquecidas de anticuerpos se fabrican habitualmente de menos de aproximadamente el 10 % de anticuerpo que tiene actividad de unión específica para el antígeno particular. Someter estas preparaciones a varias rondas de purificación por afinidad puede aumentar la proporción de anticuerpo que tiene actividad de unión específica para el antígeno. Los anticuerpos preparados de esta manera se denominan a menudo “monoespecíficos”. Las preparaciones de anticuerpos monoespecíficos pueden estar compuestas por aproximadamente un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % o 99,9 % de anticuerpo que tiene actividad de unión específica para el antígeno particular.

Un “anticuerpo” se refiere a una inmunoglobulina intacta o a una porción de unión a antígeno de la misma que compite con el anticuerpo intacto por la unión específica, a menos que se especifique lo contrario. En una realización, un anticuerpo es una inmunoglobulina intacta. Las porciones de unión al antígeno pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Las porciones de unión al antígeno incluyen, entre otros, Fab, Fab', F(ab')<2>, Fv, anticuerpos de dominio (dAb) y fragmentos de región determinante de complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena sencilla (scFv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión específica a antígeno al polipéptido.

Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) y las regiones marco (FR) de un anticuerpo dado pueden identificarse usando el sistema descrito por Kabatet al.,citado anteriormente; Lefrancet al.,citado anteriormente y/o Honegger y Pluckthun, citado anteriormente. Pueden incorporarse una o más CDR en una molécula o bien covalentemente o bien no covalentemente para convertirla en una proteína de unión a antígeno. Una proteína de unión a antígeno puede incorporar la(s) CDR como parte de una cadena polipeptídica más grande, puede unir covalentemente la(s) CDR a otra cadena polipeptídica o puede incorporar la(s) CDR de forma no covalente. Las CDR permiten que la proteína de unión a antígeno se una específicamente a un antígeno particular de interés.

Una proteína de unión a antígeno puede tener uno o más sitios de unión. Si hay más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina humana de origen natural tiene normalmente dos sitios de unión idénticos, mientras que un anticuerpo “biespecífico” o “bifuncional” tiene dos sitios de unión diferentes.

El término “anticuerpo humano” incluye un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, que tiene una o más regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. En una realización, todos los dominios variables y constantes se derivan de secuencias de inmunoglobulina humana (un anticuerpo completamente humano). Estos anticuerpos pueden prepararse de una variedad de maneras, ejemplos de las cuales se describen a continuación, incluyendo a través de la inmunización con un antígeno de interés de un ratón que está modificado genéticamente para expresar anticuerpos derivados de genes que codifican cadenas pesadas y/o ligeras humanas. Los anticuerpos humanos pueden identificarse de una variedad de maneras, incluyendo a través de la presentación en fago o a través de la inmunización de un ratón con un antígeno de interés donde el ratón está modificado genéticamente para expresar anticuerpos derivados de genes que codifican cadenas pesadas y/o ligeras humanas. En una realización, se prepara un anticuerpo completamente humano usando métodos recombinantes de manera que el patrón de glucosilación del anticuerpo es diferente de un anticuerpo que tiene la misma secuencia si tuviera que existir en la naturaleza.

Un “anticuerpo humanizado” tiene una secuencia que difiere de la secuencia de un anticuerpo derivado de una especie no humana en una o más sustituciones, deleciones y/o adiciones de aminoácidos, de modo que es menos probable que el anticuerpo humanizado induzca una respuesta inmunitaria, y/o induce una respuesta inmunitaria menos grave, en comparación con el anticuerpo de especie no humana, cuando se administra a un sujeto humano. En una realización, ciertos aminoácidos en los dominios marco y constante de las cadenas pesada y/o ligera del anticuerpo de especie no humana se mutan para producir el anticuerpo humanizado. En otra realización, el/los dominio(s) constante(s) de un anticuerpo humano se fusiona(n) al/a los dominio(s) variable(s) de una especie no humana. En otra realización, uno o más residuos de aminoácidos en una o más secuencias de CDR de un anticuerpo no humano se cambian para reducir la probable inmunogenicidad del anticuerpo no humano cuando se administra a un sujeto humano, en donde los residuos de aminoácidos cambiados no son críticos para la unión inmunoespecífica del anticuerpo a su antígeno, o los cambios en la secuencia de aminoácidos que se realizan son cambios conservativos, de manera que la unión del anticuerpo humanizado al antígeno no es significativamente peor que la unión del anticuerpo no humano al antígeno. Pueden encontrarse ejemplos de cómo preparar anticuerpos humanizados en las patentes estadounidenses 6.054.297, 5.886.152 y 5.877.293.

El término “anticuerpo quimérico” se refiere a un anticuerpo que contiene una o más regiones de un anticuerpo y una o más regiones de uno o más de otros anticuerpos. En una realización, una o más de las CDR se derivan de un anticuerpo anti-PD-L1 humano. En otra realización, todas las CDR se derivan de un anticuerpo anti-PD-L1 humano. En otra realización, las CDR de más de un anticuerpo anti-PD-L1 humano se mezclan y se aparean en un anticuerpo quimérico. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede comprender una CDR1 de la cadena ligera de un primer anticuerpo anti-PD-L1 humano, una CDR2 y una CDR3 de la cadena ligera de un segundo anticuerpo anti-PD-L1 humano, y las CDR de la cadena pesada de un tercer anticuerpo anti-PD-L1. Son posibles otras combinaciones. Además, las regiones marco pueden derivarse de uno de los mismos anticuerpos anti-PD-L1, de uno o más anticuerpos diferentes, tales como un anticuerpo humano, o de un anticuerpo humanizado. En un ejemplo de un anticuerpo quimérico, una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a, homóloga a, o derivada de un anticuerpo de una especie particular o perteneciente a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de las cadenas son idénticas a, homólogas a, o derivadas de un(os) anticuerpo(s) de otra especie o perteneciente(s) a otra clase o subclase de anticuerpo. También se incluyen fragmentos de tales anticuerpos que presentan la actividad biológica deseada (es decir, la capacidad de unirse específicamente a PD-L1).

Un “fragmento Fab” es un fragmento monovalente que tiene los dominios Vl, Vh, Cl y Cm ; un fragmento F(ab')2 es un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd tiene los dominios Vh y Ch1 ; un fragmento Fv tiene los dominios Vl y Vh de un único brazo de un anticuerpo; y un fragmento dAb tiene un dominio Vh, un dominio Vl o un fragmento de unión a antígeno de un dominio Vh o VL (patentes estadounidenses 6.846.634; 6.696.245, publicación de patente estadounidense 20/0202512; 2004/0202995; 2004/0038291; 2004/0009507; 2003/0039958 y Wardet al.,Nature 341: 544-546, 1989).

Un “anticuerpo de cadena sencilla” o un “scFv” es un anticuerpo en el que una región V<l>y una V<h>se unen por medio de un enlazador (por ejemplo, una secuencia sintética de residuos de aminoácidos) para formar una cadena proteica continua. En ciertas realizaciones, el enlazador es lo suficientemente largo como para permitir que la cadena proteica se pliegue de nuevo sobre sí misma y forme un sitio de unión a antígeno monovalente (véanse, por ejemplo, Birdet al.,1988, Science 242:423-26 y Hustonet al.,1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83). Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes que comprenden dos cadenas polipeptídicas, en donde cada cadena polipeptídica comprende dominios Vh y Vl unidos por un enlazador que es demasiado corto como para permitir el emparejamiento entre dos dominios en la misma cadena, permitiendo así que cada dominio se acople con un dominio complementario en otra cadena polipeptídica (véanse, por ejemplo, Holligeret al.,1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48 y Poljaket al.,1994, Structure 2: 1121 -23). Si las dos cadenas polipeptídicas de un diacuerpo son idénticas, entonces un diacuerpo resultante de su emparejamiento tendrá dos sitios de unión a antígeno idénticos. Pueden usarse cadenas polipeptídicas que tienen secuencias diferentes para preparar un diacuerpo con dos sitios de unión a antígeno diferentes. De manera similar, los tricuerpos y tetracuerpos son anticuerpos que comprenden tres y cuatro cadenas polipeptídicas, respectivamente, y que forman tres y cuatro sitios de unión a antígeno, respectivamente, que pueden ser iguales o diferentes.

Un “anticuerpo neutralizante” o un “anticuerpo inhibidor” es un anticuerpo que inhibe la activación proteolítica de PD-L1 cuando un exceso del anticuerpo anti-PD-L1 reduce la cantidad de activación en al menos aproximadamente el 20 % usando un ensayo tal como los descritos en el presente documento en los ejemplos. En diversas realizaciones, la proteína de unión a antígeno reduce la cantidad de cantidad de activación proteolítica de PD-L1 en al menos el 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % y 99,9 %.

Los expertos en la técnica pueden preparar fácilmente fragmentos o análogos de anticuerpos siguiendo las enseñanzas de esta memoria descriptiva y usando técnicas conocidas en la técnica. Los extremos amino y carboxiterminales de fragmentos o análogos preferidos se producen cerca de los límites de los dominios funcionales. Pueden identificarse dominios estructurales y funcionales mediante comparación de los datos de secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos con bases de datos de secuencias públicas o patentadas. Pueden usarse métodos de comparación computarizados para identificar motivos de secuencia o dominios de conformación de proteína predichos que se producen en otras proteínas de estructura y/o función conocida. Se conocen métodos para identificar secuencias de proteínas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Véase, Bowieet al.,1991, Science 253:164.

Un “anticuerpo injertado con CDR” es un anticuerpo que comprende una o más CDR derivadas de un anticuerpo de una especie o isotipo particular y el marco de otro anticuerpo de la misma o diferente especie o isotipo.

Un “anticuerpo multiespecífico” es un anticuerpo que reconoce más de un epítopo en uno o más antígenos. Una subclase de este tipo de anticuerpo es un “anticuerpo biespecífico” que reconoce dos epítopos distintos en el mismo antígeno o en antígenos diferentes.

Una proteína de unión a antígeno “se une específicamente” a un antígeno (por ejemplo, PD-L1 humano) si se une al antígeno con una constante de disociación de 1 nanomolar o menos.

Un “dominio de unión a antígeno”, “región de unión a antígeno” o “sitio de unión a antígeno” es una porción de una proteína de unión a antígeno que contiene residuos de aminoácidos (u otros restos) que interaccionan con un antígeno y contribuyen a la especificidad y afinidad de la proteína de unión a antígeno por el antígeno. Para un anticuerpo que se une específicamente a su antígeno, éste incluirá al menos parte de al menos uno de sus dominios de CDR.

Un “epítopo” es la porción de una molécula a la que se une una proteína de unión a antígeno (por ejemplo, mediante un anticuerpo). Un epítopo puede comprender porciones no contiguas de la molécula (por ejemplo, en un polipéptido, los restos de aminoácidos que no son contiguos en la secuencia primaria del polipéptido pero que, en el contexto de la estructura terciaria y cuaternaria del polipéptido, están lo suficientemente cerca entre sí como para unirse a una proteína de unión a antígeno).

El “porcentaje de identidad” o “porcentaje de homología” de dos secuencias polinucleotídicas o de dos polipeptídicas se determina comparando las secuencias usando el programa informático GAP (una parte del paquete GCG Wisconsin, versión 10.3 (Accelrys, San Diego, CA)) usando sus parámetros por defecto.

Los términos “polinucleótido”, “oligonucleótido” y “ácido nucleico” se usan indistintamente en todo el documento e incluyen moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico), moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm), análogos del ADN o ARN generados usando análogos de nucleótidos (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos y análogos de nucleótidos de origen no natural) e híbridos de los mismos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria. Las moléculas de ácido nucleico pueden comprender un marco de lectura abierto contiguo que codifica un anticuerpo, o un fragmento, derivado, muteína o variante del mismo.

Dos polinucleótidos monocatenarios son “el complemento” uno de otro si sus secuencias pueden alinearse en una orientación antiparalela de manera que cada nucleótido en un polinucleótido esté opuesto a su nucleótido complementario en el otro polinucleótido, sin la introducción de huecos, y sin nucleótidos no emparejados en el extremo 5' o 3' de cualquier secuencia. Un polinucleótido es “complementario” a otro polinucleótido si los dos polinucleótidos pueden hibridarse entre sí en condiciones moderadamente rigurosas. Por tanto, un polinucleótido puede ser complementario a otro polinucleótido sin ser su complemento.

Un “vector” es un ácido nucleico que puede usarse para introducir otro ácido nucleico unido al mismo en una célula. Un tipo de vector es un “plásmido”, que se refiere a una molécula de ADN bicatenario lineal o circular en la que pueden ligarse segmentos de ácido nucleico adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral (por ejemplo, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados de replicación defectuosa), en donde pueden introducirse segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que comprenden un origen de replicación bacteriano y vectores episomales de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episomales) se integran en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped, y de ese modo se replican junto con el genoma huésped. Un “vector de expresión” es un tipo de vector que puede dirigir la expresión de un polinucleótido elegido.

Una secuencia de nucleótidos está “operativamente unida” a una secuencia reguladora si la secuencia reguladora afecta a la expresión (por ejemplo, el nivel, tiempo o ubicación de la expresión) de la secuencia de nucleótidos. Una “secuencia reguladora” es un ácido nucleico que afecta a la expresión (por ejemplo, el nivel, momento o ubicación de la expresión) de un ácido nucleico al que está operativamente unida. La secuencia reguladora puede, por ejemplo, ejercer sus efectos directamente sobre el ácido nucleico regulado, o a través de la acción de una o más moléculas distintas (por ejemplo, polipéptidos que se unen a la secuencia reguladora y/o al ácido nucleico). Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Se describen ejemplos adicionales de secuencias reguladoras en, por ejemplo, Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California y Baronet al.,1995. Nucleic Acids Res. 23:3605-06.

