ES2984652T3

ES2984652T3 - Conjugados de proteínas de nanoporos para la detección y análisis de analitos

Info

Publication number: ES2984652T3
Application number: ES19706426T
Authority: ES
Inventors: Mark R Ambroso; Kapil M S Bajaj; Timothy K Craig
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2018-02-15
Filing date: 2019-02-13
Publication date: 2024-10-30
Anticipated expiration: 2039-02-13
Also published as: WO2019158548A1; CN111801344B; CN111801344A; JP7437456B2; EP3752522B1; JP2021513962A; KR20200119291A; JP2022169555A; US20210033591A1; EP3752522A1

Abstract

Se proporcionan métodos, composiciones y sistemas para la detección de un analito objetivo. También se proporcionan métodos, composiciones y sistemas para determinar la concentración de uno o más analitos objetivo en una solución fluida. Las composiciones incluyen conjugados de nanoporos en los que un monómero de proteína de nanoporo se une a una etiqueta de captura. Unido al conjugado de proteína de nanoporo hay un ligando de analito dirigido a un analito específico. Cuando se aplica un voltaje a través de un conjunto de nanoporos que incluye el conjugado de nanoporos, el nanoporo captura la etiqueta de captura a una velocidad de captura dada. Sin embargo, en presencia del analito en el ligando de analito, la velocidad de captura de la etiqueta de captura cambia, permitiendo así la detección del analito por el conjunto de nanoporos. Además, en función de la velocidad de captura asociada con la unión entre el analito y el ligando de analito, la concentración del analito se puede determinar utilizando cinética de asociación/disociación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Conjugados de proteínas de nanoporos para la detección y análisis de analitos

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad a la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 62/630.993, presentada el 15 de febrero de 2018, titulada "NANOPORE PROTEIN CONJUGATES FOR DETECTION AND ANALYSIS OF ANALYTES".

Listado de secuencias

La presente solicitud contiene un listado de secuencias que se ha presentado electrónicamente en formato ASCII.

Dicha copia ASCII, creada el 16 de enero de 2019, se llama 08485_001W01_SL.txt y tiene un tamaño de 29.354 bytes.

Campo técnico

La presente divulgación se refiere, en general, a procedimientos, composiciones y sistemas para la detección de un analito diana y, más en particular, al uso de conjugados de proteínas de nanoporos para identificar un analito en una solución líquida y para determinar la concentración del analito en la solución.

Antecedentes

Los componentes biológicamente activos, tales como moléculas pequeñas, proteínas, antígenos, inmunoglobulinas y ácidos nucleicos, participan en numerosos procesos y funciones biológicas. Por consiguiente, cualquier alteración en el nivel de dichos componentes puede dar lugar a enfermedades o acelerar el proceso de enfermedad. Por este motivo, se ha invertido mucho esfuerzo en desarrollar procedimientos fiables para detectar e identificar rápidamente componentes biológicamente activos para su uso en el diagnóstico y tratamiento de pacientes. Por ejemplo, la detección de una proteína o una molécula pequeña en una muestra de sangre u orina se puede usar para evaluar el estado metabólico de un paciente. De forma similar, la detección de un antígeno en una muestra de sangre u orina se puede usar para identificar patógenos a los que se ha expuesto un paciente, facilitando por tanto un tratamiento apropiado. Y con los avances más recientes en la identificación de ADN extracelular circulante fetal, ahora es posible diagnosticar prenatalmente determinados trastornos genéticos a partir de una muestra de sangre de la madre a través de la detección de ADN extracelular circulante. Es además beneficioso poder determinar la concentración de un analito en solución. Por ejemplo, determinar la concentración de un componente en sangre u orina puede permitir comparar el componente con un valor de referencia, facilitando por tanto una evaluación adicional del estado de salud de un paciente.

No obstante, si bien están disponibles numerosos procedimientos de detección e identificación, muchos son costosos y pueden llevar bastante tiempo. Por ejemplo, muchas pruebas diagnósticas pueden tardar varios días en completarse y requieren significativos recursos de laboratorio. Y en algunos casos, los retrasos en el diagnóstico pueden afectar negativamente la atención al paciente, tal como en el análisis de marcadores asociados con el infarto de miocardio. Además, la complejidad de muchas pruebas diagnósticas destinadas a identificar componentes biológicamente activos se presta a errores, reduciendo por tanto la exactitud. Y muchos procedimientos de detección e identificación solo pueden analizar uno o unos pocos componentes biológicos activos a la vez (y no pueden determinar la concentración).

Lo que se necesita son procedimientos, composiciones y sistemas adicionales que puedan detectar e identificar rápidamente componentes biológicamente activos, especialmente de una manera eficaz y rentable. También se necesitan procedimientos, composiciones y sistemas que puedan someter a ensayo múltiples componentes biológicamente activos al mismo tiempo, reduciendo por tanto los costes. Además, se necesitan procedimientos, composiciones y sistemas para determinar la concentración de un componente biológicamente activo en una solución líquida.

Sumario

La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto. En determinados aspectos de ejemplo, se proporciona un conjugado de proteína de nanoporo que incluye un monómero proteínico de nanoporo y una marca de captura. Por ejemplo, el conjugado de proteína de nanoporo puede incluir una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 %, 65 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % o más de identidad de secuencia con respecto a la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 7.

En determinados aspectos de ejemplo, se proporciona un complejo de detección de analito que incluye el conjugado de proteína de nanoporo. Por ejemplo, el complejo de detección de analito incluye un ligando de analito que se une al conjugado de proteína de nanoporo, tal como por medio de un enlace isopeptídico.

En determinados aspectos de ejemplo, se proporciona un ensamblaje de nanoporo que incluye al menos un complejo de detección de analito. Por ejemplo, el ensamblaje de nanoporo puede ser un ensamblaje de nanoporo heptamérico que incluye un complejo de detección de analito. En determinados aspectos de ejemplo, el monómero de nanoporo del conjugado es un monómero de alfa-hemolisina y cada uno de los otros seis monómeros del heptámero son monómeros de alfa-hemolisina.

En determinados aspectos de ejemplo, se proporciona un procedimiento para detectar un analito en una solución líquida. El procedimiento incluye proporcionar un genochip que incluye un ensamblaje de nanoporo como se describe en el presente documento. Por ejemplo, el ensamblaje de nanoporo incluye un complejo de detección de analito, incluyendo el complejo de detección de analito un monómero de nanoporo, una marca de captura y un ligando de analito. Además, el ensamblaje de nanoporo se dispone dentro de una membrana del genochip. A continuación se coloca un electrodo sensor contiguo a o en proximidad a la membrana. Se determina una primera tasa de captura de la marca de captura con la ayuda de un procesador informático y el electrodo sensor. A continuación, el ensamblaje de nanoporo se pone en contacto con un analito, teniendo el analito una afinidad de unión al ligando de analito del complejo de detección de analito. Usando el procesador informático y el electrodo sensor, se determina a continuación una segunda tasa de captura de la marca de captura. La segunda tasa de captura, por ejemplo, proporciona una indicación de que el analito está unido al ligando de analito del complejo de detección de analito y, por consiguiente, el analito está presente en la solución líquida. La segunda tasa de captura, por ejemplo, puede ser menor que o mayor que la primera tasa de captura. Además, en base a la identidad del ligando de analito, y a la indicación de que el analito está unido al ligando de analito, se puede determinar la identidad del analito.

En otros aspectos de ejemplo, se proporciona un procedimiento para determinar la concentración de un analito en una solución líquida. El procedimiento incluye proporcionar un genochip que tiene un ensamblaje de nanoporo como se describe en el presente documento, disponiéndose el ensamblaje de nanoporo dentro de una membrana. El ensamblaje de nanoporo incluye, por ejemplo, un complejo de detección de analito, incluyendo el complejo de detección de analito un monómero de nanoporo, una marca de captura y un ligando de analito. Un electrodo sensor se sitúa contiguo o en proximidad a la membrana. Después de esto, y con la ayuda de un procesador informático y el electrodo sensor, se determina una primera tasa de captura de la marca de captura del ensamblaje de nanoporo. A continuación, el ensamblaje de nanoporo se pone en contacto con un analito, teniendo el analito una afinidad de unión por el ligando de analito del complejo de detección de analito. Con la ayuda del procesador informático y el electrodo sensor, se identifica una primera transición de la primera tasa de captura a una segunda tasa de captura de la marca de captura del complejo de detección de analito. A continuación, con la ayuda del procesador informático y el electrodo sensor, se identifica una segunda transición de la segunda tasa de captura a una tasa de captura que se aproxima a la primera tasa de captura. En base al menos en parte a la identificación de la primera transición y la segunda transición, se determina a continuación la concentración del analito en la solución líquida. Por ejemplo, el intervalo de tiempo entre las tasas de transición se puede usar para determinar la concentración del analito.

Todavía en otros aspectos de ejemplo, se proporciona un sistema para determinar la concentración de analito en una solución líquida. El sistema también se puede usar para detectar un analito en solución. El sistema incluye, por ejemplo, un genochip que tiene un ensamblaje de nanoporo que se dispone dentro de una membrana del genochip. El ensamblaje de nanoporo, por ejemplo, incluye al menos un monómero proteínico de nanoporo que tiene una marca de captura y un ligando de analito. El sistema incluye además un electrodo sensor situado contiguo a o en proximidad a la membrana. El electrodo sensor, por ejemplo, se configura para detectar una señal del ensamblaje de nanoporo. El sistema incluye además un procesador informático que, junto con el electrodo sensor, se configura para identificar una primera transición y una segunda transición asociadas con el ensamblaje de nanoporo. La primera transición corresponde, por ejemplo, a la unión de un analito al ligando de analito. La segunda transición corresponde, por ejemplo, a la disociación del analito del ligando de analito.

En determinados aspectos de ejemplo del sistema, se determina una concentración del analito en la solución líquida en base al menos en parte a la primera transición identificada y la segunda transición identificada. En determinados aspectos de ejemplo del sistema, el monómero proteínico de nanoporo es un monómero de alfahemolisina o un monómero de OmpG. En determinados aspectos de ejemplo, el monómero proteínico de nanoporo incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o más de identidad de secuencia con respecto a la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 7. En determinados aspectos de ejemplo, la marca de captura incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o más de identidad de secuencia con respecto a la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 8.

Estos y otros aspectos, objetivos, rasgos característicos y ventajas de los modos de realización de ejemplo resultarán evidentes para los expertos en la técnica tras considerar la siguiente descripción detallada de los modos de realización de ejemplo ilustrados.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una ilustración que muestra un conjugado de proteína de nanoporo, de acuerdo con determinados modos de realización de ejemplo.

La figura 2 es una ilustración que muestra un complejo de detección de analito, de acuerdo con determinados modos de realización de ejemplo.

La figura 3 es una ilustración que muestra un ensamblaje de nanoporo que incluye un complejo de detección de analito, de acuerdo con determinados modos de realización de ejemplo.

Las figuras 4A-4C son ilustraciones que muestran estados de poro diferentes que están asociados con tasas de captura diferentes, de acuerdo con determinados modos de realización de ejemplo. Más en particular, la figura 4A muestra un ensamblaje de nanoporo que incluye un conjugado de proteína de nanoporo, pero que no incluye un ligando de analito (y, por consiguiente, no incluye un complejo de detección de analito). Un poro de este tipo está asociado con una tasa de captura de referencia de la marca de captura (línea continua frente a línea discontinua, que muestra la captura). La figura 4B muestra el mismo ensamblaje de nanoporo, pero con un ligando de analito (por ejemplo, un nanocuerpo) fijado. Por consiguiente, el ensamblaje de nanoporo de la figura 4B incluye un complejo de detección de analito. El ensamblaje de nanoporo de la figura 4B se asocia con una primera tasa de captura de la marca de captura (línea continua frente a línea discontinua, que muestra la captura). La figura 4C muestra el mismo poro que en la figura 4B, pero ahora con el analito (por ejemplo, un antígeno al nanocuerpo) fijado. Un poro de este tipo se asocia con una segunda tasa de captura de la marca de captura (línea continua frente a línea discontinua, que muestra la captura).

Las figuras 5A-5C son gráficos que muestran diversas tasas de captura, ya que esas tasas corresponden a un estado de unión del ensamblaje de nanoporo, de acuerdo con determinados modos de realización de ejemplo. Más en particular, la figura 5A es un gráfico que muestra la medición de una tasa de captura de referencia. La figura 5B es un gráfico que muestra la medición de una primera tasa de captura en la que un ligando de analito se unió al conjugado de proteína de nanoporo del ensamblaje de nanoporo, formando de este modo un complejo de detección de analito. En la figura 5B, no hay ningún analito presente. La figura 5C muestra la medición de las tasas de captura para la primera tasa de captura (sin analito unido) y la segunda tasa de captura (analito unido). También se muestra una primera transición de la primera tasa de captura a la segunda tasa de captura y una segunda transición de la segunda tasa de captura de regreso a la primera tasa de captura.

Descripción detallada de los modos de realización de ejemplo

Los modos de realización descritos en el presente documento se pueden entender más fácilmente por referencia a la siguiente descripción detallada, ejemplos y reivindicaciones, y su descripción previa y siguiente. Antes de divulgar y describir el presente sistema, dispositivos, composiciones y/o procedimientos, se ha de entender que los modos de realización descritos en el presente documento no se limitan a los sistemas, dispositivos y/o procedimientos de composiciones específicos divulgados a menos que se especifique de otro modo, ya que estos, por supuesto, pueden variar. También se ha de entender que la terminología usada en el presente documento es solo para describir aspectos particulares y no pretende ser limitante.

Además, la siguiente descripción se proporciona como enseñanza habilitante de los diversos modos de realización en su mejor aspecto actualmente conocido. Los expertos en la técnica pertinente reconocerán que se pueden realizar muchos cambios a los aspectos descritos, mientras todavía se obtienen los resultados beneficiosos de la presente divulgación. También será evidente que algunos de los beneficios deseados de la presente invención se pueden obtener seleccionando algunos de los rasgos característicos de los diversos modos de realización sin utilizar otros rasgos característicos. En consecuencia, los que trabajan en la técnica reconocerán que son posibles muchas modificaciones y adaptaciones a los diversos modos de realización descritos en el presente documento e incluso pueden ser deseables en determinadas circunstancias y son parte de la presente divulgación. Por tanto, la siguiente descripción se proporciona como ilustrativa de los principios de los modos de realización descritos en el presente documento y no como limitación de los mismos.

Visión general

Como se divulga en el presente documento, se proporcionan procedimientos, composiciones y sistemas para la detección de un analito diana. También se proporcionan procedimientos, composiciones y sistemas para determinar la concentración de uno o más analitos diana en una solución líquida. Las composiciones incluyen conjugados de nanoporos en los que un monómero proteínico de nanoporo se une a una marca de captura. Al conjugado de proteína de nanoporo se liga un ligando de analito que se puede dirigir a un analito específico. Como se describe en el presente documento, cuando se aplica un voltaje a través de un ensamblaje de nanoporo que incluye el conjugado de nanoporo, el nanoporo captura la marca de captura a una tasa de captura dada. Sin embargo, en presencia del analito para el ligando de analito, la tasa de captura de la marca de captura cambia, permitiendo por tanto la detección del analito por el ensamblaje de nanoporo. Además, en base a la tasa de captura asociada con la unión entre el analito y el ligando de analito, la concentración del analito se puede determinar en determinados ejemplos.

Más en particular, el monómero proteínico de nanoporo del conjugado de nanoporo descrito en el presente documento puede ser cualquier tipo de monómero proteínico de nanoporo biológico. Por ejemplo, el monómero proteínico de nanoporo puede ser un monómero de alfa-hemolisina (a-HL), un monómero de OmpG u otro monómero de nanoporo proteínico. Cuando el monómero proteínico de nanoporo es alfa-hemolisina, por ejemplo, el conjugado de proteína de nanoporo resultante es un conjugado proteínico de alfa-hemolisina/marca de captura.

Usando un monómero de nanoporo de alfa-hemolisina para formar el conjugado, por ejemplo, el monómero de alfa-hemolisina del conjugado está disponible para oligomerizarse con otros monómeros de a-HL, formando de este modo un ensamblaje de nanoporo heptamérico. El ensamblaje heptamérico, por ejemplo, puede tener un conjugado de alfa-hemolisina/marca de captura y seis monómeros de alfa-hemolisina, tales como seis monómeros de alfa-hemolisina naturales. En dichos ejemplos, la marca de captura del conjugado proteínico se configura para interactuar con el ensamblaje de nanoporo heptamérico en presencia de un voltaje. En determinados ejemplos, la marca de captura se fusiona a una alfa-hemolisina por medio de una secuencia conectora durante la síntesis del monómero de alfa-hemolisina, formando de este modo el conjugado de proteína de nanoporo. La marca de captura, por ejemplo, es cualquier molécula que el nanoporo pueda capturar y liberar, dando como resultado de este modo una tasa de captura detectable.

Además de incluir una marca de captura, el conjugado de proteína de nanoporo se liga a un ligando de analito. El ligando de analito, por ejemplo, puede ser cualquier ligando que se una a un analito. En determinados ejemplos, el ligando de analito es un nanocuerpo, tal como un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a un antígeno o fragmento del mismo cuando está en presencia del antígeno. El ligando de analito se puede unir al conjugado de proteína de nanoporo directa o indirectamente, tal como por medio de una secuencia conectora peptídica. Por ejemplo, el conjugado de proteína de nanoporo puede incluir una región para ligar un ligando de analito al ensamblaje de nanoporo. En determinados ejemplos, el conjugado de proteína de nanoporo puede incluir una secuencia SpyTag. En dichos ejemplos, el ligando de analito se puede unir a una secuencia SpyCatcher. Por consiguiente, el ligando de analito se puede ligar al conjugado de proteína de nanoporo por medio de un enlace SpyTag/SpyCatcher. En determinados ejemplos, la marca de captura descrita en el presente documento se puede unir al ligando de analito.

Cuando se ensambla en una membrana de un genochip, se puede usar un ensamblaje de proteína de nanoporo que incluye un conjugado de proteína de nanoporo y un ligando de analito como se describe en el presente documento para identificar un analito en una solución líquida y/o para determinar la concentración del analito. Sin quedar vinculado a ninguna teoría particular, cuando el genochip se pone en contacto con una solución líquida que contiene el analito, se cree que la proximidad del par de unión analito-ligando a la marca de captura altera la interacción de la marca de captura con el poro, afectando por tanto la tasa de captura de la marca de captura. Un electrodo que está cerca de la membrana puede detectar a continuación el cambio en la tasa de captura, proporcionando por tanto una indicación de que el analito está unido al ligando de analito y, por consiguiente, el ligando está presente en la solución líquida. Además, usando la cinética de asociación/disociación, se puede determinar la concentración del analito en base a la tasa de captura de la marca de captura. Es decir, los cambios en las tasas de captura se pueden usar para determinar la Ka y/o la Kd para el analito y, con otras variables conocidas, la Ka y/o la Kd determinada se puede usar para determinar la concentración del analito en la solución líquida.

En otros ejemplos, se pueden usar ensamblajes proteínicos de nanoporos diferentes que están dirigidos a analitos diferentes en un único genochip para detectar y/o determinar la concentración de analitos diferentes en el mismo genochip. En dichos ejemplos, los ensamblajes proteínicos de nanoporos diferentes se pueden configurar para producir señales diferentes que son detectables por el electrodo sensor. Por ejemplo, se pueden usar diversos parámetros, tales como el tamaño del canal de poro abierto del poro, marcas de captura diferentes y/o la colocación de marcas de captura adicionales en el lado trans de la membrana, para alterar la señal de referencia que genera un conjunto de poros dado. Con dichas configuraciones, por ejemplo, un poro con una abertura más grande puede proporcionar una señal más fuerte que un poro con una abertura más pequeña, permitiendo por tanto la diferenciación de los poros en el mismo genochip. A continuación, los poros diferentes se pueden correlacionar con los analitos para los que se configuran para detectar, permitiendo por tanto la identificación de analitos diferentes en el mismo genochip. Además, la concentración de cada analito detectado se puede determinar como se describe en el presente documento usando cinética de asociación/disociación.

