ES2959480T3 - Acoplador de células T - antígeno trifuncional y métodos y usos del mismo - Google Patents
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Abstract
Se proporciona una molécula trifuncional que comprende un ligando específico de la diana, un ligando que se une a una proteína asociada con el complejo TCR y un polipéptido del dominio de señalización del receptor de células T. La ingeniería de células T con este nuevo receptor genera una activación específica del antígeno de numerosas funciones de las células T, incluida la producción de citocinas, la degranulación y la citólisis. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Acoplador de células T - antígeno trifuncional y métodos y usos del mismo
Solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica prioridad a la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos No. 61/936,906 presentada el 7 de febrero de 2014.
Campo
La presente divulgación se refiere a un ácido nucleico, un polipéptido codificado por el ácido nucleico y un vector de expresión que comprende el ácido nucleico, células T diseñadas que expresan el ácido nucleico y composiciones farmacéuticas. En particular, la divulgación se refiere a la ingeniería de células T para expresar agentes biológicos novedosos que imitan el proceso natural de activación de las células T
Antecedentes
El cáncer es un desafío muy importante para la salud, se espera que se diagnostiquen más de 150,000 casos de cáncer en Canadá solamente en 2013. Si bien los pacientes con enfermedad en etapa temprana pueden ser tratados efectivamente con terapias convencionales (cirugía, radiación, quimioterapia), hay pocas opciones disponibles para los pacientes con enfermedad avanzada y esas opciones suelen ser de naturaleza paliativa. La inmunoterapia activa busca emplear el sistema inmunológico del paciente para eliminar los depósitos tumorales y ofrece una opción interesante para los pacientes que han fracasado con las terapias convencionales (Humphries, 2013). De hecho, varios estudios clínicos han demostrado que la inmunoterapia con células T puede ser curativa en pacientes con melanoma avanzado, lo que confirma la utilidad de este enfoque (Humphries, 2013). Además, los pacientes que padecen leucemia linfocítica crónica (LLC) y leucemia linfoblástica aguda (LLA) también han sido tratados y curados efectivamente con inmunoterapia de células T (Fry and Mackall, 2013) (Kochenderfer and Rosenberg, 2013). Si bien existen varias aproximaciones a la inmunoterapia, el diseño de células T con receptores quiméricos permite que las células inmunes de cualquier paciente se dirijan de manera independiente a cualquier diana deseable en un complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). Hasta la fecha, los receptores quiméricos utilizados para el diseño de células T constan de un dominio diana, normalmente un fragmento variable de cadena sencilla (Fvcs); un dominio transmembranal; y un dominio citosólico que contiene elementos de señalización del receptor de células T y proteínas asociadas (Dottiet al.,2009). Estos receptores quiméricos se han denominado "cuerpo T", "Receptor de Antígeno Quimérico" (RAQ) o "Receptor Inmune Quimérico" (RIQ); actualmente, la mayoría de los investigadores utilizan el término "RAQ" (Dottiet al.,2009). Estos RAQ se consideran en términos modulares y los científicos han dedicado un tiempo considerable a investigar la influencia de diferentes dominios de señalización citoplasmáticos en la función de los RAQ. Los RAQ de primera generación empleaban un único dominio de señalización de CD3Z o F<ce>RI<y>. Los RAQ de segunda generación combinaban el dominio de señalización de CD3Z con el dominio citoplásmico de los receptores coestimuladores de la familia de receptores CD28 o RFNT (Dottiet al.,2009). Los<r>A<q>de tercera generación combinaban múltiples dominios coestimuladores, pero existe la preocupación de que los RAQ de tercera generación pueden perder especificidad por el antígeno (Hanet al.,2013). La mayoría de las células T diseñadas con RAQ que se están probando en la clínica utilizan RAQ de segunda generación donde CD3Z está acoplado al dominio citoplásmico de ya sea CD28 o CD137 (Hanet al.,2013) (Finneyet al.,2004) (Miloneet al,2009).
Si bien las células T diseñadas con RAQ se han mostrado ser muy prometedoras en la aplicación clínica, se basan en un método sintético para reemplazar la señal de activación proporcionada por el receptor de células T (RCT). Dado que este receptor sintético no entrega todos los componentes de señalización asociados con el RCT (por ejemplo. CD3epsilon, Lck), aún no está claro si las células T son activadas de manera óptima por el RAQ o cómo la activación del RAQ afecta la diferenciación de las células T (por ejemplo, progresión a la memoria). Además, dado que los dominios de señalización de los RAQ están desconectados de sus socios reguladores naturales por la propia naturaleza de la estructura del RAQ, también existe un riesgo inherente de que los RAQ puedan conducir a un bajo nivel de activación constitutiva que podría dar lugar a toxicidades fuera de la diana.
Dadas estas limitaciones, es preferible redirigir a las células T para que ataquen a los tumores a través de su RCT natural. Con esta finalidad, se ha creado una clase de proteínas recombinantes denominadas "Comprometedoras de células T Biespecíficas" (CTBi) (Chames and Baty, 2009) (Portellet al.,2013). Estas proteínas emplean fragmentos de anticuerpos biespecíficos para entrecruzar los receptores RCT de las células T con los antígenos diana. Esto conduce a una activación eficiente de las células T, desencadenando la citotoxicidad. De manera similar, se han generado anticuerpos biespecíficos que logran este objetivo y algunos científicos simplemente han vinculado anticuerpos anti-CD3 con anticuerpos específicos para tumores empleando enlace químico (Chames and Baty, 2009). Mientras que estas proteínas biespecíficas han demostrado cierta actividadin vitro,la producción de GMP, vidas medias biológicas cortas y biodisponibilidad representan desafíos importantes para el uso exitoso de estas moléculas en el tratamiento contra el cáncer. Además, estas moléculas tampoco logran recapitular adecuadamente la señalización natural de RCT porque no se comprometen con los correceptores de RCT (CD8 y CD4).
Por ejemplo, una publicación de Helsenet al.describe células T diseñadas con un RAQ que codifica para un ligando específico para la diana, por ejemplo, contra el protooncogén HER-2, que redirige el RCT en presencia del antígeno tumoral. También, el documento de patente WO 2014/011988, divulga una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica para un receptor de antígeno quimérico (RAQ), el RAQ comprende un dominio de unión al antígeno derivado de un anticuerpo biespecífico. Otro documento de patente, WO 99/57268, divulga ADN que codifica para un RAQ que tiene una región variable del anticuerpo humano P67, un dominio transmembranal CD4 y que comprende una cadena zeta de CD3.
Sin embargo, acopladores de células T-antígeno con actividad y seguridad mejoradas en comparación con los RAQ tradicionales sigue siendo una necesidad.
Sumario de la invención
Los presentes inventores han demostrado que un acoplador de células T-antígeno trifuncional imita mejor la señalización natural a través del receptor de células T (RCT), al tiempo que conserva la orientación sin restricciones del complejo mayor de histocompatibilidad, tiene actividad y seguridad mejoradas en comparación con los receptores de antígenos quiméricos tradicionales.
En un primer aspecto de la invención, se proporciona un ácido nucleico que comprende:
a. un primer polinucleótido que codifica para un ligando específico para la diana en el que el ligando específico para la diana se une a un antígeno tumoral;
b. un segundo polinucleótido que codifica para un ligando que se une a una proteína CD3 asociada con el complejo RCT; y
c. un tercer polinucleótido que codifica para un dominio polipeptídico de señalización del coreceptor de células T que comprende un dominio citosólico CD4 y un dominio transmembranal CD4; en el que los componentes (a), (b) y (c) del acoplador de células T al antígeno codificado por el ácido nucleico están fusionados directamente entre sí o unidos mediante al menos un enlazadory el ácido nucleico no codifica para un dominio de activación.
En una realización del primer aspecto de la invención, el ligando específico para la diana es un polipéptido diseñado con repetición de anquirina (PDR<a>) o un Fvcs.
En una realización del primer aspecto de la invención, el ligando que se une a una proteína asociada con el complejo RCT es un anticuerpo de cadena sencilla o UCHT1, o una variante del mismo.
En una realización del primer aspecto de la invención, el primer polinucleótido y el tercer polinucleótido están fusionados al segundo polinucleótido.
En una realización del primer aspecto de la invención, el segundo polinucleótido y el tercer polinucleótido están fusionados al primer polinucleótido.
En un segundo aspecto de la invención, se proporciona un polipéptido codificado por el ácido nucleico del primer aspecto de la invención, en el que en el polipéptido los componentes (a), (b) y (c) están fusionados directamente entre sí o unidos por al menos un enlazador.
En un tercer aspecto de la invención, se proporciona un vector de expresión que comprende el ácido nucleico del primer aspecto de la invención.
En un cuarto aspecto de la invención, se proporciona un vector de construcción que comprende:
a. un ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto de la invención; y
b. un promotor funcional en una célula de mamífero.