Una “célula huésped” es una célula que puede usarse para expresar un ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico de la divulgación. Una célula huésped puede ser un procariota, por ejemplo,E. coli,o puede ser un eucariota, por ejemplo, un eucariota unicelular(porejemplo, una levadura u otro hongo), una célula vegetal (por ejemplo, una célula vegetal de tabaco o tomate), una célula animal (por ejemplo, una célula humana, una célula de mono, una célula de hámster, una célula de rata, una célula de ratón o una célula de insecto) o un hibridoma. Los ejemplos de células huésped incluyen la línea COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (véase Gluzmanet al.,1981, Cell 23:175), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (Ch O) o sus derivados tales como Veggie CHO y líneas celulares relacionadas que crecen en medios sin suero (véase Rasmussenet al.,1998, Cytotechnology 28:31) o la cepa CHO DX-B11, que es deficiente en DHFR (véase Urlaubet al.,1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20), células HeLa, líneas celulares BHK (ATCC CRL 10), la línea celular CV1/EBNA derivada de la línea celular CV1 de riñón de mono verde africano (ATCC CCL 70) (véase McMahanet al.,1991, EMBO J. 10:2821), células renales embrionarias humanas tales como 293,293 EBNA o MSR 293, células A431 epidérmicas humanas, células Colo205 humanas, otras líneas celulares de primates transformadas, células diploides normales, cepas celulares derivadas de cultivoin vitrode tejido primario, explantes primarios, células HL-60, U937, HaK o Jurkat. En una realización, una célula huésped es una célula huésped de mamífero que no es humana. Normalmente, una célula huésped es una célula cultivada que puede transformarse o transfectarse con un ácido nucleico codificante de polipéptido, que puede expresarse entonces en la célula huésped. La expresión “célula huésped recombinante” puede usarse para indicar una célula huésped que se ha transformado o transfectado con un ácido nucleico que va a expresarse. Una célula huésped también puede ser una célula que comprende el ácido nucleico, pero no lo expresa a un nivel deseado a menos que se introduzca una secuencia reguladora en la célula huésped de manera que se una operativamente con el ácido nucleico. Se entiende que el término célula huésped se refiere no sólo a la célula objeto particular sino también a la progenie o potencial progenie de tal célula. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a, por ejemplo, mutación o influencia ambiental, tal progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula parental, pero todavía se incluyen dentro del alcance del término tal como se usa en el presente documento. En una realización, una célula huésped es una célula CHO.

El término “anticuerpo recombinante” se refiere a un anticuerpo que se expresa a partir de una célula huésped (o línea celular) transfectada con un vector de expresión (o posiblemente más de un vector de expresión) que comprende la secuencia codificante del anticuerpo, o una porción del mismo (por ejemplo, una secuencia de ADN que codifica una región variable de cadena pesada o cadena ligera como se describe en el presente documento). En una realización, dicha secuencia codificante no está asociada de manera natural con la célula. En una realización, un anticuerpo recombinante tiene un patrón de glucosilación que es diferente del patrón de glucosilación de un anticuerpo que tiene la misma secuencia si tuviera que existir en la naturaleza. En una realización, se expresa un anticuerpo recombinante en una célula huésped de mamífero que no es una célula huésped humana. Notablemente, las células huésped de mamífero individuales tienen patrones de glicosilación únicos.

Los términos “inhibidor de PD-L1 ” y “antagonista de PD-L1 ” se usan indistintamente. Cada uno es una molécula que inhibe de manera detectable al menos una función de PD-L1. Por el contrario, un “agonista de PD-L1 ” es una molécula que aumenta de manera detectable al menos una función de PD-L1. No es necesario que la inhibición provocada por un inhibidor de PD-L1 sea completa siempre que sea detectable usando un ensayo. Puede usarse cualquier ensayo de una función de PD-L1, cuyos ejemplos se proporcionan en el presente documento. Los ejemplos de funciones de PD-L1 que pueden inhibirse por un inhibidor de PD-L1, o aumentarse por un agonista de PD-L1, incluyen el crecimiento de células cancerosas o la apoptosis (muerte celular programada), etc. Los ejemplos de tipos de inhibidores de PD-L1 y agonistas de PD-L1 incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos de unión a PD-L1 tales como proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, proteínas de unión a antígeno inhibidoras de PD-L1), anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y derivados de anticuerpo.

Los términos “péptido”, “polipéptido” y “proteína” se refieren cada uno a una molécula que comprende dos o más residuos de aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. Estos términos abarcan, por ejemplo, proteínas nativas y artificiales, fragmentos de proteínas y análogos de polipéptidos (tales como muteínas, variantes y proteínas de fusión) de una secuencia de proteínas, así como proteínas modificadas postraduccionalmente, o de otro modo covalentemente o no covalentemente. Un péptido, polipéptido o proteína puede ser monomérico o polimérico.

Una “variante” de un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) comprende una secuencia de aminoácidos en donde uno o más residuos de aminoácidos se insertan, delecionan y/o sustituyen en la secuencia de aminoácidos en relación con otra secuencia polipeptídica. Las variantes divulgadas incluyen, por ejemplo, proteínas de fusión.

Un “derivado” de un polipéptido es un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) que se ha modificado químicamente, por ejemplo, mediante conjugación con otro resto químico (tal como, por ejemplo, polietilenglicol o albúmina, por ejemplo, albúmina sérica humana), fosforilación y glucosilación. A menos que se indique lo contrario, el término “anticuerpo” incluye, además de anticuerpos que comprenden dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa, derivados, variantes, fragmentos y muteínas de los mismos, ejemplos de los cuales se describen a continuación.

Proteínas de unión a antígeno PD-L1

La presente divulgación proporciona un anticuerpo completamente humano de una clase de IgG que se une a un epítopo de PD-L1 con una afinidad de unión de 10-6 M o menos, que tiene una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos un 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 1, y que tiene una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos un 95 % idéntica a las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en. Preferiblemente, el anticuerpo completamente humano tiene tanto una cadena pesada como una cadena ligera en donde el anticuerpo tiene una secuencia de dominio variable de cadena pesada/cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2 (denominado H6B1L-EM en el presente documento) y SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 3 (denominado H6B1L-EV en el presente documento). Las secuencias del anticuerpo parental H6B1L y sus variantes -EM y -EV se proporcionan en la tabla de secuencias a continuación. Los anticuerpos anti-PD-L1 -EM y -EV divulgados en el presente documento se han identificado como que tienen ventajas para la expresión, particularmente en células CHO, en donde se evita la fragmentación. Preferiblemente, el anticuerpo (o fragmento) anti-PD-L1 de la invención se une a PD-L1 humano.

Las proteínas de unión a antígeno incluyen anticuerpos monoclonales completamente humanos que inhiben una actividad biológica de PD-L1.

El anticuerpo completamente humano divulgado en el presente documento puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprende un dominio CDR3 (como se determina usando el esquema de numeración de Kabat) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y un dominio variable de cadena ligera que comprende un dominio CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. El anticuerpo completamente humano descrito en el presente documento puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprende un dominio CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y un dominio variable de cadena ligera que comprende un dominio CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. El anticuerpo completamente humano descrito en el presente documento puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprende un dominio CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y un dominio variable de cadena ligera que comprende un dominio CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. El anticuerpo completamente humano descrito en el presente documento puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprende una CDR3, una CDR2 y una CDR1 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 6 y 5, respectivamente, y un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDR3, una CDR2 y una CDR1 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, 9 y 8, respectivamente.

La divulgación proporciona un anticuerpo completamente humano de una clase de IgG (por ejemplo, IgG1 o IgG4) que se une a un epítopo de PD-L1, en donde el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO. 1, y comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO. 2 o SEQ ID NO. 3. También se divulga un anticuerpo completamente humano de una clase de IgG (por ejemplo, IgG1 o IgG4) que se une a un epítopo de PD-L1, en donde el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende un dominio CDR1, un dominio CDR2 y un dominio CDR3 como se expone en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7, respectivamente, y comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO. 2 o SEQ ID NO. 3.

También se contemplan en el presente documento fragmentos de anticuerpo, en donde el fragmento de anticuerpo se une a PD-L1 y comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO. 1, y comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO. 2 o SEQ ID NO. 3. También se divulga un fragmento de anticuerpo anti-PD-L1 que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende un dominio CDR1, un dominio CDR2 y un dominio CDR3 como se expone en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7, respectivamente, y comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO. 2 o SEQ ID NO. 3.

La presente divulgación proporciona un fragmento de anticuerpo completamente humano Fab, que tiene una región de dominio variable de una cadena pesada y una región de dominio variable de una cadena ligera, en donde la secuencia de dominio variable de cadena pesada es al menos un 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 1, y que tiene una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos un 95 % idéntica a las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en. Preferiblemente, el fragmento de anticuerpo completamente humano Fab tiene tanto una región de dominio variable de cadena pesada como una región de dominio variable de cadena ligera en donde el anticuerpo tiene una secuencia de dominio variable de cadena pesada/cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2 y SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 3.

También se divulga un fragmento de anticuerpo completamente humano Fab que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una CDR3 (como se determina usando el esquema de numeración de Kabat) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. También se divulga un fragmento de anticuerpo completamente humano Fab que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. También se divulga un fragmento de anticuerpo completamente humano Fab que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. También se divulga un fragmento de anticuerpo completamente humano Fab que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una CDR3, una CDR2 y una CDR1 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 6 y 5, respectivamente, y un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDR3, una CDR2 y una CDR1 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, 9 y 8, respectivamente.

Los fragmentos de unión a antígeno de las proteínas de unión a antígeno de la invención pueden producirse mediante técnicas convencionales. Los ejemplos de tales fragmentos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab y F(ab')<2>.

La presente divulgación proporciona un anticuerpo humano de cadena sencilla, que tiene una región de dominio variable de una cadena pesada y una región de dominio variable de una cadena ligera y una conexión de enlazador peptídico de las regiones de dominio variable de cadena pesada y cadena ligera, en donde la secuencia de dominio variable de cadena pesada es al menos un 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 1, y que tiene una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos un 95 % idéntica a las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO. 2 y SEQ ID NO. 3. Preferiblemente, el anticuerpo de cadena sencilla completamente humano tiene tanto una región de dominio variable de cadena pesada como una región de dominio variable de cadena ligera, en donde el anticuerpo de cadena sencilla completamente humano tiene una secuencia de dominio variable de cadena pesada/cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO.

1/SEQ ID NO. 2 y SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 3.

También se divulga un anticuerpo humano de cadena sencilla que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una CDR3 (como se determina usando el esquema de numeración de Kabat) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. También se divulga un anticuerpo humano de cadena sencilla que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. También se divulga un anticuerpo humano de cadena sencilla que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. También se divulga un anticuerpo humano de cadena sencilla que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una CDR3, una CDR2 y una CDR1 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 6 y 5, respectivamente, y un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDR3, una CDR2 y una CDR1 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, 9 y 8, respectivamente.

La presente divulgación proporciona además un método para tratar un amplio espectro de cánceres de mamíferos o enfermedades inflamatorias o enfermedades autoinmunitarias, que comprende administrar una cantidad eficaz de un polipéptido anti-PD-L1, en donde el polipéptido anti-PD-L1 se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo completamente humano de una clase de IgG que se une a un epítopo de PD-L1 con una afinidad de unión de al menos 10<-6>M, un fragmento de anticuerpo completamente humano Fab, que tiene una región de dominio variable de una cadena pesada y una región de dominio variable de una cadena ligera, un anticuerpo humano de cadena sencilla, que tiene una región de dominio variable de una cadena pesada y una región de dominio variable de una cadena ligera y una conexión de enlazador peptídico de las regiones de dominio variable de cadena pesada y cadena ligera, y combinaciones de los mismos; en donde el anticuerpo completamente humano tiene una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos un 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 1, y que tiene una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos un 95 % idéntica a las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en; en donde el fragmento de anticuerpo completamente humano Fab tiene la secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos un 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 1, y que tiene la secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos un 95 % idéntica a las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO. 2 y SEQ ID NO. 3; y en donde el anticuerpo humano de cadena sencilla tiene la secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos un 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 1, y que tiene la secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos un 95 % idéntica a las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO. 2 y SEQ ID NO. 3.

Preferiblemente, el anticuerpo completamente humano tiene tanto una cadena pesada como una cadena ligera en donde el anticuerpo tiene una secuencia de dominio variable de cadena pesada/cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en S<e>Q ID NO. 1/SEQ ID NO. 2 y SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 3. Preferiblemente, el fragmento Fab de anticuerpo completamente humano tiene tanto una región de dominio variable de cadena pesada como una región de dominio variable de cadena ligera en donde el anticuerpo tiene una secuencia de dominio variable de cadena pesada/cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2 y SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 3. Preferiblemente, el anticuerpo de cadena sencilla completamente humano tiene tanto una región de dominio variable de cadena pesada como una región de dominio variable de cadena ligera, en donde el anticuerpo de cadena sencilla completamente humano tiene una secuencia de dominio variable de cadena pesada/cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2 y SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 3.

En realizaciones particulares, las proteínas de unión a antígeno de la presente invención tienen una afinidad de unión (K<a>) por PD-L1 de al menos 10<6>. En otras realizaciones, las proteínas de unión a antígeno presentan una K<a>de al menos 10<7>, al menos 10<8>, al menos 10<9>o al menos 10<10>. En otra realización, la proteína de unión a antígeno presenta una K<a>sustancialmente igual que la de un anticuerpo descrito en el presente documento en los ejemplos.

En otra realización, la presente divulgación proporciona una proteína de unión a antígeno que tiene una baja velocidad de disociación de PD-L1. En una realización, la proteína de unión a antígeno tiene una K<off>de 1 X 10<-4>a<-1>o inferior. En otra realización, la K<off>es de 5 X 10<-5>a<-1>o inferior. En otra realización, la K<off>es sustancialmente igual que un anticuerpo descrito en el presente documento. En otra realización, la proteína de unión a antígeno se une a PD-L1 con sustancialmente la misma K<off>que un anticuerpo descrito en el presente documento.

