ES2962704T3

ES2962704T3 - Ensayo de detección para conjugados de proteína-polinucleótido

Info

Publication number: ES2962704T3
Application number: ES19739430T
Authority: ES
Inventors: Mai Thayer; Sara Humphreys
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2018-06-07
Filing date: 2019-06-06
Publication date: 2024-03-20
Anticipated expiration: 2039-06-06
Also published as: US20190376119A1; US20220170074A1; JP7372941B2; US11208677B2; AU2019280973A1; CN112424371B; SG11202012163VA; CN112424371A; WO2019236921A1; WO2019236921A9; MX2020013183A; CA3101473A1; JP2021526803A; EP3802859A1; EP3802859B1; JP2023126536A; KR20210018327A

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para detectar y cuantificar moléculas conjugadas de proteína-polinucleótido intactas en diversas matrices de muestra. En particular, los métodos utilizan oligonucleótidos formadores de triplex en combinación con compañeros de unión específicos de proteínas para detectar respectivamente los componentes polinucleotídicos y proteicos de las moléculas conjugadas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Ensayo de detección para conjugados de proteína-polinucleótido

La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias, que se ha presentado electrónicamente en formato ASCII. La copia en formato legible por computadora del Listado de Secuencias, que se creó el 23 de mayo de 2019, se denomina A-2248-WO-PCT_SeqList_ST25 y tiene un tamaño de 1,7 kilobytes.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la detección de moléculas de conjugados de fármacos. En particular, la invención se refiere a métodos para detectar moléculas de conjugados de proteína-polinucleótido intactas en una muestra utilizando oligonucleótidos formadores de triplex etiquetados y participantes en la unión específica de proteínas en ensayos basados en sándwich.

Antecedentes de la invención

Las moléculas de ácido nucleico continúan representando una clase prometedora de agentes terapéuticos. Sin embargo, el suministro de moléculas de ácido nucleico terapéuticas a los tejidos diana ha demostrado ser un desafío y se han intentado diversos enfoques. Uno de esos enfoques de suministro implica la conjugación de una molécula de ácido nucleico terapéutica con una proteína diana que se une específicamente a proteínas de la superficie celular expresadas en los tipos de células de interés. Por lo tanto, estas moléculas de conjugados de proteína-polinucleótido, tales como los conjugados de anticuerpo-ARNip, están surgiendo como una nueva modalidad terapéutica. Como tal, es importante contar con métodos de ensayo sólidos que permitan la detección y cuantificación de moléculas de conjugados de proteína-polinucleótido intactas.

Aunque existen algunos métodos que podrían adaptarse para detectar moléculas de conjugados de proteínapolinucleótido intactas, los mismos adolecen de varias desventajas. Por ejemplo, la cromatografía de exclusión por tamaño podría utilizarse para separar moléculas de conjugados de proteína-polinucleótido intactas de otras especies en solución. Sin embargo, este método es en gran medida cualitativo y requiere un alto nivel de pureza de la muestra y, por lo tanto, no es compatible para uso en matrices de muestras complejas, tales como homogeneizados de suero y tejido. Otros métodos, tales como la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), la cromatografía líquida - espectrometría de masas (LC-MS) y la resonancia magnética nuclear (RMN), requieren condiciones que podrían afectar a la integridad de la molécula de conjugado o diversas etapas que requieren mucho tiempo para el procesamiento de muestras o la interpretación de datos posteriores al ensayo. Además, ninguno de estos métodos es compatible con la detección o cuantificación de la molécula de conjugado en matrices de muestras complejas, ya que típicamente se requieren muestras de alta pureza.

Se ha informado de un método de detección de moléculas de conjugados de anticuerpo-ARNip que utiliza una etapa de captura basada en antígeno, seguido de una reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) (Tan et al., Analytical Biochemistry, Vol. 430: 171-178, 2012). Sin embargo, este método depende en gran medida de la eficacia de la hibridación del cebador y la sonda de la PCR, que puede verse afectada por el número y el tipo de nucleótidos modificados químicamente presentes en la molécula de ARNip. Además, la etapa de PCR requiere el uso de altas temperaturas (p. ej., 85 °C o más), lo que puede dar lugar a la degradación de proteínas, limitando con ello potencialmente el uso del ensayo en matrices de muestras más complejas, tales como los homogeneizados de tejidos. Métodos y composiciones para la detección de secuencias de ácidos nucleicos específicas se conocen en la técnica (véanse los documentos WO 00/29624, WO 97/15691 y US 2008/026388).

Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de desarrollar ensayos simples que permitan la detección, así como la cuantificación de moléculas de conjugados de proteína-polinucleótido intactas en una diversidad de tipos de muestras, incluyendo muestras biológicas complejas.

Sumario de la invención

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. La presente invención proporciona métodos para detectar moléculas de conjugados de proteína-polinucleótido en diversas matrices de muestras, incluyendo muestras biológicas complejas, tales como homogeneizados de suero y tejido. En una realización, los métodos comprenden poner en contacto la muestra con un oligonucleótido formador de triplex (TFO, por sus siglas en inglés) que está enlazado covalentemente a una etiqueta bajo condiciones que permiten que el TFO se hibride con el polinucleótido en la molécula de conjugado, formando con ello una mezcla de hibridación; poner en contacto la mezcla de hibridación con una superficie que comprende un reactivo de captura que se une específicamente a la etiqueta enlazada covalentemente al TFO; poner en contacto la superficie con un reactivo de detección, en donde el reactivo de detección comprende un marcador detectable acoplado a un participante en la unión que se une específicamente a la proteína en la molécula de conjugado; y detectar una señal procedente del marcador detectable.

En otra realización, los métodos comprenden poner en contacto la muestra con un TFO que está enlazado covalentemente a una etiqueta bajo condiciones que permiten que el TFO se hibride con el polinucleótido en la molécula de conjugado, formando con ello una mezcla de hibridación; poner en contacto la mezcla de hibridación con una superficie que comprende un reactivo de captura que se une específicamente a la proteína en la molécula de conjugado; poner en contacto la superficie con un reactivo de detección, en donde el reactivo de detección comprende un marcador detectable acoplado a un participante en la unión que se une específicamente a la etiqueta enlazada covalentemente al TFO; y detectar una señal procedente del marcador detectable.

El TFO empleado en los métodos de la invención puede tener una secuencia que sea complementaria a la secuencia del componente polinucleotídico de la molécula de conjugado. En realizaciones en las que el componente polinucleotídico es un polinucleótido de doble cadena (p. ej., un ARNip), el TFO puede tener una secuencia que sea complementaria a la secuencia de la cadena del polinucleótido que está enlazada a la proteína en la molécula de conjugado. En algunas realizaciones, el TFO tiene al menos 15 nucleótidos de longitud y comprende al menos un nucleótido modificado con una modificación de azúcar bicíclico (p. ej., ácido nucleico bloqueado). En determinadas realizaciones, el TFO comprende una mezcla de monómeros de ácido nucleico bloqueados y desoxirribonucleótidos. En realizaciones de este tipo, aproximadamente del 30 % a aproximadamente el 40 % de los nucleótidos en el TFO son monómeros de ácido nucleico bloqueados. En determinadas realizaciones de los métodos de la invención, el TFO está enlazado covalentemente a una etiqueta. La etiqueta puede ser un hapteno, tal como biotina, digoxigenina o 2,4-dinitrofenol.

En algunas realizaciones de los métodos de la invención, el reactivo de captura se une específicamente a la etiqueta enlazada covalentemente al TFO. En realizaciones de este tipo, el reactivo de captura puede ser un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a la etiqueta. Por ejemplo, la etiqueta puede ser digoxigenina y el reactivo de captura puede ser un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a digoxigenina. En otras realizaciones, el reactivo de captura es una proteína o un péptido que se une específicamente a la etiqueta. En estas realizaciones, la etiqueta puede ser biotina y el reactivo de captura puede ser estreptavidina.

En otras realizaciones de los métodos de la invención, el reactivo de captura se une específicamente a la proteína en la molécula de conjugado. En realizaciones de este tipo, el reactivo de captura puede ser un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a la proteína en la molécula de conjugado. Por ejemplo, en una realización, la proteína en la molécula de conjugado es un anticuerpo y el reactivo de captura es un anticuerpo anti región Fc o un anticuerpo anti-idiotípico. En otra realización, la proteína en la molécula de conjugado es un ligando peptídico y el reactivo de captura es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une específicamente al ligando peptídico. En otras realizaciones, el reactivo de captura puede ser una proteína o un fragmento de la misma que se une específicamente al componente proteico de la molécula de conjugado. En estas realizaciones, la proteína en la molécula de conjugado puede ser un anticuerpo y el reactivo de captura puede ser un antígeno diana del anticuerpo, proteína A o proteína G. En otras realizaciones similares, la proteína en la molécula de conjugado es un ligando de un receptor de la superficie celular y el reactivo de captura es el receptor o un fragmento de unión a ligando del mismo.

El reactivo de detección empleado en los métodos de la invención comprende un marcador detectable acoplado a un participante en la unión, en donde el participante en la unión se une específicamente a la proteína en la molécula de conjugado o a la etiqueta enlazada covalentemente al TFO. La etiqueta detectable acoplada al participante en la unión puede ser cualquier tipo de entidad generadora de señales, tal como un fluoróforo, una nanopartícula metálica, una nano-envoltura metálica, una enzima o un luminóforo de electroquimioluminiscencia (ECL). En algunas realizaciones de los métodos de la invención, el participante en la unión se une específicamente a la proteína en la molécula de conjugado. En estas realizaciones, el participante en la unión puede ser un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a la proteína en la molécula de conjugado. En una realización de este tipo, la proteína en la molécula de conjugado es un anticuerpo y el participante en la unión es un anticuerpo anti-región Fc o un anticuerpo anti-idiotípico. En otra realización, la proteína en la molécula de conjugado es un ligando peptídico y el participante en la unión es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une específicamente al ligando peptídico. En otras realizaciones, el participante en la unión puede ser una proteína o un fragmento de la misma que se une específicamente al componente proteico de la molécula de conjugado. Por ejemplo, en una realización, la proteína en la molécula de conjugado es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno y el participante en la unión es un antígeno diana del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno. En otra realización, la proteína en la molécula de conjugado es un ligando de un receptor de la superficie celular y el participante en la unión es el receptor o un fragmento de unión al ligando del mismo.

En otras realizaciones de los métodos de la invención, el participante en la unión en el reactivo de detección se une específicamente a la etiqueta enlazada covalentemente al TFO. En realizaciones de este tipo, el participante en la unión puede ser un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a la etiqueta. Por ejemplo, en una realización, la etiqueta es digoxigenina y el participante en la unión es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a digoxigenina. En otras realizaciones, el participante en la unión es una proteína o un péptido que se une específicamente a la etiqueta. En estas realizaciones, la etiqueta puede ser biotina y el participante en la unión puede ser estreptavidina.

Los métodos de la invención se pueden utilizar para detectar o medir diversos tipos de moléculas de conjugados de proteína-polinucleótido. El componente polinucleotídico de las moléculas de conjugado puede ser un ARNip, un ARNsh, un miARN, un pre-miARN, un mimético de miARN, un oligonucleótido anti-miARN o un oligonucleótido antisentido. El componente proteico de la molécula de conjugado puede ser un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno (p. ej., un scFv, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2 o un fragmento Fv), o un ligando. En algunas realizaciones, el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o ligando se une específicamente a un receptor expresado por un tipo de célula o tejido particular. En algunas realizaciones, la molécula de conjugado de proteínapolinucleótido a detectar o medir con los métodos de la invención es una molécula de conjugado de anticuerpo-ARNip. En otras realizaciones, la molécula de conjugado de proteína-polinucleótido a detectar o medir con los métodos de la invención es una molécula de conjugado de anticuerpo-ARNip.

Los métodos de la invención se pueden utilizar para detectar o medir moléculas de conjugados de proteínapolinucleótido en una diversidad de tipos de muestras. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra biológica, tal como suero, plasma, lisado celular o tejido (p. ej., homogeneizado de tejido). Muestras de este tipo pueden obtenerse de sujetos animales o humanos a quienes se les han administrado las moléculas de conjugado de proteínapolinucleótido. En algunas realizaciones, las muestras se obtienen de cultivos celulares (p. ej., sobrenadantes o lisados) que han sido expuestos a las moléculas de conjugado de proteína-polinucleótido. En otras realizaciones, la muestra se obtiene de una etapa en el procedimiento de fabricación de la molécula de conjugado, tal como una mezcla de reacción o producto de una etapa en el proceso de síntesis de la molécula de conjugado. Aún en otras realizaciones, los métodos de la invención se utilizan como parte de un proceso de control de calidad o de liberación de lotes y la muestra es una sustancia farmacológica o un producto farmacológico.