Sumario de términos

La invención se describirá ahora en detalle a modo de referencia usando solo las siguientes definiciones y ejemplos. A menos que se defina de otro modo en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento se puede usar en la práctica o pruebas de la presente invención, se describen los procedimientos y materiales preferentes. Se ha de entender que la presente invención no está limitada a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos, ya que estos pueden variar.

Los títulos proporcionados en el presente documento no son limitaciones de los diversos aspectos o modos de realización de la invención que se pueden tener por referencia a la memoria descriptiva como un todo. En consecuencia, los términos definidos inmediatamente a continuación se definen más completamente por referencia a la memoria descriptiva como un todo.

Como se usa en el presente documento, las formas en singular "un", "una" y "el/la" incluyen referentes al plural a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo.

Los intervalos o valores se pueden expresar en el presente documento como de "aproximadamente" un valor particular y/o a "aproximadamente" otro valor particular. Cuando se expresa un intervalo de este tipo, otro aspecto incluye del un valor particular del intervalo y/o al otro valor particular del intervalo. Se entenderá además que los criterios de valoración de cada uno de los intervalos son significativos tanto en relación con el otro criterio de valoración como independientemente del otro criterio de valoración. De forma similar, cuando los valores se expresan como aproximaciones, por el uso del antecedente "aproximadamente", se entenderá que el valor particular forma otro aspecto. En determinados modos de realización de ejemplo, el término "aproximadamente" se entiende como dentro de un intervalo de tolerancia normal en la técnica para una medición dada, por ejemplo, tal como dentro de 2 desviaciones estándar de la media. En determinados modos de realización de ejemplo, dependiendo de la medición, "aproximadamente" se puede entender como dentro de un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 % o 0,01 % del valor declarado. A menos que de otro modo esté claro del contexto, todos los valores numéricos proporcionados en el presente documento se pueden modificar por el término aproximadamente. Además, los términos usados en el presente documento, como "ejemplo", "ejemplar" o "ejemplificado", no pretenden mostrar preferencia, sino más bien explicar que el aspecto analizado después de esto es simplemente un ejemplo del aspecto presentado.

Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere ampliamente a cualquier molécula de inmunoglobulina (Ig) compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L), o cualquier fragmento funcional, mutante, variante o derivación de la misma, que conserva los rasgos característicos de unión a epítopo esenciales de una molécula de Ig. Dichas entidades de anticuerpo mutantes, variantes o derivadas son conocidas en la técnica. Un fragmento funcional del anticuerpo, por ejemplo, incluye una porción del anticuerpo que, cuando se separa del anticuerpo en su conjunto, conserva la capacidad de unirse o unirse parcialmente al antígeno al que está dirigido el anticuerpo. Un "nanocuerpo", por ejemplo, un fragmento de anticuerpo de dominio único.

Como se usa en el presente documento, el término "aminoácido" es un compuesto orgánico que contiene un grupo amino y un grupo ácido carboxílico. Un péptido o polipéptido contiene dos o más aminoácidos. Para los propósitos en el presente documento, los aminoácidos incluyen los veinte aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales y análogos de aminoácidos (es decir, aminoácidos en los que el carbono a tiene una cadena lateral).

Como se usa en el presente documento, "polipéptido", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier cadena polimérica de aminoácidos. Los términos "péptido" y "proteína" se usan de manera intercambiable con el término polipéptido y también se refieren a una cadena polimérica de aminoácidos. El término "polipéptido" engloba proteínas naturales o artificiales, fragmentos de proteínas y análogos de polipéptidos de una secuencia de proteínas. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico y puede incluir una serie de modificaciones. En general, un péptido o polipéptido tiene una longitud mayor que o igual a 2 aminoácidos y, en general, una longitud menor que o igual a 40 aminoácidos.

Como se usa en el presente documento, "alfa-hemolisina", "a-hemolisina", "a-HL", "a-HL" y "hemolisina" se usan de manera intercambiable y se refieren a la proteína monomérica que se autoensambla en un canal transmembranario lleno de agua heptamérico (es decir, nanoporo). Dependiendo del contexto, el término también se puede referir al canal transmembranario formado por siete proteínas monoméricas. En determinados modos de realización de ejemplo, la alfa-hemolisina es una "alfa-hemolisina modificada", lo que quiere decir que la alfahemolisina se originó de otra alfa-hemolisina (es decir, original) y contiene una o más alteraciones aminoacídicas (por ejemplo, sustitución, deleción o inserción aminoacídica) en comparación con la alfa-hemolisina original. En algunos modos de realización de ejemplo, una alfa-hemolisina modificada de la invención se origina o modifica a partir de una alfa-hemolisina natural. En algunos modos de realización de ejemplo, una alfa-hemolisina modificada se origina o modifica a partir de una alfa-hemolisina recombinante o genomanipulada incluyendo, pero sin limitarse a, alfa-hemolisina quimérica, alfa-hemolisina de fusión u otra alfa-hemolisina modificada. Típicamente, una alfahemolisina modificada tiene al menos un fenotipo cambiado en comparación con la alfa-hemolisina original. En determinados modos de realización de ejemplo, la alfa-hemolisina surge de un "gen de hemolisina variante" o es una "hemolisina variante", lo que quiere decir, respectivamente, que la secuencia de ácido nucleico del gen de alfa-hemolisina de Staphylococcus aureus se ha alterado retirando, añadiendo y/o manipulando la secuencia codificante o la secuencia de aminoácidos de la proteína expresada se ha modificado consecuente con la invención descrita en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, el término "analito" o "analito diana" se refiere ampliamente a cualquier compuesto, molécula u otra sustancia de interés que se va a detectar, identificar o caracterizar. Por ejemplo, el término "analito" o "analito diana" incluye cualquier molécula o agente fisiológico de interés que sea una sustancia o componente específico que se esté detectando y/o midiendo. En determinados modos de realización de ejemplo, el analito es un analito fisiológico de interés. Adicionalmente o de forma alternativa, el analito puede ser un producto químico que tenga una acción fisiológica, por ejemplo, o un fármaco o agente farmacológico. Adicionalmente o de forma alternativa, el analito o analito diana puede ser un agente ambiental u otro agente o entidad química. El término "agente" se usa en el presente documento para indicar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto preparado a partir de materiales biológicos. Por ejemplo, un agente puede ser un agente citotóxico.

En determinados modos de realización de ejemplo, el término "analitos" o "analitos diana" incluye toxinas, compuestos orgánicos, proteínas, péptidos, microorganismos, aminoácidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, hormonas, esteroides, vitaminas, fármacos (incluyendo los administrados con propósitos terapéuticos así como los administrados con propósitos ilícitos), lípidos, partículas de virus y metabolitos de o anticuerpos contra cualquiera de las sustancias anteriores. Por ejemplo, los analitos pueden incluir ferritina; creatinina cinasa MIB (CK-MIB); digoxina; fenitoína; fenobarbitol; carbamacepina; vancomicina; gentamicina; teofilina; ácido valproico; quinidina; hormona leutinizante (LH); hormona foliculoestimulante (FSH); estradiol, progesterona; anticuerpos IgE; microglobulina de vitamina B2; glucohemoglobina (Gly. Hb); cortisol; digitoxina; N-acetilprocainamida (NAPA); procainamida; anticuerpos contra la rubéola, tales como rubéola-IgG y rubéola-IgM; anticuerpos contra la toxoplasmosis, tales como toxoplasmosis-IgG (Toxo-IgG) y toxoplasmosis-IgM (Toxo-IgM); testosterona; salicilatos; paracetamol; antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg); anticuerpos contra el antígeno central del virus de la hepatitis B, tales como IgG e IgM anti-antígeno central del virus de la hepatitis B (anti-HBC); virus de inmunodeficiencia humana 1 y 2 (HTLV); antígeno c del virus de la hepatitis B (HBcAg); anticuerpos contra el antígeno e del virus de la hepatitis B (anti-Hbe); hormona estimulante del tiroides (TSH); tiroxina (T4); triyodotironina total (T3 total); triyodotironina libre (T3 libre); antígeno carcinoembrionario (CEA); y proteína alfa fetal (FA); y drogas y medicamentos de dispensación controlada, incluyendo pero sin pretender estar limitado a, anfetaminas; metanfetamina; barbitúricos tales como amobarbital, seobarbital, pentobarbital, fenobarbital y barbital; benzodiacepinas tales como Librium y Valium; canabinoides tales como hachís y marihuana; cocaína; fetanilo; LSD; metapualona; opiáceos tales como heroína, morfina, codina, hidromorfona, hidrocodona, metadona, oxicodona, oximorfona y opio; fenciclidina; y propoxifeno. El término analito también incluye cualquier sustancia antigénica, haptenos, anticuerpos, macromoléculas y combinaciones de los mismos.

Otros analitos de ejemplo o analitos diana incluyen folato, folato de glóbulos rojos, hierro, receptor de transferrina soluble, transferrina, vitamina B12, lactato deshidrogenasa, calcio óseo, osteocalcina N-MID, P1NP, fósforo, PTH, PTH (1-84), b-CrossLaps, vitamina D, apolipoproteína A1 cardíaca, apolipoproteína B, colesterol, CK, CK-MB, CK-<MB (masa), CK-MB (masa) urgente,>C<r>P<hs, cistatina C, dímero D, digitoxina cardíaca, digoxina, GDF-154,>colesterol de las HDL directo, homocisteína, hidroxibutirato deshidrogenasa, colesterol de las LDL directo, lipoproteína (a), mioglobina, mioglobina urgente, NT-proBNP, NT-proBNP urgente, 1 troponina I, 1 troponina I urgente, troponina T hs, troponina T hs urgente, coagulación AT III, dímero D, pruebas de drogas anfetaminas (éxtasis), benzodiacepinas, benzodiacepinas (suero), canabinoides, cocaína, etanol, metadona, metabolitos de metadona (EDDP), metacualona, opiáceos, oxicodona, 3-fenciclidina, propoxifeno, amilasa, ACTH, anti-Tg, anti-TPO, anti-TSH-R, calcitonina, cortisol, péptido C, FT3, FT4, hGH, hidroxibutirato deshidrogenasa, IGF-14, insulina, lipasa, PTH urgente, T3, T4, tiroglobulina (TG II), tiroglobulina de confirmación, TSH, captación de T, hormona antimuleriana de fertilidad, DHEA-S, estradiol, FSH, hCG, hCG plus beta, EH, progesterona, prolactina, SHBG, testosterona, hepatología AFP, fosfatasa alcalina (IFCC), fosfatasa alcalina (opc.), 3-ALT/GPT con Pyp, ALT/GPT sin Pyp, amoníaco, anti-VHC, AST/GOT con Pyp, AST/GOT sin Pyp, bilirrubina: directa, bilirrubina: total, acetilcolinesterasa, 3-butirilcolinesterasa, gamma-glutamil transferasa, glutamato deshidrogenasa, HBeAg, HBsAg, lactato deshidrogenasa, enfermedades infecciosas anti-VHA, IgM anti-VHA, anti-HBc, IgM anti-HBc, anti-HBe, HBeAg, anti-HBsAg, HBsAg, HBsAg de confirmación, HBsAg cuantitativo, anti-VHC, Chagas 4, IgG frente a CMV, avidez de IgG frente a CMV, IgM frente a CMV, HIV Combi PT, VIH-Ag, VIH-Ag de confirmación, IgG frente a VHS-1, IgG frente a VHS-2, HTLV-I/II, IgG frente al virus de la rubéola, IgM frente al virus de la rubéola, sífilis, IgG frente a toxoplasmosis, avidez de IgG frente a toxoplasmosis, IgM frente a toxoplasmosis, TPLA (sífilis), anti-CCP, ASLO, C3c, C4, ceruloplasmina, CRP (látex), haptoglobina, IgA, IgE, IgG, IgM, inmunoglobulina A de CSF, inmunoglobulina M de CSF, interleucina 6, cadenas ligeras kappa, cadenas ligeras kappa libres 6, 2,3, cadenas ligeras lambda, cadenas ligeras lambda libres 6, 2,3, transtirretina, procalcitonina, factor reumatoide, a1-glucoproteína ácida, a1 -antitripsina, bicarbonato (CO2), calcio, cloruro, fructosamina, glucosa, HbA1c (hemolizado), HbA1c (sangre completa), insulina, lactato, colesterol de las LDL directo, magnesio, potasio, sodio, proteína total, triglicéridos, triglicéridos blanqueados con glicerol, vitamina D total, fosfatasa ácida, AFP, CA 125, CA 15-3, CA 19-9, CA 72-4, calcitonina, Cyfra 21-1, hCG plus beta, HE4, cadenas ligeras kappa libres 6, 2,3, cadenas ligeras lambda libres 6, 2,3, NSE, proGRP, PSA libre, PSA total, SCC, S-100, tiroglobulina (TG II), tiroglobulina de confirmación, b2-microglobulina, albúmina (BCG) , albúmina (BCP), albúmina inmunitaria, creatinina (enzimática), creatinina (Jaffe), cistatina C, potasio, PTH, PTH (1-84), proteína total, proteína total, orina/CSF, urea/BUN, ácido úrico, a1-microglobulina, b2-microglobulina, acetaminofeno (paracetamol), amikacina, carbamacepina, ciclosporina, digitoxina, digoxina, everólimus, gentamicina, lidocaína, litio, ácido micofenólico-ISE, NAPA, fenobarbital, fenitoína, primidona, procainamida, quinidina, salicilato, sirólimus, tacrólimus, teofilina, tobramicina, ácido valproico, vancomicina, hormona antimuleriana, AFP, b-CrossLaps, DHEA-S, estradiol, FSH, IJhCG libre, hCG, hCG plus beta, hCG urgente, HE4, LH, osteocalcina N-MID, PAPP-A, P1GF, sFIt-1, P1NP, progesterona, prolactina, SHBG, testosterona, IgG frente a CMV, avidez de IgG frente a CMV, IgM frente a CMV, IgG frente al virus de la rubéola, IgM frente al virus de la rubéola, IgG frente a toxoplasmosis, avidez de IgG frente a toxoplasmosis y/o IgM frente a toxoplasmosis.

El término "ligando" o "ligando de analito" como se usa en el presente documento se refiere ampliamente a cualquier compuesto, molécula, grupo molecular u otra sustancia que se une a otra entidad (por ejemplo, receptor) para formar un complejo más grande. Por ejemplo, un ligando de analito es una entidad que tiene afinidad de unión por un analito, como se entiende ese término en la técnica y se define ampliamente en el presente documento. Los ejemplos de ligandos de analitos incluyen, pero no se limitan a, péptidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, anticuerpos o cualquier molécula que se une a receptores. En determinados ejemplos, el ligando forma un complejo con un analito para cumplir un propósito biológico. Como apreciarán los expertos en la técnica, la relación entre un ligando y su compañero de unión (por ejemplo, un analito) es función de la carga, la hidrofobia y la estructura molecular. La unión se puede producir por medio de una variedad de fuerzas intermoleculares, tales como enlaces iónicos, enlaces de hidrógeno y fuerzas de Van der Waals. En determinados ejemplos, el ligando o ligando de analito es un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que tiene afinidad de unión con un antígeno.

Como se usa en el presente documento, el término "ADN" se refiere a una molécula que comprende al menos un residuo de desoxirribonucleótido, como se entiende comúnmente en la técnica. Un "desoxirribonucleótido" es un nucleótido sin un grupo hidroxilo y en su lugar un hidrógeno en la posición 2' de un resto p-D-desoxirribofuranosa. El término engloba ADN bicatenario, ADN monocatenario, ADN con regiones tanto bicatenarias como monocatenarias, ADN aislado tal como ADN parcialmente purificado, ADN esencialmente puro, ADN sintético, ADN producido de forma recombinante, así como ADN alterado o ADN análogo, que difiere del ADN natural por la adición, deleción, sustitución y/o modificación de uno o más nucleótidos.

Como se usa en el presente documento, el término "unir", "unido", "enlazar", "enlazado" o "ligado" se refiere a cualquier procedimiento conocido en la técnica para conectar funcionalmente dos o más entidades, tales como conectar una proteína a una molécula de ADN o una proteína a una proteína. Por ejemplo, una proteína se puede enlazar a otra proteína por medio de un enlace covalente, tal como en una proteína de fusión recombinante, con o sin secuencias o dominios intermedios. Se pueden formar enlaces covalentes de ejemplo, por ejemplo, a través de interacciones SpyCatcher/SpyTag, conjugación cisteína-maleimida o química clic acida-alquino, así como otros medios conocidos en la técnica. Además, una molécula de ADN se puede enlazar a otra molécula de ADN por medio de la hibridación de secuencias de ADN complementarias.

Como se usa en el presente documento, el término "nanoporo" se refiere en general a un poro, canal o paso formado o de otro modo proporcionado en una membrana. Una membrana puede ser una membrana orgánica, tal como una bicapa lipídica, o una membrana sintética, tal como una membrana formada de un material polimérico. La membrana puede ser un material polimérico. El nanoporo se puede disponer contiguo o en proximidad a un circuito sensor o un electrodo acoplado a un circuito sensor, tal como, por ejemplo, un circuito con semiconductor de óxido metálico complementario (CMOS) o transistor de efecto campo (f Et ). En algunos modos de realización de ejemplo, un nanoporo tiene una anchura o diámetro característico del orden de 0,1 nanómetros (nm) a aproximadamente 1000 nm. Algunos nanoporos son proteínas. Los monómeros de alfa-hemolisina, por ejemplo, se oligomerizan para formar una proteína. La membrana incluye un lado trans (es decir, un lado orientado hacia el electrodo sensor) y un lado cis (es decir, un lado orientado hacia el contraelectrodo).

El término "molécula de ácido nucleico" o "ácido nucleico" incluye moléculas de ARN, ADN y ADNc. Se entenderá que, como resultado de la degeneración del código genético, se puede producir una multitud de secuencias de nucleótidos que codifican una proteína dada tal como alfa-hemolisina y/o variantes de la misma. La presente divulgación contempla cada posible secuencia de nucleótidos variante, que codifica alfa-hemolisina variante, de las que todas son posibles dada la degeneración del código genético.

El término "nucleótido" se usa en el presente documento, como se reconoce en la técnica, para incluir bases naturales (estándar) y bases modificadas bien conocidas en la técnica. Dichas bases se localizan, en general, en la posición 1' de un resto de glúcido nucleotídico. Los nucleótidos comprenden, en general, una base, un glúcido y un grupo fosfato.

Como se usa en el presente documento, "sintético", tal como con referencia a, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico sintético o un gen sintético o un péptido sintético se refiere a una molécula de ácido nucleico o molécula de polipéptido que se produce por procedimientos recombinantes y/o por procedimientos de síntesis química.

Como se usa en el presente documento, la producción por procedimientos recombinantes usando procedimientos de ADN recombinante se refiere al uso de procedimientos bien conocidos de biología molecular para expresar proteínas codificadas por ADN clonado. Por ejemplo, se pueden usar técnicas estándar para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos y cultivo y transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se pueden realizar de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se logra comúnmente en la técnica o como se describe en el presente documento. Las técnicas y procedimientos anteriores se pueden realizar, en general, de acuerdo con procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)).

