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ES2985986T3 - Conjugado biciclo para tratar el cáncer - Google Patents

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ES2985986T3
ES2985986T3 ES18700385T ES18700385T ES2985986T3 ES 2985986 T3 ES2985986 T3 ES 2985986T3 ES 18700385 T ES18700385 T ES 18700385T ES 18700385 T ES18700385 T ES 18700385T ES 2985986 T3 ES2985986 T3 ES 2985986T3
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ES
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cancer
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tumor
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inhibitors
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ES18700385T
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English (en)
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Gavin Bennett
Daniel Paul Teufel
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BicycleRD Ltd
Original Assignee
BicycleRD Ltd
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Abstract

La presente invención proporciona compuestos, composiciones de los mismos y métodos para utilizarlos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugado biciclo para tratar el cáncer
Antecedentes de la invención
MT1-MMP es una metaloproteasa transmembrana que desempeña un papel importante en la remodelación de la matriz extracelular, directamente degradando varios de sus componentes e indirectamente activando pro-MMP2. MT1-MMP es crucial para la angiogénesis tumoral (Sounni et al (2002) FASEB J. 16(6), 555-564) y se sobreexpresa en una diversidad de tumores sólidos. En consecuencia, sigue habiendo una gran necesidad insatisfecha en el desarrollo de inhibidores de MT1-MMP para el tratamiento del cáncer. El documento WO 2016/067035 describe péptidos que son aglutinantes de alta afinidad de metaloproteasa de membrana tipo 1 (MT1-MMP). El documento WO 2017/191460 describe conjugados de fármacos que comprenden péptidos bicíclicos específicos para MT1-MMP conjugados con uno o más grupos efectores y/o funcionales que tienen utilidad en la terapia dirigida contra el cáncer. El documento WO 2010/089115 describe un método para proporcionar un ligando peptídico multiespecífico que comprende un polipéptido unido covalentemente a un andamio molecular en tres o más restos de aminoácidos y capaz de unirse a dos o más dianas separadas. El documento WO 2013/050615 describe un método para seleccionar un ligando polipeptídico que tiene un nivel deseado de especificidad para una diana. Gu Guangzhi et al (2013) Biomaterials 34(21) 5138-5148 describen la influencia del péptido penetrante iRGD sobre el efecto de las nanopartículas conjugadas con MT1-AF7p cargadas con paclitaxel sobre las células de glioma.
Breve descripción de los dibujos
LaFigura 1representa la estabilidad plasmática deI-1aen ser humano y ratón.
LaFigura 2representa la estabilidad plasmática deI-1acon y sin AEBSF.
LaFigura 3representa la estabilidad plasmática deI-1aen ratón y la formación del metabolito MMAE.
LaFigura 4representa la eficacia deI-1aen el modelo de xenoinjerto HT1080.
LaFigura 5representa el desplazamiento de la actividad deI-1acuando se dosifica a 1 mg/kg en el modelo de xenoinjerto HT1080 por el péptido de unión.
LaFigura 6representa la eficacia deI-1aen el modelo de xenoinjerto derivado de paciente (PDX) de cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) que expresa MT1-MMP.
LaFigura 7representa la eficacia deI-1aen el modelo PDX de NSCLC de baja expresión de MT1-MMP.
LaFigura 8representa la tolerabilidad deI-1aen el modelo PDX de NSCLC de baja expresión de MT1-MMP.
LaFigura 9representa los cambios en el peso corporal después de administrar I-3a, 1-7, I-4a y 1-8 a ratones hembra Balb/c desnudos portadores de xenoinjerto HT1080. Los puntos de datos representan el peso corporal medio del grupo. Las barras de error representan el error típico de la media (SEM).
LaFigura 10representa trazados del volumen tumoral después de administrar I-3a, 1-7, 1-4a y 1-8 a ratones hembra Balb/c desnudos portadores de xenoinjerto HT1080. Los puntos de datos representan la media del grupo, las barras de error representan el error típico de la media (SEM).
LaFigura 11representa los cambios de peso corporal (A) y el volumen tumoral (B) después de administrar I-12 a ratones desnudos BALB/c hembra portadores de xenoinjerto HT1080. Los puntos de datos representan el peso corporal medio del grupo. Las barras de error representan el error típico de la media (SEM).
LaFigura 12representa los cambios de peso corporal (A) y el Volumen tumoral (B) después de administrar I-16 a ratones desnudos BALB/c hembra portadores de xenoinjerto HT1080. Los puntos de datos representan el peso corporal medio del grupo. Las barras de error representan el error típico de la media (SEM).
Descripción detallada de determinadas realizaciones de la invención
1. Compuesto
Una tecnología patentada de visualización de fagos y péptidos cíclicos (tecnología Bicycle®) se utilizó para identificar péptidos de unión de alta afinidad a la metaloproteinasa de matriz tipo 1 de membrana (MT1-MMP/MMP14). MT1-MMP (MT1) es una proteasa de membrana de la superficie celular que normalmente participa en la remodelación de tejidos y que se ha descubierto que está sobreexpresada en muchos tumores sólidos. La sobreexpresión de MT1 se ha relacionado con la invasividad del cáncer y un mal pronóstico. Aunque los intentos de dirigirse a la actividad proteolítica de MT1 y otras MMP en el cáncer no tuvieron éxito en los ensayos clínicos debido en gran parte a la toxicidad provocada por una selectividad insuficiente, MT1-MMP sigue siendo una diana de cáncer atractiva para enfoques de suministro citotóxico dirigido.
Diversas bibliotecas de fagos de selección que contienen de 1011 a 1013 secuencias peptídicas únicas que se ciclan postraduccionalmente con andamios reactivos con tiol se usaron para identificar pequeños (1,5-2 kDa) productos de unión a péptidos bicíclicos restringidos (Biciclos) al dominio de hemopexina de m T1. Los productos de unión iniciales se sometieron a maduración por afinidad mediante exploraciones dirigidas y estabilización mediante optimización química.
Se identificó un producto de unión a péptidos restringidos bicíclicos (Biciclo) que se une al dominio de hemopexina de MT1 con una Kd aparente de aproximadamente 2 nM. El péptido Biciclo (N241) se une con afinidad similar a todo el ectodominio de la proteasa pero no muestra unión al dominio catalítico. N241 tampoco muestra unión con ninguno de los miembros de la familia MMP estrechamente relacionados analizados (MMP15, MMP16, MMP24, MMP1, Pro-MMP1, MMP2). La caracterización del efecto farmacológico de N241 sobre MT1in vitromuestra que el péptido no tiene un impacto directo sobre la actividad catalítica de la proteasa, ni actividad catalítica de MMP relacionada (MMP1, MMP2 y MMP9) ni migración o invasión celular. Sin embargo, la unión de N241 etiquetado con fluorescencia a MT1 en células de fibrosarcoma HT1080 da como resultado la rápida internalización y la posterior localización lisosómica del compuesto. Además, N241 cargado con 177Lu demuestra una rápida localización del tumor cuando se inyecta IV en ratones con xenoinjertos de tumores positivos para MT1, con niveles tan altos como el 15-20 % de la dosis inyectada por gramo de tumor en menos de 60 minutos. Por el contrario, un péptido Biciclo que no se une no muestra localización tumoral. Estas propiedades sugieren que N241 puede ser un buen vehículo de administración de cargas útiles citotóxicas dirigidas a células tumorales positivas para MT1. Se prepararon conjugados de fármacos Biciclo (BDC) con una diversidad de conectores y cargas útiles citotóxicas que mantuvieron la unión a MT1. La actividad antitumoral de BDC seleccionados se demostró en xenoinjertos de células tumorales humanas positivas para MT1 en ratones.
I-1aes un conjugado de fármaco Biciclo (BDC) que comprende un péptido bicíclico restringido que se une con alta afinidad y especificidad a la metaloproteasa de matriz tipo 1 de membrana (MT1-MMP; MMP14) enlazado covalentemente a través de un Espaciador-AA1-AA2-Enlazador a monometil auristatina E (MMAE), un potente agente antimitótico. MT1-MMP está implicado de forma natural en la remodelación de tejidos, sin embargo la sobreexpresión de la proteasa de la superficie celular se ha relacionado con la agresividad y la invasividad tumorales, así como un mal pronóstico del paciente para muchas indicaciones de cáncer. El producto de unión Biciclo paraI-1a(N241) se identificó utilizando una tecnología patentada de péptidos de presentación en fagos que consiste en bibliotecas de fagos muy diversas de secuencias de aminoácidos lineales restringidos en dos bucles por un andamio químico central. Aunque se une con afinidad y especificidad similares a las observadas con anticuerpos monoclonales, el pequeño tamaño de un péptido Biciclo (1,5-2 kDa) ayuda a su rápida extravasación y penetración en el tumor lo que lo convierte en un formato ideal para la administración dirigida de cargas citotóxicas.
Una ventaja del enlazador AA1-AA2 es la especificidad del direccionamiento y la liberación de toxinas. Se conoce la liberación no específica de toxinas y se la ha denominado actividad espectadora. Por ejemplo, se ha demostrado que los conjugados de fármaco-anticuerpo (ADC) se activan principalmente mediante la internalización y la degradación del anticuerpo en el lisosoma y la liberación de un metabolito activado que puede destruir las células tumorales. Dependiendo del tipo de carga útil (toxina) y de enlazador, los metabolitos activados pueden tener actividad secundaria (la capacidad de penetrar a las células vecinas) y destruir las células tumorales vecinas. Por ejemplo, las toxinas DM1 y MMAE (el metabolito de Brentuximab vedotina, nombre comercial Adcetris) tienen actividad espectadora, mientras que DM1-SMCC-lisina (el metabolito de Trastuzumab emtasina, nombre comercial Kadcyla) y m Ma F no la tienen. La mayor parte de la actividad de BDC no está mediada por la internalización y degradación de BDC mediada por dianas en metabolitos activos. Sin desear quedar ligados a teoría particular alguna, se cree que los BDC se activan principalmente fuera de las células mediante reducción por disulfuro para los BDC que utilizan un enlazador disulfuro y escisión de proteasa mediante catepsina B expresada en la superficie de la célula tumoral para los BDC que utilizan un enlazador AA1-AA2 tal comoI-1a, lo cual es consistente con la semivida observada de los BDC. La utilización de la escisión por catepsina B tiene el potencial de lograr una liberación más selectiva de toxina ya que se ha descubierto que la actividad de la catepsina B está elevada en una diversidad de tumores humanos y líneas celulares tumorales. Una hipótesis alternativa es que los BDC liberan toxinas a través de un mecanismo no dirigido dentro de la célula a través de la pinocitosis y la degradación de los lisosomas. Una hipótesis adicional es que los BDC liberan toxinas mediante una combinación de activación tanto interna como externa.
Se preparó una serie de Biciclo-espaciador-AA1-AA2-enlazador-toxina, con formato de espaciador variable para ajustar la presentación del Biciclo y evaluado por su actividad antitumoral en un modelo de xenoinjerto tumoral positivo para MT1. El BDC seleccionado para una evaluación adicional (I-1a) se evaluó para determinar su eficacia en una variedad de modelos de xenoinjertos tumorales.
Una construcción AA1-AA2 enlazador-MMAE (I-1a) estaba entre las construcciones más activas contra los xenoinjertos de tumores de pulmón EBC-1 positivos para MT1. La dosificaciónI-1aen un programa de 3 veces por semana durante dos semanas, se observó una reducción significativa en el crecimiento del tumor con 1 mg/kg, provocando 3 mg/kg y 10 mg/kg regresiones completas en este modelo. La eficacia terapéutica deI-1aa 10 mg/kg se acompaña de una breve pérdida de peso corporal que es reversible al suspender el tratamiento.I-1a, un conjugado de fármaco Biciclo (BDC), muestra una potente actividad antitumoral en modelos de xenoinjerto de tumores humanos de cáncer de pulmón. Sin desear quedar ligados a teoría particular alguna, se cree que el pequeño tamaño del BDC puede ofrecer una ventaja significativa sobre otros enfoques citotóxicos dirigidos tales como los conjugados anticuerpo-fármaco debido a la rápida extravasación y la mejora de la penetración tumoral. De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un compuesto de fórmulaI:
en donde:
Biciclo es un polipéptido que está unido covalentemente a un andamio molecular de tal manera que dos o más bucles peptídicos están subtendidos entre los puntos de unión al andamio, en donde el polipéptido tiene una secuencia:
El espaciador es un resto bivalente que conecta el resto Biciclo con el resto AA1-AA2;
AA1-AA2 es -Val-Cit- o -Cit-Val-;
El enlazador es un resto espaciador bivalente que conecta el resto AA1-AA2 con el resto Toxina; y la Toxina es un agente quimioterapéutico.
En determinados aspectos, la presente invención proporciona un conjugado de fármaco que comprende un aglutinante de alta afinidad de MT1-MMP, tal como1-1,o una sal o composición farmacéuticamente aceptable de la misma para su uso en un método para tratar determinados cánceres en un sujeto. En determinados aspectos, la presente invención proporciona un conjugado de fármaco que comprende un aglutinante de alta afinidad de MT1-MMP, tal comoI-1a,o una sal o composición farmacéuticamente aceptable de la misma para su uso en un método para tratar determinados cánceres en un sujeto.
En determinadas realizaciones, la presente invención proporciona un compuesto de fórmulaI-aoI-b:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde cada uno de Biciclo, Espaciador, Enlazador y Toxina son como se definen y se describen en el presente documento.
Las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento están escritas del extremo N al extremo C, excepto cuando se describe de manera diferente.
I. Restos Biciclo
Como se ha descrito en general anteriormente, la presente invención proporciona un BDC que comprende un resto Biciclo, un resto Espaciador, un resto AA1-AA2, un resto Enlazador y un resto Toxina.
Como se usa en el presente documento, el término resto Biciclo se refiere a un péptido bicíclico unido covalentemente a una estructura molecular.
Como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento, un péptido bicíclico es un polipéptido que está unido covalentemente a un andamio molecular de tal manera que dos o más bucles peptídicos están subtendidos entre los puntos de unión al andamio.
En algunas realizaciones, el polipéptido es un producto de unión de alta afinidad de la metaloproteasa de membrana tipo 1 (MT1-MMP, también conocido como MMP14). En algunas realizaciones, el polipéptido tiene reacción cruzada total con MT 1-MMP murina, canina, de macaco cangrejero y humana. En algunas realizaciones, el polipéptido es selectivo para MT1-MMP, pero no reacciona de forma cruzada con MMP-1, MMP-2, MMP-15 y MMP-16. En algunas realizaciones, el polipéptido es específico para MT1-MMP humana. En algunas realizaciones, el polipéptido es específico para MT1-MMP de ratón. En algunas realizaciones, el polipéptido es específico para MT1-MMP humana y de ratón. En algunas realizaciones, el polipéptido es específico para MT1-MMP humana, de ratón y de perro. En algunas realizaciones, el polipéptido es un aglutinante de alta afinidad del dominio de hemopexina MT1-MMP (PEX).
En una realización, el reactivo de andamio molecular puede comprendero puede consistir en tris(bromometil)benceno,
, , o un derivado del mismo.
En una realización, el andamio molecular puede formarse mediante tratamiento del polipéptido con un reactivo de andamio molecular que comprende o que puede consistir en tris(bromometil)benceno, especialmente 1,3,5-
tris(bromometil)benceno (TBMB), o un derivado del mismo, en donde el tratamiento con un
polipéptido proporciona el andamio molecular o un derivado del mismo, a través de desplazamiento de bromuro.
En una realización, el andamio molecular puede comprendero puede consistir en triacrilf
(TATA), en donde el tratamiento con un polipéptido proporciona el andamio molecular través de la adición de Michael.
El reactivo de andamio molecular de la invención contiene grupos químicos que permiten que los grupos funcionales del polipéptido de la invención formen enlaces covalentes con el andamio molecular. Dichos grupos químicos se seleccionan de una amplia gama de funcionalidades incluyendo aminas, tioles, alcoholes, cetonas, aldehídos, nitrilos, ácidos carboxílicos, ésteres, alquenos, alquinos, anhídridos, succinimidas, maleimidas, azidas, haluros de alquilo y haluros de acilo.
En algunas realizaciones, un Biciclo es:
Como se usa en el presente documento Espaciador se refiere a un resto bivalente que conecta el resto Biciclo con el resto AA1-AA2.
Un experto en la materia apreciará que una diversidad de restos Espaciadores son adecuados para lograr la conexión del Biciclo con el resto AA1-AA2.
En determinadas realizaciones, el resto espaciador es un resto bivalente que comprende una alanina, un dominio de polisarcosina, una beta-alanina y un resto glutarilo. En algunas realizaciones, el dominio de polisarcosina es un resto de polisarcosina bivalente de 5-15 miembros. En algunas realizaciones, el dominio de polisarcosina es un resto de polisarcosina bivalente de 5 miembros. En algunas realizaciones, el dominio de polisarcosina es un resto de polisarcosina bivalente de 6 miembros. En algunas realizaciones, el dominio de polisarcosina es un resto de polisarcosina bivalente de 7 miembros. En algunas realizaciones, el dominio de polisarcosina es un resto de polisarcosina bivalente de 8 miembros. En algunas realizaciones, el dominio de polisarcosina es un resto de polisarcosina bivalente de 9 miembros. En algunas realizaciones, el dominio de polisarcosina es un resto de polisarcosina bivalente de 10 miembros. En algunas realizaciones, el dominio de polisarcosina es un resto de polisarcosina bivalente de 11 miembros. En algunas realizaciones, el dominio de polisarcosina es un resto de polisarcosina bivalente de 12 miembros. En algunas realizaciones, el dominio de polisarcosina es un resto de polisarcosina bivalente de 13 miembros. En algunas realizaciones, el dominio de polisarcosina es un resto de polisarcosina bivalente de 14 miembros. En algunas realizaciones, el dominio de polisarcosina es un resto de polisarcosina bivalente de 15 miembros.
En algunas realizaciones, el resto Espaciador
En determinadas realizaciones, el resto Espaciador es un resto tiopropanoil maleimido caproílo bivalente. En otras realizaciones, el resto Espaciador se selecciona de:
En algunas realizaciones, el resto Espaciador es En algunas
realizaciones, el resto Espaciador es u En algunas realizaciones, el resto
Espaciador es En al unas realizaciones, el resto
Espaciador es En algunas realizaciones, el resto Espaciador es
continuación.
En algunas realizaciones, el resto Espaciador se selecciona de los representados en laTabla 1b,a continuación.III. Restos AA1-AA2
Como se usa en el presente documento AA1-AA2 es un resto que conecta el resto Espaciador con el resto Enlazador, en donde el enlace entre ellos puede escindirse selectivamente mediante enzimas expresadas en células tumorales. En algunas realizaciones, AA1-AA2 es un resto que se escinde selectivamente por catepsina.
En algunas realizaciones, cada uno de AA1 y AA2 es un L aminoácido. En algunas realizaciones, cada uno de AA1 y AA2 es un D aminoácido. En algunas realizaciones, uno de AA1 y AA2 es un L aminoácido y el otro es un D aminoácido. En algunas realizaciones, AA1-AA2 es -Val-Cit-. En algunas realizaciones, AA1-AA2 es - Cit-Val-.
IV. Restos Enlazadores
Como se usa en el presente documento Enlazador es un resto espaciador bivalente que conecta el resto AA1-AA2 con el resto Toxina. En algunas realizaciones, un Enlazador es un Enlazador que se autoinmola.
Un experto en la materia apreciará que una diversidad de restos Enlazadores son adecuados para lograr la conexión del resto AA1-AA2 con el resto Toxina.
En algunas realizaciones, el Enlazador es un resto para-aminobencilo. En algunas realizaciones, el Enlazador es
En algunas realizaciones, el Enlazador es un resto espaciador autoinmolador bivalente. En algunas realizaciones, el
En algunas realizaciones, el resto Enlazador se selecciona de los representados en laTabla 1a,a continuación. En algunas realizaciones, el resto Enlazador se selecciona de los representados en laTabla 1b,a continuación.V. Restos de Toxina
Como se usa en el presente documento Toxina se refiere a un agente quimioterapéutico.
Un experto en la materia apreciará que una diversidad de restos de Toxina son susceptibles de lograr los efectos quimioterapéuticos de la presente invención.
En algunas realizaciones, la Toxina puede conectarse en cualquier posición disponible. En algunas realizaciones, la Toxina puede conectarse en cualquier posición -OH, -C(O)OH, -SH, -NH<2>o - NHCH<3>disponible.
En algunas realizaciones, la Toxina es monometil auristatina E (MMAE):
En algunas realizaciones, la Toxina es monometil auristatina E (MMAE):
En algunas realizaciones, el resto de toxina se selecciona de los representados en laTabla 1a,a continuación. En algunas realizaciones, el resto de toxina se selecciona de los representados en laTabla 1b,a continuación. Los compuestos ilustrativos de la invención se exponen también en la Tabla 1a, a continuación.
Tabla 1a. Compuestos ilustrativos
��
��
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un compuesto como se expone en laTabla 1a,anteriormente, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Los compuestos ilustrativos de la invención se exponen también en laTabla 1b,a continuación.
Tabla ib . Compuestos ilustrativos
��
��
��
��
��
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un compuesto como se expone en laTabla 1b,anteriormente, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
2. Composiciones farmacéuticamente aceptables
De acuerdo con otra realización, la invención proporciona una composición que comprende un compuesto de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptables.
Como se usa en el presente documento, la expresión "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a las sales que son, dentro del alcance del buen criterio médico, adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos o animales inferiores sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica y similares y que es proporcional a una relación beneficio/riesgo razonable. Las sales farmacéuticamente aceptables son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, S. M. Bergeet al.,describen detalladamente sales farmacéuticamente aceptables en J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la presente invención incluyen las obtenidas a partir de ácidos y bases inorgánicos y orgánicos adecuados. Los ejemplos de sales de adición de ácidos no tóxicas farmacéuticamente aceptables son las sales de un grupo amino formadas con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y ácido perclórico o con ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico o ácido malónico o usando otros métodos usados en la técnica tales como el intercambio iónico. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, alcanforato, alcanforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, formiato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, gluconato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, yodhidrato, 2-hidroxi-etanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, lauril sulfato, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p-toluenosulfonato, undecanoato, valerato y similares.
Las sales derivadas de bases apropiadas incluyen sales de metales alcalinos, metales alcalinotérreos, amonio y N+(alquilo C-<m>)4. Las sales de metales alcalinos o alcalinotérreos representativas incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables adicionales incluyen, cuando sea apropiado, amonio no tóxico, amonio cuaternario y cationes de amina formados usando contraiones tales como haluro, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, sulfonato de alquilo inferior y sulfonato de arilo.
El término "sujeto", como se usa en el presente documento, se usa indistintamente con el término "paciente" y significa un animal, preferentemente un mamífero. En algunas realizaciones, un sujeto o paciente es un ser humano. En otras realizaciones, un sujeto (o paciente) es un sujeto (o paciente) veterinario. En algunas realizaciones, un sujeto (o paciente) veterinario es un sujeto canino, felino o equino.
La expresión "portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un portador, adyuvante, o vehículo no tóxico que no destruye la actividad farmacológica del compuesto con el que se formula. Los portadores, adyuvantes o vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden usarse en las composiciones de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales como albúmina sérica humana, sustancias tampón tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato disódico, hidrogenofosfato potásico, cloruro sódico, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloques de polietilenopolioxipropileno, polietilenglicol y lanolina.
Las composiciones de la presente invención pueden administrarse por vía oral, por vía parenteral, mediante pulverización por inhalación, por vía tópica, por vía rectal, por vía nasal, por vía bucal, por vía vaginal o mediante un depósito implantado. El término "parenteral" como se usa en el presente documento incluye técnicas de inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal. Preferentemente, las composiciones se administran por vía oral, por vía intraperitoneal o por vía intravenosa. Las formas inyectables estériles de las composiciones de la presente invención pueden ser una suspensión acuosa u oleaginosa. Estas suspensiones pueden formularse de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica usando agentes de dispersión o humectación y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o un disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro sódico. Además, se usan aceites no volátiles estériles convencionalmente como un disolvente o un medio de suspensión.
Con este fin, puede emplearse cualquier aceite suave no volátil incluyendo monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales como ácido oleico y sus derivados de glicéridos, son útiles en la preparación de inyectables, como lo son los aceites naturales farmacéuticamente aceptables, tales como aceite de oliva o aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas soluciones o suspensiones oleaginosas también pueden contener un diluyente o dispersante alcohólico de cadena larga, tales como carboximetilcelulosa o agentes dispersantes similares que se usan comúnmente en la formulación de formas farmacéuticas farmacéuticamente aceptables que incluyen emulsiones y suspensiones. Otros tensioactivos usados comúnmente, tales como los Tween, Span y otros agentes emulsionantes o potenciadores de la biodisponibilidad que se usan habitualmente en la fabricación de formas farmacéuticas sólidas, líquidas u otras también pueden usarse con fines de formulación.
Las composiciones farmacéuticamente aceptables de la presente invención pueden administrarse por vía oral en cualquier forma de dosificación oralmente aceptable incluyendo, pero no limitado a, cápsulas, comprimidos, suspensiones acuosas o soluciones. En el caso de comprimidos para uso oral, los vehículos que se usan habitualmente incluyen lactosa y almidón de maíz. Los agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, también se añaden normalmente. Para la administración oral en forma de una cápsula, los diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz deshidratado. Cuando se necesitan suspensiones acuosas para uso oral, el principio activo se combina con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se desea, también pueden añadirse determinados agentes edulcorantes, saborizantes o colorantes.
Como alternativa, las composiciones farmacéuticamente aceptables de la presente invención pueden administrarse en forma de supositorios para administración rectal. Estos pueden prepararse mezclando el agente con un excipiente no irritante adecuado que es sólido a temperatura ambiente pero líquido a temperatura rectal y, por lo tanto, se derretirá en el recto para liberar el fármaco. Dichos materiales incluyen manteca de cacao, cera de abeja y polietilenglicoles.
Las composiciones farmacéuticamente aceptables de la presente invención también pueden administrarse por vía tópica, especialmente cuando la diana de tratamiento incluye áreas u órganos fácilmente accesibles mediante aplicación tópica, incluyendo enfermedades del ojo, la piel o el tracto intestinal inferior. Las formulaciones tópicas adecuadas se preparan fácilmente para cada una de estas áreas u órganos.
La aplicación tópica para el tracto intestinal inferior puede efectuarse en una formulación de supositorio rectal (véase anteriormente) o en una formulación de enema adecuada. También pueden usarse parches transdérmicos por vía tópica.
Para aplicaciones tópicas, las composiciones farmacéuticamente aceptables proporcionadas pueden formularse en una pomada adecuada que contiene el componente activo suspendido o disuelto en uno o más vehículos. Los vehículos para administración tópica de los compuestos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, aceite mineral, vaselina líquida, vaselina blanca, propilenglicol, polioxietileno, compuesto de polioxipropileno, cera emulsionante y agua. Como alternativa, las composiciones farmacéuticamente aceptables proporcionadas pueden formularse en una loción o crema adecuadas que contienen los componentes activos suspendidos o disueltos en uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Los vehículos adecuados incluyen, pero no se limitan a, aceite mineral, monoestearato de sorbitán, polisorbato 60, cera de ésteres cetílicos, alcohol cetearílico, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua.
Para uso oftálmico, las composiciones farmacéuticamente aceptables proporcionadas pueden formularse como suspensiones micronizadas en solución salina estéril isotónica con pH ajustado, o, preferentemente, como soluciones en solución salina estéril isotónica con pH ajustado, ya sea con o sin un conservante tal como cloruro de benzalconio. Como alternativa, para usos oftálmicos, las composiciones farmacéuticamente aceptables pueden formularse en una pomada tal como vaselina.
Las composiciones farmacéuticamente aceptables de la presente invención también pueden administrarse por aerosol nasal o inhalación. Dichas composiciones se preparan de acuerdo con técnicas bien conocidas en la técnica de la formulación farmacéutica y pueden prepararse como soluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otros conservantes adecuados, promotores de la absorción para potenciar la biodisponibilidad, fluorocarbonos y/u otros agentes solubilizantes o dispersantes convencionales.
En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticamente aceptables de la presente invención se formulan para administración oral. Dichas formulaciones pueden administrarse con o sin alimento. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticamente aceptables de la presente invención se administran sin alimento. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticamente aceptables de la presente invención se administran con alimento.
Las composiciones farmacéuticamente aceptables de la presente invención pueden administrarse a seres humanos y otros animales por vía oral, por vía rectal, por vía parenteral, por vía intracisternal, por vía intravaginal, por vía intraperitoneal, por vía tópica (en forma de polvos, pomadas o gotas), por vía bucal, en forma de un pulverizador oral o nasal o similares, dependiendo de la gravedad de la infección que se va a tratar. En determinadas realizaciones, los compuestos de la invención pueden administrarse por vía oral o parenteral a niveles de dosificación de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg y preferentemente de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, de peso corporal del sujeto por día, una o más veces al día, para obtener el efecto terapéutico deseado.
Las formas farmacéuticas líquidas para la administración oral incluyen, pero no se limitan a, emulsiones farmacéuticamente aceptables, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires. Además de los compuestos activos, las formas farmacéuticas líquidas pueden contener diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán, y mezclas de los mismos. Además de diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, edulcorantes, aromatizantes y agentes perfumantes.
Las preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles pueden formularse de acuerdo con la técnica conocida usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución, una suspensión o una emulsión inyectable estéril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están agua, solución de Ringer, U.S.P. y solución isotónica de cloruro sódico. Además, se usan aceites no volátiles estériles convencionalmente como un disolvente o un medio de suspensión. Para este fin puede emplearse cualquier aceite no volátil suave incluyendo mono- o diglicéridos sintéticos. Además, en la preparación de inyectables se usan ácidos grasos tales como ácido oleico.
Las formulaciones inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias o mediante incorporación de agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse o dispersarse en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de su uso.
Para prolongar el efecto de un compuesto de la presente invención, puede ser deseable ralentizar la absorción del compuesto de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto puede lograrse mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con escasa solubilidad en agua. La velocidad de absorción del compuesto depende entonces de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y de la forma cristalina. Como alternativa, se realiza absorción retardada de una forma de compuesto administrado por vía parenteral disolviendo o suspendiendo el compuesto en un vehículo de aceite. Las formas de depósito inyectables se fabrican mediante la formación de matrices microencapsuladas del compuesto en polímeros biodegradables tales como poliláctido poliglucólido. Dependiendo de la relación de compuesto con respecto a polímero y de la naturaleza del polímero particular empleado, puede controlarse la velocidad de liberación del compuesto. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). También se preparan formulaciones de depósito inyectables atrapando el compuesto en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales.
Las composiciones para la administración rectal o vaginal son preferentemente supositorios que pueden prepararse mezclando los compuestos de la presente invención con excipientes o vehículos adecuados no irritantes tales como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera para supositorios que son sólidos a temperatura ambiente pero líquidos a temperatura corporal y, por lo tanto, se derriten en el recto o en la cavidad vaginal y liberan el compuesto activo.