Los parámetros de afinidad pueden determinarse usando métodos convencionales conocidos en la técnica, por ejemplo, BIACORE.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una proteína de unión a antígeno que inhibe una actividad de PD-L1. En una realización, la proteína de unión a antígeno tiene una CI<50>de 1000 nM o menos. En otra realización, la CI<50>es 100 nM o inferior; en otra realización, la CI<50>es 10 nM o inferior. En otra realización, la CI<50>es sustancialmente igual que la de un anticuerpo descrito en el presente documento en los ejemplos. En otra realización, la proteína de unión a antígeno inhibe una actividad de PD-L1 con sustancialmente la misma CI<50>que un anticuerpo descrito en el presente documento.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una proteína de unión a antígeno que se une a PD-L1 humano expresado en la superficie de una célula y, cuando se une de este modo, inhibe la actividad de señalización de PD-L1 en la célula sin provocar una reducción significativa en la cantidad de PD-L1 en la superficie de la célula. Puede usarse cualquier método para determinar o estimar la cantidad de PD-L1 en la superficie y/o en el interior de la célula. En otras realizaciones, la unión de la proteína de unión a antígeno a la célula que expresa PD-L1 provoca que se internalice menos de aproximadamente el 75 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 1 % o 0,1 % del PD-L1 de superficie celular.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una proteína de unión a antígeno que tiene una semivida de al menos un díain vitrooin vivo(por ejemplo, cuando se administra a un sujeto humano). En una realización, la proteína de unión a antígeno tiene una semivida de al menos tres días. En otra realización, la proteína de unión a antígeno tiene una semivida de cuatro días o más. En otra realización, la proteína de unión a antígeno tiene una semivida de ocho días o más. En otra realización, la proteína de unión a antígeno se deriva o modifica de manera que tenga una semivida más larga en comparación con la proteína de unión a antígeno no derivada o no modificada. En otra realización, la proteína de unión a antígeno contiene una o más mutaciones puntuales para aumentar la semivida, tal como se describe en el documento WO00/09560.

La presente divulgación proporciona además proteínas de unión a antígeno multiespecíficas, por ejemplo, proteína de unión a antígeno biespecífica, por ejemplo, proteína de unión a antígeno que se une a dos epítopos diferentes de PD-L1, o a un epítopo de PD-L1 y un epítopo de otra molécula, a través de dos sitios o regiones de unión a antígeno diferentes. Además, la proteína biespecífica de unión a antígeno como se describe en el presente documento puede comprender un sitio de unión a PD-L1 de uno de los anticuerpos descritos en la presente y una segunda región de unión a PD-L1 de otro de los anticuerpos descritos en la presente. Alternativamente, una proteína de unión a antígeno biespecífica puede comprender un sitio de unión a antígeno de uno de los anticuerpos descritos en el presente documento y un segundo sitio de unión a antígeno de otro anticuerpo frente a PD-L1 que se conoce en la técnica, o de un anticuerpo que se prepara mediante métodos conocidos o los métodos descritos en el presente documento.

En la técnica se conocen numerosos métodos para preparar anticuerpos biespecíficos. Tales métodos incluyen el uso de hibridomas híbridos como se describe por Milsteinet al.,1983, Nature 305:537, y acoplamiento químico de fragmentos de anticuerpos (Brennanet al.,1985, Science 229:81; Glennieet al.,1987, J. Immunol. 139: 139:2367; patente estadounidense 6.010.902). Además, pueden producirse anticuerpos biespecíficos mediante medios recombinantes, por ejemplo, usando restos de cremallera de leucina (es decir, a partir de las proteínasFosyJunque forman preferiblemente heterodímeros; Kostelnyet al.,1992, J. Immunol. 148: 148:1547) u otras estructuras de dominio interactivo de cerradura y llave como se describe en la patente estadounidense 5.582.996. Las técnicas útiles adicionales incluyen las descritas en las patentes estadounidenses 5.959.083; y 5.807.706.

En otro aspecto, la proteína de unión a antígeno comprende un derivado de un anticuerpo. El anticuerpo derivatizado puede comprender cualquier molécula o sustancia que confiera una propiedad deseada al anticuerpo, tal como una semivida aumentada en un uso particular. El anticuerpo derivatizado puede comprender, por ejemplo, un resto detectable (o de marcaje) (por ejemplo, una molécula radiactiva, colorimétrica, antigénica o enzimática, una perla detectable (tal como magnética o electrodensa (por ejemplo, perla de oro), o una molécula que se une a otra molécula (por ejemplo, biotina o estreptavidina), un resto terapéutico o de diagnóstico (por ejemplo, un resto radiactivo, citotóxico o farmacéuticamente activo) o una molécula que aumenta la idoneidad del anticuerpo para un uso particular (por ejemplo, administración a un sujeto, tal como un sujeto humano, u otros usosin vivooin vitro).Los ejemplos de moléculas que pueden usarse para derivatizar un anticuerpo incluyen albúmina (por ejemplo, albúmina sérica humana) y polietilenglicol (PEG). Pueden prepararse derivados de anticuerpos unidos a albúmina y pegilados usando técnicas bien conocidas en la técnica. En una realización, el anticuerpo se conjuga o se une de otro modo a transtiretina (TTR) o una variante de TTR. La TTR o variante de TTR puede modificarse químicamente con, por ejemplo, un producto químico seleccionado del grupo que consiste en dextrano, poli(n-vinilpirrolidona), polietilenglicoles, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de poli(óxido de propileno)/óxido de etileno, polioles polioxietilados y poli(alcoholes vinílicos).

Pueden emplearse oligómeros que contienen una o más proteínas de unión a antígeno como antagonistas de PD-L1. Los oligómeros pueden estar en forma de dímeros, trímeros u oligómeros superiores unidos covalentemente o no covalentemente. Se contemplan para su uso oligómeros que comprenden dos o más proteínas de unión a antígeno, siendo un ejemplo un homodímero. Otros oligómeros incluyen heterodímeros, homotrímeros, heterotrímeros, homotetrámeros, heterotetrámeros, etc.

Se divulgan oligómeros que comprenden múltiples proteínas de unión a antígeno unidas mediante interacciones covalentes o no covalentes entre restos peptídicos fusionados a las proteínas de unión a antígeno. Tales péptidos pueden ser enlazadores peptídicos (espaciadores) o péptidos que tienen la propiedad de promover la oligomerización. Las cremalleras de leucina y ciertos polipéptidos derivados de anticuerpos están entre los péptidos que pueden promover la oligomerización de proteínas de unión a antígeno unidas a los mismos, como se describe con más detalle a continuación.

Los oligómeros pueden comprender de dos a cuatro proteínas de unión a antígeno. Las proteínas de unión a antígeno del oligómero pueden estar en cualquier forma, tal como cualquiera de las formas descritas anteriormente, por ejemplo, variantes o fragmentos. Preferiblemente, los oligómeros comprenden proteínas de unión a antígeno que tienen actividad de unión a PD-L1.

Se prepara un oligómero usando polipéptidos derivados de inmunoglobulinas. Se ha descrito la preparación de proteínas de fusión que comprenden ciertos polipéptidos heterólogos fusionados a diversas porciones de polipéptidos derivados de anticuerpos (incluido el dominio Fc), por ejemplo, por Ashkenaziet al.,1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535; Byrnet al.,1990, Nature 344:677; y Hollenbaughet al.,1992 “Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins”, en Current Protocols in Immunology, supl. 4, páginas 10.19.1-10.19.11.

También se divulga un dímero que comprende dos proteínas de fusión creadas fusionando un fragmento de unión a PD-L1 de un anticuerpo anti-PD-L1 a la región Fc de un anticuerpo. El dímero puede prepararse, por ejemplo, insertando una fusión génica que codifica la proteína de fusión en un vector de expresión apropiado, expresando la fusión génica en células huésped transformadas con el vector de expresión recombinante y permitiendo que la proteína de fusión expresada se ensamble de manera muy similar a moléculas de anticuerpo, tras lo cual se forman enlaces disulfuro intercatenarios entre los restos Fc para producir el dímero.

El término “polipéptido de Fc” incluye formas nativas y de muteína de polipéptidos derivados de la región Fc de un anticuerpo. También se incluyen formas truncadas de tales polipéptidos que contienen la región bisagra que promueve la dimerización. Las proteínas de fusión que comprenden restos Fc (y oligómeros formados a partir de los mismos) ofrecen la ventaja de una fácil purificación por cromatografía de afinidad sobre columnas de proteína A o proteína G.

Otro método para preparar proteínas de unión a antígeno oligoméricas implica el uso de una cremallera de leucina. Los dominios de cremallera de leucina son péptidos que promueven la oligomerización de las proteínas en las que se encuentran. Las cremalleras de leucina se identificaron originalmente en varias proteínas de unión a ADN (Landschulzet al.,1988, Science 240: 1759), y se han encontrado desde entonces en una variedad de diferentes proteínas. Entre las cremalleras de leucina conocidas están péptidos de origen natural y derivados de los mismos que se dimerizan o trimerizan. Se describen ejemplos de dominios de cremallera de leucina adecuados para producir proteínas oligoméricas solubles en el documento WO 94/10308, y la cremallera de leucina derivada de la proteína D tensioactiva pulmonar (SPD) descrita en Hoppeet al.,1994, FEBS Letters 344:191. Se describe el uso de una cremallera de leucina modificada que permite la trimerización estable de una proteína heteróloga fusionada a la misma en Fanslowet al.,1994, Semin. Immunol. 6: 267-78. En un enfoque, se expresan proteínas de fusión recombinantes que comprenden un fragmento o derivado de anticuerpo anti-PD-L1 fusionado a un péptido cremallera de leucina en células huésped adecuadas, y los fragmentos o derivados de anticuerpo anti-PD-L1 oligomérico soluble que se forman se recuperan del sobrenadante de cultivo.

Modificaciones postraduccionales de polipéptidos

En ciertas realizaciones, los polipéptidos de unión de la invención pueden comprender además modificaciones postraduccionales. Las modificaciones postraduccionales de proteínas a modo de ejemplo incluyen fosforilación, acetilación, metilación, ADP-ribosilación, ubiquitinación, glicosilación, carbonilación, sumoilación, biotinilación o adición de una cadena lateral polipeptídica o de un grupo hidrófobo. Como resultado, los polipéptidos solubles modificados pueden contener elementos distintos de aminoácidos, tales como lípidos, polisacáridos o monosacáridos y fosfatos. Una forma preferida de glicosilación es la sialilación, que conjuga uno o más restos de ácido siálico al polipéptido. Los restos de ácido siálico mejoran la solubilidad y la semivida en suero, al tiempo que también reducen la posible inmunogenicidad de la proteína. Véase Rajuet al.Biochemistry. 2001 31; 40(30):8868-76. Los efectos de tales elementos distintos de aminoácidos sobre la funcionalidad de un polipéptido pueden someterse a prueba para determinar su papel antagonizante en la función de PD-L1 o PD-1, por ejemplo, su efecto inhibidor sobre la angiogénesis o sobre el crecimiento tumoral.

En una realización específica, formas modificadas de los polipéptidos solubles objeto comprenden unir los polipéptidos solubles objeto a polímeros no proteínicos. En una realización específica, el polímero es polietilenglicol (“PEG”), polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera que se expone en las patentes estadounidenses 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.

El PEG es un polímero soluble en agua que está disponible comercialmente o puede prepararse mediante polimerización por apertura de anillo de etilenglicol según métodos bien conocidos en la técnica (Sandler y Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, Nueva York, vol. 3, páginas 138-161). El término “PEG” se usa ampliamente para englobar cualquier molécula de polietilenglicol, sin tener en cuenta el tamaño o la modificación en un extremo del PEG, y puede representarse por la fórmula: X-O(CH<2>CH<2>O)<n>-1CH<2>CH<2>OH (1), donde n es de 20 a 2300 y X es H o una modificación terminal, por ejemplo, un alquilo C<1-4>. En una realización, el PEG termina en un extremo con hidroxi o metoxi, es decir, X es H o CH<3>(“metoxi PEG”). Un PEG puede contener grupos químicos adicionales que son necesarios para las reacciones de unión; que resulta de la síntesis química de la molécula; o que es un espaciador para la distancia óptima de partes de la molécula. Además, tal PEG puede consistir en una o más cadenas laterales de PEG que están unidas entre sí. Los PEG con más de una cadena de PEG se denominan PEG de múltiples brazos o ramificados. Los PEG ramificados pueden prepararse, por ejemplo, mediante la adición de poli(óxido de etileno) a diversos polioles, incluidos glicerol, pentaeritritol y sorbitol. Por ejemplo, puede prepararse un PEG ramificado de cuatro brazos a partir de pentaeritritol y óxido de etileno. Se describen PEG ramificados, por ejemplo, en el documento EP-A 0 473084 y la patente estadounidense 5.932.462. Una forma de PEG incluye dos cadenas laterales de PEG (PEG2) unidas a través de los grupos amino primarios de una lisina (Monfardinietal.,Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69).

Aunque el PEG se conoce ben, esta es, según el conocimiento de los inventores, la primera demostración de que un polipéptido pegilado<10F>n3 puede pegilarse y retener la actividad de unión al ligando. En una realización preferida, el polipéptido pegilado<10F>n3 se produce mediante pegilación dirigida a sitio, particularmente mediante conjugación de PEG con un resto de cisteína en el extremo N o C terminal. Por consiguiente, la presente divulgación proporciona un polipéptido<10F>n3 de unión a la diana con propiedades farmacocinéticas mejoradas, comprendiendo el polipéptido: un dominio<10F>n3 que tiene de aproximadamente 80 a aproximadamente 150 aminoácidos, en donde al menos uno de los bucles de dicho dominio<10F>n3 participa en la unión a la diana; y un resto de PEG unido covalentemente, en donde dicho polipéptido<10F>n3 se une a la diana con una Kd de menos de 100 nM y tiene una tasa de aclaramiento de menos de 30 ml/h/kg en un mamífero. El resto de PEG puede unirse al polipéptido<10F>n3 mediante pegilación dirigida a sitio, tal como mediante unión a un residuo de Cys, en donde el residuo de Cys puede estar situado en el extremo N-terminal del polipéptido<0F>n3 o entre el extremo N-terminal y la hebra beta o similar a beta más N-terminal o en el extremo C-terminal del polipéptido<10F>n3 o entre el extremo C-terminal y la hebra beta o similar a beta más C-terminal. Un residuo de Cys puede estar situado también en otras posiciones, particularmente en cualquiera de los bucles que no participan en la unión a la diana. Un resto de PEG también puede unirse mediante otra química, incluyendo mediante conjugación con aminas.