Breve descripción de los dibujos

LaFigura1 es un esquema que ilustra un formato del método de ensayo de la invención. En esta realización, un oligonucleótido formador de triplex etiquetado (TFO), p. ej. TFO biotinilado, se pone en contacto con una muestra que contiene moléculas de conjugados de anticuerpo-ARNip en condiciones de hibridación que permiten que el TFO etiquetado forme un triplex con el componente de ARNip del conjugado de anticuerpo-ARNip. La mezcla de hibridación se pone en contacto con una superficie recubierta con un reactivo de captura que se une específicamente a la etiqueta unida covalentemente al TFO (p. ej., estreptavidina). Las moléculas de conjugados de anticuerpo-ARNip que comprenden un híbrido de TFO-ARNip etiquetado se inmovilizan de este modo en la superficie mediante la interacción reactivo de captura-etiqueta (p. ej., interacción biotina-estreptavidina). La detección del conjugado inmovilizado se logra posteriormente utilizando un participante en la unión marcado que se une específicamente al anticuerpo tal como un anticuerpo anti-Fc marcado con rutenio.

LasFiguras 2A y 2Bson gráficos lineales de diversas concentraciones de moléculas de conjugados de mAb anti-ASGR1-ARNip (0,04 ng/mL a 2500 ng/mL) en tampón de muestra frente a señal electroquimioluminiscente en unidades arbitrarias (respuesta MSD) para ensayos que utilizan un intervalo de concentraciones bajo de TFO biotinilado (Figura 2A; 6,25 nM a 50 nM) y ensayos que utilizan un intervalo de concentraciones alto de TFO biotinilado (Figura 2B; 50 nM a 250 nM). Se empleó el formato de ensayo representado en la Figura 1. Los datos se ajustaron con un modelo de regresión no lineal de cuatro parámetros (Marquardt con factor de ponderación 1/YA2). Los valores de R se muestran entre paréntesis para cada una de las curvas.

LaFigura 2Ces un gráfico lineal que muestra la relación entre la concentración de moléculas de conjugado de mAb anti-ASGR1-ARNip (0,04 ng/mL a 2500 ng/mL) en suero de ratón u homogeneizado de hígado de ratón y señal electro-quimioluminiscente en unidades arbitrarias (respuesta MSD). Se empleó el formato de ensayo representado en la Figura 1. Los datos se ajustaron con un modelo de regresión no lineal de cuatro parámetros (Marquardt con factor de ponderación 1/YA2). Los valores de R2 se muestran entre paréntesis para cada una de las dos curvas. En el ensayo se utilizaron 100 nM de TFO biotinilado para capturar las moléculas de conjugados.

LaFigura 3Aes un gráfico que muestra la relación entre la concentración de moléculas de conjugados de mAb anti-ARNip (ARC; 0,04 ng/mL a 2500 ng/mL) y señal electro-quimioluminiscente en unidades arbitrarias (respuesta MSD). Se empleó el formato de ensayo representado en la Figura 1. La molécula de ARNip T2 se conjugó con el anticuerpo monoclonal anti-ASGR1 25B3 (T2-25B3) o con un anticuerpo monoclonal portador no específico 655 (T2-655). La molécula de ARNip se conjugó en una relación de ARN a anticuerpo de 1 o 2 (RAR1 o RAR2, respectivamente). En el ensayo se utilizaron 100 nM de TFO biotinilado para capturar las moléculas de conjugados.

LaFigura 3Bes una gráfica de los datos mostrados en la Figura 3A en una escala lineal. Los datos se ajustaron con un modelo de regresión lineal y se calcularon las pendientes de las líneas ajustadas. Las pendientes calculadas se muestran en la tabla debajo del gráfico. Las pendientes de las líneas de regresión para los conjugados RAR1 se redujeron en comparación con las pendientes de las líneas de regresión para los conjugados RAR2. Específicamente, la pendiente para el conjugado T2-25B3 RAR1 fue el 72 % de la del conjugado T2-25B3 RAR2, y la pendiente para el conjugado T2-655 RAR1 fue el 78 % de la del conjugado T2-655 RAR2.

LaFigura 4Aes un gráfico que muestra la relación entre la concentración de moléculas de conjugados de mAb anti-ARNip (ARC; 0,04 ng/mL a 2500 ng/mL) y señal electro-quimioluminiscente en unidades arbitrarias (respuesta MSD). Se empleó el formato de ensayo representado en la Figura 1. La molécula de ARNip HPRT o la molécula de ARNip C911 se conjugó con el anticuerpo monoclonal anti-ASGR1 25B3 (HPRT-25B3 o C911-25B3, respectivamente). Las moléculas de ARNip se conjugaron en una relación de ARN a anticuerpo de 1 o 2 (RAR1 o RAR2, respectivamente). En el ensayo se utilizaron 100 nM de TFO biotinilado para capturar las moléculas de conjugados.

LaFigura 4Bes una gráfica de los datos mostrados en la Figura 4A en una escala lineal. Los datos se ajustaron con un modelo de regresión lineal y se calcularon las pendientes de las líneas ajustadas. Las pendientes calculadas se muestran en la tabla debajo del gráfico. Las pendientes de las líneas de regresión para los conjugados RAR1 se redujeron en comparación con las pendientes de las líneas de regresión para los conjugados RAR2. Específicamente, la pendiente para el conjugado HPRT-25B3 RAR1 fue el 75 % de la del conjugado HPRT-25B3 RAR2, y la pendiente para el conjugado C911-25B3 RAR1 fue el 62 % de la del conjugado C911-25B3 RAR2.

LaFigura5 es un esquema que ilustra un segundo formato del método de ensayo de la invención. En esta realización, un oligonucleótido formador de triplex etiquetado (TFO), p. ej., TFO marcado con digoxigenina se pone en contacto con una muestra que contiene moléculas de conjugados de anticuerpo-ARNip en condiciones de hibridación que permiten que el TFO etiquetado forme un triplex con el componente de ARNip del conjugado de anticuerpo-ARNip. La mezcla de hibridación se pone en contacto con una superficie recubierta con un reactivo de captura que se une específicamente al componente de anticuerpo del conjugado anticuerpo-ARNip (p. ej., un anticuerpo anti-Fc o antígeno diana del anticuerpo). El reactivo de captura se puede acoplar directamente a la superficie o indirectamente a través de otros participantes en la unión, tales como biotina y estreptavidina, como se muestra en la ilustración. La detección del conjugado inmovilizado se logra posteriormente utilizando un participante en la unión marcado que se une específicamente a la etiqueta fijada covalentemente al TFO, tal como un anticuerpo anti-digoxigenina marcado con rutenio.

LaFigura 6es un gráfico que muestra la relación entre la concentración de moléculas de conjugado de mAb anti-ARNip (ARC; 0,38 ng/mL a 25000 ng/mL) en tampón de muestra y señal electro-quimioluminiscente en unidades arbitrarias (respuesta MSD). Se empleó el formato de ensayo representado en la Figura 5. La molécula de ARNip T2 se conjugó con el anticuerpo monoclonal anti-ASGR1 25B3 (T2-25B3) o con un anticuerpo monoclonal portador no específico 655 (T2-655). La molécula de ARNip se conjugó en una relación de ARN a anticuerpo de 1 o 2 (RAR1 o RAR2, respectivamente). En el ensayo se utilizaron 100 nM de TFO marcado con digoxigenina para hibridar con el componente de ARNip de las moléculas de conjugados y permitir la detección mediante un anticuerpo anti-digoxigenina marcado con rutenio.

LaFigura 7es un gráfico que muestra la relación entre la concentración de moléculas de conjugado de anticuerpo monoclonal-ARNip (ARC; 0,04 ng/mL a 2500 ng/mL) en tampón de muestra y señal electroquimioluminiscente en unidades arbitrarias (señal MSD). La molécula de ARNip T2 se conjugó con el anticuerpo monoclonal anti-ASGR1 25B3 en una relación de ARN a anticuerpo de 1 o 2 (RAR1 o RAR2, respectivamente). Las moléculas de conjugado se evaluaron en dos formatos de ensayo diferentes: formato de ensayo 1 en el que se utiliza el TFO etiquetado para la captura (véase el formato representado en la Figura 1) y formato de ensayo 2 en el que se utiliza el TFO etiquetado para la detección (véase el formato representado en la Figura 5). En el formato de ensayo 1, se utilizó TFO biotinilado en el ensayo para capturar las moléculas de conjugado y se utilizó un anticuerpo anti-Fc humano marcado con rutenio para la detección. En el formato de ensayo 2, se utilizó un anticuerpo anti-Fc humano biotinilado para capturar las moléculas de conjugado y para la detección se utilizó un TFO marcado con digoxigenina en combinación con un anticuerpo anti-digoxigenina marcado con rutenio.

LaFigura 8es un gráfico que muestra la relación entre la concentración de molécula de conjugado de mAb anti-ASGR1-ARNip (ARC) en tampón de muestra y señal electro-quimioluminiscente en unidades arbitrarias (respuesta MSD). El ARC se capturó e inmovilizó en una placa de microtitulación recubierta de estreptavidina utilizando una proteína ASGR1 humana biotinilada. En el ensayo se utilizó un TFO marcado con digoxigenina para hibridar con el componente de ARNip de las moléculas de conjugado y permitir la detección mediante un anticuerpo anti-digoxigenina marcado con rutenio.

LaFigura 9Aes un gráfico lineal que representa la expresión de la proteína diana en hígados de ratones de tipo salvaje que reciben una molécula de conjugado de mAb anti-ASGR1-ARNip por vía subcutánea (SC) o por vía intravenosa (IV) en todos los grupos de dosificación medidos en los momentos indicados (días 2, 4, 8 y 15). Se utilizó como control positivo el mismo ARNip conjugado con un resto GalNAc (GalNAc-ARNip).

La cantidad de ARNip en 5 mpk de GalNAc-ARNip es equivalente a la de 30 mpk del conjugado mAb anti-ASGR1 -ARNip, que tiene 2 ARNip/mAb.

LaFigura 9Bes es un gráfico lineal de la relación entre la concentración sérica del fármaco total ("Total") o la molécula de conjugado de mAb anti-ASGR1 -ARNip ("Intacta") a lo largo del tiempo en ratones que reciben la molécula de conjugado mAb anti-ASGR1-ARNip por vía subcutánea (SC) o por vía intravenosa (IV) en las dosis indicadas. Se tomaron muestras de suero a los 2, 4, 8 y 15 días después de la administración de las moléculas de conjugado.

LaFigura 9Ces es un gráfico lineal de la relación entre la concentración hepática del fármaco total a lo largo del tiempo en ratones que reciben una molécula de conjugado de mAb anti-ASGR1-ARNip por vía subcutánea (SC) o por vía intravenosa (IV) en las dosis indicadas. Se tomaron muestras de hígado a los 2, 4, 8 y 15 días después de la administración de las moléculas de conjugado. El fármaco total se evaluó utilizando un ELISA anti-Fc humano/anti-Fc humano que detecta el componente mAb anti-ASGR1 de los conjugados. A modo de comparación, se muestra una concentración hepática ajustada a la dosis del mAb anti-ASGR1 no conjugado (anticuerpo 25B3).

LaFigura 9Des es un gráfico lineal de la relación entre la concentración hepática del fármaco intacto a lo largo del tiempo en ratones que reciben una molécula de conjugado de mAb anti-ASGR1-ARNip por vía subcutánea (SC) o por vía intravenosa (IV) en las dosis indicadas. El fármaco intacto se evaluó utilizando el formato de ensayo representado en la Figura 1. Se tomaron muestras de hígado a los 2, 4, 8 y 15 días después de la administración de las moléculas de conjugado. La concentración hepática del mismo ARNip conjugado con un resto GalNAc (GalNAc-ARNip) se muestra a modo de comparación.

LaFigura 10Aes el espectro de masas nativo de la mezcla de hibridación de una molécula de conjugado de anticuerpo monoclonal-ARNip y un TFO biotinilado. La molécula de ARNip se conjugó con el anticuerpo en una relación de ARN a anticuerpo de 1 (RAR1). La molécula de conjugado mAb-ARNip RAR1 se hibridó con el TFO biotinilado durante 1 hora a 52 °C. Se observa un pico a 165 kDa, que corresponde a una molécula de conjugado en la que el TFO biotinilado se hibrida con el componente ARNip de la molécula de conjugado para formar un triplex (tríplex mAb-ARNip).

LaFigura 10Bes el espectro de masas nativo de la molécula de conjugado mAb-ARNip RAR1 en la Figura 10A en ausencia del TFO biotinilado. Solo se observa un pico a 158 kDa, correspondiente al peso molecular esperado del anticuerpo monoclonal con una molécula de ARNip fijada covalentemente.