Las formas farmacéuticas sólidas para administración oral incluyen cápsulas, comprimidos, pastillas, polvos y gránulos. En dichas formas farmacéuticas sólidas, el compuesto activo se mezcla con al menos un excipiente o vehículo inerte farmacéuticamente aceptable tal como citrato sódico o fosfato dicálcico y/o a) cargas o extensores tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico, b) aglutinantes tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polvinilpirrolidona, sacarosa y goma arábiga, c) humectantes tales como glicerol, d) agentes disgregantes tales como agar-agar, carbonato cálcico, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, determinados silicatos y carbonato sódico, e) agentes retardantes de la solución tales como parafina, f) aceleradores de la absorción tales como compuestos de amonio cuaternario, g) agentes humectantes tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, h) absorbentes tales como caolín y arcilla bentonítica e i) lubricantes tales como talco, estearato cálcico, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato sódico y mezclas de los mismos. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, la forma farmacéutica también puede comprender agentes tampón.
También pueden emplearse composiciones sólidas de tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina blandas y duras usando excipientes tales como lactosa o azúcar de la leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares. Las formas farmacéuticas sólidas de comprimidos, grageas, cápsulas, pastillas y gránulos pueden prepararse con recubrimientos y cubiertas tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de la formulación farmacéutica. Opcionalmente pueden contener agentes opacificantes y también pueden tener una composición que libere el principio o principios activos solo o con preferencia, en una parte determinada del tracto intestinal, opcionalmente, de manera retardada. Los ejemplos de composiciones de inclusión que pueden usarse incluyen sustancias poliméricas y ceras. También pueden emplearse composiciones sólidas de tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina de relleno blando y duro usando excipientes tales como lactosa o azúcar de la leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
Un compuesto de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, también puede estar en forma microencapsulada con uno o más excipientes como se ha indicado anteriormente. Las formas farmacéuticas sólidas de comprimidos, grageas, cápsulas, píldoras y gránulos pueden prepararse con recubrimientos y cubiertas tales como recubrimientos entéricos, recubrimientos de control de la liberación y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de la formulación farmacéutica. En dichas formas farmacéuticas sólidas el compuesto activo puede mezclarse con al menos un diluyente inerte tal como sacarosa, lactosa o almidón. Dichas formas farmacéuticas también pueden comprender, como es práctica normal, sustancias adicionales distintas de diluyentes inertes, por ejemplo, lubricantes para la formación de comprimidos y otros adyuvantes para la formación de comprimidos tales como estearato de magnesio y celulosa microcristalina. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, las formas farmacéuticas también pueden comprender agentes tampón. Opcionalmente pueden contener agentes opacificantes y también pueden tener una composición que libere el principio o principios activos solo o con preferencia, en una parte determinada del tracto intestinal, opcionalmente, de manera retardada. Los ejemplos de composiciones de inclusión que pueden usarse incluyen sustancias poliméricas y ceras.
Las formas farmacéuticas para la administración tópica o transdérmica de un compuesto de la presente invención incluyen pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, pulverizaciones, inhalantes o parches. El componente activo se mezcla en condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable y cualquier conservante o tampón necesario según pueda requerirse. Las formulaciones oftálmicas, las gotas óticas y los colirios también se contemplan en el alcance de la presente invención. Adicionalmente, la presente invención contempla el uso de parches transdérmicos, que tienen la ventaja añadida de proporcionar un suministro controlado de un compuesto al organismo. Dichas formas farmacéuticas pueden prepararse disolviendo o dispensando el compuesto en el medio apropiado. También pueden usarse potenciadores de la absorción para aumentar el flujo del compuesto a través de la piel. La velocidad puede controlarse proporcionando una membrana de control de la velocidad o dispersando el compuesto en una matriz polimérica o gel.
3. Usos de compuestos y composiciones farmacéuticamente aceptables
Los compuestos y las composiciones descritos en el presente documento son generalmente útiles para el tratamiento del cáncer.
Como se usa en el presente documento, los términos "tratamiento", "tratar", y "que trata" se refieren a revertir, aliviar, retrasar el inicio de o inhibir el progreso de una enfermedad o trastorno o de uno o más síntomas del mismo, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el tratamiento puede administrarse después de que se hayan desarrollado uno o más síntomas. En otras realizaciones, el tratamiento puede administrarse en ausencia de síntomas. Por ejemplo, el tratamiento puede administrarse a un individuo susceptible antes de la aparición de los síntomas (por ejemplo, a la vista de antecedentes de síntomas y/o a la vista de factores genéticos u otros factores de susceptibilidad). El tratamiento también puede continuar después de que los síntomas se hayan resuelto, por ejemplo, para prevenir o retrasar la recaída.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un compuesto para su uso en un método para tratar el cáncer como se describe en el presente documento.
Cáncer
El cáncer incluye, en una realización, sin limitación, leucemias (por ejemplo, leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia mielomonocítica aguda, leucemia monocítica aguda, eritroleucemia aguda, leucemia crónica, leucemia mielocítica crónica, leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfoma (por ejemplo, enfermedad de Hodgkin o enfermedad no Hodgkiniana), macroglobulinemia de Waldenstrom, mieloma múltiple, enfermedad de la cadena pesada y tumores sólidos tales como sarcomas y carcinomas (por ejemplo, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma epidermoide, carcinoma basocelular, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de las vías biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, cáncer de cuello uterino, cáncer de útero, cáncer testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón microcítico, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, glioblastoma multiforme (GBM, también conocido como glioblastoma), meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, schwannoma, neurofibrosarcoma, meningioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma).
En algunas realizaciones, el cáncer es glioma, astrocitoma, glioblastoma multiforme (GBM, también conocido como glioblastoma), meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, schwannoma, neurofibrosarcoma, meningioma, melanoma, neuroblastoma o retinoblastoma.
En algunas realizaciones, el cáncer es neuroma acústico, astrocitoma (por ejemplo, grado I - astrocitoma pilocítico, grado II - astrocitoma de grado bajo, grado III - astrocitoma anaplásico, o grado IV - glioblastoma (GBM)), cordoma, linfoma del SNC, craneofaringioma, glioma del tronco encefálico, ependimoma, glioma mixto, glioma del nervio óptico, subependimoma, meduloblastoma, meningioma, tumor cerebral metastásico, oligodendroglioma, tumores de hipófisis, tumor neuroectodérmico primitivo (PNET, por sus siglas en inglés) o schwannoma. En algunas realizaciones, el cáncer es un tipo que se encuentra más comúnmente en niños que en adultos, tal como glioma de tronco encefálico, craneofaringioma, ependimoma, astrocitoma pilocítico juvenil (JPA, por sus siglas en inglés), meduloblastoma, glioma del nervio óptico, tumor pineal, tumores neuroectodérmicos primitivos (PNET), o tumor rabdoide. En algunas realizaciones, el paciente es un ser humano adulto. En algunas realizaciones, el paciente es un niño o paciente pediátrico.
El cáncer incluye, en otra realización, sin limitación, mesotelioma, hepatobiliar (conducto hepático y biliar), cáncer de hueso, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, gastrointestinal (gástrico, colorrectal y duodenal), cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de la uretra, cáncer del pene, cáncer de próstata, cáncer testicular, leucemia crónica o aguda, leucemia mieloide crónica, linfomas linfocíticos, cáncer de la vejiga, cáncer del riñón o del uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, linfoma no Hodgkiniano, tumores del eje espinal, glioma del tronco encefálico, adenoma hipofisario, cáncer adrenocortical, cáncer de vesícula biliar, mieloma múltiple, colangiocarcinoma, fibrosarcoma, neuroblastoma, retinoblastoma, o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores.
En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona de carcinoma hepatocelular, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario o cáncer de trompa de Falopio; cistoadenocarcinoma seroso papilar o carcinoma seroso papilar uterino (UPSC, por sus siglas en inglés); cáncer de próstata; cáncer testicular; cáncer de vesícula biliar; hepatocolangiocarcinoma; sarcoma sinovial de tejido blando y hueso; rabdomiosarcoma; osteosarcoma; condrosarcoma; sarcoma de Ewing; cáncer de tiroides anaplásico; adenoma adrenocortical; cáncer pancreático; carcinoma ductal pancreático o adenocarcinoma pancreático; cáncer gastrointestinal/de estómago (GIST, por sus siglas en inglés); linfoma; carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN, por sus siglas en inglés); cáncer de glándula salival; glioma o cáncer cerebral; tumores malignos de la vaina nerviosa periférica (MPNST, por sus siglas en inglés) asociados a neurofibromatosis-1; macroglobulinemia de Waldenstrom; o meduloblastoma.
En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona de carcinoma hepatocelular (HCC), hepatoblastoma, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario, cáncer de las trompas de Falopio, cistadenocarcinoma seroso papilar, carcinoma seroso papilar uterino (UPSC), hepatocolangiocarcinoma, sarcoma sinovial de tejido blando y hueso, rabdomiosarcoma, osteosarcoma, cáncer de tiroides anaplásico, adenoma adrenocortical, cáncer pancreático, carcinoma ductal pancreático, adenocarcinoma pancreático, glioma, tumores malignos de la vaina nerviosa periférica (MPNST) asociados a neurofibromatosis-1, macroglobulinemia de Waldenstrom o meduloblastoma.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un compuesto para su uso en un método para tratar un cáncer que se presenta como un tumor sólido, tal como un sarcoma, un carcinoma o un linfoma, que comprende la etapa de administrar un compuesto desvelado, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, a un paciente que lo necesita. Los tumores sólidos generalmente comprenden una masa anormal de tejido que normalmente no incluye quistes o áreas líquidas. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona de carcinoma de células renales o cáncer de riñón; carcinoma hepatocelular (HCC) o hepatoblastoma, o cáncer de hígado; melanoma; cáncer de mama; carcinoma colorrectal o cáncer colorrectal; cáncer de colon; cáncer de recto; cáncer anal; cáncer de pulmón, tales como cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) o cáncer de pulmón microcítico (SCLC); cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario, carcinoma de ovario o cáncer de trompa de Falopio; cistoadenocarcinoma seroso papilar o carcinoma seroso papilar uterino (UPSC, por sus siglas en inglés); cáncer de próstata; cáncer testicular; cáncer de vesícula biliar; hepatocolangiocarcinoma; sarcoma sinovial de tejido blando y hueso; rabdomiosarcoma; osteosarcoma; condrosarcoma; sarcoma de Ewing; cáncer de tiroides anaplásico; carcinoma adrenocortical; cáncer pancreático; carcinoma ductal pancreático o adenocarcinoma pancreático; cáncer gastrointestinal/de estómago (GIST, por sus siglas en inglés); linfoma; carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN, por sus siglas en inglés); cáncer de glándula salival; glioma o cáncer cerebral; tumores malignos de la vaina nerviosa periférica (MPNST, por sus siglas en inglés) asociados a neurofibromatosis-1; macroglobulinemia de Waldenstrom; o meduloblastoma.
En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona de carcinoma de células renales, carcinoma hepatocelular (HCC), hepatoblastoma, carcinoma colorrectal, cáncer colorrectal, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de ano, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario, carcinoma de ovario, cáncer de las trompas de Falopio, cistadenocarcinoma seroso papilar, carcinoma seroso papilar uterino (UPSC), hepatocolangiocarcinoma, sarcoma sinovial de tejido blando y hueso, rabdomiosarcoma, osteosarcoma, condrosarcoma, cáncer de tiroides anaplásico, carcinoma adrenocortical, cáncer pancreático, carcinoma ductal pancreático, adenocarcinoma pancreático, glioma, cáncer de cerebro, tumores malignos de la vaina nerviosa periférica (MPNST) asociados a neurofibromatosis-1, macroglobulinemia de Waldenstrom o meduloblastoma.
En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona de carcinoma hepatocelular (HCC), hepatoblastoma, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario, carcinoma de ovario, cáncer de las trompas de Falopio, cistadenocarcinoma seroso papilar, carcinoma seroso papilar uterino (UPSC), hepatocolangiocarcinoma, sarcoma sinovial de tejido blando y hueso, rabdomiosarcoma, osteosarcoma, cáncer de tiroides anaplásico, carcinoma adrenocortical, cáncer pancreático, carcinoma ductal pancreático, adenocarcinoma pancreático, glioma, tumores malignos de la vaina nerviosa periférica (MPNST) asociados a neurofibromatosis-1, macroglobulinemia de Waldenstrom o meduloblastoma.
En algunas realizaciones, el cáncer es carcinoma hepatocelular (HCC). En algunas realizaciones, el cáncer es hepatoblastoma. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de colon. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer rectal. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de ovario o carcinoma de ovario. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer epitelial de ovario. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de las trompas de Falopio. En algunas realizaciones, el cáncer es cistoadenocarcinoma seroso papilar. En algunas realizaciones, el cáncer es carcinoma seroso papilar uterino (UPSC). En algunas realizaciones, el cáncer es hepatocolangiocarcinoma. En algunas realizaciones, el cáncer es sarcoma sinovial de tejido blando y hueso. En algunas realizaciones, el cáncer es rabdomiosarcoma. En algunas realizaciones, el cáncer es osteosarcoma. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de tiroides anaplásico. En algunas realizaciones, el cáncer es carcinoma adrenocortical. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer pancreático o carcinoma ductal pancreático. En algunas realizaciones, el cáncer es adenocarcinoma pancreático. En algunas realizaciones, el cáncer es glioma. En algunas realizaciones, el cáncer son tumores malignos de la vaina nerviosa periférica (MPNST). En algunas realizaciones, el cáncer es MPNST asociado a neurofibromatosis-1. En algunas realizaciones, el cáncer es macroglobulinemia de Waldenstrom. En algunas realizaciones, el cáncer es meduloblastoma.
La presente invención presenta además métodos y composiciones para el diagnóstico, el pronóstico y el tratamiento de cánceres asociados a virus, incluyendo tumores sólidos asociados al virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), tumores sólidos incurables positivos para el virus del papiloma humano (VPH)-16 y leucemia de linfocitos T del adulto, que está provocada por el virus de la leucemia de linfocitos T humanos de tipo I (HTLV-I) y es una forma altamente agresiva de leucemia de linfocitos T CD4+ caracterizada por la integración clonal de HTLV-I en células leucémicas (véase https://clinicaltrials.gov/ct2/show/study/ NCT02631746); así como tumores asociados a virus en cáncer gástrico, carcinoma nasofaríngeo, cáncer de cuello uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello y carcinoma de células de Merkel. (Véase https://clinicaltrials.gov/ct2/show/study/NCT02488759; véanse también https://clinicaltrials.gov/ct2/show/study/NCT0240886; https://clinicaltrials.gov/ct2/show/ NCT02426892)
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un compuesto para su uso en un método para tratar un tumor en un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente cualquiera de los compuestos, sales o composiciones farmacéuticas descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el tumor comprende cualquiera de los cánceres descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el tumor comprende cáncer de melanoma. En algunas realizaciones, el tumor comprende cáncer de mama. En algunas realizaciones, el tumor comprende cáncer de pulmón. En algunas realizaciones, el tumor comprende cáncer de pulmón microcítico (CPCP). En algunas realizaciones, el tumor comprende cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC).
En algunas realizaciones, el tumor se trata deteniendo el crecimiento adicional del tumor. En algunas realizaciones, el tumor se trata reduciendo el tamaño (por ejemplo, volumen o masa) del tumor en al menos un 5 %, un 10 %, un 25 %, un 50 %, un 75 %, un 90 % o un 99 % con respecto al tamaño del tumor antes del tratamiento. En algunas realizaciones, los tumores se tratan reduciendo la cantidad de tumores en el paciente en al menos un 5 %, un 10 %, un 25 %, un 50 %, un 75 %, un 90 % o un 99 % con respecto a la cantidad de tumores antes del tratamiento.
Los compuestos y las composiciones, de acuerdo con la presente invención, pueden administrarse usando cualquier cantidad y cualquier vía de administración eficaz para tratar o disminuir la gravedad de un cáncer. La cantidad exacta requerida variará de sujeto a sujeto, dependiendo de la especie, la edad y el estado general del sujeto, la gravedad de la enfermedad o afección, el agente particular, su modo de administración y similares. Los compuestos de la invención se formulan preferentemente en forma farmacéutica unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La expresión "forma farmacéutica unitaria" como se usa en el presente documento se refiere a una unidad físicamente concreta de agente adecuada para el paciente a tratar. Se entenderá, sin embargo, que el uso diario total de los compuestos y las composiciones de la presente invención será decidido por el médico tratante dentro del alcance del buen criterio médico. El nivel específico de dosis eficaz para cualquier paciente u organismo en particular dependerá de una diversidad de factores incluyendo el trastorno que se trate y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada; la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo y la dieta del paciente; el momento de la administración, la vía de administración y la tasa de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; los fármacos usados en combinación o simultáneos con el compuesto específico empleado y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. El término "paciente", como se usa en el presente documento, significa un animal, preferentemente un mamífero y lo más preferentemente un ser humano.
En algunas realizaciones, la invención se refiere a un compuesto de la presente invención, o una composición que comprende dicho compuesto para su uso en un método para tratar el cáncer positivo para MT1 en un paciente. En algunas realizaciones, un cáncer es como se describe en detalle en el presente documento.
En algunas realizaciones, la invención se refiere a un compuesto de la presente invención, o una composición que comprende dicho compuesto para su uso en un método para tratar el cáncer en un paciente, en donde el cáncer se selecciona de cáncer colorrectal, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de mama, cáncer gástrico, sarcoma, mieloma, cáncer nasofaríngeo/laríngeo/esofágico, cáncer de ovario, cáncer epitelial, melanoma, glioma, astrocitoma, glioblastoma, neuroblastoma, mesotelioma, cáncer de vejiga, carcinoma hepatocelular y cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer colorrectal. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón no microcítico. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de mama. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer gástrico. En algunas realizaciones, el cáncer es sarcoma. En algunas realizaciones, el cáncer es mieloma. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer nasofaríngeo/laríngeo/esofágico. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de ovario. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer epitelial. En algunas realizaciones, el cáncer es melanoma. En algunas realizaciones, el cáncer es glioma. En algunas realizaciones, el cáncer es astrocitoma. En algunas realizaciones, el cáncer es glioblastoma. En algunas realizaciones, el cáncer es neuroblastoma. En algunas realizaciones, el cáncer es mesotelioma. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, el cáncer es carcinoma hepatocelular. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de próstata.
En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de mama triple negativo. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de mama positivo para Her2. En algunas realizaciones, el cáncer es adenocarcinoma de pulmón. En algunas realizaciones, cáncer es carcinoma epidermoide de pulmón. En algunas realizaciones, el cáncer es fibrosarcoma. En algunas realizaciones, el cáncer es leiomiosarcoma. En algunas realizaciones, el cáncer es rabdomiosarcoma. En algunas realizaciones, el cáncer es Osteosarcoma. En algunas realizaciones, cáncer es carcinoma epidermoide esofágico. En algunas realizaciones, el cáncer es adenocarcinoma intestinal. En algunas realizaciones, el cáncer es carcinoma hepatocelular. En algunas realizaciones, cáncer es carcinoma epidermoide uterino.
Coadministración de agentes terapéuticos adicionales
Dependiendo de la afección o enfermedad particular, que se va a tratar, los agentes terapéuticos adicionales que normalmente se administran para tratar esa afección, también pueden estar presentes en las composiciones de la presente invención. Como se usa en el presente documento, los agentes terapéuticos adicionales que se administran normalmente para tratar una enfermedad o afección particular, se conocen como "apropiados para la enfermedad o afección, que se va a tratar".
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un compuesto para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o una afección desveladas que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de un compuesto desvelado en el presente documento o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y coadministrar simultánea o secuencialmente una cantidad eficaz de uno o más agentes terapéuticos adicionales, tal como los descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el compuesto para su uso incluye la coadministración de un agente terapéutico adicional. En algunas realizaciones, el compuesto para su uso incluye la coadministración de dos agentes terapéuticos adicionales. En algunas realizaciones, la combinación del compuesto desvelado y el agente o agentes terapéuticos adicionales actúa sinérgicamente.
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional se selecciona de un compuesto terapéutico inmunoestimulador. En algunas realizaciones, el compuesto terapéutico inmunoestimulador se selecciona de elotuzumab, mifamurtida, un agonista o activador de un receptor de tipo toll o un activador de RORyt.
En algunas realizaciones, el compuesto para su uso comprende además administrar a dicho paciente un tercer agente terapéutico, tal como un inhibidor de puntos de control inmunitario. En algunas realizaciones, el compuesto para su uso comprende administrar al paciente que lo necesita tres agentes terapéuticos seleccionados de un compuesto desvelado en el presente documento o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, un compuesto terapéutico inmunoestimulador y un inhibidor de puntos de control inmunitario.
Otros inhibidores de puntos de control que pueden usarse en la presente invención incluyen agonistas de OX40. Los agonistas de OX40 que se están estudiando en ensayos clínicos incluyen PF-04518600/PF-8600 (Pfizer), un anticuerpo anti-OX40 agonista, en cáncer de riñón metastásico (NCT03092856) y cánceres y neoplasias avanzados (NCT02554812; NCT05082566); GSK3174998 (Merck), un anticuerpo anti-OX40 agonista, en ensayos de cáncer de Fase 1 (NCT02528357); MEDI0562 (Medimmune/AstraZeneca), un anticuerpo anti-OX40 agonista, en tumores sólidos avanzados (NCT02318394 y NCT02705482); MED16469, un anticuerpo anti-OX40 agonista (Medimmune/AstraZeneca), en pacientes con cáncer colorrectal (NCT02559024), cáncer de mama (NCT01862900), cáncer de cabeza y cuello (NCT02274155) y cáncer de próstata metastásico (NCT01303705); y BMS-986178 (Bristol-Myers Squibb) un anticuerpo anti-OX40 agonista, en cánceres avanzados (NCT02737475).
Otros inhibidores de puntos de control que pueden usarse en la presente invención incluyen agonistas de CD137 (también denominados 4-1BB). Los agonistas de CD137 que se están estudiando en ensayos clínicos incluyen utomilumab (PF-05082566, Pfizer), un anticuerpo anti-CD137 agonista, en linfoma difuso de linfocitos B grandes (NCT02951156) y en cánceres y neoplasias avanzados (NCT02554812 y NCT05082566); urelumab (BMS-663513, Bristol-Myers Squibb), un anticuerpo anti-CD137 agonista, en melanoma y cáncer de piel (NCT02652455) y glioblastoma y gliosarcoma (NCT02658981).
Otros inhibidores de puntos de control que pueden usarse en la presente invención incluyen agonistas de CD27. Los agonistas de CD27 que se están estudiando en ensayos clínicos incluyen varlilumab (CDX-1127, Celldex Therapeutics) un anticuerpo anti-CD27 agonista, en cáncer de cabeza y cuello epidermoide, carcinoma de ovario, cáncer colorrectal, cáncer de células renales y glioblastoma (NCT02335918); linfomas (NCT01460134); y glioma y astrocitoma (NCT02924038).
Otros inhibidores de puntos de control que pueden usarse en la presente invención incluyen agonistas del receptor del factor de necrosis tumoral (GITR, por sus siglas en inglés) inducido por glucocorticoides. Los agonistas de GITR que se están estudiando en ensayos clínicos incluyen TRX518 (Leap Therapeutics), un anticuerpo anti-GITR agonista, en melanoma maligno y otros tumores sólidos malignos (NCT01239134 y NCT02628574); GWN323 (Novartis), un anticuerpo anti-GITR agonista, en tumores sólidos y linfoma (NCT 02740270); INCAGN01876 (Incyte/Agenus), un anticuerpo anti-GITR agonista, en cánceres avanzados (NCT02697591 y NCT03126110);<m>K-4166 (Merck), un anticuerpo anti-GITR agonista, en tumores sólidos (NCT02132754) y MEDI1873 (Medimmune/AstraZeneca), una molécula ligando de GITR hexamérica agonista con un dominio Fc de IgG1 humana, en tumores sólidos avanzados (NCT02583165).
Otros inhibidores de puntos de control que pueden usarse en la presente invención incluyen agonistas del coestimulador de linfocitos T inducible (ICOS, también conocido como CD278). Los agonistas de ICOS que se están estudiando en ensayos clínicos incluyen MEDI-570 (Medimmune), un anticuerpo anti-ICOS agonista, en linfomas (NCT02520791); GSK3359609 (Merck), un anticuerpo anti-ICOS agonista, en Fase 1 (NCT02723955); JTX-2011 (Jounce Therapeutics), un anticuerpo anti-ICOS agonista, en Fase 1 (NCT02904226).
Otros inhibidores de puntos de control que pueden usarse en la presente invención incluyen inhibidores del receptor de tipo inmunoglobulina de células citolíticas naturales (KIR, por sus siglas en inglés). Los inhibidores de KIR que se están estudiando en ensayos clínicos incluyen lirilumab (IPH2102/BMS-986015, Innate Pharma/Bristol-Myers Squibb), un anticuerpo anti-KIR, en leucemias (NCT01687387, NCT02399917, NCT02481297, NCT02599649), mieloma múltiple (NCT02252263) y linfoma (NCT01592370); IPH2101 (1-7F9, Innate Pharma) en mieloma (NCT01222286 y NCT01217203); e IPH4102 (Innato Pharma), un anticuerpo anti-KIR que se une a tres dominios de la cola citoplasmática larga (KIR3DL2), en linfoma (NCT02593045).
Otros inhibidores de puntos de control que pueden usarse en la presente invención incluyen inhibidores de CD47 de la interacción entre CD47 y la proteína reguladora de señales alfa (SIRPa, por sus siglas en inglés). Los inhibidores de CD47/SIRPa que se están estudiando en ensayos clínicos incluyen ALX-148 (Alexo Therapeutics), una variante antagonista de (SIRPa) que se une a CD47 y evita la señalización mediada por CD47/SIRPa, en fase 1 (NCT03013218); TTI-621 (SIRPa-Fc, Terapéutica Trillium), una proteína de fusión recombinante soluble creada al unir el dominio de unión a CD47 aminoterminal de SIRPa con el dominio Fc de IgG1 humana, actúa al unirse al CD47 humano y evitar que suministre su señal de "no fagocitar" a los macrófagos, se encuentra en ensayos clínicos en Fase 1 (NCT02890368 y NCT02663518); CC-90002 (Celgene), un anticuerpo anti-CD47, en leucemias (NCT02641002); y Hu5F9-G4 (Forty Seven, Inc.), en neoplasias colorrectales y tumores sólidos (NCT02953782), leucemia mieloide aguda (NCT02678338) y linfoma (NCT02953509).
Otros inhibidores de puntos de control que pueden usarse en la presente invención incluyen inhibidores de CD73. Los inhibidores de CD73 que se están estudiando en ensayos clínicos incluyen MEDI9447 (Medimmune), un anticuerpo anti-CD73, en tumores sólidos (NCT02503774); y BMS-986179 (Bristol-Myers Squibb), un anticuerpo anti-CD73, en tumores sólidos (NCT02754141).
Otros inhibidores de puntos de control que pueden usarse en la presente invención incluyen agonistas de la proteína estimuladora de genes de interferón (STING, también conocida como proteína transmembrana 173 o TMEM173). Los agonistas de STING que se están estudiando en ensayos clínicos incluyen MK-1454 (Merck), un dinucleótido cíclico sintético agonista, en linfoma (NCT03010176); y ADU-S100 (MIW815, Aduro Biotech/Novartis), un dinucleótido cíclico sintético agonista, en Fase 1 (NCT02675439 y NCT03172936).
Otros inhibidores de puntos de control que pueden usarse en la presente invención incluyen inhibidores de CSF1R. Los inhibidores de CSF1R que se están estudiando en ensayos clínicos incluyen pexidartinib (PLX3397, Plexxikon), un inhibidor de molécula pequeña CSF1R, en cáncer colorrectal, cáncer pancreático, cánceres metastásicos y avanzados (NCT02777710) y melanoma, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de cabeza y cuello epidermoide, tumor del estroma gastrointestinal (GIST) y cáncer ovárico (NCT02452424); e IMC-CS4 (LY3022855, Lilly), un anticuerpo anti-CSF-1R, en cáncer de páncreas (NCT03153410), melanoma (NCT03101254) y tumores sólidos (NCT02718911); y BLZ945 (metilamida del ácido 4-[2((1R,2R)-2-hidroxiciclohexilamino)-benzotiazol-6-iloxilo]-piridin-2-carboxílico, Novartis), un inhibidor disponible por vía oral de CSF1R, en tumores sólidos avanzados (NCT02829723).
Otros inhibidores de puntos de control que pueden usarse en la presente invención incluyen inhibidores del receptor NKG2A. Los inhibidores del receptor NKG2A que se están estudiando en ensayos clínicos incluyen monalizumab (IPH2201, Innate Pharma), un anticuerpo anti-NKG2A, en neoplasias de cabeza y cuello (NCT02643550) y leucemia linfocítica crónica (NCT02557516).
En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario se selecciona de nivolumab, pembrolizumab, ipilimumab, avelumab, durvalumab, atezolizumab o pidilizumab.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un compuesto para su uso en un método para el tratamiento de un cáncer en un paciente que lo necesita, en donde dicho método comprende administrar a dicho paciente un compuesto desvelado en el presente documento o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales seleccionados de un inhibidor de indolamina (2,3)-dioxigenasa (IDO), un inhibidor de Poli-ADP ribosa polimerasa (PARP), un inhibidor de histona desacetilasa (HDAC), un inhibidor de CDK4/CDK6 o un inhibidor de fosfatidilinositol 3 quinasa (PI3K).
En algunas realizaciones, el inhibidor de IDO se selecciona de epacadostat, indoximod, capmanitib, GDC-0919, PF-06840003, BMS:F001287, Phy906/KD108 o una enzima que descompone la quinurenina.
En algunas realizaciones, el inhibidor de PARP se selecciona de olaparib, rucaparib o niraparib.
En algunas realizaciones, el inhibidor de HDAC se selecciona de vorinostat, romidepsina, panobinostat, belinostat, entinostat o chidamida.
En algunas realizaciones, el inhibidor de CDK 4/6 se selecciona de palbociclib, ribociclib, abemaciclib o trilaciclib.
En algunas realizaciones, el compuesto para su uso comprende además administrar a dicho paciente un tercer agente terapéutico, tal como un inhibidor de puntos de control inmunitario. En algunas realizaciones, el compuesto para su uso comprende administrar al paciente que lo necesita tres agentes terapéuticos seleccionados de un compuesto desvelado en el presente documento o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, un segundo agente terapéutico seleccionado de un inhibidor de indolamina (2,3)-dioxigenasa (IDO), un inhibidor de Poli-ADP ribosa polimerasa (PARP), un inhibidor de histona desacetilasa (HDAC), un inhibidor de CDK4/CDK6, o un inhibidor de fosfatidilinositol 3 quinasa (PI3K) y un tercer agente terapéutico seleccionado de un inhibidor de puntos de control inmunitario. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario se selecciona de nivolumab, pembrolizumab, ipilimumab, avelumab, durvalumab, atezolizumab o pidilizumab.