La conjugación de PEG con péptidos o proteínas generalmente implica la activación de PEG y el acoplamiento de los productos intermedios de PEG activados directamente a proteínas/péptidos diana o a un enlazador, que posteriormente se activa y se acopla a proteínas/péptidos diana (véase Abuchowskiet al.,J. Biol. Chem., 252, 3571 (1977) y J. Biol. Chem., 252, 3582 (1977), Zalipsky,et al.,y Harriset al.,en: Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications; (J. M. Harris ed.) Plenum Press: Nueva York, 1992; cap. 21 y 22). Se observa que un polipéptido de unión que contiene una molécula de PEG también se conoce como proteína conjugada, mientras que la proteína que carece de una molécula de PEG unida puede denominarse no conjugada.

Puede seleccionarse una variedad de formas de masa molecular de PEG, por ejemplo, de aproximadamente 1.000 Daltons (Da) a 100.000 Da (n es de 20 a 2300), para conjugarse con polipéptidos de unión a PD-L1. El número de unidades de repetición “n” en el PEG se aproxima para la masa molecular descrita en Daltons. Se prefiere que la masa molecular combinada de PEG en un enlazador activado sea adecuada para uso farmacéutico. Por tanto, en una realización, la masa molecular de las moléculas de PEG no supera 100.000 Da. Por ejemplo, si tres moléculas de PEG están unidas a un enlazador, donde cada molécula de PEG tiene la misma masa molecular de 12.000 Da (cada n es aproximadamente 270), entonces la masa molecular total de PEG en el enlazador es aproximadamente 36.000 Da (n total es aproximadamente 820). Las masas moleculares del PEG unido al enlazador también pueden ser diferentes, por ejemplo, de tres moléculas en un enlazador, dos moléculas de PEG pueden ser de 5.000 Da cada una (cada n es aproximadamente 110) y una molécula de PEG puede ser de 12.000 Da (n es aproximadamente 270).

En una realización específica de la divulgación, un polipéptido de unión a PD-L1 está unido covalentemente a un grupo poli(etilenglicol) de fórmula: -CO-(CH<2>)<x>-(OCH<2>CH<2>)<m>-OR, formando el -CO (es decir, carbonilo) del grupo polietilenglicol) un enlace amida con uno de los grupos amino del polipéptido de unión; siendo R alquilo inferior; siendo x 2 o 3; siendo m de aproximadamente 450 a aproximadamente 950; y eligiéndose n y m de modo que el peso molecular del conjugado menos el polipéptido de unión sea de aproximadamente 10 a 40 kDa. En una realización, un grupo 6-amino del polipéptido de unión de una lisina es el grupo amino disponible (libre).

Los conjugados anteriores pueden presentarse más específicamente por la fórmula (II): P-NHCO-(CH<2>)<x>-(OCH<2>CH<2>)<m>-OR (II), en donde P es el grupo de un polipéptido de unión como se describe en el presente documento, (es decir, sin el grupo amino o grupos amino que forman un enlace amida con el carbonilo mostrado en la fórmula (II); y en donde R es alquilo inferior; x es 2 o 3; m es de aproximadamente 450 a aproximadamente 950 y se elige de modo que el peso molecular del conjugado menos el polipéptido de unión sea de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 kDa. Como se usa en el presente documento, los intervalos dados de “m” tienen un significado orientativo. Los intervalos de “m” se determinan, en cualquier caso, y exactamente, por el peso molecular del grupo PEG.

Un experto en la técnica puede seleccionar una masa molecular adecuada para PEG, por ejemplo, basándose en cómo se usará terapéuticamente el polipéptido de unión pegilado, la dosificación deseada, el tiempo de circulación, la resistencia a la proteólisis, la inmunogenicidad y otras consideraciones. Para una discusión del PEG y su uso para potenciar las propiedades de las proteínas, véase Katre, Advanced Drug Delivery Reviews 10: 91-114 (1993).

En una realización, las moléculas de PEG pueden activarse para reaccionar con grupos amino en un polipéptido de unión, tal como con lisinas (Benchamet al.,Anal. Biochem. 131,25 (1983); Veroneseet al.,Appl. Biochem., 11, 141 (1985); Zalipskyet al.,Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, adrs 9-110 ACS Symposium Series 469 (1999); Zalipskyet al.,Europ. Polym. J., 19, 1177-1183 (1983); Delgadoet al.,Biotechnology and Applied Biochemistry, 12, 119-128 (1990)).

En una realización específica, se usan ésteres de carbonato de PEG para formar los conjugados de polipéptido de unión a PEG. Puede usarse carbonato de N,N'-disuccinimidilo (DSC) en la reacción con PEG para formar carbonato de PEG-succinimidilo mixto activo que puede hacerse reaccionar posteriormente con un grupo nucleófilo de un enlazador o un grupo amino de un polipéptido de unión (véanse las patentes estadounidenses 5.281.698 y 5.932.462). En un tipo de reacción similar, pueden hacerse reaccionar carbonato de 1, 1 '-(dibenzotriazolilo) y carbonato de di-(2-piridilo) con PEG para formar carbonato mixto de PEG-benzotriazolilo y PEG-piridilo (patente estadounidense 5.382.657), respectivamente.

La pegilación de un polipéptido 10Fn3 puede realizarse según los métodos del estado de la técnica, por ejemplo, mediante reacción del polipéptido de unión con PEG electrofílicamente activos (proveedor: Shearwater Corp., E<e>.UU., www.shearwatercorp.com). Reactivos de PEG preferidos son, por ejemplo, propionatos de N-hidroxisuccinimidilo (PEG-SPA), butanoatos (PEG-SBA), propionato de PEG-succinimidilo o N-hidroxisuccinimidas ramificadas tales como mPEG2-NHS (Monfardiniet al.,Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69). Tales métodos pueden usarse para pegilar en un grupo f-amino de un polipéptido de unión lisina o el grupo amino N-terminal del polipéptido de unión.

En otra realización, las moléculas de PEG pueden acoplarse a grupos sulfhidrilo en un polipéptido de unión (Sartoreet al.,Appl. Biochem. Biotechnol., 27, 45 (1991); Morpurgoet al.,Biocon. Chem., 7, 363-368 (1996); Goodsonet al.,Bio/Technology (1990) 8, 343; patente estadounidense 5.766.897). Las patentes estadounidenses 6.610.281 y 5.766.897 describen especies reactivas de PEG a modo de ejemplo que pueden acoplarse a grupos sulfhidrilo.

En algunas realizaciones en donde las moléculas de PEG se conjugan con residuos de cisteína en un polipéptido de unión, los residuos de cisteína son nativos para el polipéptido de unión, mientras que, en otras realizaciones, uno o más residuos de cisteína se modifican por ingeniería genética en el polipéptido de unión. Pueden introducirse mutaciones en una secuencia codificante de un polipéptido de unión para generar residuos de cisteína. Esto podría lograrse, por ejemplo, mutando uno o más residuos de aminoácidos a cisteína. Los aminoácidos preferidos para mutar a un residuo cisteína incluyen serina, treonina, alanina y otros residuos hidrófilos. Preferiblemente, el residuo que va a mutarse a cisteína es un residuo expuesto en la superficie. Se conocen bien algoritmos en la técnica para predecir la accesibilidad a la superficie de residuos basándose en la secuencia primaria o una proteína. Alternativamente, los residuos de superficie pueden predecirse comparando las secuencias de aminoácidos de polipéptidos de unión, dado que se ha resuelto la estructura cristalina del armazón basándose en qué polipéptidos de unión se diseñan y evolucionan (véase Himanenet al.,Nature. (2001) 20-27; 414(6866): 933-8) y, por tanto, se han identificado los residuos expuestos en la superficie. En una realización, se introducen residuos cisteína en polipéptidos de unión en o cerca del extremo N y/o C, o dentro de regiones de bucle.

En algunas realizaciones, el polipéptido de unión pegilado comprende una molécula de PEG unida covalentemente al grupo alfa-amino del aminoácido N-terminal. La aminación reductora N-terminal específica de sitio se describe en Pepinskyet al.,(2001) JPET, 297, 1059 y la patente estadounidense 5.824.784. El uso de un PEG-aldehído para la aminación reductora de una proteína utilizando otros grupos amino nucleófilos disponibles se describe en la patente estadounidense 4.002.531, en Wiederet al.,(1979) J. Biol. Chem. 254, 12579 y en Chamowet al.,(1994) Bioconjugate Chem. 5, 133.

En otra realización, el polipéptido de unión pegilado comprende una o más moléculas de PEG unidas covalentemente a un enlazador, que a su vez está unido al grupo alfa-amino del residuo de aminoácido en el extremo N-terminal del polipéptido de unión. Tal enfoque se divulga en la publicación de patente estadounidense 2002/0044921 y en el documento WO094/01451.

En una realización, un polipéptido de unión se pegila en el extremo C-terminal. En una realización específica, una proteína se pegila en el extremo C mediante la introducción de azido-metionina C-terminal y la posterior conjugación de un compuesto de metil-PEG-triarilfosfina a través de la reacción de Staudinger. Este método de conjugación C-terminal se describe en Cazaliset al.,Bioconjugag. Chem. 2004; 15(5): 1005-1009.

La monopegilación de un polipéptido de unión también puede producirse según los métodos generales descritos en el documento WO 94/01451. El documento WO 94/01451 describe un método para preparar un polipéptido recombinante con un grupo reactivo de carbono alfa de aminoácido terminal modificado. Las etapas del método implican formar el polipéptido recombinante y protegerlo con uno o más grupos protectores añadidos biológicamente en la alfa-amina N-terminal y el alfa-carboxilo C-terminal. El polipéptido puede hacerse reaccionar después con agentes protectores químicos para proteger selectivamente grupos de cadena lateral reactivos y, de ese modo, evitar que se modifiquen los grupos de cadena lateral. El polipéptido se escinde después con un reactivo de escisión específico para el grupo protector biológico para formar un grupo reactivo de carbono alfa de aminoácido terminal no protegido. El grupo reactivo de alfa-carbono de aminoácido terminal no protegido se modifica con un agente modificador químico. El polipéptido de copia única modificado terminalmente protegido de cadena lateral se desprotege entonces en los grupos de cadena lateral para formar un polipéptido de copia única recombinante modificado terminalmente. El número y la secuencia de etapas en el método puede variarse para lograr la modificación selectiva en el aminoácido N- y/o C-terminal del polipéptido.

La razón de un polipéptido de unión con respecto a PEG activado en la reacción de conjugación puede ser de aproximadamente 1:0,5 a 1:50, entre aproximadamente 1:1 y 1:30, o de aproximadamente 1:5 a 1:15. Pueden usarse diversos tampones acuosos en el presente método para catalizar la adición covalente de PEG al polipéptido de unión. En una realización, el pH de un tampón usado es de aproximadamente 7,0 a 9,0. En otra realización, el pH está en un intervalo ligeramente básico, por ejemplo, de aproximadamente 7,5 a 8,5. Pueden usarse tampones que tienen un pKa cercano al intervalo de pH neutro, por ejemplo, tampón fosfato.

Pueden usarse técnicas convencionales de separación y purificación conocidas en la técnica para purificar el polipéptido de unión pegilado, tal como cromatografía de exclusión por tamaño (por ejemplo, filtración en gel) y de intercambio iónico. Los productos también pueden separarse usando SDS-PAGE. Los productos que pueden separarse incluyen polipéptido de unión mono-, di-, tri-, poli- y no pegilado, así como PEG libre. El porcentaje de conjugados de mono-PEG puede controlarse agrupando fracciones más amplias alrededor del pico de elución para aumentar el porcentaje de mono-PEG en la composición. Aproximadamente el noventa por ciento de conjugados de mono-PEG representa un buen equilibrio de rendimiento y actividad. Pueden desearse composiciones en las que, por ejemplo, al menos el noventa y dos por ciento o al menos el noventa y seis por ciento de los conjugados son especies de mono-PEG. En una realización de esta invención, el porcentaje de conjugados de mono-PEG es del noventa por ciento al noventa y seis por ciento.

En una realización, el polipéptido de unión pegilado de la invención contiene uno, dos o más restos de PEG. En una realización, el/los resto(s) de PEG se une(n) a un resto de aminoácido que está en la superficie de la proteína y/o lejos de la superficie que entra en contacto con el ligando diana. En una realización, la masa molecular combinada o total de PEG en el polipéptido de unión a PEG es de aproximadamente 3.000 Da a 60.000 Da, opcionalmente de aproximadamente 10.000 Da a 36.000 Da. En una realización, el PEG en el polipéptido de unión pegilado es un PEG sustancialmente de cadena lineal, recta.

En una realización, el PEG en el polipéptido de unión pegilado no se hidroliza a partir del residuo de aminoácido pegilado usando un ensayo de hidroxilamina, por ejemplo, hidroxilamina 450 mM (pH 6,5) durante de 8 a 16 horas a temperatura ambiente, y por tanto es estable. En una realización, más del 80 % de la composición es un polipéptido de unión a mono-PEG estable, más preferiblemente al menos el 90 % y lo más preferiblemente al menos el 95 %.