Descripción detallada

La presente invención se refiere al desarrollo de métodos para detectar moléculas de conjugado de proteínapolinucleótido en diversas matrices de muestras, incluyendo muestras biológicas complejas, tales como homogeneizados de suero y tejido. Los métodos utilizan oligonucleótidos formadores de triplex etiquetados en combinación con participantes en la unión específicos de proteínas en formatos basados en sándwich para determinar la presencia del polinucleótido y los componentes proteicos del conjugado en la misma molécula (es decir, que el conjugado está intacto). Los métodos de la invención son útiles en una diversidad de aplicaciones, incluyendo la síntesis, estabilidad y detección de moléculas de conjugado de proteína-polinucleótido. Los métodos también se pueden emplear en estudios farmacocinéticos y de metabolismo de fármacos para comprender el perfil de aclaramiento de moléculas de conjugado de proteína-polinucleótido intactas y su degradación metabólicain vivo.Los métodos también encuentran uso en el control de calidad y en la liberación de lotes de formulaciones de sustancias farmacológicas y productos farmacológicos que comprenden moléculas de conjugado proteína terapéuticapolinucleótido.

Los métodos de la invención implican poner en contacto una muestra que comprende un conjugado de proteínapolinucleótido con un oligonucleótido formador de triplex (TFO). Un TFO es un oligonucleótido que se une al surco principal de una molécula de ARN o ADN de doble cadena a través de enlaces de hidrógeno de Hoogsteen o de Hoogsteen inversos de una manera específica de secuencia. Las cadenas ricas en pirimidina se unen mediante emparejamiento de bases de Hoogsteen en una orientación paralela con la cadena rica en purina en el dúplex, con timina (T) y citosina (C) en el TFO reconociendo pares de bases de adenina (A)-T y guanina (G)-C para generar tripletes de bases T-AT y C+-GC, respectivamente. Las cadenas ricas en purina se unen mediante emparejamiento de bases de Hoogsteen en una orientación anti-paralela con la cadena rica en purina en el dúplex, reconociendo A y G en el TFO los pares de bases AT y GC para generar tripletes de bases A-AT y G-GC, respectivamente. TFOs que contienen modificaciones de bases o análogos de nucleósidos pueden formar triplex con hebras dúplex que contienen una mezcla de nucleótidos de purina y pirimidina(véase, p. ej.,Rusling et al., Nucleic Acids Res., Vol. 33:3025-3032, 2005).

TFOs utilizados en los métodos de la invención son generalmente de al menos aproximadamente 15 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el TFO tiene una longitud de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos. En determinadas realizaciones, el TFO puede tener la misma longitud que el polinucleótido en el conjugado proteína-polinucleótido. Por ejemplo, el TFO puede tener la misma longitud que un polinucleótido de cadena sencilla (p. ej., oligonucleótido antisentido) en el conjugado proteína-polinucleótido. En otra realización, el TFO puede tener la misma longitud que una de las cadenas de un polinucleótido de doble cadena (p. ej., ARNip) en el conjugado proteína-polinucleótido. En estas y otras realizaciones, el TFO puede tener aproximadamente 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o 26 nucleótidos de longitud. En una realización, el TFO tiene aproximadamente 19 nucleótidos de longitud. En otra realización, el TFO tiene aproximadamente 21 nucleótidos de longitud.

En determinadas realizaciones, el TFO tiene una secuencia que es complementaria a la secuencia del polinucleótido en la molécula de conjugado. Una primera secuencia es "complementaria" de una segunda secuencia si un polinucleótido que comprende la primera secuencia puede hibridarse con un polinucleótido que comprende la segunda secuencia para formar una región dúplex o triplex bajo determinadas condiciones. "Hibridar" o "hibridación" se refiere al emparejamiento de polinucleótidos complementarios, típicamente mediante enlaces hidrógeno (p. ej., enlaces de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen inverso) entre bases complementarias en los dos polinucleótidos. Se considera que una primera secuencia es totalmente complementaria (100 % complementaria) a una segunda secuencia si un polinucleótido que comprende la primera secuencia se empareja en bases con un polinucleótido que comprende la segunda secuencia en toda la longitud de una o ambas secuencias de nucleótidos sin desajuste alguno.

En algunas realizaciones, el TFO tiene una secuencia que es totalmente complementaria a la secuencia del polinucleótido en la molécula de conjugado, p. ej., la secuencia del TFO es complementaria a la secuencia del polinucleótido en toda la longitud del TFO. En realizaciones en las que el polinucleótido en la molécula de conjugado es un polinucleótido de doble cadena, el TFO puede ser complementario (p. ej., totalmente complementario) a una de las cadenas del polinucleótido de doble cadena. Por ejemplo, en determinadas realizaciones de este tipo, el TFO es complementario (p. ej., totalmente complementario) a la cadena del polinucleótido de doble cadena que está enlazado covalentemente a la molécula de proteína. En realizaciones en las que el polinucleótido en la molécula de conjugado es un ARNip que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, el TFO tiene una secuencia que es complementaria (p. ej., totalmente complementaria) a la secuencia de la cadena sentido. En otras realizaciones en las que el polinucleótido en la molécula de conjugado es un ARNip, el TFO tiene una secuencia que es complementaria (p. ej., totalmente complementaria) a la secuencia de la cadena antisentido. La cadena de un ARNip que comprende una región que tiene una secuencia que es complementaria a una secuencia diana (p. ej., ARNm diana) se la denomina "cadena antisentido". La "cadena sentido" se refiere a la cadena que incluye una región que es complementaria a una región de la cadena antisentido. En algunas realizaciones, la cadena sentido puede comprender una región que tiene una secuencia que es idéntica a la secuencia diana.

En determinadas realizaciones, el TFO utilizado en los métodos de la invención comprende uno o más nucleótidos modificados. Un "nucleótido modificado" se refiere a un nucleótido que tiene una o más modificaciones químicas en el nucleósido, nucleobase, anillo de pentosa o grupo fosfato. Tal como se utiliza en esta memoria, los nucleótidos modificados no abarcan ribonucleótidos que contienen monofosfato de adenosina, monofosfato de guanosina, monofosfato de uridina y monofosfato de citidina, ni desoxirribonucleótidos que contienen monofosfato de desoxiadenosina, monofosfato de desoxiguanosina, monofosfato de desoxitimidina y monofosfato de desoxicitidina. Sin embargo, el TFO puede comprender combinaciones de nucleótidos, ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos modificados. Nucleótidos modificados que se ha informado que fomentan la formación de triplex incluyen 2'-aminoetoxi-5-(3-aminoprop-1 -inil)uridina (BAU), 3-metil-2 aminopiridina (MeP), 6-(3-aminopropil)-7-metil-3H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-2(7H)-ona (ap P), N-(4-(3-acetamidofenil)tiazol-2-il-acetamida), ácido nucleico bloqueado (LNA; nucleótido 2'-O, 4'-C-metileno-p-D-ribofuranosilo), ácido nucleico puenteado con etileno (ENA; nucleótido 2'-O, 4'-C-etileno-p-D-ribofuranosilo), ácido nucleico puenteado con 2'-O,4'-C-aminometileno (2',4'-BNANC), 5-metil citosina, 2-tio uridina, 5-propinil-desoxiuridina, 8-aminopurinas, 2'-desoxi-6-tioguanosinas, bases universales, 2'-aminoetilribonucleótidos, nucleótidos 2'-O-alquilo (p. ej., nucleótidos 2'-O-metilo) y nucleótidos con enlaces internucleósido modificados (p. ej., enlaces internucleósido fosforoamidato, enlaces internucleósido fosforotioato y ácidos nucleicos peptídicos (PNA)).Véase, p. ej.,Rusling et al., Nucleic Acids Res., Vol. 33:3025-3032, 2005; Duca et al., Nucleic Acids Res., Vol. 36: 5123-5138, 2008; y Zhou et al., Nucleic Acids Res., Vol. 41: 6664-6673, 2013. El TFO empleado en los métodos de la invención puede comprender uno o más de estos nucleótidos modificados o combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, el TFO comprende uno o más nucleótidos con una modificación de azúcar bicíclica. Una "modificación de azúcar bicíclica" se refiere a una modificación del anillo de pentosa en donde un puente conecta dos átomos del anillo para formar un segundo anillo que da como resultado una estructura de azúcar bicíclica. En algunas realizaciones, la modificación de azúcar bicíclica comprende un puente entre los carbonos 4' y 2' del anillo de pentosa. Nucleótidos que comprenden un resto de azúcar con una modificación de azúcar bicíclico se denominan en esta memoria ácidos nucleicos bicíclicos o BNAs. Ejemplos de modificaciones de azúcares bicíclicos incluyen, pero no se limitan a ácido nucleico bicíclico a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') (BNA); BNA p-D-metilenoxi (4'-CH2-O-2') (al que también se alude como un ácido nucleico bloqueado o LNA); BNA etilenoxi (4'-(CH2)2-O-2') (al que también se alude como un ácido nucleico puenteado con etileno o ENA); B<n>A aminooxi (4'-CH2-O-<n>(<r>)-2'); B<n>A oxiamino (4'-CH2-N(R)-O-2'); BNA metil(metilenoxi) (4'-CH(CH3)-O-2') (al que también se alude como etilo restringido o cEt); BNA metilen-tio (4'-CH2-S-2'); BNA metilen-amino (4'-CH2-N(R)-2'); BNA metilo carbocíclico (4'-CH2-CH(CH3)- 2'); BNA propileno carbocíclico (4'-(CH2)3-2'); y BNA metoxi(etilenoxi) (4'-CH(CH2OMe)-O-2') (al que también se alude como MOE restringido o cMOE). En una realización, el TFO comprende uno o más monómeros de LNA. En otra realización, el TFO comprende uno o más monómeros de ENA.

En determinadas realizaciones, el TFO utilizado en los métodos de la invención comprende una mezcla de monómeros de LNA y desoxirribonucleótidos. Generalmente, el número y la colocación de los monómeros de LNA en el TFO es tal que la temperatura de fusión (7m) de un complejo entre el TFO y una cadena de ARN complementaria es de aproximadamente 75 °C a aproximadamente 85 °C, de aproximadamente 77 °C a aproximadamente 82 °C o aproximadamente 80 °C. La 7m puede medirse experimentalmente o puede predecirse utilizando diversos modelos termodinámicos, tales como el modelo del vecino más cercano(véase, p. e j,Owczarzy et al., Biopolymers, Vol. 44(3): 217-239, 1997; SantaLucia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 95(4): 1460-1465, 1998). Las herramientas de predicción para predecir la 7m de oligonucleótidos que contienen monómeros de LNA también están disponibles públicamente, tal como el algoritmo de predicción de la 7m de ARN de Exiqon (véase la herramienta de predicción disponible en exiqon.com/ls/Pages/ExiqonTMPredictionTool).

En algunas realizaciones de este tipo, aproximadamente 30 % a aproximadamente 40 % de los nucleótidos en el TFO son monómeros de LNA. Por ejemplo, a modo de ilustración, un TFO que tiene una longitud de 21 nucleótidos puede tener de 6 a 8 monómeros de lNa . En determinadas realizaciones, el TFO que tiene una longitud de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 30 nucleótidos puede tener de 4 a 12 monómeros de LNA, de 5 a 10 monómeros de LNA o de 6 a 8 monómeros de LNA. Los monómeros distintos de LNA pueden ser nucleótidos modificados (p. ej., cualquiera de los nucleótidos modificados descritos en esta memoria), ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. En realizaciones particulares, los monómeros distintos de LNA son desoxirribonucleótidos. En algunas realizaciones, los monómeros de LNA se colocan lo más uniformemente posible en todo el TFO mientras se mantiene el intervalo de 7m diana (aproximadamente 75 °C a aproximadamente 85 °C). En realizaciones relacionadas, el TFO no tiene más de cuatro monómeros de LNA consecutivos.

Los TFOs se pueden preparar fácilmente utilizando técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, utilizando síntesis en fase sólida de ácidos nucleicos convencionales. Los TFOs se pueden ensamblar en un sintetizador de ácidos nucleicos adecuado utilizando precursores de nucleósidos o nucleótidos estándares (p. ej., fosforoamiditas). Varios proveedores venden comercialmente sintetizadores automatizados de ácido nucleico, incluyendo sintetizadores de ADN/ARN de Applied Biosystems (Foster City, CA), sintetizadores MerMade de BioAutomation (Irving, TX) y sintetizadores OligoPilot de GE Healthcare Life Sciences (Pittsburgh, PA). Los TFOs con secuencias deseadas y modificaciones químicas también se pueden adquirir comercialmente, ya que la síntesis de oligonucleótidos personalizada está disponible de varios proveedores, tales como Exiqon/Qiagen (Venlo, Países Bajos), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) y Dharmacon (Lafayette, CO).