Como se usa en el presente documento, "vector" (o plásmido) se refiere a elementos de ADN discretos que se usan para introducir ácido nucleico heterólogo en células para la expresión o bien la replicación del mismo. Los vectores típicamente siguen siendo episomales, pero se pueden diseñar para efectuar la integración de un gen o una porción del mismo en un cromosoma del genoma. También se contemplan vectores que son cromosomas artificiales, tales como cromosomas artificiales bacterianos, cromosomas artificiales de levaduras y cromosomas artificiales de mamíferos. La selección y uso de dichos vehículos son bien conocidos para los expertos en la técnica.

Como se usa en el presente documento, "expresión" se refiere en general al proceso por el que un ácido nucleico se transcribe en ARNm y se traduce en péptidos, polipéptidos o proteínas. Si el ácido nucleico se deriva de ADN genómico, la expresión puede, si se selecciona una célula u organismo huésped eucariota apropiado, incluir procesamiento, tal como corte y empalme del ARNm.

Como se usa en el presente documento, un "vector de expresión" incluye vectores que pueden expresar ADN que está enlazado de forma funcional con secuencias reguladoras, tales como regiones promotoras, que pueden efectuar la expresión de dichos fragmentos de ADN. Dichos segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y finalizadoras y, opcionalmente, pueden incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un potenciador, una señal de poliadenilación y similares. Los vectores de expresión se derivan en general de ADN plasmídico o vírico, o pueden contener elementos de ambos. Por tanto, un vector de expresión se refiere a una construcción de ADN o ARN recombinante, tal como un plásmido, un fago, virus recombinante u otro vector que, tras su introducción en una célula huésped apropiada, da como resultado la expresión del ADN clonado. Los vectores de expresión apropiados son bien conocidos para los expertos en la técnica e incluyen aquellos que son replicables en células eucariotas y/o células procariotas y aquellos que permanecen episomales o aquellos que se integran en el genoma de la célula huésped. Como se usa en el presente documento, vector también incluye "vectores de virus" o "vectores víricos". Los vectores víricos son virus genomanipulados que están enlazados de forma funcional a genes exógenos para transferir (como vehículos o lanzaderas) los genes exógenos en las células.

Por el término "célula huésped" se quiere decir una célula que contiene un vector y apoya la replicación, y/o transcripción o transcripción y traducción (expresión) de la construcción de expresión. Las células huésped pueden ser células procariotas, tales como E. coli o Bacillus subtilus, o células eucariotas tales como levaduras, células vegetales, de insecto, anfibio o mamífero. En general, las células huésped son procariotas, por ejemplo, E. coli.

Los términos "expresión celular" o "expresión génica celular" se refieren en general a los procesos celulares por los que se produce un polipéptido biológicamente activo a partir de una secuencia de ADN y presenta una actividad biológica en una célula. Como tal, la expresión génica implica procesos de transcripción y traducción, pero también puede implicar procesos postranscripcionales y postraduccionales que pueden influir en la actividad biológica de un gen o producto génico. Estos procesos incluyen, por ejemplo, la síntesis, el procesamiento y el transporte de ARN, así como la síntesis, el transporte y la modificación postraduccional de polipéptidos. Adicionalmente, los procesos que afectan las interacciones proteína-proteína dentro de la célula también pueden afectar la expresión génica como se define en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, el término "opcional" u "opcionalmente" quiere decir que se puede producir o no el acontecimiento o circunstancia descrito posteriormente, y que la descripción incluye casos donde se produce dicho acontecimiento o circunstancia y casos donde no. Por ejemplo, una etapa opcional de unir un complejo de detección de analito a un monómero de ensamblaje de nanoporo quiere decir que el complejo de detección de analitos se puede unir o no.

El término "fosfolípido", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula hidrófoba que comprende al menos un grupo de fósforo. Por ejemplo, un fosfolípido puede comprender un grupo que contiene fósforo y un grupo alquilo saturado o insaturado, opcionalmente sustituido con OH, COOH, oxo, amina o grupos arilo sustituidos o no sustituidos.

Como se usa en el presente documento, el término "membrana" se refiere a una lámina o capa de doble capa continua de moléculas lipídicas, en la que están incluidas proteínas de membrana. Las moléculas lipídicas de membrana son típicamente anfipáticas y, de la forma más espontánea, forman bicapas cuando se colocan en agua. Una "membrana fosfolipídica" se refiere a cualquier estructura compuesta por fosfolípidos alineados de modo que las cabezas hidrófobas de los lípidos apuntan en una dirección mientras que las colas hidrófilas apuntan en la dirección opuesta. Los ejemplos de membranas fosfolipídicas incluyen la bicapa lipídica de una membrana celular.

Como se usa en el presente documento, "identidad" o "identidad de secuencia" se refiere, en el contexto de una secuencia, a la similitud entre dos secuencias de ácidos nucleicos, o dos secuencias de aminoácidos, y se expresa en términos de la similitud entre las secuencias, de otro modo denominada identidad de secuencia. La identidad de secuencia se mide con frecuencia en términos de porcentaje de identidad (o similitud u homología); cuanto mayor sea el porcentaje, más similares serán las dos secuencias. Por ejemplo, un 80 % de homología quiere decir lo mismo que un 80 % de identidad de secuencia determinada por un algoritmo definido y, en consecuencia, un homólogo de una secuencia dada tiene más de un 80 % de identidad de secuencia en una longitud de la secuencia dada. Los niveles de ejemplo de identidad de secuencia incluyen, por ejemplo, un 80, 85, 90, 95, 98 % o más de identidad de secuencia con respecto a una secuencia dada, por ejemplo, la secuencia codificante para uno cualquiera de los polipéptidos según la invención, como se describe en el presente documento.

Los procedimientos de alineación de secuencias para su comparación son bien conocidos en la técnica. Diversos programas y algoritmos de alineación se describen en: Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981; Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443, 1970; Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988; Higgins y Sharp, Gene 73: 237-244, 1988; Higgins y Sharp, CABIOS 5: 151-153, 1989; Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16, 10881-90, 1988; Huang et al., Computer Appls. In the Biosciences 8, 155-65, 1992; y Pearson et al., Meth. Mol. Bio. 24, 307-31, 1994. Altschul et al. (J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990), presentan un examen detallado de procedimientos de alineación de secuencia y cálculos de homología.

La herramienta de búsqueda de alineación local básica (BLAST) de NCBI (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990) está disponible a partir de varias fuentes, incluyendo el National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD) y en internet, para su uso en relación con los programas de análisis de secuencia que incluyen, por ejemplo, el paquete de programas BLAST, tales como<b>L<a>STN, BLASTX y TBLASTX, BLAS<t>P y TBLASTN.

Las búsquedas de secuencias se llevan a cabo típicamente usando el programa BLASTN cuando se evalúa una secuencia de ácido nucleico dada en relación con las secuencias de ácido nucleico en GenBank DNA Sequences y otras bases de datos públicas. El programa BLASTX es preferente para buscar secuencias de ácido nucleico que se han traducido en todos los marcos de lectura frente a secuencias de aminoácidos en GenBank Protein Sequences y otras bases de datos públicas. Tanto BLASTN como BLASTX se ejecutan usando parámetros predeterminados de una penalización por hueco abierto de 11,0 y una penalización por hueco extendido de 1,0, y utilizan la matriz BLOSu M-62. (Véase, por ejemplo, Altschul, S. F., et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997).

En determinados modos de realización de ejemplo, se realiza una alineación preferente de secuencias seleccionadas para determinar el "% de identidad" entre dos o más secuencias, usando, por ejemplo, el programa CLUSTAL-W en MacVector versión 13.0.7, ejecutado con parámetros predeterminados, incluyendo una penalización por hueco abierto de 10,0, una penalización por hueco extendido de 0,1 y una matriz de similitud BLOSUM 30.

Como se usa en el presente documento, el término "variante" se refiere a una proteína modificada que presenta características alteradas cuando se compara con la proteína original, por ejemplo, conductancia iónica alterada.

Como se usa en el presente documento, el término "muestra" se usa en su sentido más amplio. Una "muestra biológica", como se usa en el presente documento, incluye, pero no se limita a, cualquier cantidad de una sustancia de un ser vivo o de un ser anteriormente vivo, tal como de un sujeto. Una muestra biológica puede incluir una muestra de origen líquido o tisular biológico obtenida in vivo o in vitro. Dichas muestras pueden proceder, sin limitación, de líquidos corporales, órganos, tejidos, fracciones y células aisladas de un sujeto biológico. Las muestras biológicas también pueden incluir extractos de una muestra biológica, tal como, por ejemplo, un extracto de un líquido biológico (por ejemplo, sangre u orina).

Como se usa en el presente documento, un "líquido biológico" o "muestra de líquido biológico" se refiere a cualquier líquido fisiológico (por ejemplo, sangre, plasma sanguíneo, esputo, líquido de lavado, líquido del cristalino ocular, líquido cefalorraquídeo, orina, semen, sudor, lágrimas, leche, saliva, líquido sinovial, líquido peritoneal, líquido amniótico), así como tejidos sólidos que, al menos en parte, se han convertido a una forma líquida a través de uno o más protocolos conocidos o para los que se ha extraído un líquido. Por ejemplo, un extracto de tejido líquido, tal como el de una biopsia, puede ser una muestra de líquido biológico. En determinados ejemplos, una muestra de líquido biológico es una muestra de orina recogida de un sujeto. En determinados ejemplos, la muestra de líquido biológico es una muestra de sangre extraída de un sujeto. Como se usa en el presente documento, los términos "sangre", "plasma" y "suero" incluyen fracciones o porciones procesadas de los mismos. De forma similar, cuando se toma una muestra de una biopsia, hisopo, frotis, etc., la "muestra" engloba una fracción o porción procesada derivada de la biopsia, hisopo, frotis, etc.

Además, una "solución líquida", "muestra líquida" o "líquido" engloban líquidos biológicos pero también pueden incluir y englobar componentes no fisiológicos, tales como cualquier analito que pueda estar presente en una muestra ambiental. Por ejemplo, la muestra puede ser de un río, lago, estanque u otro depósito de agua. En determinados modos de realización de ejemplo, la muestra líquida se puede modificar. Por ejemplo, se puede añadir un tampón o conservante a la muestra líquida, o se puede diluir la muestra líquida. En otros modos de realización de ejemplo, la muestra líquida se puede modificar por medios comunes conocidos en la técnica para incrementar la concentración de uno o más solutos en la solución. Independientemente, la solución líquida todavía es una solución líquida como se describe en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, un "sujeto" se refiere a un animal, incluyendo un animal vertebrado. El vertebrado puede ser un mamífero, por ejemplo, un ser humano. En determinados ejemplos, el sujeto puede ser un paciente humano. Un sujeto puede ser un "paciente", por ejemplo, tal como un paciente que padece o se sospecha que padece una enfermedad o afección y puede necesitar tratamiento o diagnóstico o puede necesitar un seguimiento de la progresión de la enfermedad o afección. El paciente también puede estar recibiendo un tratamiento que necesita un seguimiento a su eficacia. Un mamífero se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo, por ejemplo, seres humanos, chimpancés, animales domésticos y de granja, así como animales de zoológico, deportivos o de compañía, tales como perros, gatos, ganado vacuno, conejos, caballos, ovejas, cerdos y así sucesivamente.

Como se usa en el presente documento, el término "natural" se refiere a un gen o producto génico que tiene las características de ese gen o producto génico cuando se aísla de una fuente natural.

Como se usa en el presente documento, se usan los códigos de una letra y tres letras convencionales para los residuos aminoacídicos. Para facilidad de referencia, las variantes de secuencia se describen por el uso de la siguiente nomenclatura: aminoácido(s) original(es): posición/posiciones: aminoácido(s) sustituido(s). De acuerdo con esta nomenclatura, por ejemplo, la sustitución de treonina por una arginina en la posición 17 se muestra como Thr17Arg o T17R. Las mutaciones múltiples se separan por signos más, por ejemplo: Thr17Arg+Glu34Ser o T17R+E34S, que representan mutaciones en las posiciones 17 y 34 que sustituyen una treonina y un ácido glutámico con una arginina y una serina, respectivamente.

Modos de realización de ejemplo

Los modos de realización de ejemplo se describen ahora en detalle, en parte con referencia a las figuras adjuntas. Cuando se hace referencia a las figuras, números similares indican elementos similares (pero no necesariamente idénticos) en todas las figuras.

Conjugados de proteínas de nanoporos

En el presente documento se proporcionan composiciones que incluyen conjugados de proteínas de nanoporos. Como se muestra en la figura 1, los conjugados 1 pueden incluir un monómero de nanoporo 2 que está unido a una marca de captura 5, de acuerdo con determinados modos de realización de ejemplo. El conjugado de proteína de nanoporo 1 también puede incluir un sitio de fijación de ligando de analito 4. Por consiguiente, el conjugado de proteína de nanoporo 1 resultante puede incluir un dominio de monómero de nanoporo, un dominio de fijación de ligando de analito y un dominio de marca de captura. Dichos conjugados de proteínas de nanoporos 1 se pueden usar, por ejemplo, para formar un complejo de detección de analito que, como se describe en el presente documento, puede interactuar con y facilitar la detección de un analito como se describe en el presente documento. En determinados modos de realización de ejemplo, el conjugado de conjugado de proteína de nanoporo 1 también puede incluir uno o más dominios conectores 3 que unen diversos componentes del conjugado de proteína de nanoporo 1.

El monómero proteínico de nanoporo 2 del conjugado de proteína de nanoporo 1 puede incluir cualquier proteína de nanoporo que, cuando se sitúa en un sustrato tal como una membrana, permite el paso de una molécula a través del sustrato. Los ejemplos de nanoporos incluyen poros proteínicos o basados en proteínas o poros sintéticos. En determinados modos de realización de ejemplo, un nanoporo puede tener un diámetro interno de 1 10 nm o 1-5 nm o 1-3 nm. Los ejemplos de poros proteínicos incluyen, por ejemplo, alfa-hemolisina, porina mitocondrial dependiente de voltaje (VDAC), OmpF, OmpG, OmpC, MspA y LamB (maltoporina) (véase, por ejemplo, Rhee, M. et al., Trends in Biotechnology, 25(4) (2007): 174-181). En determinados modos de realización de ejemplo, la proteína con poro puede ser una proteína modificada, tal como una proteína natural o proteína sintética modificada.

En determinados modos de realización de ejemplo, el dominio del monómero proteínico de nanoporo 2 del conjugado de proteína de nanoporo 1 es un monómero de alfa-hemolisina. Por consiguiente, en dichos modos de realización, el conjugado de proteína de nanoporo 1 resultante incluye un dominio de alfa-hemolisina (es decir, la porción de monómero de alfa-hemolisina del conjugado), un sitio de fijación de ligando de analito 4 y una marca de captura 5 (figura 1). En determinados modos de realización de ejemplo, dichos conjugados de proteínas de nanoporos también pueden incluir una o más regiones conectoras 3 que unen los diversos dominios del conjugado de proteína de nanoporo 1.

Como apreciarán los expertos en la técnica, la alfa-hemolisina es un polipéptido de 293 aminoácidos secretado por Staphylococcus aureus como monómero soluble en agua que se ensambla en bicapas lipídicas para formar un poro heptamérico. El heptámero, por ejemplo, es estable en dodecilsulfato de sodio (SDS) hasta 65 °C. La alteración de la alfa-hemolisina por mutagénesis o modificación química selectiva, en la secuencia central rica en glicina, demuestra que esta parte de la molécula penetra la bicapa lipídica y recubre la luz del canal transmembranario. El canal a través del heptámero es un barril p de 14 hebras con dos hebras por subunidad aportadas por la secuencia del dominio del tallo central.

En modos de realización de ejemplo donde el monómero de nanoporo 2 es alfa-hemolisina, el dominio de alfahemolisina del conjugado de proteína de nanoporo 1 se puede codificar por la secuencia de ácido nucleico expuesta como SEQ ID NO: 1 (alfa-hemolisina natural). En determinados modos de realización de ejemplo, el dominio de alfa-hemolisina del conjugado de proteína de nanoporo 1 se puede codificar por una secuencia de ácido nucleico que es un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico expuesta como SEQ ID NO: 1. En determinados modos de realización de ejemplo, el dominio de alfa-hemolisina del conjugado de proteína de nanoporo 1 tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. En determinados modos de realización de ejemplo, el dominio de alfahemolisina del conjugado de proteína de nanoporo 1 puede tener una secuencia de aminoácidos que es un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.

En modos de realización de ejemplo donde el monómero de nanoporo 2 es alfa-hemolisina, el dominio de alfahemolisina del conjugado de proteína de nanoporo 1 puede tener la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 16 (alfa-hemolisina natural original, madura; AAA26598 ). En determinados modos de realización de ejemplo, el dominio de alfa-hemolisina del conjugado de proteína de nanoporo 1 descrito en el presente documento puede tener una secuencia de aminoácidos que es un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 16. En determinados modos de realización de ejemplo, el dominio de alfa-hemolisina del conjugado de proteína de nanoporo 1 puede ser una variante de alfahemolisina específica. Por ejemplo, la variante de alfa-hemolisina puede tener al menos un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más de identidad de secuencia con respecto a SEQ ID NO: 16, pero incluye una o más sustituciones aminoacídicas.

En determinados modos de realización de ejemplo, la porción de monómero proteínico de nanoporo 2 del conjugado de proteína de nanoporo 1 es un monómero de proteína G de membrana externa (u "OmpG"). Por consiguiente, en dichos modos de realización, el conjugado de proteína de nanoporo 1 resultante incluye un dominio de OmpG (es decir, la porción de monómero de OmpG del conjugado), un sitio de fijación de ligando de analito 4, una marca de captura 5 y, en determinados modos de realización de ejemplo, una o más regiones conectoras 3. Como apreciarán los expertos en la técnica, OmpG es una proteína porina de 34 kDa que forma un barril beta de 14 hebras. El barril, por ejemplo, permite la absorción y secreción pasiva aunque selectiva de nutrientes, iones y proteínas en bacterias gramnegativas. Dichas porinas tienen en general vueltas cortas en el lado periplásmico y bucles largos en el lado extracelular. Pero a diferencia de la mayoría de las porinas, se entiende que OmpG funciona como un monómero.

En modos de realización de ejemplo donde el monómero de nanoporo 2 es un monómero de OmpG, el dominio de OmpG del conjugado de proteína de nanoporo 1 puede tener una secuencia de aminoácidos que es un 60 %,<65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %,>96<%, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia expuesta como SEQ>ID NO: 6. En determinados modos de realización de ejemplo, el dominio de OmpG del conjugado de proteína de nanoporo 1 puede ser una variante de OmpG. Por ejemplo, la variante de OmpG puede tener al menos un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más de identidad de secuencia con respecto a SEQ ID NO: 6, pero incluyen una o más sustituciones aminoacídicas específicas, formando de este modo una variante de OmpG.

La marca de captura 5 del conjugado de proteína de nanoporo 1 puede ser cualquier secuencia polipeptídica que interactúe con el poro de un ensamblaje de nanoporo de tal manera que se pueda identificar una señal detectable del ensamblaje de nanoporo. Por ejemplo, un homopolímero de aproximadamente 30 aminoácidos de lisina, tal como aproximadamente 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 aminoácidos de lisina. En determinados modos de realización de ejemplo, la marca de captura es una marca EPPP (SEQ ID NO: 17). En determinados modos de realización de ejemplo, la marca de captura 5 puede tener la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 8. En otros modos de realización de ejemplo, la marca de captura 5 puede tener una secuencia de aminoácidos que es un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 8.

En determinados modos de realización de ejemplo, el conjugado de proteína de nanoporo 1 también incluye una región para fijar un ligando de analito, tal como un dominio de fijación de analito 4 (figura 1). El dominio de fijación de analito 4 se puede localizar en cualquier lugar a lo largo del conjugado de proteína de nanoporo 1 que no interfiera, por ejemplo, con la función del ensamblaje de nanoporo como se describe en el presente documento. Por ejemplo, el dominio de fijación de analito 4 no debe interferir con el ensamblaje del monómero proteínico de nanoporo 2 en un ensamblaje de nanoporo o la interacción de la marca de captura 5 con el ensamblaje, como se describe en el presente documento. Como se muestra en la figura 1, en determinados modos de realización de ejemplo, el dominio de fijación de analito 4 se puede localizar entre el monómero proteínico de nanoporo 2 y la marca de captura 5.

