CN111801344B - 用于分析物的检测和分析的纳米孔蛋白缀合物 - Google Patents

Abstract

提供了用于检测目标分析物的方法、组合物和系统。还提供了用于确定流体溶液中一种或多种目标分析物的浓度的方法、组合物和系统。所述组合物包括其中纳米孔蛋白单体与捕获标签连接的纳米孔缀合物。与纳米孔蛋白缀合物相连的是针对特定分析物的分析物配体。当在包括纳米孔缀合物的纳米孔组件上施加电压时，纳米孔以给定的捕获速率捕获捕获标签。然而，在有分析物配体的分析物存在下，捕获标签的捕获率改变，从而允许通过纳米孔组件检测分析物。此外，基于与分析物和分析物配体之间的结合相关的捕获率，可以使用结合/解离动力学确定分析物的浓度。

Description

用于分析物的检测和分析的纳米孔蛋白缀合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年2月15日提交的标题为“NANOPORE PROTEIN CONJUGATES FORDETECTION AND ANALYSIS OF ANALYTES（用于分析物的检测和分析的纳米孔蛋白缀合物）”的美国临时专利申请号62/630,993的优先权权益。上述优先权申请的整个公开内容特此完整地通过引用整体并入本文。

序列表

本申请含有序列表，其已经以ASCII格式电子地提交，且特此通过引用整体并入。所述ASCII拷贝（创建于2019年1月16日）被命名为08485_001WO1_SL.txt且具有29,354字节大小。

技术领域

本公开内容总体上涉及用于检测目标分析物的方法、组合物和系统，且更具体地涉及纳米孔蛋白缀合物用于鉴定流体溶液中的分析物和确定溶液中的分析物浓度的用途。

背景

生物活性组分，诸如小分子、蛋白、抗原、免疫球蛋白和核酸，参与许多生物学过程和功能。因此，此类组分的水平的任何紊乱都可以导致疾病或加速疾病过程。由于该原因，在开发可靠的方法以快速检测和鉴定用于患者诊断和治疗的生物活性组分方面已经付出了很多努力。例如，检测血液或尿液样品中的蛋白质或小分子可用于评估患者的代谢状态。类似地，对血液或尿液样品中的抗原的检测可以用于鉴定患者已经暴露的病原体，从而促进适当的治疗。并且随着胎儿无细胞DNA的鉴定的最新进展，通过检测无细胞DNA来从母亲的血液样品在产前诊断某些遗传障碍的能力现在是可能的。能够确定溶液中分析物的浓度是进一步有益的。例如，确定血液或尿液组分的浓度可以使该组分与参考值进行对比，从而有助于进一步评价患者的健康状况。

然而，尽管有许多检测和鉴定方法可用，但是许多方法是昂贵的并且可能相当耗时。例如，许多诊断测试可能需要几天才能完成，并且需要大量的实验室资源。且在某些情况下，诊断延迟可能会对患者护理产生负面影响，例如在分析与心肌梗塞相关的标志物时。此外，许多旨在鉴定生物活性组分的诊断测试的复杂性使其自身容易出错，从而降低了准确性。并且，许多检测和鉴定方法一次仅可以分析一种或几种生物活性组分（且不可确定浓度）。

需要另外的方法、组合物和系统，其可以快速地检测和鉴定生物活性组分，特别是以有效且有成本效应的方式。还需要可以同时测定多种生物活性组分从而降低成本的方法、组合物和系统。此外，需要方法、组合物和系统来确定流体溶液中的生物活性组分的浓度。

发明内容

在某些实例方面，提供了一种纳米孔蛋白缀合物，其包括纳米孔蛋白单体和捕获标签。例如，纳米孔蛋白缀合物可以包含与SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 7所示的序列具有至少60%、65%、70%、80%、90%或95%或更多序列同一性的氨基酸序列。

在某些实例方面，提供了一种包括纳米孔蛋白缀合物的分析物检测复合物。例如，分析物检测复合物包括连接至纳米孔蛋白缀合物的分析物配体，诸如经由异肽键。

在某些实例方面，提供了一种纳米孔组件，其包括至少一种分析物检测复合物。例如，纳米孔组件可以是包括分析物检测复合物的七聚体纳米孔组件。在某些实例方面，缀合物的纳米孔单体是α-溶血素单体，并且七聚体的其它六个单体中的每一个是α-溶血素单体。

在某些实例方面，提供了一种用于检测流体溶液中的分析物的方法。该方法包括提供包括本文所述的纳米孔组件的芯片。例如，纳米孔组件包括分析物检测复合物，所述分析物检测复合物包括纳米孔单体、捕获标签和分析物配体。此外，纳米孔组件设置在芯片的膜内。然后将传感电极放置在膜邻近或附近。借助于计算机处理器和传感电极确定捕获标签的第一捕获率。然后使纳米孔组件与分析物接触，所述分析物对分析物检测复合物的分析物配体具有结合亲和力。然后使用计算机处理器和传感电极，确定捕获标签的第二捕获率。例如，第二捕获率提供了一种指示，即分析物与分析物检测复合物的分析物配体结合，因此表明分析物存在于流体溶液中。第二捕获率例如可以小于或大于第一捕获率。此外，基于分析物配体的身份-以及基于分析物与分析物配体结合的指示-可以确定分析物的身份。

在其它实例方面，提供了一种用于确定流体溶液中分析物的浓度的方法。该方法包括提供具有本文所述的纳米孔组件的芯片，该纳米孔组件设置在膜内。纳米孔组件包括例如分析物检测复合物，所述分析物检测复合物包括纳米孔单体、捕获标签和分析物配体。传感电极位于膜邻近或附近。此后，借助于计算机处理器和传感电极，确定纳米孔组件的捕获标签的第一捕获率。然后使纳米孔组件与分析物接触，该分析物对分析物检测复合物的分析物配体具有结合亲和力。借助于计算机处理器和传感电极，鉴定分析物检测复合物的捕获标签从第一捕获率到第二捕获率的第一转变。然后，借助于计算机处理器和传感电极，鉴定从第二捕获率到近似于第一捕获率的捕获率的第二转变。然后至少部分地基于第一转变和第二转变的鉴定，确定流体溶液中分析物的浓度。例如，转变率之间的时间间隔可用于确定分析物的浓度。

在其它实例方面，提供了一种用于确定流体溶液中的分析物浓度的系统。该系统还可用于检测溶液中的分析物。该系统包括例如具有纳米孔组件的芯片，该纳米孔组件设置在芯片的膜内。纳米孔组件例如包括至少一种具有捕获标签的纳米孔蛋白单体和分析物配体。该系统还包括位于膜邻近或附近的传感电极。传感电极例如被配置成检测来自纳米孔组件的信号。该系统还包括计算机处理器，该计算机处理器与传感电极一起被配置成鉴定与纳米孔组件相关的第一转变和第二转变。第一转变例如对应于分析物与分析物配体的结合。第二转变例如对应于分析物与分析物配体的解离。

在系统的某些实例方面，至少部分地基于所鉴定的第一转变和所鉴定的第二转变来确定流体溶液中分析物的浓度。在系统的某些实例方面，纳米孔蛋白单体是α-溶血素单体或OmpG单体。在系统的某些实例方面，纳米孔蛋白单体包括与SEQ ID NO: 4或SEQ IDNO:7所示的序列具有至少80%、90%、95%、98%或更多序列同一性的氨基酸序列。在系统的某些实例方面，捕获标签包括与SEQ ID NO: 8所示的序列具有至少80%、90%、95%、98%或更多序列同一性的氨基酸序列。

在考虑了以下对举例说明的实施例实施方案的详细描述之后，本领域普通技术人员会明白实施例实施方案的这些和其它方面、目的、特征和优点。

附图说明

图1是显示根据某些实施例实施方案的纳米孔蛋白缀合物的图示。

图2是显示根据某些实施例实施方案的分析物检测复合物的图示。

图3是显示根据某些实施例实施方案的包括分析物检测复合物的纳米孔组件的图示。

图4A-4C是显示根据某些实施例实施方案的与不同捕获率相关的不同孔状态的图示。更具体地，图4A显示了包括纳米孔蛋白缀合物、但是不包括分析物配体（且因此不包括分析物检测复合物）的纳米孔组件。这样的孔与捕获标签的基线捕获率相关（实线对虚线，示出捕获）。图4B显示了相同的纳米孔组件，但是附有分析物配体（例如，纳米抗体）。因此，图4B的纳米孔组件包括分析物检测复合物。图4B的纳米孔组件与捕获标签的第一捕获率相关（实线对虚线，示出捕获）。图4C显示了与图4B相同的孔，但是现在附有分析物（例如，纳米抗体的抗原）。这样的孔与捕获标签的第二捕获率相关（实线对虚线，示出捕获）。

图5A-5C是显示根据某些实施例实施方案的各种捕获率的图，因为那些捕获率对应于纳米孔组件的结合状态。更具体地，图5A是显示基线捕获率的测量的图。图5B是显示第一捕获率的测量的图，其中分析物配体结合至纳米孔组件的纳米孔蛋白缀合物，从而形成分析物检测复合物。在图5B中，不存在分析物。图5C显示了第一捕获率（无分析物结合）和第二捕获率（与分析物结合）的捕获率测量。还示出了从第一捕获率到第二捕获率的第一转变以及从第二捕获率回到第一捕获率的第二转变。

具体实施方式

通过参考以下详细描述、实施例和权利要求以及它们的先前和随后描述，可以更容易地理解本文描述的实施方案。在公开和描述本系统、装置、组合物和/或方法之前，应当理解，除非另外指出，否则本文所述的实施方案不限于所公开的特定系统、装置和/或组合物方法，因为这些当然可以变化。还应该理解，本文所使用的术语仅用于描述特定方面，而无意进行限制。

此外，提供以下描述作为各个实施方案在其最好的当前已知方面的实现教导。相关领域技术人员会认识到，可以对所描述的方面进行许多改变，同时仍然获得本公开内容的有益结果。还将显而易见的是，通过选择各种实施方案的一些特征而不利用其它特征，可以获得本发明的一些期望的益处。因此，本领域技术人员会认识到，对本文描述的各种实施方案的许多修改和改变是可能的，并且在某些情况下甚至可能是期望的，并且是本公开内容的一部分。因此，提供以下描述作为对本文描述的实施方案的原理的示例，而不是对它的限制。

概述

如在本文中公开的，提供了用于检测目标分析物的方法、组合物和系统。还提供了用于确定流体溶液中一种或多种目标分析物的浓度的方法、组合物和系统。该组合物包括其中纳米孔蛋白单体与捕获标签连接的纳米孔缀合物。与纳米孔蛋白缀合物相连的是可以针对特定分析物的分析物配体。如本文所述，当在包括纳米孔缀合物的纳米孔组件上施加电压时，所述纳米孔以给定的捕获率捕获所述捕获标签。但是，在有针对分析物配体的分析物存在下，捕获标签的捕获率改变，从而允许通过纳米孔组件检测分析物。此外，基于与分析物和分析物配体之间的结合相关的捕获率，在某些实施例中可以确定分析物的浓度。

更特别地，本文所述的纳米孔缀合物的纳米孔蛋白单体可以是任何类型的生物纳米孔蛋白单体。例如，纳米孔蛋白单体可以是α-溶血素(α-HL)单体、OmpG单体或其它蛋白纳米孔单体。例如，当纳米孔蛋白单体是α-溶血素时，所得的纳米孔蛋白缀合物是α-溶血素/捕获标签蛋白缀合物。

通过使用α-溶血素纳米孔单体形成缀合物，例如，缀合物的α-溶血素单体可与其它α-HL单体寡聚化，从而形成七聚体纳米孔组件。七聚体组件例如可以具有一个α-溶血素/捕获标签缀合物和六个α-溶血素单体，例如六个野生型α-溶血素单体。在这样的实施例中，蛋白缀合物的捕获标签被配置成在电压存在下与七聚体纳米孔组件相互作用。在某些实施例中，在α-溶血素单体的合成过程中，捕获标签经由接头序列与α-溶血素融合，从而形成纳米孔蛋白缀合物。捕获标签例如是纳米孔可以捕获和释放从而导致可检测的捕获率的任何分子。

除了包括捕获标签外，纳米孔蛋白缀合物还被连接至分析物配体。分析物配体例如可以是结合分析物的任何配体。在某些实施例中，分析物配体是纳米抗体，例如在有抗原存在下结合抗原或其片段的抗体或其片段。可以将分析物配体直接或间接地（例如通过肽接头序列）结合至纳米孔蛋白缀合物。例如，纳米孔蛋白缀合物可以包括用于将分析物配体连接至纳米孔组件的区域。在某些实施例中，纳米孔蛋白缀合物可以包括SpyTag序列。在这样的实施例中，分析物配体可以连接到SpyCatcher序列。因此，分析物配体可以通过SpyTag/SpyCatcher键而连接至纳米孔蛋白缀合物。在某些实施例中，本文所述的捕获标签可以与分析物配体连接。

当组装到芯片的膜中时，包含本文所述的纳米孔蛋白缀合物和分析物配体的纳米孔蛋白组件可用于鉴定流体溶液中的分析物和/或确定分析物的浓度。不希望受任何特定理论约束，当芯片与包含分析物的流体溶液接触时，据信，分析物-配体结合对与捕获标签的接近会改变捕获标签与孔的相互作用，从而影响捕获标签的捕获率。然后，靠近膜的电极可以检测捕获率的变化，从而提供分析物结合至分析物配体的指示，并从而表明配体存在于流体溶液中。此外，使用结合/解离动力学，可以基于捕获标签的捕获率来确定分析物的浓度。也就是说，捕获率的变化可用于确定分析物的K_a和/或K_d，并且与其它已知变量一起，确定的K_a和/或K_d可用于确定流体溶液中分析物的浓度。