Preferiblemente, los TFOs empleados en los métodos de la invención están enlazados covalentemente a una etiqueta. La etiqueta puede ser cualquier entidad molecular capaz de fijarse covalentemente al TFO y a la que esté disponible o pueda generarse un participante en la unión específica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la etiqueta es una proteína, un péptido, glicopéptido, hidrato de carbono o hapteno. En algunas realizaciones, la etiqueta es suficientemente inmunogénica en una especie animal de modo que se puedan generar anticuerpos específicos de la etiqueta contra la etiqueta. En determinadas realizaciones, la etiqueta es un hapteno. El hapteno puede ser, pero no se limita a biotina, digoxigenina o 2,4-dinitrofenol. En una realización, la etiqueta es biotina. En otra realización, la etiqueta es digoxigenina.

La etiqueta se puede fijar covalentemente al extremo 5' o 3' del TFO o se puede fijar a un nucleótido incorporado al TFO (p. ej., mediante modificación del azúcar o de la cadena principal del nucleótido). En una realización, la etiqueta está fijada covalentemente al extremo 3' del TFO. En otra realización, la etiqueta está fijada covalentemente al extremo 5' del TFO. La etiqueta se puede fijar al TFO utilizando métodos conocidos en la técnica, tales como acoplamiento de éster de succinimida, acoplamiento de tiol, química de clic y los métodos descritos en Zearfoss y Ryder, Methods Mol. Biol., Vol. 941:181-193, 2012. Los proveedores comerciales que ofrecen servicios personalizados de síntesis de oligonucleótidos tales como los proveedores arriba descritos, también pueden preparar TFOs fijados covalentemente a las etiquetas deseadas.

En algunas realizaciones, los métodos de la invención comprenden formar una mezcla de hibridación poniendo en contacto una muestra que comprende una molécula de conjugado de proteína-polinucleótido diana con un TFO etiquetado en condiciones que permiten que el TFO se hibride con el polinucleótido en la molécula de conjugado. Las condiciones de hibridación se pueden ajustar basándose en el tipo de polinucleótido diana (p. ej., de cadena sencilla o de doble cadena) y la secuencia y el grado de modificación química del TFO. Sin embargo, generalmente, la hibridación del TFO con el componente polinucleotídico de la molécula de conjugado que puede estar presente en la muestra se realiza a una temperatura de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 60 °C, de aproximadamente 45 °C a aproximadamente 55 °C, de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 55 °C o de aproximadamente 52 °C durante aproximadamente 30 min a aproximadamente 90 min, o aproximadamente 60 min. En determinadas realizaciones, la hibridación del TFO con el componente polinucleotídico de la molécula de conjugado no se realiza a una temperatura superior a 65 °C. Un tampón de hibridación adecuado puede incluir un tampón que mantenga el pH en un intervalo de 7 a 8, una sal y un tensioactivo. Un tampón de hibridación ejemplar comprende tampón fosfato de sodio 30 mM, pH 7,0, NaCl 500 mM, EDTA 5 mM y Tween 20 al 0,2 % (v/v). Los expertos en la técnica conocen tampones de hibridación adecuados adicionales.

Las moléculas de conjugado que comprenden TFOs etiquetados hibridados con el componente polinucleotídico se pueden aislar de la muestra utilizando un reactivo de captura que se une específicamente a la etiqueta enlazada covalentemente al TFO. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los métodos de la invención comprenden poner en contacto una muestra con un t Fo que está enlazado covalentemente a una etiqueta en condiciones que permiten que el TFO se hibride con el polinucleótido en la molécula de conjugado, formando con ello una mezcla de hibridación, y poner en contacto la mezcla de hibridación con una superficie que comprende un reactivo de captura que se une específicamente a la etiqueta enlazada covalentemente al TFO. En realizaciones de este tipo, el reactivo de captura puede ser cualquier molécula que sea capaz de unirse o reconocer específicamente la etiqueta. Una molécula "se une específicamente" a una molécula diana cuando tiene una afinidad de unión significativamente mayor y, en consecuencia, es capaz de distinguir esa molécula diana en comparación con su afinidad por otras moléculas no relacionadas, en condiciones de ensayo de unión similares. En algunas realizaciones, el reactivo de captura puede unirse a la etiqueta con una constante de disociación de equilibrio Kd) de < 1 x 10-6 M. En otras realizaciones, el reactivo de captura puede unirse a la etiqueta con una constante de disociación de equilibrio Kd de < 1 x 10-8 M.

Reactivos de captura que se unen específicamente a la etiqueta incluyen, pero no se limitan a polipéptidos, aptámeros, glicopéptidos, lectinas y anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En algunas realizaciones, el reactivo de captura que se une específicamente a la etiqueta es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo es una porción de un anticuerpo que carece de al menos algunos de los aminoácidos presentes en una cadena pesada y/o cadena ligera de longitud completa, pero que todavía es capaz de unirse específicamente a un antígeno. Un fragmento de unión a antígeno incluye, pero no se limita a un fragmento variable de cadena sencilla (scFv), un nanocuerpo (p. ej., dominio VH de anticuerpos de cadena pesada de camélido), fragmento VHH, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, un fragmento Fd y un fragmento de región determinante de la complementariedad (CDR). En determinadas realizaciones, el reactivo de captura es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la etiqueta.

En algunas realizaciones de los métodos de la invención, la etiqueta enlazada covalentemente al TFO es biotina y el reactivo de captura es avidina, estreptavidina, neutravidina o un anticuerpo anti-biotina o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En una realización, la etiqueta es biotina y el reactivo de captura es estreptavidina. En otras realizaciones de los métodos de la invención, la etiqueta enlazada covalentemente al TFO es digoxigenina y el reactivo de captura es un anticuerpo anti-digoxigenina o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

Alternativamente, moléculas de conjugado que comprenden TFOs etiquetados hibridados con el componente polinucleotídico se pueden aislar de la muestra utilizando un reactivo de captura que se une específicamente al componente proteico de las moléculas de conjugado. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los métodos de la invención comprenden poner en contacto una muestra con un TFO que está enlazado covalentemente a una etiqueta en condiciones que permiten que el TFO se hibride con el polinucleótido en la molécula de conjugado, formando con ello una mezcla de hibridación, y poner en contacto la mezcla de hibridación con una superficie que comprende un reactivo de captura que se une específicamente a la proteína en la molecula de conjugado. En realizaciones de este tipo, el reactivo de captura puede ser cualquier molécula que sea capaz de unirse específicamente a la proteína o una entidad marcadora incorporada a la proteína. En algunas realizaciones, el reactivo de captura puede unirse a la proteína o entidad marcadora con una constante de disociación de equilibrio Kd de < 1 x 10-6 M. En otras realizaciones, el reactivo de captura puede unirse a la proteína o entidad marcadora con una constante de disociación de equilibrio Kd de < 1 x 10-8 M.

Reactivos de captura que se unen específicamente a la proteína incluyen, pero no se limitan a polipéptidos, aptámeros, glicopéptidos, ligandos, receptores, polisacáridos, antígenos y anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En algunas realizaciones, el reactivo de captura que se une específicamente a la proteína en la molécula de conjugado es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En determinadas realizaciones, la proteína en la molécula de conjugado es un ligando (p. ej., un ligando de un receptor de la superficie celular) y el reactivo de captura es el receptor para el ligando o un fragmento del receptor que contiene el dominio de unión al ligando (p. ej., un fragmento del receptor que se une al ligando). En otras realizaciones, la proteína en la molécula de conjugado es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y el reactivo de captura es un antígeno diana (o fragmento del antígeno que contiene el epítopo) del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno. Aún en otras realizaciones, la proteína en la molécula de conjugado es un anticuerpo y el reactivo de captura es una proteína que se une específicamente a la región Fc del anticuerpo, tal como un anticuerpo anti-región Fc, proteína A o proteína G. En todavía otras realizaciones, la proteína en la molécula de conjugado es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y el reactivo de captura es un anticuerpo anti-idiotípico. Un anticuerpo anti-idiotípico es un anticuerpo que se une al idiotipo de otro anticuerpo. Un idiotipo de un anticuerpo es la combinación específica de idiotipos presentes dentro de las regiones variables del anticuerpo.

En algunas realizaciones de los métodos de la invención, el reactivo de captura se une específicamente a una entidad marcadora incorporada a la proteína en la molécula de conjugado. Las entidades marcadoras son secuencias peptídicas que pueden condensarse con la proteína en la molécula de conjugado, p. ej., en el extremo N o el extremo C. Ejemplos de entidades marcadoras incluyen, pero no se limitan a polihistidina (p. ej., 6-8 residuos histidina), proteína de unión a calmodulina, secuencia myc (EQKLISEEDL; SEQ ID NO: 4), secuencia de hemaglutinina (HA) (YPYDVPDYA; SEQ ID NO: 5), y secuencia FLAG (DYKDDDDK; SEQ ID NO: 6). En determinadas realizaciones, el reactivo de captura es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une a la entidad marcadora condensada a la proteína en la molécula de conjugado (p. ej., el reactivo de captura es un anticuerpo anti-myc, anti-HA o anti-FLAG). En otras realizaciones, el reactivo de captura es una proteína u otra molécula que reconoce o se une específicamente a la entidad marcadora. Por ejemplo, la calmodulina puede capturar moléculas de proteína condensadas a la proteína de unión a calmodulina. En aún otras realizaciones, la entidad marcadora es polihistidina y el reactivo de captura son iones de níquel, cobalto o zinc.

Los reactivos de captura empleados en los métodos de la invención están preferiblemente fijados a o inmovilizados sobre una superficie. La superficie puede ser una perla o partícula (p. ej., una perla o partícula magnética que comprende sílice, látex, poliestireno, policarbonato, poliacrilato o poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF)), una membrana (p. ej., membrana de PVDF, nitrocelulosa, polietileno o nailon), un tubo, una resina, una columna, un electrodo o un pocillo en una placa de ensayo (p. ej., un pocillo en una placa de microtitulación). Superficies de este tipo pueden comprender vidrio, materiales a base de celulosa, polímeros termoplásticos, tales como polietileno, polipropileno o poliéster, estructuras sinterizadas compuestas de materiales en partículas (p. ej., vidrio o diversos polímeros termoplásticos), o películas de membrana fundidas compuestas de nitrocelulosa, nailon, polisulfona o similares. Todos estos materiales de superficie se pueden utilizar en formas adecuadas, tales como películas, láminas o placas, o se pueden recubrir sobre o unir o laminar a soportes inertes apropiados, tales como papel, vidrio, películas plásticas o tejidos.

Los reactivos de captura pueden inmovilizarse sobre o unirse a una superficie mediante una diversidad de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Los reactivos de captura se pueden rayar, depositar o imprimir sobre la superficie, seguido del secado de la superficie para facilitar la inmovilización. La inmovilización de los reactivos de captura puede tener lugar mediante adsorción o enlace covalente. Dependiendo de la naturaleza de la superficie, se pueden utilizar métodos de derivatización para facilitar la formación de enlaces covalentes entre la superficie y el reactivo de captura. Métodos de derivatización pueden incluir tratar la superficie con un compuesto, tal como glutaraldehído o carbodiimida, y aplicar el reactivo de captura. El reactivo de captura también se puede fijar a la superficie indirectamente a través de un resto acoplado al reactivo de captura que permite la unión covalente o no covalente, tal como un resto que tiene una alta afinidad por un componente fijado a la superficie. Por ejemplo, el reactivo de captura puede acoplarse a biotina y el componente adherido a la superficie puede ser avidina, estreptavidina o neutravidina(véase, p. ej.,la Figura 5). Se conocen en la técnica otros métodos físicos, químicos o biológicos para inmovilizar una macromolécula u otra sustancia directa o indirectamente a una superficie y pueden utilizarse para inmovilizar o fijar el reactivo de captura a una superficie.

Una vez que las moléculas de conjugado que comprenden TFOs etiquetados hibridados con el componente polinucleotídico se unen a la superficie a través de los reactivos de captura, los métodos de la invención comprenden poner en contacto la superficie con un reactivo de detección y detectar una señal de una etiqueta detectable en el reactivo de detección. El reactivo de detección comprende un marcador detectable acoplado a un participante en la unión, en donde el participante en la unión se une específicamente a la proteína en la molécula de conjugado o a la etiqueta enlazada covalentemente al TFO. En realizaciones del método en el que las moléculas de conjugado se unen a la superficie mediante un reactivo de captura que se une específicamente a la etiqueta enlazada covalentemente al TFO, el participante en la unión en el reactivo de detección se une específicamente a la proteína en la molécula de conjugado.Véase, p. ej.,la Figura 1. En realizaciones de este tipo, el participante en la unión que se une específicamente a la proteína en la molécula de conjugado puede ser cualquier molécula que sea capaz de unirse específicamente a la proteína o una entidad marcadora incorporada en la proteína. Participantes en la unión de este tipo pueden incluir, pero no se limitan a polipéptidos, aptámeros, glicopéptidos, iones metálicos, ligandos, receptores, polisacáridos, antígenos y anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En algunas realizaciones, el participante en la unión que se une específicamente a la proteína en la molécula de conjugado es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En determinadas realizaciones, la proteína en la molécula de conjugado es un ligando (p. ej., un ligando de un receptor de la superficie celular) y el participante en la unión en el reactivo de detección es el receptor para el ligando o un fragmento del receptor que contiene el dominio de unión al ligando (p. ej., un fragmento del receptor que se une al ligando). En otras realizaciones, la proteína en la molécula de conjugado es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y el participante en la unión en el reactivo de detección es un antígeno diana (o fragmento del antígeno que contiene el epítopo) del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno. Aún en otras realizaciones, la proteína en la molécula de conjugado es un anticuerpo y el participante en la unión en el reactivo de detección es una proteína que se une específicamente a la región Fc del anticuerpo, tal como un anticuerpo anti-región Fc, proteína A o proteína G. En todavía otras realizaciones, la proteína en la molécula de conjugado es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y el participante en la unión en el reactivo de detección es un anticuerpo anti-idiotípico. En algunas realizaciones de los métodos de la invención, el participante en la unión en el reactivo de detección se une específicamente a una entidad marcadora incorporada a la proteína en la molécula de conjugado, tal como cualesquiera de las entidades marcadoras arriba descritas. En determinadas realizaciones, el participante en la unión en el reactivo de detección es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une a la entidad marcadora condensada a la proteína en la molécula de conjugado (p. ej., el participante en la unión es un anticuerpo anti-myc, anti-HA o anti-FLAG).