Otro agente terapéutico inmunoestimulador que puede usarse en la presente invención es la interleucina 15 humana recombinante (rhIL-15). La rhIL-15 se ha probado en la práctica clínica como terapia para el melanoma y el carcinoma de células renales (NCT01021059 y NCT01369888) y las leucemias (NCT02689453). Otro agente terapéutico inmunoestimulador que puede usarse en la presente invención es la interleucina 12 humana recombinante (rhIL-12). Otro agente inmunoterapéutico basado en IL-15 adecuado es la IL-15 heterodimérica (hetIL-15, Novartis/Admune), un complejo de fusión compuesto por una forma sintética de IL-15 endógena en forma de complejo con la cadena alfa del receptor de IL-15 de la proteína de unión a IL-15 soluble (IL15:sIL-15RA), que se ha probado en ensayos clínicos de Fase 1 para melanoma, carcinoma de células renales, cáncer de pulmón de células no microcítico y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (NCT02452268). La interleucina 12 humana recombinante (rhIL-12) se ha probado en la práctica clínica para muchas indicaciones oncológicas, por ejemplo, como terapia para el linfoma (NM-IL-12, Neumedicines, Inc.), (NCT02544724 y NCT02542124).
En algunas realizaciones, el inhibidor de PI3K se selecciona de idelalisib, alpelisib, taselisib, pictilisib, copanlisib, duvelisib, PQR309 o TGR1202.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un compuesto para su uso en un método para el tratamiento de un cáncer en un paciente que lo necesita, en donde dicho método comprende administrar a dicho paciente un compuesto desvelado en el presente documento o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales seleccionados de un agente terapéutico basado en platino, un taxano, un inhibidor de nucleósidos, o un agente terapéutico que interfiere con la síntesis normal de ADN, síntesis de proteínas, replicación celular o de otro modo inhibirá las células que proliferan rápidamente.
En algunas realizaciones, el agente terapéutico basado en platino se selecciona de cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, nedaplatino, picoplatino o satraplatino.
En algunas realizaciones, el taxano se selecciona de paclitaxel, docetaxel, paclitaxel unido a albúmina, cabazitaxel o SID530.
En algunas realizaciones, el agente terapéutico que interfiere con la síntesis normal de ADN, síntesis de proteínas, replicación celular o de otro modo interferirá con la replicación de células que proliferan rápidamente se selecciona de trabectedina, mecloretamina, vincristina, temozolomida, citarabina, lomustina, azacitidina, mepesuccinato de omacetaxina, asparaginasa deErwinia chrysanthemi,mesilato de eribulina, capacetrina, bendamustina, ixabepilona, nelarabina, clorafabina, trifluridina o tipiracilo.
En algunas realizaciones, el compuesto para su uso comprende además administrar a dicho paciente un tercer agente terapéutico, tal como un inhibidor de puntos de control inmunitario. En algunas realizaciones, el compuesto para su uso comprende administrar al paciente que lo necesita tres agentes terapéuticos seleccionados de un compuesto desvelado en el presente documento o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, un segundo agente terapéutico seleccionado de un agente terapéutico basado en platino, un taxano, un inhibidor de nucleósidos, o un agente terapéutico que interfiere con la síntesis normal de ADN, síntesis de proteínas, replicación celular o inhibirá de otro modo las células que proliferan rápidamente, y un tercer agente terapéutico seleccionado de un inhibidor de puntos de control inmunitario.
En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario se selecciona de nivolumab, pembrolizumab, ipilimumab, avelumab, durvalumab, atezolizumab o pidilizumab.
En algunas realizaciones, uno cualquiera de los compuestos anteriores para su uso comprende además la etapa de obtener una muestra biológica del paciente y medir la cantidad de un biomarcador relacionado con la enfermedad.
En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de sangre.
En algunas realizaciones, el biomarcador relacionado con la enfermedad se selecciona de células T CD8+ circulantes o la proporción de células T Cd8+:células Treg.
En un aspecto, la presente invención proporciona un compuesto para su uso en un método para tratar un cáncer avanzado, que comprende administrar un compuesto desvelado en el presente documento o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o una composición farmacéutica del mismo, ya sea como agente único (monoterapia) o en combinación con un agente quimioterapéutico, un agente terapéutico dirigido, tal como un inhibidor de quinasa y/o una terapia inmunomoduladora, tal como un inhibidor de puntos de control inmunitario. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo contra PD-1. PD-1 se une al receptor de muerte celular programada 1 (PD-1) para evitar que el receptor se una al ligando inhibidor de PDL-1, anulando de esta manera la capacidad de los tumores para suprimir la respuesta inmunitaria antitumoral del hospedador.
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de quinasa o un antagonista de VEGF-R. Los inhibidores de VEGF y los inhibidores de quinasa aprobados útiles en la presente invención incluyen: bevacizumab (Avastin®, Genentech/Roche) un anticuerpo monoclonal anti-VEGF; ramucirumab (Cyramza®, Eli Lilly), un anticuerpo anti-VEGFR-2 y ziv-aflibercept, también conocida como VEGF Trap (Zaltrap®; Regeneron/Sanofi). inhibidores de VEGFR, tales como regorafenib (Stivarga®, Bayer); vandetanib (Caprelsa®, AstraZeneca); axitinib (Inlyta®, Pfizer); y lenvatinib (Lenvima®, Eisai); inhibidores de Raf, tales como sorafenib (Nexavar®, Bayer AG y Onyx); dabrafenib (Tafinlar®, Novartis); y vemurafenib (Zelboraf®, Genentech/Roche); inhibidores de m Ek , tales como cobimetanib (Cotellic®, Exelexis/Genentech/Roche); trametinib (Mekinist®, Novartis); inhibidores de tirosina quinasa Bcr-Abl, tales como imatinib (Gleevec®, Novartis); nilotinib (Tasigna®, Novartis); dasatinib (Sprycel®, BristolMyersSquibb); bosutinib (Bosulif®, Pfizer); y ponatinib (Inclusig®, Ariad Pharmaceuticals); inhibidores de Her2 y EGFR, tales como gefitinib (Iressa®, AstraZeneca); erlotinib (Tarceeva®, Genentech/Roche/Astellas); lapatinib (Tykerb®, Novartis); afatinib (Gilotrif®, Boehringer Ingelheim); osimertinib (dirigido a EGFR activado, Tagrisso®, AstraZeneca); y brigatinib (Alunbrig®, Ariad Pharmaceuticals); inhibidores de c-Met y VEGFR2, tales como cabozanitib (Cometriq®, Exelexis); e inhibidores multiquinasa, tales como sunitinib (Sutent®, Pfizer); pazopanib (Votrient®, Novartis); inhibidores de ALK, tales como crizotinib (Xalkori®, Pfizer); ceritinib (Zykadia®, Novartis); y alectinib (Alecenza®, Genentech/Roche); inhibidores de la tirosina quinasa de Bruton, tales como ibrutinib (Imbruvica®, Pharmacyclics/Janssen); e inhibidores del receptor Flt3, tales como midostaurina (Rydapt®, Novartis).
Otros inhibidores de quinasas y antagonistas de VEGF-R que están en desarrollo y pueden usarse en la presente invención incluyen tivozanib (Aveo Pharmaecuticals); vatalanib (Bayer/Novartis); lucitanib (Clovis Oncology); dovitinib (TK1258, Novartis); Chiauanib (Chipscreen Biosciences); CEP-11981 (Cephalon); linifanib (Abbott Laboratories); neratinib (HKI-272, Puma Biotechnology); radotinib (Supect®, IY5511, Il-Yang Pharmaceuticals, Corea del Sur); ruxolitinib (Jakafi®, Incyte Corporation); PTC299 (PTC Therapeutics); CP-547.632 (Pfizer); foretinib (Exelexis, GlaxoSmithKline); quizartinib (Daiichi Sankyo) y motesanib (Amgen/Takeda).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de mTOR, que inhibe la proliferación celular, la angiogénesis y la captación de glucosa. Los inhibidores de mTOR aprobados útiles en la presente invención incluyen everolimus (Afinitor®, Novartis); temsirolimus (Torisel®, Pfizer); y sirolimus (Rapamune®, Pfizer).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de Poli ADP ribosa polimerasa (PARP). Los inhibidores de PARP aprobados útiles en la presente invención incluyen olaparib (Lynparza®, AstraZeneca); rucaparib (Rubraca®, Clovis Oncology); y niraparib (Zejula®, Tesaro). Otros inhibidores de PARP que se están estudiando que pueden usarse en la presente invención incluyen talazoparib (MDV3800/BMN 673/LT00673, Medivation/Pfizer/Biomarin); veliparib (ABT-888, AbbVie); y bGb-290 (BeiGene, Inc.).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de la fosfatidilinositol 3 quinasa (PI3K). Los inhibidores de PI3K aprobados útiles en la presente invención incluyen idelalisib (Zydelig®, Gilead). Otros inhibidores de PI3K que se están estudiando que pueden usarse en la presente invención incluyen alpelisib (BYL719, Novartis); taselisib (GDC-0032, Genentech/Roche); pictilisib (GDC-0941, Genentech/Roche); copanlisib (BAY806946, Bayer); duvelisib (anteriormente IPI-145, Infinity Pharmaceuticals); PQR309 (Piqur Therapeutics, Suiza); y TGR1202 (anteriormente RP5230, TG Therapeutics).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un inhibidor del proteasoma. Los inhibidores del proteasoma aprobados útiles en la presente invención incluyen bortezomib (Velcade®, Takeda); carfilzomib (Kyprolis®, Amgen); e ixazomib (Ninlaro®, Takeda).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de histona desacetilasa (HDAC). Los inhibidores de HDAC aprobados útiles en la presente invención incluyen vorinostat (Zolinza®, Merck); romidepsina (Istodax®, Celgene); panobinostat (Farydak®, Novartis); y belinostat (Beleodaq®, Spectrum Pharmaceuticals). Otros inhibidores de HDAC que se están estudiando que pueden usarse en la presente invención incluyen entinostat (SNDX-275, Syndax Pharmaceuticals) (NCT00866333); y chidamida (Epidaza®, HBI-8000, Chipscreen Biosciences, China).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de CDK, tal como un inhibidor de CDK 4/6. Los inhibidores de CDK 4/6 aprobados útiles en la presente invención incluyen palbociclib (Ibrance®, Pfizer); y ribociclib (Kisqali®, Novartis). Otros inhibidores de CDK 4/6 que se están estudiando que pueden usarse en la presente invención incluyen abemaciclib (Ly2835219, Eli Lilly); y trilaciclib (G1T28, G1 Therapeutics).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de la indolamina (2,3)-dioxigenasa (IDO). Los inhibidores de IDO que se están estudiando que pueden usarse en la presente invención incluyen epacadostat (INCB024360, Incyte); indoximod (NLG-8189, NewLink Genetics Corporation); capmanitib (INC280, Novartis); GDC-0919 (Genentech/Roche); PF-06840003 (Pfizer); BMS:F001287 (Bristol-Myers Squibb); Phy906/KD108 (Phytoceutica); y una enzima que descompone la quinurenina (Kynase, Kyn Therapeutics).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un antagonista del factor de crecimiento, tal como un antagonista del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) o del factor de crecimiento epidérmico (EGF) o su receptor (EGFR). Los antagonistas de PDGF aprobados que pueden usarse en la presente invención incluyen olaratumab (Lartruvo®; Eli Lilly). Los antagonistas de EGFR aprobados que pueden usarse en la presente invención incluyen cetuximab (Erbitux®, Eli Lilly); necitumumab (Portrazza®, Eli Lilly), panitumumab (Vectibix®, Amgen); y osimertinib (dirigido a EGFR activado, Tagrisso®, AstraZeneca).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de aromatasa. Los inhibidores de aromatasa aprobados que pueden usarse en la presente invención incluyen exemestano (Aromasin®, Pfizer); anastazol (Arimidex®, AstraZeneca) y letrozol (Femara®, Novartis).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un antagonista de la ruta hedgehog. Los inhibidores de la ruta hedgehog aprobados que pueden usarse en la presente invención incluyen sonidegib (Odomzo®, Sun Pharmaceuticals); y vismodegib (Erivedge®, Genentech), ambos para el tratamiento del carcinoma de células basales.
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un inhibidor del ácido fólico. Los inhibidores del ácido fólico aprobados útiles en la presente invención incluyen pemetrexed (Alimta®, Eli Lilly).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un inhibidor del receptor 4 de quimiocinas CC (CCR4). Los inhibidores de CCR4 que se están estudiando que pueden ser útiles en la presente invención incluyen mogamulizumab (Poteligeo®, Kyowa Hakko Kirin, Japón).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de isocitrato deshidrogenasa (IDH). Los inhibidores de IDH que se están estudiando que pueden usarse en la presente invención incluyen AG120 (Celgene; NCT02677922); AG221 (Celgene, NCT02677922; NCT02577406); BAY1436032 (Bayer, NCT02746081); IDH305 (Novartis, NCT02987010).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de arginasa. Los inhibidores de arginasa que se están estudiando que pueden usarse en la presente invención incluyen AEB1102 (arginasa recombinante pegilada, Aeglea Biotherapeutics), que se está estudiando en ensayos clínicos de Fase 1 para leucemia mieloide aguda y síndrome mielodisplásico (NCT02732184) y tumores sólidos (NCT02561234); y CB-1158 (Calithera Biosciences).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de glutaminasa. Los inhibidores de glutaminasa que se están estudiando que pueden usarse en la presente invención incluyen CB-839 (Calithera Biosciences).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo que se une a antígenos tumorales, esto es, proteínas expresadas en la superficie celular de las células tumorales. Los anticuerpos aprobados que se unen a antígenos tumorales que pueden usarse en la presente invención incluyen rituximab (Rituxan®, Genentech/BiogenIdec); ofatumumab (anti-CD20, Arzerra®, GlaxoSmithKline); obinutuzumab (anti-CD20, Gazyva®, Genentech), ibritumomab (anti-CD20 e Yttrium-90, Zevalin®, Spectrum Pharmaceuticals); daratumumab (anti-CD38, Darzalex®, Janssen Biotech), dinutuximab (antiglicolípido GD2, Unituxin®, United Therapeutics); trastuzumab (anti-HER2, Herceptin®, Genentech); ado-trastuzumab emtansina (anti-HER2, fusionada a emtansina, Kadcyla®, Genentech); y pertuzumab (anti-HER2, Perjeta®, Genentech); y brentuximab vedotina (conjugado anti-CD30-fármaco, Adcetris®, Seattle Genetics).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de topoisomerasa. Los inhibidores de topoisomerasa aprobados útiles en la presente invención incluyen irinotecán (Onivyde®, Merrimack Pharmaceuticals); topotecan (Hycamtin®, GlaxoSmithKline). Los inhibidores de topoisomerasa que se están estudiando que pueden usarse en la presente invención incluyen pixantrona (Pixuvri®, c T i Biopharma).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de nucleósidos u otro agente terapéutico que interfiere con la síntesis normal de ADN, síntesis de proteínas, replicación celular o de otro modo inhibirá las células que proliferan rápidamente. Dichos inhibidores de nucleósidos u otros agentes terapéuticos incluyen trabectedina (agente alquilante de guanidina, Yondelis®, Janssen Oncology), mecloretamina (agente alquilante, Valchlor®, Aktelion Pharmaceuticals); vincristina (Oncovin®, Eli Lilly; Vincasar®, Teva Pharmaceuticals; Marqibo®, Talon Therapeutics); temozolomida (profármaco del agente alquilante 5-(3-metiltriazen-1-il)-imidazol-4-carboxamida (MTIC) Temodar®, Merck); inyección de citarabina (ara-C, análogo antimetabólico de citidina, Pfizer); lomustina (agente alquilante, CeeNU®, Bristol-Myers Squibb; Gleostine®, NextSource Biotechnology); azacitidina (análogo nucleósido de pirimidina de citidina, Vidaza®, Celgene); mepesuccinato de omacetaxina (éster de cefalotaxina) (inhibidor de la síntesis de proteínas, Synribo®; Teva Pharmaceuticals); asparaginasa deErwinia chrysanthemi(enzima para el agotamiento de asparagina, Elspar®, Lundbeck; Erwinaze®, EUSA Pharma); mesilato de eribulina (inhibidor de microtúbulos, antimitótico basado en tubulina, Halaven®, Eisai); cabazitaxel (inhibidor de microtúbulos, antimitótico basado en tubulina, Jevtana®, Sanofi-Aventis); capacetrina (inhibidor de la timidilato sintasa, Xeloda®, Genentech); bendamustina (derivado bifuncional de mecloretamina, que se cree que forma entrecruzamientos de ADN entre cadenas, Treanda®, Cephalon/Teva); ixabepilona (análogo semisintético de la epotilona B, inhibidor de microtúbulos, antimitótico basado en tubulina, Ixempra®, Bristol-Myers Squibb); nelarabina (profármaco del análogo de desoxiguanosina, inhibidor metabólico de nucleósidos, Arranon®, Novartis); clorafabina (profármaco del inhibidor de la ribonucleótido reductasa, inhibidor competitivo de la desoxicitidina, Cloar®, Sanofi-Aventis); y trifluridina y tipiracilo (análogo de nucleósido basado en timidina e inhibidor de timidina fosforilasa, Lonsurf®, Taiho Oncology).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un agente terapéutico basado en platino, también conocido como platinos. Los platinos provocan el entrecruzamiento del ADN, de manera que inhiben la reparación del ADN y/o la síntesis del<a>D<n>, principalmente en células que se reproducen rápidamente, tales como células cancerosas. Los agentes terapéuticos basados en platino aprobados que se pueden usar en la presente invención incluyen cisplatino (Platinol®, Bristol-Myers Squibb); carboplatino (Paraplatin®, Bristol-Myers Squibb; también, Teva; Pfizer); oxaliplatino (Eloxitin® Sanofi Aventis); y nedaplatino (Aqupla®, Shionogi). Otros productos terapéuticos basados en platino que se han sometido a pruebas clínicas y que pueden usarse en la presente invención incluyen picoplatino (Poniard Pharmaceuticals); y satraplatino (JM-216, Agennix).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un compuesto de taxano, que provoca la ruptura de los microtúbulos, que son esenciales para la división celular. Los compuestos de taxano aprobados que pueden usarse en la presente invención incluyen paclitaxel (Taxol®, Bristol-Myers Squibb), docetaxel (Taxotere®, Sanofi-Aventis; Docefrez®, Sun Pharmaceutical), paclitaxel unido a albúmina (Abraxane®; Abraxis/Celgene) y cabazitaxel (Jevtana®, Sanofi-Aventis). Otros compuestos de taxano que se han sometido a pruebas clínicas y que pueden usarse en la presente invención incluyen SID530 (SK Chemicals, Co.) (NCT00931008).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de proteínas antiapoptóticas, tales como BCL-2. Los antiapoptóticos aprobados que pueden usarse en la presente invención incluyen venetoclax (Venclexta®, AbbVie/Genentech); y blinatumomab (Blincyto®, Amgen). Otros agentes terapéuticos dirigidos a proteínas apoptóticas que se han sometido a pruebas clínicas y que pueden usarse en la presente invención incluyen navitoclax (ABT-263, Abbott), un inhibidor de BCL-2 (NCT02079740).
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un compuesto para su uso en un método para tratar el cáncer de próstata que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de un compuesto desvelado en el presente documento o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o una composición farmacéutica del mismo en combinación con un agente terapéutico adicional que interfiere con la síntesis o actividad de los andrógenos. Los inhibidores de los receptores de andrógenos aprobados útiles en la presente invención incluyen enzalutamida (Xtandi®, Astellas/Medivation); los inhibidores aprobados de la síntesis de andrógenos incluyen abiraterona (Zytiga®, Centocor/Ortho); antagonista del receptor de la hormona liberadora de gonadotropina aprobado (GnRH) (degaralix, Firmagon®, Ferring Pharmaceuticals).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un modulador selectivo de receptor de estrógenos (SERM, por sus siglas en inglés), que interfiere con la síntesis o actividad de los estrógenos. Los SERM aprobados útiles en la presente invención incluyen raloxifeno (Evista®, Eli Lilly).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de la resorción ósea. Un agente terapéutico aprobado que inhibe la resorción ósea es denosumab (Xgeva®, Amgen), un anticuerpo que se une a RANKL, evita la unión a su receptor RANK, se encuentra en la superficie de los osteoclastos, sus precursores, y células gigantes similares a osteoclastos, que media la patología ósea en tumores sólidos con metástasis óseas. Otros agentes terapéuticos aprobados que inhiben la resorción ósea incluyen bisfosfonatos, tales como ácido zoledrónico (Zometa®, Novartis).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de la interacción entre las dos proteínas supresoras p53 primarias, MDMX y MDM2. Los inhibidores de las proteínas supresoras p53 que se están estudiando y que pueden usarse en la presente invención incluyen ALRN-6924 (Aileron), un péptido básico que se une de manera equipotente y altera la interacción de MDMX y MDM2 con p53. ALRN-6924 se está evaluando actualmente en ensayos clínicos para el tratamiento de AML, síndrome mielodisplásico avanzado (MDS) y linfoma periférico de linfocitos T (PTCL) (NCT02909972; NCT02264613).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un inhibidor del factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta o TGFp). Los inhibidores de las proteínas TGF-beta que se están estudiando que pueden usarse en la presente invención incluyen NIS793 (Novartis), un anticuerpo anti-TGF-beta que se está probando en la práctica clínica para el tratamiento de diversos cánceres, incluyendo cáncer de mama, de pulmón, hepatocelular, colorrectal, pancreático, de próstata y renal (NCT 02947165). En algunas realizaciones, el inhibidor de las proteínas TGF-beta es fresolimumab (GC1008; Sanofi-Genzyme), que se están estudiando para melanoma (NCT00923169); carcinoma de células renales (NCT00356460); y cáncer de pulmón no microcítico (NCT02581787). Adicionalmente, en algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es una trampa TGF-beta, tal como se describe en Connollyet al.(2012) Int'l J. Biological Sciences 8:964-978. Un compuesto terapéutico actualmente en ensayos clínicos para el tratamiento de tumores sólidos es M7824 (Merck KgaA, anteriormente MSB0011459X), que es un compuesto trampa biespecífico anti-PD-L1/TGFp (NCT026995l5); y (NCT02517398). M7824 está compuesto por un anticuerpo IgG1 completamente humano contra PD-L1 fusionado al dominio extracelular del receptor II de TGF-beta humano, que funciona como una "trampa" de TGFp.
Agentes terapéuticos coadministrados - Agentes terapéuticos dirigidos y fármacos inmunomoduladores
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional se selecciona de un agente terapéutico dirigido o fármaco inmunomodulador. Las terapias adyuvantes con agentes terapéuticos dirigidos o fármacos inmunomoduladores han mostrado una eficacia prometedora cuando se administran solas, pero están limitadas por la aparición de inmunidad tumoral a lo largo del tiempo o la evasión de la respuesta inmunitaria.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un compuesto para su uso en un método para tratar cáncer, tal como un cáncer descrito en el presente documento, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de un compuesto desvelado en el presente documento o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o una composición farmacéutica del mismo en combinación con un agente terapéutico adicional tal como un agente terapéutico dirigido o un fármaco inmunomodulador. En algunas realizaciones, el agente terapéutico inmunomodulador induce específicamente la apoptosis de las células tumorales. Los agentes terapéuticos inmunomoduladores aprobados que pueden usarse en la presente invención incluyen pomalidomida (Pomalyst®, Celgene); lenalidomida (Revlimid®, Celgene); mebutato de ingenol (Picato®, LEO Pharma).
En otras realizaciones, el agente terapéutico inmunomodulador es una vacuna contra el cáncer. En algunas realizaciones, la vacuna contra el cáncer se selecciona de sipuleucel-T (Provenge®, Dendreon/Valeant Pharmaceuticals), que se ha aprobado para el tratamiento del cáncer de próstata metastásico resistente a la castración (refractario a las hormonas) asintomático o mínimamente sintomático; y talimogén laherparepvec (Imlygic®, BioVex/Amgen, anteriormente conocido como T-VEC), una terapia vírica oncolítica modificada genéticamente aprobada para el tratamiento de lesiones cutáneas, subcutáneas y ganglionares irresecables en melanoma. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional se selecciona de una terapia vírica oncolítica tal como pexastimogen devacirpvec (PexaVec/JX-594, SillaJen/anteriormente Jennerex Biotherapeutics), un virus vaccinia deficiente en timidina quinasa-(TK-) modificado por ingeniería para expresar GM-CSF, para carcinoma hepatocelular (NCT02562755) y melanoma (NCT00429312); pelareorep (Reolysin®, Oncolytics Biotech), una variante del virus respiratorio entérico huérfano (reovirus) que no se replica en células que no están activadas por RAS, en numerosos cánceres, incluyendo cáncer colorrectal (NCT01622543); cáncer de próstata (NCT01619813); cáncer de cabeza y cuello epidermoide (NCT01166542); adenocarcinoma pancreático (NCT00998322); y cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) (NCT 00861627); enadenotucirev (NG-348, PsiOxus, conocido anteriormente como ColoAdl), un adenovirus modificado por ingeniería genética para expresar un CD80 de longitud completa y un fragmento de anticuerpo específico para la proteína CD3 del receptor de células T, en cáncer de ovario (NCT02028117); tumores epiteliales metastásicos o avanzados tal como en cáncer colorrectal, cáncer de vejiga, carcinoma epidermoide de cabeza y cuello y cáncer de glándulas salivales (NCT02636036); ONCOS-102 (Targovax/anteriormente Oncos), un adenovirus modificado por ingeniería genética para expresar GM-CSF, en melanoma (NCT03003676); y enfermedad peritoneal, cáncer colorrectal o cáncer ovárico (NCT02963831); GL-ONC1 (GLV-1h68/GLV-1h153, Genelux GmbH), virus vaccinia modificados por ingeniería genética para expresar beta-galactosidasa (beta-gal)/beta-glucoronidasa o betagal/simportador de yoduro de sodio humano (hNIS), respectivamente, se estudiaron en carcinomatosis peritoneal (NCT01443260); cáncer de las trompas de Falopio, cáncer ovárico (NCT 02759588); o CG0070 (Cold Genesys), un adenovirus modificado por ingeniería genética para expresar GM-CSF, en cáncer de vejiga (NCT02365818).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional se selecciona de JX-929 (SillaJen/anteriormente Jennerex Biotherapeutics), un virus vaccinia deficiente en factor de crecimiento de vaccinia y TK modificado por ingeniería genética para expresar citosina desaminasa, que es capaz de convertir el profármaco 5-fluorocitosina en el fármaco citotóxico 5-fluorouracilo; TG01 y TG02 (Targovax/anteriormente Oncos), agentes de inmunoterapia basados en péptidos dirigidos a mutaciones RAS difíciles de tratar; y TILT-123 (TILT Biotherapeutics), un adenovirus modificado por ingeniería genética denominado: Ad5/3-E2F-delta24-hTNFa-IRES-hIL20; y VSV-GP (ViraTherapeutics), un virus de la estomatitis vesicular (VSV) modificado por ingeniería genética para expresar la glucoproteína (GP) del virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV, por sus siglas en inglés), que puede modificarse por ingeniería genética adicionalmente para expresar antígenos diseñados para generar una respuesta de células T CD8+ específica de antígeno.
En algunas realizaciones, la presente invención comprende administrar a dicho paciente un compuesto desvelado en el presente documento o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en combinación con un linfocito T modificado por ingeniería para expresar un receptor de antígenos quimérico, o CAR. Los linfocitos T modificados por ingeniería genética para expresar dicho receptor de antígenos quimérico se denominan células CAR-T.
Se han construido CAR que consisten en dominios de unión, que pueden proceder de ligandos naturales, fragmentos variables monocatenarios (scFv) derivados de anticuerpos monoclonales específicos para antígenos de la superficie celular, fusionados con endodominios que son el extremo funcional del receptor de células T (TCR), tal como el dominio de señalización CD3-zeta de los TCR, que es capaz de generar una señal de activación en los linfocitos T. Tras unirse al antígeno, dichos CAR se unen a rutas de señalización endógenas en la célula efectora y generan señales de activación similares a las iniciadas por el complejo TCR.
Por ejemplo, en algunas realizaciones la célula CAR-T es una de las descritas en la Patente de EE.UU. 8.906.682, que desvela células CAR-T modificadas por ingeniería genética para comprender un dominio extracelular que tiene un dominio de unión a antígeno (tal como un dominio que se une a CD19), fusionado a un dominio de señalización intracelular de la cadena zeta del complejo receptor de antígenos de células T (tal como CD3 zeta). Cuando se expresa en el linfocito T, el CAR es capaz de redirigir el reconocimiento del antígeno en función de la especificidad de unión al antígeno. En el caso de CD19, el antígeno se expresa en células B malignas. Actualmente se están realizando más de 200 ensayos clínicos que emplean CAR-T en una amplia gama de indicaciones.
[https://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=chimeric+antigen+receptors&pg=1].
Agentes terapéuticos coadministrados adicionales - Fármacos inmunoestimuladores
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un fármaco inmunoestimulador. Por ejemplo, los anticuerpos que bloquean el eje inhibidor de PD-1 y PD-L1 pueden desencadenar células T reactivas a tumores activados y se ha demostrado en ensayos clínicos que inducen respuestas antitumorales duraderas en un número cada vez mayor de histologías tumorales, incluyendo algunos tipos de tumores que no se han considerado convencionalmente sensibles a inmunoterapia. Véase, por ejemplo, Okazaki, T.et al.(2013) Nat. Immunol. 14, 1212 1218; Zouet al.(2016) Sci. Transl. Med. 8. El anticuerpo anti-PD-1 nivolumab (Opdivo®, Bristol-Myers Squibb, también conocido como ONO-4538, MDX1106 y BMS-936558), ha mostrado potencial para mejorar la supervivencia general en pacientes con RCC que habían experimentado progresión de la enfermedad durante o después de una terapia antiangiogénica previa.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un compuesto para su uso en un método para tratar cáncer, tal como un cáncer descrito en el presente documento, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de un compuesto desvelado en el presente documento o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o una composición farmacéutica del mismo en combinación con un agente terapéutico adicional tal como un fármaco inmunoestimulador, tal como un inhibidor de puntos de control inmunitario. En algunas realizaciones, el compuesto y el inhibidor de puntos de control se administran de manera simultánea o secuencial. En algunas realizaciones, un compuesto desvelado en el presente documento se administra antes de la dosificación inicial con el inhibidor de puntos de control inmunitario. En determinadas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario se administra antes de la dosificación inicial con el compuesto desvelado en el presente documento.
En determinadas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario se selecciona de un antagonista de PD-1, un antagonista de PD-L1 o un antagonista de CTLA-4. En algunas realizaciones, un compuesto desvelado en el presente documento o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra en combinación con nivolumab (anticuerpo anti-PD-1, Opdivo®, Bristol-Myers Squibb); pembrolizumab (anticuerpo anti-PD-1, Keytruda®, Merck); ipilimumab (anticuerpo anti-CTLA-4, Yervoy®, Bristol-Myers Squibb); durvalumab (anticuerpo anti-PD-L1, Imfinzi®, AstraZeneca); o atezolizumab (anticuerpo anti-PD-L1, Tecentriq®, Genentech).