En determinados modos de realización de ejemplo, el dominio de fijación de analito 4 puede incluir una secuencia de aminoácidos SpyTag o SpyCatcher. Véase, por ejemplo, Li et al., J Mol Biol., 23 enero de 2014; 426(2):309-17. Por ejemplo, el dominio de fijación de analito 4 puede incluir una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 %, 85 %, 90 % o 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 11. En dichos modos de realización de ejemplo, se puede usar la secuencia SpyTag para fijar un ligando de analito, formando de este modo un complejo de detección de analito 9 como se describe en el presente documento (véase la figura 2). En otros modos de realización de ejemplo, el sitio de fijación de ligando de analito 4 puede incluir otras estructuras o secuencias peptídicas que se pueden usar para fijar un ligando de analito al conjugado de proteína de nanoporo. Por ejemplo, el sitio de fijación de ligando de analito 4 puede incluir componentes de otros pares de unión covalente, tales como conjugados de cisteína-maleimida o pares de química clic de acida-alquino, así como otros componentes de enlace conocidos en la técnica. En determinados modos de realización de ejemplo, el dominio de fijación de analito 4 puede incluir una secuencia molecular básica para fijar un ligando de analito al conjugado de proteína de nanoporo 1 (véase a continuación).

En determinados modos de realización de ejemplo, el conjugado de proteína de nanoporo 1 también puede incluir una o más regiones conectoras 3 (figura 1). Por ejemplo, la región conectora 3 puede ser cualquier secuencia de aminoácidos que une el monómero proteínico de nanoporo 2 a las otras regiones funcionales del conjugado de proteína de nanoporo 1, pero que no interfiere con la función independiente de los dominios del conjugado de proteína de nanoporo. Por ejemplo, la región conectora 3 no interfiere con el ensamblaje del monómero proteínico de nanoporo 2 en un ensamblaje de proteína de nanoporo como se describe en el presente documento. La región conectora 3 tampoco interfiere con la asociación de la marca de captura 5 con el ensamblaje como se describe en el presente documento o la asociación de un ligando de analito con el dominio de fijación de ligando de analito.

En determinados modos de realización de ejemplo, se puede usar la región conectora 3 para unir el monómero proteínico de nanoporo 2 al dominio de fijación de analito 4 (figura 1). En determinados modos de realización de ejemplo, la región conectora 3 incluye 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos. En determinados modos de realización de ejemplo, la región conectora 3 tiene menos de aproximadamente 15 aminoácidos, tal como aproximadamente 1-10 aminoácidos. En determinados modos de realización de ejemplo, la región conectora 3 es al menos un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta como una cualquiera de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15.

En determinados modos de realización de ejemplo, el conjugado de proteína de nanoporo 1 puede incluir una segunda región conectora (no mostrada). En dichos modos de realización, la segunda región conectora puede unir otras regiones funcionales del conjugado de proteína de nanoporo 1 entre sí mientras se conserva la funcionalidad del conjugado de proteína de nanoporo 1 como se describe en el presente documento. Por ejemplo, la segunda región conectora puede unir la primera región conectora 3 al dominio de fijación de analito 4. Al igual que la primera región conectora 3, la segunda región conectora (no mostrada) puede incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos. En determinados modos de realización de ejemplo, la segunda región conectora tiene menos de aproximadamente 15 aminoácidos, tal como aproximadamente 1-10 aminoácidos. En determinados modos de realización de ejemplo, la segunda región conectora es al menos un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta como una cualquiera de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15. En determinados modos de realización de ejemplo, la primera región conectora 3 y la segunda región conectora pueden estar separadas por una marca no funcional, tal como una marca de polihistadina.

En determinados modos de realización de ejemplo, el conjugado de proteína de nanoporo 1 descrito en el presente documento tiene una secuencia de aminoácidos que es un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 4. En dichos modos de realización de ejemplo, el conjugado de proteína de nanoporo 1 puede incluir secuencialmente un monómero de alfa-hemolisina como monómero de nanoporo 2, una región conectora 3, una secuencia SpyTag como sitio de fijación de ligando de analito 4, una marca de histadina y una región de marca de captura 5 (véanse la figura 1 y SEQ ID NO: 4). Por ejemplo, el dominio del monómero de alfa-hemolisina del conjugado de proteína de nanoporo 1 puede corresponder a la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 16 y la región conectora 3 puede corresponder a la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 12. Además, el sitio de fijación de ligando de analito 4 del conjugado de proteína de nanoporo 1 puede corresponder a la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 11 (secuencia SpyTag) y la marca de captura 5 del conjugado de proteína de nanoporo 1 puede corresponder a la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 8.

En determinados modos de realización de ejemplo, el conjugado de proteína de nanoporo 1 descrito en el presente documento tiene una secuencia de aminoácidos que es un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 7. En dichos modos de realización de ejemplo, el conjugado de proteína de nanoporo 1 puede incluir una secuencia de OmpG como monómero de nanoporo 2, una primera región conectora 3, una marca de histadina, una segunda región conectora, una secuencia SpyTag como sitio de fijación de ligando de analito 4 y una región de marca de captura 5. Por ejemplo, el dominio del monómero de OmpG del conjugado de proteína de nanoporo 1 puede corresponder a la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 6, la primera región conectora 3 puede corresponder a la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 13 y la segunda región conectora puede corresponder a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14. Además, el sitio de fijación de ligando de analito 4 del conjugado de proteína de nanoporo 1 puede corresponder a la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 11 (secuencia SpyTag) y la marca de captura 5 del conjugado de proteína de nanoporo 1 puede corresponder a la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 8.

En determinados modos de realización de ejemplo, el conjugado de proteína de nanoporo 1 descrito en el presente documento puede incluir cualquier número de modificaciones de proteína. Como apreciarán los expertos en la técnica, dichas modificaciones pueden incluir, por ejemplo, fosfato (fosforilación), carbohidrato (glucosilación), ADP-ribosilo (ribosilación de ADP), ácido graso (prenilación, que incluye pero no se limita a: miristoilación y palmitilación), ubicuitina (ubicuitinación) y sentrina (sentrinización; una modificación de proteína similar a la ubicuitinación). Los ejemplos adicionales de modificación postraduccional incluyen metilación, actilación, hidroxilación, yodación y enlace de flavina.

En determinados modos de realización de ejemplo, los aminoácidos que forman la totalidad o una parte del conjugado de proteína de nanoporo 1 pueden ser estereoisómeros. Adicionalmente o de forma alternativa, los aminoácidos que forman la totalidad o una parte del conjugado de proteína de nanoporo 1 pueden ser modificaciones de aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales, aminoácidos modificados de forma postraduccional, aminoácidos sintetizados de forma enzimática, aminoácidos derivatizados, construcciones o estructuras diseñadas para imitar aminoácidos y similares. Los aminoácidos que forman los péptidos del conjugado de proteína de nanoporo 1 pueden ser uno o más de los 20 aminoácidos comunes encontrados en las proteínas naturales, o uno o más de los aminoácidos modificados e inusuales. En determinados modos de realización de ejemplo, los aminoácidos pueden ser D- o L-aminoácidos.

En determinados modos de realización de ejemplo, la secuencia de aminoácidos del conjugado de proteína de nanoporo 1 también puede incluir uno o más aminoácidos modificados y/o inusuales. Los ejemplos de aminoácidos modificados e inusuales incluyen pero no se limitan a, ácido 2-aminoadípico (Aad), ácido 3-aminoadípico (Baad), ácido p-amino-propiónico (Bala, p-alanina), ácido 2-aminobutírico (Abu, ácido piperidínico), ácido 4-aminobutírico (4Abu), ácido 6-aminocaproico (Acp), ácido 2-aminoheptanoico (Ahe), ácido 2-aminoisobutírico (Aib), ácido 3-aminoisobutírico (Baib), ácido 2-aminopimélico (Apm), ácido 2,4-diaminobutírico (Dbu), desmosina (Des), ácido 2,2'-diaminopimélico (Dpm), ácido 2,3-diaminopropiónico (Dpr), N-etilglicina (EtGly), N-etilasparagina (EtAsn), hidroxilisina (Hyl), alo-hidroxilisina (AHyl), 3-hidroxiprolina (3Hyp), 4-hidroxiprolina (4Hyp), isodesmosina (Ide), aloisoleucina (Alle), N-metilglicina (MeGly, sarcosina), N-metilisoleucina (Melle), 6-N-metillisina (MeLys), N-metilvalina (MeVal), norvalina (Nva), norleucina (Nle) y ornitina (Orn). Otros ejemplos de aminoácidos modificados e inusuales se describen en general en Synthetic Peptides: A User's Guide, segunda edición, abril de 2002, editado por Gregory A. Grant, Oxford University Press; Hruby V J, Al-obeidi F y Kazmierski W: Biochem J 268:249-262, 1990; y Toniolo C: Int J Peptide Protein Res 35:287-300, 1990.

Complejos de detección de analitos

La figura 2 es una ilustración que muestra un complejo de detección de analito 9, de acuerdo con determinados modos de realización de ejemplo. Con referencia a la figura 2, se puede unir un conjugado de proteína de nanoporo 1 a un ligando de analito 8 para formar el complejo de detección de analito 9. Por ejemplo, el ligando de analito 8 se puede unir al conjugado de proteína de nanoporo 1 a través del sitio de fijación de ligando de analito 4 del conjugado de proteína de nanoporo 1, tal como por medio de un miembro de fijación 6. En determinados modos de realización de ejemplo, se puede usar un miembro conector 7 para fijar indirectamente el ligando de analito 8 al sitio de fijación de ligando de analito 4 del conjugado de proteína de nanoporo 1.

El ligando de analito 8 del complejo de detección de analito 9 puede ser cualquier ligando que tenga afinidad de unión por un analito, siendo el analito cualquier analito como se describe en el presente documento. Por ejemplo, el ligando de analito 8 puede ser un anticuerpo con afinidad por un antígeno particular, siendo el antígeno el analito. Como apreciarán los expertos en la técnica a la vista de esta divulgación, se puede usar cualquier anticuerpo o fragmento funcional del mismo como ligando de analito. En otros modos de realización de ejemplo, se puede usar el ligando de analito 8 del complejo de detección de analito 9 para detectar analitos ambientales. En determinados modos de realización de ejemplo, se puede usar el ligando de analito 8 del complejo de detección de analito 9 para identificar analitos proteínicos en muestras líquidas biológicas complejas, por ejemplo, en un tejido y/o un líquido corporal.

En determinados modos de realización de ejemplo, el analito al que está dirigido el ligando de analito 9 puede estar presente en una variedad de tipos de muestras, incluyendo muestras biológicas, productos de cuidado personal, productos farmacéuticos, muestras de agua, muestras de alimentos, muestras de bebidas, muestras de aire, muestras de medio de nutrientes, muestras clínicas y similares. En determinados modos de realización de ejemplo, el analito al que está dirigido el ligando de analito 9 puede estar presente en una concentración baja en comparación con otros componentes de la muestra. En determinados modos de realización de ejemplo, el ligando de analito 9 también se puede usar para seleccionar subpoblaciones de analitos macromoleculares en base a la conformación o a las propiedades funcionales de los analitos. Los ligandos de analito 8 de ejemplo incluyen, por ejemplo, los definidos en el presente documento, así como aptámeros, anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos, receptores y/o péptidos que son conocidos por unirse al analito diana. Con respecto a los aptámeros, el aptámero puede ser un aptámero de ácido nucleico que incluye ADN, ARN y/o análogos de ácidos nucleicos. En determinados modos de realización de ejemplo, el aptámero puede ser un aptámero peptídico, tal como un aptámero peptídico que incluye un bucle peptídico variable fijado en ambos extremos a un armazón. Los aptámeros se pueden seleccionar, por ejemplo, para unirse a un analito proteínico diana específico.

Como apreciarán los expertos en la técnica, un analito y un ligando de analito 8 representan dos miembros de un par de unión, es decir, dos moléculas diferentes en las que una de las moléculas se une específicamente a la segunda molécula a través de química o física. Además de los bien conocidos miembros del par de unión antígenoanticuerpo, otros pares de unión incluyen, por ejemplo, biotina y avidina, carbohidratos y lectinas, secuencias de nucleótidos complementarias, secuencias peptídicas complementarias, moléculas efectoras y receptoras, cofactores de enzimas y enzimas, inhibidores de enzimas y enzimas, una secuencia peptídica y un anticuerpo específico para la secuencia o toda la proteína, bases y ácidos poliméricos, tintes y aglutinantes de proteínas, péptidos y aglutinantes de proteínas específicos (por ejemplo, ribonucleasa, péptido S y proteína S-ribonucleasa), glúcido y ácido borónico, y moléculas similares que tienen una afinidad que permite sus asociaciones en un ensayo de unión.

Además, los pares de unión ligando de analito/analito pueden incluir miembros que son análogos del miembro de unión original, por ejemplo, un analito-análogo o miembro de unión preparado por técnicas recombinantes o ingeniería molecular. Si el ligando de analito es un inmunorreactante puede ser, por ejemplo, un anticuerpo, antígeno, hapteno o complejo del mismo y, si se usa un anticuerpo, puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal, una proteína o anticuerpo recombinante, un anticuerpo quimérico, una(s) mezcla(s) o fragmento(s) de los mismos, así como una mezcla de un anticuerpo y otros miembros de unión. Los detalles de las preparaciones de dichos anticuerpos, péptidos y nucleótidos y su idoneidad para su uso como miembros de unión en un ensayo de unión son bien conocidos en la técnica.

En determinados modos de realización de ejemplo, y como se ilustra en la figura 2, el ligando de analito 8 se puede unir al conjugado de proteína de nanoporo 1 por medio de un miembro de fijación 6 y un miembro conector 7. El miembro de fijación 6 puede ser cualquier proteína, secuencia de ácido nucleico u otra entidad que se pueda usar para fijar el ligando de analito 8, directa o indirectamente, al conjugado de proteína de nanoporo 1. En determinados modos de realización de ejemplo, el miembro de fijación 6 se puede usar para formar un enlace isopeptídico con el conjugado de proteína de nanoporo. Por ejemplo, cuando el sitio de fijación de ligando de analito 4 es un dominio SpyCatcher o un dominio SpyTag, el correspondiente miembro de fijación 6 puede ser una secuencia SpyTag o SpyCatcher, respectivamente. Por consiguiente, en dichos modos de realización de ejemplo, el ligando de analito 8 se puede ligar al conjugado de proteína de nanoporo 1 por medio de un enlace isopéptido SpyCatcher/SpyTag. En otros modos de realización de ejemplo, el miembro de fijación 6 puede incluir componentes de otros pares de unión covalente, tales como conjugados de cisteína-maleimida o pares de química clic de acida-alquino, así como otros componentes de enlace conocidos en la técnica tales como fijaciones mediadas por transglutaminasa y sortasa.

En modos de realización de ejemplo que incluyen un miembro conector 7, el miembro conector 7 puede ser cualquier estructura que una el ligando de analito 8 al miembro de fijación 6, pero que no interfiera con la función del complejo de detección de analito 9 como se describe en el presente documento (figura 2). Por ejemplo, el miembro conector puede ser un conector peptídico que incluye 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos. En determinados modos de realización de ejemplo, el miembro conector 7 tiene menos de aproximadamente 15 aminoácidos, tal como aproximadamente 1-10 aminoácidos. En determinados modos de realización de ejemplo, el miembro conector es al menos un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos expuesta como una cualquiera de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15.

En determinados modos de realización de ejemplo, el ligando de analito 8, el miembro conector 7 y el miembro de fijación 6 se pueden disponer secuencialmente como se ilustra en la figura 2. Adicionalmente o de forma alternativa, el ligando de analito 8, el conector 7 y el miembro de fijación 6 se pueden preparar como una única entidad y a continuación fijarse al dominio de fijación de analito 4 del conjugado de proteína de nanoporo 1. Se puede realizar una fusión genética de los componentes proteínicos del ligando de analito 8, el conector 7 y el miembro de fijación 6 concatenando las secuencias de ADN que codifican esas proteínas o péptidos en un vector de expresión, y purificando la proteína resultante usando procedimientos estándar para los expertos en la técnica.

Arquitectura y ensamblaje de nanoporos

Con referencia a la figura 3, se proporciona un ensamblaje de nanoporo 10 que incluye un complejo de detección de analito 9, de acuerdo con determinados modos de realización de ejemplo. El ensamblaje de nanoporo 10 es típicamente una estructura proteínica multimérica incluida en un sustrato, tal como una membrana lipídica 11. Al menos una de las subunidades proteínicas del ensamblaje de nanoporo 10 incluye un conjugado de proteína de nanoporo 1, como se describe en el presente documento. Al incluir un conjugado de proteína de nanoporo 1 como se describe en el presente documento, se puede fijar un ligando de analito 8 al conjugado de proteína de nanoporo 1. Además, con el uso del conjugado de proteína de nanoporo 1, al menos una de las subunidades proteínicas con nanoporo del ensamblaje de nanoporo 10 incluye una marca de captura 5 y un monómero de nanoporo 2, siendo el monómero de nanoporo 2 la porción de la subunidad monomérica que interactúa con otras subunidades de nanoporos para formar el nanoporo multimérico. La marca de captura 5, por ejemplo, está disponible para interactuar con el poro, y su interacción con el poro se puede modificar en presencia de un analito como se describe en el presente documento.

El conjugado de proteína de nanoporo 1 del ensamblaje de nanoporo 10 puede ser cualquiera de los conjugados de proteínas de nanoporos 1 descritos en el presente documento. En el caso de alfa-hemolisina, por ejemplo, el ensamblaje de nanoporo es un oligómero de siete monómeros de alfa-hemolisina (es decir, un ensamblaje de nanoporo heptamérico). Las subunidades monoméricas de alfa-hemolisina del ensamblaje de nanoporo heptamérico pueden ser copias idénticas de la misma secuencia polipeptídica o pueden ser secuencias polipeptídicas de alfa-hemolisina diferentes, siempre que al menos una de las subunidades de alfa-hemolisina esté asociada con una marca de captura 5 como se describe en el presente documento. Por ejemplo, el ensamblaje de nanoporo puede incluir un conjugado de proteína de nanoporo 1 y seis monómeros de alfa-hemolisina que no están enlazados a una marca de captura 5 (para un total de siete subunidades de alfa-hemolisina oligomerizadas). En dichos modos de realización, el dominio de alfa-hemolisina de cada una de las siete subunidades puede ser el mismo, o las alfa-hemolisinas pueden ser una mezcla de monómeros de alfa-hemolisina y variantes de la misma.

En determinados modos de realización de ejemplo, el conjugado de proteína de nanoporo 1 del ensamblaje de<nanoporo 10 (es decir, el "único" componente del heptámero) es una secuencia de aminoácidos que es un>60<%, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %,>98<% o 99 % o más idéntica a la secuencia expuesta>como SEQ ID NO: 4. Además, en determinados modos de realización de ejemplo, uno o más de otros monómeros de nanoporos (es decir, uno o más de los "seis" componentes del heptámero) pueden tener una secuencia de aminoácidos que es un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más idéntica a la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 5.