在其它实施例中，可以在单个芯片上使用针对不同分析物的不同纳米孔蛋白组件，以在同一芯片上检测和/或确定不同分析物的浓度。在这样的实施例中，不同的纳米孔蛋白组件可以被配置成产生可被传感电极检测到的不同信号。例如，可以使用各种参数（例如，孔的开放孔通道的大小，不同的捕获标签，和/或其它捕获标签在膜的反面侧放置）来改变给定孔集合产生的基线信号。例如，利用这种配置，具有较大开口的孔可以提供比具有较小开口的孔更强的信号，从而允许区分同一芯片上的孔。然后可以将不同的孔与它们被配置成检测的分析物相关联，从而允许在同一芯片上鉴定不同分析物。此外，可以使用结合/解离动力学如本文所述确定每种检测到的分析物的浓度。

术语的总结

现在将使用下述定义和实施例仅通过参考来详细描述本发明。除非在本文中另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料都可以用在本发明的实践或测试中，但是描述了优选的方法和材料。应当理解，本发明不限于所描述的具体方法、方案和试剂，因为这些可能变化。

本文提供的标题不是本发明的各个方面或实施方案的限制，其可以通过参考整个说明书来获得。因此，在下面紧接着定义的术语通过参考整个说明书更完整地定义。

本文中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指明。

范围或值在本文中可以表示为从“约”一个特定值和/或到“约”另一个特定值。当表达这样的范围时，另一个方面包括从该范围的一个特定值和/或到该范围的另一个特定值。进一步理解，每个范围的端点相对于其它端点是显著的，并且独立于其它端点。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应该理解，所述特定值形成另一个方面。在某些实施例实施方案中，术语“约”被理解为在给定测量的本领域的正常公差范围内，例如，诸如在平均值的2个标准差之内。在某些实施例实施方案中，取决于测量，“约”可以理解为在所述值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%内。除非另外从上下文明白，否则本文提供的所有数值均可以用术语“约”修饰。此外，本文中使用的术语，诸如“实施例”、“示例性的”或“示例”，并不意味着表明偏好，而是解释其后所讨论的方面仅仅是所提出的方面的一个例子。

本文中使用的术语“抗体”广泛地表示由四个多肽链即两个重（H）链和两个轻（L）链构成的任何免疫球蛋白(Ig)分子，或其任何功能片段、突变体、变体或衍生物，其保留Ig分子的基本表位结合特征。这样的突变体、变体或衍生物抗体实体是本领域已知的。抗体的功能片段，例如，包括抗体的一部分，当与抗体整体分离时，其保留结合或部分地结合抗体所针对的抗原的能力。“纳米抗体”，例如，单结构域抗体片段。

本文中使用的术语“氨基酸”是含有氨基基团和羧酸基团的有机化合物。肽或多肽含有两个或多个氨基酸。就本文的目的而言, 氨基酸包括二十种天然存在的氨基酸、非天然的氨基酸和氨基酸类似物（即，其中α-碳具有侧链的氨基酸）。

本文中使用的“多肽”表示氨基酸的任何聚合物链。术语“肽”和“蛋白”与术语多肽互换使用，并且还指氨基酸的聚合物链。术语“多肽”包括天然或人工蛋白、蛋白片段和蛋白序列的多肽类似物。多肽可以是单体的或聚合的，并且可以包括许多修饰。通常，肽或多肽具有大于或等于2个氨基酸的长度，并且通常具有小于或等于40个氨基酸的长度。

本文中使用的“α-溶血素”、“α-溶血素”、“α-HL”、“a-HL”和“溶血素”互换使用，且表示自装配成七聚体水填充的跨膜通道（即纳米孔）的单体蛋白。根据上下文，该术语还可以表示由七个单体蛋白形成的跨膜通道。在某些实施例实施方案中，α-溶血素是“修饰的α-溶血素”，意指α-溶血素起源于另一种(即，亲本)α-溶血素，并且与亲本α-溶血素相比含有一个或多个氨基酸改变（例如，氨基酸置换、缺失或插入）。在一些实施例实施方案中，本发明的修饰的α-溶血素源自天然存在的或野生型α-溶血素或由其修饰而来。在一些实施例实施方案中，经修饰的α-溶血素源自重组的或经工程改造的α-溶血素或由其修饰而来，包括、但不限于嵌合α-溶血素、融合α-溶血素或另一种修饰的α-溶血素。通常，与亲本α-溶血素相比，修饰的α-溶血素具有至少一个改变的表型。在某些实施例实施方案中，α-溶血素起源于“变体溶血素基因”或是“变体溶血素”，其分别意味着，通过除去、添加和/或操作编码序列已经改变了来自金黄色葡萄球菌的α-溶血素基因的核酸序列，或者已经与本文描述的发明一致地修饰了表达的蛋白的氨基酸序列。

本文中使用的术语“分析物”或“目标分析物”广泛地指待检测、鉴定或表征的任何目标化合物、分子或其它物质。例如，术语“分析物”或“目标分析物”包括任何目标生理分子或试剂，其是正被检测和/或测量的特定物质或组分。在某些实施例实施方案中，分析物是目标生理分析物。额外地或可替换地，分析物可以是具有生理作用的化学物质，例如药物或药理学试剂。额外地或可替换地，分析物或目标分析物可以是环境因素或其它化学试剂或实体。术语“试剂”在本文中用于表示化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子、或从生物学材料制备的提取物。例如，试剂可以是细胞毒性剂。

在某些实施例实施方案中，术语“分析物”或“目标分析物”包括毒素、有机化合物、蛋白、肽、微生物、氨基酸、碳水化合物、核酸、激素、类固醇、维生素、药物（包括为治疗目的而施用的那些以及为非法目的而施用的那些）、脂质、病毒颗粒以及任何上述物质的代谢物或抗体。例如，分析物可以包括铁蛋白；肌酸酐激酶MIB (CK-MIB)；地高辛；苯妥英；苯巴比妥(phenobarbitol)；卡马西平；万古霉素；庆大霉素；茶碱；丙戊酸；奎尼丁；黄体化激素(LH)；促卵泡激素(FSH)；雌二醇, 黄体酮; IgE抗体；维生素B2微球蛋白；糖化的血红蛋白(Gly. Hb)；皮质醇；洋地黄毒苷; N-乙酰基普鲁卡因胺(NAPA)；普鲁卡因胺；针对风疹的抗体，诸如风疹-IgG和风疹-IgM；针对弓形虫病的抗体，诸如弓形虫病IgG (Toxo-IgG)和弓形虫病IgM (Toxo-IgM)；睾酮；水杨酸盐；对乙酰氨基酚；乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)；针对乙型肝炎核心抗原的抗体，诸如抗-乙型肝炎核心抗原IgG和IgM (抗-HBC)；人免疫缺陷病毒1和2 (HTLV)；乙型肝炎抗原(HBeAg)；针对乙型肝炎抗原的抗体(抗-Hbe)；促甲状腺激素(TSH)；甲状腺素(T4)；总三碘甲状腺原氨酸(总T3)；游离三碘甲状腺原氨酸(游离T3)；癌胚抗原(CEA)；和α胎蛋白(AF)；和滥用和管制物质的药物，包括但无意限于：苯丙胺；甲基苯丙胺；巴比妥酸盐诸如异戊巴比妥、司可巴比妥（seobarbital）、戊巴比妥、苯巴比妥和巴比妥；苯并二氮杂环庚三烯类诸如librium和valium；大麻素类诸如hashish和marijuana；可卡因; fetanyl; LSD；安眠酮(methapualone)；鸦片剂诸如二醋吗啡、吗啡、可待因(codine)、氢吗啡酮、氢可酮、美沙酮、羟考酮、羟吗啡酮和鸦片；苯环利定；和丙氧吩。术语分析物还包括任何抗原性物质、半抗原、抗体、大分子和它们的组合。

其它实例分析物或目标分析物包括、叶酸盐、叶酸盐RBC、铁、可溶性转铁蛋白受体、转铁蛋白、维生素B12、乳酸脱氢酶、骨钙、N-MID骨钙素、P1NP、磷、PTH、PTH (1-84)、b-CrossLaps、维生素D、心脏载脂蛋白A1、载脂蛋白B、胆固醇、CK、CK-MB、CK-MB (mass)、CK-MB(mass) STAT、CRP hs、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、D-二聚体、心脏洋地黄毒苷、地高辛、GDF-154、直接HDL胆固醇（HDL Cholesterol direct）、高半胱氨酸、羟丁酸脱氢酶、直接LDL胆固醇（LDL Cholesterol direct）、脂蛋白(a)、肌红蛋白、肌红蛋白STAT、NT-proBNP、NT-proBNP STAT、1肌钙蛋白I、1肌钙蛋白I STAT、肌钙蛋白T hs、肌钙蛋白T hs STAT、凝固ATIII、D-二聚体、滥用药物测试苯丙胺(Ecstasy)、苯并二氮杂环庚三烯类、苯并二氮杂环庚三烯类(血清)、大麻素类、可卡因、乙醇、美沙酮、美沙酮代谢物(EDDP)、甲喹酮、阿片剂类、羟考酮、3、苯环利定、右丙氧芬、淀粉酶、ACTH、抗-Tg、抗-TPO、抗-TSH-R、降钙素、皮质醇、C-肽、FT3、FT4、hGH、羟基丁酸脱氢酶、IGF-14、胰岛素、脂肪酶、PTH STAT、T3、T4、甲状腺球蛋白(TG II)、甲状腺球蛋白证实（confirmatory）、TSH、T-摄取、能育性抗Muellerian激素、DHEA-S、雌二醇、FSH、hCG、hCG + β、LH、黄体酮、催乳素、SHBG、睾酮、肝脏病学AFP、碱性磷酸酶(IFCC)、碱性磷酸酶(opt.)、3、具有Pyp的ALT/GPT 、没有Pyp的ALT/GPT、氨、抗-HCV、 具有Pyp的AST/GOT 、没有Pyp的AST/GOT 、直接胆红素、总胆红素、胆碱酯酶乙酰基、3胆碱酯酶丁酰基、γ谷氨酰基转移酶、谷氨酸脱氢酶、HBeAg、HBsAg、乳酸脱氢酶、感染性疾病抗-HAV、抗-HAV IgM、抗-HBc、抗-HBc IgM、抗-HBe、HBeAg、抗-HBsAg、HBsAg、HBsAg证实、HBsAg定量、抗-HCV、Chagas 4、CMV IgG、CMV IgG亲合力、CMV IgM、HIV combi PT、HIV-Ag、HIV-Ag证实、HSV-1 IgG、HSV-2 IgG、HTLV-I/II、风疹IgG、风疹IgM、梅毒、Toxo IgG、Toxo IgG亲合力、Toxo IgM、TPLA (梅毒)、抗-CCP、ASLO、C3c、C4、血浆铜蓝蛋白、CRP (胶乳)、触珠蛋白、IgA、IgE、IgG、IgM、免疫球蛋白A CSF、免疫球蛋白M CSF、白介素6、κ轻链、κ轻链free6、2,3、λ轻链、λ轻链free6、2,3、前清蛋白、原降钙素、类风湿因子、a1-Acid糖蛋白、a1-抗胰蛋白酶, 碳酸氢盐(CO2)、钙、氯化物、果糖胺、葡萄糖、HbA1c (溶血产物)、HbA1c (全血)、胰岛素、乳酸盐、直接LDL胆固醇、镁、钾、钠、总蛋白、甘油三酯、甘油三酯甘油空白(Triglycerides Glycerol blanked)、总维生素D, 酸性磷酸酶、AFP、CA 125、CA 15-3、CA19-9、CA 72-4、降钙素、Cyfra 21-1、hCG + β、HE4、κ轻链free6、2,3、λ轻链free6、2,3、NSE、proGRP、PSA free、总PSA、SCC、S-100、甲状腺球蛋白(TG II)、甲状腺球蛋白证实、b2-微球蛋白、白蛋白(BCG)、白蛋白(BCP)、免疫学白蛋白、肌酸酐(酶促的)、肌酸酐(Jaffe)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、钾、PTH、PTH (1-84)、总蛋白、总蛋白、尿/CSF、脲/BUN、尿酸、a1-微球蛋白、b2-微球蛋白、对乙酰氨基酚(对乙酰氨基酚)、阿米卡星、卡马西平、环孢菌素、洋地黄毒苷、地高辛、依维莫司、庆大霉素、利多卡因、锂、ISE麦考酚酸、NAPA、苯巴比妥、苯妥英、扑米酮、普鲁卡因胺、奎尼丁、水杨酸盐、西罗莫司、他克莫司、茶碱、妥布霉素、丙戊酸、万古霉素, 抗Muellerian激素、AFP、b-Crosslaps、DHEA-S、雌二醇、FSH、游离ßhCG、hCG、hCG + β、hCG STAT、HE4、LH、N-MID骨钙素、PAPP-A、PlGF、sFIt-1、P1NP、黄体酮、催乳素、SHBG、睾酮、CMV IgG、CMV IgG亲合力、CMV IgM、风疹IgG、风疹IgM、Toxo IgG、Toxo IgG亲合力和/或Toxo IgM。

本文中使用的术语“配体”或“分析物配体”广泛地表示与另一实体（例如受体）结合形成较大复合物的任何化合物、分子、分子基团或其它物质。例如，分析物配体是对分析物具有结合亲和力的实体，如该术语在本领域中理解并在本文中广泛定义的。分析物配体的例子包括、但不限于肽、碳水化合物、核酸、抗体或与受体结合的任何分子。在某些实施例中，配体与分析物形成复合物以用于生物学目的。如本领域技术人员将理解的，配体和它的结合配偶体（例如，分析物）之间的关联随电荷、疏水性和分子结构而变化。结合可以通过多种分子间力发生，诸如离子键、氢键和范德华力。在某些实施例中，配体或分析物配体是与抗原具有结合亲和力的抗体或其功能片段。

本文中使用的术语“DNA”表示包含至少一个脱氧核糖核苷酸残基的分子，如本领域通常理解的。“脱氧核糖核苷酸”是在β-D-脱氧呋喃型核糖部分的2'位置处没有羟基而是氢的核苷酸。该术语涵盖双链DNA，单链DNA，具有双链和单链区域的DNA，分离的DNA，例如部分地纯化的DNA，基本上纯的DNA，合成的DNA，重组地产生的DNA以及改变的DNA或类似物DNA，与天然存在的DNA的区别在于一个或多个核苷酸的添加、缺失、置换和/或修饰。