En realizaciones del método en el que las moléculas de conjugado se unen a la superficie mediante un reactivo de captura que se une específicamente a la proteína en la molécula de conjugado, el participante en la unión en el reactivo de detección se une específicamente a la etiqueta enlazada covalentemente al TFO.Véase, p. e j,la Figura 5. En realizaciones de este tipo, el participante en la unión puede ser cualquier molécula que sea capaz de unirse o reconocer específicamente la etiqueta. Participantes en la unión de este tipo pueden incluir, pero no se limitan a polipéptidos, aptámeros, glicopéptidos, lectinas y anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En algunas realizaciones, el participante en la unión en el reactivo de detección que se une específicamente a la etiqueta es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En determinadas realizaciones, la etiqueta enlazada covalentemente al TFO es biotina y el participante en la unión en el reactivo de detección es avidina, estreptavidina, neutravidina o un anticuerpo anti-biotina o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En una realización, la etiqueta es biotina y el participante en la unión en el reactivo de detección es estreptavidina. En otras realizaciones, la etiqueta enlazada covalentemente al TFO es digoxigenina y el participante en la unión en el reactivo de detección es un anticuerpo anti-digoxigenina o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

El marcador detectable en el reactivo de detección puede ser cualquier entidad molecular que sea capaz de producir una señal detectable bajo un conjunto particular de condiciones. Se pueden utilizar marcadores convencionales que sean capaces, solos o junto con otras composiciones o compuestos, de proporcionar una señal detectable. El marcador detectable puede ser un radiomarcador, una enzima, un fluoróforo, un cromóforo, un marcador quimioluminiscente, un luminóforo de electroquimioluminiscencia (ECL), una nanopartícula metálica o una nanocubierta metálica.

En una realización, el marcador detectable acoplado al participante en la unión es una nanopartícula metálica o una nanocubierta metálica. Nanopartículas o nanocubiertas metálicas adecuadas para uso como marcador detectable incluyen, pero no se limitan a nanopartículas de oro, nanopartículas de plata, nanopartículas de cobre, nanopartículas de platino, nanopartículas de cadmio, nanopartículas de material compuesto (p. ej., plata y oro o cobre y plata), esferas huecas de oro, nanocubiertas de sílice recubiertas de oro y cubiertas de oro recubiertas de sílice. En otra realización, el marcador detectable acoplado al participante en la unión es una enzima que puede convertir un sustrato en una señal detectable, p. ej., un producto coloreado, fluorescente o quimioluminiscente. Ejemplos no limitantes de enzimas que son adecuadas para acoplarse al participante en la unión para producir un reactivo de detección incluyen fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, beta-galactosidasa, beta-lactamasa, galactosa oxidasa, lactoperoxidasa, luciferasa, mieloperoxidasa y amilasa. En aún otra realización, el marcador detectable acoplado al participante en la unión es un fluoróforo. Moléculas fluorescentes ejemplares, adecuadas para uso como marcadores detectables, incluyen fluoresceína, rojo Texas, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente amarilla, proteína fluorescente cian, moléculas de colorante Alexa, moléculas de colorante rodamina y similares.

En algunas realizaciones de los métodos de la invención, el marcador detectable acoplado al participante en la unión es un luminóforo ECL. Luminóforos ECL que pueden acoplarse al participante en la unión para producir un reactivo de detección incluyen, pero no se limitan a complejos de rutenio (p. ej., tri-2,2'-bipiridilrutenio(II) [Ru(bpy)32+]), complejos de iridio, complejos de aluminio, complejos de cromo, complejos de cobre, complejos de europio, complejos de osmio, complejos de platino y complejos de renio, tales como los descritos en Richter, Chem. Rev., Vol. 104: 3003 3036, 2004, Liu et al., Chem. Soc. Rev., Vol. 44, 3117-3142, 2015 y Zhou et al., Dalton Trans., Vol. 46, 355-363, 2017. En determinadas realizaciones, el luminóforo ECL acoplado al participante en la unión en el reactivo de detección es un complejo de rutenio.

Métodos para acoplar el marcador detectable al participante en la unión son conocidos en la técnica y pueden incluir adsorción pasiva (p. ej., cuando las nanopartículas o nanocubiertas metálicas son el marcador detectable) y químicas de conjugación, tales como acoplamiento de éster de succinimida a aminas primarias y acoplamiento de maleimida a grupos sulfhidrilo. El experto conoce otros métodos para acoplar macromoléculas a marcadores detectables, que pueden seleccionar el método adecuado basándose en el tipo de marcador detectable deseado a utilizar y el tipo de participante en la unión (p. ej., macromolécula) a marcar.

Después del contacto de la superficie que comprende las moléculas de conjugado capturadas con el reactivo de detección, los métodos de la invención comprenden detectar o medir una señal del marcador detectable en el reactivo de detección. Una señal procedente del marcador detectable indica que la molécula conjugada de proteínapolinucleótido diana está intacta, es decir, que el componente polinucleotídico permanece enlazado covalentemente al componente proteico. La señal a detectar dependerá del tipo de marcador de detección empleado. Por ejemplo, señales de nanopartículas metálicas o marcadores de nanocapas se pueden detectar midiendo la cantidad de dispersión o absorción de la luz. Las señales de fluoróforos o luminóforos ECL se pueden detectar o medir como intensidad de la luz en longitudes de onda de emisión particulares. Cuando el marcador detectable es una enzima, la señal se produce añadiendo un sustrato de la enzima que produce una señal detectable, tal como un sustrato cromogénico, fluorogénico o quimioluminiscente. Instrumentos, tales como espectrofotómetros, lectores de placas fluorescentes/luminiscentes y otros instrumentos capaces de detectar cambios espectrales y electroquímicos, están disponibles comercialmente y son conocidos por los expertos en la técnica. En determinadas realizaciones, la detección de una señal del marcador detectable proporciona una evaluación cualitativa (es decir, la molécula conjugada intacta está presente en la muestra). En otras realizaciones, la detección de una señal del marcador detectable proporciona una medición cuantitativa de la cantidad de molécula conjugada intacta en la muestra. Por ejemplo, las mediciones de, p. ej., dispersión de la luz, absorción de la luz o emisión de fluorescencia/luminiscencia permiten determinar cuantitativamente la cantidad de molécula de conjugado intacta en la muestra. Una cuantificación de este tipo se puede lograr midiendo la señal del marcador detectable en muestras que contienen cantidades conocidas de moléculas de conjugado intactas, construyendo curvas de calibración a partir de los datos y determinando la cantidad de moléculas de conjugado intactas en una muestra de ensayo a partir de las curvas de calibración.

Cualquier tipo de molécula de conjugado de proteína-polinucleótido se puede detectar o medir en una muestra utilizando los métodos de la invención. El componente polinucleotídico de la molécula de conjugado puede ser un polinucleótido de cadena sencilla, un polinucleótido de doble cadena o un polinucleótido que comprende regiones tanto de cadena sencilla como de doble cadena (p. ej., un polinucleótido que contiene al menos una región autocomplementaria tal que el polinucleótido único se pliega sobre sí mismo para hibridar y generar regiones de doble cadena). Los polinucleótidos en el conjugado proteína-polinucleótido pueden estar compuestos de ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, nucleótidos modificados o combinaciones de los mismos. El componente polinucleotídico de la molécula de conjugado puede ser un ARN pequeño de interferencia (ARNip), un ARN de horquilla corta (ARNhc), un microARN (miARN), un miARN precursor (pre-miARN), un mimético de miARN, un oligonucleótido anti-miARN (p. ej., antagomir y antimiR), o un oligonucleótido antisentido. En determinadas realizaciones, el polinucleótido es un polinucleótido terapéutico diseñado para fijar como objetivo un gen o una molécula de ARN asociado con una enfermedad o trastorno. En estas y otras realizaciones, el polinucleótido comprende uno o más nucleótidos modificados para potenciar la estabilidad o potencia del polinucleótido. Nucleótidos modificados de este tipo pueden incluir, pero no se limitan a nucleótidos con modificaciones de azúcar 2' (2'-O-metilo, 2'-metoxietilo, 2'-fluoro, etc.), nucleótidos abásicos, nucleótidos invertidos (nucleótidos 3'-3’ enlazados), nucleótidos enlazados a fosforotioato, nucleótidos con modificaciones de azúcares bicíclicos (p. ej., LNA, ENA) y nucleótidos que comprenden análogos de bases (p. ej., bases universales, 5-metilcitosina, pseudouracilo, etc.).

La longitud del componente polinucleótido del conjugado proteína-polinucleótido variará dependiendo del tipo de polinucleótido (p. ej., ARNip, miARN, oligonucleótido antisentido, etc.), pero generalmente tendrá una longitud de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 150 nucleótidos. Por ejemplo, cada una de las cadenas de una molécula de ARNip de doble cadena, una molécula de miARN o una molécula mimética de miARN tiene típicamente una longitud de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 30 nucleótidos, mientras que como molécula de ARNhc de cadena sencilla y una molécula de pre-miARN, que se pliegan sobre sí mismos para formar estructuras de tallo-bucle o de horquilla, pueden tener una longitud de aproximadamente 35 nucleótidos a aproximadamente 120 nucleótidos. Los oligonucleótidos antisentido y los oligonucleótidos anti-miARN tienen típicamente una longitud de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 25 nucleótidos. En algunas realizaciones, el componente polinucleotídico en la molécula de conjugado que se ha de detectar o medir con los métodos de la invención es un oligonucleótido antisentido. En otras realizaciones, el componente polinucleotídico en la molécula de conjugado que se ha de detectar o medir con los métodos de la invención es una molécula de ARNip. En realizaciones de este tipo, la cadena sentido y la cadena antisentido de la molécula de ARNip pueden tener independientemente una longitud de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos, de aproximadamente 18 a aproximadamente 26 nucleótidos o de aproximadamente 19 a aproximadamente 21 nucleótidos.

El componente proteico de la molécula de conjugado puede ser cualquier proteína o fragmento de la misma a la que se pueda enlazar covalentemente un polinucleótido. En algunas realizaciones, el componente proteico imparte una propiedad o característica al polinucleótido enlazado, tal como una semivida en suero circulante más larga o la fijación como objetivo de un tejido o tipo de célula específico. En determinadas realizaciones, la proteína en la molécula de conjugado es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En estas y otras realizaciones, la proteína en la molécula de conjugado fija la molécula de conjugado como objetivo a un tipo de célula o tejido específico, p. ej., uniéndose específicamente a una proteína específica de célula o específica de tejido. En realizaciones de este tipo, el componente polinucleotídico puede ser un polinucleótido terapéutico. Por ejemplo, en una realización, la proteína es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un receptor expresado por la célula o tejido diana. A modo de ejemplo, la proteína puede ser un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a un receptor expresado por hepatocitos, tal como el receptor de asialoglicoproteína o el receptor de LDL, para fijar como objetivo la molécula de conjugado al hígado. Los anticuerpos que se unen a otros receptores de la superficie celular en otros tipos de células diana (p. ej., células B, células tumorales, cardiomiocitos, miocitos esqueléticos, células pancreáticas, neuronas, etc.) pueden ser el componente proteico de la molécula de conjugado. En otras realizaciones, la proteína en la molécula de conjugado es un ligando. El ligando puede ser un ligando para un receptor expresado en la superficie de una célula o tejido diana al que se ha de suministrar la molécula de conjugado. En realizaciones de este tipo en la molécula de conjugado puede ser el propio ligando o un fragmento peptídico o análogo del ligando que conserva la función de unión al receptor.