El ensamblaje de nanoporo 2 se puede preparar por cualquier procedimiento conocido en la técnica. Por ejemplo, el ensamblaje de nanoporo descrito en el presente documento se puede ensamblar de acuerdo con los procedimientos descritos en el documento WO2014/074727, que proporciona un procedimiento para formar proteínas multiméricas que tienen un número definido de subunidades modificadas (véase la figura 27 del documento WO2014/074727; véase también el documento PCT/EP2017/057433). En determinados modos de realización de ejemplo, el ensamblaje de nanoporo 10 se puede formar mezclando un conjugado de proteína de nanoporo 1 con monómeros proteínicos de nanoporos. En el caso de nanoporos de alfa-hemolisina, por ejemplo, un detergente (por ejemplo, ácido desoxicólico) puede provocar que el monómero de alfa-hemolisina adopte la conformación de poro. Los nanoporos también se pueden formar, por ejemplo, usando un lípido (por ejemplo, 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC) o 1,2-di-0-fitanil-sn-glicero-3-fosfocolina (DoPhPC)) y temperatura moderada (por ejemplo, menos de aproximadamente 100 °C). En algunos casos, mezclar DPhPC con una solución tampón crea grandes vesículas multilaminares (VML), y añadir subunidades de alfa-hemolisina a esta solución e incubar la mezcla a 40 °C durante 30 minutos da como resultado la formación de poro.

Debido a que los procedimientos y sistemas descritos en el presente documento se basan en la interacción de la marca de captura 5 con el ensamblaje de nanoporo 10, puede ser beneficioso tener solo una única marca de captura 5 asociada con el ensamblaje de nanoporo 10 (en lugar de múltiples marcas de captura 5). Con un ensamblaje de nanoporo no multimérico, tal como un ensamblaje de OmpG, se puede usar un único conjugado de proteína de nanoporo 1 que incluye un dominio de nanoporo de OmpG para formar el/un ensamblaje de nanoporo. En el caso de un ensamblaje de nanoporo multimérico, tal como un ensamblaje de nanoporo de alfa-hemolisina, el ensamblaje de nanoporo 10 se puede preparar de modo que solo se incluya un único conjugado de proteína de nanoporo 1 dentro del ensamblaje (y, por consiguiente, solo esté presente una única marca de captura 5).

En determinados modos de realización de ejemplo, el sitio de fijación de ligando de analito 4 del conjugado de proteína de nanoporo 1, tal como un dominio SpyTag, se puede usar para seleccionar heptámeros de alfahemolisina que incluyen un único conjugado de proteína de nanoporo 1 (y, por consiguiente, una única marca de captura 5). Por ejemplo, mezclar el conjugado de proteína de nanoporo 1 con monómeros proteínicos de alfahemolisina da como resultado heptámeros que tienen 0, 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 conjugados de proteínas de nanoporos. Aún debido al número diferente de secuencias SpyTag (0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7) asociadas con cada heptámero, los heptámeros tienen cargas diferentes. Por consiguiente, en determinados modos de realización de ejemplo, los heptámeros se pueden separar por procedimientos conocidos en la técnica, tales como por medio de elución con cromatografía de intercambio catiónico. A continuación, se pueden examinar las fracciones eluidas para determinar qué fracción incluye un ensamblaje con una única SpyTag. Véase el documento PCT/EP2017/057433.

Si bien una variedad de procedimientos pueden ser adecuados para determinar qué fracción de heptámero contiene una única SpyTag (y que, por consiguiente, se puede unir solo a una única proteína de fusión polimerasa/SpyCatcher por heptámero), en determinados modos de realización de ejemplo, la fracción de heptámero diferente se puede separar en base al peso molecular, tal como por medio de SDS-PAGE. A continuación, se puede usar un reactivo para confirmar la presencia de SpyTag asociada con cada fracción. Como se describe en el documento PCT/EP2017/057433, por ejemplo, se puede añadir una SpyCatcher-GFP (proteína fluorescente verde) a las fracciones antes de la separación por medio de SDS-PAGE.

Debido a que los heptámeros con un número menor de conjugados de proteínas de nanoporos (y, por consiguiente, menos SpyTag) son más pequeños que los heptámeros con mayor número de conjugados de proteínas de nanoporos (y, por consiguiente, más SpyTag), se puede identificar la fracción con una única SpyTag y, por consiguiente, un único conjugado de proteína de nanoporo 1, como se demuestra por la migración de banda más lejos y la presencia de fluorescencia de GFP en el gel de SDS-PAGE correspondiente a la banda. Por ejemplo, una fracción que contiene siete monómeros de alfa-hemolisina (pero ningún conjugado de proteína de nanoporo) migrará más lejos, pero no emitirá fluorescencia cuando se mezcle con SpyCatcher-GFP debido a la ausencia de SpyTag unida a los heptámeros. Pero, sin embargo, la fracción que contiene una única SpyTag tanto migrará lo siguiente más lejos (en comparación con otras bandas fluorescentes) como emitirá fluorescencia, facilitando de este modo la identificación de la fracción que contiene un único conjugado de proteína de nanoporo 1 (y, por consiguiente, una única marca de captura 5). Véase el documento PCT/EP2017/057433. En modos de realización de ejemplo donde se pueden desear ensamblajes de nanoporos que tengan marcas de captura 5 adicionales, dichos análisis de desplazamiento de migración se pueden usar de forma similar para identificar facciones de nanoporo de alfa-hemolisina con 0, 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 conjugados de proteínas de nanoporos 1 (y, por consiguiente, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 marcas de captura 5).

Fijación del ligando de analito para formar un complejo de detección de analito

Para preparar un ensamblaje de nanoporo 10 que incluye un complejo de detección de analito 9 (figura 3), se fija un ligando de analito 8 al conjugado de proteína de nanoporo 1. En determinados modos de realización de ejemplo, el ligando de analito 8 se puede fijar al conjugado de proteína de nanoporo 1 antes de que el conjugado de proteína de nanoporo 1 se incorpore a una membrana. En otros modos de realización de ejemplo, el ligando de analito 8 se puede fijar al conjugado de proteína de nanoporo 1 después de que el conjugado de proteína de nanoporo 1 se incorpore a la membrana. Por ejemplo, cuando el ensamblaje de nanoporo 10 incluye un monómero de porina que no se oligomeriza con otros monómeros, tales como un monómero de OmpG, el ligando de analito 8 se puede fijar al conjugado de proteína de nanoporo 1 que incluye el monómero proteínico de nanoporo 2 de OmpG antes de que el conjugado de proteína de nanoporo 1 se incorpore a la membrana lipídica o después de que el conjugado de proteína de nanoporo 1 se incorpore a la membrana.

De forma similar, cuando el ensamblaje de nanoporo 10 es un nanoporo de alfa-hemolisina, por ejemplo, el ligando de analito 8 se puede fijar al conjugado de proteína de nanoporo 1 de alfa-hemolisina antes o después de que el conjugado de proteína de nanoporo 1 se incorpore al ensamblaje de nanoporo 10 multimérico. Por ejemplo, el nanoporo heptamérico de alfa-hemolisina se puede ensamblar como se describe en el presente documento para incluir un único conjugado de proteína de nanoporo 1 que tiene un monómero proteínico de nanoporo 2 de alfahemolisina. A continuación, se puede fijar el ligando de analito 8 al conjugado de proteína de nanoporo 1 después del ensamblaje del nanoporo heptamérico de alfa-hemolisina después de que se ensambla el ensamblaje de nanoporo 10, formando de este modo un ensamblaje de nanoporo 10 que incluye un complejo de detección de analito 9 como parte del nanoporo. En otros modos de realización de ejemplo, el ligando de analito 8 se puede fijar al conjugado de proteína de nanoporo 1 antes de la formación del ensamblaje de nanoporo heptamérico de alfahemolisina. El complejo de detección de analito 9 de alfa-hemolisina se puede mezclar a continuación con otros monómeros proteínicos de nanoporos como se describe en el presente documento para formar un ensamblaje de nanoporo 10 de alfa-hemolisina.

El ligando de analito 8 se puede fijar al conjugado de proteína de nanoporo 1 (y, por consiguiente, al ensamblaje de nanoporo 10) por cualquier procedimiento conocido en la técnica. En determinados modos de realización de ejemplo, fijar el ligando de analito 8 al conjugado de proteína de nanoporo 1 implica en general incluir una secuencia conectora o molécula conectora como sitio de fijación de ligando de analito 4 del conjugado de proteína de nanoporo 1. A continuación, se puede fijar un ligando de analito 8 al sitio de fijación de ligando de analito 4 por medio de la fijación del miembro de fijación 6 a la secuencia conectora del sitio de fijación de ligando de analito 4. Por ejemplo, el miembro de fijación 6 puede ser una secuencia u otra molécula que se une o interactúa con el sitio de fijación de ligando de analito 4 de tal manera que se una el ligando de analito 8 al sitio de fijación de ligando de analito 4 del conjugado de proteína de nanoporo 1.

Adicionalmente o de forma alternativa, el ligando de analito 8 se puede fijar al conjugado de proteína de nanoporo 1 con cualquier química adecuada (por ejemplo, enlace covalente y/o conector). En determinados modos de realización de ejemplo, el ligando de analito 8 se fija al conjugado de proteína de nanoporo 1 con grapas moleculares. En determinados modos de realización de ejemplo, las grapas moleculares incluyen tres secuencias de aminoácidos (indicadas como conectores A, B y C). El conector A se puede extender desde el conjugado de proteína de nanoporo 1, tal como desde el sitio de fijación de ligando de analito 4. El conector B se puede extender desde el ligando de analito 8, tal como desde el miembro de fijación 6 asociado con el ligando de analito 8. Y el conector C se puede unir a continuación a los conectores A y B (por ejemplo, envolviendo ambos conectores A y B) y uniendo por tanto el ligando de analito 8 al conjugado de proteína de nanoporo 1. El conector C también se puede construir para ser parte del conector A o conector B, reduciendo por tanto el número de moléculas conectoras.

En determinados modos de realización de ejemplo, el sistema SpyTag/SpyCatcher, que forma espontáneamente enlaces isopeptídicos covalentes en condiciones fisiológicas, se puede usar para unir el conjugado de proteína de nanoporo 1 al ligando de analito 8. Véase, por ejemplo, Li et al., J Mol Biol., 23 enero de 2014; 426(2):309-17. Por ejemplo, se puede expresar un conjugado de proteína de nanoporo 1 que tiene un dominio SpyTag como sitio de fijación de ligando de analito 4. Además, el ligando de analito 8 que se va a unir al conjugado de proteína de nanoporo 1 puede incluir un dominio de SpyCatcher como miembro de fijación 6. Al mezclar el conjugado de proteína de nanoporo 1/SpyTag con el ligando de analito 8/SpyCatcher, las proteínas SpyTag y SpyCatcher interactúan para formar el conjugado de proteína de nanoporo 1 que se enlaza al ligando de analito 8 por medio de un enlace isopeptídico covalente, formando de este modo un complejo de detección de analito 9 como se describe en el presente documento. Véase, por ejemplo, Li et al., J Mol Biol., 23 enero de 2014; 426(2):309-17.

Sistemas y procedimientos para detectar un analito

Al usar y basarse en un ensamblaje de nanoporo 10 que incluye un complejo de detección de analito 9 como se describe en el presente documento, en determinados modos de realización de ejemplo se proporcionan sistemas y procedimientos para detectar un analito en una muestra, tal como en una muestra líquida. Para detectar un analito, en determinados modos de realización de ejemplo, se incluye un ensamblaje de nanoporo 10 que incluye un complejo de detección de analito 10 dentro de una membrana y se sitúa un electrodo sensor contiguo a o en proximidad a la membrana. Por ejemplo, el ensamblaje de nanoporo 10 descrito en el presente documento se puede formar o incluirse de otro modo en una membrana dispuesta contigua a un electrodo sensor de un circuito sensor, tal como un circuito integrado. El circuito integrado puede ser un circuito integrado específico de la aplicación (ASIC). En determinados modos de realización de ejemplo, el circuito integrado es un transistor de efecto de campo o un semiconductor complementario de óxido metálico (CMOS). El circuito sensor se puede situar en un genochip u otro dispositivo que incluya el nanoporo, o fuera del genochip o dispositivo, tal como en una configuración fuera de genochip. El semiconductor puede ser cualquier semiconductor, incluyendo, sin limitación, los semiconductores del grupo IV (por ejemplo, silicio) y del grupo III-V (por ejemplo, arseniuro de galio). Véase, por ejemplo, el documento WO 2013/123450, para la configuración del aparato y dispositivo que se puede usar de acuerdo con las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento.

Como apreciarán los expertos en la técnica, se pueden usar sensores basados en poros (por ejemplo, genochips) para el análisis por electroexploración de moléculas individuales. Un sensor basado en poros puede incluir un ensamblaje de nanoporo 10 como se describe en el presente documento que se forma en una membrana que se dispone contigua a o en proximidad a un electrodo sensor. El sensor puede incluir, por ejemplo, un contraelectrodo. La membrana incluye un lado trans (es decir, un lado orientado hacia el electrodo sensor) y un lado cis (es decir, un lado orientado hacia el contraelectrodo). Por consiguiente, un ensamblaje de nanoporo que se dispone en la membrana puede incluir también un lado trans (es decir, un lado orientado hacia el electrodo sensor) y un lado cis (es decir, un lado orientado hacia el contraelectrodo). El ligando de analito 8 del complejo de detección de analito 9 se sitúa, por ejemplo, en el lado cis de la membrana.

Para detectar un analito, los procedimientos, sistemas y composiciones proporcionados en el presente documento se basan en la medición y el análisis de la tasa de captura de la marca de captura 5 por el ensamblaje de nanoporo 10. Se puede identificar un acontecimiento de captura usando el procedimiento de diferenciación de período a período (o p2p), como se describe en el documento WO/2017/220732, titulado "Period-to-Period Analysis of AC Signals from Nanopore Sequencing". En resumen, se detectan acontecimientos de captura cuando la señal del ADC en la porción brillante o bien la oscura de un ciclo de CA está por encima de un valor de umbral diferenciado p2p. El número de acontecimientos de captura en cualquier ventana deslizante de tiempo dada da la tasa de captura. En los casos donde la marca de captura tenga una carga negativa neta, las capturas se realizarán en la parte brillante del ciclo de CA, mientras que las marcas de captura con una carga positiva neta se capturarán en la parte oscura del ciclo de CA. Véase el documento WO/2017/220732.

En determinados modos de realización de ejemplo, una vez que un ensamblaje de nanoporo 10 y su complejo de detección de analito 9 asociado se disponen dentro de una membrana (véase la figura 3), se puede determinar una primera tasa de captura de la marca de captura 5 por medio de los electrodos sensores. La primera tasa de captura, por ejemplo, corresponde a la tasa de captura de la marca de captura 5 en presencia de un ligando de analito 8 unido en solitario (es decir, sin la presencia de un analito que se une al ligando de analito). Es decir, como se usa en el presente documento, la primera tasa de captura corresponde a la tasa de captura de la marca de captura 5 por el ensamblaje de nanoporo 10 antes de que el ligando de analito se una a cualquier analito por el que el ligando de analito 8 tenga afinidad de unión. Por consiguiente, la primera tasa de captura se puede determinar antes de que un genochip que incluye el ensamblaje de nanoporo se ponga en contacto con una muestra que incluye el analito. En otros modos de realización de ejemplo, la primera tasa de captura representa el estado del poro en el que un analito se ha disociado del ligando de analito 8 del complejo de detección de analito. Independientemente, la primera tasa de captura puede ser indicativa de un ensamblaje de nanoporo 10 que incluye un complejo de detección de analito 9, donde el ligando de analito está en un estado no unido (es decir, un ligando no está unido).

En determinados modos de realización de ejemplo, la primera tasa de captura se puede diferenciar de una tasa de captura de referencia, tal como para proporcionar una indicación de que el ligando de analito 8 está unido al conjugado de proteína de nanoporo 1 y, por consiguiente, al ensamblaje de nanoporo. Por ejemplo, en modos de realización de ejemplo donde el ligando de analito 8 se une al conjugado de proteína de nanoporo 1 después de la formación del nanoporo, la tasa de captura del nanoporo se puede determinar antes de que el ligando de analito 8 se una al conjugado de proteína de nanoporo 1. Es decir, la tasa de captura del nanoporo se puede determinar en ausencia del ligando de analito 8. Después de esto, el ligando del analito 8 se puede unir al conjugado de proteína de nanoporo 1 para formar el complejo de detección de analito 9, y se puede determinar la primera tasa de captura a partir del nanoporo.

Sin estar vinculado a ninguna teoría particular, se cree que, con la fijación del ligando de analito 8 al conjugado de proteína de nanoporo 1 como se describe en el presente documento, la proximidad del ligando de analito 8 a la marca de captura 5 altera la interacción de la marca de captura 5 con el nanoporo. Por ejemplo, el ligando de analito 8 puede impedir estéricamente la asociación de la marca de captura 5 con el nanoporo. Por consiguiente, en determinados modos de realización de ejemplo, la presencia del ligando de analito 8 puede disminuir la tasa de captura de la marca de captura 5 por el ensamblaje de nanoporo 10. En determinados modos de realización de ejemplo, la presencia del ligando de analito 8 puede incrementar la tasa de captura de la marca de captura 5 por el ensamblaje de nanoporo. Independientemente, se pueden determinar dichos incrementos o disminuciones en la tasa de captura, por ejemplo, comparando la primera tasa de captura (es decir, el ligando de analito 8 unido al conjugado de proteína de nanoporo 1) con la tasa de captura de referencia (sin ligando de analito unido al conjugado de proteína de nanoporo 1). Un cambio de este tipo en la tasa de captura, por ejemplo, entre la tasa de captura de referencia y la primera tasa de captura, en determinados modos de realización de ejemplo, puede proporcionar una indicación de que el ligando de analito 8 se ha unido con éxito al conjugado de proteína de nanoporo 1.

En determinados modos de realización de ejemplo, se cree que la diferencia entre la primera tasa de captura (es decir, ligando de analito 8 unido) y la tasa de captura de referencia (ligando de analito 8 fijado pero sin analito unido) es altamente variable en base al nivel de interferencia con la marca de captura 5. En determinados modos de realización de ejemplo, la primera tasa de captura puede ser aproximadamente un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 105 %, 110 %, 115 %, 120 %, 125 %, 130 %, 135 %, 140 %, 145 %, 150 %, 155 %, 160 %, 165 %, 170 %, 175 %, 180 %, 185 %, 190 %, 195 %, 200 % o más mayor que la tasa de captura de referencia. En determinados modos de realización de ejemplo, la primera tasa de captura puede disminuir en aproximadamente un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 105 %, 110 %, 115 %, 120 %, 125 %, 130 %, 135 %, 140 %, 145 %, 150 %, 155 %, 160 %, 165 %, 170 %, 175 %, 180 %, 185 %, 190 %, 195 % o 200 % o más en comparación con la tasa de captura de referencia.

Después de determinar la primera tasa de captura, el genochip que contiene el ensamblaje de proteína de nanoporo 10 y el complejo de detección de analito 9 asociado se puede poner en contacto con una solución líquida, tal como una solución de muestra que se va a someter a prueba para detectar un analito diana. Para someter a prueba una solución líquida para determinar la presencia del analito diana, la solución líquida se puede hacer fluir sobre un genochip que incluye el ensamblaje de nanoporo 10, poniendo en contacto de este modo el ensamblaje de nanoporo 10 con la solución líquida. El ensamblaje de nanoporo 10, por ejemplo, se dispone para incluir al menos un complejo de detección de analito 9 como se describe en el presente documento, teniendo el ligando de analito 8 del complejo de detección de analito 9 una afinidad de unión por el analito diana. A medida que el líquido fluye sobre el nanoporo, el analito diana (cuando está presente) puede interactuar con el ligando de analito 8 y, por consiguiente, se puede unir al ligando de analito 8. Por el contrario, si el analito diana está ausente de la solución líquida, no se puede producir dicha unión al ligando de analito 8. La solución líquida que se va a someter a prueba, por ejemplo, puede incluir o consistir en cualquier líquido biológico, muestra líquida u otra muestra como se describe en el presente documento que incluye (o puede incluir) el analito diana.