本文中使用的术语“连接”（“join”、“joined”、“link”、“linked”或“tethered”）表示本领域已知的用于在功能上连接两个或更多个实体的任何方法，例如将蛋白连接至DNA分子或将蛋白连接至蛋白。例如，一种蛋白可以通过共价键连接至另一种蛋白，例如在重组融合蛋白中，具有或没有中间序列或结构域。示例性共价键可以例如如下形成：通过SpyCatcher/SpyTag相互作用、半胱氨酸-马来酰亚胺缀合，或叠氮化物-炔烃点击化学，以及本领域已知的其它方式。此外，一个DNA分子可以通过互补DNA序列的杂交与另一个DNA分子连接。

本文中使用的术语“纳米孔”通常表示在膜中形成或以其它方式提供的孔、沟道或通道。膜可以是有机膜，诸如脂质双层，或合成的膜，诸如由聚合材料形成的膜。膜可以是聚合材料。可以将纳米孔配置为邻近或接近传感电路或与传感电路偶联的电极，例如，互补金属氧化物半导体（CMOS）或场效应晶体管（FET）电路。在一些实施例实施方案中，纳米孔具有0.1纳米(nm)至约1000nm的量级的特征宽度或直径。一些纳米孔是蛋白质。例如，α-溶血素单体寡聚化以形成蛋白。该膜包括反侧（即，面向传感电极的一侧）和顺侧（即，面向对应电极的一侧）。

术语“核酸分子”或“核酸”包括RNA、DNA和cDNA分子。应当理解，作为遗传密码的简并性的结果，可以生产许多编码给定蛋白质诸如α-溶血素和/或其变体的核苷酸序列。本公开内容涵盖编码变体α-溶血素的每种可能的变体核苷酸序列，考虑到遗传密码的简并性，所有这些都是可能的。

如本领域公认的，术语“核苷酸”在本文中用于包括天然碱基（标准）和本领域众所周知的经修饰的碱基。这样的碱基通常位于核苷酸糖部分的1′位置。核苷酸通常包含碱基、糖和磷酸酯基团。

本文中使用的“合成的”，例如参考例如合成的核酸分子或合成的基因或合成的肽，表示通过重组方法和/或通过化学合成方法产生的核酸分子或多肽分子。

如本文中使用的，通过使用重组DNA方法的重组方法生产表示使用分子生物学的熟知方法来表达由克隆的DNA编码的蛋白。例如，标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂转染)。根据生产商的说明书，或如本领域常用的或如如本文中所述的，可以进行酶反应和纯化技术。前述技术和方案通常可以根据本领域众所周知的常规方法执行，并且如贯穿本说明书所引用和讨论的各种一般性和更具体的参考文献中所述。参见，例如，Sambrook等人. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))，其通过引用并入本文用于任意目的。

本文中使用的“载体”(或质粒)表示离散的DNA元件，其用于将异源核酸引入细胞以将它表达或复制。载体通常保持游离状态，但是可以被设计成实现基因或其部分向基因组的染色体中的整合。还考虑了作为人工染色体的载体，诸如细菌人工染色体、酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体。这样的媒介物的选择和使用是本领域技术人员众所周知的。

本文中使用的“表达”通常表示将核酸转录成mRNA并翻译成肽、多肽或蛋白的过程。如果所述核酸衍生自基因组DNA，则在选择适当的真核宿主细胞或生物的情况下，表达可以包括加工，例如mRNA的剪接。

本文中使用的“表达载体”包括能够表达与调节序列（诸如启动子区域）可操作地连接的DNA的载体，所述调节序列能够实现此类DNA片段的表达。这样的另外区段可以包括启动子和终止子序列，并且任选地可以包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体通常衍生自质粒或病毒DNA，或可以包含两者的元件。因此，表达载体表示重组DNA或RNA构建体，诸如质粒、噬菌体、重组病毒或其它载体，其在引入合适的宿主细胞后导致克隆的DNA的表达。合适的表达载体是本领域技术人员众所周知的，且包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的那些以及保持游离的那些或整合进宿主细胞基因组的那些。本文中使用的载体还包括“病毒载体”或“病毒的载体”。病毒载体是经过工程改造的病毒，其可操作地连接到外源基因以（作为媒介物或穿梭物）将外源基因转移进细胞。

术语“宿主细胞”是指包含载体并支持表达构建体的复制和/或转录或转录和翻译(表达)的细胞。宿主细胞可以是原核细胞，诸如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌，或真核细胞诸如酵母、植物、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞。一般而言，宿主细胞是原核的，例如，大肠杆菌。

术语“细胞表达”或“细胞基因表达”通常表示由DNA序列产生生物活性多肽并在细胞中表现出生物活性的细胞过程。这样，基因表达涉及转录和翻译的过程，但是也可以涉及可能影响基因或基因产物的生物学活性的转录后和翻译后过程。这些过程包括例如RNA合成、加工和运输，以及多肽的多肽合成、运输和翻译后修饰。另外，影响细胞内的蛋白-蛋白相互作用的过程也可影响本文定义的基因表达。

本文中使用的术语“任选的”或“任选地”是指，随后描述的事件或情况发生或不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的情形和不发生的情形。例如，将分析物检测复合物连接至纳米孔组件单体的任选步骤意味着可以连接或不连接分析物检测复合物。

本文中使用的术语“磷脂”表示包含至少一个磷基的疏水分子。例如，磷脂可以包含含磷的基团以及饱和的或不饱和的烷基，其任选地被以下基团取代：OH、COOH、氧代、胺或被取代的或未被取代的芳基。

本文中使用的术语“膜”表示脂质分子的连续双层的片或层，在其中嵌入了膜蛋白。膜脂质分子通常是两亲性的，当置于水中时，大多数自发形成双层。“磷脂膜”表示由磷脂组成的任何结构，所述磷脂排列成使得脂质的疏水头指向一个方向而亲水尾巴指向相反的方向。磷脂膜的例子包括细胞膜的脂质双层。

本文中使用的“同一性”或“序列同一性”在序列的上下文中表示两个核酸序列或两个氨基酸序列之间的相似性，并以序列之间的相似性的方式表示，否则被称作序列同一性。序列同一性经常以百分比同一性（或相似性或同源性）的方式测量；百分比越高，两个序列越相似。例如，80%同源性是指，与通过明确的算法确定的80%序列同一性相同的事物，且因此给定序列的同源物在给定序列的长度上具有大于80%序列同一性。序列同一性的示例水平包括，例如，与给定序列（例如，本文所述的本发明多肽的任何一种的编码序列）的80%、85%、90%、95%、98%或更高序列同一性。

用于对比的序列比对方法是本领域众所周知的。在以下文献中描述了各种程序和比对算法：Smith和Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981; Needleman和Wunsch J.Mol. Biol. 48: 443, 1970; Pearson和Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins和Sharp Gene 73: 237-244, 1988; Higgins和Sharp CABIOS 5:151-153, 1989; Corpet等人. Nuc. Acids Res. 16, 10881-90, 1988; Huang等人.Computer Appls. In the Biosciences 8, 155-65, 1992；和Pearson等人. Meth. Mol.Bio. 24, 307-31, 1994。Altschul等人(J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)提出了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。

NCBI基本局部比对搜索工具（BLAST）(Altschul等人. J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)可从几个来源获得，包括国家生物技术信息中心(NCBI, Bethesda, MD)和因特网，以与序列分析程序结合使用，所述序列分析程序包括例如BLAST程序的套件，诸如BLASTN、BLASTX和TBLASTX、BLASTP和TBLASTN。

在相对于GenBank DNA序列和其它公共数据库中的核酸序列评价给定的核酸序列时，通常使用BLASTN程序进行序列检索。BLASTX程序优选用于对GenBank蛋白质序列和其它公共数据库中的氨基酸序列检索已经在所有读码框中翻译的核酸序列。BLASTN和BLASTX使用11.0的开放缺口罚分和1.0的延伸缺口罚分的默认参数运行，并利用BLOSUM-62矩阵。(参见，例如，Altschul, S. F., 等人, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)。

在某些实施例实施方案中，使用例如MacVector 13.0.7版中的CLUSTAL-W程序来执行所选择的序列的优选比对以确定两个或更多个序列之间的“％同一性”，其用默认参数运行，包括10.0的开放缺口罚分、0.1的延伸缺口罚分和BLOSUM 30相似度矩阵。

本文中使用的术语“变体”表示与亲本蛋白相比显示出改变的特征（例如改变的离子电导）的经修饰的蛋白。

本文中使用的术语“样品”以它的最宽含义使用。本文中使用的“生物样品”包括、但不限于来自生物或先前生物（诸如来自受试者）的任何量的物质。生物样品可以包括在体内或在体外获得的生物组织或液体起源的样品。这样的样品可以来自但不限于从生物受试者分离的体液、器官、组织、级分和细胞。生物样品也可以包括来自生物样品的提取物，例如来自生物流体（例如，血液或尿液）的提取物。

本文中使用的“生物流体”或“生物流体样品”表示任何生理流体（例如，血液、血浆、痰、洗出液、眼透镜流体、脑脊液、尿液、精液、汗液、眼泪、乳汁、唾液、滑液、腹膜液、羊水）以及已经至少部分地通过一种或多种已知方案转换为液体形式或已为其提取液体的固体组织。例如，液体组织提取物（诸如来自活组织检查）可以是生物流体样品。在某些实施例中，生物流体样品是从受试者收集的尿液样品。在某些实施例中，生物流体样品是从受试者收集的血液样品。本文中使用的术语“血液”、“血浆”和“血清”包括其级分或加工部分。类似地，在从活组织检查、拭子、涂片等获取样品的情况下，“样品”包括从活组织检查、拭子、涂片等衍生出的经处理的级分或部分。

此外，“流体溶液”、“流体样品”或“流体”包括生物流体，但也可以包括并涵盖非生理组分，例如在环境样品中可能存在的任何分析物。例如，样品可以来自河流、湖泊、池塘或其它蓄水池。在某些实施例实施方案中，可以修改流体样品。例如，可以将缓冲液或防腐剂添加到流体样品中，或者可以将流体样品稀释。在其它实施例实施方案中，可以通过本领域已知的普通方法来修改流体样品，以增加溶液中一种或多种溶质的浓度。无论如何，流体溶液仍然是本文所述的流体溶液。

本文中使用的“受试者”表示动物，包括脊椎动物。脊椎动物可以是哺乳动物，例如人。在某些实施例中，受试者可以是人类患者。受试者可以是“患者”，例如，患有或怀疑患有疾病或病症的患者，并且可能需要治疗或诊断，或者可能需要监测疾病或病症的进展。患者也可以接受需要监测疗效的治疗疗法。哺乳动物表示被归类为哺乳动物的任何动物，包括例如人类、黑猩猩、家养和耕作动物、以及动物园、运动或宠物动物，诸如狗、猫、牛、兔、马、绵羊、猪、诸如此类。

本文中使用的术语“野生型”表示当从天然存在的来源分离时具有该基因或基因产物的特征的基因或基因产物。

如本文中使用的，使用氨基酸残基的常规单字母和三字母代码。为了易于提及，通过使用以下命名法来描述序列变体：原始氨基酸：位置：取代的氨基酸。根据该命名法，例如，在位置17的苏氨酸被精氨酸置换显示为Thr17Arg或T17R。多个突变用加号分隔，例如：Thr17Arg+Glu34Ser或T17R+E34S，代表在位置17和34的突变，分别用精氨酸和丝氨酸置换苏氨酸和谷氨酸。

实施例实施方案

现在部分地参考附图详细描述实施例实施方案。在参考附图的地方，在附图中相似的数字指示相似（但不一定相同）的元件。

纳米孔蛋白缀合物

本文提供了包括纳米孔蛋白缀合物的组合物。如在图1中所示，根据某些实施例实施方案，缀合物1可以包括连接至捕获标签5的纳米孔单体2。纳米孔蛋白缀合物1还可以包括分析物配体附着位点4。因此，得到的纳米孔蛋白缀合物1可以包括纳米孔单体结构域、分析物配体附接结构域和捕获标签结构域。这样的纳米孔蛋白缀合物1可以用于例如形成分析物检测复合物，如本文中所述的，所述复合物能够与如本文中所述的分析物相互作用和促进其检测。在某些实施例实施方案中，纳米孔蛋白缀合物1还可以包括一个或多个接头结构域3，其连接纳米孔蛋白缀合物1的不同组分。

纳米孔蛋白缀合物1的纳米孔蛋白单体2可以包括当定位在基质诸如膜中时允许分子通过基质的任何纳米孔蛋白。纳米孔的例子包括蛋白性的或基于蛋白的孔或合成孔。在某些实施例实施方案中，纳米孔可以具有1-10 nm或1-5 nm或1-3 nm的内径。蛋白孔的例子包括，例如，α-溶血素、电压依赖性的线粒体孔蛋白(VDAC)、OmpF、OmpG、OmpC、MspA和LamB(麦芽糖孔蛋白) (参见，例如，Rhee, M. 等人, Trends in Biotechnology, 25(4)(2007): 174-181)。在某些实施例实施方案中，孔蛋白可以是经修饰的蛋白，诸如经修饰的天然蛋白或合成蛋白。

在某些实施例实施方案中，纳米孔蛋白缀合物1的纳米孔蛋白单体2结构域是α-溶血素单体。因此，在这样的实施方案中，得到的纳米孔蛋白缀合物1包括α-溶血素结构域(即，缀合物的α-溶血素单体部分)、分析物配体附着位点4和捕获标签5 (图1)。在某些实施例实施方案中，这样的纳米孔蛋白缀合物还可以包括一个或多个接头区域3，其连接纳米孔蛋白缀合物1的各个结构域。