Otros inhibidores de puntos de control inmunitarios adecuados para su uso en la presente invención incluyen REGN2810 (Regeneron), un anticuerpo anti-PD-1 probado en pacientes con carcinoma basocelular (NCT03132636); NSCLC (NCT03088540); carcinoma epidermoide cutáneo (NCT02760498); linfoma (NCT02651662); y melanoma (NCT03002376); pidilizumab (CureTech), también conocido como CT-011, un anticuerpo que se une a PD-1, en ensayos clínicos para el linfoma difuso de linfocitos B grandes y el mieloma múltiple; avelumab (Bavencio®, Pfizer/Merck KGaA), también conocido como MSB0010718C), un anticuerpo IgG1 anti-PD-L1 totalmente humano, en ensayos clínicos para el cáncer de pulmón no microcítico, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, tumores sólidos, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello y cáncer gástrico; y PDR001 (Novartis), un anticuerpo inhibidor que se une a PD-1, en ensayos clínicos para el cáncer de pulmón no microcítico, melanoma, cáncer de mama triple negativo y tumores sólidos avanzados o metastásicos. T remelimumab (CP-675.206; Astrazeneca) es un anticuerpo monoclonal totalmente humano contra CTLA-4 que se ha estudiado en ensayos clínicos para varias indicaciones, incluyendo: mesotelioma, cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de mama, cáncer de pulmón y cáncer de pulmón no microcítico, adenocarcinoma ductal pancreático, cáncer pancreático, cáncer de células germinales, cáncer epidermoide de cabeza y cuello, carcinoma hepatocelular, cáncer de próstata, cáncer de endometrio, cáncer metastásico en el hígado, cáncer de hígado, linfoma de linfocitos B grandes, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de tiroides anaplásico metastásico, cáncer urotelial, cáncer de las trompas de Falopio, mieloma múltiple, cáncer de vejiga, sarcoma de tejidos blandos y melanoma. AGEN-1884 (Agenus) es un anticuerpo anti-CTLA4 que se está estudiando en ensayos clínicos de Fase 1 para tumores sólidos avanzados (NCT02694822).
Otro paradigma para la inmunoestimulación es el uso de virus oncolíticos. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para tratar a un paciente mediante la administración de un compuesto desvelado en el presente documento o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o una composición farmacéutica del mismo en combinación con una terapia inmunoestimuladora tal como virus oncolíticos. Los virus oncolíticos inmunoestimulantes aprobados que pueden usarse en la presente invención incluyen talimogen laherparepvec (virus del herpes simple vivo, atenuado, Imlygic®, Amgen).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un activador del receptor<y>huérfano relacionado con el receptor de ácido retinoico (RORYt). RORYt es un factor de transcripción con funciones clave en la diferenciación y el mantenimiento de los subconjuntos efectores de tipo 17 de células T CD4+ (Th17) y CD8+ (Tc17), así como la diferenciación de subpoblaciones de células inmunitarias innatas que expresan IL-17 tal como las células NK. Un activador de RORYt, que se está estudiando que puede usarse en la presente invención es LYC-55716 (Lycera), que actualmente se está evaluando en ensayos clínicos para el tratamiento de tumores sólidos (NCT02929862).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un agonista o activador de un receptor de tipo toll (TLR). Los activadores adecuados de TLR incluyen un agonista o activador de TLR9 tal como SD-101 (Dynavax). SD-101 es un CpG inmunoestimulador que se está estudiando para linfomas de células B, foliculares y otros (NCT02254772). Los agonistas o activadores de TLR8 que pueden usarse en la presente invención incluyen motolimod (VTX-2337, VentiRx Pharmaceuticals), que se está estudiando para el cáncer epidermoide de cabeza y cuello (NCT02124850) y el cáncer de ovario (NCT02431559).
Otros inhibidores de puntos de control que pueden usarse en la presente invención incluyen inhibidores de la proteína 3 que contiene mucina e inmunoglobulina de linfocitos T (TIM-3). Los inhibidores de TlM-3 que pueden usarse en la presente invención incluyen TSR-022, LY3321367 y MBG453. TSR-022 (Tesaro) es un anticuerpo anti-TIM-3 que se está estudiando en tumores sólidos (NCT02817633). LY3321367 (Eli Lilly) es un anticuerpo anti-TIM-3 que se está estudiando en tumores sólidos (NCT03099109). MBG453 (Novartis) es un anticuerpo anti-TIM-3 que se está estudiando en neoplasias malignas avanzadas (NCT02608268).
Otros inhibidores de puntos de control que pueden usarse en la presente invención incluyen inhibidores de inmunorreceptores de linfocitos T con dominios Ig e ITIM, o TIGIT, un receptor inmunitario en determinados linfocitos T y células NK. Los inhibidores de TIGIT que pueden usarse en la presente invención incluyen BMS-986207 (Bristol-Myers Squibb), un anticuerpo monoclonal anti-TIGIT (NCT02913313); OMP-313M32 (Oncomed); y anticuerpo monoclonal anti-TIGIT (NCT03119428).
Los inhibidores de puntos de control que pueden usarse en la presente invención también incluyen inhibidores del gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3). Los inhibidores de LAG-3 que pueden usarse en la presente invención incluyen BMS-986016 y REGN3767 e IMP321. BMS-986016 (Bristol-Myers Squibb), un anticuerpo anti-LAG-3, se está estudiando en glioblastoma y gliosarcoma (NCT02658981). REGN3767 (Regeneron), también es un anticuerpo anti-LAG-3 y se está estudiando en neoplasias malignas (NCT03005782). IMP321 (Immutep S.A.) es una proteína de fusión LAG-3-Ig, que se están estudiando en melanoma (NCT02676869); adenocarcinoma (NCT02614833); y cáncer de mama metastásico (NCT00349934).
Otros agentes inmunooncológicos que pueden usarse en la presente invención en combinación con un compuesto desvelado en el presente incluyen urelumab (BMS-663513, Bristol-Myers Squibb), un anticuerpo monoclonal anti-CD137; varlilumab (CDX-1127, Celldex Therapeutics), un anticuerpo monoclonal anti-CD27; BMS-986178 (Bristol-Myers Squibb), un anticuerpo monoclonal anti-OX40; lirilumab (IPH2102/BMS-986015, Innate Pharma, Bristol-Myers Squibb), un anticuerpo monoclonal anti-KIR; monalizumab (IPH2201, Innate Pharma, AstraZeneca) un anticuerpo monoclonal anti-NKG2A; andecaliximab (GS-5745, Gilead Sciences), un anticuerpo anti-MMP9; MK-4166 (Merck & Co.), un anticuerpo monoclonal anti-GITR.
Otros agentes terapéuticos adicionales que pueden usarse en la presente invención incluyen glembatumumab vedotina-monometil auristatina E (MMAE) (Celldex), un anticuerpo antiglucoproteína NMB (gpNMB) (CR011) unido a MMAE citotóxico. gpNMB es una proteína sobreexpresada por múltiples tipos de tumores asociados con la capacidad de metástasis de las células cancerosas.
Un compuesto de la presente invención también puede usarse ventajosamente en combinación con otros compuestos antiproliferativos. Dichos compuestos antiproliferativos incluyen, pero no se limitan a inhibidores de puntos de control; inhibidores de aromatasa; antiestrógenos; inhibidores de topoisomerasa I; inhibidores de topoisomerasa II; compuestos activos de microtúbulos; compuestos alquilantes; inhibidores de histona desacetilasa; compuestos que inducen procesos de diferenciación celular; inhibidores de ciclooxigenasa; inhibidores de MMP; inhibidores de mTOR; antimetabolitos antineoplásicos; compuestos de platino; compuestos que se dirigen a/disminuyen la actividad proteína o lípido quinasa y otros compuestos antiangiogénicos; compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad de una fosfatasa de proteínas o lípidos; agonistas de gonadorelina; antiandrógenos; inhibidores de metionina aminopeptidasa; inhibidores de metaloproteinasa de matriz; bisfosfonatos; modificadores de la respuesta biológica; anticuerpos antiproliferativos; inhibidores de heparanasa; inhibidores de las isoformas oncogénicas de Ras; inhibidores de telomerasa; inhibidores del proteasoma; compuestos usados en el tratamiento de neoplasias malignas hematológicas; compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad de Flt-3; inhibidores de Hsp90 tal como 17-AAG (17-alilaminogeldanamicina, NSC330507), 17-DMAG (17-dimetilaminoetilamino-17-desmetoxigeldanamicina, NSC707545), IPI-504, CNF1010, CNF2024, CNF1010 de Conforma Therapeutics; temozolomida (Temodar®); inhibidores de la proteína del huso de quinesina, tales como SB715992 o SB743921 de GlaxoSmithKline o pentamidina/clorpromazina de CombinatoRx; inhibidores de MEK tales como ARRY142886 de Array BioPharma, AZd6244 de AstraZeneca, PD181461 de Pfizer y leucovorina.
La expresión "inhibidor de puntos de control" como se usa en el presente documento se refiere a agentes útiles para prevenir que las células cancerosas eviten el sistema inmunitario del paciente. Uno de los principales mecanismos de subversión de la inmunidad antitumoral se conoce como "agotamiento de células T", que es el resultado de la exposición crónica a antígenos que ha dado lugar al aumento de los receptores inhibidores. Estos receptores inhibidores sirven como puntos de control inmunitarios para prevenir reacciones inmunitarias descontroladas.
PD-1 y receptores coinhibidores tales como el antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4, Atenuador de linfocitos B y T (BTLA; CD272), Inmunoglobulina de células T y Dominio 3 de mucina (Tim-3), Gen-3 de activación de linfocitos (Lag-3; CD223) y otros con frecuencia se denominan reguladores de puntos de control. Actúan como "guardianes" moleculares que permiten que la información extracelular dicte si la progresión del ciclo celular y otros procesos de señalización intracelular deben continuar.
En un aspecto, el inhibidor de puntos de control es un agente terapéutico biológico o una molécula pequeña. En otro aspecto, el inhibidor de puntos de control es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo completamente humano, una proteína de fusión o una combinación de los mismos. En un aspecto adicional, el inhibidor de puntos de control inhibe una proteína de puntos de control seleccionada de CTLA-4, PDL1, PDL2, PDl, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, ligandos de la familia B-7 o una combinación de los mismos. En un aspecto adicional, el inhibidor de puntos de control interactúa con un ligando de una proteína del punto de control seleccionada de CTLA-4, PDL1, p Dl2, PDl, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, ligandos de la familia B-7 o una combinación de los mismos. En un aspecto, el inhibidor de puntos de control es un agente inmunoestimulador, un factor de crecimiento de células T, una interleucina, un anticuerpo, una vacuna o una combinación de los mismos. En un aspecto adicional, la interleucina es IL-7 o IL-15. En un aspecto específico, la interleucina es IL-7 glucosilada. En un aspecto adicional, la vacuna es una vacuna de células dendríticas (DC).
Los inhibidores de puntos de control incluyen cualquier agente que bloquee o inhiba de manera estadísticamente significativa, las rutas inhibidoras del sistema inmunitario. Dichos inhibidores pueden incluir inhibidores de molécula pequeña o pueden incluir anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen a y bloquean o inhiben los receptores de puntos de control inmunitario o los anticuerpos que se unen a y bloquean o inhiben los ligandos de receptores de puntos de control inmunitario. Las moléculas de puntos de control ilustrativas que pueden dirigirse para el bloqueo o la inhibición incluyen, pero no se limitan a, CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, G<a>L9, LAG3, TIM3, VISTA, KIR,<2>B<4>(pertenece a la familia de moléculas de CD2 y se expresa en todas las células NK,<y>§ y T CD8+ (ap) de memoria), CD 160 (también conocido como BY55), CGEN-15049, quinasas CHK 1 y CHK2, A2aR y diversos ligandos de la familia B-7. Los ligandos de la familia B7 incluyen, pero no se limitan a, B7- 1, B7-2, B7-DC, B7-H1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H5, B7-H6 y B7-H7. Dichos inhibidores de puntos de control pueden incluir anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, otras proteínas de unión, agentes terapéuticos biológicos o moléculas pequeñas, que se unen a y bloquean o inhiben la actividad de uno o más de CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD 160 y CGEN-15049. Los inhibidores de puntos de control inmunitario ilustrativos incluyen tremelimumab (anticuerpo que bloquea CTLA-4), anti-OX40, Anticuerpo monoclonal PD-Ll (Anti-B7-Hl; MEDI4736), MK-3475 (bloqueante de PD-1), nivolumab (anticuerpo anti-PD1), CT-011 (anticuerpo anti-PD1), anticuerpo monoclonal BY55, AMP224 (anticuerpo anti-PDL1), BMS- 936559 (anticuerpo anti-PDL1), MPLDL3280A (anticuerpo anti-PDL1), MSB0010718C (anticuerpo anti-PDL1) e ipilimumab (inhibidor de puntos de control anti-CTLA-4). Los ligandos de proteínas de puntos de control incluyen, pero no se limitan a PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, CD28, CD86 y TIM-3.
En determinadas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario se selecciona de un antagonista de PD-1, un antagonista de PD-L1 y un antagonista de CTLA-4. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control se selecciona del grupo que consiste en nivolumab (Opdivo®), ipilimumab (Yervoy®) y pembrolizumab (Keytruda®).
En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control se selecciona del grupo que consiste en lambrolizumab (MK-3475), nivolumab (BMS-936558), pidilizumab (CT-011), AMP-224, MDX-1105, MEDI4736, MPDL3280A, BMS-936559, ipilimumab, lirlumab, IPH2101, pembrolizumab (Keytruda®) y tremelimumab.
La expresión "inhibidor de aromatasa" como se usa en el presente documento se refiere a un compuesto que inhibe la producción de estrógenos, por ejemplo, la conversión de los sustratos androstenodiona y testosterona en estrona y estradiol, respectivamente. El término incluye, pero no se limita a esteroides, especialmente atamestano, exemestano y formestano y, en particular, no esteroides, especialmente aminoglutetimida, rogletimida, piridoglutetimida, trilostano, testolactona, ketoconazol, vorozol, fadrozol, anastrozol y letrozol. El exemestano se comercializa con el nombre comercial Aromasin™. El formestano se comercializa con el nombre comercial Lentaron™. El fadrozol se comercializa con el nombre comercial de Afema™. El anastrozol se comercializa con el nombre comercial Arimidex™. El letrozol se comercializa con el nombre comercial Femara™ o Femar™. La aminoglutetimida se comercializa con el nombre comercial Orimeten™. Una combinación de la invención que comprende un agente quimioterapéutico que es un inhibidor de aromatasa es particularmente útil para el tratamiento de tumores con receptores hormonales positivos, tales como tumores de mama.
El término "antiestrógeno" como se usa en el presente documento se refiere a un compuesto que antagoniza el efecto de los estrógenos a nivel de receptores de estrógenos. El término incluye, pero no se limita a tamoxifeno, fulvestrant, raloxifeno y clorhidrato de raloxifeno. El tamoxifeno se comercializa con el nombre comercial Nolvadex™. El clorhidrato de raloxifeno se comercializa con el nombre comercial Evista™. El fulvestrant puede administrarse con el nombre comercial Faslodex™. Una combinación de la invención que comprende un agente quimioterapéutico que es un antiestrógeno es particularmente útil para el tratamiento de tumores con receptores de estrógenos positivos, tales como tumores de mama.
El término "antiandrógeno" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier sustancia que sea capaz de inhibir los efectos biológicos de las hormonas androgénicas e incluye, pero no se limita a, bicalutamida (Casodex™). La expresión "agonista de la gonadorelina" como se usa en el presente documento incluye, pero no se limita a abarelix, goserelina y acetato de goserelina. La goserelina puede administrarse con el nombre comercial Zoladex™.
La expresión "inhibidor de topoisomerasa I" como se usa en el presente documento incluye, pero no se limita a topotecán, gimatecán, irinotecán, camptotecina y sus análogos, 9-nitrocamptotecina y el conjugado macromolecular de camptotecina PNU-166148. Puede administrarse irinotecán, por ejemplo, en la forma en que se comercializa, por ejemplo, bajo la marca Camptosar™. El topotecán se comercializa con el nombre comercial Hycamptin™.
La expresión "inhibidor de topoisomerasa II" como se usa en el presente documento incluye, pero no se limita a las antraciclinas tales como doxorrubicina (incluyedo la formulación liposómica, tal como Caelyx™), daunorrubicina, epirrubicina, idarrubicina y nemorrubicina, las antraquinonas mitoxantrona y losoxantrona y las podofilotoxinas etopósido y tenipósido. El etopósido se comercializa con el nombre comercial Etopophos™. El tenipósido se comercializa con el nombre comercial VM 26-Bristol. La doxorrubicina se comercializa con el nombre comercial Acriblastin™ o Adriamycin™. La epirrubicina se comercializa con el nombre comercial Farmorrubicina™. La idarubicina se comercializa, con el nombre comercial Zavedos™. La mitoxantrona se comercializa con el nombre comercial Novantron.
La expresión "agente activo de microtúbulos" se refiere a estabilización de microtúbulos, compuestos desestabilizadores de microtúbulos e inhibidores de la polimerización de microtubulinas incluyendo, pero no limitado a taxanos, tales como paclitaxel y docetaxel; alcaloides vinca, tales como vinblastina o sulfato de vinblastina, vincristina o sulfato de vincristina y vinorelbina; discodermolidas; colchicina y epotilonas y derivados de los mismos. Paclitaxel se comercializa con el nombre comercial Taxol™. Docetaxel se comercializa con el nombre comercial Taxotere™. El sulfato de vinblastina se comercializa con el nombre comercial Vinblastin R.P™. El sulfato de vincristina se comercializa con el nombre comercial Farmistin™.
La expresión "agente alquilante" como se usa en el presente documento incluye, pero no se limita a, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalán o nitrosourea (BCNU o Gliadel). La ciclofosfamida se comercializa con el nombre comercial Cyclostin™. La ifosfamida se comercializa con el nombre comercial Holoxan™.
La expresión "inhibidores de histona desacetilasa" o "inhibidores de HDAC" se refiere a compuestos que inhiben la histona desacetilasa y que poseen actividad antiproliferativa. Esto incluye, pero no se limita a, ácido hidroxámico de suberoilanilida (SAHA).
La expresión "antimetabolito antineoplásico" incluye, pero no se limita a, 5-fluorouracilo o 5-FU, capecitabina, gemcitabina, compuestos desmetilantes del ADN, tales como 5-azacitidina y decitabina, metotrexato y edatrexato y antagonistas del ácido fólico tales como pemetrexed. La capecitabina se comercializa con el nombre comercial Xeloda™. La gemcitabina se comercializa con el nombre comercial Gemzar™.
La expresión "compuesto de platino" como se usa en el presente documento incluye, pero no se limita a, carboplatino, cis-platino, cisplatino y oxaliplatino. El carboplatino puede administrarse, por ejemplo, en la forma en que se comercializa, por ejemplo, bajo la marca Carboplat™. El oxiplatino puede administrarse, por ejemplo, en la forma en que se comercializa, por ejemplo, bajo la marca Eloxatin™.
La expresión "compuestos que se dirigen a/disminuyen una actividad proteína o lípido quinasa; o una actividad fosfatasa de proteínas o lípidos; o compuestos antiangiogénicos adicionales" como se usa en el presente documento incluye, pero no se limita a, inhibidores de la proteína tirosina quinasa y/o serina y/o treonina quinasa o inhibidores de la lípido quinasa, tales como a) compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad de los receptores del factor de crecimiento derivados de las plaquetas (PDGFR), tales como compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad de PDGFR, especialmente compuestos que inhiben el receptor de PDGF, tales como un derivado de N-fenil-2-pirimidina-amina, tales como imatinib, SU101, SU6668 y GFB-111; b) compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad de los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR); c) compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad del receptor I del factor de crecimiento similar a insulina (IGF-IR), tales como compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad de IGF-IR, especialmente compuestos que inhiben la actividad quinasa del receptor de IGF-I o anticuerpos que se dirigen al dominio extracelular del receptor de IGF-I o sus factores de crecimiento; d) compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad de la familia de receptores tirosina quinasa Trk o inhibidores de efrina B4; e) compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad de la familia de receptores tirosina quinasa Axl; f) compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad del receptor tirosina quinasa Ret; g) compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad de la familia de receptores tirosina quinasa Kit/SCFR, tales como imatinib; h) compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad de la familia de receptores tirosina quinasa c-Kit, que forman parte de la familia PDGFR, tales como compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad de la familia de receptores tirosina quinasa c-Kit, especialmente compuestos que inhiben el receptor c-Kit, tales como imatinib; i) compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad de los miembros de la familia c-Abl, sus productos de fusión génica (por ejemplo, BCR-Abl quinasa) y mutantes, tales como compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad de los miembros de la familia c-Abl y sus productos de fusión génica, tales como un derivado de N-fenil-2-pirimidina-amina, tales como imatinib o nilotinib (AMN107); PD180970; AG957; NSC 680410; PD173955 de ParkeDavis; o dasatinib (BMS-354825); j) compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad de los miembros de la familia de serina/treonina quinasas de proteína quinasa C (PKC) y Raf, miembros de las familias MEK, SRC, JAK/pan-JAK, FAK, PDK1, PKB/Akt, Ras/MAPK, PI3K, SYK, TYK2, BTK y TEC y/o miembros de la familia de quinasas cicladependientes (CDK) incluyendo derivados de estaurosporina, tales como midostaurina; algunos ejemplos de compuestos adicionales incluyen UCN-01, safingol, BAY 43-9006, Briostatina 1, Perifosina; llmofosina; Ro 318220 y RO 320432; GO 6976; lsis 3521; LY333531/LY379196; compuestos de isoquinolina; FTI; PD184352 o QAN697 (un inhibidor de P13K) o AT7519 (inhibidor de CDK); k) compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad de los inhibidores de proteínas tirosina quinasa, tales como compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad de inhibidores de proteínas tirosina quinasa incluyen mesilato de imatinib (Gleevec™) o tirfostina tales como tirfostina A23/RG-50810; AG 99; Tirfostina a G 213; Tirfostina AG 1748; Tirfostina Ag 490; Tirfostina B44; enantiómero (+) de Tirfostina B44; Tirfostina AG 555; AG 494; Tirfostina AG 556, AG957 y adafostina (éster de adamantilo de ácido 4-{[(2,5-dihidroxifenil)metil]amino}-benzoico; NSC 680410, adafostina); l) compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad de la familia de receptores tirosina quinasa del factor de crecimiento epidérmico (EGFR<1>ErbB2, ErbB3, ErbB4 como homo- o heterodímeros) y sus mutantes, tales como compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico son especialmente compuestos, proteínas o anticuerpos que inhiben los miembros de la familia receptor tirosina quinasa del EGF, tales como el receptor de EGF, ErbB2, ErbB3 y ErbB4 o se unen a EGF o ligandos relacionados con EGF, CP 358774, ZD 1839, ZM 105180; trastuzumab (Herceptin™), cetuximab (Erbitux™), Iressa, Tarceva, OSI-774, Cl-1033, EKB-569, GW-2016, E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, e6.4, E2.11, E6.3 o E7.6.3 y derivados de 7H-pirrolo-[2,3-d]pirimidina; m) compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad del receptor c-Met, tales como compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad de c-Met, especialmente compuestos que inhiben la actividad quinasa del receptor c-Met, o anticuerpos que se dirigen al dominio extracelular de c-Met o se unen a HGF, n) compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad quinasa de uno o más miembros de la familia JAK (JAK1/JAK2/JAK3/TYK2 y/o pan-JAK), incluyendo pero no limitado a PRT-062070, SB-1578, baricitinib, pacritinib, momelotinib, VX-509, AZD-1480, TG-101348, tofacitinib y ruxolitinib; o) compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad quinasa de PI3 quinasa (PI3K) incluyendo pero no limitado a ATU-027, SF-1126, DS-7423, PBI-05204, GSK-2126458, ZSTK-474, buparlisib, pictrelisib, PF-4691502, BYL-719, dactolisib, XL-147, XL-765 e idelalisib; y; y q) compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben los efectos de señalización de la proteína hedgehog (Hh) o las rutas del receptor smoothened (SMO), incluyendo pero no limitado a ciclopamina, vismodegib, itraconazol, erismodegib e IPI-926 (saridegib).
La expresión "inhibidor de PI3K" como se usa en el presente documento incluye, pero no se limita a compuestos que tienen actividad inhibidora contra una o más enzimas de la familia de las fosfatidilinositol-3-quinasas, incluyendo, pero no limitado a PI3Ka, PI3K<y>, PI3K6, PI3Kp, PI3K-C2a, PI3K-C2P, PI3K-C2<y>, Vps34, p110-a, p110-p, p110-Y, p110-5, p85-a, p85-p, p55-Y, p150, p101 y p87. Los ejemplos de inhibidores de Pl3K útiles en la presente invención incluyen pero no se limitan a ATU-027, SF-1126, DS-7423, PBI-05204, GSK-2126458, ZSTK-474, buparlisib, pictrelisib, PF-4691502, BYL-719, dactolisib, XL-147, XL-765 e idelalisib.
La expresión "inhibidor de Bcl-2" como se usa en el presente documento incluye, pero no se limita a compuestos que tienen actividad inhibidora contra la proteína 2 del linfoma de células B (Bcl-2), incluyendo pero no limitado a ABT-199, ABT-731, ABT-737, apogosipol, inhibidores de pan-Bcl-2 de Ascenta, curcumina (y análogos de la misma), inhibidores dobles de Bcl-2/Bcl-xL (Infinity Pharmaceuticals/Novartis Pharmaceuticals), Genasense (G3139), HA14-1 (y análogos del mismo; véase el documento WO2008118802), navitoclax (y análogos del mismo, véase el documento US7390799), NH-1 (Universidad Farmacéutica de Shenayng), obatoclax (y análogos del mismo, véase el documento WO2004106328), S-001 (Gloria Pharmaceuticals), compuestos de la serie TW (Univ. de Michigan) y venetoclax. En algunas realizaciones el inhibidor de Bcl-2 es un agente terapéutico de molécula pequeña. En algunas realizaciones el inhibidor de Bcl-2 es un peptidomimético.
La expresión "inhibidor de BTK" como se usa en el presente documento incluye, pero no se limita a compuestos que tienen actividad inhibidora contra la tirosina quinasa de Bruton (BTK), incluyendo, pero no limitado a AVL-292 e ibrutinib.
La expresión "inhibidor de SYK" como se usa en el presente documento incluye, pero no se limita a compuestos que tienen actividad inhibidora contra la tirosina quinasa del bazo (SYK), incluyendo pero no limitado a PRT-062070, R-343, R-333, Excellair, PRT-062607 y fostamatinib.
Algunos ejemplos adicionales de compuestos inhibidores de BTK y afecciones tratables mediante tales compuestos en combinación con compuestos de la presente invención pueden encontrarse en el documento WO2008039218 y el documento WO2011090760.
Algunos ejemplos adicionales de compuestos inhibidores de SYK y afecciones tratables mediante tales compuestos en combinación con compuestos de la presente invención pueden encontrarse en el documento WO2003063794, WO2005007623 y WO2006078846.
Algunos ejemplos adicionales de compuestos inhibidores de PI3K y afecciones tratables mediante tales compuestos en combinación con compuestos de la presente invención pueden encontrarse en los documentos WO2004019973, WO2004089925, WO2007016176, US8138347, WO2002088112, WO2007084786, WO2007129161, WO2006122806, WO2005113554 y WO2007044729.
Algunos ejemplos adicionales de compuestos inhibidores de JAK y afecciones tratables mediante tales compuestos en combinación con compuestos de la presente invención pueden encontrarse en el documento WO2009114512, WO2008109943, WO2007053452, WO2000142246 y WO2007070514.
Los compuestos antiangiogénicos adicionales incluyen compuestos que tienen otro mecanismo para su actividad, por ejemplo, no relacionado con la inhibición de proteína o lípido quinasas, por ejemplo, talidomida (Thalomid™) y<t>NP-470.
Los ejemplos de inhibidores del proteasoma útiles para su uso en combinación con compuestos de la invención incluyen, pero no se limitan a bortezomib, disulfiram, epigalocatequin-3-galato (EGCG), salinosporamida A, carfilzomib, ONX-0912, CEP-18770 y MLN9708.
Los compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad de una fosfatasa de proteínas o lípidos son, por ejemplo, inhibidores de la fosfatasa 1, fosfatasa 2A o CDC25, tales como ácido okadaico o un derivado del mismo.
Los compuestos que inducen procesos de diferenciación celular incluyen, pero no se limitan a, ácido retinoico, a-Y- o 8-tocoferol o a-Y- o 8-tocotrienol.
La expresión inhibidor de la ciclooxigenasa como se usa en el presente documento incluye, pero no se limita a, inhibidores de Cox-2, ácido 2-arilaminofenilacético sustituido con 5-alquilo y derivados, tales como celecoxib (Celebrex™), rofecoxib (Vioxx™), etoricoxib, valdecoxib o un ácido 5-alquil-2-arilaminofenilacético, tales como ácido 5-metil-2-(2'-cloro-6'-fluoroanilino)fenilacético, lumiracoxib.
El término "bifosfonatos" como se usa en el presente documento incluye, pero no se limita a, ácido etridónico, clodrónico, tiludrónico, pamidrónico, alendrónico, ibandrónico, risedrónico y zoledrónico. El ácido etridónico se comercializa con el nombre comercial Didronel™. El ácido clodrónico se comercializa con el nombre comercial Bonefos™. El ácido tiludrónico se comercializa con el nombre comercial Skelid™. El ácido pamidrónico se comercializa con el nombre comercial Aredia™. El ácido alendrónico se comercializa con el nombre comercial Fosamax™. El ácido ibandrónico se comercializa con el nombre comercial Bondranat™. El ácido risedrónico se comercializa con el nombre comercial Actonel™. El ácido zoledrónico se comercializa con el nombre comercial Zometa™. La expresión "inhibidores de mTOR" se refiere a compuestos que inhiben la diana de mamíferos de rapamicina (mTOR) y que poseen actividad antiproliferativa tales como sirolimus (Rapamune®), everolimus (Certican)™), CCI-779 y ABT578.
La expresión "inhibidor de heparanasa" como se usa en el presente documento se refiere a compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la degradación de sulfato de heparina. El término incluye, pero no se limita a, PI-88. La expresión "modificador de la respuesta biológica" como se usa en el presente documento se refiere a una linfocina o interferones.
La expresión "inhibidor de las isoformas oncogénicas de Ras", tales como H-Ras, K-Ras o N-Ras, como se usa en el presente documento se refiere a compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad oncogénica de Ras; por ejemplo, un "inhibidor de farnesil transferasa" tales como L-744832, DK8G557 o R115777 (Zarnestra™). La expresión "inhibidor de telomerasa" como se usa en el presente documento se refiere a compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad de telomerasa. Los compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad de la telomerasa son especialmente compuestos que inhiben el receptor de la telomerasa, tales como telomestatina.
La expresión "inhibidor de la metionina aminopeptidasa" como se usa en el presente documento se refiere a compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad de la metionina aminopeptidasa. Los compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad de la metionina aminopeptidasa incluyen, pero no se limitan a, bengamida o un derivado de la misma.
La expresión "inhibidor del proteasoma" como se usa en el presente documento se refiere a compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad del proteasoma. Los compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad del proteasoma incluyen, pero no se limitan a, Bortezomib (Velcade™) y MLN 341.