En otra realización, los polipéptidos de unión pegilados de la invención preferiblemente retendrán al menos el 25 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de la actividad biológica asociada con la proteína no modificada. En una realización, la actividad biológica se refiere a su capacidad para unirse a PD-L1, según se evalúa por KD, k<on>o k<off>. En una realización específica, la proteína polipeptídica de unión pegilada muestra un aumento en la unión a PD-L1 con respecto al polipéptido de unión no pegilado.

La tasa de aclaramiento en suero del polipéptido modificado con PEG puede reducirse en aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o incluso 90 %, con respecto a la tasa de aclaramiento del polipéptido de unión no modificado. El polipéptido modificado con PEG puede tener una semivida (t<1/2>) que está potenciada con relación a la semivida de la proteína no modificada. La semivida del polipéptido de unión a PEG puede potenciarse en al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 125 %, 150 %, 175 %, 200 %, 250 %, 300 %, 400 % o 500 %, o incluso en el 1000 % con respecto a la semivida del polipéptido de unión no modificado. En algunas realizaciones, se determina la semivida de la proteínain vitro,tal como en una solución salina tamponada o en suero. En otras realizaciones, la semivida de la proteína es una semividain vivo,tal como la semivida de la proteína en el suero u otro fluido corporal de un animal.

Métodos terapéuticos, formulaciones y modos de administración

Ciertos métodos proporcionados en el presente documento comprenden administrar una proteína de unión a antígeno de unión a PD-L1 a un sujeto, reduciendo de este modo una respuesta biológica inducida por PD-L1 que desempeña un papel en una afección particular. En realizaciones particulares, los métodos implican poner en contacto PD-L1 endógeno con una proteína de unión a antígeno de unión a PD-L1, por ejemplo, mediante la administración a un sujeto o en un procedimientoex vivo.

El término “tratamiento” abarca el alivio o la prevención de al menos un síntoma u otro aspecto de un trastorno, o la reducción de la gravedad de la enfermedad, y similares. No es necesario que una proteína de unión a antígeno efectúe una curación completa, o erradicar cada síntoma o manifestación de una enfermedad, para constituir un agente terapéutico viable. Como se reconoce en el campo pertinente, los fármacos empleados como agentes terapéuticos pueden reducir la gravedad de un estado patológico dado, pero no es necesario que anulen cada manifestación de la enfermedad para que se consideren como agentes terapéuticos útiles. De manera similar, un tratamiento administrado profilácticamente no es necesario que sea completamente eficaz en la prevención de la aparición de una afección con el fin de constituir un agente profiláctico viable. Es suficiente reducir simplemente el impacto de una enfermedad (por ejemplo, reduciendo el número o la gravedad de sus síntomas, o aumentando la eficacia de otro tratamiento, o produciendo otro efecto beneficioso), o reduciendo la probabilidad de que la enfermedad se produzca o empeore en un sujeto. Una realización se refiere a un método que comprende administrar a un paciente un antagonista de PD-L1 en una cantidad y durante un tiempo suficientes para inducir una mejora sostenida respecto al nivel basal de un indicador que refleja la gravedad del trastorno particular.

La presente divulgación presenta métodos para tratar afecciones o prevenir afecciones previas que responden a una inhibición de la actividad biológica de PD-L1. Ejemplos preferidos son afecciones que se caracterizan por inflamación o hiperproliferación celular. Las técnicas y dosificaciones para la administración varían dependiendo del tipo de polipéptido específico y la afección específica que está tratándose, pero puede determinarlas fácilmente el experto en la técnica. En general, las agencias reguladoras requieren que un reactivo proteico que va a usarse como agente terapéutico se formule de manera que tenga niveles aceptablemente bajos de pirógenos. Por consiguiente, las formulaciones terapéuticas se distinguirán generalmente de otras formulaciones en que están sustancialmente exentas de pirógenos, o al menos contienen niveles no más que aceptables de pirógenos según determina la agencia reguladora apropiada (por ejemplo, FDA).

Como se entiende en el campo pertinente, las composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos y fragmentos de los mismos de la divulgación se administran a un sujeto de una manera apropiada a la indicación. Por tanto, la invención incluye una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo (o fragmento) anti-PD-L1 divulgado en el presente documento, y un portador farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse mediante cualquier técnica adecuada, incluyendo, pero sin limitarse a, por vía parenteral, tópica o mediante inhalación. Si se inyecta, la composición farmacéutica puede administrarse, por ejemplo, por vía intraarticular, intravenosa, intramuscular, intralesional, intraperitoneal o subcutánea, mediante inyección en bolo o infusión continua. Se contempla la administración localizada, por ejemplo, en un sitio de enfermedad o lesión, como lo son la administración transdérmica y la liberación sostenida desde implantes. La administración por inhalación incluye, por ejemplo, inhalación nasal u oral, uso de un nebulizador, inhalación del antagonista en forma de aerosol, y similares. Otras alternativas incluyen gotas oculares; preparaciones orales que incluyen píldoras, jarabes, pastillas para chupar o goma de mascar; y preparaciones tópicas tales como lociones, geles, pulverizaciones y pomadas.

Ventajosamente, las proteínas de unión a antígeno se administran en forma de una composición que comprende uno o más componentes adicionales tales como un portador, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable. Opcionalmente, la composición comprende adicionalmente uno o más agentes fisiológicamente activos, por ejemplo, una segunda sustancia inhibidora de la inflamación o la inmunidad, una sustancia antiangiogénica, una sustancia analgésica, etc., cuyos ejemplos no exclusivos se proporcionan en el presente documento. En diversas realizaciones particulares, la composición comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis agentes fisiológicamente activos además de una proteína de unión a antígeno de unión a PD-L1.

Las composiciones terapéuticas de la presente descripción pueden administrarse con un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, en forma de dosificación unitaria. La administración puede ser parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea), oral o tópica, como ejemplos no limitantes. Además, puede emplearse cualquier técnica de terapia génica, que usa ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la invención, tal como administración de ADN desnudo, genes y vectores recombinantes, administración basada en células, incluyendo manipulaciónex vivode células de pacientes, y similares.

La composición puede estar en forma de una píldora, comprimido, cápsula, líquido o comprimido de liberación sostenida para administración oral; o un líquido para administración intravenosa, subcutánea o parenteral; gel, loción, pomada, crema o un polímero u otro vehículo de liberación sostenida para administración local.

Se encuentran métodos bien conocidos en la técnica para preparar formulaciones, por ejemplo, en “Remington: The Science and Practice of Pharmacy” (20a ed., ed. A. R. Gennaro A R., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, PA). Las formulaciones para administración parenteral pueden contener, por ejemplo, excipientes, agua estéril, solución salina, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal o naftalenos hidrogenados. Pueden usarse polímeros de lactida, copolímeros de lactida/glicolida o copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno biocompatibles y biodegradables para controlar la liberación de los compuestos. Pueden usarse formulaciones nanoparticuladas (por ejemplo, nanopartículas biodegradables, nanopartículas lipídicas sólidas, liposomas) para controlar la biodistribución de los compuestos. Otros sistemas de administración parenteral potencialmente útiles incluyen partículas de copolímero de etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables y liposomas. La concentración del compuesto en la formulación varía dependiendo de varios factores, incluyendo la dosificación del fármaco que va a administrarse y la vía de administración.

El polipéptido puede administrarse opcionalmente como una sal farmacéuticamente aceptable, tal como sales de adición de ácido no tóxicas o complejos metálicos que se usan comúnmente en la industria farmacéutica. Los ejemplos de sales de adición de ácido incluyen ácidos orgánicos tales como ácidos acético, láctico, pamoico, maleico, cítrico, málico, ascórbico, succínico, benzoico, palmítico, subérico, salicílico, tartárico, metanosulfónico, toluenosulfónico o trifluoroacético o similares; ácidos poliméricos tales como ácido tánico, carboximetilcelulosa o similares; y ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico o similares. Los complejos metálicos incluyen zinc, hierro y similares. En un ejemplo, el polipéptido se formula en presencia de acetato de sodio para aumentar la estabilidad térmica.

Las formulaciones para uso oral incluyen comprimidos que contienen el/los principio(s) activo(s) en una mezcla con excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes o cargas inertes (por ejemplo, sacarosa y sorbitol), agentes lubricantes, deslizantes y antiadhesivos (por ejemplo, estearato de magnesio, estearato de zinc, ácido esteárico, sílices, aceites vegetales hidrogenados o talco). Las formulaciones para uso oral también pueden proporcionarse como comprimidos masticables, o como cápsulas de gelatina dura en donde el principio activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, o como cápsulas de gelatina blanda en donde el principio activo se mezcla con agua o un medio oleoso.

Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a una dosis que produce los efectos terapéuticos para los que se administra. La dosis exacta dependerá del trastorno que va a tratarse, y puede determinarla un experto en la técnica usando técnicas conocidas. En general, el polipéptido se administra a de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg al día, preferiblemente de 0,01 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg al día, lo más preferiblemente de 0,1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg al día. El polipéptido puede administrarse diariamente (por ejemplo, una, dos, tres veces o cuatro veces al día) o preferiblemente menos frecuentemente (por ejemplo, semanalmente, cada dos semanas, cada tres semanas, mensualmente o trimestralmente). Además, como se conoce en la técnica, pueden ser necesarios ajustes para la edad, así como el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la interacción con fármacos y la gravedad de la enfermedad, y pueden determinarlos con experimentación rutinaria los expertos en la técnica.

Las proteínas de unión a PD-L1 descritas en el presente documento y sus variantes relacionadas son útiles en varias aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Estas incluyen la inhibición de la actividad biológica de PD-L1 al competir por o bloquear la unión a un PD-L1 así como la administración de restos citotóxicos o de obtención de imágenes a células, preferiblemente células que expresan PD-L1. El pequeño tamaño y la estructura estable de estas moléculas pueden ser particularmente valiosos con respecto a la fabricación del fármaco, el rápido aclaramiento del cuerpo para ciertas aplicaciones en donde se desea un aclaramiento rápido o la formulación en sistemas de administración novedosos que son adecuados se mejoran usando una molécula con tales características.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos de tratamiento de un sujeto. El método puede, por ejemplo, tener un efecto generalmente saludable sobre el sujeto, por ejemplo, puede aumentar la longevidad esperada del sujeto. Alternativamente, el método puede, por ejemplo, tratar, prevenir, curar, aliviar o mejorar una enfermedad, trastorno, afección o enfermedad (“una afección”). Entre las afecciones que van a tratarse, están afecciones caracterizadas por una expresión o actividad inapropiada de PD-L1. En algunas de tales afecciones, el nivel de expresión o actividad es demasiado alto, y el tratamiento comprende administrar un antagonista de PD-L1 como se describe en el presente documento. Los trastornos o afecciones están relacionados con el cáncer. En particular, esos cánceres incluyen, pero no se limitan a, carcinoma de pulmón, ovario y colon y diversos mielomas.

Las afecciones y enfermedades médicas específicas que pueden tratarse o prevenirse con las proteínas de unión a antígeno de esta descripción incluyen diversos cánceres.

Basándose en su eficacia como inhibidores de la actividad biológica de PD-L1, los polipéptidos de esta divulgación son eficaces contra una serie de afecciones cancerosas, así como complicaciones que surgen del cáncer, tales como derrame pleural y ascitis. Preferiblemente, los polipéptidos de unión a PD-L1 de la divulgación pueden usarse para el tratamiento de prevención de enfermedades hiperproliferativas o cáncer y la diseminación metastásica de cánceres. Las indicaciones preferidas para los anticuerpos anti-PD-L1 divulgados incluyen cánceres colorrectales, cánceres de cabeza y cuello, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) y cáncer pancreático. Los ejemplos no limitantes de cánceres incluyen cáncer de vejiga, sangre, hueso, cerebro, mama, cartílago, colon, riñón, hígado, pulmón, ganglio linfático, tejido nervioso, ovario, pancreático, próstata, músculo esquelético, piel, médula espinal, bazo, estómago, testículos, timo, tiroides, tráquea, tracto urogenital, uréter, uretra, útero o vaginal. En ciertas realizaciones, el cáncer que va a tratarse se selecciona del grupo que consiste en cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de mama o carcinoma hepático, mieloma, tumor del SNC derivado de neuroblastos, leucemia monocítica, leucemia derivada de células B, leucemia derivada de células T, linfoma derivado de células B, linfoma derivado de células T, un tumor derivado de mastocitos y cualquier combinación de los mismos.

En ciertas realizaciones, el amplio espectro de cánceres de mamíferos que va a tratarse se selecciona del grupo que consiste en cánceres de ovario, colon, mama, pulmón, mielomas, tumores del SNC derivados de neuroblastos, leucemias monocíticas, leucemias derivadas de células B, leucemias derivadas de células T, linfomas derivados de células B, linfomas derivados de células T, tumores derivados de mastocitos y combinaciones de los mismos. Preferiblemente, la enfermedad autoinmunitaria o enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en inflamación de la mucosa intestinal, enfermedad de consunción asociada con colitis, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, infecciones víricas, artritis reumatoide, osteoartritis, psoriasis, enfermedad de Crohn y enfermedad inflamatoria intestinal.

Además, pueden tratarse diversos trastornos inflamatorios con los polipéptidos de unión anti-PD-L1 divulgados en el presente documento. Tales trastornos inflamatorios incluyen, por ejemplo, enfermedades de consunción de inflamación de la mucosa intestinal asociadas con colitis, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, infecciones víricas, artritis reumatoide, osteoartritis, psoriasis y enfermedad de Crohn.

También se contempla el uso de proteínas de unión a antígeno en procedimientosex vivo.Por ejemplo, la sangre u otro fluido corporal de un paciente puede ponerse en contacto con una proteína de unión a antígeno que se une a PD-L1ex vivo.La proteína de unión a antígeno puede unirse a una matriz insoluble adecuada o material de soporte sólido.