如本领域技术人员将理解的，α-溶血素是金黄色葡萄球菌作为水溶性单体分泌的293个氨基酸的多肽，其组装成脂质双层以形成七聚体孔。例如，七聚体在高达65℃在十二烷基硫酸钠(SDS)中是稳定的。通过诱变或靶向化学修饰在富含甘氨酸的中央序列中对α-溶血素的改变证实，所述分子的该部分会穿透脂质双层并衬在跨膜通道的内腔。穿过七聚体的通道是14-链β桶，每个亚基由中央茎结构域序列贡献两条链。

在其中纳米孔单体2是α-溶血素的实施例实施方案中，纳米孔蛋白缀合物1的α-溶血素结构域可以由SEQ ID NO: 1所示的核酸序列编码(野生型α-溶血素)。在某些实施例实施方案中，纳米孔蛋白缀合物1的α-溶血素结构域可以由与SEQ ID NO: 1所示的核酸序列具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核酸序列编码。在某些实施例实施方案中，纳米孔蛋白缀合物1的α-溶血素结构域具有如SEQ ID NO: 2或SEQID NO: 3所示的氨基酸序列。在某些实施例实施方案中，纳米孔蛋白缀合物1的α-溶血素结构域可以具有与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3所示的序列具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。

在其中纳米孔单体2是α-溶血素的实施例实施方案中，纳米孔蛋白缀合物1的α-溶血素结构域可以具有如SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列（成熟的亲本野生型α-溶血素;AAA26598）。在某些实施例实施方案中，本文所述的纳米孔蛋白缀合物1的α-溶血素结构域可以具有与SEQ ID NO: 16所示的序列具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在某些实施例实施方案中，纳米孔蛋白缀合物1的α-溶血素结构域可以是特异性的α-溶血素变体。例如，α-溶血素变体可以与SEQ ID NO: 16具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更多序列同一性，但是包括一个或多个氨基酸置换。

在某些实施例实施方案中，纳米孔蛋白缀合物1的纳米孔蛋白单体2部分是外膜蛋白G (或“OmpG”)单体。因此，在这样的实施方案中，得到的纳米孔蛋白缀合物1包括OmpG结构域（即，缀合物的OmpG单体部分）、分析物配体附着位点4、捕获标签5，和在某些实施例实施方案中，一个或多个接头区域3。如本领域技术人员将理解的，OmpG是形成14-链β-桶的34kDa孔蛋白。例如，该桶允许革兰氏阴性细菌中营养物、离子和蛋白的被动但选择性摄取和分泌。这样的孔蛋白通常在周质侧具有短转角，而在细胞外侧具有长环。但是与大多数孔蛋白不同，OmpG被认为作为单体起作用。

在其中纳米孔单体2是OmpG单体的实施例实施方案中，纳米孔蛋白缀合物1的OmpG结构域可以具有与SEQ ID NO: 6所示的序列具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在某些实施例实施方案中，纳米孔蛋白缀合物1的OmpG结构域可以是OmpG变体。例如，Ompg变体可以与SEQ ID NO: 6具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更多序列同一性，但包括一个或多个特定氨基酸置换，从而形成OmpG变体。

纳米孔蛋白缀合物1的捕获标签5可以是与纳米孔组件的孔相互作用的任何多肽序列，作用方式使得可以鉴定来自纳米孔组件的可检测信号。例如，约30个赖氨酸氨基酸（诸如约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个赖氨酸氨基酸）的同聚物。在某些实施例实施方案中，捕获标签是EPPP标签(SEQ ID NO: 17)。在某些实施例实施方案中，捕获标签5可以具有如SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列。在其它实施例实施方案中，捕获标签5可以具有与SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。

在某些实施例实施方案中，纳米孔蛋白缀合物1还包括用于附接分析物配体的区域，例如分析物附接结构域4 (图1)。分析物附接结构域4可以位于沿着纳米孔蛋白缀合物1的任何位置，其不会例如干扰本文所述的纳米孔组件的功能。例如，如本文所述，分析物附接结构域4不应干扰纳米孔蛋白单体2组装成纳米孔组件或捕获标签5与组件的相互作用。如图1所示，在某些实施例实施方案中，分析物附接结构域4可以位于纳米孔蛋白单体2和捕获标签5之间。

在某些实施例实施方案中，分析物附接结构域4可以包括SpyTag或SpyCatcher氨基酸序列。参见，例如，Li等人, J Mol Biol. 2014 Jan 23; 426(2):309-17。例如，分析物附接结构域4可以包括与SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列。在这样的实施例实施方案中，SpyTag序列可以用于附接分析物配体，从而形成本文所述的分析物检测复合物9（参见图2）。在其它实施例实施方案中，分析物配体附着位点4可以包括可用于将分析物配体附接至纳米孔蛋白缀合物的其它结构或肽序列。例如，分析物配体附着位点4可以包括其它共价结合对的组分，诸如半胱氨酸-马来酰亚胺缀合物或叠氮化物-炔烃点击化学对，以及本领域已知的其它键合组分。在某些实施例实施方案中，分析物附接结构域4可以包括用于将分析物配体附接至纳米孔蛋白缀合物1的分子钉序列（见下文）。

在某些实施例实施方案中，纳米孔蛋白缀合物1还可以包括一个或多个接头区域3(图1)。例如，接头区域3可以是将纳米孔蛋白单体2连接至纳米孔蛋白缀合物1的其它功能区、但不干扰纳米孔蛋白缀合物结构域的独立功能的任何氨基酸序列。例如，接头区域3不会干扰如本文所述的纳米孔蛋白单体2向纳米孔蛋白组件的组装。接头区域3也不会干扰捕获标签5与本文所述的组件的结合或分析物配体与分析物配体附接结构域的结合。

在某些实施例实施方案中，接头区域3可以用于将纳米孔蛋白单体2连接至分析物附接结构域4 (图1)。在某些实施例实施方案中，接头区域3包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在某些实施例实施方案中，接头区域3小于约15个氨基酸，诸如约1-10个氨基酸。在某些实施例实施方案中，接头区域3与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO: 15中的任何一个所示的氨基酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。

在某些实施例实施方案中，纳米孔蛋白缀合物1可以包括第二接头区域(未显示)。在这样的实施方案中，第二接头区域可以将纳米孔蛋白缀合物1的其它功能区域连接在一起，同时保留如本文所述的纳米孔蛋白缀合物1的功能性。例如，第二接头区域可以将第一接头区域3连接至分析物附接结构域4。像第一接头区域3一样，第二接头区域(未显示)可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在某些实施例实施方案中，第二接头区域小于约15个氨基酸，诸如约1-10个氨基酸。在某些实施例实施方案中，第二接头区域与SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 15中的任何一个所示的氨基酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。在某些实施例实施方案中，第一接头区域3和第二接头区域可以被无功能标签（诸如多组胺标签）隔开。

在某些实施例实施方案中，本文所述的纳米孔蛋白缀合物1具有与SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在这样的实施例实施方案中，纳米孔蛋白缀合物1可以依次包括α-溶血素单体（作为纳米孔单体2）、接头区域3、SpyTag序列（作为分析物配体附着位点4）、组氨酸标签和捕获标签5区域(参见图1和SEQ ID NO: 4)。例如，纳米孔蛋白缀合物1的α-溶血素单体结构域可以对应于SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列，并且接头区域3可以对应于SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。此外，纳米孔蛋白缀合物1的分析物配体附着位点4可以对应于SEQID NO: 11所示的氨基酸序列(SpyTag序列)，并且纳米孔蛋白缀合物1的捕获标签5可以对应于SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列。

在某些实施例实施方案中，本文所述的纳米孔蛋白缀合物1具有与SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在这样的实施例实施方案中，纳米孔蛋白缀合物1可以包括OmpG序列（作为纳米孔单体2）、第一接头区域3、组氨酸标签、第二接头区域、SpyTag序列（作为分析物配体附着位点4）和捕获标签5区域。例如，纳米孔蛋白缀合物1的OmpG单体结构域可以对应于SEQID NO: 6所示的氨基酸序列，第一接头区域3可以对应于SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列，且第二接头区域可以对应于SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列。此外，纳米孔蛋白缀合物1的分析物配体附着位点4可以对应于SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列(SpyTag序列)，并且纳米孔蛋白缀合物1的捕获标签5可以对应于SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列。

在某些实施例实施方案中，本文所述的纳米孔蛋白缀合物1可以包括任何数目的蛋白修饰。如本领域技术人员将理解的，这样的修饰可以包括例如磷酸酯（磷酸化）、碳水化合物（糖基化）、ADP-核糖基（ADP核糖基化）、脂肪酸（异戊二烯化，其包括、但不限于: 肉豆蔻酰化和棕榈酰化）、泛素（泛素化）和sentrin（sentrinization；泛素化-样蛋白修饰）。翻译后修饰的其它例子包括甲基化、乙酰化、羟基化、碘化和黄素键合。

在某些实施例实施方案中，形成纳米孔蛋白缀合物1的全部或一部分的氨基酸可以是立体异构体。额外地或可替换地，形成纳米孔蛋白缀合物1的全部或一部分的的氨基酸可以是天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸、翻译后修饰的氨基酸、酶促合成的氨基酸、衍生的氨基酸、用于模拟氨基酸的构建体或结构等的修饰。形成纳米孔蛋白缀合物1的肽的氨基酸可以是在天然存在的蛋白中发现的20种常见氨基酸中的一种或多种，或者是修饰的和罕见的氨基酸中的一种或多种。在某些实施例实施方案中，氨基酸可以是D-或L-氨基酸。

在某些实施例实施方案中，纳米孔蛋白缀合物1的氨基酸序列还可以包括一种或多种修饰的和/或罕见的氨基酸。修饰的和罕见的氨基酸的例子包括、但不限于：2-氨基己二酸(Aad), 3-氨基己二酸(Baad), β-氨基-丙酸(Bala, β-丙氨酸), 2-氨基丁酸(Abu,哌啶酸), 4-氨基丁酸(4Abu), 6-氨基己酸(Acp), 2-氨基庚酸(Ahe), 2-氨基异丁酸(Aib), 3-氨基异丁酸(Baib), 2-氨基庚二酸(Apm), 2,4-二氨基丁酸(Dbu), 锁链素(Des), 2,2’-二氨基庚二酸(Dpm), 2,3-二氨基丙酸(Dpr), N-乙基甘氨酸(EtGly), N-乙基天冬酰胺(EtAsn), 羟赖氨酸(Hyl), 别羟赖氨酸(AHyl), 3-羟脯氨酸(3Hyp), 4-羟脯氨酸(4Hyp), 异锁链素(Ide), 别异亮氨酸(Alle), N-甲基甘氨酸(MeGly, 肌氨酸), N-甲基异亮氨酸(Melle), 6-N-甲基赖氨酸(MeLys), N-甲基缬氨酸(MeVal), 正缬氨酸(Nva), 正亮氨酸(Nle),和鸟氨酸(Orn)。修饰的和罕见的氨基酸的其它例子一般地描述在：Synthetic Peptides: A User's Guide, 第2版, 2002年4月, Gregory A. Grant编,Oxford University Press; Hruby V J, Al-obeidi F和Kazmierski W: Biochem J 268:249-262, 1990；和Toniolo C: Int J Peptide Protein Res 35:287-300, 1990；它们全部的教导明确地通过引用并入本文。

分析物检测复合物

图2是根据某些实施例实施方案显示分析物检测复合物9的图示。参考图2，可以将纳米孔蛋白缀合物1连接至分析物配体8以形成分析物检测复合物9。例如，分析物配体8可以经由纳米孔蛋白缀合物1的分析物配体附着位点4（例如经由附着成员6）连接至纳米孔蛋白缀合物1。在某些实施例实施方案中，接头成员7可用于将分析物配体8间接附接到纳米孔蛋白缀合物1的分析物配体附着位点4。

分析物检测复合物9的分析物配体8可以是对分析物具有结合亲和力的任何配体，该分析物是本文所述的任何分析物。例如，分析物配体8可以是对特定抗原具有亲和力的抗体，该抗原是分析物。如本领域技术人员考虑到本公开内容将理解的，任何抗体或其功能片段都可以用作分析物配体。在其它实施例实施方案中，分析物检测复合物9的分析物配体8可用于检测环境分析物。在某些实施例实施方案中，分析物检测复合物9的分析物配体8可以用于鉴定在复杂的生物流体样品中（例如在组织和/或体液中）的蛋白分析物。

在某些实施例实施方案中，分析物配体9所针对的分析物可以存在于多种样品类型中，包括生物样品、个人护理产品、药物产品、水样品、食品样品、饮料样品、空气样品、营养培养基样品、临床样品等。在某些实施例实施方案中，与样品的其它组分相比，分析物配体9所针对的分析物可以以低浓度存在。在某些实施例实施方案中，分析物配体9还可以用于靶向大分子分析物的亚群，这基于分析物的构象或功能特性。示例性分析物配体8包括例如本文定义的那些以及已知与目标分析物结合的适体、抗体或其功能片段、受体和/或肽。关于适体，所述适体可以是包括DNA、RNA和/或核酸类似物的核酸适体。在某些实施例实施方案中，所述适体可以是肽适体，例如包括在两端连接至支架的可变肽环的肽适体。可以选择适体，例如以结合特定的靶蛋白分析物。

如本领域技术人员将理解的，分析物和分析物配体8代表结合对的两个成员，即两个不同的分子，其中一个分子通过化学或物理特异性地结合第二个分子。除了众所周知的抗原-抗体结合对成员外，其它结合对包括例如生物素和抗生物素蛋白，碳水化合物和凝集素，互补核苷酸序列，互补肽序列，效应子和受体分子，酶辅因子和酶，酶抑制剂和酶，肽序列和对该序列或整个蛋白具有特异性的抗体，聚合酸和碱，染料和蛋白结合剂，肽和特异性蛋白结合剂（例如，核糖核酸酶、S-肽和核糖核酸酶S-蛋白），糖和硼酸，以及具有允许它们在结合测定法中缔合的亲和力的类似分子。