En una realización del cuarto aspecto de la invención, en el que el primer polinucleótido y el tercer polinucleótido están fusionados con el segundo polinucleótido para proporcionar una fusión del acoplador de células T al antígeno y la secuencia codificante para la fusión del acoplador de células T al antígeno está conectada operativamente al promotor. En una realización del cuarto aspecto de la invención, en el que el segundo polinucleótido y el tercer polinucleótido están fusionados con el primer polinucleótido para proporcionar una fusión del acoplador de células T al antígeno y la secuencia codificante para la fusión del acoplador de células T al antígeno está conectada operativamente al promotor. En un quinto aspecto de la invención se proporciona una célula T aislada que expresa el ácido nucleico del primer aspecto o transfectada con el vector de construcción del cuarto aspecto de la invención.
En un quinto aspecto de la invención se proporciona una composición farmacéutica que comprende la célula T de la reivindicación 11 y un vehículo.
En una realización del primer aspecto de la invención, en el que el segundo polinucleótido comprende una secuencia de acuerdo con SEQ<i>D NO: 13 o SEQ ID NO: 24.
En una realización del primer aspecto de la invención, en el que el tercer polinucleótido comprende una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO: 17.
Tema en cuestión divulgado en la presente
El tema en cuestión divulgado en la presente no forma parte de la invención. Los términos "divulgación" y "ejemplo" como se divulgan en la presente se refieren a información que puede ser útil en el contexto de la presente invención pero que no forma parte de la invención reivindicada.
Por consiguiente, la presente divulgación proporciona un ácido nucleico que comprende:
a. un primer polinucleótido que codifica para un ligando específico para la diana;
b. un segundo polinucleótido que codifica para un ligando que se une a una proteína asociada con el complejo RCT; y
c. un tercer polinucleótido que codifica para un dominio polipeptídico de señalización del receptor de células T
En otro ejemplo de la divulgación se proporciona un polipéptido codificado por el ácido nucleico descrito anteriormente. Otro ejemplo de la divulgación proporciona un vector de expresión que comprende el ácido nucleico descrito anteriormente.
Otro ejemplo más de la divulgación proporciona una célula T que expresa el ácido nucleico descrito anteriormente. Otro aspecto de la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende la célula T y un vehículo. La divulgación también proporciona un uso de una célula T para tratar el cáncer en un sujeto en necesidad del mismo, en el que la célula T expresa un ácido nucleico que comprende:
a. un primer polinucleótido que codifica para un ligando específico para la diana;
b. un segundo polinucleótido que codifica para un ligando que se une a una proteína asociada con el complejo RCT; y
c. un tercer polinucleótido que codifica para un dominio polipeptídico de señalización del receptor de células T En un ejemplo de la divulgación, el ligando específico para la diana se une a un antígeno en una célula cancerígena. En otro ejemplo de la divulgación, el ligando específico para la diana es un polipéptido diseñado con repetición de anquirina (PDRA) o un Fvcs.
En otro ejemplo de la divulgación, la proteína asociada con el complejo RCT es CD3.
En otro ejemplo de la divulgación, el ligando que se une a una proteína asociada con el complejo RCT es un anticuerpo de cadena sencilla.
En otro ejemplo de la divulgación, el ligando que se une a una proteína asociada con el complejo RCT es UCHT1, o una variante del mismo.
En otro ejemplo de la divulgación, el polipéptido del dominio de señalización del receptor de células T comprende un dominio citosólico y un dominio transmembranal.
En otro ejemplo de la divulgación, el dominio citosólico es un dominio citosólico CD4 y el dominio transmembranal es un dominio transmembranal CD4.
En otro ejemplo de la divulgación, el primer polinucleótido y el tercer polinucleótido están fusionados al segundo polinucleótido.
En otro ejemplo de la divulgación, el segundo polinucleótido y el tercer polinucleótido están fusionados al primer polinucleótido.
La divulgación también proporciona un vector de construcción que comprende:
a. un primer polinucleótido que codifica para un ligando específico para la diana;
b. un segundo polinucleótido que codifica para un ligando que se une a una proteína asociada con el complejo RCT; y
c. un tercer polinucleótido que codifica para un dominio polipeptídico de señalización del receptor de células T. d. un promotor funcional en una célula de mamífero.
En un ejemplo de la divulgación, el primer polinucleótido y el tercer polinucleótido están fusionados al segundo polinucleótido para proporcionar una fusión del acoplador de células T al antígeno y la secuencia codificante para la fusión del acoplador de células T al antígeno está conectada operativamente al promotor.
En otro ejemplo de la divulgación, el segundo polinucleótido y el tercer polinucleótido están fusionados al primer polinucleótido para proporcionar una fusión del acoplador de células T al antígeno y la secuencia codificante para fusión del acoplador de células T al antígeno está conectada operativamente al promotor.
La divulgación también proporciona una célula T aislada transfectada con el vector de construcción.
Descripción breve de las figuras
Figura 1 es un resumen gráfico del acoplador de células T-antígeno trifuncional (ATA-Tri) en comparación con un RAQ convencional de segunda generación. Se incluye un esquema de las construcciones utilizadas en este trabajo. Figura 2 muestra un análisis de expresión en la superficie de las variantes de ATA-Tri y el RAQ clásico.
Figura 3 muestra un análisis de la activación celular observando los diferentes marcadores IFN-y, FNT-a y CD107a. Figura 4 analiza la muerte de dos líneas celulares diferentes que expresan (D2F2E2) o no expresan (D2F2), la diana molecular del RAQ clásico y el ATA-Tri.
Figura 5 representa la iniciación natural de las células T (A), dos métodos artificiales utilizados actualmente para la activación de las células T (B y C) y la tecnología de activación ATA (D).
Figura 6 representa (A) la configuración 1 de la molécula ATA y (B) la configuración 2 de la molécula ATA.
Figura 7 muestra la funcionalidad de ATA CD4 Fvcs. (A) es un histograma que muestra la expresión en la superficie del receptor ATA CD4 Fvcs en relación con el vector vacío, (B) muestra la activación específica del antígeno de las células T que expresan ATA CD4 Fvcs (arriba) o RAQ Fvcs (abajo) y (C) muestra la muerte comparable de la línea celular tumoral humana MCF-7 (Her2 positiva) tanto por ATA CD4 Fvcs como por RAQ Fvcs.
Figura 8 caracteriza la configuración 2 de ATA CD4 PDRA. (A) es un histograma que muestra la expresión en la superficie del receptor ATACD4 PDRA en relación con el vector vacío, (B) muestra la producción de citoquinas y la degranulación de células T diseñadas con la configuración 2 de ATA PDRA expuestas al antígeno Her2 y (C) muestra el crecimiento de la configuración 2 de ATACD4 relativa al control del vector vacío.
Figura 9 muestra la funcionalidad de la configuración 1 de ATACD4 PDRA. (A) muestra la expresión en la superficie de CAL CD4 PDRA en comparación con RAQ PDRA y el control solo RFCN, (B) muestra el crecimiento de la configuración 1 de ATA CD4 y (C) y (D) muestran el porcentaje de células positivas para varios marcadores de activaciones y degradación.
Figura 10 muestra la citotoxicidad y la actividad general de ATA y RAQ. Se incubaron células diseñadas con ATA, RAQ o vector vació de control en varias líneas celulares tumorales humanas.
Figura 11 muestra la expresión en la superficie del receptor y la activación de varios controles ATA. (A) muestra la expresión en la superficie celular (izquierda), la degranulación (centro) y la producción de citoquinas (derecha) y (B) muestra que solo ATA-CD4 de longitud completa es capaz de provocar una respuesta citotóxica.
Figura 12 muestra propiedades de diversas variantes del ATA transmembranal. (A) es una descripción general de varias construcciones de dominio transmembranal, (B) muestra la expresión de la superficie de varias construcciones diseñadas en CD8 de células T purificadas y (C) muestra pruebas de las diversas variantes para la degranulación y la producción de citoquinas.
Figura 13 muestra la interacción de Lck con variantes del ATA. (A) muestra la capacidad del ATA de longitud completa y la deleción citosólica para llevar hacia abajo a Lck y (B) es un análisis de densitometría de Lck detectada en los pellets de (A).
Figura 14 muestra la expresión y actividad en la superficie de CD4 ATA en comparación con una variante tipo CTBi. (A) representa la expresión en la superficie de un control único de RFCN, CD4 ATA y la variante tipo CTBi y (B) compara la citotoxicidad en varias líneas celulares.
Figura 15 muestra CD4 ATA de tipo silvestre en comparación con una biblioteca de mutágenos aleatorios de UCHT1. (A) muestra la representación esquemática de la mutante, (B) es un histograma que muestra la expresión en la superficie de la biblioteca y (C) muestra la capacidad de la biblioteca para activar células T y producir citoquinas. Figura 16 muestra la expresión mejorada en la superficie de la mutante A85V, T161P (A) compara las poblaciones finales de CD/CD8 entre CD4 ATA y la mutante A85V, T161P, (B) muestra una expresión mejorada en la superficie de la mutante A85V, T161P y (C) muestra que la producción de citoquinas está disminuida en la mutante A85V, T161. Figura 17 muestra la citotoxicidad y el crecimiento de la mutante A85V, T161P (A) muestra la citotoxicidad de la mutante A85V, T161P en diversas líneas celulares y (B) muestra el crecimiento celular en cultivo durante 2 semanas. Descripción detallada
(i) Definiciones
El término "una célula", como se utiliza en la presente, incluye una única célula, así como una pluralidad de células.