Una vez que el ensamblaje de nanoporo se pone en contacto con la solución líquida, se puede determinar una segunda tasa de captura de la marca de captura 5 por el ensamblaje de nanoporo 10. La segunda tasa de captura puede proporcionar a continuación una indicación de si el ligando de analito 8 del complejo de detección de analito 9 se ha unido a un analito diana (o no). Por consiguiente, la segunda tasa de captura puede proporcionar una indicación de si el analito diana está presente en la muestra líquida que se sometió a prueba (o no). Por ejemplo, cuando el analito diana está unido al ligando de analito 8, la segunda tasa de captura puede diferir de la primera tasa de captura. En determinados modos de realización de ejemplo, cuando el analito está unido al ligando de analito 8, la segunda tasa de captura se puede incrementar en relación con la primera tasa de captura. En otros modos de realización de ejemplo, cuando el analito diana está unido al ligando de analito 8, la segunda tasa de captura puede disminuir en relación con la primera tasa de captura. Independientemente, una segunda tasa de captura diferente, en comparación con la primera tasa de captura, puede proporcionar una indicación de que el analito diana está unido al ligando de analito 8 del ensamblaje de nanoporo 10 (y, por consiguiente, que el analito

diana está presente en la solución líquida).

Sin quedar vinculado a ninguna teoría particular, se cree que, con la unión del analito diana al ligando de analito

8, la proximidad del par de unión analito diana/ligando de analito a la marca de captura 5 altera la interacción de la

marca de captura 5 con el nanoporo. Por ejemplo, el par de unión analito diana/ligando de analito puede impedir estéricamente la asociación de la marca de captura 5 con el nanoporo, dando como resultado de este modo una

segunda tasa de captura disminuida (en relación con la primera tasa de captura). De forma alternativa, y nuevamente sin estar vinculado a ninguna teoría particular, en determinados modos de realización de ejemplo, la

unión entre el analito diana y el ligando de analito 8 (para formar el par de unión) puede reducir el impedimento

estérico impuesto por el ligando de analito 8 en solitario (sin el analito unido), dando como resultado de este modo

una segunda tasa de captura incrementada (en relación con la primera tasa de captura). Por consiguiente, se

puede usar un cambio en la tasa de captura, de la primera tasa de captura a la segunda tasa de captura, para

detectar un analito en una solución líquida.

En determinados modos de realización de ejemplo, se cree que la diferencia entre la segunda tasa de captura (es

decir, analito presente y unido) y la primera tasa de captura (ligando de analito 8 fijado pero sin analito unido) es altamente variable en base al nivel de interferencia con la marca de captura 5. En determinados modos de realización de ejemplo, la segunda tasa de captura puede ser aproximadamente un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %,

30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %. , 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 105 %, 110 %,

115 %, 120 %, 125 %, 130 %, 135 %, 140 %, 145 %, 150 %, 155 %, 160 %, 165 %, 170 %, 175 %, 180 %, 185 %, 190 %, 195 % o 200 % o más mayor que la primera tasa de captura. En determinados modos de realización de

ejemplo, la segunda tasa de captura puede disminuir en aproximadamente un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %,

35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 105 %, 110 %, 115 %,

120 %, 125 %, 130 %, 135 %, 140 %, 145 %, 150 %, 155 %, 160 %, 165 %, 170 %, 175 %, 180 %, 185 %, 190 %, 195 % o 200 % o más en comparación con la primera tasa de captura.

En determinados modos de realización de ejemplo, además de detectar el analito, se puede determinar la identidad específica del analito detectado en base a la identidad del ligando de analito 8. Por ejemplo, si el ligando de analito

8 es un nanocuerpo dirigido a un péptido específico, y la segunda tasa de captura proporciona una indicación de

que el péptido está presente en la muestra sometida a prueba, se puede determinar la identidad del péptido

presente en la muestra. En otras palabras, se puede usar cualquier ligando de analito 8 conocido que se use como

se describe en el presente documento para detectar un analito para determinar la identidad del analito.

Como apreciarán los expertos en la técnica en base a esta divulgación, los procedimientos, sistemas y composiciones descritos en el presente documento se pueden usar en una variedad de aplicaciones prácticas. Por

ejemplo, se pueden usar los procedimientos, sistemas y composiciones descritos en el presente documento para

facilitar el cribado de analitos desconocidos en una muestra. En dichos modos de realización de ejemplo, el

complejo de detección de analito 9 se podría configurar para incluir un dominio de unión de un receptor celular

conocido como ligando de analito 8. La solución líquida aplicada al genochip que incluye el ensamblaje de

nanoporo 10 podría ser una de múltiples fracciones, por ejemplo, conteniendo una o más de las fracciones un

analito, tal como un agonista o antagonista potencial del receptor. Al someter a prueba cada fracción como se

describe en el presente documento, se puede(n) determinar la(s) fracción/fracciones que incluye(n) un analito al

ligando de analito 8 (es decir, el dominio del receptor).

En determinados modos de realización de ejemplo, se pueden usar los procedimientos, composiciones y sistemas

descritos en el presente documento para cribar la presencia de múltiples analitos diferentes en una única muestra

líquida en un único genochip. Como apreciarán los expertos en la técnica, la tecnología de genochip actual permite

el depósito de cientos de miles de nanoporos (o más) en un único genochip. Por consiguiente, al usar los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento, se pueden usar múltiples ensamblajes de nanoporos 10 diferentes, incluyendo cada uno un complejo de detección de analito, en el mismo genochip para

someter a prueba una muestra líquida para detectar múltiples analitos diferentes. Por ejemplo, se pueden ensamblar conjuntos individuales de ensamblajes de nanoporos 10 como se describe en el presente documento, disponiéndose cada conjunto para detectar un analito diferente.

En dichos modos de realización de ejemplo, un conjunto de ensamblajes de nanoporos 10 puede incluir un ligando

de analito 8 para el analito A, mientras que otro conjunto de ensamblajes de nanoporos 10 puede incluir el ligando

de analito 8 para el analito B. Se podrían disponer otros múltiples ensamblajes de nanoporos 10 en el mismo

genochip también, tales como los dirigidos a los analitos C, D, E, F y así sucesivamente, de modo que el genochip

pueda detectar múltiples analitos diferentes. En determinados modos de realización de ejemplo, se puede determinar una tasa de captura de referencia para cada ensamblaje de nanoporo, y la tasa de captura de referencia

se puede comparar con una primera tasa de captura como se describe en el presente documento para proporcionar

una indicación de que un ligando de analito 8 se une al conjugado de proteína de nanoporo 1 como se describe en

el presente documento.

Adicionalmente o de forma alternativa, se puede poner en contacto una única muestra líquida con el genochip (y, por consiguiente, con los múltiples ensamblajes de nanoporos diferentes) como se describe en el presente documento. A continuación, para cada uno de los ensamblajes de nanoporos 10, se puede determinar una segunda tasa de captura y compararse con la primera tasa de captura como se describe en el presente documento, permitiendo por tanto la detección de un ligando de analito diferente para cada conjunto diferente de ensamblajes de nanoporos 10. Para cada poro, a continuación, la segunda tasa de captura puede proporcionar una indicación de si el analito diana, al que está dirigido el ligando de analito 8 del poro, está presente en la muestra. Por consiguiente, se pueden usar múltiples poros para detectar múltiples analitos diferentes.

Para diferenciar entre los ensamblajes de nanoporos diferentes dispuestos en el genochip, se pueden usar y están disponibles una variedad de técnicas. Por ejemplo, se pueden usar marcas de captura 5 diferentes para grupos diferentes de ensamblajes de nanoporos, de modo que se pueden usar tasas de captura de referencia diferentes para identificar los ensamblajes de nanoporos 10 diferentes. Por ejemplo, se puede usar una marca de captura 5 con una tasa de captura de referencia conocida con un conjunto de ensamblajes de nanoporos 10 dirigidos al analito A, mientras que se puede usar una marca de captura 5 diferente con una tasa de captura de referencia diferente con un conjunto de ensamblajes de nanoporos 10 dirigidos al analito B. Las dos poblaciones diferentes de nanoporos se pueden diferenciar a continuación por las tasas de captura de referencia diferentes.

Adicionalmente o de forma alternativa, se pueden usar y diferenciar fácilmente tipos de poros diferentes, tales como poros con tamaños de poros más pequeños o más grandes, en base a técnicas conocidas en la técnica. Con dichas configuraciones, por ejemplo, un nanoporo con una abertura más grande puede proporcionar una señal de corriente mayor que un poro con una abertura más pequeña, permitiendo por tanto la diferenciación de los poros en el mismo genochip. A continuación, los poros diferentes se pueden correlacionar con los analitos para los que se configuran para detectar, permitiendo por tanto la identificación de analitos diferentes en el mismo genochip. Otros procedimientos de diferenciación incluyen el nivel de bloqueo de la marca de captura, la tasa de captura de la marca de captura en ausencia de analito como se describe en el presente documento y los perfiles de corrientevoltaje de los nanoporos.

En otros modos de realización de ejemplo, se pueden localizar una o más marcas de captura diferentes en el lado trans del nanoporo, proporcionando de este modo una forma adicional en la que se pueden diferenciar conjuntos de poros diferentes en el mismo genochip. En dichos ejemplos, se puede fijar una segunda marca de captura al lado trans del nanoporo, dando como resultado un bloqueo durante la porción oscura del ciclo de CA. Estas capturas del lado oscuro también se pueden distinguir entre sí por la tasa de captura y el nivel de marca capturada. Véase el documento WO/2017/220732.

Las figuras 4A-4C son ilustraciones que muestran los diversos estados del ensamblaje de nanoporo que están asociados con la tasa de captura de referencia, la primera tasa de captura y la segunda tasa de captura, de acuerdo con determinados modos de realización de ejemplo. Como se muestra en la figura 4A, el ensamblaje de nanoporo incluye un conjugado de proteína de nanoporo 1 (como se describe en la fig. 1), junto con una marca de captura (es decir, la marca peptídica 5, como se ilustra). La línea discontinua ilustra la interacción de la marca peptídica con el poro del nanoporo, lo que da como resultado una tasa de captura de referencia detectable. Como se muestra, el ligando de analito (por ejemplo, un nanocuerpo) aún no está unido al ensamblaje de nanoporo (figura 4A). Como se muestra en la figura 4B, el ensamblaje de nanoporo incluye un conjugado de proteína de nanoporo 1 (como se describe en la fig. 1) junto con un nanocuerpo 8 fijado. Por consiguiente, el ensamblaje de nanoporo incluye un complejo de detección de analito como se describe en el presente documento. También se muestra la marca de captura (es decir, la marca peptídica 5), mostrando la línea discontinua la interacción de la marca de captura con el nanoporo, dando como resultado de este modo una primera tasa de captura detectable (figura 4B). Como se muestra en la figura 4C, un analito (por ejemplo, un antígeno) ahora se ha unido al ligando de analito (por ejemplo, el nanocuerpo 8) del complejo de detección de analito, lo que da como resultado una segunda tasa de captura detectable de la marca de captura (es decir, la captura de la marca peptídica, como se ilustra).

Procedimientos para determinar la concentración de analito

Además de detectar e identificar un analito, los procedimientos, sistemas y composiciones descritos en el presente documento se pueden usar para determinar la concentración de un analito en una solución líquida. Por ejemplo, debido a que la primera tasa de captura y la segunda tasa de captura corresponden a un nanoporo dado que pasa de un estado no unido a un estado unido a analito, respectivamente, el cambio en la tasa de captura de la primera tasa de captura a la segunda tasa de captura y de regreso a la primera tasa de captura se puede usar para determinar las tasas de asociación/disociación entre el ligando de analito y el analito. Las tasas de asociación/disociación, junto con las características de unión conocidas entre el ligando de analito y el analito, se pueden usar a continuación junto con procedimientos cinéticos conocidos para determinar la información de concentración del analito en la muestra.

Para determinar la concentración de un analito, se puede realizar el procedimiento para detectar la presencia de un analito como se describe en el presente documento, determinándose las tasas de asociación/disociación entre el par analito/ligando a partir de las transiciones de la primera y segunda tasa de captura. Por ejemplo, un ensamblaje de nanoporo 10 que incluye un complejo de detección de analito 9 como se describe en el presente documento se dispone dentro de una membrana de un genochip. A continuación, se colocan uno o más electrodos sensores en proximidad al ensamblaje de nanoporo 10 que incluye el complejo de detección de analito 9. A continuación, se determina una primera tasa de captura para el ensamblaje de nanoporo 10 como se describe en el presente documento, correspondiendo la primera tasa de captura a un estado de poro en el que el ligando de analito 8 está unido al conjugado de proteína de nanoporo 1 del ensamblaje de nanoporo 10 en ausencia de un analito unido.

Después de esto, el genochip (y, por consiguiente, el ensamblaje de nanoporo 10 dispuesto en el mismo) se puede poner en contacto con una muestra líquida, tal como una muestra que incluye el ligando de analito, y realizarse un seguimiento continuamente de la tasa de captura. Poner en contacto el ensamblaje de nanoporo 10 con el analito permite la unión del analito al ligando de analito 8 y, por consiguiente, permite la identificación de la transición entre la primera tasa de captura a la segunda tasa de captura como se describe en el presente documento. La segunda tasa de captura, por ejemplo, corresponde a un estado de poro en el que el analito ahora está unido al ligando de analito, como se describe en el presente documento.

Tras la identificación de la transición entre la primera tasa de captura a la segunda tasa de captura, la medición continua de la segunda tasa de captura permite la identificación de una segunda transición, es decir, el punto temporal donde la segunda tasa de captura regresa a (o aproximadamente a) la primera tasa de captura. Es decir, con una medición continua de la tasa de captura, se puede identificar un retorno a (o aproximadamente a) la primera tasa de captura, correspondiendo el retorno a la primera tasa de captura a un estado de poro en el que el analito y el ligando de analito 8 han quedado no unidos. En otras palabras, la segunda transición de regreso a (o aproximadamente a) la primera tasa de captura desde la segunda tasa de captura corresponde a la disociación del par de unión analito-ligando.

En determinados modos de realización de ejemplo, se puede determinar el tiempo transcurrido en el estado unido para el par analito-ligando midiendo el intervalo de tiempo entre la primera transición y la segunda transición. Asimismo, en determinados modos de realización de ejemplo, se puede determinar el tiempo que el par analitoligando pasa en el estado no unido midiendo la longitud de la transición de la primera tasa de captura a la segunda tasa de captura en presencia del analito. A continuación, se pueden determinar las tasas de asociación/disociación entre el analito y el ligando de analito 8 para la reacción de unión a partir de las transiciones de tasa de captura identificadas y, en particular, del período de tiempo que el nanoporo está en los estados unido frente a no unido. Por ejemplo, para determinar la tasa de asociación (K<a>) los tiempos de intercaptura individuales para una reacción de unión dada se pueden registrar y ajustar a una ecuación que describa la reacción de unión. La ecuación, por ejemplo, puede ser una única ecuación exponencial u otro tipo de ecuación, dependiendo del mecanismo de unión entre el analito y el ligando de analito 8 (por ejemplo, una interacción proteína-proteína, interacción proteína-ADN, interacción ADN-ADN, interacción aptámero-ADN, proteína-producto químico, etc.). Para determinar la tasa de disociación (K<d>) para la reacción de unión, los tiempos de permanencia de unión y las duraciones de cada acontecimiento de unión se recopilan, registran y ajustan a una ecuación que describe la reacción de disociación. Puede ser una única ecuación exponencial u otro tipo de ecuación dependiendo del mecanismo de disociación asociado con la reacción de unión.

Una vez que se determinan las tasas de asociación y/o disociación para una reacción de unión particular, la K<a>y K<d>, junto con procedimientos y principios cinéticos conocidos, se pueden usar para calcular la concentración del analito. Por ejemplo, cuando la concentración de nanoporos del genochip, la concentración de antígeno-ligando (es decir, analito-poro) y la K<a>/K<d>son conocidas, se puede determinar fácilmente la concentración del analito a partir de la siguiente ecuación cinética:

k<d>

[Analito] [Poro] ^ [analito-ligando]

k<a>

donde, ka/kd = ([Analito] * [Poro]) / [Analito-Ligando]. La concentración de analito libre se puede determinar por: ;[Analito] = (ka/kd) * [Analito-Poro] / [Poro]. Por consiguiente, la concentración total de analito es [Analito-Poro] [Analito]. Los diversos parámetros, es decir, K<a>, k<d>, [poro] y [poro-analito] se pueden medir en el genochip como se describe en el presente documento. Por ejemplo, se puede determinar la concentración de analito-ligando en base al número de poros que se identifican como que unen el analito. Un ejemplo de la transición de la primera tasa de captura a la segunda tasa de captura y, a continuación, de regreso a (o aproximadamente a) la primera tasa de captura se muestra, por ejemplo, en la figura 5C (analizada a continuación).

Como apreciarán los expertos en la técnica en base a esta divulgación, el ensamblaje de nanoporo descrito en el presente documento puede tener otras disposiciones que pueden ser compatibles con los procedimientos y sistemas descritos en el presente documento (tanto para la detección de analitos como para la determinación de la concentración). Por ejemplo, en determinados modos de realización de ejemplo, la marca de captura descrita en el presente documento se puede fijar, directa o indirectamente, al ligando de analito. En dichos modos de realización, un ensamblaje de nanoporo se puede configurar para incluir un conjugado de proteína de nanoporo en el que la proteína conjugada incluye un monómero proteínico de nanoporo y un sitio de fijación de ligando de analito. A continuación, se puede fijar un ligando de analito que incluye una marca de captura al sitio de fijación de ligando de analito, formando de este modo un complejo de detección de analito en el que la marca de captura se fija al ligando de analito, directa o indirectamente, en lugar de al conjugado de proteína de nanoporo. En determinados modos de realización de ejemplo, el ligando de analito con la marca de captura se puede fijar al sitio de fijación de ligando de analito de la proteína conjugada después de que se forme el nanoporo dentro de una membrana lipídica. En otros modos de realización de ejemplo, el ligando de analito con la marca de captura se puede unir al sitio de fijación de la proteína conjugada antes de que se incorpore el complejo a la membrana lipídica.

En otros modos de realización de ejemplo, un conjugado de proteína de nanoporo que incluye un monómero proteínico de nanoporo y una marca de captura se puede combinar con al menos otro monómero de nanoporo que incluye un ligando de analito. Por ejemplo, se puede formar un nanoporo de alfa-hemolisina en el que el componente único es un conjugado de nanoporo que incluye una marca de captura y en el que uno de los otros seis monómeros de alfa-hemolisina incluye el ligando de analito. Por consiguiente, el ensamblaje de nanoporo de alfa-hemolisina sería un heptámero 1:6 con una única marca de captura y un único ligando de analito. En otros modos de realización de ejemplo, el ligando de analito se puede fijar a 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de los monómeros de alfahemolisina del heptámero, incluyendo el monómero de alfa-hemolisina restante la marca de captura. En otros modos de realización de ejemplo, la marca de captura se puede colocar en múltiples monómeros de alfa-hemolisina mientras que uno o más de otros de los monómeros del heptámero incluyen el ligando de analito. Dichos nanoporos se pueden identificar, por ejemplo, como se describe en el presente documento usando análisis de desplazamiento de migración.

Ejemplos

La presente invención se describe con más detalle en los siguientes ejemplos que de ningún modo pretenden limitar el alcance de la invención como se reivindica. Las figuras adjuntas se deben considerar como partes integrales de la memoria descriptiva y la descripción de la invención.

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar la invención reivindicada.