此外，分析物配体/分析物结合对可以包括与原始结合成员类似的成员，例如，通过重组技术或分子工程制备的分析物类似物或结合成员。如果分析物配体是免疫反应物，它可以是例如抗体、抗原、半抗原或其复合物，如果使用抗体，它可以是单克隆或多克隆抗体、重组蛋白或抗体、嵌合抗体或其混合物或片段，以及抗体和其它结合成员的混合物。此类抗体、肽和核苷酸的制备的细节及其在结合测定中用作结合成员的适合性是本领域众所周知的。

在某些实施例实施方案中，并且如图2所示，分析物配体8可以经由附着成员6和接头成员7连接至纳米孔蛋白缀合物1。附着成员6可以是可用于将分析物配体8直接或间接附接至纳米孔蛋白缀合物1的任何蛋白、核酸序列或其它实体。在某些实施例实施方案中，附着成员6可以用于与纳米孔蛋白缀合物形成异肽键。例如，当分析物配体附着位点4是SpyCatcher结构域或SpyTag结构域时，相应的附着成员6可以分别是SpyTag或SpyCatcher序列。因此，在这样的实施例实施方案中，可以通过SpyCatcher/SpyTag异肽键将分析物配体8连接至纳米孔蛋白缀合物1。在其它实施例实施方案中，附着成员6可以包括其它共价结合对的组分，诸如半胱氨酸-马来酰亚胺缀合物或叠氮化物-炔烃点击化学对，以及本领域已知的其它键合组分，诸如转谷氨酰胺酶和分选酶介导的附接。

在包括接头成员7的实施例实施方案中，接头成员7可以是将分析物配体8连接至附着成员6的任何结构，但是不干扰本文所述的分析物检测复合物9的功能（图2）。例如，接头成员可以是肽接头，其包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在某些实施例实施方案中，接头成员7小于约15个氨基酸，诸如约1-10个氨基酸。在某些实施例实施方案中，接头成员与SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQID NO: 15中任何一个所示的氨基酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。

在某些实施例实施方案中，分析物配体8、接头成员7和附着成员6可以如图2所示依次排列。额外地或可替换地，可以将分析物配体8、接头7和附着成员6制备为单个实体，然后附接到纳米孔蛋白缀合物1的分析物附接结构域4。通过将编码那些蛋白或肽的DNA序列连接到表达载体中，并使用对于本领域技术人员而言标准的方法纯化所得的蛋白，可以进行分析物配体8、接头7和附着成员6的蛋白组分的遗传融合。

纳米孔体系结构和组装

参考图3，根据某些实施例实施方案，提供了纳米孔组件10，其包括分析物检测复合物9。纳米孔组件10通常是嵌入在基质（诸如脂质膜11）中的多聚蛋白结构。纳米孔组件10的蛋白亚基中的至少一个包括纳米孔蛋白缀合物1，如本文所述。通过包括本文所述的纳米孔蛋白缀合物1，可以将分析物配体8连接至纳米孔蛋白缀合物1。此外，通过使用纳米孔蛋白缀合物1，纳米孔组件10的纳米孔蛋白亚基中的至少一个包括捕获标签5和纳米孔单体2，纳米孔单体2是与其它纳米孔亚基相互作用以形成多聚体纳米孔的单体亚基的一部分。例如，捕获标签5可用于与孔相互作用，并且其与孔的相互作用可在本文所述的分析物存在下发生改变。

纳米孔组件10的纳米孔蛋白缀合物1可以是本文所述的任何纳米孔蛋白缀合物1。例如，在α-溶血素的情况下，纳米孔组件是七个α-溶血素单体的寡聚体（即，七聚体纳米孔组件）。七聚体纳米孔组件的单体α-溶血素亚基可以是同一多肽序列的相同拷贝，或它们可以是不同的α-溶血素多肽序列，只要至少一个α-溶血素亚基如本文所述与捕获标签5结合。例如，纳米孔组件可以包括一个纳米孔蛋白缀合物1和六个不与捕获标签5连接的α-溶血素单体（共七个寡聚化的α-溶血素亚基）。在这样的实施方案中，七个亚基中每个的α-溶血素结构域可以是相同的，或者α-溶血素可以是α-溶血素单体及其变体的混合物。

在某些实施例实施方案中，纳米孔组件10的纳米孔蛋白缀合物1（即七聚体的“一个”组分）是与SEQ ID NO: 4所示的序列具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更多同一性的氨基酸序列。此外，在某些实施例实施方案中，一个或多个其它纳米孔单体（即，七聚体的“六个”组分中的一个或多个）可以具有与SEQ ID NO: 5所示序列具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更多同一性的氨基酸序列。

可以通过本领域已知的任意方法来制备纳米孔组件2。例如，可以根据WO2014/074727中所述的方法组装本文所述的纳米孔组件，该方法提供了形成具有限定数目的修饰亚基的多聚体蛋白的方法(参见WO2014/074727的图27；也参见PCT/EP2017/057433)。在某些实施例实施方案中，通过将纳米孔蛋白缀合物1与纳米孔蛋白单体混合，可以形成纳米孔组件10。例如，在α-溶血素纳米孔的情况下，去污剂(例如，脱氧胆酸)可以触发α-溶血素单体采用孔构象。也可以例如使用脂质(例如，1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPhPC)或1,2-二-0-植烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DoPhPC))和中等温度(例如，小于约100℃)形成纳米孔。在某些情况下，将DPhPC与缓冲溶液混合形成大多层囊泡（LMV），向该溶液中添加α-溶血素亚基并在40°C温育混合物30分钟，导致孔形成。

因为本文所述的方法和系统依赖于捕获标签5与纳米孔组件10的相互作用，所以仅具有与纳米孔组件10相关的单个捕获标签5（而不是多个捕获标签5）可能是有益的。对于非多聚体的纳米孔组件，例如OmpG组件，可以使用包含OmpG纳米孔结构域的单个纳米孔蛋白缀合物1来形成纳米孔组件。在多聚体纳米孔组件(诸如α-溶血素纳米孔组件)的情况下，可以制备纳米孔组件10，使得在组件中仅包括单个纳米孔蛋白缀合物1（因此仅存在单个捕获标签5）。

在某些实施例实施方案中，纳米孔蛋白缀合物1的分析物配体附着位点4，诸如SpyTag结构域，可以用于选择包括单个纳米孔蛋白缀合物1（且因此包括单个捕获标签5）的α-溶血素七聚体。例如，将纳米孔蛋白缀合物1与α-溶血素蛋白单体混合，得到具有0、1、2、3、4、5、6或7个纳米孔蛋白缀合物的七聚体。但是由于与每个七聚体相关的SpyTag序列的不同数目（0、1、2、3、4、5、6或7），所以七聚体具有不同的电荷。因此，在某些实施例实施方案中，可以通过本领域已知的方法分离七聚体，例如通过用阳离子交换色谱法洗脱。然后可以检查洗脱的级分，以确定哪个级分包含具有单个SpyTag的组件。参见PCT/EP2017/057433。

尽管多种方法可能适合用于确定哪个七聚体级分包含单个SpyTag（因此其能够结合每个七聚体中的仅单个聚合酶/SpyCatcher融合蛋白），但在某些实施例实施方案中，可以基于分子量分离不同的七聚体级分，例如通过SDS-PAGE。然后可以使用试剂来确认与每个级分相关的SpyTag的存在。例如，如在PCT/EP2017/057433（其通过引用明确地并入本文）中所述，在通过SDS-PAGE分离之前，可以将SpyCatcher-GFP (绿色荧光蛋白)加入级分中。

因为具有较少数量的纳米孔蛋白缀合物（和因此较少的SpyTag）的七聚体比具有较多数量的纳米孔蛋白缀合物（和因此较多的SpyTag）的七聚体小，所以可以鉴定具有单个SpyTag（且因此具有单个纳米孔蛋白缀合物1）的级分，如通过最远的带迁移以及对应于该带的SDS-PAGE凝胶中GFP荧光的存在所证明的。例如，含有七种α-溶血素单体（但没有纳米孔蛋白缀合物）的级分将迁移最远，但当与SpyCatcher-GFP混合时不会发荧光，因为不存在与七聚体结合的SpyTag。但是，包含单个SpyTag的级分会迁移到次最远（与其它荧光带相比）并发荧光，从而有助于鉴定包含单个纳米孔蛋白缀合物1（和因此具有单个捕获标签5）的级分。参见PCT/EP2017/057433。在可能需要具有额外捕获标签5的纳米孔组件的实施例实施方案中，这种迁移-位移分析可以类似地用于鉴定具有0、1、2、3、4、5、6或7个纳米孔蛋白缀合物1 (和因此具有0、1、2、3、4、5、6或7个捕获标签5)的α-溶血素纳米孔部分。

附接分析物配体以形成分析物检测复合物

为了制备包括分析物检测复合物9的纳米孔组件10（图3），将分析物配体8附接到纳米孔蛋白缀合物1。在某些实施例实施方案中，在将纳米孔蛋白缀合物1掺入膜中之前，可以将分析物配体8附接到纳米孔蛋白缀合物1。在其它实施例实施方案中，在将纳米孔蛋白缀合物1掺入膜中之后，可以将分析物配体8附接到纳米孔蛋白缀合物1。例如，当纳米孔组件10包括不与其它单体(诸如OmpG单体)寡聚化的孔蛋白单体时，在将纳米孔蛋白缀合物1掺入脂质膜中之前或在将纳米孔蛋白缀合物1掺入膜中之后，可以将分析物配体8附接到包括OmpG纳米孔蛋白单体2的纳米孔蛋白缀合物1。

类似地，当纳米孔组件10是α-溶血素纳米孔时，例如，可以在将纳米孔蛋白缀合物1掺入多聚体纳米孔组件10之前或之后，将分析物配体8附接到α-溶血素纳米孔蛋白缀合物1。例如，可以如本文所述组装α-溶血素七聚体纳米孔，以包括具有α-溶血素纳米孔蛋白单体2的单个纳米孔蛋白缀合物1。然后，在组装纳米孔组件10之后，在组装α-溶血素七聚体纳米孔之后，可以将分析物配体8附接到纳米孔蛋白缀合物1，从而形成包括分析物检测复合物9作为纳米孔的一部分的纳米孔组件10。在其它实施例实施方案中，在形成α-溶血素七聚体纳米孔组件之前，可以将分析物配体8附接到纳米孔蛋白缀合物1。然后可以如本文所述将α-溶血素分析物检测复合物9与其它纳米孔蛋白单体混合以形成α-溶血素纳米孔组件10。

可以通过本领域已知的任意方法将分析物配体8附接到纳米孔蛋白缀合物1（并因此附接到纳米孔组件10）。在某些实施例实施方案中，将分析物配体8附接到纳米孔蛋白缀合物1通常涉及包括接头序列或接头分子作为纳米孔蛋白缀合物1的分析物配体附着位点4。然后可以通过将附着成员6附接到分析物配体附着位点4的接头序列上，将分析物配体8附接到分析物配体附着位点4。例如，附着成员6可以是这样的序列或其它分子：其以将分析物配体8连接至纳米孔蛋白缀合物1的分析物配体附着位点4的方式与分析物配体附着位点4结合或相互作用。

额外地或可替换地，分析物配体8可以通过任何合适的化学方法（例如，共价键和/或接头）附接到纳米孔蛋白缀合物1。在某些实施例实施方案中，分析物配体8通过分子钉附接到纳米孔蛋白缀合物1。在某些实施例实施方案中，分子钉包含三个氨基酸序列（表示为接头A、B和C）。接头A可以从纳米孔蛋白缀合物1延伸，例如从分析物配体附着位点4延伸。接头B可以从分析物配体8延伸，例如从与分析物配体8相关的附着成员6延伸。且接头C可以结合接头A和B（例如，通过缠绕在接头A和B周围），从而将分析物配体8连接到纳米孔蛋白缀合物1。接头C也可以被构建为接头A或接头B的一部分，从而减少接头分子的数量。

在某些实施例实施方案中，在生理条件下自发形成共价异肽键的SpyTag/SpyCatcher系统可用于将纳米孔蛋白缀合物1连接至分析物配体8。参见，例如，Li等人, JMol Biol. 2014 Jan 23; 426(2):309-17。例如，可以表达具有SpyTag结构域作为分析物配体附着位点4的纳米孔蛋白缀合物1。此外，待连接至纳米孔蛋白缀合物1的分析物配体8可以包括SpyCatcher结构域作为附着成员6。通过将SpyTag/纳米孔蛋白缀合物1与SpyCatcher/分析物配体8混合，SpyTag和SpyCatcher蛋白相互作用以形成纳米孔蛋白缀合物1，其通过共价异肽键连接至分析物配体8，从而形成如本文中所述的分析物检测复合物9。参见，例如，Li等人, J Mol Biol. 2014 Jan 23; 426(2):309-17。

用于检测分析物的系统和方法

通过使用并依赖本文所述的包括分析物检测复合物9的纳米孔组件10，在某些实施例实施方案中，提供了用于检测样品中（例如流体样品中）的分析物的系统和方法。为了检测分析物，在某些实施例实施方案中，将包括分析物检测复合物10的纳米孔组件10嵌入膜内，并且将传感电极放置在膜邻近或附近。例如，本文描述的纳米孔组件10可以形成或以其它方式嵌入膜中，所述膜设置成邻近传感电路（诸如集成电路）的传感电极。集成电路可以是专用集成电路(ASIC)。在某些实施例实施方案中，集成电路是场效应晶体管或互补金属氧化物半导体(CMOS)。传感电路可以位于包括纳米孔的芯片或其它设备中，或者位于所述芯片或设备之外，例如处于芯片外配置中。半导体可以是任何半导体，包括、但不限于IV族（例如硅）和III-V族半导体（例如砷化镓）。关于可根据本文所述的组合物和方法使用的设备和装置设置，参见例如WO 2013/123450，其整个内容通过引用明确地并入本文。