El término "célula T", como se utiliza en la presente, se refiere a un tipo de linfocito que desempeña un papel central en la inmunidad mediada por células. Las células T, también denominadas linfocitos T, se pueden distinguir de otros linfocitos, tales como las células B y las células asesinas naturales, por la presencia de un receptor de células T (RCT) en la superficie celular. Hay varios subconjuntos de células T con funciones distintas, que incluyen, pero no se limitan a, células T auxiliares, células T citotóxicas, células T de memoria, células T reguladoras y células T asesinas naturales.
El término "acoplador de células T al antígeno", como se utiliza en la presente, se refiere a una construcción diseñada de ácido nucleico o polipéptido que, cuando se expresa en una célula T, dirige la célula T a un antígeno en particular.
El término "polinucleótido" y/o "secuencia de ácido nucleico" y/o "ácido nucleico" como se utiliza en la presente se refiere a una secuencia de monómeros de nucleósidos o nucleótidos que consisten en bases, azúcares y enlaces entre azúcares (esqueleto). El término también incluye secuencias modificadas o sustituidas que comprenden monómeros que no ocurren naturalemente o porciones de los mismos. Las secuencias de ácidos nucleicos de la presente solicitud pueden ser secuencias de ácido desoxirribonucleico (ADN) o secuencias de ácido ribonucleico (ARN) y pueden incluir bases que ocurren naturalmente que incluyen adenina, guanina, citosina, timidina y uracilo. Las secuencias también pueden contener bases modificadas. Ejemplos de dichas bases modificadas incluyen aza y deaza adenina, guanina, citosina, timidina y uracilo; y xantina e hipoxantina. Los ácidos nucleicos de la presente divulgación pueden aislarse de organismos biológicos, formarse mediante métodos de laboratorio de recombinación genética u obtenerse mediante síntesis química u otros protocolos conocidos para la creación de ácidos nucleicos.
El término "polinucleótido aislado" o "secuencia de ácido nucleico aislada" como se utiliza en la presente se refiere a un ácido nucleico sustancialmente libre de material celular o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas de ADN recombinante, o precursores químicos, u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Un ácido nucleico aislado también está sustancialmente libre de secuencias que flanquean naturalmente el ácido nucleico (es decir, secuencias ubicadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) del que se deriva el ácido nucleico. Se pretende que el término "ácido nucleico" incluya ADN y ARN y puede ser de cadena doble o de cadena sencilla, y representa la cadena sentido o antisentido. Además, el término "ácido nucleico" incluye las secuencias complementarias de los ácidos nucleicos.
El término "ácido nucleico recombinante" o "ácido nucleico diseñado" como se utiliza en la presente se refiere a un ácido nucleico o polinucleótido que no se encuentra en un organismo biológico. Por ejemplo, los ácidos nucleicos recombinantes pueden formarse mediante métodos de laboratorio de recombinación genética (como la clonación molecular) para crear secuencias que de otro modo no se encontrarían en la naturaleza. Los ácidos nucleicos recombinantes también pueden crearse mediante síntesis química u otros protocolos conocidos para la creación de ácidos nucleicos.
El término "polipéptido" o "proteína" como se utiliza en la presente describe una cadena de aminoácidos que corresponden a los codificados por un ácido nucleico. Un polipéptido o proteína de esta divulgación puede ser un péptido, que normalmente describe una cadena de aminoácidos de dos hasta alrededor de 30 aminoácidos. El término proteína como se utiliza en la presente también describe una cadena de aminoácidos que tiene más de 30 aminoácidos y puede ser un fragmento o dominio de una proteína o una proteína de longitud completa. Además, como se utiliza en la presente, el término proteína puede referirse a una cadena lineal de aminoácidos o puede referirse a una cadena de aminoácidos que ha sido procesada y plegada convirtiéndose en una proteína funcional. Se entiende, sin embargo, que 30 es un número arbitrario con respecto a la distinción de péptidos y proteínas y los términos se pueden utilizar indistintamente para una cadena de aminoácidos. Las proteínas de la presente divulgación se pueden obtener mediante aislamiento y purificación de las proteínas de células donde se producen de forma natural, mediante escisión enzimática (por ejemplo, proteolítica) y/o de forma recombinante mediante expresión de ácidos nucleicos que codifican para las proteínas o fragmentos de esta divulgación. Las proteínas y/o fragmentos de esta divulgación también se pueden obtener mediante síntesis química u otros protocolos conocidos para producir proteínas y fragmentos.
El término "polipéptido aislado" se refiere a un polipéptido sustancialmente libre de material celular o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas de ADN recombinante, o precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente.
El término "anticuerpo", como se utiliza en la presente, pretende incluir anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos quiméricos y fusiones de los anticuerpos. El anticuerpo puede proceder de fuentes recombinantes y/o producirse en animales transgénicos. El término "fragmento de anticuerpo", como se utiliza en la presente, pretende incluir, sin limitaciones, Fab, Fab', F(ab')2, Fvcs, Fvds, Fvcs-ds, dímeros, minicuerpos, diacuerpos y multímeros de los mismos, fragmentos de anticuerpos multiespecíficos y anticuerpos de dominio.
El término "vector", como se utiliza en la presente, se refiere a un polinucleótido que se puede utilizar para entregar un ácido nucleico al interior de una célula. En un ejemplo, un vector es un vector de expresión que comprende secuencias de control de la expresión (por ejemplo, un promotor) unidas operativamente a un ácido nucleico que va a ser expresado en una célula. Los vectores conocidos en la técnica incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, fagos, cósmidos y virus.
(ii) Composiciones
Los presentes inventores han desarrollado un acoplador de células T-antígeno trifuncional (ATA-Tri) para imitar mejor la señalización natural a través del receptor de células T (RCT), manteniendo al mismo tiempo la orientación sin restricciones del CMH. Específicamente, los inventores crearon una molécula donde las regiones transmembranal e intracelular del correceptor CD4, que se localizan en la balsa lipídica y se unen a Lck, respectivamente, se fusionaron con un anticuerpo de cadena sencilla que se une a CD3. La construcción está diseñada para atraer a la molécula CD3 y el RCT hacia regiones de balsas lipídicas y acercar Lck al RCT, de manera similar a la unión natural del CMH. Para apuntar al receptor quimérico, se unió un polipéptido diseñado con repetición de anquirina (PDRA) a la quimera CD4-UCHT1 para generar un acoplador de células T-antígeno trifuncional (ATA-Tri)
Experimentalmente, se diseñaron células T humanas para expresar el prototipo ATA-Tri o un RAQ convencional con el mismo PDRA. Se determinó que, en todos los aspectos, las células T diseñadas con ATA-Tri demostraron una funcionalidad equivalente a la de un RAQ convencional. Con respecto a dos parámetros (producción de FNT-a y movilización de CD107a), se observó que el ATA-Tri era más activo que un rAq convencional. Además, los datos muestran que, por molécula, el ATA-Tri muestra una actividad significativamente mejorada. Además, el ATA-Tri ofrece mayor seguridad en comparación con los RAQ tradicionales, ya que no hay dominios de activación que formen parte de la proteína.
Por consiguiente, la presente divulgación se refiere a un ácido nucleico que comprende:
un primer polinucleótido que codifica para un ligando específico para la diana;
un segundo polinucleótido que codifica para un ligando que se une al complejo RCT; y
un tercer polinucleótido que codifica para un dominio polipeptídico de señalización del receptor de células T.
En un ejemplo, el ácido nucleico es un ácido nucleico recombinante o diseñado. En otro ejemplo, el primer, segundo y/o tercer polinucleótidos son polinucleótidos recombinantes o polinucleótidos diseñados.
La divulgación también se refiere a un polipéptido codificado por el ácido nucleico y una composición que comprende el ácido nucleico.
Un ácido nucleico que comprende cada uno de los polinucleótidos primero, segundo y tercero, y el polipéptido codificado por el ácido nucleico también se refiere en la presente como un acoplador de células T-antígeno trifuncional o ATA-Tri.
Ligando específico para la diana
El ligando específico para la diana dirige al acoplador de células T-antígeno a una célula diana. En consecuencia, un ligando específico para la diana se refiere a cualquier sustancia que se une, directa o indirectamente, a una célula diana. Una célula diana puede ser cualquier célula asociada con un estado de enfermedad, incluido, pero no limitado al cáncer. En un ejemplo, el ligando específico para la diana se une a un antígeno (proteína producida por una célula que puede provocar una respuesta inmune) en la célula diana. El ligando específico para la diana también puede denominarse como un dominio de unión al antígeno.