En determinadas realizaciones, la molécula de conjugado de proteína-polinucleótido a detectar o medir en una muestra utilizando los métodos de la invención es una molécula de conjugado de anticuerpo-ARNip. En otras realizaciones, la molécula de conjugado de proteína-polinucleótido es una molécula de conjugado de ligando peptídico-ARNip. Aún en otras realizaciones, la molécula de conjugado de proteína-polinucleótido es una molécula de conjugado de anticuerpooligonucleótido antisentido. En todavía otras realizaciones, la molécula de conjugado de proteína-polinucleótido es una molécula de conjugado de ligando peptídico-oligonucleótido antisentido. En estas realizaciones, los componentes de ARNip o oligonucleótido antisentido de las moléculas de conjugado pueden ser terapéuticos (es decir, fijados como objetivo a un gen o molécula de ARN asociado con una enfermedad o un trastorno) y el componente de anticuerpo o ligando peptídico de la molécula de conjugado puede unirse específicamente a un receptor específico de célula o específico de tejido.

Los métodos de la invención se pueden utilizar para detectar o medir moléculas de conjugado de proteínapolinucleótido en diversos tipos de muestras. En algunas realizaciones, la muestra es un fluido corporal, tal como sangre, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo u orina. En otras realizaciones, la muestra es un tejido (p. ej., un homogeneizado de tejido) o un lisado celular. En estas y otras realizaciones, la muestra se obtiene de un animal o un sujeto humano al que se le ha administrado la molécula de conjugado de proteína-polinucleótido. En algunas realizaciones, las muestras se obtienen de cultivos celulares que han sido expuestos a las moléculas de conjugado de proteína-polinucleótido. En realizaciones de este tipo, la muestra puede ser un sobrenadante del cultivo celular o un lisado de las células en el cultivo. En una realización, la muestra es una mezcla de reacción o un producto de una etapa durante el proceso de síntesis para la molécula de conjugado de proteína-polinucleótido. En otra realización, la muestra es una gran cantidad de sustancia farmacológica (p. ej., un ingrediente farmacéutico activo o API (por sus siglas en inglés)). En aún otra realización, la muestra es un lote de producto farmacológico (p. ej., API formulado con uno o más excipientes para uso humano).

Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos realizados y los resultados obtenidos, se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitativos del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos

Ejemplo 1. Ensayo de Detección Utilizando Oligonucleótido Formador de T riplex como Agente de Captura

Este ejemplo describe un formato del método de ensayo de la invención en el que se utiliza un oligonucleótido formador de triplex (TFO) etiquetado para capturar un conjugado de anticuerpo-ARNip en una solución de muestra e inmovilizar el conjugado en una superficie sólida. Posteriormente, el conjugado se detecta y cuantifica utilizando un participante en la unión marcado que reconoce específicamente el anticuerpo. Este formato de ensayo se muestra esquemáticamente en la Figura 1.

Se preparó un conjugado de anticuerpo-ARNip fijando covalentemente una molécula de ARNip que fija como objetivo un gen del hígado a un anticuerpo monoclonal (mAb) dirigido a la proteína del receptor de asialoglicoproteína 1 (ASGR1) utilizando el método descrito en el Ejemplo 10 del documento WO 2018/039647.Brevemente, un mAb anti-ASGR1 con una mutación E272C en su cadena pesada de acuerdo con el esquema de numeración de la UE (mAb anti-ASGR1 cys) se incubó con una solución de cistamina 2,5 mM y cisteamina 2,5 mM en tampón HEPES 40 mM, pH 7,5-8,5 durante 15-20 h a TA (temperatura ambiente) y posteriormente se purificó para proporcionar un mAb anti-ASGR1 cys rematado con bis-cisteamina. La molécula de ARNip estaba compuesta por una cadena sentido y una cadena antisentido, cada una de las cuales tenía 21 nucleótidos de longitud. La molécula de ARNip tenía una región dúplex de 19 pares de bases con un colgante de 2 nucleótidos en el extremo 3' de las cadenas sentido y antisentido. La cadena sentido del dúplex de ARNip tenía una modificación de homoserina-ácido aminohexanoico en su extremo 3', que se funcionalizó adicionalmente con un grupo bromoacetilo utilizando bromoacetato de succinimidilo. El intermedio de mAb anti-ASGR1 cys protegido con bis-cisteamina se redujo parcialmente utilizando tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) o sal trisódica del ácido trifenilfosfina-3,3',3"-trisulfónico (TPPTS). Posteriormente se realizó la oxidación del mAb cys parcialmente reducido con ácido deshidroascórbico (DHAA) y la oxidación se llevó a cabo a TA hasta que solo se observaron una cantidad traza de especies de mAb reducidas. Luego se añadió el dúplex bromoacetil-ARNip a la mezcla de reacción y la alquilación se llevó a cabo a TA durante 15-48 h. Los conjugados mAb anti-ASGR1-ARNip con una relación ARN a anticuerpo (RAR) de 1 y 2 se separaron utilizando cromatografía de intercambio aniónico.

El TFO fue diseñado para tener una secuencia que fuera totalmente complementaria a la cadena sentido, que era la cadena directamente enlazada al anticuerpo. Se incorporaron monómeros de ácido nucleico (LNA) bloqueado en el TFO de manera que aproximadamente el 30-40 % de los nucleótidos del TFO eran monómeros de LNA y la temperatura de fusión (7m) de un complejo entre el TFO y una cadena de ARN complementaria era de aproximadamente 80 °C basada en el algoritmo de predicción de ARN Tm de Exiqon (véase la herramienta de predicción disponible en el sitio web de Exiqon en exiqon.com/ls/Pages/ExiqonTMPredictionTool). Los monómeros de LNA se colocaron lo más uniformemente posible por todo el TFO manteniendo la Tm diana. El TFO fue sintetizado a medida por Exiqon (Vedbaek, Dinamarca) y marcado con biotina en el extremo 3'. La secuencia del TFO fue: 5' -AAACTTCATCTTT<c>TTCC CAC - 3' (SE<q>ID NO: 1), en donde los monómeros de LNA se indican mediante subrayado y negrita.

Se preparó una curva estándar de once puntos del conjugado de anticuerpo anti-ASGR1-ARNip (0,04 ng/mL a 2500 ng/mL) diluyendo en serie 1 en 3 una solución madre de 2500 ng/mL de conjugado de anticuerpo anti-ASGR1-ARNip en el tampón de muestra (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0), suero de ratón u homogeneizado de hígado de ratón. Por separado, se prepararon diversas concentraciones de TFO biotinilado (6,25 nM a 250 nM) en tampón de hibridación (fosfato sódico dibásico 60 mM, NaCl 1 M, EDTA 5 mM, Tween 20 al 0,2 % (v/v), pH 7,0). El TFO biotinilado en tampón de hibridación se mezcló con cada una de las muestras 1:1 y la hibridación se llevó a cabo a 52 °C durante 1 hora.

Después de la hibridación, las muestras se transfirieron a una placa de microtitulación recubierta con estreptavidina y se agitaron durante 30 min. Luego se lavó la placa con tampón de lavado (solución salina tamponada con imidazol y Tween 20; suministrada como solución concentrada de lavado 20X de KPL Inc.). Se añadió tampón de bloqueo (leche en polvo desnatada al 5 % en solución salina tamponada con Tris (Blocker™ BLOTTO, ThermoFisher Scientific)) a las muestras y la placa se agitó durante 30 min. La placa se lavó nuevamente con tampón de lavado. Posteriormente, se añadió a cada una de las muestras en tampón de bloqueo un anticuerpo monoclonal de ratón marcado con rutenio dirigido a la región Fc de la inmunoglobulina humana (anticuerpo anti-Fc humano; 1 pg/mL) y la placa se agitó durante 1 hora. Después de lavar la placa con tampón de lavado, la señal del marcador de rutenio se leyó utilizando un lector electroquimioluminiscente QuickPlex SQ 120 de Meso Scale Diagnostics (MSD) y MSD Read Buffer T con tensioactivo.

Los resultados del ensayo para la detección de conjugados de mAb anti-ASGR1-ARNip en tampón de muestra a diferentes intervalos de concentraciones de TFO biotinilado se muestran en las Figuras 2A y 2B. Los datos se ajustaron con un modelo de regresión no lineal de cuatro parámetros (Marquardt con factor de ponderación 1/YA2), que arrojó valores deRcercanos a 1. El intervalo lineal del ensayo en tampón fue de 3,4 ng/mL a 2500 ng/mL. La detección de los conjugados mAb anti-ASGR1 -ARNip también podría lograrse en suero de ratón y homogeneizado de hígado de ratón.Véasela Figura 2C. Utilizando una concentración de TFO biotinilado de 100 nM, el intervalo lineal del ensayo en suero y homogeneizado de hígado fue el mismo que para el tampón. Sin embargo, la respuesta de la señal se redujo en el suero y el homogeneizado de hígado en comparación con el tampón, siendo la respuesta en el suero aproximadamente el 46 % de la del tampón y la respuesta en el homogeneizado de hígado fue aproximadamente el 25 % de la del tampón, medida por la diferencia de pendientes de las curvas.

Para explorar el efecto del componente anticuerpo del conjugado sobre la eficacia del ensayo de detección, se conjugó la misma molécula de ARNip arriba descrita (ARNip T2) con un anticuerpo monoclonal diferente (mAb 655). El mAb 655 se mutó para eliminar su especificidad de unión a la diana. Se prepararon diversas concentraciones (0,04 ng/mL a 2500 ng/mL) de las siguientes moléculas de conjugado en tampón de muestra: (1) molécula conjugada de mAb 655-ARNip con una molécula de ARNip enlazada (T2-655 RAR1), (2) molécula de conjugado de mAb 655-ARNip con dos moléculas de ARNip enlazadas (T2-655 RAR2), (3) molécula de conjugado de mAb anti-ASGR1-ARNip con una molécula de ARNip enlazada (T2-25B3 RAR1) y (4) molécula de conjugado de mAb anti-ASGR1-ARNip con dos moléculas de ARNip enlazadas (T2-25B3 RAR2). Las muestras se hibridaron con TFO biotinilado 100 nM (SEQ ID NO: 1) en tampón de hibridación a 52 °C durante 1 hora. Después de la hibridación, las muestras se transfirieron a placas recubiertas con estreptavidina y se lavaron y bloquearon como se describe arriba. La detección de las moléculas de conjugado capturadas se logró utilizando el mAb anti-Fc humano marcado con rutenio y la señal electro quimioluminiscente se leyó mediante un lector electro-quimioluminiscente MSD QuickPlex SQ 120.

Los resultados del ensayo demuestran que el rendimiento y la sensibilidad del ensayo son similares para las diferentes moléculas de conjugado a pesar de la diferencia en el componente de anticuerpo de los conjugados.Véasela Figura 3A. El límite inferior de cuantificación (LLOQ) de < 420 pg/mL en este ensayo fue el mismo para las cuatro moléculas de conjugado. Para determinar si el ensayo podía distinguir entre conjugados que tenían una o dos moléculas de ARNip enlazadas, los datos se ajustaron a un modelo de regresión lineal y se compararon las diferencias en las pendientes entre los conjugados RAR1 y RAR2. Como se muestra en la Figura 3B, las pendientes de las líneas de regresión lineal ajustadas para los conjugados RAR1 fueron aproximadamente el 75 % de las de los conjugados RAR2 (pendiente T2-25B3 RAR1 72 % de pendiente T2-25B3 R<a>R2; pendiente T2-655 RAR1 78 % de pendiente T2-655 RAR2). Por lo tanto, el ensayo puede detectar diferencias entre conjugados que tienen una o dos moléculas de ARNip enlazadas en estas condiciones.

A continuación, se evaluaron dos conjugados anticuerpo-ARNip diferentes, cada uno con una molécula de ARNip única, para determinar el efecto del componente de ARNip del conjugado sobre la eficacia del ensayo de detección. Las moléculas de ARNip HPRT y C911 tenían el mismo formato que la molécula de ARNip T2 arriba descrita (es decir, cadenas 21 meras, región dúplex de 19 pb, 2 colgantes de nucleótidos en los extremos 3'), pero tenían secuencias diferentes. Las moléculas de ARNip HPRT y C911 se conjugaron con un mAb anti-ASGR1 utilizando el método arriba descrito. La secuencia del TFO empleado en el ensayo para el conjugado ARNip-anticuerpo HPRT fue 5' - ATAAAA TCT ACAGTCATA GGA - 3' (S<e>Q ID NO: 2), mientras que la secuencia del TFO empleado en el ensayo para el conjugado ARNip-anticuerpo C911 fue 5' - AAACTTCAT CAAACT TCCCAC - 3' (SEQ ID NO: 3). Los monómeros de LNA se indican mediante subrayado y negrita. Ambos TFOs fueron biotinilados en sus extremos 3'.