如本领域技术人员将理解的，基于孔的传感器（例如，生物芯片）可用于单个分子的电询问分析。基于孔的传感器可以包括形成在膜中的如本文所述的纳米孔组件10，该膜设置成邻近或靠近传感电极。传感器可以包括例如对应电极。该膜包括反侧（即，面向传感电极的一侧）和顺侧（即，面向对应电极的一侧）。因此，设置在膜中的纳米孔组件也可以包括反侧（即，面向传感电极的一侧）和顺侧（即，面向对应电极的一侧）。分析物检测复合物9的分析物配体8位于例如膜的顺侧。

为了检测分析物，本文提供的方法、系统和组合物依赖于纳米孔组件10对捕获标签5的捕获率的测量和分析。如在标题为“Period-to-Period Analysis of AC Signalsfrom Nanopore Sequencing”的WO/2017/220732（其特此整体并入本文）中所述，使用逐周期（或p2p）差分方法，可以鉴定捕获事件。简而言之，当AC周期的亮或暗部分中的ADC信号高于阈值p2p差值时，就会检测到捕获事件。在任何给定的时间滑动窗口中捕获事件的数量会给出捕获率。在捕获标签具有净负电荷的情况下，将在AC周期的明亮部分进行捕获，而带有净正电荷的捕获标签将在AC周期的黑暗部分被捕获。参见WO/2017/220732。

在某些实施例实施方案中，一旦将纳米孔组件10及其相关的分析物检测复合物9设置在膜内（参见图3），就可以经由传感电极确定捕获标签5的第一捕获率。例如，第一捕获率对应于在有单独结合的分析物配体8存在下（即，不存在与分析物配体结合的分析物）捕获标签5的捕获率。也就是说，本文中使用的第一捕获率对应于在分析物配体结合分析物配体8对它具有结合亲和力的任何分析物之前，纳米孔组件10对捕获标签5的捕获率。因此，可以在包括纳米孔组件的芯片与包括分析物的样品接触之前确定第一捕获率。在其它实施例实施方案中，第一捕获率代表其中分析物已经从分析物检测复合物的分析物配体8解离的孔的状态。无论如何，第一捕获率可以指示包括分析物检测复合物9的纳米孔组件10，其中分析物配体处于未结合状态（即，未结合配体）。

在某些实施例实施方案中，第一捕获率可以与基线捕获率区分开，例如以提供分析物配体8结合至纳米孔蛋白缀合物1并因此结合至纳米孔组件的指示。例如，在其中在纳米孔形成之后将分析物配体8连接到纳米孔蛋白缀合物1的实施例实施方案中，可以在将分析物配体8连接到纳米孔蛋白缀合物1之前确定纳米孔的捕获率。也就是说，可以在没有分析物配体8存在下确定纳米孔的捕获率。此后，可以将分析物配体8连接至纳米孔蛋白缀合物1以形成分析物检测复合物9，并且可以从纳米孔确定第一捕获率。

不受任何特定理论约束，据信，随着如本文中所述的分析物配体8与纳米孔蛋白缀合物1的附接，分析物配体8与捕获标签5的靠近会改变捕获标签5与纳米孔的相互作用。例如，分析物配体8可能在空间上阻碍捕获标签5与纳米孔的结合。因此，在某些实施例实施方案中，分析物配体8的存在可降低纳米孔组件10对捕获标签5的捕获率。在某些实施例实施方案中，分析物配体8的存在可以增加纳米孔组件对捕获标签5的捕获率。无论如何，可以确定捕获率的这种增加或降低，例如，通过将第一捕获率（即与纳米孔蛋白缀合物1结合的分析物配体8）与基线捕获率（没有与纳米孔蛋白缀合物1结合的分析物配体）进行对比。在某些实施例实施方案中，例如在基线捕获率和第一捕获率之间的捕获率的这种改变可以提供分析物配体8已经成功地结合至纳米孔蛋白缀合物1的指示。

在某些实施例实施方案中，基于对捕获标签5的干扰水平，认为第一捕获率（即，结合了分析物配体8）和基线捕获率（附着了分析物配体8，但没有结合分析物）之间的差异是高度可变的。在某些实施例实施方案中，第一捕获率可以比基线捕获率高约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%、150%、155%、160%、165%、170%、175%、180%、185%、190%、195%、200%或更多。在某些实施例实施方案中，第一捕获率可以比基线捕获率低约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%、150%、155%、160%、165%、170%、175%、180%、185%、190%、195%或200%或更多。

在确定第一捕获率之后，可以将包含纳米孔蛋白组件10和相关的分析物检测复合物9的芯片与流体溶液（例如待测试目标分析物的样品溶液）接触。为了测试流体溶液中是否存在目标分析物，可以使流体溶液流过包括纳米孔组件10的芯片，从而使纳米孔组件10与流体溶液接触。纳米孔组件10例如布置成包括至少一种本文所述的分析物检测复合物9，其中分析物检测复合物9的分析物配体8具有与目标分析物的结合亲和力。随着流体流过纳米孔，目标分析物(当存在时)可以与分析物配体8相互作用，并因此可以结合分析物配体8。相反，如果流体溶液中不存在目标分析物，则不会发生对分析物配体8的这种结合。例如，要测试的流体溶液可以包括任何生物流体、流体样品或本文所述的包括（或可以包括）目标分析物的其它样品，或由其组成。

一旦纳米孔组件与流体溶液接触，就可以确定纳米孔组件10对捕获标签5的第二捕获率。然后，第二捕获率可以提供分析物检测复合物9的分析物配体8是否已经结合目标分析物的指示。因此，第二捕获率可以提供目标分析物是否存在于被测试的流体样品中的指示。例如，当目标分析物结合分析物配体8时，第二捕获率可以不同于第一捕获率。在某些实施例实施方案中，当分析物与分析物配体8结合时，第二捕获率可以相对于第一捕获率增加。在其它实施例实施方案中，当目标分析物结合分析物配体8时，第二捕获率可以相对于第一捕获率降低。无论如何，与第一捕获率相比，不同的第二捕获率可以提供目标分析物结合纳米孔组件10的分析物配体8（和因此，目标分析物存在于流体溶液中）的指示。

不希望受任何特定理论约束，据信，随着目标分析物与分析物配体8的结合，目标分析物/分析物配体结合对与捕获标签5的接近会改变捕获标签5与纳米孔的相互作用。例如，目标分析物/分析物配体结合对可能在空间上阻碍捕获标签5与纳米孔的结合，从而导致降低的第二捕获率（相对于第一捕获率）。可替换地，并且再次不受任何特定理论约束，在某些实施例实施方案中，目标分析物和分析物配体8之间的结合（以形成结合对）可以减少由单独分析物配体8（没有结合分析物）施加的空间位阻，从而导致增加的第二捕获率（相对于第一捕获率）。因此，捕获率的变化（从第一捕获率到第二捕获率）可用于检测流体溶液中的分析物。

在某些实施例实施方案中，基于对捕获标签5的干扰程度，第二捕获率（即存在并结合分析物）与第一捕获率（附着分析物配体8，但未结合分析物）之间的差异被认为是高度可变的。在某些实施例实施方案中，第二捕获率可以比第一次捕获率高约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%、150%、155%、160%、165%、170%、175%、180%、185%、190%、195%或200%或更多。在某些实施例实施方案中，第二捕获率可以比第一捕获率低约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%、150%、155%、160%、165%、170%、175%、180%、185%、190%、195%或200%或更多。

在某些实施例实施方案中，除了检测分析物之外，还可以基于分析物配体8的身份来确定检测到的分析物的具体身份。例如，如果分析物配体8是针对特定肽的纳米抗体，并且第二捕获率提供了该肽存在于测试样品中的指示，则可以确定在样品中存在的肽的身份。换句话说，如本文所述用于检测分析物的任何已知分析物配体8可用于确定分析物的身份。

本领域技术人员基于本公开内容将理解，本文所述的方法、系统和组合物可用于多种实际应用中。例如，本文描述的方法、系统和组合物可用于促进样品中未知分析物的筛选。在这样的实施例实施方案中，分析物检测复合物9可以被配置成包括已知细胞受体的结合结构域作为分析物配体8。施加到包括纳米孔组件10的芯片上的流体溶液可以是多个级分之一，例如，一个或多个含有分析物（诸如受体的潜在激动剂或拮抗剂）的级分。通过如本文所述测试每个级分，可以确定包括分析物配体8(即，受体结构域)的分析物的级分。

在某些实施例实施方案中，本文所述的方法、组合物和系统可用于在单个芯片上筛选单个流体样品中多种不同分析物的存在。如本领域技术人员将理解的，当前的芯片技术允许在单个芯片上沉积数十万个纳米孔（或更多）。因此，通过使用本文所述的方法和组合物，可以在同一芯片上使用多个不同的纳米孔组件10（每个包括分析物检测复合物）来测试流体样品中的多种不同的分析物。例如，纳米孔组件10的各个组可以如本文所述进行组装，其中每组布置成检测不同的分析物。

在这样的实施例实施方案中，一组纳米孔组件10可以包括针对分析物A的分析物配体8，而另一组纳米孔组件10可以包括针对分析物B的分析物配体8。多个其它纳米孔组件10也可以设置在同一芯片上，诸如针对分析物C、D、E、F等的那些，使得所述芯片可以检测多种不同的分析物。在某些实施例实施方案中，可以为每个纳米孔组件确定基线捕获率，并且可以将基线捕获率与本文所述的第一捕获率进行对比，以提供将分析物配体8连接至如本文所述的纳米孔蛋白缀合物1的指示。

额外地或可替换地，如本文所述，可以将单个流体样品放置成与芯片（并因此与多个不同的纳米孔组件）接触。然后，对于每个纳米孔组件10，可以确定第二捕获率并将其与本文所述的第一捕获率进行对比，从而允许针对每组不同的纳米孔组件10检测不同的分析物配体。对于每个孔，第二捕获率然后可以提供样品中是否存在目标分析物（该孔的分析物配体8针对它）的指示。因此，可以使用多个孔来检测多种不同的分析物。

为了区分设置在芯片上的不同纳米孔组件，可以使用多种技术并且它们是可行的。例如，不同的捕获标签5可以用于不同组的纳米孔组件，使得不同的基线捕获率可以用于鉴定不同的纳米孔组件10。例如，具有已知基线捕获率的捕获标签5可以与针对分析物A的一组纳米孔组件10一起使用，而具有不同基准捕获率的不同捕获标签5可以与针对分析物B的一组纳米孔组件10一起使用。然后可以通过不同的基线捕获率来区分两个不同的纳米孔群体。

额外地或可替换地，可以使用不同的孔类型，例如具有较小或较大孔径的孔，并且可以基于本领域已知的技术容易地区分。例如，利用这种配置，具有较大开口的纳米孔可以提供比具有较小开口的孔更大的电流信号，从而允许区分同一芯片上的孔。然后可以将不同的孔与它们被配置成检测的分析物相关联，从而允许鉴定同一芯片上的不同分析物。其它区分方法包括捕获标签的阻断水平，如本文所述在没有分析物存在下捕获标签捕获的速率，以及纳米孔的电流-电压曲线。

在其它实施例实施方案中，一个或多个不同的捕获标签可以位于纳米孔的反侧上，从而提供了另一种方式，其中可以在同一芯片上区分不同的孔组。在这样的实施例中，第二捕获标签可以附接到纳米孔的反侧，导致在AC循环的黑暗部分阻断。这些暗侧捕获也可以通过捕获率和捕获标签的水平彼此区分开。参见WO/2017/220732。

图4A-4C是显示根据某些实施例实施方案的与基线捕获率、第一捕获率和第二捕获率相关的纳米孔组件的各种状态的图示。如图4A所示，纳米孔组件包括纳米孔蛋白缀合物1（如图1所示），以及捕获标签（即，肽标签5，如图所示）。虚线示出了肽标签与纳米孔的孔的相互作用，这导致可检测的基线捕获率。如显示的，分析物配体（例如，纳米抗体）尚未连接至纳米孔组件（图4A）。如图4B所示，纳米孔组件包括纳米孔蛋白缀合物1（如图1所示）以及附接的纳米抗体8。因此，纳米孔组件包括如本文所述的分析物检测复合物。还显示了捕获标签（即，肽标签5），虚线显示了捕获标签与纳米孔的相互作用，从而导致可检测的第一捕获率（图4B）。如图4C所示，分析物（例如，抗原）现在已经结合至分析物检测复合物的分析物配体（例如，纳米抗体8），这导致捕获标签的可检测的第二捕获率（即，肽标签的捕获，如图所示）。

确定分析物浓度的方法

除了检测和鉴定分析物之外，本文描述的方法、系统和组合物可以用于确定流体溶液中分析物的浓度。例如，由于第一捕获率和第二捕获率分别对应于从未结合状态向分析物结合状态转变的给定纳米孔，因此捕获率从第一捕获率到第二捕获率再回到第一捕获率的变化可用于确定分析物配体与分析物之间的结合/解离速率。然后可以将结合/解离速率以及分析物配体和分析物之间的已知结合特性一起与已知的动力学方法结合使用，以确定样品中分析物的浓度信息。

为了确定分析物的浓度，可以执行本文所述的用于检测分析物的存在的方法，其中从第一和第二捕获率转变确定分析物/配体对之间的结合/解离速率。例如，包括本文所述的分析物检测复合物9的纳米孔组件10设置在芯片的膜内。然后将一个或多个传感电极放置在包括分析物检测复合物9的纳米孔组件10附近。然后如本文所述确定纳米孔组件10的第一捕获率，该第一捕获率对应于在没有结合的分析物存在下分析物配体8结合至纳米孔组件10的纳米孔蛋白缀合物1的孔状态。

此后，可以使芯片（和因此设置在其上的纳米孔组件10）与流体样品（诸如包括分析物配体的样品）接触，并连续监测捕获率。纳米孔组件10与分析物的接触允许分析物结合分析物配体8，并因此允许如本文中所述鉴定第一捕获率与第二捕获率之间的转变。例如，如本文所述，第二捕获率对应于其中分析物现在结合至分析物配体的孔状态。