Como se usa en el presente documento, se aplican las siguientes abreviaturas: eq. (equivalentes); M (Molar); |jM (micromolar); N (normal); mol (moles); mmol (milimoles); jm ol (micromoles); nmol (nanomoles); g (gramos); mg (miligramos); kg (kilogramos); jg (microgramos); l (litros); ml (mililitros); j l (microlitros); cm (centímetros); mm (milímetros); jm (micrómetros); nm (nanómetros); °C (grados centígrados); h (horas); min (minutos); s (segundos); ms (milisegundos).

Ejemplo 1

Expresión y recuperación de proteínas

Este ejemplo ilustra la expresión y recuperación de proteínas de células huésped bacterianas, por ejemplo, E. coli. Más en particular, este ejemplo describe la expresión y recuperación de un conjugado de proteína de nanoporo de a-HL (secuencia de subunidad de a-HL/SpyTag/marca de captura, SEQ ID NO: 4), una variante de la subunidad de a-HL (SEQ ID NO: 5) , un ligando de analito de GFP que tiene una secuencia SpyCatcher (SEQ ID NO: 9) y un analito de GFP (SEQ ID NO: 10).

Preparación del conjugado de proteína de nanoporo de a-HL (SEQ ID NO: 4)

Se preparó una proteína de subunidad de a-HL/SpyTag/marca de captura (SEQ ID NO: 4) como conjugado de proteína de nanoporo, correspondiendo el dominio de marca de captura del conjugado a la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 8 y correspondiendo el monómero de a-HL del conjugado a SEQ ID NO: 16. Para preparar la proteína de subunidad de a-HL/SpyTag/marca de captura (SEQ ID NO: 4), se sintetizó el gen que codifica la secuencia de proteína de subunidad de a-HL/SpyTag/marca de captura (SEQ ID NO: 4) por síntesis de ADN comercial y se insertó en un vector pET26b usando digestión y fijación con enzimas de restricción de ADN estándar. Se transformó el ADN plásmido en células competentes de E. coli BL21(DE3) usando protocolos estándar de choque térmico y se cultivaron en placas de agar LB complementadas con kanamicina. Se seleccionaron y secuenciaron colonias bacterianas para verificar la integridad del gen. Se iniciaron los cultivos bacterianos a partir de reservas de glicerol y se cultivaron durante la noche en cultivos de 5 ml de medio LB complementado con el antibiótico apropiado. A continuación, se aumentaron estos cultivos en MagicMedia de autoinducción (Invitrogen) complementado con antibióticos y se dejaron aumentar a 25 °C durante 16-24 horas. Se recogieron los sedimentos celulares usando centrifugación a 2.200 x g durante 15 minutos y se congelaron a -80 °C hasta su uso posterior.

Tras la expresión de la subunidad de a-HL/SpyTag/marca de captura (SEQ ID NO: 4), se descongelaron los sedimentos y se solubilizaron en 5 ml de tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, KPO4 100 mM, imidazol 10 mM) por cada gramo de sedimento celular y complementado con comprimidos inhibidores de proteasa sin EDTA y DNasa1 (Sigma-AldrichTM). Se lisaron las células usando un homogeneizador ultrasónico con punta<(Fisher ScientificTM) fijado en un 90>%<de potencia máxima y se pulsaron durante 1 segundo encendido, 4>segundos apagado durante dos minutos. Se retiraron los restos celulares usando centrifugación a 20.000 x g durante 45 minutos. Se aplicó el sobrenadante a una columna de afinidad de cobalto y se lavó con 2 VC de tampón de lisis, 2 VC de tampón de lavado (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM), 10 VC de tampón de lavado con alto contenido de sal (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 1 M, imidazol 10 mM), 2 VC de tampón de lavado, y se eluyó usando tampón de lavado complementado con imidazol 150 mM.

Preparación de la variante de la subunidad de a-HL (SEQ ID NO: 5)

La variante de la subunidad de a-HL (SEQ ID NO: 5) se usa como el sexto componente para formar un heptámero de a-HL 1:6 (como se describe en el ejemplo 2). En resumen, para preparar la variante de la subunidad de a-HL (SEQ ID NO: 5), se sintetizó el gen que codifica la subunidad proteínica variante de a-HL enumerada en SEQ ID NO: 5 por síntesis de ADN comercial y se insertó en un vector pET26b usando digestión y fijación con enzimas de restricción de ADN estándar. Se transformó el ADN plásmido en células competentes de E. coli BL21(DE3) usando protocolos estándar de choque térmico y se cultivaron en placas de agar LB complementadas con kanamicina. Se seleccionaron y secuenciaron colonias bacterianas para verificar la integridad del gen. Se iniciaron los cultivos bacterianos a partir de reservas de glicerol y se cultivaron durante la noche en cultivos de 5 ml de medio LB complementado con el antibiótico apropiado. A continuación, se aumentaron estos cultivos en MagicMedia de autoinducción (Invitrogen) complementado con antibióticos y se dejaron aumentar a 25 °C durante 16-24 horas. Se recogieron los sedimentos celulares usando centrifugación a 2.200 x g durante 15 minutos y se congelaron a -80 °C hasta su uso posterior.

Tras la expresión de la proteína a-HL (SEQ ID NO: 5), se descongelaron los sedimentos y se solubilizaron en 5 ml de tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, KPO4 100 mM, imidazol 10 mM) por cada gramo de sedimento celular y complementado con comprimidos inhibidores de proteasa sin EDTA y DNasa 1 (Sigma-AldrichTM). Se lisaron las células usando un homogeneizador ultrasónico con punta (Fisher ScientificTM) fijado en un 90 % de potencia máxima y se pulsaron durante 1 segundo encendido, 4 segundos apagado durante dos minutos. Se retiraron los restos celulares usando centrifugación a 20.000 x g durante 45 minutos. Se aplicó el sobrenadante a una columna de afinidad de cobalto y se lavó con 2 VC de tampón de lisis, 2 VC de tampón de lavado (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM), 10 VC de tampón de lavado con alto contenido de sal (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 1 M, imidazol 10 mM), 2 VC de tampón de lavado, y se eluyó usando tampón de lavado complementado con imidazol 150 mM.

Preparación del ligando de analito de GFP (SEQ ID NO: 9)

El ligando de analito de GFP se usa para formar un complejo de detección de analito, siendo el ligando de analito del complejo de detección de analito anti-GFP. Para preparar el ligando de analito de GFP, se sintetizó el gen que codifica una proteína de fusión GFP-analito-ligando/SpyCatcher (SEQ ID NO: 9) por síntesis de ADN comercial y se insertó en un vector pET26b usando digestión y fijación con enzimas de restricción de ADN estándar. Se transformó el ADN plásmido en células competentes de E. coli BL21(DE3) usando protocolos estándar de choque<térmico y se cultivaron en placas de agar l>B<complementadas con kanamicina. Se seleccionaron y secuenciaron>colonias bacterianas para verificar la integridad del gen. Se iniciaron los cultivos bacterianos a partir de reservas de glicerol y se cultivaron durante la noche en cultivos de 5 ml de medio LB complementado con el antibiótico apropiado. A continuación, se aumentaron estos cultivos en MagicMedia de autoinducción (Invitrogen) complementado con antibióticos y se dejaron aumentar a 25 °C durante 16-24 horas. Se recogieron los sedimentos celulares usando centrifugación a 2.200 x g durante 15 minutos y se congelaron a -80 °C hasta su uso posterior.

Tras la expresión de la proteína GFP-analito-ligando/SpyCatcher (SEQ ID NO: 9), se descongelaron los sedimentos y se solubilizaron en 5 ml de tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, KPO4 100 mM, imidazol 10 mM) por cada gramo de sedimento celular y complementado con comprimidos inhibidores de proteasa sin EDTA y DNasa1 (Sigma-AldrichTM). Se lisaron las células usando un homogeneizador ultrasónico con punta (Fisher ScientificTM) fijado en un 90 % de potencia máxima y se pulsaron durante 1 segundo encendido, 4 segundos apagado durante dos minutos. Se retiraron los restos celulares usando centrifugación a 20.000 x g durante 45 minutos. Se aplicó el sobrenadante a una columna de afinidad de cobalto y se lavó con 2 VC de tampón de lisis, 2 VC de tampón de lavado (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM), 10 VC de tampón de lavado<con alto contenido de sal (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 1 M, imidazol 10 mM), 2>V<c de tampón de lavado, y se>eluyó usando tampón de lavado complementado con imidazol 150 mM.

Analito de GFP (SEQ ID NO: 10)

El analito GFP (SEQ ID NO: 10) se usa junto con el complejo de detección de analito para demostrar la actividad de un nanoporo de a-HL que incluye un complejo de detección de analito (véase el ejemplo 3). Para preparar el analito de GFP (SEQ ID NO: 10), se sintetizó el gen que codifica el analito de GFP enumerado en SEQ ID NO: 10 por síntesis de ADN comercial y se insertó en un vector pET26b usando digestión y fijación con enzimas de restricción de ADN estándar. Se transformó el ADN plásmido en células competentes de E. coli BL21(DE3) usando protocolos estándar de choque térmico y se cultivaron en placas de agar LB complementadas con kanamicina. Se seleccionaron y secuenciaron colonias bacterianas para verificar la integridad del gen. Se iniciaron los cultivos bacterianos a partir de reservas de glicerol y se cultivaron durante la noche en cultivos de 5 ml de medio LB complementado con el antibiótico apropiado. A continuación, se aumentaron estos cultivos en MagicMedia de autoinducción (Invitrogen) complementado con antibióticos y se dejaron aumentar a 25 °C durante 16-24 horas. Se recogieron los sedimentos celulares usando centrifugación a 2.200 x g durante 15 minutos y se congelaron a -80 °C hasta su uso posterior.

Tras la expresión del analito de GFP (SEQ ID NO: 10), se descongelaron los sedimentos y se solubilizaron en 5 ml de tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, KPO4 100 mM, imidazol 10 mM) por cada gramo de sedimento celular y complementado con comprimidos inhibidores de proteasa sin EDTA y DNasa 1 (Sigma-AldrichTM). Se lisaron las células usando un homogeneizador ultrasónico con punta (Fisher ScientificTM) fijado en un 90 % de potencia máxima y se pulsaron durante 1 segundo encendido, 4 segundos apagado durante dos minutos. Se retiraron los restos celulares usando centrifugación a 20.000 x g durante 45 minutos. Se aplicó el sobrenadante a una columna de afinidad de cobalto y se lavó con 2 VC de tampón de lisis, 2 VC de tampón de lavado (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM), 10 VC de tampón de lavado con alto contenido de sal (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 1 M, imidazol 10 mM), 2 VC de tampón de lavado, y se eluyó usando tampón de lavado complementado con imidazol 150 mM. Se dividió en alícuotas la proteína y se almacenó a -80 °C hasta inmediatamente antes de su uso.

Ejemplo 2

Ensamblaje del nanoporo que incluye complejo de detección de analito

Este ejemplo describe el ensamblaje de un nanoporo heptamérico que tiene seis subunidades de monómero de nanoporo variantes de a-HL (SEQ ID NO: 5) y una subunidad de a-HL que comprende una secuencia de marca de captura y una secuencia SpyTag (SEQ ID NO: 4), donde el ligando de analito de GFP (SEQ ID NO: 9) se fija a la única subunidad de a-HL (<s>E<q>ID NO: 4) por medio de un enlace SpyTag-SpyCatcher para formar un complejo de detección de analito. El enlace SpyTag-SpyCatcher se describe, por ejemplo, en Li et al., J Mol Biol., 23 de enero de 2014; 426(2):309-17.

Preparación del ensamblaje de nanoporo heptamérico de a-HL 1:6

En general, se puede preparar un ensamblaje de nanoporo heptamérico de a-HL que incluye una proteína de a-HL/SpyTag (SEQ ID No: 4) y 6 variantes de a-HL (SEQ ID NO: 5) (es decir, una proporción de heptámero de 1:6). como se describe en el documento PCT/EP2017/057433. En resumen, usando aproximadamente 20 mg de proteína total, se mezclaron soluciones de la proteína a-HL/SpyTag (SEQ ID No: 4) con la variante de a-HL deseada (SEQ ID NO: 5) en una proporción de 1:9 para formar una mezcla de heptámeros. Se espera que una mezcla de este tipo dé como resultado diversas fracciones que incluyen proporciones variables de proteína a-HL/SpyTag (SEQ ID NO: 4) y variante de a-HL (SEQ ID NO: 5) (es decir, 0:7; 1:6, 2:5, 3:4, etc.), donde el componente SpyTag de a-HL/SpyTag (SEQ ID NO: 4) está presente como 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 subunidades monoméricas del heptámero.

Se solubilizó el lípido difitanoilfosfatidilcolina (DPhPC) en Tris 50 mM, NaCI 200 mM, pH 8 o bien KCI 150 mM, HEPES 30 mM, pH 7,5 hasta una concentración final de 50 mg/ml y se añadió a la mezcla de monómeros de a-HL hasta una concentración final de 5 mg/ml. Se incubó la mezcla de los monómeros de a-HL a 37 °C durante al menos 60 min. Después de esto, se añadió n-octil-p-D-glucopiranósido (pOG) hasta una concentración final de un 5 % (peso/volumen) para solubilizar la mezcla de lípido-proteína resultante. Se centrifugó la muestra para depurar los agregados de proteínas y los complejos lipídicos sobrantes y se recogió el sobrenadante para su posterior purificación.

A continuación, se sometió la mezcla de heptámeros a purificación por intercambio catiónico y se recogieron las fracciones de elución. Para cada fracción, se prepararon dos muestras para SDS-PAGE. La primera muestra incluía 15 ul de eluato de a-HL en solitario y la segunda muestra se combinó con 3 ug de GFP-SpyCatcher (SEQ ID NO: 10). A continuación, se incubaron las muestras (y se protegieron de la luz) y a temperatura ambiente durante 1-16 horas. Tras la incubación, se añadieron 5 ul de 4x tampón SDS-PAGE Laemmli (Bio-Rad™) a cada muestra. A continuación se cargaron las muestras y una escalera de proteínas sin tinción PrecisionPlus™ en un gel prefabricado de proteínas sin tinción Mini-PROTEAN al 4-20 % (Bio-Rad). Se desarrollaron los geles a 200 mV durante 30 minutos. A continuación, se tomaron imágenes de los geles usando un filtro sin tinción.

La fijación de la proteína GFP-SpyCatcher (SEQ ID NO: 10) a a-HL/SpyTag (SEQ ID NO: 4) del ensamblaje de nanoporo heptamérico se puede observar a través de desplazamientos de banda de peso molecular durante SDS-PAGE, facilitando por tanto la identificación de la fracción de heptámero 1:6. Es decir, los heptámeros que contienen una única SpyTag se unirán a una única molécula de GFP-SpyCatcher (SEQ ID NO: 10) y, por tanto, tendrán un desplazamiento que corresponde al peso molecular del poro heptamérico más el peso molecular de una única molécula de GFP-SpyCatcher (SEQ ID NO: 10), mientras que los heptámeros con dos o más SpyTag deberían tener desplazamientos de peso molecular correspondientemente mayores. Por lo tanto, se pueden analizar los picos eluidos de la columna de intercambio catiónico durante la purificación de a-HL heptamérica anterior para determinar la proporción de a-HL/SpyTag con respecto a variante de a-HL. Además, se puede observar la presencia de la fijación de GFP-SpyCatcher (SEQ ID NO: 10) usando un filtro de fluorescencia de GFP cuando se forman imágenes de los geles de SDS-PAGE. Véase el documento PCT/EP2017/057433.

En base a este razonamiento, se determinó la fracción con un desplazamiento de peso molecular que correspondía a una única adición de GFP-SpyCatcher (SEQ ID NO: 10) y, por consiguiente, un conjugado de proteína de nanoporo de 1 componente (SEQ ID NO: 4) con respecto a seis variantes de a-HL (SEQ ID NO: 5), usando una escalera de proteínas estándar de peso molecular. Se usó el sistema de formación de imágenes sin tinción de Bio-Rad para determinar el desplazamiento de peso molecular. Se determinó la presencia de fluorescencia de GFP usando un filtro azul. Se usó la presencia de fluorescencia para confirmar la presencia de la proteína SpyTag. Véase el documento PCT/EP2017/057433. A continuación se usó la fracción de elución correspondiente a la proporción 1:6, es decir, una a-HL/SpyTag (SEQ ID NO: 4) con respecto a seis variantes de a-HL (SEQ ID NO: 5), para otros experimentos.

Fijación del ligando de analito de GFP (SEQ ID NO: 9) a heptámeros 1:6

Usando la fracción de heptámero 1:6 anterior, el ligando de analito de GFP (SEQ ID NO: 9) (es decir, el nanocuerpo anti-GFP que incluye una secuencia de SpyCatcher) se fijó a continuación al un componente de a-HL/SpyTag/CapTag (SEQ ID NO: 4) del heptámero 1:6 usando el sistema SpyTag/SpyCatcher (véase Li et al., J Mol Biol. 23 de enero de 2014; 426 (2):309-17 9), formando de este modo un complejo de detección de analito dentro del ensamblaje de nanoporo. En resumen, para fijar el ligando de analito de GFP pegajoso (SEQ ID NO: 9) al un componente de a-HL/SpyTag (SEQ ID NO: 4) del heptámero 1:6, se mezcló el ligando de analito de GFP pegajoso (SEQ ID NO: 9) con el complejo de heptámero 1:6 (véase anteriormente) a 4 °C durante la noche. Se separó el ligando de analito de GFP no fijado (SEQ ID NO: 9) del complejo aplicando la mezcla a una columna de cromatografía de exclusión por tamaño. Se dividieron en alícuotas las fracciones resultantes que contenían el complejo y se almacenaron a -80 °C antes de su uso. A continuación, se usó el heptámero que incluía el ligando de analito de GFP en experimentos posteriores, con el ligando de analito de GFP (SEQ ID NO: 9) fijado a a-HL/SpyTag/CapTag (SEQ ID NO: 4) formando el complejo de detección de analito del ensamblaje de nanoporo.

Ejemplo 3

Determinación y análisis de la tasa de captura

Este ejemplo muestra la determinación y el análisis de la tasa de captura para un ensamblaje de nanoporo sin un ligando de analito fijado, con el ligando de analito fijado (es decir, el nanoporo descrito en el ejemplo 2 anterior) y en presencia del analito de GFP (SEQ ID NO: 10).

En resumen, se prepararon heptámeros de alfa-hemolisina 1:6 sin el ligando de analito fijado y se dispusieron en un genochip como se describe en la pub. de patente de EE. UU. 2017/0322195, titulada "Systems and methods for forming a nanopore in a lipid bilayer".

Tras la preparación del genochip, a continuación se usó el procedimiento de análisis de la tasa de captura para evaluar la tasa de captura de la marca de captura en diferentes condiciones (es decir, sin el ligando de analito de GFP unido al poro, con el ligando de analito de GFP unido al poro y en presencia del analito de GFP). En resumen, el procedimiento de análisis de la tasa de captura se basa en el procedimiento de diferencias de período a período, que se describe en detalle en el documento WO/2017/220732. La tasa de captura se puede medir detectando en primer lugar todos los acontecimientos de captura de marca por el poro. Los acontecimientos de captura se detectan en la señal restando la señal que se desplazó un período a la derecha del original. La señal de diferencia se procesa además estableciendo en cero los valores de diferencia por debajo del umbral de ruido del ADC. Se registran las marcas de tiempo de cada uno de los acontecimientos de captura.

Las figuras 5A-5C son gráficos que muestran determinaciones de la tasa de captura, de acuerdo con determinados modos de realización de ejemplo. Cada punto en las figuras 5A-5C, por ejemplo, representa un número de acontecimiento de captura frente a la marca de tiempo medida del acontecimiento. La tasa de captura es la inversa de la pendiente de la curva de todos los acontecimientos. Más en particular, la figura 5A muestra la tasa de captura de referencia para capturas de marca con una única pendiente global, en ausencia del ligando de analito de GFP (es decir, sin ligando unido). Para los datos mostrados en la figura 5B, el ligando de analito de GFP se fijó al nanoporo como se describe en el ejemplo 2, anteriormente, y se determinó la primera tasa de captura. Como se muestra en la figura 5B, la primera tasa de captura se redujo en comparación con la tasa de captura de referencia (figura 5A) cuando el ligando de analito de g Fp se fijó al nanoporo.