La expresión "inhibidor de metaloproteinasas de matriz" o (inhibidor de "MMP") como se usa en el presente documento incluye, pero no se limita a, inhibidores peptidomiméticos y no peptidomiméticos de colágeno, derivados de tetraciclina, por ejemplo, el inhibidor peptidomimético de hidroxamato batimastat y su análogo marimastat biodisponible por vía oral (BB-2516), prinomastat (AG3340), metastat (NSC 683551) BMS-279251, BAY 12-9566, TAA211, MMI270B o AAJ996.
La expresión "compuestos usados en el tratamiento de neoplasias malignas hematológicas" como se usa en el presente documento incluye, pero no se limita a, inhibidores de la tirosina quinasa de tipo FMS, que son compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad de los receptores de tirosina quinasa de tipo FMS (Flt-3R); interferón, 1-p-D-arabinofuransilcitosina (ara-c) y bisulfán; e inhibidores de ALK, que son compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la linfoma quinasa anaplásica.
Los compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad de los receptores de tirosina quinasa de tipo FMS (Flt-3R) son especialmente compuestos, proteínas o anticuerpos que inhiben los miembros de la familia quinasa del receptor Flt-3R, tales como PKC412, midostaurina, un derivado de estaurosporina, SU11248 y MLN518.
La expresión "inhibidores de HSP90" como se usa en el presente documento incluye, pero no se limita a, compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad ATPasa intrínseca de HSP90; degradan, se dirigen a, disminuyen o inhiben las proteínas cliente de HSP90 a través de la ruta del proteasoma de ubiquitina. Los compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad ATPasa intrínseca de HSP90 son, especialmente, compuestos, proteínas o anticuerpos que inhiben la actividad ATPasa de HSP90, tales como 17-alilamino,17-desmetoxigeldanamicina (17AAG), un derivado de geldanamicina; otros compuestos relacionados con geldanamicina; inhibidores de radicicol y HDAC.
La expresión "anticuerpos antiproliferativos" como se usa en el presente documento incluye, pero no se limita a, trastuzumab (Herceptin™), trastuzumab-DMI, erbitux, bevacizumab (Avastin™), rituximab (Rituxan®), PRO64553 (anti-CD40) y anticuerpo 2C4. Por anticuerpos se entiende anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos formados a partir de al menos 2 anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpos siempre que exhiban la actividad biológica deseada.
Para el tratamiento de leucemia mieloide aguda (AML), los compuestos de la presente invención pueden usarse en combinación con terapias convencionales contra la leucemia, especialmente en combinación con terapias usadas para el tratamiento de AML. En particular, los compuestos de la presente invención pueden administrarse en combinación con, por ejemplo, inhibidores de farnesil transferasa y/u otros fármacos útiles para el tratamiento de AML, tales como Daunorrubicina, Adriamicina, Ara-C, VP-16, Tenipósido, Mitoxantrona, Idarrubicina, Carboplatino y PKC412.
Otros compuestos antileucémicos incluyen, por ejemplo, Ara-C, un análogo de pirimidina, que es el derivado 2-alfahidroxi ribosa (arabinósido) de desoxicitidina. También se incluye el análogo purínico de hipoxantina, 6-mercaptopurina (6-MP) y fosfato de fludarabina. Los compuestos que se dirigen a, disminuyen o inhiben la actividad de inhibidores de histona desacetilasas (HDAC, por sus siglas en inglés) tales como butirato sódico y ácido suberoilanilida hidroxámico (SAHA, por sus siglas en inglés) inhiben la actividad de las enzimas conocidas como histona desacetilasas. Los inhibidores específicos de HDAC incluyen MS275, SAHA, FK228 (anteriormente FR901228), Tricostatina A y compuestos desvelados en el documento US 6.552.065 incluyendo, pero no limitado a, N-hidroxi-3-[4-[[[2-(2-metil-1H-indol-3-il)-etil]-amino]metil]fenil]-2E-2-propenamida o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y N-hidroxi-3-[4-[(2-hidroxietil){2-(1H-indol-3-il)etil]-amino]metil]fenil]-2E-2-propenamida o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, especialmente la sal de lactato. Los antagonistas de los receptores de somatostatina como se usan en el presente documento se refieren a compuestos que se dirigen a, tratan o inhiben el receptor de somatostatina tales como octreótido y SOM230. Los enfoques que dañan las células tumorales se refieren a enfoques tales como la radiación ionizante. La expresión "radiación ionizante" mencionada anteriormente y en lo sucesivo en el presente documento significa radiación ionizante que se produce como rayos (tales como rayos X y rayos gamma) o partículas (tales como partículas alfa y beta) electromagnéticos. La radiación ionizante se proporciona en, pero no limitado a, radioterapia y se conoce en la técnica. Véanse Hellman, Principles of Radiation Therapy, Cancer, en Principles and Practice of Oncology, Devitaet al.,Eds., 4a Edición, Vol. 1, págs. 248-275 (1993).
También se incluyen aglutinantes de EDG e inhibidores de ribonucleótido reductasa. La expresión "aglutinantes de EDG" como se usa en el presente documento se refiere a una clase de inmunosupresores que modulan la recirculación de linfocitos, tales como FTY720. La expresión "inhibidores de ribonucleótido reductasa" se refiere a análogos de nucleósidos de pirimidina o purina que incluyen, pero no limitado a, fludarabina y/o arabinósido de citosina (ara-C), 6-tioguanina, 5-fluorouracilo, cladribina, 6-mercaptopurina (especialmente en combinación con ara-C contra la ALL) y/o pentostatina. Los inhibidores de ribonucleótido reductasa son especialmente derivados de hidroxiurea o 2-hidroxi-1H-isoindol-1,3-diona.
También se incluyen en particular aquellos compuestos, proteínas o anticuerpos monoclonales de VEGF tales como 1-(4-cloroanilino)-4-(4-piridilmetil)ftalazina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, succinato de 1-(4-cloroanilino)-4-(4-piridilmetil)ftalazina; Angiostatina™; Endostatina™; amidas de ácido antranílico; ZD4190; Zd6474; SU5416; SU6668; bevacizumab; o anticuerpos anti-VEGF o anticuerpos anti-receptor de VEGF, tales como rhuMAb y RHUFab, aptámero de VEGF tal como Macugon; inhibidores de FLT-4, inhibidores de FLT-3, anticuerpo IgGI contra VEGFR-2, angiozima (RPI 4610) y bevacizumab (Avastin™).
La terapia fotodinámica como se usa en el presente documento se refiere a la terapia que usa determinados productos químicos conocidos como compuestos fotosensibilizadores para tratar o prevenir cánceres. Los ejemplos de terapia fotodinámica incluyen el tratamiento con compuestos, tales como Visudyne™ y porfímero sódico.
Los esteroides angiostáticos como se usan en el presente documento se refieren a compuestos que bloquean o inhiben la angiogénesis, tales como, por ejemplo, anecortave, triamcinolona, hidrocortisona, 11-a-epihidrocotisol, cortexolona, 17a-hidroxiprogesterona, corticosterona, desoxicorticosterona, testosterona, estrona y dexametasona.
Los implantes que contienen corticosteroides se refieren a compuestos, tales como fluocinolona y dexametasona.
Otros compuestos quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a, alcaloides vegetales, compuestos hormonales y antagonistas; modificadores de la respuesta biológica, preferentemente linfocinas o interferones; oligonucleótidos o derivados de oligonucleótidos antisentido; ARNhc o ARNip; o diversos compuestos o compuestos con otro mecanismo de acción o desconocido.
La estructura de los compuestos activos identificados por números de código, nombres genéricos o comerciales puede tomarse de la edición actual del compendio convencional "The Merck Index" o a partir de bases de datos, por ejemplo, Patents International (por ejemplo, iMs World Publications).
Un compuesto de la presente invención también puede usarse en combinación con procesos terapéuticos conocidos, por ejemplo, la administración de hormonas o radiación. En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado se usa como radiosensibilizador, especialmente para el tratamiento de tumores que presentan poca sensibilidad a radioterapia.
Un compuesto de la presente invención puede administrarse solo o en combinación con uno o más compuestos terapéuticos diferentes, adoptando la posible terapia de combinación la forma de combinaciones fijas o la administración de un compuesto de la invención y uno o más de otros compuestos terapéuticos que se escalonan o se administran independientemente entre sí, o la administración combinada de combinaciones fijas y uno o más de otros compuestos terapéuticos. Un compuesto de la presente invención puede administrarse además especialmente para terapia tumoral en combinación con quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia, fototerapia, intervención quirúrgica o una combinación de estas. La terapia a largo plazo es igualmente posible como lo es la terapia adyuvante en el contexto de otras estrategias de tratamiento, como se ha descrito anteriormente. Otros tratamientos posibles son la terapia para mantener el estado del paciente después de la regresión tumoral o incluso quimioterapia preventiva, por ejemplo, en pacientes en riesgo.
Esos agentes adicionales pueden administrarse por separado de una composición que contiene el compuesto de la invención, como parte de un régimen de dosificación múltiple. Como alternativa, esos agentes pueden ser parte de una forma farmacéutica individual, mezclados junto con un compuesto de la presente invención en una composición individual. Si se administran como parte de un régimen de dosificación múltiple, los dos principios activos pueden suministrarse de forma simultánea, secuencialmente o con un intervalo de tiempo entre sí, normalmente con un intervalo de cinco horas entre sí.
Como se usa en el presente documento, el término "combinación", "combinado", y términos relacionados se refieren a la administración simultánea o secuencial de agentes terapéuticos de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, un compuesto de la presente invención puede administrarse con otro agente terapéutico de forma simultánea o secuencial en formas farmacéuticas unitarias separadas o conjuntamente en una forma farmacéutica unitaria individual. En consecuencia, la presente invención proporciona una forma de dosificación unitaria individual que comprende un compuesto de la presente invención, un agente terapéutico adicional y un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable.
La cantidad tanto de un compuesto de la invención como de agente terapéutico adicional (en las composiciones que comprenden un agente terapéutico adicional como se describe anteriormente) que puede combinarse con los materiales vehículo para producir una forma farmacéutica unitaria variará dependiendo del hospedador tratado y del modo particular de administración. Preferentemente, las composiciones de la presente invención deben formularse de tal manera que pueda administrarse una dosificación de entre 0,01 - 100 mg/kg de peso corporal/día de un compuesto de la invención.
En las composiciones que comprenden un agente terapéutico adicional, ese agente terapéutico adicional y el compuesto de la presente invención pueden actuar de manera sinérgica. Por lo tanto, la cantidad de agente terapéutico adicional en dichas composiciones será inferior al necesario en una monoterapia que utilice solamente dicho agente terapéutico. En dichas composiciones puede administrarse una dosis de entre 0,01 - 1.000 pg/kg de peso corporal/día del compuesto terapéutico adicional.
La cantidad de agente terapéutico adicional presente en las composiciones de la presente invención no será mayor que la cantidad que normalmente se administraría en una composición que comprende ese agente terapéutico como el único principio activo. Preferentemente la cantidad de agente terapéutico adicional en las composiciones divulgadas en el presente documento variará de aproximadamente el 50 % al 100 % de la cantidad normalmente presente en una composición que comprende ese agente como el único principio terapéuticamente activo.
Los compuestos de la presente invención o las composiciones farmacéuticas de los mismos, también pueden incorporarse en composiciones para recubrir un dispositivo médico implantable, tales como prótesis, válvulas artificiales, injertos vasculares, endoprótesis y catéteres. Las endoprótesis vasculares, por ejemplo, se han usado para superar la reestenosis (reestrechamiento de la pared del vaso tras una lesión). Sin embargo, los pacientes que usan endoprótesis u otros dispositivos implantables están en riesgo de formación de coágulos o activación de plaquetas. Estos efectos indeseados pueden prevenirse o mitigarse prerrecubriendo el dispositivo con una composición farmacéuticamente aceptable que comprende un inhibidor de quinasa. Los dispositivos implantables recubiertos con un compuesto de la presente invención son otra realización de la presente invención.
EJEMPLIFICACIÓN
Los siguientes Ejemplos ilustran la invención descrita anteriormente; no están, sin embargo, previstos para limitar el alcance de la invención de ninguna manera. Los efectos beneficiosos de los compuestos farmacéuticos, las combinaciones y las composiciones de la presente invención también pueden determinarse mediante otros modelos de prueba conocidos como tales por el experto en la materia pertinente.
Lista de abreviaturas comunes usadas en la sección experimental.
DMA: N,N-dimetilacetamida
DMSO: dimetilsulfóxido
EDCI: clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
equiv.: equivalentes
HpLC: cromatografía líquida de alto rendimiento
CLEM: cromatografía líquida-espectrometría de masas
M: molar
mg: miligramos
min: minutos
ml: mililitros
mM: milimolar
mmol: milimoles
NHS: N-hidroxisuccinimida
°C: grados Celsius
PBS: solución salina tamponada con fosfato
RP-HPLC: cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa
RP-HPLC-EM: cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa - espectrometría de masas
ta: temperatura ambiente
TFA: ácido trifluoroacético
Ejemplo 1:
EVALUACIÓN DE I-1a, DM1-SME, MMAE Y SN38 CONTRA UN PANEL DE 11 LÍNEAS CÉLULAS DE CÁNCEREl procedimiento para el panel de líneas celulares de cáncer se proporciona en laTabla 2.
DM1-Sme es DM1 en donde el tiol libre está unido covalentemente al metanotiol a través de un enlace disulfuro.
Tabla 2. Procedimiento
Los detalles del procedimiento inicial de revestimiento celular se describen en laTabla 3.Todas las líneas celulares cumplieron con el criterio de que la viabilidad de las células adheridas/mezcladas >90 % y la viabilidad de las células en suspensión >85 % durante el recubrimiento celular inicial. Todas las placas celulares en este ensayo cumplieron con el criterio de que CV máx <10 %. El compuesto de referencia paclitaxel funcionó bien en todas las líneas celulares analizadas y los datos de paclitaxel fueron consistentes con los datos históricos como se muestra en laTabla 5,a continuación.
continuación
Se evaluaron líneas celulares probadas para determinar la expresión de MT1-MMP. Los resultados se muestran en laTabla 4.Aunque la relación entre expresión y eficacia en el ensayo de citotoxicidad no es lineal, existe la posibilidad de que un nivel umbral de expresión de MT1 sea eficaz a pesar de la variedad de tipos de tumores, tasas de crecimiento y formatos de modelo presentes en el panel de 11 líneas celulares.
T l 4. Ex r i n MT1-MMP n lín l l r r
Los resultados de CI<50>y el porcentaje de inhibición superior paraI-1ay el compuesto de referencia paclitaxel se muestran en laTabla 5.
Tabla 5. Resultados de las pruebas de citotoxicidad del panel de 11 líneas celulares para I-1a y Paclitaxel com uesto de referencia
Los resultados de CI<50>y el porcentaje de inhibición superior para DM1-Sme, MMAE y SN38 se muestran en laTabla 6.
Tabla 6. Resultados de las pruebas de citotoxicidad del panel de 11 líneas celulares para DM1-Sme, MMAE y
SN38
Tres toxinas (DM1-Sme, MMAE y SN38) funcionan bien en las 11 líneas de células tumorales (CI5<o><300 nM).I-1afunciona bien en todas las líneas celulares excepto HCT-15.I-1atiene HCT-15 CI<50>elevadas (CI<50>>5000 nM). Detalles de datos para lasTablas 5y6.
% de inhibición = (Valor máx-muestra)/(Máx.-Mín)*100.
Las curvas de CI<50>se generaron mediante el modelo logístico de 4 parámetros: modelo sigmoideo de respuesta a la dosis como sigue: Y=Abajo+(Arriba-Abajo)/(1 10A((LogCE5o-x)*Pendiente)).
Ejemplo 2:
EVALUACIÓN DE LA EFICACIA DE I-1a EN EL MODELO DE XENOINJERTO EBC-1 EN RATONES HEMBRAS BALB/C DESNUDOS
OBJETIVOS DEL ESTUDIO
El objetivo de este estudio fue evaluar la eficacia antitumoral deI-1a,en el modelo de xenoinjerto EBC-1 en ratones desnudos hembra BALB/c. El diseño experimental se muestra en laTabla 7.
Tabla 7. Diseño ex erimental
a grupo, b número
MATERIALES ANIMALES Y CONDICIONES DE ALOJAMIENTO ANIMALES
Especie:Mus musculus.
Raza: BALB/c desnudo.
Edad: 6-8 semanas.
Sexo: Hembra.
Peso corporal: 18-22 g.
Número de animales: 42 ratones.
CONDICIONES DE ALOJAMIENTO
Los ratones se mantuvieron en jaulas de ventilación individuales a temperatura y humedad constantes con 3 animales en cada jaula.
Temperatura: 20~26 °C.
Humedad del 40-70 %.
Jaulas: Hechas de policarbonato. El tamaño es de 300 mm x 180 mm x 150 mm. El material del lecho es mazorca de maíz, que se cambia dos veces por semana.
Dieta: Los animales tuvieron libre acceso a alimentos granulados secos esterilizados por irradiación durante todo el período del estudio.
Agua: Los animales tuvieron libre acceso a agua potable esterilizada.
Identificación de jaulas: Las etiquetas de identificación de cada jaula contenían la siguiente información: número de animales, sexo, raza, fecha de recepción, tratamiento, número de estudio, número de grupo y la fecha de inicio del tratamiento.
Identificación del animal: Los animales fueron marcados mediante codificación en la oreja.
ARTÍCULOS DE PRUEBA Y CONTROL POSITIVO
Artículo de prueba
Identificación de producto:I-1a
Descripción física: Solución transparente (en DMSO)
Pureza: >95 %
Condiciones de embalaje y almacenamiento: almacenado a -80 °C
MÉTODOS EXPERIMENTALES Y PROCEDIMIENTOS CULTIVO CELULAR
Las células tumorales EBC-1 se mantuvieron como un cultivo en monocapa en medio RPM11640 suplementado con suero de ternera fetal al 10 % a 37 °C en una atmósfera de CO<2>al 5 % en aire. Las células tumorales se subcultivaron de forma rutinaria dos veces por semana mediante tratamiento con tripsina-EDTA. Las células creciendo en una fase de crecimiento exponencial se recogieron y se contaron para la inoculación del tumor.
INOCULACIÓN DEL TUMOR
Cada ratón se inoculó por vía subcutánea en el flanco derecho con las células tumorales EBC-1 (5 x 106) en 0,2 ml de PBS para el desarrollo de tumores. Los tratamientos se iniciaron el día 7 después de la inoculación del tumor cuando el tamaño promedio del tumor alcanzó aproximadamente 152 mm3. Cada grupo consistió en 3 ratones portadores de tumores. Los artículos de prueba se administraron a los ratones de acuerdo con el régimen predeterminado como se muestra en laTabla 7.
T l . Pr r i n l f rm l i n l r í l r
continuación
OBSERVACIONES
Todos los procedimientos relacionados con el manejo de animales, el cuidado y el tratamiento en el estudio se realizaron de acuerdo con las directrices de la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC). En el momento del seguimiento de rutina, se comprobó en los animales diariamente cualquier efecto del crecimiento del tumor y los tratamientos sobre la conducta normal tales como movilidad, consumo de alimentos y agua (solo mirando), aumento/pérdida de peso corporal (los pesos corporales se midieron todos los días), ojos/cabello mates y cualquier otro efecto anormal según lo establecido en el protocolo. La muerte y los signos clínicos observados se registraron basándose el número de animales dentro de cada subconjunto. Los animales en los que se observó que estaban en un estado de deterioro continuo o que el tamaño del tumor excedía los 2000 mm3 fueron sacrificados antes de morir o antes de llegar a un estado de coma.
MEDICIONES DE TUMORES Y LOS CRITERIOS DE VALORACIÓN
El criterio de valoración principal era ver si se podía retrasar el crecimiento del tumor o si se podía curar a los ratones. Los tamaños tumorales se midieron tres veces por semana en dos dimensiones con un calibrador y el volumen se expresó en mm3 usando la fórmula: V = 0,5axb2dondeayberan los diámetros largo y corto del tumor, respectivamente.
El tamaño del tumor se usó para los cálculos de los valores de T/C. El valor de T/C (en porcentaje) es una indicación de la eficacia antitumoral; T y C son los volúmenes medios de los grupos tratados y de control.
TGI se calculó para cada grupo usando la fórmula: TGI (%) = [1-(Ti-T0)/ (Vi-V0)] x100; Ti es el volumen tumoral promedio de un grupo de tratamiento en un día dado, T0 es el volumen tumoral promedio del grupo de tratamiento en el día del inicio del tratamiento, Vi es el volumen tumoral promedio del grupo de control de vehículo el mismo día con Ti y V0 es el volumen tumoral promedio del grupo de vehículo el día del inicio del tratamiento.
RECOGIDA DE MUESTRAS
Se recogió plasma de todos los ratones durante 5 min, 15 min, 30 min, 1 h y 2 h después de la dosificación el día 14. Se tomó una muestra de sangre al final del estudio (30-50 pl) mediante punción de la vena del seno orbital con EDTA-2K como anticoagulante (1,5 pl de EDTA-2K 0,5 M). Se pipetearon 10 pl de plasma a un tubo nuevo para el análisis PK.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Las estadísticas de resumen, incluyendo la media y el error típico de la media (SEM), se proporcionaron para el volumen tumoral de cada grupo en cada momento.
El análisis estadístico de la diferencia en el volumen tumoral entre los grupos se realizó a partir de los datos obtenidos en el mejor momento terapéutico después de la dosis final.
Se realizó un ANOVA de una vía para comparar la bioluminiscencia entre grupos y cuando se obtuvo un estadístico F significativo (una proporción entre la varianza del tratamiento y la varianza del error), las comparaciones entre grupos se realizaron con la prueba de Games-Howell. Todos los datos se analizaron usando Prism. P < 0,05 se consideró ser estadísticamente significativo.
RESULTADOS
MORTALIDAD, MORBILIDAD, Y GANANCIA O PÉRDIDA DE PESO CORPORAL
El peso corporal de los animales se controló periódicamente como medición indirecta de la toxicidad. El cambio de peso corporal en ratones hembra BALB/c desnudos portadores de EBC-1 dosificados conI-1ase muestra en laTabla 9.
Tabla 9. Peso cor oral
* tiw = 3 veces por semana.
TRAZO DEL VOLUMEN TUMORAL
Los volúmenes tumorales medios a lo largo del tiempo en ratones desnudos BALB/c hembra portadores de xenoinjertos de EBC-1 a los que se les administróI-1ase muestran en laTabla 10.
Tabla 10. Trazo del volumen tumoral a lo lar o del tiem o
Nota: a Media ± SEM, b tiw = 3 veces por semana
CURVA DE CRECIMIENTO TUMORAL
Las curvas de crecimiento tumoral se muestran en laTabla 11.
Tabla 11. Inhibición del crecimiento tumoral
a Media ± SEM.
ANÁLISIS DE INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO TUMORAL
La inhibición del crecimiento tumoral se calcula dividiendo el volumen tumoral promedio del grupo tratado por el volumen tumoral promedio del grupo control (T/C). Para que se considere que un artículo de prueba tiene actividad antitumoral, T/C debe ser del 50 % o menos. Se realizó ANOVA unidireccional de Dunnett para analizar las diferencias estadísticas de los grupos de tratamiento compuesto frente al grupo de Vehículo el día 14, *** indica p<0,001.
RESUMEN DE RESULTADOS Y ANÁLISIS
En este estudio, se evaluó la eficacia terapéutica deI-1aen el modelo de xenoinjerto EBC-1. El peso corporal medido se muestra en laTabla 9.Los tamaños de los tumores de todos los grupos de tratamiento en distintos momentos se muestran en laTabla 10.
Como se muestra en laTabla 10, el tamaño medio del tumor de los ratones tratados con vehículo alcanzó 1195 mm3 el Día 14, los ratones tratados conI-1aa 1 mg/kg (TGI=90 %), 3 mg/kg (TGI=114 %), 10 mg/kg (TGI=116 %) mostraron un efecto de inhibición del crecimiento tumoral significativo.
Ejemplo 3:
ESPECIFICIDAD DE LA LIBERACIÓN DE TOXINAS
I-1a,que posee un enlazador AA1-AA2, es más resistente a la liberación no específica de toxina en comparación con BDC con enlaces disulfuro, como lo demuestra una susceptibilidad reducida al bloqueo con bacitracina, un inhibidor de la proteína disulfuro isomerasa (PDI). La medición de citotoxicidad en células HT 1080 después de 24 horas de incubación conI-1amostró un cambio de 1,4 veces en la CI50 al comparar sin bacitracina frente a bacitracina 1 mM como se muestra en laTabla 12.La química del enlazador AA1-AA2 da como resultado una menor liberación de toxina no específica.
Tabla 12. Cit xi i n l l HT1 n r n i n i tracina 1 mM
Ejemplo 4:
ESTABILIDAD EN PLASMA DE I-1a (ENSAYO CL-EM/EM)
Se llevaron a cabo estudios de estabilidad en plasma deI-1aen plasma humano y de ratón.
ANTECEDENTES
El ensayo de estabilidad en plasmain vitromide el grado de degradación de los compuestos en el plasma.
La determinación de la estabilidad de nuevas entidades químicas en plasma es importante en el descubrimiento de fármacos, ya que los compuestos que se degradan rápidamente en el plasma generalmente muestran mala eficaciain vivo.
Los péptidos o BDC se incuban a 37 °C en plasma (de ratón o humano) en concentraciones micromolares bajas durante varias horas. La estabilidad se mide cuantitativamente mediante CL-EM/EM.
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES MADRE DE DMSO
La preparación de soluciones madre para el ensayo de estabilidad del plasma es como sigue.
Preparar una solución madre de DMSO de 160 pM de un péptido convencional (que contenga todos los D-AA) para usarlo como un patrón interno.
Preparar solución madre de DMSO (calidad CC, hybrimax) para cada péptido o BDC a 1 mM.
Diluir la solución madre de DMSO 1 mM para cada péptido a 160 pM (64 pl de solución madre 1 mM 168*2 pl de DMSO (calidad CC, hybrimax)).
Preparar diluciones escalares de 160 pM a 5 pM (160 pM, 80 pM, 40 pM, 20 pM, 10 pM o 5 pM).
solución madre 80 pM: 100 pl de 160 pM 100 ul de DMSO (calidad CC, hybrimax),
solución madre 40 pM: 100 pl de 80 pM 100 ul de DMSO (calidad CC, hybrimax),
solución madre 20 pM: 100 pl de 40 pM 100 ul de DMSO (calidad CC, hybrimax)
solución madre 10 pM: 100 pl de 20 pM 100 ul de DMSO (calidad CC, hybrimax)
solución madre 5 pM: 100 pl de 10 pM 100 pl de DMSO (calidad CC, hybrimax)
Para cada solución madre, mezclar exhaustivamente con una pipeta y mezclar en vórtex suavemente.
EXPERIMENTO DE ESTABILIDAD EN PLASMA: TRANSCURSO DEL TIEMPO
Añadir 8 pl de la solución madre de DMSO 160 pM de péptido o BDC y añadir 8 pl de la solución madre de DMSO 160 pM de 06-34-18-N182 como patrón interno a 304 pl de plasma (152 pl*2) para una concentración final de 4 pM (DMSO al 5 %).
Incubar a 37 °C con 100%de humedad.
Pipetear 40 |jl durante 7 tiempos: tiempo 0, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 24 h en un Eppendorf de 1,5 ml. Almacenar a -80 °C inmediatamente. (volumen total de muestras 7 x 40 = 280 jl).
EXPERIMENTO DE ESTABILIDAD EN PLASMA: CURVA PATRÓN
Añadir 5 j l de cada solución madre de DMSO a 95 j l de plasma. Para cada muestra, mezclar exhaustivamente con una pipeta y mezclar en vórtex suavemente.
Almacenar a -80 °C.
Las concentraciones de las muestras de la curva patrón se muestran en laTabla 13,a continuación.
Tabla 13. Conc n r i n l m r l rv r n^
PREPARACIÓN PARA EXPERIMENTOS CLEM
Descongelar las muestras de plasma en un baño de agua a temperatura ambiente.
Añadir a la muestra el disolvente de extracción. El disolvente de extracción contiene 1 parte de agua, 3 partes de metanol y 3 partes de acetonitrilo.
A las muestras transcurridas en el tiempo se añaden 120 j l de disolvente de extracción, mezclar exhaustivamente con una pipeta y mezclar en vórtex suavemente.
A las muestras de curva patrón se añaden 2* 150 jl, mezclar bien con una pipeta y agitar suavemente.
Centrifugar durante 40 minutos a 14000 rpm a 4 °C.
T ransferir el sobrenadante a los viales de CL-EM y ejecutar el experimento inmediatamente después.
EXPERIMENTOS CL-EM/EM
Se recomienda seguir una transición para el péptido de BDC a estudiar y una transición para el patrón interno 06-34-18-N182 al mismo tiempo. Se determinaron las transiciones de reacción de iones seleccionados (SIR) y monitorización de reacciones múltiples (MRM) más relevantes para cada péptido o BDC. Las transiciones recomendadas para el estudio se muestran en laTabla 14,a continuación.
T l 14. Tr n i i n r m n r l r n I-1 MMAE
Los gradientes recomendados como se muestran en lasTablas 15 y 16,a continuación.
Tabla 15. Gradiente recomendado 1
Tabla 16. Gradiente recomendado 2
Donde la fase móvil A hasta D es como sigue: A= HCOOH al 0,1%en agua; B= HCOOH al 0,1%en MeCN; C= bicarbonato de amonio 5 mM en agua; D= bicarbonato de amonio 5 mM al 10 % agua en acetonitrilo
El volumen de inyección recomendado es 5 ul
La temperatura de la muestra debe configurarse en 21 °C.
La temperatura de la columna es 40 °C.
El método CL-EM se llama "Predeterminado" y tiene las siguientes configuraciones:
Polaridad: ES+
CalibraciónDinámica 1
Capilaridad (kV): 2,51
Cono (V): 20,00
Extractor (V): 3,00
RF (V): 0,10
Temperatura de la fuente (°C): 150
Temperatura de desolvatación (°C): 400
Caudal del gas del cono (l/h): 2
Caudal del gas de desolvatación (l/h): 800
Caudal de gas de colisión (ml/min): 0,20
Resolución LM 1: 12,00
Resolución HM 1: 12,00
Energía iónica 1: 1,00
Entrada al modo EM: 50,00
Energía de colisión en modo EM: 3,00
Salida del modo EM: 50,00
Entrada al modo EMEM: 1,00
Energía de colisión en modo EMEM: 20,00
Salida del modo EMEM: 0,50
Resolución LM 2: 14,00
Resolución HM 2: 14,00
Energía iónica 2: 1,00
Ganancia: 1,00
El orden sugerido de las muestras es: del curso de tiempo 7 (24 h) al curso de tiempo 0 para reducir el arrastre de las muestras; y de dilución de 5 pM a 80 pM para las muestras de curva patrón por el mismo motivo.
El análisis de los datos se ha realizado mediante el software "QuanLynks" y "Sigmaplot".
Los resultados de las pruebas de estabilidad en plasma en plasma humano y de ratón se muestran en lasFiguras 1 -3.
Para los estudios representados en lasFiguras 1-3,se usaron las siguientes condiciones.