在鉴定第一捕获率到第二捕获率之间的转变后，对第二捕获率的连续测量允许鉴定第二转变，即，第二捕获率转变回（或近似于）第一捕获率的时间点率。也就是说，通过捕获率的连续测量，可以鉴定向（或近似于）第一捕获率的返回，向第一捕获率的返回对应于其中分析物和分析物配体8已经变成未结合的孔状态。换句话说，从第二捕获率回到（或近似于）第一捕获率的第二转变对应于分析物-配体结合对的解离。

在某些实施例实施方案中，通过测量第一转变和第二转变之间的时间间隔，可以确定分析物-配体对在结合状态下度过的时间。同样地，在某些实施例实施方案中，通过在有分析物存在下测量从第一捕获率回到第二捕获率的转变的长度，可以确定分析物-配体对在未结合状态度过的时间。然后从所鉴定的捕获率转变，特别是从纳米孔处于结合状态相对于未结合状态的时间长度，可以确定分析物与分析物配体8之间关于结合反应的结合/解离速率。例如，为了确定结合速率(K_a)，可以记录给定结合反应的各个俘获间时间（intercapture time），并将其拟合至描述结合反应的方程式。取决于分析物和分析物配体8之间的结合机制（例如，蛋白-蛋白相互作用、蛋白-DNA相互作用、DNA-DNA相互作用、适体-DNA相互作用、蛋白-化学等），方程式例如可以是单一指数方程式或另一类方程式。为了确定结合反应的解离速率(K_d)，收集、记录结合停留时间和每个结合事件的持续时间，并将其拟合至描述解离反应的方程式。取决于与结合反应相关的解离机理，这可以是单一指数方程式或另一类方程式。

一旦确定了特定结合反应的结合和/或解离速率，就可以使用K_a和K_d（与已知的动力学方法和原理一起）来反算分析物的浓度。例如，在已知芯片的纳米孔浓度、抗原-配体（即分析物-孔）浓度和K_a/K_d的情况下，可以从以下动力学方程式容易地确定分析物的浓度：

其中，ka/kd = ([分析物] * [孔])/[分析物-配体]。可以如下确定游离分析物的浓度：[分析物] = (ka/kd) * [分析物-孔]/[孔]。因此，分析物的总浓度为[分析物-孔] +[分析物]。可以如本文所述在芯片上测量各种参数，即，K_a、k_d、[孔]和[孔-分析物]。例如，可以基于被鉴定为结合分析物的孔的数量来确定分析物-配体浓度。从第一捕获率到第二捕获率然后回到（或近似于）第一捕获率的转变的一个例子显示在例如图5C中（在下面讨论）。

本领域技术人员基于本公开内容将理解，本文所述的纳米孔组件可以具有可与本文所述的方法和系统兼容的其它布置（用于分析物检测和浓度确定）。例如，在某些实施例实施方案中，本文所述的捕获标签可以直接地或间接地附接至分析物配体。在这样的实施方案中，纳米孔组件可以被配置成包括纳米孔蛋白缀合物，其中该缀合物蛋白包括纳米孔蛋白单体和分析物配体附着位点。然后可以将包括捕获标签的分析物配体附接到分析物配体附着位点，从而形成分析物检测复合物，其中捕获标签直接地或间接地附接到分析物配体，而不是附接到纳米孔蛋白缀合物。在某些实施例实施方案中，可以在脂质膜内形成纳米孔之后使具有捕获标签的分析物配体附接到缀合物蛋白的分析物配体附着位点。在其它实施例实施方案中，可以在将复合物掺入脂质膜之前将具有捕获标签的分析物配体连接至缀合物蛋白的附着位点。

在其它实施例实施方案中，可以将包括纳米孔蛋白单体和捕获标签的纳米孔蛋白缀合物与包括分析物配体的至少一种其它纳米孔单体组合。例如，可以形成α-溶血素纳米孔，其中一个组分是包括捕获标签的纳米孔缀合物，并且其中其它六个α-溶血素单体之一包括分析物配体。因此，α-溶血素纳米孔组件将是具有单个捕获标签和单个分析物配体的1:6七聚体。在其它实施例实施方案中，分析物配体可以附接到七聚体的1、2、3、4、5或6个α-溶血素单体，其余的α-溶血素单体包括捕获标签。在其它实施例实施方案中，捕获标签可以放置在多种α-溶血素单体上，而七聚体的一个或多个其它单体包括分析物配体。例如，如本文所述，使用迁移偏移分析，可以鉴定此类纳米孔。

实施例

在以下实施例中进一步详细描述本发明，这些实施例决不旨在限制所要求保护的本发明的范围。附图意图被视作本发明的说明书和描述的组成部分。引用的所有参考文献对于其中描述的所有内容都通过引用特别并入本文中。提供下述实施例来解释、而不是限制要求保护的发明。

本文中使用的以下缩写适用：eq (当量)；M (摩尔)；µM (微摩尔)；N (标准)；mol(摩尔)；mmol (毫摩尔)；µmol (微摩尔)；nmol (纳摩尔)；g (克)；mg (毫克)；kg (千克)；µg (微克)；L (升)；ml (毫升)；µl (微升)；cm (厘米)；mm (毫米)；µm (微米)；nm (纳米)；℃(摄氏度)；h (小时)；min (分钟)；sec (秒)；msec (毫秒)。

实施例1

蛋白表达和回收

本实施例解释了从细菌宿主细胞（例如大肠杆菌）表达和回收蛋白。更具体地，本实施例描述了α-HL纳米孔蛋白缀合物(α-HL-亚基/SpyTag/CaptureTag序列，SEQ ID NO:4)、α-HL亚基变体(SEQ ID NO: 5)、具有SpyCatcher序列的GFP分析物配体(SEQ ID NO: 9)和GFP分析物(SEQ ID NO: 10)的表达和回收。

α-HL纳米孔蛋白缀合物(SEQ ID NO: 4)的制备

将α-HL-亚基/SpyTag/CaptureTag蛋白(SEQ ID NO: 4)制备为纳米孔蛋白缀合物，其中缀合物的捕获标签结构域对应于SEQ ID NO: 8所示的序列，并且缀合物的α-HL单体对应于SEQ ID NO: 16。为了制备α-HL-亚基/SpyTag/CaptureTag蛋白(SEQ ID NO: 4)，通过商业DNA合成合成了编码α-HL-亚基/SpyTag/CaptureTag蛋白序列(SEQ ID NO: 4)的基因，并且使用标准的DNA限制性酶消化和连接将其插入pET26b载体。使用标准的热激方案将质粒DNA转化到BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，并在补充了卡那霉素的LB琼脂平板上生长。选择细菌菌落并测序以验证基因的完整性。从甘油储液开始细菌培养，并在补充了适当抗生素的LB培养基的5 mL培养物中过夜生长。然后在补充了抗生素的自诱导MagicMedia(Invitrogen)中扩增这些培养物，并使其在25°C扩增16-24小时。使用在2,200 x g离心15分钟，收获细胞沉淀物，并于-80°C冷冻直至进一步使用。

表达α-HL-亚基/SpyTag/CaptureTag (SEQ ID NO: 4)后，将沉淀物融化并将每克细胞沉淀物溶解在5 mL裂解缓冲液(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 100 mMKPO4, 10 mM咪唑)中，并补充无EDTA的蛋白酶抑制剂片和DNA酶1 (Sigma-AldrichTM)。使用设置为90%最大功率的尖头超声破碎器(Fisher ScientificTM)裂解细胞，并脉冲1秒钟、关闭4秒钟，持续2分钟。使用在20,000 x g离心45分钟，除去细胞碎片。将上清液加到钴亲和柱上，并用2CV的裂解缓冲液、2CV的洗涤缓冲液(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 500 mMNaCl, 10 mM咪唑)、10CV的高盐洗涤缓冲液(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 M NaCl, 10 mM咪唑)、2CV的洗涤缓冲液洗涤，并用补充了150 mM咪唑的洗涤缓冲液洗脱。

α-HL亚基变体(SEQ ID NO: 5)的制备

将α-HL亚基变体(SEQ ID NO: 5)用作六个组分以形成1:6α-HL七聚体（如实施例2中所述）。简而言之，为了制备α-HL亚基变体(SEQ ID NO: 5)，通过商业DNA合成合成了编码在SEQ ID NO: 5中列出的α-HL变体蛋白亚基的基因，并使用标准的DNA限制性酶消化和连接将其插入pET26b载体中。使用标准的热激方案将质粒DNA转化到BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，并在补充了卡那霉素的LB琼脂平板上生长。选择细菌菌落并测序以验证基因的完整性。从甘油储液开始细菌培养，并在补充了适当抗生素的LB培养基的5 mL培养物中过夜生长。然后在补充了抗生素的自诱导MagicMedia (Invitrogen)中扩增这些培养物，并使其在25°C扩增16-24小时。使用在2,200 x g离心15分钟，收获细胞沉淀物，并于-80°C冷冻直至进一步使用。

表达α-HL蛋白(SEQ ID NO: 5)后，将沉淀物融化并将每克细胞沉淀物溶解在5 mL裂解缓冲液(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 100 mM KPO4, 10 mM咪唑)中，并补充无EDTA的蛋白酶抑制剂片和DNA酶1 (Sigma-AldrichTM)。使用设置为90%最大功率的尖头超声破碎器(Fisher ScientificTM)裂解细胞，并脉冲1秒钟、关闭4秒钟，持续2分钟。使用在20,000 x g离心45分钟，除去细胞碎片。将上清液加到钴亲和柱上，并用2CV的裂解缓冲液、2CV的洗涤缓冲液(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 10 mM咪唑)、10CV的高盐洗涤缓冲液(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 M NaCl, 10 mM咪唑)、2CV的洗涤缓冲液洗涤，并用补充了150 mM咪唑的洗涤缓冲液洗脱。

GFP分析物配体(SEQ ID NO: 9)的制备

将GFP分析物配体用于形成分析物检测复合物，其中分析物检测复合物的分析物配体为抗-GFP。为了制备GFP分析物配体，通过商业DNA合成合成了编码GFP-分析物-配体/SpyCatcher融合蛋白(SEQ ID NO: 9)的基因，并且使用标准的DNA限制性酶消化和连接将其插入pET26b载体。使用标准的热激方案将质粒DNA转化到BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，并在补充了卡那霉素的LB琼脂平板上生长。选择细菌菌落并测序以验证基因的完整性。从甘油储液开始细菌培养，并在补充了适当抗生素的LB培养基的5 mL培养物中过夜生长。然后在补充了抗生素的自诱导MagicMedia (Invitrogen)中扩增这些培养物，并使其在25°C扩增16-24小时。使用在2,200 x g离心15分钟，收获细胞沉淀物，并于-80°C冷冻直至进一步使用。

表达GFP-分析物-配体/SpyCatcher蛋白(SEQ ID NO: 9)后，将沉淀物融化并将每克细胞沉淀物溶解在5 mL裂解缓冲液(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 100 mMKPO4, 10 mM咪唑)中，并补充无EDTA的蛋白酶抑制剂片和DNA酶1 (Sigma-AldrichTM)。使用设置为90%最大功率的尖头超声破碎器(Fisher ScientificTM)裂解细胞，并脉冲1秒钟、关闭4秒钟，持续2分钟。使用在20,000 x g离心45分钟，除去细胞碎片。将上清液加到钴亲和柱上，并用2CV的裂解缓冲液、2CV的洗涤缓冲液(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 500 mMNaCl, 10 mM咪唑)、10CV的高盐洗涤缓冲液(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 M NaCl, 10 mM咪唑)、2CV的洗涤缓冲液洗涤，并用补充了150 mM咪唑的洗涤缓冲液洗脱。

GFP分析物(SEQ ID NO: 10)

将GFP分析物(SEQ ID NO: 10)与分析物检测复合物结合使用，以证实包括分析物检测复合物的α-HL纳米孔的活性（参见实施例3）。为了制备GFP分析物(SEQ ID NO: 10)，通过商业DNA合成合成了编码在SEQ ID NO: 10中列出的GFP分析物的基因，并使用标准的DNA限制性酶消化和连接插入到pET26b载体中。使用标准的热激方案将质粒DNA转化到BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，并在补充了卡那霉素的LB琼脂平板上生长。选择细菌菌落并测序以验证基因的完整性。从甘油储液开始细菌培养，并在补充了适当抗生素的LB培养基的5 mL培养物中过夜生长。然后在补充了抗生素的自诱导MagicMedia (Invitrogen)中扩增这些培养物，并使其在25°C扩增16-24小时。使用在2,200 x g离心15分钟，收获细胞沉淀物，并于-80°C冷冻直至进一步使用。

表达GFP分析物(SEQ ID NO: 10)后，将沉淀物融化并将每克细胞沉淀物溶解在5mL裂解缓冲液(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 100 mM KPO4, 10 mM咪唑)中，并补充无EDTA的蛋白酶抑制剂片和DNA酶1 (Sigma-AldrichTM)。使用设置为90%最大功率的尖头超声破碎器(Fisher ScientificTM)裂解细胞，并脉冲1秒钟、关闭4秒钟，持续2分钟。使用在20,000 x g离心45分钟，除去细胞碎片。将上清液加到钴亲和柱上，并用2CV的裂解缓冲液、2CV的洗涤缓冲液(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 10 mM咪唑)、10CV的高盐洗涤缓冲液(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 M NaCl, 10 mM咪唑)、2CV的洗涤缓冲液洗涤，并用补充了150 mM咪唑的洗涤缓冲液洗脱。将蛋白等分并在-80℃保存直至即将使用前。

实施例2

包含分析物检测复合物的纳米孔的组装

本实施例描述了具有六个α-HL变体纳米孔单体亚基s (SEQ ID NO: 5)和一个包含捕获标签序列和SpyTag序列(SEQ ID NO: 4)的α-HL亚基的七聚体纳米孔的组装，其中GFP分析物配体(SEQ ID NO: 9)通过SpyTag-SpyCatcher键附接到单个α-HL亚基(SEQ IDNO: 4)以形成分析物检测复合物。例如，在Li等人, J Mol Biol. 2014年1月23日; 426(2):309-17中描述了SpyTag-SpyCatcher键。