Un polipéptido de unión a PD-L1 puede administrarse solo o en combinación con una o más terapias adicionales tales como quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia, intervención quirúrgica o cualquier combinación de estas. La terapia a largo plazo es igualmente posible como terapia adyuvante en el contexto de otras estrategias de tratamiento, como se ha descrito anteriormente.

El método puede comprender administrar uno o más de los antagonistas de PD-L1 descritos en el presente documento y uno o más de otros tratamientos (por ejemplo, un tratamiento terapéutico o paliativo). Cuando un método comprende administrar más de un tratamiento a un sujeto, debe entenderse que el orden, el tiempo, el número, la concentración y el volumen de las administraciones está limitado solo por los requisitos médicos y las limitaciones del tratamiento, es decir, pueden administrarse dos tratamientos al sujeto, por ejemplo, simultáneamente, consecutivamente, alternativamente, o según cualquier otro régimen.

Por tanto, en otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método de tratamiento de un sujeto con una proteína de unión a antígeno inhibidora de PD-L1 y uno o más de otros tratamientos. En una realización, tal terapia de combinación logra sinergia o un efecto aditivo, por ejemplo, atacando múltiples sitios o dianas moleculares en un tumor. Los tipos de terapias de combinación que pueden usarse en relación con la presente invención incluyen inhibir o activar (según sea apropiado) múltiples nodos en una única ruta relacionada con enfermedad, múltiples rutas en una célula diana y múltiples tipos de células dentro de un tejido diana.

En otra realización, un método de terapia de combinación comprende administrar al sujeto dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de los agonistas o antagonistas de PD-L1 descritos en el presente documento. En otra realización, el método comprende administrar al sujeto dos o más tratamientos que juntos inhiben o activan (directa o indirectamente) la transducción de señales mediada por PD-L1. Los ejemplos de tales métodos incluyen usar combinaciones de dos o más proteínas de unión a antígeno inhibidoras de PD-L1, de una proteína de unión a antígeno inhibidora de PD-L1 y uno o más de otros restos terapéuticos que tienen propiedades anticancerosas (por ejemplo, agentes citotóxicos y/o inmunomoduladores), o de una proteína de unión a antígeno inhibidora de PD-L1 y uno o más de otros tratamientos (por ejemplo, cirugía o radiación). Además, pueden usarse uno o más anticuerpos anti-PD-L1 o derivados de anticuerpos en combinación con una o más moléculas u otros tratamientos, en donde la(s) otra(s) molécula(s) y/o tratamiento(s) no se une(n) directamente a o afecta(n) a PD-L1, pero cuya combinación es eficaz para tratar o prevenir la afección que está tratándose. En una realización, una o más de la moléculas y/o tratamientos trata o previene una afección que está provocada por una o más de las otras moléculas o tratamientos en el curso de la terapia, por ejemplo, náuseas, fatiga, alopecia, caquexia, insomnio, etc. En cada caso donde se usa una combinación de moléculas y/u otros tratamientos, la(s) molécula(s) y/o tratamiento(s) individual(es) puede(n) administrar en cualquier orden, durante cualquier período de tiempo, que sea eficaz, por ejemplo, simultáneamente, consecutivamente o alternativamente. En una realización, el método de tratamiento comprende completar un primer ciclo de tratamiento con una molécula u otro tratamiento antes de comenzar un segundo ciclo de tratamiento. El período de tiempo entre el final del primer ciclo de tratamiento y el comienzo del segundo ciclo de tratamiento puede ser cualquier período de tiempo que permita que el ciclo total de la terapia sea eficaz, por ejemplo, segundos, minutos, horas, días, semanas, meses o incluso años.

En ciertas realizaciones, los agentes de anticuerpos anti-PD-L1 objeto de la invención pueden usarse solos. Alternativamente, los agentes objeto pueden usarse en combinación con otros enfoques terapéuticos anticancerígenos convencionales dirigidos al tratamiento o la prevención de trastornos proliferativos (por ejemplo, tumor). Por ejemplo, tales métodos pueden usarse en la prevención profiláctica del cáncer, la prevención de la reaparición del cáncer y la metástasis después de la cirugía, y como adyuvante de otra terapia convencional contra el cáncer. La presente divulgación reconoce que la eficacia de las terapias convencionales contra el cáncer (por ejemplo, quimioterapia, radioterapia, fototerapia, inmunoterapia y cirugía) pueden mejorarse mediante el uso de un agente terapéutico polipeptídico objeto.

En ciertas realizaciones de tales métodos, uno o más agentes terapéuticos polipeptídicos pueden administrarse, juntos (simultáneamente) o en diferentes momentos (secuencialmente). Además, pueden administrarse agentes terapéuticos polipeptídicos con otro tipo de compuestos para tratar el cáncer o para inhibir la angiogénesis.

Se ha demostrado que una amplia variedad de compuestos convencionales tienen actividades antineoplásicas. Estos compuestos se han usado como agentes farmacéuticos en quimioterapia para contraer tumores sólidos, prevenir la metástasis y el crecimiento adicional, o disminuir el número de células malignas en tumores malignos leucémicos o de médula ósea. Aunque la quimioterapia ha sido eficaz en el tratamiento de diversos tipos de tumores malignos, muchos compuestos antineoplásicos inducen efectos secundarios no deseados. Se ha demostrado que, cuando se combinan dos o más tratamientos diferentes, los tratamientos pueden funcionar sinérgicamente y permitir la reducción de la dosificación de cada uno de los tratamientos, reduciendo así los efectos secundarios perjudiciales ejercidos por cada compuesto a dosificaciones más altas. En otros casos, los tumores malignos que son refractarios a un tratamiento pueden responder a una terapia de combinación de dos o más tratamientos diferentes.

Cuando un agente terapéutico polipeptídico de la presente invención se administra en combinación con otro agente antineoplásico convencional, de forma simultánea o secuencial, puede encontrarse que tal agente terapéutico potencia el efecto terapéutico del agente antineoplásico o supera la resistencia celular a tal agente antineoplásico. Esto permite la disminución de la dosificación de un agente antineoplásico, reduciendo de este modo los efectos secundarios no deseados, o restaura la eficacia de un agente antineoplásico en células resistentes.

Los compuestos farmacéuticos que pueden usarse para terapia antitumoral combinatoria incluyen, simplemente para ilustrar: aminoglutetimida, amsacrina, anastrozol, asparaginasa, bcg, bicalutamida, bleomicina, buserelina, busulfán, campotecina, capecitabina, carboplatino, carmustina, clorambucilo, cisplatino, cladribina, clodronato, colchicina, ciclofosfamida, ciproterona, citarabina, dacarbazina, dactinomicina, daunorubicina, dienestrol, dietilestilbestrol, docetaxel, doxorubicina, epirubicina, estradiol, estramustina, etopósido, exemestano, filgrastim, fludarabina, fludrocortisona, fluorouracilo, fluoximesterona, flutamida, gemcitabina, genisteína, goserelina, hidroxiurea, idarubicina, ifosfamida, imatinib, interferón, irinotecán, letrozol, leucovorina, leuprolida, levamisol, lomustina, mecloretamina, medroxiprogesterona, megestrol, melfalán, mercaptopurina, mesna, metotrexato, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, nilutamida, nocodazol, octreotida, oxaliplatino, paclitaxel, pamidronato, pentostatina, plicamicina, porfímero, procarbazina, raltitrexed, rituximab, estreptozocina, suramina, tamoxifeno, temozolomida, tenipósido, testosterona, tioguanina, tiotepa, dicloruro de titanoceno, topotecán, trastuzumab, tretinoína, vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina.

Ciertos compuestos antitumorales quimioterápicos pueden clasificarse por su mecanismo de acción en, por ejemplo, los siguientes grupos: agentes antimetabolitos/antineoplásicos, tales como análogos de pirimidina (5-fluorouracilo, floxuridina, capecitabina, gemcitabina y citarabina) y análogos de purina, antagonistas de folato e inhibidores relacionados (mercaptopurina, tioguanina, pentostatina y 2-clorodesoxiadenosina (cladribina)); agentes antiproliferativos/antimitóticos que incluyen productos naturales tales como alcaloides de la vinca (vinblastina, vincristina y vinorelbina), disruptores de microtúbulos tales como taxano (paclitaxel, docetaxel), vincristina, vinblastina, nocodazol, epotilonas y navelbina, epidipodofilotoxinas (etopósido, tenipósido), agentes que dañan el ADN (actinomicina, amsacrina, antraciclinas, bleomicina, busulfán, camptotecina, carboplatino, clorambucilo, cisplatino, ciclofosfamida, citoxano, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, epirubicina, hexametilmelaminaoxaliplatino, ifofamida, melfalán, mercloretamina, mitomicina, mitoxantrona, nitrosourea, plicamicina, procarbazina, taxol, taxotere, tenipósido, trietilentiofosforamida y etopósido (VP16)); antibióticos tales como dactinomicina (actinomicina D), daunorubicina, doxorubicina (adriamicina), idarubicina, antraciclinas, mitoxantrona, bleomicinas, plicamicina (mitramicina) y mitomicina; enzimas (L-asparaginasa que metaboliza sistémicamente L-asparagina y priva a las células que no tienen la capacidad de sintetizar su propia asparagina); agentes antiplaquetarios; agentes alquilantes antiproliferativos/antimitóticos tales como mostazas nitrogenadas (mecloretamina, ciclofosfamida y análogos, melfalán, clorambucilo), etileniminas y metilmelaminas (hexametilmelamina y tiotepa), alquilsulfonatos-busulfán, nitrosoureas (carmustina (BCNU) y análogos, estreptozocina), trazenos-dacarbazinina (DTIC); antimetabolitos antiproliferativos/antimitóticos tales como análogos de ácido fólico (metotrexato); complejos de coordinación de platino (cisplatino, carboplatino), procarbazina, hidroxiurea, mitotano, aminoglutetimida; hormonas, análogos de hormonas (estrógeno, tamoxifeno, goserelina, bicalutamida, nilutamida) e inhibidores de aromatasa (letrozol, anastrozol); anticoagulantes (heparina, sales de heparina sintéticas y otros inhibidores de trombina); agentes fibrinolíticos (tales como activador de plasminógeno tisular, estreptoquinasa y uroquinasa), aspirina, dipiridamol, ticlopidina, clopidogrel, abciximab; agentes antimigratorios; agentes antisecretores (breveldina); inmunosupresores (ciclosporina, tacrolimús (FK-506), sirolimús (rapamicina), azatioprina, micofenolato mofetilo); compuestos antiangiogénicos (TNP-470, genisteína) e inhibidores de factores de crecimiento (por ejemplo, inhibidores de VEGF, inhibidores de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF)); bloqueantes de receptores de angiotensina; donadores de óxido nítrico; oligonucleótidos antisentido; anticuerpos (trastuzumab); inhibidores del ciclo celular e inductores de diferenciación (tretinoína); inhibidores de mTOR, inhibidores de topoisomerasa (doxorubicina (adriamicina), amsacrina, camptotecina, daunorubicina, dactinomicina, tenipósido, epirubicina, etopósido, idarubicina y mitoxantrona, topotecán, irinotecán), corticosteroides (cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisona y prenisolona); inhibidores de quinasa de la transducción de señales de factores de crecimiento; inductores de disfunción mitocondrial y activadores de caspasa; y disruptores de cromatina.

Dependiendo de la naturaleza de la terapia combinatoria, la administración del anticuerpo anti-PD-L1 de la invención (o fragmento del mismo) puede continuarse mientras está administrándose la otra terapia y/o después de eso. La administración de los agentes terapéuticos polipeptídicos puede realizarse en una dosis única, o en dosis múltiples. En algunos casos, la administración de los agentes terapéuticos polipeptídicos comienza al menos varios días antes de la terapia convencional, mientras que, en otros casos, la administración comienza inmediatamente antes o en el momento de la administración de la terapia convencional.

En un ejemplo de una aplicación de diagnóstico, una muestra biológica, tal como una biopsia de suero o de tejido, de un paciente sospechoso de tener una afección caracterizada por angiogénesis inapropiada, se pone en contacto con un polipéptido marcado detectablemente de la divulgación para detectar los niveles de PD-L1. Los niveles de PD-L1 detectados se comparan después con los niveles de PD-L1 detectados en una muestra normal también en contacto con el polipéptido marcado. Un aumento de al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % en los niveles de PD-L1 puede considerarse un indicador de diagnóstico.

En ciertas realizaciones, los polipéptidos de unión a PD-L1 se unen además a un marcador que puede detectarse (por ejemplo, el marcador puede ser un radioisótopo, compuesto fluorescente, enzima o cofactor enzimático). El resto activo puede ser un agente radiactivo, tal como: metales pesados radiactivos tales como quelatos de hierro, quelatos radiactivos de gadolinio o manganeso, emisores de positrones de oxígeno, nitrógeno, hierro, carbono o galio, 43K, 52Fe, 57Co, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 123I, 125I, 131I, 132I o 99Tc. Un agente de unión fijado a tal resto puede usarse como agente de obtención de imágenes y se administra en una cantidad eficaz para uso de diagnóstico en un mamífero tal como un ser humano y después se detecta la localización y acumulación del agente de obtención de imágenes. La localización y acumulación del agente de obtención de imágenes puede detectarse por radioescintigrafía, obtención de imágenes por resonancia magnética nuclear, tomografía computarizada o tomografía por emisión de positrones. La inmunoescintigrafía que usa polipéptidos de unión a PD-L1 dirigidos a PD-L1 puede usarse para detectar y/o diagnosticar cánceres y la vasculatura. Por ejemplo, cualquiera del polipéptido de unión contra un marcador de PD-L1 marcado con 99Tecnecio, 1111ndio o 125Yodo puede usarse eficazmente para tal obtención de imágenes. Como resultará evidente para el experto en la técnica, la cantidad de radioisótopo que va a administrarse depende del radioisótopo. Los expertos en la técnica pueden formular fácilmente la cantidad del agente de obtención de imágenes que va a administrarse basándose en la actividad y energía específicas de un radionúclido dado usado como resto activo. Normalmente, se administran 0,1-100 milicurios por dosis de agente de obtención de imágenes, preferiblemente 1-10 milicurios, lo más a menudo 2-5 milicurios. Por lo tanto, las composiciones según la presente invención útiles como agentes de obtención de imágenes que comprenden un resto de direccionamiento conjugado con un resto radiactivo comprenden 0,1-100 milicurios, preferiblemente 1-10 milicurios, preferiblemente 2-5 milicurios, más preferiblemente 1-5 milicurios.