Columna: Waters ACQUITY CSH Fenilo-Hexilo 1,7 pm 2,1 x 50 mm
Fase móvil: C= bicarbonato de amonio 5 mM en agua; B= bicarbonato de amonio 5 mM al 10 % agua en acetonitrilo. Gradiente: del 5 al 60 % B en 4 minutos a un caudal de 0,6 ml/min.
LaFigura 1muestra curvas de estabilidad en plasma paraI-1aen plasma de ratón y humano (1 pM en plasma, pH 7,4 a 37 °C). Después de 24 horas de incubación en plasma humano, se quedó un 96 % deI-1aque corresponde a t<1/2>= >>24 h. Después de 24 horas de incubación en plasma de ratón, se quedó un 57 % deI-1aque corresponde a t1/2 = 6,4 h.
Sin desear quedar ligados a teoría particular alguna, se cree que la menor estabilidad observada en ratones probablemente se deba a la carboxesterasa 1c (Ces1c) de ratón y al entorno proteolítico generalmente más agresivo que se encuentra en los ratones.
Para probar la hipótesis de que la inestabilidad plasmática en ratones se debía a Ceslc,1-1 ase incubó en plasma de
ratón tanto en presencia como en ausencia inhibidor de la serina proteasa que tiene reacción cruzada con Ces1
LaFigura 2muestra curvas de estabilidad en plasma paraI-1aen plasma de ratón (4 pM en plasma, pH 7,4 a 37 °C). Después de 24 horas de incubación en plasma de ratón sin AEBSF, se quedó un 50 % deI-1aque corresponde a t<1/2>= 24 h. Después de 24 horas de incubación en plasma de ratón AEBSF, se quedó un 100 % deI-1aque corresponde a t<1/2>= >>24 h.
Adicionalmente, se controló la formación del metabolito MMAE en plasma de ratón (liberación de la toxina) tanto en presencia como en ausencia de AEBSF. Como se muestra en laFigura 3, en presencia de AEBSF, la degradación deI-1ase inhibe como lo demuestra la falta de formación de MMAE libre. En ausencia de AEBSF, la degradación deI-1ase sigue con la aparición de MMAE libre.
Ejemplo 5:
ESPECIFICIDAD DE DIANA DE LA CITOTOXICIDAD IN VITRO DE I-1a
La dependencia de diana de la citotoxicidad deI-1aen líneas celulares que expresan o carecen de MT1-MMP se evaluó midiendo los niveles de ATP en un ensayo de criterio de valoración después de 24 horas de exposición a la toxina, en presencia o ausencia de un exceso de péptido de unión o péptido de control no de unión.
La estructura del péptido de unión, que es el Biciclo Espaciador deI-1a,es
El péptido que no se une es (B-Ala)-Sar10-ACVPCADFPIWYC (SEQ ID NO: 17). El péptido que no se une no mostró inhibición en experimentos de competencia de polarización fluorescente MT1-MMP hasta 20 pM.
MÉTODOS
Se sembraron células HT1080 en placas de 96 pocillos (75 pl/pocillo) y se incubaron durante la noche a 37 °C CO<2>al 5 %. El día siguiente, los péptidos se prepararon en tampón a partir de una solución madre de DMSO. Se añadieron 10 pl de tampón o péptido a las células y se incubaron durante 1 hora. Las toxinas se diluyeron en medios de cultivo celular y se añadieron 15 pl/pocillo a las células (<0,5 % de DMSO final). Las células tenían aproximadamente un 30 50 % de confluencia después de la dosificación. Las placas se sellaron con sellos permeables al gas y se incubaron durante 24 horas a 37 °C CO<2>al 5 %. Después de 24 horas, los medios se eliminaron, las células se lavaron con PBS y se añadieron 100 pl de medio nuevo por pocillo. Las células se incubaron durante 48 horas adicionales a 37 °C CO<2>al 5 %.
El reactivo ATPLite (Perkin Elmer) se equilibró a temperatura ambiente y se reconstituyó en tampón según las instrucciones del fabricante. Se añadieron 100 pl de reactivo por pocillo. Las placas se sellaron y se agitaron suavemente durante 20 minutos para asegurar la lisis celular completa antes de leer la luminiscencia usando un BMG Pherastar. Los recuentos de luminiscencia se correlacionan con los niveles de ATP y, por tanto, con la viabilidad celular. Los datos se analizaron usando GraphPad Prism. Se usó un ajuste de regresión no lineal para calcular una CI<50>para cada agente tóxico: Y=Abajo (Arriba-Abajo)/(1+10A((LogCl50-X)*Pendiente)).
Los resultados se muestran en laTabla 17,a continuación. Un cambio en la CI<50>de citotoxicidad de 13 veces se observó paraI-1aen presencia de péptido de unión 250 ^M, mientras que la presencia de 250 ^M de péptido que no se une dio como resultado sólo un cambio de 2 veces, indicando queI-1apuede competir con el péptido de unión pero no con un péptido no relacionado. Estos resultados demuestran la especificidad deI-1aunión para dirigirse a células HT1080. La toxina MMAE muestra un cambio de 1,2 veces en la CI<50>de citotoxicidad en presencia de péptido de unión 250 ^M y sin desplazamiento en la CI<50>en presencia de 250 ^M de péptido no de unión consistente con su falta de un resto de unión a MT1-MMP.
T l 17. D l z mi n I i xi i n HT1 n r n i n i i ni n
Ejemplo 6:
TOXICIDAD CELULAR DE I-1a Y TOXINAS EN CÉLULAS HT1080 Y L540 EN PRESENCIA/AUSENCIA DE INHIBIDORES DE PROTEÍNA DISULFURO ISOMERASA BACITRACINA A 1 mM
Una ventaja del enlazador AA1-AA2 es su resistencia a la escisión por la proteína disulfuro isomerasa que puede escindir fácilmente enlaces disulfuro. Esto puede dar como resultado la liberación no selectiva de toxina para BDC que utilizan un enlace disulfuro.
Como se ha mencionado anteriormente, la liberación no selectiva de toxina se denomina actividad de espectador. Un factor que contribuye en algunos BDC puede ser la enzima proteína disulfuro isomerasa (PDI), que puede romper el enlace -S-S- para liberar la toxina. Para determinar el efecto de PDI en la liberación de toxina, PDI se inhibe con bacitracina, un inhibidor conocido de PDI.
La bacitracina es un péptido cíclico que interfiere con la síntesis de la pared celular/peptidoglucano. Se ha usado como inhibidor de PDI y tiene la siguiente estructura:
MATERIALES
DM1-SMe, solución madre 10,58 mM en DMSO.
I-1a,100 mg/ml, 25,8 mM.
MMAE, 10 mM
Kit ATPlite de 1 etapa (Perkin Elmer 6016731)
células HT1080 (ATCC, vía LGC, BIC918) Mantenido en medio EMEM (Sigma M2279) FBS al 10 % (Código Sigma F7524) L-Glu 4 mM (Invitrogen Cat 25030-024)
Células L540 (DSMZ N.° ACC72, BIC5121), mantenidas en medio RPMI-1640 (Sigma N.° R8758) 20 % de suero inactivado por calor
Placas de 96 pocillos tratadas con cultivo de tejidos transparentes
Sello adhesivo permeable al gas (VWR 732-0077)
Sello estelar de poliolefina avanzado X-clear (Starlabs E2796-9795)
Estaurosporina 1 mM (Sigma S6942-200UL)
MÉTODO
I-1a Y TOXINAS CON BACITRACINA: EXPOSICIÓN DE 24 O 72 HORAS EN PLACAS DE 96 POCILLOSCélulas sembradas con DB en medio normal, 75 pl en placas transparentes de 96 pocillos, ~24 horas antes.
HT1080 - 7,5k células/pocillo: 50 % confluente al dosificar.
L540 - 20k células/pocillo: 40 % confluente al dosificar.
Preparación de estaurosporina: solución madre 1 mM en DMSO: Diluir 1:50 (5 pl 245 pl) a 20 pM en medio o tampón de formación de imágenes (4x cono final 5 pM. Concentración final de DMSO = 0,5 %).
Reactivo Lyis fabricado de R&D DYC002: (Final 1 % NP40, Tris 20 mM pH8, NaCl 137 mM, glicerol al 10 %, EDTA 2 mM, Ortovanadato de Na 1 mM, leupeptina 10 ug/ml, aprotinina 10 pg/ml). Combinar 750 pl de agua y 750 pl de DYC002.
Las soluciones madre se prepararon como se muestra en laTabla 18.
Tabla 18. Pre aración de la solución madre
Diluir anteriormente 1 en 5 añadiendo 4 ml anteriormente a 16 ml de DMSO (columnas 1-9, DMSO en 10)
CÉLULAS HT1080 Y L540
Diluir en medio 1:42,85 = 5 pl de DMSO diluido 209 pl de medio => usar 15 pl por pocillo
Esto proporciona una concentración máxima de 5 pM para BDC en el ensayo
Esto proporciona una concentración máxima de 2 pM para DM1-SMe y MMAE en el ensayo
Añadir 10 |jl de medio ± bacitracina (2 placas de cada uno) - dejar durante 1 h
Bacitracina = concentración final 1 mM. Esto requiere una concentración de 10 mM sin DMSO.
Para los medios HT1080 y L540 se necesitan 3 ml de medio 1 ml de bacitracina 40 mM para preparar la concentración requerida.
La solución de bacitracina 40 mM se preparó disolviendo 0,2 g de bacitracina en 3514 j l de agua.
Añadir 15 j l de tratamiento por pocillo como en laTabla 19,a continuación.
*SS = estaurosporina
Sellar las placas con membrana permeable al gas e incubar a 37 °C.
Lavar las placas HT1080 con 2 x 150 j l de PBS a las 24 h y añadir 100 j l de medio nuevo
En t = 72 h, equilibrar el reactivo ATPlite a temperatura ambiente. Añadir 10 ml de tampón a cada vial de sustrato liofilizado. Añadir 100 j l de reactivo por pocillo. Sellar con sello PCR y tapar para proteger de la luz. Agitar durante 20 min antes de leer la luminiscencia
AJUSTES DE LUMINISCENCIA CONFIGURACIÓN DEL PUNTO FINAL
Tiempo del intervalo de medición [s]: 1,00
Configuraciones ópticas
Módulo óptico: LUM plus
Ganancia: 3000
Altura focal [mm]: 10,0
Configuración general
Tiempo de configuración [s]: 0,1
Temperatura diana [°C]: 25
Para permitir la comparación de diferentes ventanas cinéticas todos los valores de medición están normalizados a 1 segundo.
RESULTADOS
Los resultados se resumen en laTabla 20, a continuación.
Tabla 20. Resumen de CI<50>de I-1a Toxina con Bacitracina
Las CI<50>deI-1ase desplazaron 1,4 veces con tratamiento con bacitracina en células HT1080. Las CI<50>deI-1ase desplazaron 2,3 veces con tratamiento con bacitracina en células L540. Estos datos indican que la escisión del enlazador AA1-AA2 no se ve afectada por la presencia o la ausencia de actividad de PDI. De manera similar MMAE que no tiene enlazador muestra cambios insignificantes en presencia de bacitracina tanto en células HT1080 como en L540. DM1-SMe que posee un enlace disulfuro con metanotiol muestra un pequeño desplazamiento de 5,9 veces en las células HT1080 y ningún cambio en las células L540.
Ejemplo 7:
EVALUACIÓN DE LA EFICACIA DE I-1a EN EL MODELO DE XENOINJERTO HT1080
I-1ase evaluó en un modelo de xenoinjerto HT1080 a 1, 3 y 10 mg/kg. Adicionalmente se evaluó la capacidad del péptido de unión (el Biciclo Espaciador deI-1a,estructura mostrada en el Ejemplo 6) para anular la actividad cuando se dosifica en un exceso de 100 veces inmediatamente antes del tratamiento conI-1aen el modelo de xenoinjerto HT1080.
Los resultados de los estudios de xenoinjertos se muestran en lasFiguras 4-6.
LaFigura 4muestra la eficacia conI-1aen el modelo de xenoinjerto HT1080. Se observó eliminación completa del tumor a 1 mg/kg. No se observaron efectos relacionados con la dosis sobre el peso corporal en ninguna de las dosis probadas.
LaFigura 5muestra el desplazamiento de la actividad deI-1acon un exceso de 100 veces del péptido de unión a 1 mg/kg deI-1a.A 1 mg/kg, se observa un desplazamiento significativo de la eficacia con la dosificación conjunta del péptido de unión.
Ejemplo 8:
SÍNTESIS DE I-1a
SUMARIO
Péptido bicíclico1, (PM. 2658,95 Da), se acopló a un enlazador de fármaco citotóxico auristatina, monometil auristatina E (VcMMAE) a través de un enlazador glutarato para dar el conjugado VcMMAE-péptido Bicíclico (I-1a, PM. 3877.94) después de una purificación adecuada.
Se llevó a cabo una reacción inicial a pequeña escala (10 mg de péptido bicíclico) para confirmar que se habían seleccionado las condiciones de conjugación adecuadas y desarrollar un gradiente de HPLC capaz de resolver materiales/productos/subproductos de partida.
Se desarrollaron dos métodos de RP-HPLC, el primero utilizando acetato de amonio 10 mM usando una columna Hichrom ACE 3 (2,1 x 50 mm, 3 pm, 100 A, C18) y el segundo usando acetato de amonio 10 mM con una columna Waters xselect (2,1 x 50 mm, 3,5 pm, péptido CSH™, C18, 130 A).
El análisis final se llevó a cabo en la columna ACE 3 usando el método TFA.
Se realizó una única conjugación preparativa de 114 mg y se purificó usando la HPLC preparativa Gilson 20:20 en múltiples pases de 20 mg después de la traducción del método analítico usando una columna de preparación waters xselect (10 x 100 mm, 10 pm, péptido CSH™, C18, 130 A) para producir el producto puro.
Se agruparon las fracciones que contenían producto puro, se liofilizaron/reconstituyeron y se cuantificaron gravimétricamente antes de separarlas en viales alícuotas de 5 mg.
Se reconstituyó un único vial nominal de 5 mg (3,4 mg reales) en DMSO para análisis de CC
Los resultados de las pruebas de control de calidad y los viales de producto suministrados se resumen en laTabla 21,a continuación.
El proceso desde los materiales de partida hasta los viales del producto final dio un rendimiento del 72 % deI-1a.
MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES CLAVE PÉPTIDO BICÍCLICO 1
El péptido Bicíclico1,(196,74 mg, 73,9 pmol) cuantificado por UV A280 se proporcionó como un polvo liofilizado como sigue en laTabla 22,a continuación.
Tabla 22. Pé tido Bicíclico 1
VcMMAE
VcMMAE se adquirió de Levena Biopharma. N.° de lote P15707040144
GLUTARATO DE VcMMAE ACTIVADO POR NHS
El glutarato de VcMMAE se preparó y activó internamente con una pureza del 80 % a escala media y del 60 % a gran escala (40 % de glutarato no activado presente).
TAMPONES DE ANÁLISIS UVHEPES 50 mM, pH 7 (para medición de UV, para iniciar la concentración de péptidos mediante UV) se usó para las mediciones UV.
El tampón se preparó como sigue: HEPES (5,96 g), ajuste de pH con NaOH 0,5 M a pH 7,0 y preparado en agua ELGA (500 ml).
MÉTODOS CLAVE HPLC DE FASE INVERSA CON UV Y/O MSD
Los datos de control de calidad iniciales para el péptido se obtuvieron en una columna Hichrom ACE 3 C18 con el espectrómetro de masas en un ajuste de polaridad negativa. Un resumen de los métodos HPLC y CLEM se describen en laTabla 23,a continuación.
Tabla 23. Métodos HPLC ^ CLEM
Una vez calificada, la misma muestra se procesó en un sistema HPLC separado con la misma fase móvil pero usando una columna Waters xselect CSH, C18. La monitorización analítica del progreso de la reacción se llevó a cabo nuevamente en ambas columnas, dando la columna xselect la mejor forma de pico y separación. El análisis del producto final se llevó a cabo utilizando agua acetonitrilo (TFA al 0,05 %), ya que proporcionó la mejor calidad de cromatografía. Las condiciones finales de HPLC desarrolladas se describen en la
Tabla 23.
BIOTAGE ISOLERA™ PRIME
El método Biotage Purification RP-HPLC implicó aumentar la duración del método para los métodos desarrollados a 3 o 4 veces como se describe en laTabla 24.
Tabla 24. Método RP-HPLC en Biota e
HPLC PREPARATIVA
La HPLC preparativa se llevó a cabo en un sistema de HPLC Gilson 20:20 con una columna prep Waters xselect, CSH, C18, (10 |jm, 130 A) con acetato de amonio 10 mM (pH 5,7), ya que este sistema era capaz de resolver el conjugado peptídico de otros componentes brutos de la reacción como se resume en laTabla 25.
T l 2 . M HPL r r iv
SECADO POR CONGELACION (LIOFILIZACION)
La liofilización usada después de la purificación usó las condiciones que se describen a continuación.
Sistema: Thermo PL3000 HetoPowerdry
Vacío: 0,80 hPa
Temp. del condensador: -63 °C
Longitud de tiempo: 2-4 días
MEDICIONES UV EN A280 Y A320
La absorbancia tanto a 280 nm como a 320 nm se determinó para cada muestra después de que el instrumento se había puesto a cero con HEPES 50 mM, pH 7,0. El valor promedio de A280 nm se convirtió después en una concentración y el producto total por vial se basó en la siguiente ecuación.
Concentración (mg/ml) = (((A280nm promedio) x D.F**)/£*) x peso molecular [donde* coeficiente de extinción y ** es el factor de dilución].
El Péptido bicíclico1tiene un coeficiente de extinción estimado de 7290 M'1cirr1 en solución acuosa tamponada neutra.
CARACTERIZACION DE REACTIVOS Y REACCIONES
Usando ambos métodos de HPLC optimizados, los reactivos y la reacción de conjugación se caracterizaron como se enumera a continuación.
Solución madre de Péptido bicíclico1.
Solución madre de glutarato VcMMAE activado por NHS.
Una reacción de conjugación de prueba entre el péptido bicíclico1y glutarato VcMMAE activado por NHS.
Conjugación a escala completa del péptido bicíclico1y glutarato VcMMAE activado por NHS.
La preparación de los reactivos y las condiciones de la reacción de conjugación se describen a continuación.
Solución madre de péptido bicíclico1.
El péptido bicíclico 1 (244,47 mg) se proporcionó en un tubo Falcon de 50 ml. El tubo se centrifugó a 3900 rpm durante 2 minutos. Se añadió DMA (2,2986 ml) para disolver el péptido dando una solución madre 40 mM que se almacenó a -80 °C hasta que se necesitó.
SÍNTESIS DE GLUTARATO VcMMAE
Se purgó un vial con tapa de rosca de 7 ml que contenía VcMMAE (250 mg) usando un balón de nitrógeno. Se añadieron 1,72 ml de dimetilacetamida anhidra con agitación y la solución se enfrió a 0 °C en un baño de agua con hielo. Después se añadió DIPEA (52,24 mg, 0,40 mmol, 2,0 eqv.) como una solución madre en dimetil acetamida anhidra (1,05 ml a 50 mg/ml) y la reacción se agitó a 0 °C durante 10 minutos.
Después se añadió anhídrido glutárico (46,12 mg, 0,40 mmol, 2,0 eqv.) como una solución en dimetilacetamida anhidra (922,4 pl a 50 mg/ml).
Después se retiró el baño de hielo y la reacción se agitó hasta t.a. en el transcurso de 1 h. El progreso de la reacción se controló mediante CLEM (método 1) y al finalizar la reacción se inactivó con sulfato de amonio acuoso saturado (4 ml) asegurando que la mezcla estuviera a un pH neutro antes de continuar.
Se añadió agua pura (20 ml) provocando que se volviera a disolver un precipitado que se formó durante la neutralización. Después se transfirió la mezcla acuosa a un embudo de decantación de 100 ml y se enjuagó el recipiente de reacción en el embudo con diclorometano (25 ml). Las capas se separaron y la fase acuosa se extrajo dos veces más con diclorometano nuevo (2 x 25 ml) antes de secar las fases orgánicas combinadas haciéndolas pasar a través de un cartucho de separación de fases Biotage® en un matraz de fondo redondo limpio de 250 ml.
El disolvente se eliminó mediante evaporación rotatoria con una temperatura máxima del baño de agua de 30 °C para dar el material bruto en forma de un aceite amarillo pegajoso que se recogió en dimetilacetamida 1:5: acetonitrilo (4 ml) y se cargó como líquido en un cartucho Biotage C18 de 60 g que se había equilibrado con acetonitrilo al 1 % en agua con tampón TFA al 0,05 %.
El cartucho se eluyó con 1 - 99 % de acetonitrilo en agua con TFA al 0,05 % durante 40 minutos. Las fracciones individuales se transfirieron a viales liofilizados de 50 ml enjuagando los tubos de recolección con 2 ml de acetonitrilo 50:50 en agua con TFA al 0,05 %. Después los viales se llenaron hasta 25 ml usando agua pura para asegurar un contenido de disolvente de menos del 30 %. Después los viales se congelaron a -80 °C durante la noche antes de liofilizarse hasta sequedad. Mientras tanto, las fracciones que contenían producto puro se identificaron usando CLEM y se combinaron en un matraz de fondo redondo de 100 ml previamente pesado pasando 2 x 5 ml de metanol a través de viales que contenían producto puro. Después se eliminó el metanol mediante evaporación rotatoria con una temperatura máxima del baño de agua de 20 °C para dar el producto en forma de un sólido blanquecino (203 mg, 0,18 mmol, rendimiento del 91 %).
SÍNTESIS DE GLUTARATO VcMMAE ACTIVADO POR NHS (ESCALA MEDIA)
Glutarato VcMMAE activado por NHS
Se pesó glutarato VcMMAE (50 mg, 0,040 mmol) del material descrito anteriormente en un vial con tapa de rosca de 7 ml que después se purgó usando un balón de nitrógeno. Después se añadieron dimetilacetamida anhidra (1,55 ml) y diclorometano anhidro (550 j l) con agitación antes de añadir N-hidroxisuccinimida (5,58 mg, 0,049 mmol, 1,2 eqv.) como un sólido y la solución se enfrió a 0 °C en un baño de agua helada.
Después se añadió EDCI (9,30 mg, 0,049 mmol, 1,2 eqv.) como un sólido antes de retirar el baño de agua helada y dejar que la reacción se calentara a t.a. durante la noche. La monitorización de la reacción usando CLEM (método 1) mostró que la reacción había avanzado hasta aproximadamente el 33 %. La mezcla de reacción se enfrió a 0 °C y después se añadieron 3,0 eqv adicionales de cada uno de N-hidroxisuccinimida y EDCI antes de retirar el baño de hielo y dejar que la reacción se calentara a t.a. durante 20 h adicionales dando una conversión del 98 % al producto.
Se eliminó el diclorometano mediante evaporación rotatoria suave antes de inyectar la solución de dimetil acetamida resultante en un cartucho Biotage® de 12 g que se había equilibrado con 5 % de acetonitrilo en agua (0,05 % de tampón TFA) antes de que el cartucho se eluyera con 5 - 99 % de acetonitrilo en agua (0,05 % de TFA) durante 40 minutos.
Las fracciones que contenían el producto puro se identificaron mediante CLEM y se transfirieron a viales individuales de liofilización de 50 ml enjuagando los tubos de recolección con 2 ml de acetonitrilo 50:50: agua (0,05 % TFA) antes de llenar hasta 25 ml con agua pura para garantizar un contenido orgánico inferior al 30 %.
Después, los viales se congelaron en el congelador a -80 °C durante la noche antes de secarlos por liofilización. Después se combinaron los viales que contenían el producto puro pasando 2 x 5 ml de acetonitrilo:agua 50:50 (0,05 % TFA) a través de todos los viales en un único vial previamente pesado. Después se completó el vial hasta 25 ml con agua pura para dar un contenido orgánico inferior al 30 % antes de congelarlo a -80 °C durante la noche y secar mediante liofilización para dar un 80 % de material puro como un sólido blanquecino que fluye libremente (33 mg, 0,025 mmol, 61 % de rendimiento).
FABRICACIÓN DE GLUTARATO VcMMAE ACTIVADO POR NHS (A GRAN ESCALA)
Un matraz de fondo redondo de 50 ml que contenía glutarato VcMMAE (136,6 mg, 0,11 mmol) (material descrito anteriormente) se purgó usando un globo de nitrógeno. Después se añadieron dimetilacetamida anhidra (4,20 ml) y diclorometano anhidro (1,5 ml) con agitación antes de añadir N-hidroxisuccinimida (38,4 mg, 0,033 mmol, 3,0 eqv.) como un sólido y la solución se enfrió a 0 °C en un baño de agua helada.
Después se añadió EDCI (63,51 mg, 0,33 mmol, 3,0 eqv.) como un sólido antes de retirar el baño de agua helada y dejar que la reacción se calentara a t.a. durante la noche. La monitorización de la reacción usando CLEM (método 1) mostró que la reacción había avanzado hasta completarse.
Se eliminó el diclorometano mediante evaporación rotatoria suave antes de inyectar la solución de dimetil acetamida resultante en un cartucho Biotage® de 30 g que se había equilibrado con 5 % de acetonitrilo en agua (0,05 % de tampón TFA) antes de que el cartucho se eluyera con 5 - 99 % de acetonitrilo en agua (0,1 % de TFA) durante 40 minutos.
Las fracciones que contenían el producto puro se identificaron mediante CLEM y se transfirieron a viales individuales de liofilización de 50 ml enjuagando los tubos de recolección con 2 ml de acetonitrilo 50:50: agua (0,1 % TFA) antes de llenar hasta 25 ml con agua pura para garantizar un contenido orgánico inferior al 30 %.
Después, los viales se congelaron en el congelador a -80 °C durante la noche antes de secarlos por liofilización. Después se combinaron los viales que contenían el producto puro pasando 2 x 5 ml de acetonitrilo:agua 50:50 (0,1 % TFA) a través de todos los viales en un único vial previamente pesado. Después se completó el vial hasta 25 ml con agua pura para dar un contenido orgánico inferior al 30 % antes de congelarlo a -80 °C durante la noche y secar mediante liofilización para dar un 60 % de material puro como un sólido blanquecino que fluye libremente (118 mg, 0,089 mmol, 80 % de rendimiento).
Durante la liofilización, la torta de hielo se derritió en varias ocasiones. A continuación se muestra un rastro de la muestra combinada que indica que se ha producido una degradación al ácido durante la liofilización problemática.
PÉPTIDO BICÍCLICO 1
Se añadieron 5 pl de la solución madre de péptido a 195 pl de DMA. Después, la solución se mezcló en vórtex y se dividió en dos muestras de HPLC de 100 pl. Las muestras se analizaron con una inyección de 5 pl en máquinas separadas equipadas con columnas ACE 3 y xselect con NH4Ac 10 mM como fase móvil en cada caso. El análisis del péptido por CLEM confirmó su pureza e identidad.
ANÁLISIS DE REACCIÓN DE PRUEBA
Se llevó a cabo una reacción de prueba a escala de 10 mg entre el péptido y el glutarato VcMMAE activado por NHS para permitir el desarrollo del método analítico.
La solución madre de Péptido 1 (32 mM, 116,8 pl en DMA, 3,76pmol) se transfirió a un vial de 1,5 ml (tapa con tabique) que se había purgado usando un globo de nitrógeno. Después se añadió DIPEA (3,33 pl, 2,43 mg, 18,8 pmol, 5 eqv.) y la solución se agitó a t.a. durante 10 minutos antes de añadir glutarato de VcMMAE activado por n Hs (7,53 mg, 5,64 pl, 1,5 eqv.) en DMA (129,7 pl, solución 58,02 mM). La reacción se agitó a t.a. bajo atmósfera de nitrógeno positivo durante 18 horas. Se usó una dilución 1:100 en agua:acetonitrilo 1:1 para producir una muestra de HPLC para el desarrollo del método. La mezcla de reacción se almacenó a -80 °C.
El análisis por HPLC usando el método 3 dio 1,3 minutos de separación entre el producto y la impureza migratoria más cercana. La impureza más cercana al producto a los 12,92 minutos en acetato de amonio 10 mM (pH 5,7) se identificó como el éster de NHS.
El método analítico se tradujo al sistema de HPLC preparativa Gilson 20:20 para obtener el método de HPLC preparativa que se muestra en laTabla 25.
El material se purificó en dos pases de 8,77 mg añadiendo cuidadosamente 123 pl de la mezcla de reacción bruta a 123 |jl de acetonitrilo al 20%en acetato de amonio 10 mM (pH 5,7) seguido de mezcla en vórtex. Después se cargó la mezcla acuosa completa en una porción en el sistema de HPLC preparativa con gradiente preparativo.
Las fracciones que contenían el producto se identificaron usando el método 2 de HPLC antes de transferirlas a viales de liofilización de 20 ml., lavar los tubos de recogida con 2 ml adicionales de acetonitrilo 50:50: acetato amónico 10 mM. Después se llenaron los viales hasta 10 ml usando agua pura, después se congeló en el congelador a -80 °C durante la noche. Después se liofilizaron los viales hasta sequedad frente a un vial de control que contenía únicamente acetato de amonio.
Después se pasaron 5 ml de acetonitrilo: acetato de amonio 10 mM 50:50 a través de viales que contenían el producto en dos porciones de 2,5 ml en un único vial previamente pesado. Después se añadieron 5 ml de agua pura y la mezcla se congeló durante la noche en el congelador a -80 °C y se liofilizó hasta sequedad para dar el producto puro como un polvo blanco que fluye libremente (8,7 mg, 2,24 x 10'3 mmol, rendimiento del 60 %).
SÍNTESIS
LOTE ESCALADO DE 166 MG
Un vial con tapa de rosca de 7 ml que contenía la solución madre de péptido 1 (32 mM, 1,34 ml en DMA, 42,9 jmol, 114 mg) se purgó usando un balón de nitrógeno. Después se añadió DIPEA (37,4 jl, 27,1 mg, 0,22 mmol, 5 eqv.) y la reacción se agitó a t.a. durante 10 minutos. Después se añadió glutarato VcMMAE activado por NHS (85,9 mg, 64,4 jmol, 1,5 eqv.) en DMA (1,85 ml, solución 34,8 mM, 60 % puro) y la reacción se agitó bajo una atmósfera de nitrógeno positivo durante la noche a t.a. El análisis de la reacción mostró un perfil similar a la reacción de prueba de 10 mg con un rastro de péptido restante. La mezcla de reacción bruta se purificó mediante cromatografía preparativa de fase inversa (8 pases de 20 mg sobre el material bruto más 3 pases repetidos de material impuro) usando el método preparativo que se muestra en la sección 3.2.2. El producto que contenía los tubos de recolección se transfirió a viales de liofilización individuales de 50 ml, lavando los tubos de recolección con 4 ml más de acetonitrilo: acetato amónico 10 mM 50:50. Después se llenaron los viales hasta un volumen de 25 ml usando agua pura, después se congeló en el congelador a -80 °C durante la noche. Después se liofilizaron los viales hasta sequedad frente a un vial de control que contenía únicamente acetato de amonio.