1:6α-HL七聚体纳米孔组件的制备

通常如PCT/EP2017/057433中所述可以制备包含一个α-HL/SpyTag (SEQ ID No:4)和6个α-HL-变体蛋白(SEQ ID NO: 5)（即1:6七聚体比例）的α-HL七聚体纳米孔组件。简而言之，使用大约20 mg总蛋白，将α-HL/SpyTag (SEQ ID No: 4)和期望的α-HL-变体蛋白(SEQ ID NO: 5)溶液以1:9的比例混合在一起以形成七聚体的混合物。预见到，这样的混合物将产生各种级分，其包括不同比例的α-HL/SpyTag (SEQ ID NO: 4)和α-HL-变体蛋白(SEQ ID NO: 5) (即，0:7; 1:6、2:5、3:4等)，其中α-HL/SpyTag (SEQ ID NO: 4) SpyTag组分作为七聚体的0、1、2、3、4、5、6或7个单体亚基存在。

将二植烷酰基磷脂酰胆碱(DPhPC)脂质溶解在50mM Tris, 200mM NaCl, pH 8或150mM KCl, 30mM HEPES, pH 7.5中至50mg/ml的终浓度，并添加至α-HL单体的混合物至5mg/ml的终浓度。将α-HL单体的混合物在37℃温育至少60min。此后，加入正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(βOG)至5%(重量/体积)的终浓度，以溶解得到的脂质-蛋白混合物。离心样品以清除蛋白聚集体和剩余的脂质复合物，并收集上清液用于进一步纯化。

然后将七聚体的混合物进行阳离子交换纯化，并收集洗脱级分。对于每个级分，制备两个样品用于SDS-PAGE。第一样品仅包括15 uLα-HL洗脱液，第二样品与3 ug GFP-SpyCatcher (SEQ ID NO: 10)合并。然后将样品在室温温育（避光）1-16小时。温育后，将5uL 4x Laemmli SDS-PAGE缓冲液(Bio-Rad^TM)添加到每个样品中。然后将样品和PrecisionPlus^TM Stain-Free蛋白阶梯上样到4-20%Mini-PROTEAN Stain-Free蛋白预制凝胶（Bio-Rad）上。使凝胶在200 mV运行30分钟。然后使用Stain-Free滤光片对凝胶成像。

通过SDS-PAGE期间的分子量带位移，可以观察GFP-SpyCatcher (SEQ ID NO: 10)向七聚体纳米孔组件的α-HL/SpyTag蛋白(SEQ ID NO: 4)的附接，从而促进1:6七聚体级分的鉴定。也就是说，包含单个SpyTag的七聚体将结合单个GFP-SpyCatcher (SEQ ID NO:10)分子，因此其位移对应于七聚体孔的分子量加上单个GFP-SpyCatcher (SEQ ID NO:10)分子的分子量，而具有两个或更多个SpyTag的七聚体应具有相应更大的分子量位移。因此，可以关于α-HL/SpyTag与α-HL-变体的比率分析在以上七聚体α-HL纯化过程中从阳离子交换柱洗脱的峰。另外，当对SDS-PAGE凝胶成像时，可以使用GFP-荧光滤光片观察GFP-SpyCatcher (SEQ ID NO: 10)附接的存在。参见PCT/EP2017/057433。

基于此原理，用分子量标准蛋白梯子测定其分子量位移对应于GFP-SpyCatcher(SEQ ID NO: 10)的单次添加，并因此1个1-组分纳米孔蛋白缀合物(SEQ ID NO: 4)对应6个α-HL变体(SEQ ID NO: 5)的级分。利用Bio-Rad的无污点成像系统确定分子量位移。使用蓝色滤光片确定GFP荧光的存在。荧光的存在用于确认SpyTag蛋白的存在。参见PCT/EP2017/057433。然后将对应于1:6比率（即一个α-HL/SpyTag (SEQ ID NO: 4)对应六个α-HL-变体(SEQ ID NO: 5)）的洗脱级分用于进一步实验。

GFP分析物配体(SEQ ID NO: 9)向1:6七聚体的附接

然后使用来自上面的1:6七聚体级分，使用SpyTag/SpyCatcher系统(参见Li等人,J Mol Biol. 2014 Jan 23;426(2):309-17 9)将GFP分析物配体(SEQ ID NO: 9)（即，包含SpyCatcher序列的抗-GFP纳米抗体）附接到1:6七聚体的一个α-HL/SpyTag/CapTag (SEQID NO: 4)组分，从而在纳米孔组件中形成分析物检测复合物。简而言之，为了将粘性的GFP分析物配体(SEQ ID NO: 9)附接至1:6七聚体的一个α-HL/SpyTag (SEQ ID NO: 4)组分，将粘性的GFP分析物配体(SEQ ID NO: 9)与1:6七聚体复合物(参见上面)在4℃混合过夜。通过将混合物施加到尺寸排阻色谱柱，从复合物分离未附接的GFP分析物配体(SEQ ID NO:9)。将所得的含有复合物的级分等分并在-80℃储存备用。然后将包含GFP分析物配体的七聚体用在随后的实验中，将GFP分析物配体(SEQ ID NO: 9)附接到α-HL/SpyTag/CapTag(SEQ ID NO: 4)，从而形成纳米孔组件的分析物检测复合物。

实施例3

捕获率确定与分析

本实施例显示了在没有附接的分析物配体存在下、附接了分析物配体(即，上面实施例2中描述的纳米孔)和在有GFP分析物(SEQ ID NO: 10)存在下，纳米孔组件的捕获率确定和分析。

简而言之，如标题为“Systems and methods for forming a nanopore in alipid bilayer”的美国专利公开2017/0322195（其特此整体并入本文）中所述，制备没有附接分析物配体的1:6α-溶血素七聚体并设置于芯片上。

在制备芯片后，然后使用捕获率分析方法评估捕获标签在不同条件（即，GFP分析物配体没有结合到孔，GFP分析物配体结合到孔，以及在有GFP分析物存在下）下的捕获率。简而言之，捕获率分析方法是基于周期差异方法（Period-to-Period DifferencesMethod），该方法在WO/2017/220732中进行了详细描述。通过首先检测孔的所有标签捕获事件，可以测量捕获率。通过从原始信号减去右移一个周期的信号，检测信号中的捕获事件。通过将低于ADC噪声阈值的差分值设置为零，进一步处理差分信号。记录每个捕获事件的时间标记。

图5A-5C是显示根据某些实施例实施方案的捕获率确定的图。例如，图5A-5C中的每个点代表捕获事件数目与事件的测量时间标记之间的关系。捕获率是所有事件的图的斜率的倒数。更具体地，图5A显示了在没有GFP分析物配体存在下（即，没有结合配体）具有单个整体斜率的标签捕获的基线捕获率。对于图5B中所示的数据，如以上实施例2中所述，将GFP分析物配体附接到纳米孔，并确定第一捕获率。如图5B中所示，当GFP分析物配体附接到纳米孔时，与基线捕获率(图5A)相比，第一捕获率降低。

在确定基线捕获率(图5A)和第一捕获率(图5B)之后，确定对应于GFP分析物配体结合的第二捕获率，如图5C所示。简而言之，将27µL GFP分析物(SEQ ID NO: 10)添加至芯片，从而促进GFP分析物(SEQ ID NO: 10)与纳米孔的GFP分析物配体之间的结合。如图5C所示，第二捕获率小于第一捕获率。此外，可以观察到从GFP分析物配体附接到GFP分析物（在大约300秒）并然后离解（在800秒之前）的位置的转变（图5C）。基于不同于第一捕获率的第二捕获率的鉴定（图5C），可以确认GFP分析物(SEQ ID NO: 10)在芯片上的存在。

序列表自由正文

SEQ ID NO: 2 (WT a-HL氨基酸) [在大肠杆菌中表达]

SEQ ID NO: 3 (成熟的WT aHL，具有纯化标签)

SEQ ID NO: 4 (α-HL-LNKR—SpyTag—HIS—CapTag)

下划线= 柔性接头；粗体= SpyTag；斜体= HistTag；粗体/下划线= 基于肽的纳米标签

SEQ ID NO: 5 (α-HL H35G变体, 6组分)

下划线= TEV-His标签

SEQ ID NO: 6 (OmpG)

SEQ ID NO: 7 (OmpG-LNKR1-HIS-LNKR2-SpyTag-CapTag)

下划线= 柔性接头；斜体= HisTag; GSGG (SEQ ID NO: 14)= 第二接头；粗体/下划线= SpyTag；仅粗体= 基于肽的纳米标签

SEQ ID NO: 8 (捕获标签氨基酸序列)

SEQ ID NO: 9 (纳米抗体, GFP—LNKR—SpyCatcher—TEV/His)

粗体= 柔性接头；下划线= TEV-His-标签

SEQ ID NO: 10 (GFP—接头—SpyCatcher—HisTag)

下划线= Hist-标签；粗体= 柔性接头

SEQ ID NO: 11 (SpyTag序列)

SEQ ID NO: 12 (接头序列)

SEQ ID NO: 13 (接头序列)

SEQ ID NO: 14 (接头序列)

SEQ ID NO: 15 (接头序列)

SEQ ID NO: 16 (成熟的WTα-HL; AAA26598)

SEQ ID NO: 17 - EPPP Tag

。

Claims (19)

1.一种纳米孔蛋白缀合物，其包含纳米孔蛋白单体和捕获标签，其中所述捕获标签由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成，并且其中所述纳米孔蛋白缀合物的纳米孔蛋白单体由α-HL的SEQ ID NO:16或OMPG的SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列组成。

2.权利要求1的纳米孔蛋白缀合物，其中所述纳米孔蛋白缀合物的纳米孔蛋白单体包含α-溶血素单体，且其中所述捕获标签由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成。

3.权利要求1的纳米孔蛋白缀合物，其中所述纳米孔蛋白缀合物由SEQ ID NO:4或SEQID NO:7所示的氨基酸序列组成。

4.一种分析物检测复合物，其中所述分析物检测复合物包含权利要求1-3中的任一项所述的纳米孔蛋白缀合物和连接至所述纳米孔蛋白缀合物的分析物配体。

5.权利要求4的分析物检测复合物，其中所述分析物配体是纳米抗体。

6.权利要求4或5的分析物检测复合物，其中所述分析物配体通过异肽键连接至所述纳米孔蛋白缀合物。

7.权利要求6的分析物检测复合物，其中所述异肽键是SpyTag/SpyCatcher键。

8.一种纳米孔组件，其包含权利要求4-7中的任一项的至少一种分析物检测复合物。

9.权利要求8的纳米孔组件，其中所述纳米孔组件是七聚体纳米孔组件，且其中所述七聚体纳米孔组件的每个单体包含α-溶血素单体。

10.一种用于检测流体溶液中的分析物的方法，所述方法包括：

提供芯片，其包含根据权利要求8或9的纳米孔组件，其中所述纳米孔组件设置在膜内；

将传感电极定位在所述膜邻近或附近；

借助于计算机处理器和所述传感电极，确定所述纳米孔组件的捕获标签的第一捕获率；

使所述纳米孔组件与分析物接触，其中所述分析物对所述分析物检测复合物的分析物配体具有结合亲和力；和，

借助于计算机处理器和传感电极，确定与纳米孔组件结合的捕获标签的第二捕获率，其中所述第二捕获率提供了所述分析物结合至所述分析物检测复合物的分析物配体且因此存在于流体溶液中的指示。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述第二捕获率大于或小于所述第一捕获率。

12.根据权利要求10或11所述的方法，所述方法进一步包括基于所述分析物配体的身份和基于所述分析物结合至所述分析物配体的指示来鉴定所述分析物。

13.一种用于确定流体溶液中的分析物浓度的方法，所述方法包括：

提供芯片，其包含根据权利要求8或9的纳米孔组件，其中所述纳米孔组件设置在膜内；

将传感电极定位在所述膜邻近或附近；

借助于计算机处理器和所述传感电极，确定所述纳米孔组件的捕获标签的第一捕获率；

使所述纳米孔组件与分析物接触，其中所述分析物对所述分析物检测复合物的分析物配体具有结合亲和力；

借助于计算机处理器和传感电极，鉴定从所述第一捕获率向所述分析物检测复合物的捕获标签的第二捕获率的第一转变；

借助于计算机处理器和传感电极，鉴定从所述第二捕获率向接近第一捕获率的第二转变；和，

至少部分地基于所述第一转变和所述第二转变的鉴定，确定所述流体溶液中分析物的浓度。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第二捕获率大于或小于所述第一捕获率。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其中确定所述流体溶液中分析物的浓度进一步包括测量所述第一转变和所述第二转变之间的时间间隔。

16.根据权利要求13-15中的任一项所述的方法，其中确定所述流体溶液中分析物的浓度进一步包括确定所述分析物和所述纳米孔组件的分析物检测复合物的分析物配体之间的结合速率。

17.一种用于确定流体溶液中的分析物浓度的系统，所述系统包括：

包含纳米孔组件的芯片，其中所述纳米孔组件设置在所述芯片的膜内，且其中所述纳米孔组件的至少一个纳米孔蛋白单体包含捕获标签和分析物配体；

传感电极，其定位在所述膜邻近或附近，其中所述传感电极被配置成检测来自所述纳米孔组件的信号；和，

计算机处理器，其中所述计算机处理器和传感电极被配置成鉴定与纳米孔组件相关的第一转变和第二转变，所述第一转变对应于所述分析物与所述分析物配体的结合，且所述第二转变对应于所述分析物从所述分析物配体的解离；其中所述纳米孔蛋白单体由α-HL的SEQ ID NO:16或OMPG的SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列组成；并且其中所述捕获标签由SEQID NO:8所示的氨基酸序列组成。

18.权利要求17的系统，其中至少部分地基于鉴定出的第一转变和鉴定出的第二转变来确定流体溶液中分析物的浓度。

19.权利要求17或18的系统，其中所述纳米孔蛋白单体是α-溶血素单体。