Se prepararon diversas concentraciones (0,04 ng/mL a 2500 ng/mL) de las siguientes moléculas de conjugado en tampón de muestra: (1) molécula de conjugado de mAb- ASGR1 -ARNip con una molécula de ARNip HPRT enlazada (HPRT-25B3 RAR1), (2) molécula de conjugado de mAb anti-ASGR1-ARNip con dos moléculas de HPRT ARNip enlazadas (HPRT-25B3 RAR2), (3) molécula de conjugado de mAb anti-ASGR1-ARNip con una molécula de C911 ARNip enlazada (C911-25B3 Ra r 1 ) y (4) molécula de conjugado de mAb anti-ASGR1 -ARNip con dos moléculas de C911 ARNip enlazadas (C911-25B3 RA<r>2). Las muestras se hibridaron con TFO biotinilado 100 nM (SEQ ID NO: 2 para el conjugado ARNip-mAb HPRT o SEQ ID NO: 3 para el conjugado ARNip-mAb C911) en tampón de hibridación a 52 °C durante 1 hora. Después de la hibridación, las muestras se transfirieron a placas recubiertas con estreptavidina y se lavaron y bloquearon como se describe arriba. La detección de las moléculas de conjugado capturadas se logró utilizando el mAb anti-Fc humano marcado con rutenio y la señal electro-quimioluminiscente se leyó mediante un lector electro-quimioluminiscente MSD QuickPlex SQ 120.

Los resultados del ensayo se muestran en la Figura 4A. La sensibilidad del ensayo pareció verse afectada por el par TFO-ARNip específico, ya que el LLOQ para la molécula de conjugado ARNip-mAb C911 fue aproximadamente 100 veces menor que el LLOQ para el conjugado ARNip-mAb HPRT (11 pg/mL para el conjugado C911-25B3 RAR2 frente a 926 pg/mL para el conjugado HPRT-25B3 RAR2). Sin embargo, la optimización de las condiciones de hibridación para cada par TFO-ARNip probablemente mejoraría la sensibilidad del ensayo. La regresión lineal de los datos y la comparación de las pendientes de las líneas de regresión ajustadas demostraron nuevamente que el ensayo puede distinguir entre conjugados que comprenden una o dos moléculas de ARNip enlazadas (Figura 4B). Para los conjugados ARNip-mAb HPRT, el conjugado RAR1 tenía una pendiente que era el 75 % de la pendiente del conjugado RAR2. Para los conjugados ARNip-mAb C911, el conjugado RAR1 tenía una pendiente que era el 62 % de la pendiente del conjugado RAR 2.

Los resultados de la serie de experimentos descritos en el ejemplo demuestran que una realización de los métodos de ensayo de la invención en la que se utiliza un TFO etiquetado como agente de captura puede detectar y cuantificar selectivamente conjugados anticuerpo-ARNip intactos en diversas matrices, incluyendo matrices complejas, tales como suero y homogeneizado de tejido. El ensayo también se puede utilizar para distinguir entre conjugados anticuerpo-ARNip que tienen una o dos moléculas de ARNip enlazadas.

Ejemplo 2. Ensayo de Detección Utilizando Oligonucleótido Formador de Triplex como Agente de Detección

Este ejemplo describe un segundo formato del método de ensayo de la invención en el que un TFO etiquetado permite la detección de un conjugado anticuerpo-ARNip en una solución de muestra. En este formato, el TFO etiquetado se hibrida con el componente ARNip del conjugado anticuerpo-ARNip y posteriormente el conjugado se captura e inmoviliza en una superficie sólida mediante un reactivo de captura que reconoce específicamente el componente anticuerpo del conjugado anticuerpo-ARNip (p. ej., el antígeno diana del anticuerpo o un anticuerpo anti-Fc). El conjugado capturado se detecta y cuantifica utilizando un participante en la unión marcado que reconoce específicamente la etiqueta enlazada covalentemente al TFO. Este formato de ensayo se muestra esquemáticamente en la Figura 5.

Las moléculas de conjugado mAb 655 ARNip-T2 y de conjugado mAb anti-ASGR1 -ARNip T2 descritas en el Ejemplo 1 se evaluaron en este formato de ensayo. La secuencia del TFO fue: 5' - AAACTTCATCTTTCTTCC CAC - 3' (SEQ ID NO: 1; los monómeros de LNA se indican mediante subrayado y negrita), y se marcó en el extremo 3' con digoxigenina. Se preparó una curva patrón de once puntos de cada uno de los conjugados de anticuerpo-ARNip (0,38 ng/mL a 25000 ng/mL) diluyendo en serie 1 en 3 una solución madre de 25000 ng/mL de conjugados de anticuerpo-ARNip en el tampón de muestra (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0). La digoxigenina-TFO se preparó en tampón de hibridación (fosfato de sodio dibásico 60 mM, NaCl 1 M, EDt A 5 mM, Tween 20 al 0,2 % (v/v), pH 7,0) y se mezcló con cada una de las muestras 1:1. La hibridación prosiguió a 52 °C durante 1 hora. Por separado, un anticuerpo Fc anti-humano de ratón marcado con biotina en tampón de bloqueo (leche en polvo desnatada al 5 % en solución salina tamponada con Tris (Blocker™ BLOTTO, ThermoFisher Scientific)) se depositó en los pocillos de una placa de microtitulación recubierta con estreptavidina y se agitó durante 30 min. Luego se lavó la placa con tampón de lavado (solución salina tamponada con imidazol y Tween 20; suministrado como concentrado de solución de lavado 20X de KPL Inc.) antes de su uso.

Después de la hibridación, las muestras se transfirieron a la placa de microtitulación previamente preparada que contenía el anticuerpo anti-Fc humano unido y se agitaron durante 1 hora. Después de lavar la placa con tampón de lavado, se añadió un anticuerpo anti-digoxigenina de oveja marcado con rutenio (2 pg/mL) a cada una de las muestras en tampón de bloqueo y la placa se agitó durante 30 minutos. La placa se lavó nuevamente con tampón de lavado y la señal del marcador de rutenio se leyó utilizando un lector electro-quimioluminiscente MSD QuickPlex SQ 120 y MSD Read Buffer T con tensioactivo.

Los resultados del ensayo se muestran en la Figura 6. El LLOQ para las cuatro moléculas de conjugado fue < 420 pg/mL, que es similar al LLOQ para estas moléculas en el formato de ensayo descrito en el Ejemplo 1. El componente de anticuerpo del conjugado tampoco parece influir en la sensibilidad del ensayo en este formato, ya que el LLOQ para ambos tipos de conjugados fue el mismo. Para comparar el comportamiento de este formato de ensayo (TFO etiquetado empleado para la detección) con el formato descrito en el Ejemplo 1 (TFO etiquetado empleado para la captura), se utilizó un intervalo de concentraciones de la molécula de conjugado de mAb anti-ASGR1 -ARNip T2 en un RAR1 o RAR2 se testaron en ambos formatos de ensayo. Como se muestra en la Figura 7, el intervalo dinámico del ensayo para el primer formato (TFO etiquetado empleado para la captura) es mayor que para el del segundo formato (TFO etiquetado empleado para la detección). El LLOQ para ambos formatos de ensayo fue similar.

En otra serie de experimentos, se exploró la capacidad de utilizar el antígeno del componente anticuerpo de los conjugados como reactivo de captura. En primer lugar, se testó la capacidad de unión al antígeno del conjugado anticuerpo-ARNip para verificar que la conjugación de la molécula de ARNip no afectara la interacción anticuerpoantígeno. La afinidad de unión y la cinética de la molécula de conjugado mAb anti-ASGR1-ARNip T2 RAR2 para ASGR1 humano se determinaron mediante interferometría de biocapa utilizando un biosensor de estreptavidina cargado con un fragmento biotinilado de la proteína ASGR1 humana que contiene el dominio extracelular en un instrumento Octet® HTX (Pall ForteBio). La molécula de conjugado exhibió una afinidad de unión y una cinética similares a la ASGR1 humana en comparación con el anticuerpo anti-ASGR1 no conjugado (datos no mostrados), lo que indica que la conjugación de ARNip no afectó la unión del anticuerpo a su diana. La presencia del TFO tampoco afectó a la unión del antígeno porque el sensor de estreptavidina cargado con un conjugado mAb anti-ASGR1 -ARNip que contenía un TFO biotinilado hibridado fue capaz de unirse al dominio de unión a hidratos de carbono de la ASGR1 humana (datos no mostrados).

A continuación, se repitió el ensayo de detección arriba descrito, excepto que se utilizó ASGR1 humana biotinilada como reactivo de captura en lugar del anticuerpo anti-Fc humano biotinilado. Específicamente, se prepararon diversas concentraciones del conjugado mAb anti-ASGR1-ARNip T2 en tampón de muestra. Debido a que la interacción del anticuerpo anti-ASGR1 con el antígeno ASGR1 depende del calcio, se añadió CaCl2 1 mM a todas las soluciones tampón para el ensayo. Las muestras se hibridaron con digoxigenina-TFO (SEQ ID NO: 1) en tampón de hibridación a 52 °C durante 1 hora. Por separado, una proteína ASGR1 humana marcada con biotina en tampón de bloqueo se depositó en los pocillos de una placa de microtitulación recubierta con estreptavidina y se agitó durante 30 min.

Después de la hibridación, las muestras se transfirieron a la placa de microtitulación previamente preparada que contenía la proteína ASGR1 humana unida y se agitaron durante 1 hora. Después de lavar la placa con tampón de lavado, se añadió un anticuerpo anti-digoxigenina de oveja marcado con rutenio a cada una de las muestras en tampón de bloqueo y la placa se agitó durante 30 minutos. La placa se lavó nuevamente con tampón de lavado y la señal del marcador de rutenio se leyó utilizando un lector electro-quimioluminiscente MSD QuickPlex SQ 120 y MSD Read Buffer T con tensioactivo. Los resultados del ensayo se muestran en la Figura 8. El LLOQ para el ensayo fue 103 ng/mL. Los resultados demuestran que el antígeno ASGR1 puede actuar eficazmente como un reactivo de captura para el conjugado, que posteriormente puede detectarse utilizando digoxigenina-TFO en combinación con el anticuerpo antidigoxigenina marcado con rutenio.

Los resultados de los experimentos descritos en el ejemplo demuestran que se puede utilizar un TFO etiquetado para permitir la detección y cuantificación de conjugados de anticuerpo-ARNip intactos en soluciones de muestra en combinación con un reactivo de captura que reconoce específicamente el componente de anticuerpo del conjugado (p. ej., antígeno diana o anticuerpo anti-Fc).

Ejemplo 3. Aplicación del Ensayo en Análisis Farmacocinético en Ratones

Para demostrar una de las aplicaciones potenciales de los métodos de ensayo de la invención, se utilizó el ensayo descrito en el Ejemplo 1 y representado en la Figura 1 (TFO etiquetado utilizado para la captura) para analizar muestras de suero e hígado de animales tratados con un conjugado de mAb-ARNip anti-ASGR1.

A ratones C57B1/6 de tipo salvaje de nueve semanas de edad se les inyectó por vía subcutánea o intravenosa la molécula de conjugado de mAb anti-ASGR1 -ARNip T2 descrita en el Ejemplo 1 (30 mg/kg o 60 mg/kg) o un control de ARNip T2 conjugado con GalNAc. El control de ARNip T2 conjugado con GalNAc se conjugó con un resto GalNAc triantenario en el extremo 3' de la cadena sentido, pero por lo demás tenía el mismo formato y secuencias de cadena sentido y antisentido que la molécula de ARNip T2 conjugada con el anticuerpo. El ARNip T2 fija como objetivo un gen del hígado. Se recogieron suero e hígados de los animales los días 2, 4, 8 y 15 después de la administración del compuesto. El ARN total aislado de los hígados de los animales se procesó para análisis qPCR para evaluar los niveles de ARNm. La expresión proteica de la diana del ARNip T2 en el hígado se midió mediante ELISA.

El conjugado de mAb anti-ASGR1-ARNip T2 suministró eficazmente ARNip a su diana hepáticain vivo,como se demuestra por la reducción efectiva de la expresión de la proteína diana en el hígado (Figura 9A). Se logró una reducción > 80 % en la proteína diana en el grupo de 30 mpk i.v. El punto más bajo de la reducción de proteínas fue el día 8 para el conjugado mAb anti-ASGR1-ARNip T2, dosificado i.v. o s.c., y el día 4 para el conjugado GalNAc-ARNip T2.