El anticuerpo anti-PD-L1 de la invención (o fragmento del mismo) también puede usarse para administrar agentes terapéuticos adicionales (incluyendo, pero sin limitarse a compuestos farmacológicos, compuestos quimioterápicos y compuestos radioterápicos) a una célula o tejido que expresa PD-L1. En un ejemplo, el anticuerpo anti-PD-L1 de la invención (o fragmento del mismo) se fusiona con un agente quimioterápico para la administración dirigida del agente quimioterápico a una célula tumoral o tejido que expresa PD-L1.

El anticuerpo anti-PD-L1 de la invención (o fragmento del mismo) es útil en una variedad de aplicaciones, incluyendo aplicaciones de investigación, diagnóstico y terapéuticas. Por ejemplo, puede usarse para aislar y/o purificar el receptor o porciones del mismo, y para estudiar la estructura del receptor (por ejemplo, conformación) y la función.

En ciertos aspectos, los diversos polipéptidos de unión pueden usarse para detectar o medir la expresión de PD-L1, por ejemplo, en células endoteliales (por ejemplo, células endoteliales venosas) o en células transfectadas con un gen de PD-L1. Por lo tanto, también tienen utilidad en aplicaciones tales como clasificación celular y obtención de imágenes (por ejemplo, citometría de flujo y clasificación celular activada por fluorescencia), para fines de diagnóstico o investigación.

En ciertas realizaciones, los polipéptidos de unión o fragmentos de los mismos pueden marcarse o no marcarse con fines de diagnóstico. Normalmente, los ensayos de diagnóstico implican detectar la formación de un complejo resultante de la unión de un polipéptido de unión a PD-L1. Los polipéptidos de unión o fragmentos pueden marcarse directamente, de manera similar a los anticuerpos. Puede emplearse una variedad de marcadores, incluyendo, pero sin limitación, radionúclidos, agentes que fluorescen, enzimas, sustratos enzimáticos, cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos y ligandos (por ejemplo, biotina, haptenos). Los expertos en la técnica conocen numerosos inmunoensayos apropiados (patentes estadounidenses 3.817.827; 3.850.752; 3.901.654; y 4.098.876). Cuando no están marcados, los polipéptidos de unión pueden usarse en ensayos, tales como ensayos de aglutinación. Los polipéptidos de unión no marcados también pueden usarse en combinación con otro (uno o más) reactivo adecuado que puede usarse para detectar el polipéptido de unión, tal como un anticuerpo marcado reactivo con el polipéptido de unión u otro reactivo adecuado (por ejemplo, proteína A marcada).

En una realización, los polipéptidos de unión de la presente invención pueden utilizarse en inmunoensayos enzimáticos, en donde los polipéptidos objeto se conjugan con una enzima. Cuando una muestra biológica que comprende una proteína PD-L1 se combina con los polipéptidos de unión objeto, se produce la unión entre los polipéptidos de unión y la proteína PD-L1. En una realización, una muestra que contiene células que expresan una proteína PD-L1 (por ejemplo, células endoteliales) se combina con los anticuerpos objeto, y se produce unión entre los polipéptidos de unión y las células que llevan una proteína PD-L1 reconocida por el polipéptido de unión. Estas células unidas pueden separarse de los reactivos no unidos y la presencia del conjugado polipéptido de unión-enzima unido específicamente a las células puede determinarse, por ejemplo, poniendo en contacto la muestra con un sustrato de la enzima que produce un color u otro cambio detectable cuando la enzima actúa sobre el mismo. En otra realización, los polipéptidos de unión objeto pueden estar sin marcar, y puede añadirse un segundo polipéptido marcado (por ejemplo, un anticuerpo) que reconoce el polipéptido de unión objeto.

En ciertos aspectos, también pueden prepararse kits para su uso en la detección de la presencia de una proteína PD-L1 en una muestra biológica. Tales kits incluirán un polipéptido de unión a PD-L1 que se une a una proteína PD-L1 o una porción de dicho receptor, así como uno o más reactivos auxiliares adecuados para detectar la presencia de un complejo entre el polipéptido de unión y la proteína receptora o porciones de la misma. Las composiciones polipeptídicas de la presente invención pueden proporcionarse en forma liofilizada, o bien solas o bien en combinación con anticuerpos adicionales específicos para otros epítopos. Los polipéptidos y/o anticuerpos de unión, que pueden estar marcados o no marcados, pueden incluirse en los kits con componentes adjuntos (por ejemplo, tampones, tales como Tris, fosfato y carbonato, estabilizantes, excipientes, biocidas y/o proteínas inertes, por ejemplo, albúmina sérica bovina). Por ejemplo, los polipéptidos y/o anticuerpos de unión pueden proporcionarse como una mezcla liofilizada con los componentes adjuntos, o el usuario puede proporcionar los componentes adjuntos por separado para la combinación. Generalmente, estos materiales adyuvantes estarán presentes en menos de aproximadamente un 5 % en peso basándose en la cantidad de polipéptido o anticuerpo de unión activo, y habitualmente estarán presentes en una cantidad total de al menos aproximadamente un 0,001 % en peso basándose en la concentración de polipéptido o anticuerpo. Cuando se emplea un segundo anticuerpo capaz de unirse al polipéptido de unión, tal anticuerpo puede proporcionarse en el kit, por ejemplo, en un vial o recipiente separado. El segundo anticuerpo, si está presente, está normalmente marcado, y puede formularse de una manera análoga a las formulaciones de anticuerpo descritas anteriormente.

De manera similar, la presente divulgación también proporciona un método para detectar y/o cuantificar la expresión de PD-L1, en donde una composición que comprende una célula o fracción de la misma (por ejemplo, fracción de membrana) se pone en contacto con un polipéptido de unión que se une a un PD-L1 o una porción del receptor en condiciones apropiadas para la unión al mismo, y se monitoriza la unión. La detección del polipéptido de unión, indicativa de la formación de un complejo entre el polipéptido de unión y PD-L1 o una porción del mismo, indica la presencia del receptor. La unión de un polipéptido a la célula puede determinarse mediante métodos convencionales, tales como los descritos en los ejemplos de trabajo. El método puede usarse para detectar la expresión de PD-L1 en células de un individuo. Opcionalmente, puede evaluarse una expresión cuantitativa de PD-L1 en la superficie de células endoteliales, por ejemplo, mediante citometría de flujo, y la intensidad de tinción puede correlacionarse con la susceptibilidad, progresión o riesgo de la enfermedad.

La presente divulgación también proporciona un método de detección de la susceptibilidad de un mamífero a ciertas enfermedades. Para ilustrar, el método puede usarse para detectar la susceptibilidad de un mamífero a enfermedades que progresan basándose en la cantidad de PD-L1 presente en células y/o el número de células positivas para PD-L1 en un mamífero.

Las secuencias de polipéptidos se indican usando abreviaturas convencionales de una o tres letras. A menos que se indique lo contrario, cada secuencia polipeptídica tiene extremos amino a la izquierda y extremos carboxi a la derecha; cada secuencia de ácido nucleico monocatenario, y la cadena superior de cada secuencia de ácido nucleico bicatenario, tiene extremos 5' a la izquierda y extremos 3' a la derecha. Una secuencia polipeptídica particular también puede describirse explicando cómo difiere de una secuencia de referencia.

Las proteínas de unión a antígeno dirigidas contra PD-L1 pueden usarse, por ejemplo, en ensayos para detectar la presencia de polipéptidos PD-L1, o bienin vitroo bienin vivo.Las proteínas de unión a antígeno también pueden emplearse en la purificación de proteínas PD-L1 mediante cromatografía de inmunoafinidad. Pueden usarse proteínas de unión a antígeno bloqueantes en los métodos divulgados en el presente documento. Tales proteínas de unión a antígeno que funcionan como antagonistas de PD-L1 pueden emplearse en el tratamiento de cualquier afección inducida por PD-L1, incluyendo, pero sin limitarse a, diversos cánceres.

Las proteínas de unión a antígeno pueden emplearse en un procedimientoin vitro,o administrarsein vivopara inhibir la actividad biológica inducida por PD-L1. Por tanto, pueden tratarse trastornos provocados o exacerbados (directa o indirectamente) por la activación proteolítica de PD-L1, cuyos ejemplos se proporcionan en el presente documento. También se proporciona un método terapéutico que comprende la administraciónin vivode una proteína de unión a antígeno bloqueante de PD-L1 a un mamífero que lo necesita en una cantidad eficaz para reducir una actividad biológica inducida por PD-L1.

Formulaciones farmacéuticas de anticuerpos divulgados con vacunas tumorales

Un producto terapéutico combinado o formulación de un anticuerpo anti-PD-L1 divulgado con una vacuna terapéutica proporciona un beneficio terapéutico oncológico sinérgico. Por ejemplo, la presente divulgación proporciona una combinación de un anticuerpo anti-PD-L1 divulgado con “Neuvax”, que es un péptido sintético de 9 meros derivado de E75 aislado de HER2/neu combinado con GM-CSF como adyuvante como se describe en la patente estadounidense 8.222.214. Además, la presente divulgación proporciona una combinación de un anticuerpo anti-PD-L1 divulgado con la vacuna ALVAC-CEA, que es un virus de la viruela del canario combinado con antígeno carcinoembrionario.

Producción de proteínas de unión a antígeno anti-PD-L1

Las proteínas de unión a antígeno pueden prepararse mediante cualquiera de una serie de técnicas convencionales. La presente divulgación proporciona, en una realización, anticuerpos monoclonales que se unen a PD-L1. Los anticuerpos monoclonales pueden, por ejemplo, purificarse a partir de células que los expresan de manera natural (por ejemplo, un anticuerpo puede purificarse a partir de un hibridoma que lo produce), o producirse en sistemas de expresión recombinantes, usando cualquier técnica conocida en la técnica. Véase, por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennetet al.(eds.), Plenum Press, Nueva York (1980); y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988).

Pueden producirse anticuerpos monoclonales usando cualquier técnica conocida en la técnica, por ejemplo, inmortalizando células de bazo recogidas del animal transgénico después de la finalización del programa de inmunización. Las células de bazo pueden inmortalizarse usando cualquier técnica conocida en la técnica, por ejemplo, fusionándolas con células de mieloma para producir hibridomas. Las células de mieloma para su uso en procedimientos de fusión productores de hibridoma preferiblemente no producen anticuerpos, tienen alta eficacia de fusión y deficiencias enzimáticas que las hacen incapaces de crecer en ciertos medios selectivos que apoyan el crecimiento de sólo las células fusionadas deseadas (hibridomas). Los ejemplos de líneas celulares adecuadas para su uso en fusiones de ratón incluyen Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XX0 Bul; los ejemplos de líneas celulares usadas en fusiones de rata incluyen R210.RCY3 Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 48210. Otras líneas celulares útiles para fusiones celulares son U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6.

En un ejemplo, los polipéptidos se producen mediante métodos de ADN recombinantes insertando una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, un ADNc) que codifica el polipéptido en un vector de expresión recombinante y expresando la secuencia de ADN en condiciones que promueven la expresión.

Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-PD-L1, el ácido nucleico que codifica un anticuerpo se aísla y se inserta en uno o más vectores para clonación y/o expresión adicional en una célula huésped. Tal ácido nucleico puede aislarse y secuenciarse fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que pueden unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo).

Los ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los anticuerpos (o fragmentos) anti-PD-L1 divulgados en el presente documento pueden sintetizarse químicamente. El uso de codones puede seleccionarse para mejorar la expresión en una célula. Tal uso de codones dependerá del tipo de célula seleccionado. Se han desarrollado patrones de uso de codones especializados paraE. coliy otras bacterias, así como células de mamífero, células vegetales, células de levadura y células de insecto. Véase, por ejemplo: Mayfieldet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003 100 (2): 438-42; Sinclairet al.Protein Expr. Purif. 2002 (1): 96-105; Connell ND. Curr. Opin. Biotechnol. 2001 12(5):446-9; Makrideset al.Microbiol. 199660(3): 512-38; y Sharpet al.Yeast. 1991 7 (7): 657-78.

Se describen técnicas generales para la manipulación de ácidos nucleicos, por ejemplo, en Sambrooket al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, volúmenes 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 ed., 1989 o F. Ausubelet al.,Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing and Wiley-Interscience: Nueva York, 1987) y actualizaciones periódicas. El ADN que codifica el polipéptido está unido operativamente a elementos reguladores transcripcionales o traduccionales adecuados derivados de genes de mamíferos, virales o de insectos. Tales elementos reguladores incluyen un promotor de la transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica sitios de unión al ribosoma de ARNm adecuados, y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción. Se incorpora adicionalmente la capacidad de replicarse en un huésped, conferida habitualmente por un origen de replicación, y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de transformantes.

El ADN recombinante también puede incluir cualquier tipo de secuencia de etiqueta proteica que puede ser útil para purificar la proteína. Los ejemplos de etiquetas proteicas incluyen, pero no se limitan a, una etiqueta de histidina, una etiqueta FLAG, una etiqueta myc, una etiqueta HA o una etiqueta GST. Pueden encontrarse vectores de clonación y expresión apropiados para su uso con huéspedes celulares bacterianos, fúngicos, de levadura y de mamífero en Cloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, N.Y., 1985).