En un ejemplo, una célula diana es una célula tumoral. Aquí, un ligando específico para la diana se unir a un antígeno tumoral o a un antígeno asociado a un tumor en una célula tumoral. Los antígenos tumorales son bien conocidos en la técnica. El término "antígeno tumoral" o "antígeno asociado a un tumor" como se utiliza en la presente significa cualquier sustancia antigénica producida en células tumorales que desencadena una respuesta inmune en un huésped (por ejemplo, que puede estar representada por complejos CMH). El antígeno tumoral cuando es protéico puede ser, por ejemplo, una secuencia de 8 o más aminoácidos hasta la proteína completa y cualquier número de aminoácidos entre 8 y la proteína de longitud completa que comprender al menos un fragmento antigénico de la proteína de longitud completa que puede estar representado en un complejo CMH. Los ejemplos de antígenos tumorales incluyen, pero no se limitan a, HER2 (erbB-2), antígeno de maduración de células B (AMCB), alfafetoproteína (AFP), antígeno carcinoembrionario (ACE), CA-125, MUC-1, antígeno de tumor epitelial (ATE), tirosinasa, antígeno asociado al melanoma (AGAM), antígeno prostático específico (APS), antígeno asociado al glioma, p-gonadotropina coriónica humana, tiroglobulina, RAGE-1, MN-CA IX, transcriptasa reversa de la telomerasa humana, RU1, RU2 (AS), carboxil esterasa intestinal, hsp70-2 de mut, M-CSF, prostasa, PAP, NY-ESO-1, LAGE-1 a, p53, prosteina, PSMA, survivina y telomerasa, antígeno tumoral -1 del carcinoma de próstata (ATCP-1), ELF2M, elastasa de neutrófilos, CD22, factor de crecimiento de la insulina (FCI)-I, FCI-II, receptor de FCI-I y mesotelina.
Ejemplos de ligandos específicos para la diana incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos, por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla tales como FVcs o proteínas pequeñas que se unen a la célula diana y/o al antígeno.
Un ejemplo de un ligando específico para la diana un polipéptido diseñado con repetición de anquirina (PDRA) dirigido a una célula y/o antígeno específicos. En un ejemplo, el ligando específico para la diana es un PDRA dirigido a HER2 (erbB-2). En la presente se proporciona un ejemplo de un PDRA dirigido a HER2 (erb-2) como SEQ ID NO: 7 y 8.
Otro ejemplo de un ligando específico para la diana es un FVcs dirigido a una célula y/o antígeno específicos. En un ejemplo, el ligando específico para la diana es un Fvcs que se une a HER2 (erb-2). Un ejemplo de un Fvcs que se une a HER2 (erb-2) se proporciona en la presente como SEQ ID NO: 22 y 23.
Ligando que se une al complejo RCT
El acoplador de células T-antígeno está diseñado para reclutar al Receptor de Células T (RCT) en combinación con la estimulación del correceptor. En consecuencia, el acoplador de células T al antígeno incluye un ligando que se une a una proteína asociada con el complejo receptor de células T
El RCT (Receptor de células T) es un complejo de proteínas integrales de membrana que participa en la activación de las células T en respuesta a la unión de un antígeno. El RCT es un heterodímero unido mediante enlaces disulfuro anclado a una membrana que normalmente consta de las cadenas alfa (a) y beta (p) altamente variables expresadas como parte de un complejo con las moléculas de cadena invariantes CD3 (clúster de diferenciación 3). Las células T que expresan este receptor se denominan células T a:p (o ap), aunque una minoría de células T expresan un receptor alternativo, formado por cadenas variables gamma (<y>) y delta (8), denominadas células T<y>8.<c>D3 es un complejo protéico compuesto por cuatro cadenas distintas. En los mamíferos, el complejo contiene una cadena CD3y, una cadena CD38 y dos cadenas CD3<e>.
Como se utiliza en la presente, el término "ligando que se une a una proteína asociada con el complejo receptor de células T" incluye cualquier sustancia que se une, directa o indirectamente, a una proteína del RCT. Las proteínas asociadas con el RCT incluyen, pero no se limitan a, cadena alfa (a) de RCT, cadena beta (p) de RCT, cadena gamma (Y) de RCT, cadena delta (8) de RCT, cadena CD3y, cadena CD38 y cadenas CD3e. En un ejemplo, un ligando que se une a una proteína asociada con el complejo receptor de células T es un anticuerpo a la cadena alfa (a) de RCT, cadena beta (p) de RCT, cadena gamma (<y>) de RCT, cadena delta (8) de RCT, cadena CD3<y>, cadena CD38 y/o cadena CD3e.
En un ejemplo, el ligando es un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a CD3. Se conocen en la técnica ejemplos de anticuerpos CD3 (para muromonab, otelixizumab, teplizumab y visilizumab). En un ejemplo, el anticuerpo que se une a CD3 es un anticuerpo de cadena sencilla, por ejemplo, un fragmento variable de cadena sencilla (Fvcs).
Otro ejemplo de un anticuerpo CD3 es UCHT1 que se dirige a CD3e. En la presente se proporciona una secuencia para UCHT1 como SEQ ID NO: 13 y 14.
Dominio polipeptídico de señalización del receptor de células T
El acoplador de células T al antígeno incluye un dominio polipeptídico de señalización del receptor de células T. Como se utiliza en la presente, el término " dominio de señalización del receptor de células T" se refiere a un polipéptido que (a) se localiza en la balsa lipídica y/o (b) se une a Lck. Un dominio polipeptídico de señalización del receptor de células T puede incluir uno o más dominios protéicos que incluyen, peor no se limitan a, un dominio citoplásmico y/o un dominio transmembranal. Como se utiliza en la presente, "dominio de proteínas" se refiere a la parte conservada de una determinada estructura de secuencia de la proteína que puede funcionar y existir independientemente del resto de la cadena de la proteína. En un ejemplo, el dominio polipeptídico de señalización del receptor de células T incluye un dominio citoplásmico. En otro ejemplo, el dominio polipeptídico de señalización del receptor de células T incluye un dominio transmembranal. En un ejemplo adicional, el dominio polipeptídico de señalización del receptor de células T incluye tanto un dominio citoplásmico y como uno transmembranal.
El dominio polipeptídico de señalización del receptor de células T incluyen correceptores y coestimuladores de RCT y dominios de proteína coestimuladores y correceptores de RCT.
Un "correceptor de RCT" se refiere a una molécula que ayuda al receptor de células T (RCT) a comunicarse con una célula presentadora del antígeno. Los ejemplos de correceptores de RCT incluyen, pero no se limitan a, CD4, CD8, CD28, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CDt 37 y CD 154.
Un "coestimulador de RCT" se refiere a una molécula que es necesaria para la respuesta de una célula T a un antígeno. Los ejemplos de coestimuladores de RCT incluyen, pero no se limitan a, PD-1,<i>C<o>S, CD27, CD28, 4-1BB (CD 137), OX40,<c>D30, CD40, antígeno 1 asociado a la ficción de linfocitos (AFL-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C,<b>7-H3 y un ligando que se une específicamente a CD83.
En un ejemplo, el dominio polipeptídico de señalización del receptor de células T incluye tanto un dominio citoplásmico como un dominio transmembranal de una proteína coestimuladora o correceptora de RCT. El dominio citoplásmico y el dominio transmembranal pueden ser del mismo correceptor o coestimulador o de diferentes correceptores o coestimuladores. El dominio citoplásmico y los dominios transmembranal están unidos opcionalmente mediante un enlazador.
En un ejemplo, el dominio polipeptídico de señalización del receptor de células T comprende los dominios transmembranal y citoplásmico del correceptor CD4 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 17 y 18).
En otro ejemplo, el dominio polipeptídico de señalización del receptor de células T comprende los dominios transmembranal y citoplásmico del correceptor CD8a.
En otro ejemplo, el dominio citoplásmico y/o transmembranal del dominio polipeptídico de señalización del receptor de células T es sintético. Por ejemplo, el dominio transmembranal es opcionalmente un dominio de membrana sintético altamente hidrofóbico.
En otro ejemplo, el dominio transmembranal es un dominio transmembranal de glicoforina. En otro ejemplo más, el dominio polipeptídico de señalización del receptor de células T incluye una secuencia señal CD48 GPI para unir el acoplador de células T-antígeno a la membrana utilizando el anclaje GPI.
Además de los tres componentes del acoplador de células T al antígeno descritos en la presente (ligando específico para la diana, ligando que se une al complejo RCT y dominio polipeptídico de señalización del receptor de células T), se contempla que también podrían incluirse otros polipéptidos. Por ejemplo, el acoplador de células T al antígeno incluye opcionalmente polipéptidos adicionales que actúan directa o indirectamente para apuntar o activar a la célula T.
Enlazadores
Los diversos componentes del acoplador de células T al antígeno pueden fusionarse directamente entre sí o pueden unirse mediante al menos un enlazador, opcionalmente un enlazador peptídico. El enlazador peptídico puede ser de cualquier tamaño siempre que no interfiera con la función de los componentes unidos individuales. En un ejemplo, el enlazador peptídico tiene alrededor de 1 a alrededor de 15 aminoácidos de longitud, más específicamente de alrededor de 1 a alrededor de 10 aminoácidos, y más específicamente de alrededor de 1 a alrededor de 6 aminoácidos.
Ejemplos de enlazadores útiles en el acoplador de células T al antígeno incluyen el enlazador G4S3. Otros ejemplos de enlazadores son péptidos que corresponden a SEQ ID NO: 11, 12, 15, 16, 19, 20 y 21 y variantes y fragmentos de los mismos:
Configuración
El acoplador de célula T-antígeno puede estar presente en diversas configuraciones, como apreciará fácilmente un experto en la técnica.