Después se pasaron 10 ml de acetonitrilo: acetato de amonio 10 mM 50:50 a través de viales que contenían el producto en dos porciones de 5 ml en un único vial de liofilización de 50 ml previamente pesado. Después se añadieron 15 ml de agua pura y la mezcla se congeló durante la noche en el congelador a -80 °C y se liofilizó hasta sequedad para dar el producto puro como un polvo blanco que fluye libremente (122,1 mg, en peso). El material se recuperó en acetonitrilo: acetato de amonio 10 mM 50:50 (24,42 ml, 5 mg por ml). Se dividieron porciones de 1 ml de la solución madre entre 24 viales limpios y secos de liofilización de 10 ml (pesados previamente) antes de añadir acetonitrilo: acetato de amonio 10 mM 50:50 (24,42 ml) adicional al vial principal y nuevamente repartir entre los viales de 10 ml en porciones de 1 ml. Después se añadieron 3 ml de agua a cada vial para obtener un total de 5 ml por vial (un solo vial no se llenó hasta 5 ml; este se usó como el vial de análisis).
Todos los viales se congelaron en el congelador a -80 °C durante la noche y después se liofilizaron hasta sequedad frente a un vial de control que contenía únicamente acetato de amonio. Después de que desapareció la torta de hielo, los viales se liofilizaron durante 48 h más para dar 23 viales que contenían 5 mg de producto (± 0,5 mg) y un único vial que contenía 3,4 mg. El rendimiento total fue de 122,1 mg (32 jmol, rendimiento del 73 %) de producto puro, véase laTabla 26.
Tabla 26. Viales nominales con volúmenes cantidades de llenado
ANALISIS DE CC DEL PRODUCTO
RP-HPLC Y RP-HPCL-EM PARA PUREZA E IDENTIDAD DE I-1a
Se reconstituyó un único vial nominal representativo de 5 mg (3,4 mg reales) en DMSO (175,5 j l ) de tal manera que la concentración fuera de 5 mM, Se añadieron 2 j l de esta solución madre a 198 j l de DMSO y la muestra se analizó mediante RP-HPLC y RP-HPCL-EM con 5 j l para confirmar la pureza y la identidad respectivamente. RP-HPLC usando el método 2 (NH4OAc, método 2) (véase laTabla 23) se usó inicialmente ya que este método proporcionó una resolución clara del producto de VcMMAE glutarilo y el éster de VcMMAE glutarilo NHS y confirmó que las impurezas relacionadas con VcMMAE no estaban presentes. Un método TFA (método 1, véase laTabla 23) se usó después ya que este método daba la mejor forma de pico en comparación con NH4OAc.
El análisis de EM usando el Método 1 (TFA) (véase laTabla 23) mostró la presencia de cuatro series principales de iones m/z. La serie [M]2+ tiene la masa esperada de especies de 1939,4 ((2 x 1939,4) - 2 = 3876,8). La serie [M]3+ tiene también la masa esperada de especies de 1293,4 ((3 x 1293,4) - 3 = 3877,2). Finalmente, la serie [M]4+ tiene la masa de 970,2 ((970,2 x 4) - 4 = 3976,8. El aducto de 718 Da que es consistente con MMAE es un artefacto del análisis de EM donde su intensidad depende de la energía de colisión.
ANÁLISIS Y CONCLUSIÓN CALIDAD DEL PRODUCTO
El producto final es un conjugado de péptido diana-VcMMAE al 99,5 % con cantidades mínimas de impurezas desconocidas, como se muestra en laTabla 27,a continuación.
Tabla 27. Análisis de control de calidad final usando el Método 1 TFA con Hichrom ACE 3
SINTESIS
La síntesis deI-1arequirió poca optimización de tal manera que la conversión del péptido inicial en producto fuera alta sin la necesidad de añadir un gran exceso de éster de glutarilo NHS VcMMAE.
PURIFICACIÓN
La RP-HPLC analítica dio como resultado una buena separación donde todas las impurezas no deseadas se resolvieron del péptido producto. La traducción de este método al sistema de HPLC preparativa Gilson 20:20 proporcionó una resolución y separación reproducibles.
RENDIMIENTO
Se llenó un total de 1 x 3,4 mg, 3 x 4,5 mg, 2 x 4,6 mg, 4 x 4,8 mg, 3 x 4,9 mg, 5 x 5,0 mg, 1 x 5,1 mg, 2 x 5,2 mg, 2 x 5,3 mg, 1 x 5,4 mg y 1 x 5,6 mg viales de producto. Esto es un total de 122,1 mg de los 166 mg que se pueden lograr con las dos conjugaciones iniciales. El rendimiento global desde los materiales de partida hasta el producto envasado es del 73 %.
Se aislaron 3 x 4,5 mg, 2 x 4,6 mg, 4 x 4,8 mg, 3 x 4,9 mg, 5 x 5,0 mg, 1 x 5,1 mg, 2 x 5,2 mg, 2 x 5,3 mg, 1 x 5,4 mg y 1 x 5,6 mg. Se retuvo un vial que contenía 3,4 mg de DMSO (5 mM) para futuros análisis de control de calidad junto con un vial que contenía 8,7 mg de producto de la escala de prueba.
SUMARIO
La pureza diana y el rendimiento deI-1ase logró sin la presencia de derivados de MMAE. La HPLC preparativa en acetato de amonio 10 mM (pH 5,7) dio la mejor separación de compuestos, pero dio una forma de pico deficiente al producto. El análisis por HPLC en TFA dio una forma de pico y una calidad cromatográfica superiores.
Ejemplo 9:
EFICACIA DE I-1a EN EL MODELO PDX DE NSCLC QUE EXPRESA MT1-MMP
OBJETIVOS DEL ESTUDIO
El objetivo de este estudio fue evaluar la eficacia antitumoralin vivodeI-1aen el tratamiento del modelo PDX LU-01-0046 de alta expresión de MT1-MMP en ratones hembra desnudos Balb/C.
MATERIALES: ANIMALES Y CONDICIONES DE ALOJAMIENTO
ANIMALES
Especie:Mus musculus
Raza: BALB/c desnudo
Edad: 6-8 semanas
Sexo: hembra
Peso corporal: 18-22 g
Número de animales: 18 ratones.
CONDICIONES DE ALOJAMIENTO
Los ratones se mantuvieron en jaulas de ventilación individuales a temperatura y humedad constantes con 3 animales en cada jaula.
Temperatura: 20-26 °C.
Humedad del 40-70 %.
Jaulas: Hechas de policarbonato. El tamaño es de 300 mm x 180 mm x 150 mm. El material del lecho es mazorca de maíz, que se cambia dos veces por semana.
Dieta: Los animales tuvieron libre acceso a alimentos granulados secos esterilizados por irradiación durante todo el período del estudio.
Agua: Los animales tuvieron libre acceso a agua potable esterilizada.
Identificación de jaulas: Las etiquetas de identificación de cada jaula contenían la siguiente información: número de animales, sexo, raza, la fecha de recepción, tratamiento, número de estudio, número de grupo y la fecha de inicio del tratamiento.
Identificación del animal: Los animales fueron marcados mediante codificación en la oreja.
INOCULACIÓN DEL TUMOR
Cada ratón fue inoculado por vía subcutánea en el flanco derecho con LU-01-0046 de fragmento tumoral (-30 mm3) para el desarrollo de tumores. El tratamiento se inició cuando el volumen tumoral promedio alcanza los 163 mm3.La administración del artículo de prueba y el número de animales en cada grupo se muestran en la tabla de diseño experimental.
OBSERVACIONES
Todos los procedimientos relacionados con el manejo de animales, el cuidado y el tratamiento en el estudio se realizaron siguiendo las directrices de la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC). En el momento del seguimiento de rutina, se comprobó en los animales diariamente cualquier efecto del crecimiento del tumor y los tratamientos sobre la conducta normal tales como movilidad, consumo de alimentos y agua (solo mirando), aumento/pérdida de peso corporal (los pesos corporales se midieron dos veces por semana), ojos/cabello mates y cualquier otro efecto anormal según lo establecido en el protocolo. La muerte y los signos clínicos observados se registraron basándose el número de animales dentro de cada subconjunto.
MEDICIONES DE TUMORES Y LOS CRITERIOS DE VALORACIÓN
El criterio de valoración principal era ver si se podía retrasar el crecimiento del tumor o si se podía curar a los ratones. El tamaño tumoral se midió dos veces por semana en dos dimensiones utilizando un calibre y el volumen se expresó en mm3 usando la fórmula: V = 0,5axb2dondeaybson los diámetros largo y corto del tumor, respectivamente. El tamaño tumoral se usó después para cálculos del valor de T/C. El valor de T/C (en porcentaje) es una indicación de la eficacia antitumoral; T y C son los volúmenes medios de los grupos tratados y de control, respectivamente, en un día dado.
TGI se calculó para cada grupo usando la fórmula: TGI (%) = [1-(Ti-T0)/ (Vi-V0)] x100; Ti es el volumen tumoral promedio de un grupo de tratamiento en un día dado, T0 es el volumen tumoral promedio del grupo de tratamiento en el día del inicio del tratamiento, Vi es el volumen tumoral promedio del grupo control vehículo en un día dado con Ti, y V0 es el volumen tumoral promedio del grupo vehículo el día de agrupamiento.
RECOGIDA DE MUESTRAS
A los ratones del grupo 2 se les volvió a administrar la dosis y se recogió plasma a los 5 min, 15 min, 30 min, 60 min y 120 min el día 56.
Las muestras de tumores se recogieron del grupo 2 y se fijaron en formalina al 10 %, después se embebieron en parafina y se almacenaron a temperatura ambiente.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Las estadísticas de resumen, incluyendo la media y el error típico de la media (SEM), se proporcionan para el volumen tumoral de cada grupo en cada momento.
El análisis estadístico de la diferencia en el volumen tumoral entre los grupos se realizó a partir de los datos obtenidos en el mejor momento terapéutico después de la dosis final.
Se realizó un ANOVA de una vía para comparar la bioluminiscencia entre grupos y cuando se obtuvo un estadístico F significativo (una proporción entre la varianza del tratamiento y la varianza del error), las comparaciones entre grupos se realizaron con la prueba de Games-Howell. Todos los datos se analizaron usando Prism. P < 0,05 se consideró ser estadísticamente significativo.
Como se muestra en laFigura 6, el tamaño medio del tumor de los animales tratados con vehículo alcanzó 2304 mm3 el día 28, los ratones tratados conI-1aa 1 mg/kg mostraron una inhibición significativa del crecimiento, comparable a la observada con el agente clínicamente usado Docetaxel. Los ratones tratados conI-1aa 3 o 10 mg/kg mostraron una inhibición significativa del crecimiento, mayor que la observada con docetaxel.
Ejemplo 10:
EFICACIA Y TOLERABILIDAD DE I-1a EN EL MODELO PDX DE NSCLC DE BAJA EXPRESIÓN DE MT1-MMP OBJETIVOS DEL ESTUDIO
El objetivo de este estudio fue evaluar la eficacia antitumoralin vivodeI-1aen el tratamiento del modelo PDX LU-01-0486 de baja expresión de MT1-MMP en ratones hembra desnudos Balb/C
MATERIALES: ANIMALES Y CONDICIONES DE ALOJAMIENTO
ANIMALES
Especie:Mus musculus.
Raza: BALB/c desnudo.
Edad: 6-8 semanas.
Sexo: hembra.
Peso corporal: 18-22 g.
Número de animales: 18 ratones.
CONDICIONES DE ALOJAMIENTO
Los ratones se mantuvieron en jaulas de ventilación individuales a temperatura y humedad constantes con 3 animales en cada jaula.
Temperatura: 20-26 °C.
Humedad del 40-70 %.
Jaulas: Hechas de policarbonato. El tamaño es de 300 mm x 180 mm x 150 mm. El material del lecho es mazorca de maíz, que se cambia dos veces por semana.
Dieta: Los animales tuvieron libre acceso a alimentos granulados secos esterilizados por irradiación durante todo el período del estudio.
Agua: Los animales tuvieron libre acceso a agua potable esterilizada.
Identificación de jaulas: Las etiquetas de identificación de cada jaula contenían la siguiente información: número de animales, sexo, raza, la fecha de recepción, tratamiento, número de estudio, número de grupo y la fecha de inicio del tratamiento.
Identificación del animal: Los animales fueron marcados mediante codificación en la oreja.
MÉTODOS EXPERIMENTALES Y PROCEDIMIENTOS
INOCULACIÓN DEL TUMOR
Cada ratón fue inoculado por vía subcutánea en el flanco derecho con LU-01-0486 de fragmento tumoral (30 mm3) para el desarrollo de tumores. El tratamiento se inició cuando el volumen tumoral promedio alcanza los 164 mm3.
OBSERVACIONES
Todos los procedimientos relacionados con el manejo de animales, el cuidado y el tratamiento en el estudio se realizaron siguiendo las directrices de la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC). En el momento del seguimiento de rutina, se comprobó en los animales diariamente cualquier efecto del crecimiento del tumor y los tratamientos sobre la conducta normal tales como movilidad, consumo de alimentos y agua (solo mirando), aumento/pérdida de peso corporal (los pesos corporales se midieron dos veces por semana), ojos/cabello mates y cualquier otro efecto anormal según lo establecido en el protocolo. La muerte y los signos clínicos observados se registraron basándose el número de animales dentro de cada subconjunto.
MEDICIONES DE TUMORES Y LOS CRITERIOS DE VALORACIÓN
El criterio de valoración principal era ver si se podía retrasar el crecimiento del tumor o si se podía curar a los ratones. El tamaño tumoral se midió dos veces por semana en dos dimensiones utilizando un calibre y el volumen se expresó en mm3 usando la fórmula: V = 0,5axb2dondeaybson los diámetros largo y corto del tumor, respectivamente. El tamaño tumoral se usó después para cálculos del valor de T/C. El valor de T/C (en porcentaje) es una indicación de la eficacia antitumoral; T y C son los volúmenes medios de los grupos tratados y de control, respectivamente, en un día dado.
TGI se calculó para cada grupo usando la fórmula: TGI (%) = [1-(Ti-T0)/ (Vi-V0)] x100; Ti es el volumen tumoral promedio de un grupo de tratamiento en un día dado, T0 es el volumen tumoral promedio del grupo de tratamiento en el día del inicio del tratamiento, Vi es el volumen tumoral promedio del grupo control vehículo en un día dado con Ti, y V0 es el volumen tumoral promedio del grupo vehículo el día de agrupamiento.
RECOGIDA DE MUESTRAS
A los ratones del grupo 2, 3 se les volvió a administrar la dosis y se recogió plasma a los 5 min, 15 min, 30 min, 60 min y 120 min el día 24.
Las muestras de tumores se recogieron y se fijaron en formalina al 10 %, después se embebieron en parafina y se almacenaron a temperatura ambiente antes de enviarlo al cliente.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Las estadísticas de resumen, incluyendo la media y el error típico de la media (SEM), se proporcionan para el volumen tumoral de cada grupo en cada momento.
El análisis estadístico de la diferencia en el volumen tumoral entre los grupos se realizó a partir de los datos obtenidos en el mejor momento terapéutico después de la dosis final.
Se realizó un ANOVA de una vía para comparar la bioluminiscencia entre grupos y cuando se obtuvo un estadístico F significativo (una proporción entre la varianza del tratamiento y la varianza del error), las comparaciones entre grupos se realizaron con la prueba de Games-Howell. Todos los datos se analizaron usando Prism. P < 0,05 se consideró ser estadísticamente significativo.
como se muestra en lasFiguras 7y8,el tamaño medio del tumor de los animales tratados con vehículo alcanzó 1201 mm3 el día 24, los ratones tratados con el agente Docetaxel usado clínicamente mostraron una inhibición significativa del crecimiento tumoral, pero con una pérdida de peso severa, lo que lleva al sacrificio humanitario de animales el día 24. Los ratones a los que se les administróI-1aa 3 mg/kg mostraron una mayor inhibición del crecimiento tumoral sin efecto significativo sobre el peso corporal. Los ratones a los que se les administróI-1aa 1 mg/kg mostraron una inhibición limitada del crecimiento tumoral y ningún efecto significativo sobre el peso corporal.
Ejemplo 11:
Síntesis de I-10 a I-12 y de I-14 a I-16
A continuación se describen métodos de síntesis ilustrativos.
(1) Separación:
Condición de separación: Fase A: TFA al 0,075 % en H<2>O, Fase B: MeCN
Método de separación: 18-48-55 min, TR = 53,5 min
Columna de separación: Luna 200*25 mm 10 um, C18, 110A y Gemin150*30mm, C18, 5 um, 110 A, conexión, 50 °C Método de disolución: DMF
Pureza de separación: 95 %
(2) El esquema de reacción de I-12, I-15 e I-16 se muestra a continuación:
Procedim iento general para la preparación del compuesto 3
A una solución de compuesto2(7,00 g, 18,70 mmol, 1,00 eq) en DCM (80,00 ml) y MeOH (40,00 ml) se añadió (4-aminofenil)metanol (2,53 g, 20,56 mmol, 1,10 eq) y EEDQ (9,25 g, 37,39 mmol, 2,00 eq) en la oscuridad. Y la mezcla se agitó a 25 °C durante 8 h. CL-EM mostró que el Compuesto2se consumió por completo y se detectó un pico principal con la EM deseada. La mezcla de reacción resultante se concentró a presión reducida para eliminar el disolvente y dar un residuo. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (ISCO®; Columna ultrarrápida de sílice de 120 g de SepaFlash®, Eluyente de MeOH/DCM al 0-10 % @ 85 ml/min). El Compuesto3(7,00 g, 14,60 mmol, rendimiento del 78,06 %) se obtuvo como un sólido blanco.
Procedim iento general para la preparación del Compuesto 4
A una solución de Compuesto3(4,00 g, 8,34 mmol, 1,00 eq) y carbonocloridato de 4-nitrofenilo (6,72 g, 33,36 mmol, 4,00 eq) en THF (20,00 ml) y DCM (10,00 ml) se añadió PIRIDINA (2,64 g, 33,36 mmol, 2,69 ml, 4,00 eq). Y la mezcla de reacción se agitó a 25 °C durante 5 h. CL-EM mostró que el Compuesto3se consumió por completo y se detectó un pico principal con la EM deseada. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida para dar un residuo, que se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (ISCO®; Columna ultrarrápida de sílice de 120 g de SepaFlash®, Eluyente de 0-20 % DM/MeOH @ 85 ml/min). El Compuesto4(2,20 g, 3,41 mmol, rendimiento del 40,92 %) se obtuvo como un sólido blanco.
Procedim iento general para la preparación del Compuesto 5
Una mezcla de compuesto4(1,10 g, 1,71 mmol, 1,00 eq) y DIEA (2,21 g, 17,06 mmol, 2,98 ml, 10,00 eq) en DMF (10,00 ml) se agitó en una atmósfera de nitrógeno a 0 °C durante 30 min. Se añadieron a la mezcla MMAE (900,00 mg, 1,25 mmol, 0,73 eq) y HOBt (230,56 mg, 1,71 mmol, 1,00 eq) y la mezcla de reacción resultante se agitó en nitrógeno a 0 °C durante 10 min y a 30 °C durante 18 h adicionales. CL-EM mostró que el Compuesto4se consumió por completo y se detectó un pico principal con la EM deseada. La mezcla de reacción se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel C18 (ISCO®; Columna ultrarrápida de C18 de 120 g de SepaFlash®, Eluyente de 0-50 % MeCN/H<2>O @ 85 ml/min). El Compuesto5(850,00 mg, 694,71 umol, rendimiento del 40,63 %) se obtuvo como un sólido blanco.
Procedim iento general para la preparación del Compuesto 6
A una solución de Compuesto5(850,00 mg, 694,71 umol, 1,00 eq) en DCM (36,00 ml) se añadió TFA (12,18 g, 106,80 mmol, 7,91 ml, 153,73 eq) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. La mezcla se concentró a presión reducida para dar un residuo, que se disolvió en T<h>F (10,00 ml) y se añadió K<2>CO<3>(2,40 g, 17,37 mmol, 25,00 eq) a la mezcla. La reacción se agitó a 25 °C durante 12 h. CL-EM mostró que el Compuesto 5 se consumió por completo y se detectó un pico principal con la EM deseada. La mezcla de reacción resultante se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel C<18>(ISCO®; Columna ultrarrápida de C18 de 120 g de SepaFlash®, Eluyente de 050%MeCN/H<2>O @ 85 ml/min). El Compuesto6(560,00 mg, 498,48 umol, rendimiento del 71,75 %) se obtuvo como un sólido blanco.
Procedim iento general para la preparación del Compuesto 7
Un matraz redondo de 50 ml que contenía el Compuesto 7 (400,00 mg, 356,06 umol, 1,00 eq) se purgó usando un globo de nitrógeno. Se añadieron 10 ml de DMA anhidra con agitación y la solución se enfrió a 0 °C en un baño de agua con hielo. Después se añadió DIEA (92,03 mg, 712,11 umol, 124,37 ul, 2,00 eq) como una solución madre en DMA anhidra y la reacción se agitó a 0 °C durante 10 min. Se añadió tetrahidropiran-2,6-diona (81,25 mg, 712,11 umol, 2,00 eq) como una solución en DMA. Después se retiró el baño de hielo y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. CL-EM mostró que el Compuesto 6 se consumió por completo y se detectó un pico principal con la EM deseada. La mezcla de reacción se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel C18 (ISCO®; Columna ultrarrápida de C18 de 120 g de SepaFlash®, Eluyente de 0-50 % MeCN/H<2>O @ 85 ml/min). El Compuesto 7 (300,00 mg, 242,42 umol, rendimiento del 68,08 %) se obtuvo como un sólido blanco.
Procedim iento general para la preparación del Compuesto 8
Un matraz redondo de 50 ml que contenía el Compuesto7(300,79 mg, 230,91 umol, 1,00 eq) se purgó usando un globo de nitrógeno. Se añadieron DMA (15,00 ml) y DCM (5,00 ml) con agitación y la solución se enfrió a 0 °C en un baño de agua con hielo. Se añadieron EDCI (132,79 mg, 692,72 umol, 3,00 eq) y 1-hidroxipirrolidina-2,5-diona (79,72 mg, 692,72 umol, 3,00 eq) y después se retiró el baño de hielo. Después de esto, la reacción se agitó a 25 °C durante 16 h. CL-EM mostró que el Compuesto 7 se consumió por completo y se detectó un pico principal con la EM deseada. La mezcla de reacción se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel C18 (ISCO®; Columna ultrarrápida de C18 de 130 g de SepaFlash®, Eluyente de 0-50%MeCN/H<2>O @ 85 ml/min). El Compuesto 7 (155,00 mg, 116,14 umol, rendimiento del 50,30 %) se obtuvo como un sólido blanco.
Procedim iento general para la preparación de i-16
Un matraz de fondo redondo de 50 ml que contenía el compuestoP-3(66 mg, 22,4 umol, 1,00 eq) en DMA (5 ml) se purgó usando un globo de nitrógeno. Después se añadió DIEA (2,91 mg, 112,4 umol, 19,6 ul, 5 eq) con agitación a 25 °C. Después se añadió el Compuesto8(30,00 mg, 22,48 umol, 1,00 eq) y la reacción se agitó en una atmósfera de nitrógeno positivo a 25 °C durante 16 h. CL-EM mostró que el Compuesto8se consumió por completo y se detectó un pico principal con la EM deseada. La mezcla de reacción resultante se purificó mediante HPLC preparativa (condición TFA). El CompuestoI-16(20,2 mg, 4,85 umol, rendimiento del 21,56 %) se obtuvo como un sólido blanco.Procedim iento general para la preparación de i-12
Un matraz de fondo redondo de 50 ml que contenía el compuestoP-1(75 mg, 22,75 mmol, 1 eq) en DMA (5 ml) se purgó usando un globo de nitrógeno. Después se añadió DIEA (2,91 mg, 22,48 umol, 3,92 ul, 1 eq) con agitación. Después se añadió el Compuesto8(30,00 mg, 22,48 umol, 1,00 eq) y la reacción se agitó en una atmósfera de nitrógeno positivo a 25 °C durante 17 h. CL-EM mostró que el Compuesto8se consumió por completo y se detectó un pico principal con la EM deseada. La mezcla de reacción resultante se purificó mediante HPLC preparativa (condición TFA). El Compuesto 1-12 (29,7 mg, 6,58 umol, rendimiento del 29,25 %) se obtuvo como un sólido blanco.Procedim iento general para la preparación de i-15
Un matraz de fondo redondo de 50 ml que contenía el compuestoP-2(72 mg, 22,23 umol, 1 eq) en DMA (5 ml) se purgó usando un globo de nitrógeno. Después se añadió DIEA (10,02 mg, 77,56 umol, 13,51 ul, 3,45 eq) con agitación. Después se añadió el Compuesto8(30 mg, 22,48 umol, 1,00 eq) y la reacción se agitó en una atmósfera de nitrógeno positivo a 25 °C durante 16 h. CL-EM mostró que el Compuesto8se consumió por completo y se detectó un pico principal con la EM deseada. La mezcla de reacción resultante se purificó mediante HPLC preparativa (condición TFA). El Compuesto I-15 (28,1 mg, 6,31 umol, rendimiento del 28,04 %) se obtuvo como un sólido blanco.
(3) El esquema de reacción de I-11 se muestra a continuación:
Procedimiento general para la preparación de (Ac-Az)-Val-Cit-PABC-MMAE
A una mezcla de Compuesto6(100 mg, 89,01 umol, 1 eq) y Compuesto6A(30,65 mg, 178,03 umol, 2 eq) en DMF se añadió TEA (27,02 mg, 267,04 umol, 37,17 ul, 3 eq), HOBt (24,06 mg, 178,03 umol, 2 eq) y<e>D<c>I (34,13 mg, 178,03 umol, 2 eq) a 0 °C en atmósfera de nitrógeno. La mezcla se agitó a 0 °C durante 30 min y después se calentó a 25 °C con agitación durante 18,5 h. CL-EM mostró que el Compuesto6se consumió por completo y se detectó un pico principal con la EM deseada. La mezcla de reacción resultante se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel C<1 8>(ISCO®; Columna ultrarrápida de C18 de 43 g de SepaFlash®, Eluyente de MeCN/DCM al 0-50 % @ 40 ml/min). Se obtuvo el compuesto (Ac-Az)-Val-Cit-PABC-MMAE (50 mg, 39,14 umol, rendimiento 43,97 %) como un sólido blanco.
Procedim iento general para la preparación de 1-11
A una mezcla de (Ac-Az)-Val-Cit-PABC-MMAE (65 mg, 50,88 umol, 1 eq) y CompuestoP-5(90 mg, 45,98 umol, 0,9 eq) en DMF (3 ml) se añadió una solución de CuSO4 (24,36 mg, 152,64 umol, 23,43 ul, 3 eq) en agua (0,4 ml) y una solución de ácido ascórbico (89,61 mg, 508,79 umol, 94,33 ul, 10 eq) en agua (0,4 ml) en atmósfera de nitrógeno. La mezcla se agitó después a 25 °C durante 1 h. CL-EM mostró que el compuesto (Ac-Az)-Val-Cit-PABC-MMAE se consumió por completo y se detectó un pico principal con la EM deseada. La mezcla de reacción resultante se purificó mediante Hp LC preparativa (condición TfA).I-11(66,6 mg, 20,59 umol, rendimiento del 44,78 %) se obtuvo como un sólido blanco.
(4) El esquema de reacción de I-10 y I-14 se muestra a continuación:
Procedim iento general para la preparación del Compuesto Alil-MMAF
A una solución de MMAF (300 mg, 409,86 umol, 1 eq) en DMF (10 ml) se le añadió K<2>CO<3>(67,97 mg, 491,83 umol, 1,2 eq) y 3-bromoprop-1-eno (49,58 mg, 409,86 umol, 35,42 ul, 1 eq). La mezcla se agitó a 25 °C durante 17 h. CL-EM mostró que MMAF se consumió por completo y se detectó un pico principal con la EM deseada. La mezcla de reacción resultante se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel C18 (ISCO®; Columna ultrarrápida de C18 de 130 g de SepaFlash®, Eluyente de 0-60 % MeCN/H<2>O @ 75 ml/min). Alil-MMAF (130 mg, 165,38 umol, rendimiento del 40,35 %) se obtuvo como un sólido blanco.
Procedim iento general para la preparación del Compuesto 5
A una mezcla de Compuesto4(196,83 mg, 305,32 umol, 2 eq) y DIEA (49,33 mg, 381,65 umol, 66,48 ul, 2,5 eq) en DMF (10 ml) se añadieron Alil-MMAF (120 mg, 152,66 umol, 1 eq) y HOBt (24,75 mg, 183,19 umol, 1,2 eq). La mezcla se agitó a 40 °C durante 7 h. CL-EM mostró un pico principal con la EM deseada. La mezcla de reacción resultante se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel C18 (ISCO®; Columna ultrarrápida de C18 de 43 g de SepaFlash®, Eluyente de 0-60 % MeCN/H<2>O @ 40 ml/min). El Compuesto5(150 mg, 116,13 umol, rendimiento del 76,07 %) se obtuvo como un sólido blanco.
Procedim iento general para la preparación del Compuesto 6
A una solución de Compuesto 5 (110 mg, 85,16 umol, 1 eq) en DCM (18 ml) se añadió TFA (2,82 g, 24,76 mmol, 1,83 ml, 290,74 eq) y la mezcla se agitó a 25 °C durante 1 h. CL-EM mostró que el Compuesto 5 se consumió por completo y se detectó un pico principal con la EM deseada. La mezcla de reacción resultante se concentró a presión reducida para dar un residuo, que se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel C18 (ISCO®; Columna ultrarrápida de C18 de 130 g de SepaFlash®, Eluyente de 0-60 % MeCN/H<2>O @ 75 ml/min). El Compuesto 6 (60 mg, 50,36 umol, rendimiento del 59,13 %) se obtuvo como un sólido blanco.
Procedim iento general para la preparación del Compuesto 7
A una solución de compuesto 6 (60 mg, 50,36 umol, 1 eq) en DMA (5 ml) se añadió DIEA (13,02 mg, 100,71 umol, 17,54 ul, 2 eq) con agitación a 0 °C, seguido de la adición de tetrahidropiran-2,6-diona (11,49 mg, 100,71 umol, 2 eq). La mezcla se agitó a 25 °C durante 1 h. CL-EM mostró que el Compuesto 6 se consumió por completo y se detectó un pico principal con la EM deseada. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel C18 (ISCO®; Columna ultrarrápida de C18 de 43 g de SepaFlash®, Eluyente de 0-60 % MeCN/H<2>O @ 40 ml/min). El Compuesto 7 (55 mg, 42,13 umol, rendimiento del 83,66 %) se obtuvo como un sólido blanco.
Procedim iento general para la preparación del Compuesto 8
A una solución de compuesto7(55 mg, 42,13 umol, 1 eq) en DMA (4,5 ml) y DCM (1,5 ml) se añadió 1-hidroxipirrolidina-2,5-diona (14,54 mg, 126,38 umol, 3 eq) a 0 °C con agitación seguido de la adición de EDCI (24,23 mg, 126,38 umol, 3 eq). La mezcla se agitó a 0 °C durante 30 min a 25 °C durante 20 h. CL-EM mostró que el Compuesto7se consumió por completo y se detectó un pico principal con la EM deseada. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel C18 (ISCO®; Columna ultrarrápida de C18 de 43 g de SepaFlash®, Eluyente de 0-60 % MeCN/H<2>O @ 40 ml/min). El Compuesto8(45 mg, 32,08 umol, rendimiento del 76,16 %) se obtuvo como un sólido blanco.