Tras la determinación de la tasa de captura de referencia (figura 5A) y la primera tasa de captura (figura 5B), se determinó la segunda tasa de captura correspondiente a la unión del ligando de analito de g Fp como se muestra en la figura 5C. En resumen, se añadieron 27 |jl de analito de GFP (SEQ ID NO: 10) al genochip, facilitando por tanto la unión entre el analito de GFP (SEQ ID NO: 10) y el ligando de analito de GFP del nanoporo. Como se muestra en la figura 5C, la segunda tasa de captura es menor que la primera tasa de captura. Además, se puede observar la transición desde donde el ligando de analito de GFP se fija al analito de GFP (a aproximadamente 300 s) y a continuación se disocia (antes de 800 s) (figura 5C). En base a la identificación de una segunda tasa de captura que es diferente de la primera tasa de captura (figura 5C), se puede confirmar la presencia del analito de g Fp (SEQ ID NO: 10) en el genochip.

TEXTO LIBRE DEL LISTADO DE SECUENCIAS

SEQ ID NO: 1 (ADN de WT a-HL)

ATGGCAGATC TCGATCCCGC GAAATTAATA CGACTCACTA TAGGGAGGCC 50

ACAACGGTTT CCCTCTAGAA ATAATTTTGT TTAACTTTAA GAAGGAGATA 100

TACAAATGGA TTCAGATATT AATATTAAAA CAGGTACAAC AGATATTGGT 150

TCAAATACAA CAGTAAAAAC TGGTGATTTA GTAACTTATG ATAAAG AAAA 200

TGGTATGCAT AAAAAAG TAT TTTATTCTTT TATTGATGAT AAAAATCATA 250

ATAAAAAATT GTTAGTTATT CGTACAAAAG GTACTATTGC AGGTCAATAT 300

AGAGTATATA GTGAAGAAGG TGCTAATAAA AGTGGTTTAG CATGGCCATC 350

TGCTTTTAAA GTTCAATTAC AATTACCTGA TAATGAAGTA GCACAAATTT 400

CAGATTATTA TCCACGTAAT AGTATTGATA CAAAAGAATA TATGTCAACA 450

TTAACTTATG GTTTTAATGG TAATGTAACA GGTGATGATA CTGGTAAAAT 500

TGGTGGTTTA ATTGGTGCTA ATGTTTCAAT TGGTCATACA TTAAAATATG 550

TACAACCAGA TTTTAAAACA ATTTTAGAAA GTCCTACTGA TAAAAAAG TT 600

GGTTGGAAAG TAATTTTTAA TAATATGGTT AATCAAAATT GGGGTCCTTA 650

TGATCGTGAT AGTTGGAATC CTGTATATGG TAATCAATTA TTTATGAAAA 700

CAAGAAATGG TTCTATGAAA GCAGCTGATA ATTTCTTAGA TCCAAATAAA 750

GCATCAAGTT TATTATCTTC AGGTTTTTCT CCTGATTTTG CAACAGTTAT 800

TACTATGGAT AGAAAAGCAT CAAAACAACA AACAAATATT GATGTTATTT 850

ATGAACGTGT AAGAGATGAT TATCAATTAC ATTGGACATC AACTAATTGG 900

AAAGGTACAA ATACTAAAGA TAAATGGACA GATAGAAGTT CAGAAAGATA 950

TAAAATTGAT TGGGAAAAAG AAGAAATGAC AAATGGTCTC AGCGCTTGGA 1000

GCCACCCGCA GTTCGAAAAA TAA 1023

SEQ ID NO: 2 (aminoácidos de WT a-HL) [como se expresa en E. coli]

MADSDINIKT GTTD1GSNTT VKTGDLVTYD KENGMHK.KVF YSFIDDKNHN 50

KKLLVIRTKG TIAGQYRVYS EEGANKSGLA WPSAFKVQLQ LPDNEVAQIS

100

DYYPRNSIDT KEYMSTLTYG FNGNVTGDDT GKIGGLTGAN VSIGHTLKYV

150

QPDFICT1LES PTDKKVGWKV 1FNNMVNQNW GPYDRDSWNP VYGNQLFMKT 200

RNGSMKAADN FLDPNKASSL LSSGFSPDFA TVITMDRKAS KQQTNIDV1Y 250

ERVRDDYQLH WTSTNWKGTN TKDKWTDRSS ERYKIDWEKE EMTNGLSAWS 300

HPQFEK 306

SEQ ID NO: 3 (WT aHL madura, con marca de purificación)

AD SDIN IKTG TTDIG SNTTV K T G D LV T Y D K EN G M H KKVFY

SFIDDKNHNK

50

K LLV IR T K G T IAGQYRVYSE EG ANKSG FAW PSAFKVQFQL PDNEVAQ1SD

100

YYPRNSIDTK EYMSTFTYGF NGNVTGDDTG K IG G LIG AN V

S1GHTLKYVQ

150

PDFKTILESP T D K K V G W K V I FNNM VNQ NW G PYDRDSW NPV YG NQ LFM KTR

200

N G SM KAAD N F LDPNKASSLL SSGFSPDFAT V ITM D R K A S K Q Q TN ID VIYE

250

RVRDDYQFHW TSTNW KGTNT KDKW TDRSSE RYK1DWEKEE

M TNGLSAW SH

300

PQFEK

305

SEQ ID NO: 4 (a-HL-LNKR—SpyTag—HIS—CapTag)

Subrayado = conector flexible; negrita = SpyTag; cursiva = marca Hist; negrita/subrayado = nanomarca basada en péptidos

ADSDINIKTG TTDIGSNTTV KTGDLVTYDK ENGMGKKVFY

SFIDDKNHNK 50

KLLVIRTKGT 1AGQYRVYSE EGANKSGLAW PSAFKVQLQL

PDNEVAQISD 100 YYPRNSIDTK EYMSTLTYGF NGNVTGDDTG

KIGGLIGANV SIGHTLKYVQ 150

PDFKTILESP TDKKVGWKVI FNNMVNQNWG PYDRDSWNPV YGNQLFMK.TR 200 NGSMKAADNF LDPNKASSLL SSGFSPDFAT

V1TMDRKASK QQTNIDV1YE 250 RVRDDYQLHW TSTNWKGTNT

KDKWTDRSSE RYKIDWEKEE MTNGGSSGGS 300 SGGAHIVMVD

W K P T K K G H H HHHHEAAAEA<A A E A A A E A A A E A A A E A A A E A>350

<A A E A A A E A A A E A A A E A A A E A A A E A A A E E E E E>381

SEQ ID NO: 5 (variante de a-HL H35G, 6 componentes)

Subrayado = TEV-marca His

ADSDINIKTG TTDIGSNTTV KTGDLVTYDK ENGMGKKVFY SFIDDKNHNK 50 KLLVIRTKGT IAGQYRVYSE EGANKSGLAW

PSAFKVQLQL PDNEVAQISD 100 YYPRNSIDTK EYMSTLTYGF

NGNVTGDDTG KIGGLIGANV SIGATLKYVQ 150 PDFKTILESP

TDKKVGWKVI FNNMVNQNWG PYDRDSWNPV YGNQLFMKTR 200

NGSMKAADNF LDPNKASSLL SSGFSPDFAT VITMDRKASK QQTNIDVIYE

250 RVRDDYQLHW TSTNWKGTNT KDKWTDRSSE RYKIDWEKEE

MTNGLSAENL 300 YFOGHHHHHH 310

SEQ ID NO: 6 (OmpG)

EERNDWHFNI GAMYEIENVE GYGEDMDGLA EPSVYFNAAN GPWRIALAYK 50 QEGPVDYSAG KRGTWFDRPE LEVHYQFLEN

DDFSFGLTGG FRNYGYHYVD 100 EPGKDTANMQ RWKIAPDWDV

KLTDDLRFNG WLSMYKFAND LNTTGYADTR 150 VETETGLQYT

FNETVALRVN YYLERGFNMD DSRNNGEFST QEIRAYLPLT 200

LGNHSVTPYT RIGLRAGHDF NRVGLFYGYD FQNGLSVSLE YAFEWQDHDE 250 GDSDKFHYAG VGVNYSF 267

SEQ ID NO: 7 (OmpG-LNKR1-HIS-LNKR2-SpyTag-CapTag)

Subrayado = conector flexible; cursiva = marca His; GSGG (SEQ ID NO: 14) = segundo conector; negrita/subrayado = SpyTag; negrita en solitario = nanomarca basada en péptidos

EERNDWHFNI GAMYEIENVE GY GEDMDGLA EPSVYFNAAN GPWRIALAYK QEGPVDYSAG KRGTWFDRPE LEVHYQFLEN DDFSFGLTGG FRNYGYHYVD EPGKDTANMQ RWKIAPDWDV KLTDDLRFNG WLSMYKFAND LNTTGYADTR VETETGLQYT FNETVALRVN YYLERGFNMD DSRNNGEFST QEIRAYLPLT LGNHSVTPYT RIGLRAGHDF NRVGLFY GYD FQNGLSVSLE YAFEWQDHDE GDSDKFHYAG VGVNYSFEKEbUiiíGSHHHHH HGSGGAHIVM VDAYKPTKEA AAEAAAEAAA EAAAEAAAEA AAEAAAEAAA EAAAEAAAEA AAEAAAEAAA EEEEE

SEQ ID NO: 8 (secuencia de aminoácidos de la marca de captura)EAAAEAAAEA AAEAAAEAAA EAAAEAAAEA AAEAAAEAAA EAAAEAAAEAA 50

AEEEEE 56

SEQ ID NO: 9 (nanocuerpo, GFP—LNKR—SpyCatcher—TEV/His)

Negrita = conector flexible; subrayado = TEV-marca His

QVQLVESGGA LVQPGGSLRL SCAASGFPVN RYSMRWYRQA PGKEREWVAG 50 MSSAGDRSSY EDSVKGRFTI SRDDARNTVY LQMNSLKPED TAVYYCNVNV 100 GFEYWGQGTQ VTVSSKGSGS GSDSATHIKF SKRDEDGKEL AGATMELRDS 150 SGKTISTW1S DGQVKDFYLY PGKYTFVETA APDGYEVATAITFTVNEQGQ 200 VTVNGKATKG DAHIENLYFO GHHHHHHHH 229

SEQ ID NO: 10 (GFP—CONECTOR—SpyCatcher—marca His)

Subrayado = marca Hist; negrita = conector flexible

SKGEELFTGV VPILVELDGD VNGHKFSVRG EGEGDATNGK LTLKFICTTG 50

KLPVPWPTLV TTLGYGVQCF SRYPDHMKRH DFFKSAMPEG YVQERTISFK 100

DGTYKTRAEV KFEGDTLVNR 1ELKG1DFKE DGNILGHRLE YNFNSHNVY1 150

TADKQKNGIK ANFKIRHNVE DGSVQLADHY QQNTPIGDGP VLLPDNHYLS 200

TQSKLSKDPN EKRDHMVLLE FVTAAGITHG MDELYKGSGG SGGSGGSGGS 250

GGAMVDTLSG LSSEQGQSGD MTIEEDSATH IKFSKRDEDG KELAGATMEL 300

RDSSGKTIST WISDGQVKD FYLYPGKYTF VETAAPDGYE VATAITFTVN

350

EOGOVTVNGK ATKGDAH1HH HHHH 374

SEQ ID NO: 11 (secuencia SpyTag)

AHIVMVDAYKPTKK

SEQ ID NO: 12 (secuencia conectora)

GGSSGGSSGG

SEQ ID NO: 13 (secuencia conectora)

EKEKEKGS

SEQ ID NO: 14 (secuencia conectora)

GSGG

SEQ ID NO: 15 (secuencia conectora)

GSGSGS

SEQ ID NO: 16 (WT a-HL madura; AAA26598)

ADSDINIKTG TTDIGSNTTV KTGDLVTYDK ENGMHKKVFY SF1DDKNHNK 50 KLLVIRTKGT IAGQYRVYSE EGANKSGLAW PSAFKVQLQL PDNEVAQISD 100 YYPRNSIDTK EYMSTLTYGF NGNVTGDDTG KIGGLIGANV SIGHTLKYVQ 150 PDFKTILESP TDKKVGWKVT FNNMVNQNWG PYDRDSWNPV YGNQLFMKTR

200 NGSMKAADNF LDPNKASSLL SSGFSPDFAT VITMDRKASK QQTNIDVIYE 250 RVRDDYQLHW TSTNWFCGTNT KDKWTDRSSE RYKIDWEKEE MTN 293

SEQ ID NO: 17 - Marca EPPP

EPPP

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un conjugado de proteína de nanoporo que comprende un monómero proteínico de nanoporo y una marca de captura, en el que la marca de captura comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %<de identidad de secuencia con respecto a la secuencia expuesta como SEQ ID NO:>8<(secuencia de marca de>captura), y en el que el monómero proteínico de nanoporo del conjugado de proteína de nanoporo comprende una<secuencia de aminoácidos que tiene al menos un>80<% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 16 (alfa-hemolisina (a-HL)) o SEQ ID NO:>6<(proteína G de membrana externa>(OMPG)).

2. El conjugado de proteína de nanoporo de la reivindicación 1, en el que la marca de captura comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, 95 %, 98 % o más de identidad de secuencia con respecto<a la secuencia expuesta como SEQ ID NO:>8<(secuencia de marca de captura).>

3. El conjugado de proteína de nanoporo de la reivindicación 1, en el que el monómero proteínico de nanoporo del conjugado de proteína de nanoporo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, 95 %, 98 % o más de identidad de secuencia con respecto a la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 16 (a-HL)<o SEQ ID NO:>6<(OMPG).>

4. El conjugado de proteína de nanoporo de la reivindicación 1, en el que el monómero proteínico de nanoporo del conjugado de proteína de nanoporo comprende un monómero de alfa-hemolisina y en el que la marca de captura comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o más de<identidad de secuencia con respecto a la secuencia expuesta como SEQ ID NO:>8<(secuencia de marca de>captura).

5. El conjugado de proteína de nanoporo de la reivindicación 1, en el que el conjugado de proteína de nanoporo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o más de identidad de secuencia con respecto a la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 7.

6<. Un complejo de detección de analito, en el que el complejo de detección de analito comprende un conjugado>de proteína de nanoporo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un ligando de analito que se une al conjugado de proteína de nanoporo.

<7. El complejo de detección de analito de la reivindicación>6<, en el que el ligando de analito es un nanocuerpo.>

8<. El complejo de detección de analito de las reivindicaciones>6<o 7, en el que el ligando de analito se une al>conjugado de proteína de nanoporo por medio de un enlace isopeptídico.

<9. El complejo de detección de analito de la reivindicación>8<, en el que el enlace isopeptídico es un enlace>SpyT ag/SpyCatcher.

10. Un ensamblaje de nanoporo que comprende al menos un complejo de detección de analito de cualquiera de las reivindicaciones 6-9.

11. El ensamblaje de nanoporo de la reivindicación 10, en el que el ensamblaje de nanoporo es un ensamblaje de nanoporo heptamérico y en el que cada monómero del ensamblaje de nanoporo heptamérico comprende un monómero de alfa-hemolisina.

12. Un procedimiento para detectar un analito en una solución líquida, que comprende:

<proporcionar un genochip que comprende un ensamblaje de nanoporo de acuerdo con la reivindicación>10<u>11<,>en el que el ensamblaje de nanoporo se dispone dentro de una membrana; situar un electrodo sensor contiguo o en proximidad a la membrana; determinar, con la ayuda de un procesador informático y el electrodo sensor, una primera tasa de captura de la marca de captura del ensamblaje de nanoporo;

poner en contacto el ensamblaje de nanoporo con un analito, en el que el analito comprende una afinidad de unión por el ligando de analito del complejo de detección de analito; y

determinar, con la ayuda del procesador informático y el electrodo sensor, una segunda tasa de captura de la marca de captura asociada con el ensamblaje de nanoporo, en el que la segunda tasa de captura proporciona una indicación de que el analito está unido al ligando de analito del complejo de detección de analito y, de este modo, está presente en la solución líquida.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la segunda tasa de captura es mayor o menor que la primera tasa de captura.

14. El procedimiento de la reivindicación 12 o 13, que comprende además identificar el analito en base a la identidad del ligando de analito y en base a la indicación de que el analito está unido al ligando de analito.

15. Un procedimiento para determinar la concentración de un analito en una solución líquida, que comprende: proporcionar un genochip que comprende un ensamblaje de nanoporo de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en el que el ensamblaje de nanoporo se dispone dentro de una membrana; situar un electrodo sensor contiguo o en proximidad a la membrana; determinar, con la ayuda de un procesador informático y el electrodo sensor, una primera tasa de captura de la marca de captura del ensamblaje de nanoporo;

poner en contacto el ensamblaje de nanoporo con un analito, en el que el analito comprende una afinidad de unión por el ligando de analito del complejo de detección de analito;

identificar, con la ayuda del procesador informático y el electrodo sensor, una primera transición desde la primera tasa de captura a una segunda tasa de captura de la marca de captura del complejo de detección de analito; identificar, con la ayuda del procesador informático y el electrodo sensor, una segunda transición desde la segunda tasa de captura a la primera tasa de captura aproximada; y

determinar, en base al menos en parte a la identificación de la primera transición y la segunda transición, la concentración del analito en la solución líquida.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que la segunda tasa de captura es mayor o menor que la primera tasa de captura.

17. El procedimiento de las reivindicaciones 15 o 16, en el que determinar la concentración del analito en la solución líquida comprende además medir un intervalo de tiempo entre la primera transición y la segunda transición.

18. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 15-17, en el que determinar la concentración del analito en la solución líquida comprende además determinar una tasa de asociación entre el analito y el ligando de analito del complejo de detección de analito del ensamblaje de nanoporo.

19. Un sistema para determinar la concentración de analito en una solución líquida, que comprende:

un genochip que comprende un ensamblaje de nanoporo, en el que el ensamblaje de nanoporo se dispone dentro de una membrana del genochip y en el que al menos un monómero proteínico de nanoporo del ensamblaje de nanoporo comprende una marca de captura y un ligando de analito;

un electrodo sensor situado contiguo a o en proximidad a la membrana, en el que el electrodo sensor está configurado para detectar una señal del ensamblaje de nanoporo; y

un procesador informático, en el que el procesador informático y los electrodos sensores están configurados para identificar una primera transición y una segunda transición asociadas con el ensamblaje de nanoporo, correspondiendo la primera transición a la unión de un analito al ligando de analito y correspondiendo la segunda transición a la disociación del analito del ligando de analito; en el que el monómero proteínico de nanoporo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 16 (a-HL) o 6 (OMPG); y en el que la marca de captura comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 8 (secuencia de marca de captura).

20. El sistema de la reivindicación 19, en el que se determina una concentración del analito en la solución líquida en base al menos en parte a la primera transición identificada y la segunda transición identificada.

21. El sistema de la reivindicación 19 o 20, en el que el monómero proteínico de nanoporo es un monómero de alfa-hemolisina.

22. El sistema de la reivindicación 19 o 20, en el que el monómero proteínico de nanoporo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, 95 %, 98 % o más de identidad de secuencia con respecto a la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 16 (a-HL) o 6 (OMPG).

23. El sistema de la reivindicación de cualquiera de las reivindicaciones 19-22, en el que la marca de captura comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, 95 %, 98 % o más de identidad de secuencia con respecto a la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 8 (secuencia de marca de captura).