En un ejemplo, el ligando específico para la diana y el dominio polipeptídico de señalización del receptor de células T están fusionados al ligando que se une al complejo RCT. Por ejemplo, el ATA N-PDRA descrito en la presente (también denominado configuración 1; SEQ ID NO: 1 y 2) incluye, en orden:
i) Secuencia líder ATA Tri N-PDRA (señal de secreción) (SEQ ID NO: 5 y 6)
ii) PDRA específico para el antígeno Her2 (SEQ ID NO: 7 y 8)
iii) Etiqueta Myc (SEQ ID NO: 9 y 10)
iv) Enlazador 1 (SEQ ID NO: 11 y 12)
v) UCHT1 (SEQ ID NO: 13 y 14)
vi) Enlazador 2 (SEQ ID NO: 15 y 16)
vii) CD4 (SEQ ID NO: 17 y 18)
En otro ejemplo, el PDRA se reemplaza con un FVcs, Fvcs específico para un antígeno Her2 (SEQ ID NO: 22 y 23). En otro ejemplo, el ligando que se une al complejo RCT y el dominio polipeptídico de señalización del receptor de células T están fusionados al ligando específico para la diana (ATA C-PDRA como se describe aquí (también denominado configuración 1; SEQ ID NO: 3 y 4)). Las configuraciones alternativas serán evidentes fácilmente para una persona experta en la técnica.
Construcciones de los vectores
Se pueden emplear una variedad de vectores de administración y vehículos de expresión para introducir los ácidos nucleicos descritos en la presente en una célula. Por consiguiente, los polinucleótidos antes mencionados están opcionalmente comprendidos en un vector para proporcionar una vector de construcción, también denominado en la presente como un vector.
Por lo tanto, la presente divulgación también se refiere a un vector que comprende:
a. un primer polinucleótido que codifica para un ligando específico para la diana;
b. un segundo polinucleótido que codifica para un anticuerpo que se une a CD3; y
C. un tercer polinucleótido que codifica para un dominio polipeptídico de señalización del receptor de células T, y opcionalmente un promotor funcional en una célula de mamífero.
Los promotores, regiones de ADN que inician la transcripción de una secuencia de ácido nucleico en particular, son bien conocidos en la técnica. Un "promotor funcional en una célula de mamífero" se refiere a un promotor que dirige la expresión de la secuencia de ácido nucleico asociada, en una célula de mamífero. Se puede hacer referencia a un promotor que dirige la expresión de una secuencia de ácido nucleico como "conectado operativamente" a la secuencia del ácido nucleico.
En una realización, el primer polinucleótido y el tercer polinucleótido están fusionados con el segundo polinucleótido para proporcionar una fusión del acoplador de células T al antígeno y la secuencia codificante de la fusión del acoplador de células T al antígeno está conectada operativamente al promotor.
En otra realización, el segundo polinucleótido y el tercer polinucleótido están fusionados al primer polinucleótido para proporcionar una fusión del acoplador de células T al antígeno y la secuencia codificante de la fusión del acoplador de células T al antígeno está conectada operativamente al promotor.
Opcionalmente, el vector está diseñado para expresión en células de mamífero, tales como células T En un ejemplo, el vector es un vector viral, opcionalmente un vector retroviral.
Los vectores que son útiles comprenden vectores derivados de lentivirus, virus de células madre murinas (VCMM), virus de la viruela, oncoretrovirus, adenovirus y virus adenoasociados. Otros vectores de administración que son útiles comprenden vectores derivados de los virus del herpes simple, transposones, virus vaccinia, virus del papiloma humano, virus de la inmunodeficiencia en simios, VLHT, virus espumoso humano y variantes del mismo. Otros vectores que son útiles comprenden vectores derivados de espumavirus, retrovirus tipo B de mamífero, retrovirus tipo C de mamífero, retrovirus tipo C de ave, retrovirus tipo D de mamífero y retrovirus de tipo VLHT/VLB. Un ejemplo de un vector lentiviral útil en las composiciones y métodos divulgados es el vector pCCL.
Variaciones de polinucleótidos y polipéptidos
Se pueden realizar muchas modificaciones a las secuencias de polinucleótidos, incluidas secuencias de vectores y secuencias de polipéptidos descritas en esta solicitud, y estas serán evidentes para un experto en la técnica. Las modificaciones incluyen sustitución, inserción o deleción de nucleótidos o aminoácidos o alteración de las posiciones relativas u orden de nucleótidos o aminoácidos.
En un ejemplo, los polinucleótidos descritos en la presente pueden modificarse o mutarse para optimizar la función del polipéptido codificado y/o la función, actividad y/o expresión del acoplador de células T al antígeno.
Se muestra en la presente que se puede generar una mutante UCHT1 que dé como resultado una expresión mejorada en la superficie del ATA (Figuras 15-17). Por consiguiente, en un ejemplo, el ATA comprende un ligando modificado o mutado que une al complejo RCT, en el que el ATA que comprende el anticuerpo modificado o mutado tiene una expresión y/o actividad mejorada en la superficie en comparación con un ATA que comprende un tipo silvestre o no modificado o con mutación en el ligando que se une al complejo RCT Un ejemplo de un anticuerpo mutado o modificado que se une CD3 es la mutante<u>C<h>TI A85V, T161P descrita en la presente (SEQ ID NO: 24 y 25).
Identidad de secuencia
Los polinucleótidos de la solicitud también incluyen moléculas de ácido nucleico (o un fragmento de las mismas) que tienen al menos alrededor de: 70% de identidad, al menos 80% de identidad, al menos 90% de identidad, al menos 95% de identidad, al menos 96% de identidad, al menos 97% de identidad, al menos 98% de identidad o, al menos 99% o 99.5% de identidad a una molécula de ácido nucleico de la solicitud. Los polipéptidos de la solicitud también incluyen polipéptidos (o un fragmento de los mismos) que tienen al menos alrededor de: 70% de identidad, al menos 80% de identidad, al menos 90% de identidad, al menos 95% de identidad, al menos 96% de identidad, al menos 97% de identidad, al menos 98% de identidad o, al menos 99% o 99.5% de identidad a un polipéptido de la solicitud. La identidad se refiere a la similitud de dos secuencias de nucleótidos o polipéptidos que están alineadas de manera que se obtenga la coincidencia de mayor orden. La identidad se calcula de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, si una secuencia de nucleótidos (llamada "Secuencia A") tiene un 90% de identidad con una porción de SEQ iD NO: 1, entonces la Secuencia A será idéntica a la parte referenciada de SEQ ID NO: 1 excepto que la Secuencia A puede incluir hasta 10 mutaciones puntuales (tales como sustituciones con otros nucleótidos) por cada 100 nucleótidos de la porción referenciada de SEQ ID NO: 1.
La identidad de secuencia se establece preferiblemente en al menos alrededor de: 70% de identidad, al menos 80% de identidad, al menos 90% de identidad, al menos 95% de identidad, al menos 96% de identidad, al menos 97% de identidad, al menos 98% de identidad o, lo más preferible, al menos 99% o 99.5% de identidad con las secuencias de nucleótidos proporcionadas en la presente y/o su secuencia complementaria. La identidad de secuencia también se establece preferiblemente en al menos alrededor de: 70% de identidad, al menos 80% de identidad, al menos 90% de identidad, al menos 95% de identidad, al menos 96% de identidad, al menos 97% de identidad, al menos 98% de identidad o, lo más preferible, al menos 99% o 99.5 % de identidad con las secuencias polipeptídicas proporcionadas en la presente. La identidad de secuencia se calculará preferentemente con el programa GCG de Bioinformatics (Universidad de Wisconsin). También hay otros programas disponibles para calcular la identidad de secuencia, tales como el programa Clustal W (preferiblemente utilizando los parámetros predeterminados; Thompson, JDet al.,Nucleic Acid Res. 22:4673-4680).
Hibridación
La solicitud incluye ADN que tiene una secuencia con identidad suficiente a una molécula de ácido nucleico descrita en esta solicitud para hibridar bajo condiciones de hibridación rigurosas (las técnicas de hibridación son bien conocidas en la técnica). La presente solicitud también incluye moléculas de ácido nucleico que se hibridan con una o más de las secuencias descritas en la presente y/o su secuencia complementaria. Tales moléculas de ácido nucleico se hibridan preferiblemente en condiciones de alta rigurosidad (véase Sambrooket al.see Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Most Recent Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y). Los lavados de alta rigurosidad tienen preferiblemente baja sal (preferiblemente alrededor de 0.2% de SSC) y una temperatura de aproximadamente 50-65° C y opcionalmente se realizan durante alrededor de 15 minutos.
Expresión en células T
El acoplador de células T al antígeno está diseñado para expresión en células T Por consiguiente, un aspecto de la divulgación proporciona una célula T que expresa un acoplador de células T al antígeno. Otro aspecto de la divulgación se refiere a una célula T transducida o transfectada con un acoplador de células T al antígeno o un vector que comprende un acoplador de células T al antígeno. Opcionalmente, la célula T es una célula T aislada.