Procedim iento general para la preparación del Compuesto 9A
A una solución de compuestoP-6(85 mg, 25,78 umol, 1 eq) en DMA (5 ml) se añadió DIEA (16,80 mg, 130 umol, 22,64 ul, 5 eq) con agitación en atmósfera de nitrógeno y se añadió compuesto8(45 mg, 32,08 umol, 1,25 eq). La mezcla se agitó a 25 °C durante 20 h. CL-EM mostró que el Compuesto8se consumió por completo y se detectó un pico principal con la EM deseada. El residuo se purificó por HPLC prep.(condición TFA). El Compuesto9A(60 mg, 13,13 umol, rendimiento del 50,92 %) se obtuvo como un sólido blanco.
Procedim iento general para la preparación de I-14
A una solución de Compuesto9A(80 mg, 17,50 umol, 1 eq) en DCM (6 ml) y THF (0,5 ml) se añadió FENILSILANO (9,60 mg, 88,71 umol, 10,95 ul, 5 eq) y Pd(PPh3)4 (4,40 mg, 3,81 umol, 0,2 eq) en atmósfera de nitrógeno. La mezcla se agitó a 25 °C durante 1 h. CL-e M mostró que el Compuesto9Ase consumió por completo y se detectó un pico principal con la EM deseada. El residuo se purificó por Hp LC prep.(condición t Fa ). El Compuesto 1-14 (52,7 mg, 11,63 umol, rendimiento del 66,46 %) se obtuvo como un sólido blanco.
Procedim iento general para la preparación del Compuesto 9B
A una mezcla de compuestoP-7(85 mg, 31,97 umol, 1 eq) en DMA (5 ml) se añadió DIEA (20,73 mg, 160,41 umol, 27,94 ul, 5 eq) con agitación en de nitrógeno, seguido de la adición del compuesto8(45 mg, 32,08 umol, 1 eq). La mezcla se agitó a 25 °C durante 17 h. CL-EM mostró que el Compuesto8se consumió por completo y se detectó un pico principal con la EM deseada. El residuo se purificó por HPLC prep.(condición TFA). El Compuesto9B(90 mg, 22,89 umol, rendimiento del 71,58 %) se obtuvo como un sólido blanco.
Procedim iento general para la preparación de I-10
A una solución de Compuesto9B(90 mg, 22,89 umol, 1 eq) en DCM (6 ml) y THF (1 ml) se añadió fenilsilano (35,27 mg, 325,92 umol, 40,21 ul, 14 eq) y Pd(PPh3)4 (15,06 mg, 13,04 umol, 0,56 eq) en atmósfera de nitrógeno. La mezcla se agitó a 25 °C durante 5 h. CL-E<m>mostró que el Compuesto9Bse consumió por completo y se detectó un pico principal con la EM deseada. El residuo se purificó por HPLC prep.(condición TFA). El Compuesto 1-10 (26,7 mg, 6,86 umol, rendimiento del 29,97 %) se obtuvo como un sólido blanco.
Los datos de HPLC y CL/EM de I-10 a I-12 y de I-14 a I-16 son como siguen:
Ejemplo 12:
Preparación de I-3a, I-4a, I-6a e I-7 a I-9
Los compuestosP-9, P-10yP-11,como se muestra a continuación, se prepararon inicialmente como sólidos liofilizados y se almacenaron a -20 °C hasta su uso.
Todos los compañeros de reacción que contenían los enlazadores de carga útil citotóxicos se prepararon con una pureza >95 % y se usaron para preparar los conjugados mencionados anteriormente.
RESULTADOS Y ANÁLISIS
La mayoría de los conjugados especificados anteriormente son derivados de amida y se prepararon mediante reacciones de acoplamiento de amida excepto I-6a, que se obtuvo mediante una química de clic catalizada por cobre. Por lo tanto, los péptidos bicíclicos de partidaP-9yP10contenían un grupo amino libre mientras que en el péptidoP-11un grupo amino se derivatiza de tal manera que tenga un único grupo alquino terminal para facilitar la reacción de ciclación. Para la reacción de acoplamiento de amida, la mayoría de los enlazadores de carga útil citotóxicos se prepararon como los respectivos ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) excepto el compañero de acoplamiento para preparar I-4a donde se usó un éster de tetrafluorofenilo ya que se observó que el derivado de éster de NHS era inestable durante su preparación. Para la preparación de la I-6a, se preparó el derivado de azida apropiado y se usó en la reacción de clic.
Inicialmente, todas las reacciones de conjugación para la preparación se llevaron a cabo a una escala de 5 a 15 mg para evaluar las condiciones y después se ampliaron. Inicialmente, 3,2 eq. de los ésteres de NHS (o TFP) con 1 eq de péptido se hicieron reaccionar en presencia de 30 eq. de DIEA (es decir, péptido 8 mM+reactivo 26 mM+DIEA 230 mM en 0,5 ml de DMF) como base en DMF. Sin embargo, se observó que las reacciones transcurrieron bien incluso con 2,3-2,5 eq de ésteres de NHS. También se observó que las reacciones dieron como resultado menos impurezas o subproductos cuando se llevaron a cabo en DMSO como disolvente en lugar de DMF. Todas las reacciones se purificaron mediante cromatografía preparativa de fase inversa. También se observó que era necesario realizar al menos dos purificaciones para obtener los conjugados con una pureza deseada de >95 %. Las fracciones purificadas se analizaron mediante CL-EM y las fracciones puras se combinaron y se liofilizaron después de cada ciclo de purificación para dar los conjugados como sólidos liofilizados. Los productos se disolvieron apropiadamente a continuación en una mezcla de acetonitrilo/agua y se volvieron a liofilizar.
MÉTODOS
Todas las reacciones se controlaron mediante CL-EM usando Waters Acquity UPLC. Los detalles de la columna y el método usado se detallan a continuación:
Columna: Acquity UPLC BEH C18, 2,1x50 mm, 1,7 ^m
Caudal: 0,6 ml/min
Longitud de onda: 254 nm y 220 nm
Disolventes: A - agua de calidad HPLC ácido acético 0,05 v/v; B - acetonitrilo ácido acético al 0,05% v/v
METODOS PARA CONJUGACIONES
Se llevaron a cabo reacciones de acoplamiento de amida a pequeña escala en una escala de 5-15 mg y posteriormente se ampliaron para dar cantidades apropiadas de conjugados como se indica a continuación. La concentración de reactivos usados en las reacciones fue 8 mM de péptido+2,3-2,5 eq. Éster de NHS (o TFP)+DIEA 230 mM en 0,5 ml (según la escala) de DMSO. Las reacciones se llevaron a ta durante la noche y después se purificaron cargando directamente la mezcla de reacción bruta en columnas de HPLC preparativa de fase inversa. Los disolventes usados para la purificación de los conjugados fueron: Disolvente A: Agua+TFA al 0,1 %v/v y Disolvente B - acetonitrilo+TFA 0,1 v/v.
Para I-3a a I-5a y 1-7 a 1-9: la columna usada para la purificación fue Phenomenex Gemini 5 pm, 110 A, 150x30 mm (n.° de parte: OOF-4435-V0-AX) a un caudal de 50 ml/min. El gradiente usado para la purificación fue 30-65 % de B durante 20 min.
Para la I-6a: la columna usada fue Phenomenex Luna 5 pm, 100 A, 250x50 mm (n.° de parte: OOG-4252-V0-AX) a un caudal de 110 ml/min. El gradiente usado para la purificación fue 40-55 % de durante 35 min.
Las fracciones se analizaron mediante CL-EM usando el método corto especificado anteriormente. Las fracciones puras se combinaron y se liofilizaron hasta peso constante para dar los conjugados en forma de sólidos esponjosos. La pureza de los conjugados se determinó mediante CL-EM usando un método más largo que se detalla a continuación. Los conjugados purificados se analizaron usando el método siguiente y no contenían ningún enlazador de carga útil citotóxico libre/no conjugado.
SUMARIO
Las cantidades de los compuestos (>95 % puros por CL-EM) preparados son como sigue:
1) I-3a:Cantidad = 33,3 mg
2) I-7:Cantidad = 31,5 mg
3) I-4 a:Cantidad = 25,0 mg
4) I-8:Cantidad = 9,5 mg y 20,0 mg
5) I-9:Cantidad = 25,2 mg
6) I-6 a:Cantidad = 126,2 mg
Los datos de HPLC y CL/EM son como sigue:
.Basado en el análisis CL-EM, los productos finales obtenidos estaban libres de cualquier enlazador de carga útil citotóxico no conjugado.
Ejemplo 13
Prueba de eficaciain vivode I-3a, I-7, I-4a e I-8 en el tratamiento de xenoinjerto HT1080 en ratones desnudos BALB/cOBJETIVOS DEL ESTUDIO
El objetivo de la investigación fue evaluar la eficacia antitumoralin vivode I-3a, I-7, I-4a e I-8 en el tratamiento de xenoinjerto HT1080 en ratones desnudos BALB/c.
DISEÑO EXPERIMENTAL
MATERIALES ANIMALES Y CONDICIÓN DE ALOJAMIENTO
Animales
Especie:Mus musculus
Raza: Balb/c desnudo
Edad: 6-8 semanas
Sexo: hembra
Peso corporal: 18-22 g
Número de animales: 48 ratones más repuesto
CONDICIÓN DE ALOJAMIENTO
Los ratones se mantuvieron en jaulas de ventilación individuales a temperatura y humedad constantes con 3 animales en cada jaula.
• Temperatura: 20-26 °C.
• Humedad del 40-70 %.
Jaulas: Hechas de policarbonato. El tamaño es de 300 mm x 180 mm x 150 mm. El material del lecho es mazorca de maíz, que se cambia dos veces por semana.
Dieta: Los animales tuvieron libre acceso a alimentos granulados secos esterilizados por irradiación durante todo el período del estudio.
Agua: Los animales tuvieron libre acceso a agua potable esterilizada.
Identificación de jaulas: Las etiquetas de identificación de cada jaula contenían la siguiente información: número de animales, sexo, raza, la fecha de recepción, tratamiento, número de estudio, número de grupo y la fecha de inicio del tratamiento.
Identificación del animal: Los animales fueron marcados mediante codificación en la oreja.
ARTÍCULOS DE PRUEBA Y CONTROL POSITIVO
Identificación de producto:I-3 a
Descripción física: Polvo liofilizado
Peso molecular: 3854,76
Condiciones de embalaje y almacenamiento: almacenado a -80 °C
Identificación de producto:I-7
Descripción física: Polvo liofilizado
Peso molecular: 3796,73
Condiciones de embalaje y almacenamiento: almacenado a -80 °C
Identificación de producto:I-4 a
Descripción física: Polvo liofilizado
Peso molecular: 3895,75
Condiciones de embalaje y almacenamiento: almacenado a -80 °C
Identificación de producto:I-8
Descripción física: Polvo liofilizado
Peso molecular: 3837,72
Condiciones de embalaje y almacenamiento: almacenado a -80 °C
MÉTODOS EXPERIMENTALES Y PROCEDIMIENTOS
CULTIVO CELULAR
Las células tumorales HT1080 se mantuvieronin vitrocomo un cultivo en monocapa en medio EMEM suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % a 37 °C en una atmósfera de CO<2>al 5 % en aire. Las células tumorales se subcultivaron de forma rutinaria dos veces por semana mediante tratamiento con tripsina-EDTA. Las células creciendo en una fase de crecimiento exponencial se recogieron y se contaron para la inoculación del tumor.
INOCULACIÓN DEL TUMOR
Cada ratón se inoculó por vía subcutánea en el flanco derecho con las células tumorales HT1080 ( 5 x 106) en 0,2 ml de PBS para el desarrollo de tumores. Los animales se aleatorizaron y el tratamiento se inició cuando el volumen promedio del tumor alcanzó aproximadamente 150 mm3 para el estudio de eficacia. La administración del artículo de prueba y el número de animales en cada grupo se muestran en la tabla de diseño experimental.
PREPARACIÓN DE LA FORMULACIÓN DEL ARTÍCULO DE PRUEBA
continuación
OBSERVACIONES
Todos los procedimientos relacionados con el manejo de animales, el cuidado y el tratamiento en el estudio se realizaron siguiendo las directrices de la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC). En el momento del seguimiento de rutina, se comprobó en los animales diariamente cualquier efecto del crecimiento del tumor y los tratamientos sobre la conducta normal tales como movilidad, consumo de alimentos y agua (solo mirando), aumento/pérdida de peso corporal (los pesos corporales se midieron todos los días), ojos/cabello mates y cualquier otro efecto anormal según lo establecido en el protocolo. La muerte y los signos clínicos observados se registraron basándose el número de animales dentro de cada subconjunto.
MEDICIONES DE TUMORES Y LOS CRITERIOS DE VALORACIÓN
Antes del comienzo del tratamiento, se midió el tamaño del tumor en ratones en dos dimensiones usando un calibrador y el volumen tumoral (mm3) se calculó usando la fórmula V = 0,5.a Xb2dondeaybson los diámetros largo y corto del tumor en mm, respectivamente. Los ratones se asignaron al azar a diferentes grupos de tratamiento según el volumen tumoral.
El tamaño tumoral se usó después para cálculos del valor de T/C. El valor de T/C (en porcentaje) es una indicación de la eficacia antitumoral; T y C son los volúmenes medios de los grupos tratados y de control, respectivamente, en un día dado.
TGI se calculó para cada grupo usando la fórmula: TGI (%) = [1-(Ti-T0)/ (Vi-V0)] x100; Ti es el volumen tumoral promedio de un grupo de tratamiento en un día dado, T0 es el volumen tumoral promedio del grupo de tratamiento en el día del inicio del tratamiento, Vi es el volumen tumoral promedio del grupo control vehículo en un día dado con Ti, y V0 es el volumen tumoral promedio del grupo vehículo el día de agrupamiento.
RECOLECCIÓN DE PLASMA
Al final del estudio se volvió a administrar la dosis a los ratones y se recogió plasma a los 5 min, 15 min, 30 min, 60 min y 120 min después de la dosificación para análisis farmacocinético.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Las estadísticas de resumen, incluyendo la media y el error típico de la media (SEM), se proporcionan para el volumen tumoral de cada grupo en cada momento.
El análisis estadístico de la diferencia en el volumen tumoral entre los grupos se realizó a partir de los datos obtenidos en el mejor momento terapéutico después de la dosis final.
Se realizó un ANOVA de una vía para comparar la bioluminiscencia entre grupos y cuando se obtuvo un estadístico F significativo (una proporción entre la varianza del tratamiento y la varianza del error), las comparaciones entre grupos se realizaron con la prueba de Games-Howell. Todos los datos se analizaron usando Prism.P< 0,05se consideró ser estadísticamente significativo.
RESULTADOS
MORTALIDAD, MORBILIDAD, Y GANANCIA O PÉRDIDA DE PESO CORPORAL
El peso corporal se controló periódicamente como medición indirecta de la toxicidad. Los cambios en el peso corporal en ratones hembra Balb/c desnudos portadores de HT1080 dosificados con I-3a, I-7, I-4a e I-8 se muestran en la Figura 1.
TRAZO DEL VOLUMEN TUMORAL
El volumen medio del tumor a lo largo del tiempo en ratones hembra Balb/c desnudos portadores de xenoinjerto HT1080 se muestra en la Tabla A.
TABLA A TRAZO DEL VOLUMEN TUMORAL A LO LARGO DEL TIEMPO
T ratamiento______________________ Días después del inicio del tratamiento Gr.0 24 7 91114
1Vehículo, biw151±31 278±69 453±105 717±235 913±281 1122±352 1468±529 2I-3 a, 1 mpk, biw146±14 176±18 147±25 72±17 46±14 15±8 0±0
3 I-3 a, 3 mpk, biw146±27 102±23 46±2 18±4 13±2 5±2 0±0
4 I-3 a, 10 mpk, biw146±8 74±8 28±2 12±3 9±4 2±2 0±0
5 I-7, 1 mpk, biw147±24 230±31 333±54 379±76 419±66 494±78 661±77 6I-7, 3 mpk, biw148±7 159±3 126±8 84±23 86±26 158±75 172±757 I-7, 10 mpk, biw,148±6 116±33 44±6 31±5 5 4 0
8I-4a, 1 mpk, biw150±17 226±30 302±14 434±12 518±22 621±108 837±1399 I-4a, 3 mpk, biw150±20 200±24 244±38 277±65 319±73 385±110 468±135 10I-4a, 10 mpk, biw154±44 208±53 235±61 221±64 165±44 160±34 194±59 11I-8, 1 mpk, biw155±28 227±43 304±40 446±37 558±100 541±183 611±242 12I-8, 3 mpk, biw153±25 234±47 335±38 458±33 592±80 731±96 1042±23213 I-8, 10 mpk, biw155±45 266±58 424±71 579±92 769±140 942±154 1099±163 La curva de crecimiento tumoral se muestra en la Figura 2.
ANALISIS DE INHIBICION DEL CRECIMIENTO TUMORAL
La tasa de inhibición del crecimiento tumoral paraI-3a, I-7, I-4aeI-8en el modelo de xenoinjerto HT1080 se calculó en función de las mediciones del volumen tumoral el día 14 después del inicio del tratamiento.
TABLA B ANÁLISIS DE INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO TUMORAL (T/C Y TGI)
Gr Tratamiento Volumen tumoral (mm3)a T/Cb (%) TGI (%) Valor deP1Vehículo, biw1468±529 -- -- --2I-3 a, 1 mpk, biw0±0 0,0 111,1 p<0,0013 I-3 a, 3 mpk, biw0±0 0,0 111,1 p<0,0014 I-3 a, 10 mpk, biw0±0 0,0 111,1 p< 0,0015 I-7, 1 mpk, biw661±77 45,0 61,0 p<0,05 6I-7, 3 mpk, biw172±75 11,7 98,2p<0,0017 I-3 a, 10 mpk, biw0 0,0 111,3 --8I-4, 1 mpk, biw837±139 57,0 47,8 p>0,059 I-4a, 3 mpk, biw468±135 31,9 75,9p<0,01 10I-3 a, 10 mpk, biw194±59 13,2 96,9p<0,001 11I-8, 1 mpk, biw611±242 41,6 65,3p<0,05 12I-8, 3 mpk, biw1042±232 70,9 32,5p>0,0513 I-8, 10 mpk, biw1099±163 74,8 28,3p>0,05 a. Media ± SEM.
b. La inhibición del crecimiento tumoral se calcula dividiendo el volumen tumoral promedio del grupo tratado por el volumen tumoral promedio del grupo control (T/C).
RESUMEN DE RESULTADOS Y ANÁLISIS
En este estudio, la eficacia terapéutica de I-3a, I-7, I-4a e I-8 se evaluó en el modelo de xenoinjerto HT1080. Los cambios de peso corporal medidos se muestran en la Figura 9. El volumen tumoral de todos los grupos de tratamiento en diversos momentos se muestra en las Tablas A, B y Figura 10.
El volumen tumoral medio de los ratones tratados con vehículo alcanzó 1468 mm3 el día 14. I-3a a 1 mg/kg (TV 0 mm3, TGI=111,1 %, p<0,001), 3 mg/kg (TV 0 mm3, TGI=111,1 %, p<0,001) y 10 mg/kg (TV 0 mm3, TGI=111,1 %, p<0,001) erradicaron completamente los tumores el día 14.
1-7 a 1 mg/kg (TV 661 mm3, TGI=61,0 %, p<0,05), 3 mg/kg (TV 172 mm3, TGI=98,2 %, p<0,001) y 10 mg/kg (TV 0 mm3, TGI=111,3 %) produjo actividad antitumoral dependiente de la dosis. 2/3 de los ratones tratados con 1-7 a 10 mg/kg murieron durante el período de dosificación.
I-4a a 1 mg/kg (TV 837 mm3, TGI=47,8 %, p > 0,05), 3 mg/kg (TV 468 mm3, TGI=75,9 %, p<0,01) y 10 mg/kg (TV 194 mm3, TGI=96,9 %, p<0,001) produjo actividad antitumoral dependiente de la dosis.
1-8 a 1 mg/kg, 3 mg/kg y 10 mg/kg no mostró actividad antitumoral evidente. 1/3 de los ratones tratados con 1-8 a 1 mg/kg mostraron ulceración tumoral grave y 1/3 de los ratones tratados con I-8 a 3 mg/kg murieron el día 14. La pérdida de peso corporal y la muerte de los animales en este estudio deberían deberse a la combinación de tratamientos con BDC y la carga tumoral HT1080.
Ejemplo 14:
PRUEBA DE EFICACIAIN VIVODE I-12 E I-16 EN EL TRATAMIENTO DE XENOINJERTO HT1080 EN RATONES DESNUDOS BALB/C
OBJETIVOS DEL ESTUDIO
El objetivo de la investigación fue evaluar la eficacia antitumoralin vivode I-12 y 1-16 en el tratamiento del modelo de xenoinjerto HT1080 en ratones desnudos BALB/c.
DISEÑO EXPERIMENTAL
MATERIALES ANIMALES Y CONDICIÓN DE ALOJAMIENTO
Animales
Especie:Mus musculus
Raza: Balb/c desnudo
Edad: 6-8 semanas
Sexo: hembra
Peso corporal: 18-22 g
Número de animales: 21 ratones más repuesto
CONDICIÓN DE ALOJAMIENTO
Los ratones se mantuvieron en jaulas de ventilación individuales a temperatura y humedad constantes con 3 animales en cada jaula.
• Temperatura: 20-26 °C.
• Humedad del 40-70 %.
Jaulas: Hechas de policarbonato. El tamaño es de 300 mm x 180 mm x 150 mm. El material del lecho es mazorca de maíz, que se cambia dos veces por semana.
Dieta: Los animales tuvieron libre acceso a alimentos granulados secos esterilizados por irradiación durante todo el período del estudio.
Agua: Los animales tuvieron libre acceso a agua potable esterilizada.
Identificación de jaulas: Las etiquetas de identificación de cada jaula contenían la siguiente información: número de animales, sexo, raza, la fecha de recepción, tratamiento, número de estudio, número de grupo y la fecha de inicio del tratamiento.
Identificación del animal: Los animales fueron marcados mediante codificación en la oreja.
ARTÍCULOS DE PRUEBA Y CONTROL POSITIVO
Identificación de producto: I-12
Descripción física: Polvo liofilizado
Peso molecular: 5,3 mg
Pureza: 97,76 %
Condiciones de embalaje y almacenamiento: almacenado a -80 °C
Identificación de producto: 1-16
Descripción física: Polvo liofilizado
Peso molecular: 7,6 mg
Pureza: 98,36 %
Condiciones de embalaje y almacenamiento: almacenado a -80 °C
MÉTODOS EXPERIMENTALES Y PROCEDIMIENTOS
CULTIVO CELULAR
Las células tumorales HT1080 se mantuvieronin vitrocomo un cultivo en monocapa en medio suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % a 37 °C en una atmósfera de CO<2>al 5 % en aire. Las células tumorales se subcultivaron de forma rutinaria dos veces por semana mediante tratamiento con tripsina-EDTA. Las células creciendo en una fase de crecimiento exponencial se recogieron y se contaron para la inoculación del tumor.
INOCULACIÓN DEL TUMOR
Cada ratón se inoculó por vía subcutánea en el flanco derecho con las células tumorales HT1080 ( 5 x 106) en 0,2 ml de PBS para el desarrollo de tumores. Se aleatorizaron 21 animales cuando el volumen tumoral promedio alcanzó 174 mm3. La administración del artículo de prueba y el número de animales en cada grupo se muestran en la tabla de diseño experimental.
PREPARACIÓN DE LA FORMULACIÓN DEL ARTICULO DE PRUEBA
OBSERVACIONES
Todos los procedimientos relacionados con el manejo de animales, el cuidado y el tratamiento en el estudio se realizaron siguiendo las directrices de la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC). En el momento del seguimiento de rutina, se comprobó en los animales diariamente cualquier efecto del crecimiento del tumor y los tratamientos sobre la conducta normal tales como movilidad, consumo de alimentos y agua (solo mirando), aumento/pérdida de peso corporal, ojos/cabello mates y cualquier otro efecto anormal según lo establecido en el protocolo. La muerte y los signos clínicos observados se registraron basándose el número de animales dentro de cada subconjunto.
MEDICIONES DE TUMORES Y LOS CRITERIOS DE VALORACIÓN
El criterio de valoración principal era ver si se podía retrasar el crecimiento del tumor o si se podía curar a los ratones. El volumen tumoral se midió tres veces por semana en dos dimensiones utilizando un calibre y el volumen se expresó en mm3 usando la fórmula: V = 0,5axb2dondeaybson los diámetros largo y corto del tumor, respectivamente. El tamaño tumoral se usó después para cálculos del valor de T/C. El valor de T/C (en porcentaje) es una indicación de la eficacia antitumoral; T y C son los volúmenes medios de los grupos tratados y de control, respectivamente, en un día dado.
TGI se calculó para cada grupo usando la fórmula: TGI (%) = [1-(Ti-T0)/ (Vi-V0)] x100; Ti es el volumen tumoral promedio de un grupo de tratamiento en un día dado, T0 es el volumen tumoral promedio del grupo de tratamiento en el día del inicio del tratamiento, Vi es el volumen tumoral promedio del grupo control vehículo en un día dado con Ti, y V0 es el volumen tumoral promedio del grupo vehículo el día de agrupamiento.
RECOGIDA DE MUESTRAS
Al final del estudio se recogió plasma a los 5 min, 15 min, 30 min, 60 min y 120 min después de la dosificación. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Las estadísticas de resumen, incluyendo la media y el error típico de la media (SEM), se proporcionan para el volumen tumoral de cada grupo en cada momento.
El análisis estadístico de la diferencia en el volumen tumoral entre los grupos se realizó a partir de los datos obtenidos en el mejor momento terapéutico después de la dosis final.
Se realizó un ANOVA de una vía para comparar la bioluminiscencia entre grupos y cuando se obtuvo un estadístico F significativo (una proporción entre la varianza del tratamiento y la varianza del error), las comparaciones entre grupos se realizaron con la prueba de Games-Howell. Todos los datos se analizaron usando Prism.P< 0,05se consideró ser estadísticamente significativo.
RESULTADOS CAMBIO DE PESO CORPORAL Y CURVA DE CRECIMIENTO TUMORAL
El peso corporal y el crecimiento tumoral se muestran en las Figuras 11 y 12.
TRAZO DEL VOLUMEN TUMORAL
El volumen medio del tumor a lo largo del tiempo en ratones hembra Balb/c desnudos portadores de xenoinjerto HT1080 se muestra en la Tabla C.
__________ TABLA C. TRAZO DEL VOLUMEN TUMORAL A LO LARGO DEL TIEMPO
Gr. Tratamiento Días después del inicio del tratamiento
0 2 4 7 9 11 14
1 Vehículo, biw 174±18 318±30 473±31 688±87 859±148 975±167 1075±164 2 I-12, 1 mpk, qw 175±19 234±25 112±36 151±35 182±25 165±17 310±17 3 I-4a, 3 mpk, qw 173±24 162±25 50±8 18±0 10±5 0±0 0±0
4 I-3 a, 10 mpk, qw 174±23 208±61 121 ±0 32±0
5 I-16, 1 mpk, biw 174±22 265±46 351±69 488±75 577±62 676±79 785±58 6 I-4a, 3 mpk, biw 174±25 151±16 73±19 42±11 50±4 67±9 128±16 7 I-3 a, 10 mpk, biw 173±25 153±29 58±20 27±1 18±4 10±1 2±2 ANÁLISIS DE INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO TUMORAL
La tasa de inhibición del crecimiento tumoral para I-12, I-16 en el modelo de xenoinjerto HT1080 se calculó en función de las mediciones del volumen tumoral el día 14 después del inicio del tratamiento.
TABLA D. ANÁLISIS DE INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO TUMORAL
Gr Tratamiento Volumen tumoral (mm3)a T/Cb (%) TGI (%) Valor deP1 Vehículo, biw 1075±164 -- -- --2 I-12, 1 mpk, qw 310±17 29 85 p<0,001 3 I-4a, 3 mpk, qw 0 0 119 p<0,001 4 I-12, 10 mpk, qw -- -- -- --5 I-16, 1 mpk, biw 785±58 73 32 p>0,05 6 I-4a, 3 mpk, biw 128±16 12 105 p<0,001 7 I-3 a, 10 mpk, biw 2±2 0,2 119p<0,001 a. Media ± SEM.
b. La inhibición del crecimiento tumoral se calcula dividiendo el volumen tumoral promedio del grupo tratado por el volumen tumoral promedio del grupo control (T/C).
RESUMEN DE RESULTADOS Y ANÁLISIS
En este estudio, la eficacia terapéutica de I-12, I-16 se evaluó en el modelo de xenoinjerto HT1080. Los pesos corporales medidos y los volúmenes tumorales de todos los grupos de tratamiento en diversos momentos se muestran en las Figuras 11 y 12 y en las Tablas C y D.
El tamaño medio del tumor de los ratones tratados con vehículo alcanzó 1075 mm3 el día 14. I-12 a 1 mg/kg (TV=310 mm3, TGI=85,0 %, p<0,001) mostró una actividad antitumoral significativa y erradicó completamente los tumores a la dosis de 3 mg/kg (TV=0 mm3, TGI=119,2 %, p<0,001), I-12 a 10 mg/kg provocó una pérdida grave de peso corporal y la muerte de 3/3 de los animales.
I-16 a 1 mg/kg (TV=785 mm3, TGI=32,2 %, p>0,05), 3 mg/kg (TV= 128 mm3, TGI=105,1 %, p<0,001) y 10 mg/kg (TV=2 mm3, TGI=84,3 %, p<0,001) produjo actividad antitumoral dependiente de la dosis. Entre ellos, I-16 a 10 mg/kg provocó la remisión completa de 2/3 de los tumores y la regresión de 1/3 del tumor a 7 mm3 el día 14.

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto de fórmula I:
  2. en donde: Biciclo es un polipéptido que está unido covalentemente a un andamio molecular de tal manera que dos o más bucles peptídicos están subtendidos entre los puntos de unión al andamio, en donde el polipéptido tiene una secuencia: (SEQ ID NO: 5), el andamio molecular es El espaciador es un resto bivalente que conecta el resto Biciclo con el resto AA1-AA2; AA1-AA2 es -Val-Cit- o -Cit-Val-; El enlazador es un resto espaciador bivalente que conecta el resto AA1-AA2 con el resto Toxina; y Toxina es un agente quimioterapéutico. 2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el andamio molecular
  3. 3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el andamio molecular e
  4. 4. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el Biciclo es:
  5. 5. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde erlesto Espaciador es
  6. 6. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el resto Espaciador es:
  7. 7. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el resto AA1-AA2 es -Cit-Val-.
  8. 8. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el resto Enlazador es
  9. 9. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la Toxina se selecciona del grupo que consiste en MMAE, MMAF, DM1, DM4, SN38, doxorrubicina y un análogo de duocarmicina.
  10. 10. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho compuesto se selecciona de
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