El constructo de expresión se introduce en la célula huésped usando un método apropiado para la célula huésped. Se conocen en la técnica diversos métodos para introducir ácidos nucleicos en células huésped, incluyendo, pero sin limitación, electroporación; transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrano u otras sustancias; bombardeo de microproyectiles; lipofección; e infección (en donde el vector es un agente infeccioso). Las células huésped adecuadas incluyen procariotas, levaduras, células de mamífero o células bacterianas, como se describe con más detalle a continuación.

Puede usarse cualquier sistema de expresión conocido en la técnica para preparar los polipéptidos recombinantes (por ejemplo, anticuerpo recombinante) de la invención. En general, las células huésped se transforman con un vector de expresión recombinante que comprende ADN que codifica un polipéptido deseado. Entre las células huésped que pueden emplearse están procariotas, levaduras o células eucariotas superiores. Los procariotas incluyen organismos Gram negativos o Gram positivos, por ejemploE. colio bacilos. Las células eucarióticas superiores incluyen células de insecto y líneas celulares establecidas de origen mamífero. Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión de vectores que codifican anticuerpos incluyen células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos en bacterias, en particular cuando no se necesitan glucosilación ni función efectora de Fc. Para la expresión de fragmentos de anticuerpos y polipéptidos en bacterias, véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.648.237, 5.789.199 y 5.840.523. (Véase también Charlton, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), págs. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpos enE. coli).Después de la expresión, el anticuerpo puede aislarse de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y puede purificarse adicionalmente. Las células eucarióticas superiores incluyen células de insecto y líneas celulares establecidas de origen mamífero. Los ejemplos de líneas de células huésped de mamífero adecuadas incluyen la línea COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzmanet al.,1981, Cell 23: 175), células L, células 293, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, líneas celulares BHK (ATCC CRL 10) y la línea celular CV1/EBNA derivada de la línea celular de riñón de mono verde africano CV1 (ATCC CCL 70) como se describe por McMahanet al.,1991, EMBO J. 10: 2821. Los vectores de clonación y expresión apropiados para su uso con huéspedes celulares bacterianos, fúngicos, de levadura y de mamífero se describen por Pouwelset al.(Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985).

En ciertas realizaciones, pueden usarse células de vertebrados como huéspedes para expresar un anticuerpo anti-PD-L1 o fragmento del mismo. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas celulares de mamífero que están adaptadas para crecer en suspensión. Otros ejemplos de líneas celulares huéspedes de mamíferos útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); la línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 como se describe, por ejemplo, en Grahamet al., J. Gen Virol. 36:59 (1977); células de riñón de cría de hámster (BHK); células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervical humano (HELA); células de riñón canino (MDCK; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A); células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); tumor mamario de ratón (MMT 060562); células TRI, como se describe, por ejemplo, en Matheret al.,Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982); células MRC 5; y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamíferos útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células DHFR.sup.-CHO (Urlaubet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980); y líneas celulares de mieloma tales como Y0, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de ciertas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J.), págs. 255-268 (2003). Los ejemplos de líneas de células huésped de mamífero adecuadas incluyen la línea COS-7 de células de riñón de mono (a Tc C CRL 1651) (Gluzmanet al.,1981, Cell 23:175), células L, células 293, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, líneas celulares BHK (ATCC CRL 10) y la línea celular CV1/EBNA derivada de la línea celular de riñón de mono verde africano CV1 (ATCC CCL 70) como se describe por McMahanet al.,1991, EMBO J. 10: 2821.

Además de procariotas, microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican anticuerpos, incluyendo cepas de hongos y levaduras cuyas rutas de glucosilación se han “humanizado”, dando como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véase Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004) y Liet al.,Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).

Las células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpos glicosilados también se derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células vegetales y de insectos. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que pueden usarse junto con células de insecto, particularmente para la transfección de células deSpodoptera frugiperda.

Se describen vectores de clonación y expresión apropiados para su uso con huéspedes celulares bacterianos, fúngicos, de levadura y de mamífero por Pouwelset al.(Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985).

Las células transformadas pueden cultivarse en condiciones que promueven la expresión del polipéptido, y el polipéptido recuperarse mediante procedimientos convencionales de purificación de proteínas. Uno de tales procedimientos de purificación incluye el uso de cromatografía de afinidad, por ejemplo, sobre una matriz que presenta la totalidad o una porción (por ejemplo, el dominio extracelular) de PD-L1 unido a la misma. Los polipéptidos contemplados para su uso en el presente documento incluyen polipéptidos de anticuerpo anti-PD-L1 de mamífero recombinantes sustancialmente homogéneos sustancialmente libres de materiales endógenos contaminantes.

Por tanto, pueden producirse anticuerpos usando métodos y composiciones recombinantes, por ejemplo, como se describe en la patente estadounidense n.° 4.816.567. En una realización, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-PD-L1 descrito en el presente documento. Tal ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende la VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas ligera y/o pesada del anticuerpo). En una realización adicional, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden tal ácido nucleico. En una realización adicional, se proporciona una célula huésped que comprende tal ácido nucleico. En una de tales realizaciones, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado con): (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo. En una realización, la célula huésped es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula linfoide (por ejemplo, célula Y0, NS0, Sp20). En una realización, se proporciona un método para preparar un anticuerpo anti-PD-L1, en donde el método comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, como se ha proporcionado anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo, y opcionalmente recuperar el anticuerpo de la célula huésped (o medio de cultivo de células huésped).

Las proteínas divulgadas en el presente documento también pueden producirse usando sistemas de traducción celular. Para tales propósitos, los ácidos nucleicos que codifican el polipéptido deben modificarse para permitir la transcripciónin vitropara producir ARNm y permitir la traducción libre de células del ARNm en el sistema libre de células particular que está utilizándose (eucariota tal como un sistema de traducción libre de células de mamífero o levadura o procariota tal como un sistema de traducción libre de células bacterianas).

Los polipéptidos de unión a PD-L1 también pueden producirse mediante síntesis química (por ejemplo, mediante los métodos descritos en Solid Phase Peptide Synthesis, 2a ed., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois). También pueden producirse modificaciones en la proteína mediante síntesis química.

Los polipéptidos de la presente divulgación pueden purificarse mediante métodos de aislamiento/purificación para proteínas generalmente conocidos en el campo de la química de proteínas. Los ejemplos no limitantes incluyen extracción, recristalización, precipitación salina (por ejemplo, con sulfato de amonio o sulfato de sodio), centrifugación, diálisis, ultrafiltración, cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, cromatografía de fase normal, cromatografía de fase inversa, filtración en gel, cromatografía de permeación en gel, cromatografía de afinidad, electroforesis, distribución en contracorriente o cualquier combinación de estas. Después de la purificación, los polipéptidos pueden intercambiarse en diferentes tampones y/o concentrarse mediante cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, filtración y diálisis.

El polipéptido purificado es preferiblemente al menos un 85 % puro, más preferiblemente al menos un 95 % puro y lo más preferiblemente al menos un 98 % puro. Independientemente del valor numérico exacto de la pureza, el polipéptido es suficientemente puro para su uso como producto farmacéutico. Las proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, derivados de anticuerpo, muteínas de anticuerpo y variantes de anticuerpo) son polipéptidos que se unen a PD-L1 (preferiblemente, PD-L1 humano). Las proteínas de unión a antígeno incluyen proteínas de unión a antígeno que inhiben una actividad biológica de PD-L1.

Pueden prepararse proteínas de unión a antígeno y examinarse para detectar propiedades deseadas, mediante cualquiera de varias técnicas conocidas. Ciertas de las técnicas implican aislar un ácido nucleico que codifica una cadena polipeptídica (o porción de la misma) de una proteína de unión a antígeno de interés (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-L1) y manipular el ácido nucleico a través de tecnología de ADN recombinante. El ácido nucleico puede fusionarse con otro ácido nucleico de interés, o alterarse (por ejemplo, mediante mutagénesis u otras técnicas convencionales) para añadir, delecionar o sustituir uno o más residuos de aminoácidos, por ejemplo.

Pueden formarse anticuerpos de cadena sencilla uniendo fragmentos de dominio variable de cadena pesada y ligera (región Fv) a través de un puente de aminoácidos (enlazador peptídico corto), dando como resultado una única cadena polipeptídica. Tales Fv de cadena sencilla (scFv) se han preparado fusionando ADN que codifica un enlazador peptídico entre ADN que codifican los dos polipéptidos de dominio variable (V<l>y V<h>). Los polipéptidos resultantes pueden plegarse sobre sí mismos para formar monómeros de unión a antígeno, o pueden formar multímeros (por ejemplo, dímeros, trímeros o tetrámeros), dependiendo de la longitud de un enlazador flexible entre los dos dominios variables (Korttet al.,1997, Prot. Eng. 10:423; Korttet al.,2001, Biomol. Eng. 18:95-108). Combinando diferentes polipéptidos que comprenden V<l>y V<h>, pueden formarse scFv multiméricos que se unen a diferentes epítopos (Kiringkumet al.,2001, Biomol. Eng. 18:31-40). Las técnicas desarrolladas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla incluyen las descritas en la patente estadounidense 4.946.778; Bird, 1988, Science 242:423; Hustonet al.,1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879; Wardet al.,1989, Nature 334:544, de Graafet al.,2002, Methods Mol. Biol. 178:379-87.

Se conocen técnicas para derivar un anticuerpo de una subclase o isotipo diferente de un anticuerpo de interés, es decir, cambio de subclase. Por tanto, pueden derivarse anticuerpos IgG de un anticuerpo IgM, por ejemplo, y viceversa. Tales técnicas permiten la preparación de nuevos anticuerpos que poseen las propiedades de unión a antígeno de un anticuerpo dado (el anticuerpo parental), pero también presentan propiedades biológicas asociadas con un isotipo o subclase de anticuerpo diferente del anticuerpo parental. Pueden emplearse técnicas de ADN recombinante. El ADN clonado que codifica polipéptidos de anticuerpo particulares puede emplearse en tales procedimientos, por ejemplo, ADN que codifica el dominio constante de un anticuerpo del isotipo deseado (Lantoet al.,2002, Methods Mol. Biol.

178:303-16). Además, si se desea una IgG4, también puede desearse introducir una mutación puntual (CPSCP->CPPCP) en la región bisagra (Bloomet al.,1997, Protein Science 6:407) para aliviar la tendencia a formar enlaces disulfuro dentro de la cadena H que pueden conducir a heterogeneidad en los anticuerpos IgG4.

Otras realizaciones se describen en los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1: Afinidad comparativa por el anticuerpo H6B1L y anticuerpos variantes

Este ejemplo proporciona datos de Biacore que muestran que los tres anticuerpos completamente humanos, de tipo natural (H6B1L), H6B1L-EV y H6B1L-EM tienen afinidad similar entre sí por PD-L1 humano, como se muestra en la tabla 1 a continuación:

Tabla 1. Datos de BIACORE comparativos para el anticuerpo original H6B1L y las variantes H6B1L-EV y -EM

Por consiguiente, sorprendentemente, cambiar uno o dos aminoácidos en la cadena ligera mejoró la capacidad de fabricar el anticuerpo en cantidades suficientes, pero no tuvo un impacto sobre la capacidad de unión para unirse a su diana, PD-L1 humano.

Ejemplo 2: Fabricación mejorada del anticuerpo H6B1L-EM

Este ejemplo ilustra un análisis espectral de masa de dos cadenas ligeras del anticuerpo original de tipo natural H6B1L (SEQ ID NO. 4) y la cadena ligera de H6B1L-EM (SEQ ID NO. 2). Los anticuerpos se produjeron cada uno en células CHO. En la figura 1A se muestra una comparación del pico logrado. Además, la secuenciación de Edman N-terminal confirmó que hay un fragmento de cadena ligera de SYELMXXX y LMXXX presente en los picos de espectrometría de masas para la cadena ligera de H6B1L de tipo natural. Como se describe en la figura 1B, no se detectó fragmento de cadena ligera (LC) para la cadena ligera de H6B1LEM en comparación con la cadena ligera original.

Tabla de secuencias

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo completamente humano de una clase IgG que se une a un epítopo de PD-L1, en donde el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO. 1, y comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO. 2.

2. El anticuerpo completamente humano de la reivindicación 1, que es una IgG 1 o una IgG4.

3. Un fragmento de anticuerpo completamente humano Fab anti-PD-L1 que tiene un dominio variable de una cadena pesada y un dominio variable de una cadena ligera, en donde el dominio variable de cadena pesada comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO.

1, y en donde el dominio variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO. 2.

4. Un anticuerpo humano de cadena sencilla anti-PD-L1 que tiene un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera conectados a través de un enlazador peptídico, en donde el dominio variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO. 1, y en donde el dominio variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO. 2.

5. El anticuerpo completamente humano de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, para su uso en el tratamiento de un sujeto humano que tiene cáncer o una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria.

6. El fragmento Fab de anticuerpo completamente humano de la reivindicación 3, para su uso en el tratamiento de un sujeto humano que tiene cáncer o una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria.

7. El anticuerpo de cadena sencilla completamente humano de la reivindicación 4, para su uso en el tratamiento de un sujeto humano que tiene cáncer o una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria.

8. El anticuerpo completamente humano, fragmento Fab de anticuerpo completamente humano o anticuerpo de cadena sencilla completamente humano para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de pulmón, mieloma, un tumor del SNC derivado de neuroblastos, leucemia monocítica, leucemia derivada de células B, leucemia derivada de células T, linfoma derivado de células B, linfoma derivado de células T y un tumor derivado de mastocitos.

9. El anticuerpo completamente humano, fragmento Fab de anticuerpo completamente humano o anticuerpo de cadena sencilla completamente humano para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde la enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en inflamación de la mucosa intestinal, enfermedad de consunción asociada con colitis, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, una infección viral, artritis reumatoide, osteoartritis, psoriasis, enfermedad de Crohn y enfermedad inflamatoria intestinal.

10. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que se produce en una célula de ovario de hámster chino (CHO).

11. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, y un portador farmacéuticamente aceptable.