Las células T se pueden obtener de varias fuentes, incluyendo, pero no limitadas a, sangre (por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica), médula ósea, tejido del timo, tejido de ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, tejido del bazo y tumores. En un ejemplo, las células T son células T autólogas. En otro ejemplo, las células T se obtienen de una línea celular de células T. Los métodos de cultivo y mantenimiento de células Tin vitroson bien conocidos en la técnica.
Una vez que se obtienen, las células T se enriquecenin vitroopcionalmente. Como es bien conocido en la técnica, una población de células puede enriquecerse mediante selección positiva o negativa. Además, de forma opcional las células T pueden congelarse o criopreservarse y luego descongelarse en una fecha posterior.
Antes o después de introducir el acoplador de células T al antígeno en las células T, las células T se activan y/o expanden opcionalmente utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células T pueden expandirse por contacto con una superficie que tiene unido a la misma un agente que estimula una señal asociada al complejo CD3/RCT y a un ligando que estimula una molécula coestimuladora en la superficie de las células T.
Los métodos para transducir o transfectar células T con secuencias de ácidos nucleicos y expresar los ácidos nucleicos transducidos en las células T son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede introducir un ácido nucleico en una célula por medios físicos, químicos o biológicos. Los medios físicos incluyen, pero no se limitan a, (microinyección, electroporación, bombardeo de partículas, lipofección y precipitación con fosfato de calcio). Los medios biológicos incluyen el uso de vectores de a Dn y ARN.
En un ejemplo, se utilizan vectores virales, incluidos los vectores retrovirales, para introducir y expresar un ácido nucleico en una célula T. Los vectores virales incluyen vectores derivados de lentivirus, virus de células madre murinas (VCMM), virus de la viruela, adenovirus del virus del herpes simple I y virus adenoasociados. El vector incluye opcionalmente un promotor que dirige la expresión de la molécula de ácido nucleico transducida en una célula T.
Se pueden utilizar diversos ensayos para confirmar la presencia y/o expresión de la secuencia de ácido nucleico transducida y/o el polipéptido codificado por el ácido nucleico en la célula T. Los ensayos incluyen, pero no se limitan a, transferencia tipo Southern y Northern, RT-PCR y PCR, ELISA y Transferencia tipo Western.
En un ejemplo, una célula T que expresa un acoplador de células T al antígeno tiene una mayor activación de células T en presencia de un antígeno en comparación con una célula T que no expresa un acoplador de células T al antígeno y/o en comparación con una célula T que expresa un RAQ tradicional. El aumento de la activación de las células T puede determinarse mediante numerosos métodos, incluidos, pero no limitados a, aumento de la muerte de líneas celulares tumorales, aumento de la producción de citoquinas, aumento de la citólisis, aumento de la degranulación y/o aumento de la expresión de marcadores de activación tales como CD107a, IFNy, IL2 o FNTa. Los aumentos pueden medirse en una célula individual o en una población de células.
Los términos "aumentado" o "aumentando" como se utilizan en la presente se refieren a un aumento de al menos 2%, 5%, 10%, 25%, 50%, 100% o 200% en una célula T o en una población de células T que expresan un acoplador de células T al antígeno en comparación con una célula T o población de células T que no expresan un acoplador de células T al antígeno y/o en comparación con una célula T o población de células T que expresan un RAQ tradicional.
Las células T, opcionalmente células T autólogas, que expresan el acoplador de células T al antígeno se pueden administrar a un sujeto en necesidad del mismo. De acuerdo con esto, una célula T transducida con y/o que expresa un acoplador de células T al antígeno se puede formular en una composición farmacéutica. Preferiblemente, las células T se formulan para administración intravenosa.
Se puede preparar una composición farmacéutica mediante métodos conocidos per se para la preparación de composiciones farmacéuticamente aceptables que se pueden administrar a sujetos, de manera que una cantidad efectiva de células T se combine en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos adecuados se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania, USA, 2000). Sobre esta base, las composiciones incluyen, aunque no exclusivamente, soluciones de las sustancias en asociación con uno o más vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables, y contenidas en soluciones tamponadas con un pH adecuado e isoosmóticas con los fluidos fisiológicos.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen composiciones esencialmente inertes químicamente y no tóxicas que no interfieren con la eficacia de la actividad biológica de la composición farmacéutica. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, soluciones salinas, soluciones de glicerol, etanol, cloruro de N-(1(2,3-dioleiloxi)propil)N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), diolesilfosfotidil- etanolamina (DOPE) y liposomas. Tales composiciones deben contener una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto, junto con una cantidad adecuada de vehículo para proporcionar la forma para la administración directa al paciente.
Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir, sin limitación, polvos liofilizados o soluciones o suspensiones inyectables estériles acuosas o no acuosas, que pueden contener además antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que las composiciones sean sustancialmente compatibles con los tejidos o la sangre de un receptor previsto. Otros componentes que pueden estar presentes en dichas composiciones incluyen agua, tensioactivos (tales como Tween), alcoholes, polioles, glicerina y aceites vegetales, por ejemplo. Se pueden preparar soluciones y suspensiones para inyección extemporánea a partir de polvos, gránulos, tabletas o soluciones o suspensiones concentradas estériles.
(iii) Métodos y usos
Un aspecto de la presente divulgación proporciona el uso de un acoplador de células T-antígeno trifuncional para dirigir a una célula T a un antígeno específico.
Por consiguiente, la presente divulgación también se refiere al uso de una célula T modificada para tratar el cáncer en un sujeto en necesidad del mismo, en el que la célula T modificada expresa un ácido nucleico que comprende un primer polinucleótido que codifica para un ligando específico para la diana, un segundo polinucleótido que codifica para un ligando que se une al complejo RCT; y un tercer polinucleótido que codifica para un dominio polipeptídico de señalización del receptor de células T. La divulgación también se refiere a métodos para tratar el cáncer, que comprenden administrar una cantidad eficaz de células T modificadas a un sujeto en necesidad del mismo. También se describe el uso de una cantidad eficaz de células T modificadas para tratar el cáncer en un sujeto en necesidad del mismo. Se describe además el uso de una célula T modificada en la preparación de un medicamento para tratar el cáncer en un sujeto en necesidad del mismo. Aún más se divulga una célula T modificada para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto en necesidad del mismo. En un ejemplo, el ligando específico para la diana se une a un antígeno en una célula cancerígena, dirigiendo así a la célula T modificada a la célula cancerosa.
Los cánceres que pueden tratarse incluyen cualquier forma de enfermedad neoplásica. Ejemplos de cánceres que pueden tratarse incluyen, pero no se limitan a, cáncer de mama, cáncer de pulmón y leucemia, por ejemplo, leucemia de linaje mixto (LLM), leucemia linfocítica crónica (LLC) o leucemia linfoblástica aguda (LLA). Otros cánceres incluyen carcinomas, blastomas, melonomas, sarcomas, cánceres hematológicos, neoplasias linfoides, tumores benignos y malignos y neoplasias malignas. El cáncer puede comprender tumores no sólidos o tumores sólidos. Los cánceres que pueden tratarse incluyen tumores que no están vascularizados, o que aún no están sustancialmente vascularizados, así también como tumores vascularizados.
Las células T modificadas y/o las composiciones farmacéuticas descritas en la presente pueden administrarse o utilizarse en organismos vivos, incluidos humanos y animales. El término "sujeto", tal como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier miembro del reino animal, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano.
Se conocen en la técnica procedimientos para aislar, modificar genéticamente y administrar células T a un sujeto en necesidad del mismo. En particular, las células T se aíslan de un mamífero (preferiblemente un humano), opcionalmente se expanden y/o activan como se describe en la presente y se transducen o transfectan con las moléculas de ácido nucleico de la divulgación. Las células T pueden ser autólogas con respecto al sujeto. En otro ejemplo, las células pueden ser alogénicas, singénicas o xenogénicas con respecto al sujeto.
Las células T modificadas se ser administradas ya sea solas o como una composición farmacéutica, como se describe en la presente. Las composiciones de la presente divulgación se formulan preferiblemente para administración intravenosa.
La administración de una "cantidad eficaz" de las células T modificadas y/o composiciones farmacéuticas se define como una cantidad eficaz, en las dosis y durante los períodos de tiempo necesarios para lograr el resultado deseado. Por ejemplo, una cantidad eficaz de una sustancia puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y el peso del individuo, y la capacidad de la proteína recombinante para provocar una respuesta deseada en el individuo. El régimen de dosificación puede ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, se pueden administrar varias dosis divididas diariamente o la dosis se puede reducir proporcionalmente de acuerdo con lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica.
Por ejemplo, las células T modificadas y/o las composiciones farmacéuticas descritas en la presente se pueden administrar en una dosis de 104 a 109 células por kg de peso corporal, opcionalmente 105 a 108 células por kg de peso corporal o 106 a 107 células por kg de peso corporal. La dosis se puede administrar una vez o varias veces.
Las células T modificadas y/o las composiciones farmacéuticas se pueden administrar mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero no limitado a, inhalación en aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implantación o trasplantación. Las células T modificadas y/o las composiciones farmacéuticas se pueden administrar a un sujeto por vía subcutánea, intradenal, intratumoral, intranodal, intrameduliar, intramuscular, mediante inyección intravenosa (i.v.) o intraperitoneal. Las células T modificadas y/o las composiciones farmacéuticas de las mismas se pueden inyectar directamente en un tumor, ganglio linfático o sitio de infección.