Se utilizó el método de ensayo descrito en el Ejemplo 1 para medir la cantidad de moléculas intactas de conjugado de mAb anti-ASGR1-ARNip T2 en las muestras de suero e hígado recogidas de los animales tratados con el conjugado. Las muestras se hibridaron con TFO biotinilado 100 nM (SEQ ID NO: 1) en tampón de hibridación a 52 °C durante 1 hora. Después de la hibridación, las muestras se transfirieron a placas recubiertas con estreptavidina y se lavaron y bloquearon como se describe en el Ejemplo 1. La detección de las moléculas de conjugado capturadas se logró utilizando el mAb anti-Fc humano marcado con rutenio y la señal electro-quimioluminiscente se leyó mediante un lector electro-quimioluminiscente MSD QuickPlex SQ 120. Como una medida del fármaco total en las muestras de suero e hígado, se empleó un ensayo ELISA tipo sándwich anti-Fc/anti-Fc. En el ensayo ELISA de fármaco total, se utilizó un primer anticuerpo anti-Fc humano biotinilado para capturar cualquier mAb anti-ASGR1 en la muestra y un segundo anticuerpo anti-Fc humano marcado con rutenio se unió a un epítopo diferente al del primer anticuerpo anti-Fc humano para detectar el mAb anti-ASGR1 capturado. El ensayo de fármaco total detectará mAbs anti-ASGR1 no conjugados (es decir, mAbs que han perdido las moléculas de ARNip), así como mAbs anti-ASGRI con una o dos moléculas de ARNip enlazadas.

Los resultados del análisis de las muestras de suero se muestran en la Figura 9B y los resultados del análisis de las muestras de hígado se muestran en las Figuras 9C y 9D. El análisis de las muestras de suero muestra un rápido aclaramiento sérico de las moléculas de conjugado de mAb anti-ASGR1 -ARNip T2 a lo largo de las primeras 72 horas, lo que probablemente representa una vía de aclaramiento de ASGR1 mediada por la diana. Una comparación de los perfiles de aclaramiento del fármaco total y los conjugados intactos demuestra que las moléculas de conjugado mAb anti-ASGR1-ARNip T2 permanecen intactas (al menos una molécula de ARNip enlazada al mAb) a lo largo de las primeras 72 horas en suero. La cantidad total de mAb anti-ASGR1 presente en las muestras de hígado según lo evaluado mediante el ensayo ELISA de fármaco total demuestra que la conjugación de la molécula de ARNip con el anticuerpo no parece afectar a la internalización del anticuerpo, ya que las cantidades del anticuerpo fueron similares en ratones que recibieron los conjugados mAb anti-ASGR1-ARNip y el mAb anti-ASGR1 no conjugado (Figura 9C). El método de ensayo de la invención fue capaz de detectar conjugados intactos de mAb anti-ASGR1 -ARNip en tejido hepático de ratones a los que se les administraron sistémicamente los conjugados (Figura 9D). Las concentraciones hepáticas de las moléculas de conjugado intactas fueron inferiores a las medidas para el fármaco total (es decir, evaluadas mediante concentraciones de mAb anti-ASGR1), lo que indica una eliminación específica de la molécula de ARNip en el tejido hepático.

Los resultados experimentales en este ejemplo demuestran que los métodos de ensayo de la invención se pueden emplear en estudios farmacocinéticos y de metabolismo de fármacos para evaluar el perfil de aclaramiento y la degradación metabólica de moléculas de conjugado anticuerpo-ARNipin vivo.

Ejemplo 4. Detección de Formación Triplex

Para confirmar que el TFO etiquetado fue capaz de formar un triplex con la molécula de ARNip de doble cadena conjugada con el anticuerpo monoclonal en las condiciones de hibridación de los métodos de ensayo, se realizó un análisis de espectrometría de masas nativa (MS nativa) después de la hibridación del TFO etiquetado con la molécula de conjugado anticuerpo-ARNip. Específicamente, se preparó una solución madre 168 pM de TFO a partir de polvo liofilizado en tampón de reacción, que era una mezcla 1:1 de tampón de muestra (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0) y tampón de hibridación (fosfato de sodio dibásico 60 mM, NaCl 1 M, EDTA 5 mM, Tween 20 al 0,2 % (v/v), pH 7.0) . La secuencia del TFO fue: 5' - AAACTTCATCTTTCTTCC CAC - 3' (SEQ ID NO: 1; los monómeros de L<n>A se indican mediante subrayado y negrita), y se marcó en el extremo 3' con biotina. El peso molecular aproximado del TFO biotinilado fue 6856,6 Dalton. El TFO biotinilado se mezcló 1: 1 v/v con una solución madre de 2,4 mg/mL de la molécula de conjugado de mAb anti-ASGR1 -ARNip T2 descrita en el Ejemplo 1. Una molécula de conjugado con una relación ARN-anticuerpo (RAR) de 1 se utilizó para este experimento. Las concentraciones finales del TFO biotinilado y de la molécula de conjugado mAb anti-ASGR1.ARNip T2 RAR1 fueron 84 pM y ~7,5 pM, respectivamente. La mezcla se incubó a 52 °C durante 1 h y se enfrió a 12 °C hasta su posterior análisis.

Antes del análisis de MS nativa, la muestra se intercambió con tampón por acetato de amonio 200 mM utilizando una columna de centrifugación P6 (BioRad, 732-6221) y se introdujo en el espectrómetro de masas utilizando agujas de vidrio recubiertas de oro nESI (pared larga y delgada, M956232AD1 -S; Waters Corporation). Los experimentos de MS nativa se realizaron utilizando el instrumento Synapt G1 Q-ToF (Waters Corporation) en modo de ionización positiva. Se realizó una activación por colisión leve en la fuente (Cono de muestra, 50 V) y la celda de colisión (presurizada con cC4F8) se ajustó a una tensión de 20 a 30 V. El espectrómetro de masas se calibró externamente con yoduro de cesio a lo largo del intervalom/zde 100 a 20.000.

Los resultados del análisis MS nativa se muestran en la Figura 10. Se observó una especie con un peso molecular consistente con un triplex mAb-ARNip (es decir, un TFO biotinilado hibridado con el componente de ARNip de la molécula de conjugado) después de la incubación con el TFO biotinilado.Véasela Figura 10A. El pico triplex mAb-ARNip no se observa cuando la molécula de conjugado mAb anti-ASGR1-ARNip T2 RAR1 no está expuesta al TFO biotinilado.Véasela Figura 10B. Los resultados de este experimento demuestran que el TFO biotinilado es capaz de formar un triplex con el componente de ARNip de una molécula de conjugado anticuerpo-ARNip en las condiciones de hibridación de los métodos de ensayo descritos en esta memoria.

Se entiende que la invención descrita no se limita a la metodología, protocolos y materiales particulares descritos, ya que estos pueden variar. También se entiende que la terminología utilizada en esta memoria tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente y no pretende limitar el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar moléculas de conjugado de proteína-polinucleótido en una muestra, que comprende: (a) poner en contacto la muestra con un oligonucleótido formador de triplex (TFO) que está enlazado covalentemente a una etiqueta en condiciones que permiten que el TFO se hibride con el polinucleótido en la molécula de conjugado, formando con ello una mezcla de hibridación;

(b) poner en contacto la mezcla de hibridación con una superficie que comprende un reactivo de captura que se une específicamente a la etiqueta enlazada covalentemente al TFO;

(c) poner en contacto la superficie con un reactivo de detección, en el que el reactivo de detección comprende un marcador detectable acoplado a una participante en la unión que se une específicamente a la proteína en la molécula de conjugado; y

(d) detectar una señal del marcador detectable.

2. El método de la reivindicación 1, en el que

(a) la etiqueta es un hapteno; preferiblemente en el que el hapteno es biotina, digoxigenina o 2,4-dinitrofenol; o (b) el reactivo de captura es un anticuerpo que se une específicamente a la etiqueta; o

(c) la etiqueta es biotina y el reactivo de captura es estreptavidina; o

(d) la etiqueta es digoxigenina y el reactivo de captura es un anticuerpo que se une específicamente a digoxigenina.

3. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en el que

(a) el participante en la unión es un anticuerpo que se une específicamente a la proteína en la molécula de conjugado; y/o

(b) el marcador detectable es un fluoróforo, una nanopartícula metálica, una enzima o un luminóforo de electroquimioluminiscencia (ECL); preferiblemente en donde el luminóforo ECL es un complejo de rutenio.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el TFO

(a) comprende una mezcla de monómeros de ácido nucleico bloqueado (LNA) y desoxirribonucleótidos; preferiblemente en el que aproximadamente del 30 % a aproximadamente el 40 % de los nucleótidos en el TFO son monómeros de LNA; y/o

(b) tiene al menos 15 nucleótidos de longitud; y/o

(c) tiene una secuencia que es complementaria a la secuencia del polinucleótido en la molécula de conjugado en toda su longitud.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el polinucleótido en la molécula de conjugado es un ARNip, un ARNhc, un miARN, un pre-miARN o un oligonucleótido antisentido; preferiblemente, en donde el polinucleótido en la molécula de conjugado es un ARNip que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, y en donde el TFO tiene una secuencia que es complementaria a la secuencia de la cadena sentido.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que

(a) la proteína en la molécula de conjugado es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo; preferiblemente, en donde la proteína en la molécula de conjugado es un anticuerpo y el participante en la unión es un antígeno diana del anticuerpo, un anticuerpo anti-región Fc o un anticuerpo anti-idiotípico; y/o

(b) la molécula de conjugado de proteína-polinucleótido es una molécula de conjugado de anticuerpo-ARNip.

(b) la molécula de conjugado proteína-polinucleótido es una molécula de conjugado de anticuerpo-ARNip.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la proteína en la molécula de conjugado es un ligando de un receptor de la superficie celular; preferiblemente en el que el participante en la unión es el receptor o un fragmento de unión al ligando del mismo.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que

(a) la muestra se pone en contacto con el TFO

(i) a una temperatura de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 60 °C para formar la mezcla de hibridación; o (ii) a una temperatura de aproximadamente 45 °C a aproximadamente 55 °C para formar la mezcla de hibridación; o (iii) a una temperatura de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 55 °C para formar la mezcla de hibridación; y/o (b) la muestra es suero, plasma, homogeneizado de tejido, sustancia farmacológica o producto farmacológico.

9. Un método para detectar moléculas de conjugado de proteína-polinucleótido en una muestra, que comprende: (a) poner en contacto la muestra con un TFO que está enlazado covalentemente a una etiqueta en condiciones que permiten que el TFO se hibride con el polinucleótido en la molécula de conjugado, formando con ello una mezcla de hibridación;

(b) poner en contacto la mezcla de hibridación con una superficie que comprende un reactivo de captura que se une específicamente a la proteína en la molécula de conjugado;

(c) poner en contacto la superficie con un reactivo de detección, en el que el reactivo de detección comprende un marcador detectable acoplado a un participante en la unión que se une específicamente a la etiqueta enlazada covalentemente al TFO; y

(d) detectar una señal del marcador detectable.

10. El método de la reivindicación 9, en el que

(a) la etiqueta es un hapteno; preferiblemente en el que el hapteno es biotina, digoxigenina o 2,4-dinitrofenol; o (b) el participante en la unión es un anticuerpo que se une específicamente a la etiqueta; o

(c) la etiqueta es biotina y el participante en la unión es estreptavidina; o

(d) la etiqueta es digoxigenina y el participante en la unión es un anticuerpo que se une específicamente a digoxigenina.

11. El método de las reivindicaciones 9 o 10, en el que

(a) el marcador detectable es un fluoróforo, una nanopartícula metálica, una enzima o un luminóforo de ECL; preferiblemente en donde el ECL es un complejo de rutenio; y/o

(b) el reactivo de captura es un anticuerpo que se une específicamente a la proteína en la molécula de conjugado.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el TFO

(b) tiene al menos 15 nucleótidos de longitud; y/o

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que

(a) la muestra se pone en contacto con el TFO

(i) a una temperatura de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 60 °C para formar la mezcla de hibridación; o (ii) a una temperatura de aproximadamente 45 °C a aproximadamente 55 °C para formar la mezcla de hibridación; o (iii) a una temperatura de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 55 °C para formar la mezcla de hibridación; y/o

(b) el polinucleótido en la molécula de conjugado es un ARNip, un ARNhc, un miARN, un pre-miARN o un oligonucleótido antisentido; preferiblemente, en donde el polinucleótido en la molécula de conjugado es un ARNip que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, y en donde el TFO tiene una secuencia que es complementaria a la secuencia de la cadena sentido.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el que

(a) la proteína en la molécula de conjugado es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo; preferiblemente, en donde la proteína en la molécula de conjugado es un anticuerpo y reactivo de captura es un antígeno diana del anticuerpo, un anticuerpo anti-región Fc, un anticuerpo anti-idiotípico, proteína A o proteína G; y/o (b) la molécula de conjugado proteína-polinucleótido es una molécula de conjugado de anticuerpo-ARNip.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el que la proteína en la molécula de conjugado es un ligando de un receptor de la superficie celular; preferiblemente en el que el reactivo de captura es el receptor o un fragmento de unión al ligando del mismo.

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, en el que la muestra es suero, plasma, homogeneizado de tejido, sustancia farmacológica o producto farmacológico.