Como se utiliza en la presente, y como se entiende bien en la técnica, "tratar" o "tratamiento" es un enfoque para obtener resultados beneficiosos o deseados, incluyendo los resultados clínicos. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados pueden incluir, pero no se limitan a, alivio o mejora de uno o más síntomas o afecciones, disminución de la extensión de la enfermedad, estado estabilizado (es decir, no empeoramiento) de la enfermedad, prevención de la propagación de la enfermedad, retraso o desaceleración del progreso de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. En un ejemplo, "tratamiento" incluye prevenir una enfermedad o afección.
Tabla 1. Tabla de secuencias
La divulgación anterior describe en general la presente solicitud. Se puede obtener una comprensión más completa haciendo referencia a los siguientes ejemplos específicos. Estos ejemplos se describen únicamente con el propósito de ser ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la solicitud. Se contemplan cambios en la forma y sustitución de los equivalentes según las circunstancias lo sugieran o lo hagan conveniente. Aunque en la presente se han empleado términos específicos, dichos términos se pretenden en un sentido descriptivo y no tienen un propósito limitativo.
Los siguientes ejemplos no limitantes son ilustrativos de la presente solicitud.
Ejemplos
Ejemplo 1.
Antecedentes y sumario
Se desarrolló un acoplador de células T-antígeno trifuncional (ATA-Tri) para recapitular mejor la señalización natural a través del RCT, manteniendo al mismo tiempo la orientación sin restricciones del CMH. La activación de las células T se produce después de la ligación del CMH por el RCT y el correceptor de las células T (ya sea CD4 o CD8) uniéndose de forma simultánea a regiones conservadas dentro de la molécula del CMH (Yinet al.,2012) (Kuhns and Davis, 2012). Los correceptores están localizados específicamente dentro de "balsas lipídicas" (Fragosoet al.,2003) (Arcaroet al.,2000), microdominios de membrana que son particularmente importantes para la formación del complejo de señalización RCT (He and Marguet, 2008). Además de garantizar la localización correcta del microdominio del complejo de activación de RCT, estos correceptores también se unen directamente a Lck (Kimet al.,2003), una proteína cinasa que es crucial para la activación de las células T (Methiet al.,2005). (Acuto and Cantrell, 2000). Como se indicó anteriormente, ninguno de los receptores quiméricos o proteínas bifuncionales existentes se compromete con las moléculas correceptoras o Lck. Se creó una molécula en la que las regiones transmembranal e intracelular del correceptor CD4, que se localizan a la balsa lipídica y se unen a Lck, respectivamente, se fusionaron con un anticuerpo de cadena sencilla que se une a CD3 (UCHT1; SEQ ID NO: 13 y 14; la secuencia también es de dominio público). Esta construcción está diseñada para atraer a la molécula CD3 y el RCT hacia regiones de balsas lipídicas y acercar Lck al RCT, de manera similar a la unión natural del CMH. Para apuntar a este receptor quimérico, se vinculó un diseño de repetición de anquirina (PDRA) a la quimera CD4-UCHT1 para generar un acoplador de células T-antígeno trifuncional (ATA-Tri). En este caso específico, el PDRA era específico para el protooncogén erbB-2.
Se diseñaron células T humanas para expresar ya sea el prototipo ATA-Tri o un RAQ convencional con el mismo PDRA. Se determinó que, en todos los aspectos, las células T diseñadas con ATA-Tri demostraron una funcionalidad equivalente a la de un RAQ convencional. Interesantemente, respecto a 2 parámetros (producción de FNT-a y movilización de CD107a), se observó que el ATA-Tri era más activo que un RAQ convencional. Además, los datos muestran que, por molécula, el ATA-Tri muestra una actividad significativamente mejorada. Además, el ATA-Tri ofrece seguridad mejorada en comparación con los RAQ tradicionales, dado que no hay dominios de activación que formen parte de la proteína.
El RAQ tradicional es eficaz para estimular a las células T mediante la combinación de varios dominios de señalización (Figura 1C). En comparación, el ATA-Tri (Figura 1 A/B) no contiene ningún dominio de señalización propio. Se basa exclusivamente en facilitar las interacciones propuestas entre otros actores clave (que se muestran en gris) de manera dependiente del antígeno. Para probar esta hipótesis de diseño, se generaron diversas variantes de la longitud completa del ATA-Tri N-PDRA (Figura 1D).
Trabajo previo ha establecido la expresión consistente y significativa de las moléculas RAQ en la superficie celular. Se encontró que RAQ PDRA muestra una expresión robusta en la superficie (Figura 2). Por el contrario, ATA-Tri mostró una expresión mucho menor en la superficie. Esto se observó en todas las variantes que tenían el dominio UCHT1. Sin embargo, la variante ATA-Tri que carece del dominio UCHT1 mostró una expresión similar a la de RAQ PDRA en la superficie.
Las células T diseñadas para expresar el ATA-Tri, las variantes ATA-Tri o el RAQ PDRA se estimularon con antígeno unido a la placa. Las células T diseñadas para expresar ATA-Tri y RAQ PDRA podían elaborar todas las funciones medidas (producción de FNT-a, producción de IFN-y y movilización de CD107a) (Figura 3A y 3B). Se descubrió que la unión del ATA-Tri tanto a CD3 como al antígeno diana era fundamental para que las células T pudieran desarrollar sus funciones. En la Figura 3, se demuestra que la eliminación de UCHT1, que suprime la unión a CD3, anula la función del ATA-Tri. En otros datos, se determinó que la eliminación del PDRA del ATA-Tri también anula el funcionamiento.
Como se esperaba, cuando se analizó la citotoxicidad de estas células T, ATA-Tri - UCHT1 -PDRA no mostró capacidad para matar a células que expresan antígenos (Figura 4). N-PDRAATA-Tri mostró un alto nivel de citotoxicidad selectiva que era muy similar al RAQ-PDRA clásico. Interesantemente, las células T que expresan RAQ-PDRA parecen mostrar muerte fuera de la diana en altas proporciones de células T: células diana (véase muerte en D2F2 en la Figura 4), mientras que las células T que expresan ATA-Tri no mostraron estos efectos.
Experimental
La Figura 1 es una descripción general esquemática. (A) RepresentaATA-Tri N-PDRA. El dominio repetido de anquirina dirigido contra Her2 está fusionado con el fragmento variable de cadena única (Fvcs) UCHT1 utilizando un enlazador (G4S)3. Posteriormente, la Fvcs se une a la molécula CD4. CD4 contiene la región enlazadora y la región transmembranal, así como la región de anclaje citoplasmática. Las posibles interacciones se muestran en gris descolorido. (B) Representa el ATA Tri C-PDRA. En esta construcción, el Fvcs de UCHT1 se conmuta con el dominio PDRA. Las posibles interacciones se representan nuevamente en gris descolorido. (C) Modelo de un RAQ clásico de segunda generación. El dominio de direccionamiento de PDRA está unido mediante un enlazador CD8a al dominio transmembranal CD28. El dominio zeta CD3 con sus 3 motivos MABT activadores se conecta entonces a la porción citosólica de CD28. (D) Descripción general de los diversos controles ATA-Tri, que carecen del dominio de direccionamiento de PDRA, la fracción Fvcs de unión a CD3 o la fracción citosólica del dominio CD4.
La Figura 2 muestra el análisis de la expresión fenotípica en la superficie de las células T transducidas con histogramas de las respectivas variantes de ATA-Tri. Las células T se habían incubado con Her2Fc, que luego se detectó mediante citometría de flujo. Los datos presentados se seleccionaron en linfocitos CD8+. Las puertas mostradas se eligieron en función del control no transducido.
La Figura 3 es un análisis funcional de células T diseñadas. En (A), las células se estimularon durante 4 horas con Her2Fc unido a la placa en medios que contenían GolgiPlug™. Las células se tiñeron primero para CD8+, luego se permeabilizaron y se analizaron para determinar la producción de FNT-a e IFN-y. Las puertas iniciales se establecieron para los linfocitos singletes CD8+. Las puertas mostradas se configuraron en función del control no transducido. En B), como anteriormente, las células se estimularon con Her2Fc unido a la placa. El medio incluía GolgiPlug™ así como un anticuerpo anti-CD107a. Se esperaba que las células que se degranulaban activamente tuvieran una tasa más alta de reciclamieno de CD107a y, subsecuentemente, mostraran una señal más alta para anti-CD107a.
La Figura 4 muestra la citotoxicidad de células T diseñadas. Se sembraron en placas dos líneas tumorales adherentes distintas de ratón 24 horas antes de la adición de las células T. D2F2/E2 han sido diseñados para expresar Her2 humano, mientras que D2F2 no lo hace. Se agregaron las proporciones indicadas de células T a los pocillos que contenían tumores. Las células tumorales se incubaron durante 6 h con células T. Posteriormente, las células T se eliminaron mediante lavado. Se añadió medio que contenía azul de Alamar al 10% a cada pocillo durante 3 horas. La actividad metabólica, como indicador de la supervivencia celular, se determinó mediante análisis de puntos finales. Los pocillos sin células T se definieron como de máxima capacidad de supervivencia/actividad metabólica y se establecieron en 100%, mientras que los medios incubados sin células se establecieron en 0% de actividad metabólica. Los datos presentados son el promedio de 3 réplicas.
Discusión
El uso de receptores quiméricos para redirigir las células T hacia dianas específicas de manera independiente al CMH es un método atractivo para tratar el cáncer y puede ser aplicable a enfermedades infecciosas en las que se encuentran antígenos del patógeno en la membrana plasmática. El receptor quimérico podría dar como resultado: (1) citotoxicidad específica contra las células diana y (2) toxicidad mínima fuera de la diana. Los RAQ convencionales están limitados en este respecto porque dependen de una estructura sintética donde los dominios de señalización están ubicados en posiciones no naturales donde pueden no recibir una regulación adecuada y, por lo tanto, hay un control celular reducido de una actividad específica.
El ATA-Tri fue diseñado para redirigir los componentes de señalización del RCT natural sin emplear localización ectópica de dominios de señalización. El ATA-Tri fue diseñado con los siguientes principios: (1) el receptor quimérico debe de interactuar y facilitar el ensamblaje ordenado de complejos de proteínas que son clave para la activación, (2) el receptor quimérico debe de tomar ventaja de las adaptaciones celulares preexistentes, como entornos de microdominios y (3) el receptor quimérico no debe poseer cualquier dominio de activación. El ATA-Tri es capaz de lograr esto de manera eficiente y, como lo demuestran los datos, a tasas de activación que son iguales, si no mejores, que las de un RAQ de segunda generación.
Por lo tanto, este ATA-Tri es ideal para una mayor integración con correceptores diseñados adicionales para afinar aún más la activación de las células T En última instancia, esto debería conducir a una gran reducción de los efectos fuera de la diana sin comprometer la citotoxicidad dirigida. ATA-Tri parece exhibir una toxicidad menor que los RAQ existentes. Los RAQ PDRA muestran una muerte leve fuera de la diana en proporciones altas de la célula a la diana, lo que puede resultar problemático cuando se utilizan en terapias. Sin embargo, ATA-Tri, que es tan funcional como el RAQ tradicional, no mostró efectos fuera de la diana. Dado que las PDRA se unen a las dianas con alta afinidad, los efectos fuera de la diana pueden ser más comunes en células que expresan altos niveles de un receptor quimérico que emplea un PDRA. Por lo tanto, sin estar limitado por ninguna teoría, la baja expresión en la superficie del ATA-Tri puede ser ventajosa ya que reduce la probabilidad de tales efectos fuera de la diana.
En última instancia, la naturaleza modular de la tecnología ATA-Tri permite un ajuste mucho más sofisticado del proceso de activación de las células T. Por ejemplo, el reclutamiento del complejo RCT podría modularse mediante el diseño de moléculas ATA-Tri con una menor afinidad por CD3. Esto podría utilizarse para imitar la baja afinidad natural del RCT (Chervinet al.,2009) manteniendo al mismo tiempo un dominio de direccionamiento de alta afinidad para detectar dianas de cáncer. A diferencia del RAQ clásico, la tecnología ATA-Tri puede diseñarse para parecerse más a esto.
En conclusión, la tecnología ATA-Tri presentada es una herramienta molecular altamente eficiente que es capaz de (1) desencadenar eficientemente la activación y citotoxicidad de las células T, (2) es capaz de hacerlo imitando la activación natural de las células T y (3) no requiere dominios de activación propios.
Ejemplo 2. Caracterización de la tecnología ATA-Tri
En la Figura 5 se proporciona una descripción general de la tecnología ATA-Tri.
La Figura 5A muestra un ejemplo de activación de células T CD8 basada en el coensamblaje de diferentes receptores y sus proteínas asociadas. Inicialmente, el complejo mayor de histocompatibilidad I presenta un antígeno (hélice). Esto es reconocido por un complejo receptor de células T (RCT) capaz de unirse al antígeno. El complejo RCT contiene varias subunidades individuales. Los dominios a/p pueden interactuar directamente con el antígeno presentado en el CMH-I. Los dominios a/p luego interactúan con otros varios dominios (£, y, 5 y Z), todos los cuales participan en la activación de las células T a través de varios dominios de activación intracelular. El complejo RCT interactúa con el CMH-I al mismo tiempo que el correceptor CD8. El correceptor CD8 se une al CMH-I de manera independiente al antígeno. CD8 interactúa directamente con Lck, una proteína quinasa importante para la activación del complejo del receptor RCT. La interacción CD8 y Lck también asegura su asociación con los microdominios de balsas lipídicas (porción de membrana), que, de acuerdo con la hipótesis, organizan y encapsulan otras fracciones de la señalización relevantes (esferas oscuras). Las etapas posteriores de activación conducen al reclutamiento de CD28. Si esta cascada de interacciones se produce varias veces en paralelo, las células T se activan y son capaces de ejercer sus efectos citotóxicos.
La Figura 5B proporciona una descripción general de los Receptores de Antígenos Quiméricos (RAQ). Los RAQ buscan reproducir el complejo mecanismo de activación de las células T al combinar varios dominios de activación clave, tales como Z y CD28, en una única molécula diseñada sintéticamente. Luego, el RAQ interactúa directamente con un antígeno de elección utilizando dominios de unión específicos. Aquí se muestra una proteína con repeticiones de anquirina (PDRA). Se cree que varias de estas interacciones que ocurren en paralelo conducen a la activación de las células T.
La Figura 5C representa moléculas tipo las comprometedoras de células T biespecíficas (CTBi) que involucran a las células T entrecruzando directamente el complejo RCT con un antígeno de elección. La molécula tipo CTBi que se muestra aquí contiene dos dominios de unión. La fracción PDRA interactúa con el antígeno diana. El dominio de fragmento variable de cadena sencilla (Fvcs) se une al complejo RCT a través de su dominio épsilon. Varios de estos entrecruzamientos que ocurren en paralelo conducen a la activación de las células T.
La Figura 5D es una descripción general de la tecnología ATA que imita el proceso de activación natural. El acoplador de células T al antígeno (ATA) es capaz de unirse a su antígeno a través del dominio de unión PDRA. Luego, PDRA se une a un Fvcs capaz de unirse al dominio épsilon del complejo RCT. El ATA luego se asocia con el dominio transmembranal y citosólico CD4. CD4, al igual que CD8, interactúa con Lck y está situado en balsas lipídicas. Por tanto, los ATA combinan el reclutamiento de RCT con la estimulación del correceptor. Sin estar limitado por ninguna teoría, se cree que varias de estas interacciones que ocurren en paralelo conducen a la activación de las células T.
Son posibles diferentes configuraciones de la molécula ATA. La Figura 6A muestra un modelo de la molécula ATA en configuración 1. Los dominios de CD4-cola, transmembranal y enlazador están combinados con la Fvcs específica de RCT-épsilon (UCHT1). Luego, la Fvcs se une al dominio de unión al antígeno. Este dominio es intercambiable. En esta propuesta, los dominios de unión al antígeno utilizados son ya sea un dominio Fvcs o PDRA específicos para el antígeno Her2. La Figura 6B muestra una molécula ATA en configuración 2. Aquí, los dominios CD4 interactúan primero con el dominio de unión al antígeno. Luego, este dominio se une al dominio de reclutamiento Fvcs de RCT (UCHT1).
La Figura 7 muestra la funcionalidad de ATACD4 Fvcs. La Figura 7A es un histograma que muestra la expresión en la superficie del receptor ATA CD4 Fvcs en relación con el vector vacío. Las células se tiñeron utilizando un antígeno FcHer2, que a su vez se detectó utilizando anticuerpos marcados con fluorescencia. La Figura 7B muestra la activación específica al antígeno de las células T que expresan ATA CD4 Fvcs (arriba) o RAQ Fvcs (abajo). Las células T que expresan ya sea ATA CD4 Fvcs (arriba) o RAQ Fvcs (abajo) se incubaron con antígeno Her2 unido a la placa. Ambas células modificadas mostraron activación específica por el antígeno. El control negativo de DMSO no mostró actividad (datos no mostrados). La Figura 7C muestra la muerte comparable de la línea celular tumoral humana MCF-7 (Her2 positiva) tanto por ATA CD4 Fvcs como por RAQ Fvcs. Tanto ATA CD4 Fvcs como RAQ Fvcs se incubaron con la línea celular tumoral humana MCF-7 (Her2 positiva) y se compararon con un vector vacío de control.
La Figura 8 es una caracterización de la configuración 2 de ATA-CD4. La Figura 8A es un histograma de la configuración 2 de ATA-CD4 PDRA en relación con el vector de control. La expresión en la superficie se sondeó con el antígeno modificado FcHer2. Las células que expresan la configuración 2 de ATA-CD4 muestran un claro aumento en la unión de FcHer2, lo que demuestra una alta expresión en la superficie del receptor. Para mayor claridad, se muestra el modelo configuración 2 de ATACD4. La Figura 8B muestra células T diseñadas con configuración 2 de ATA PDRA expuestas al antígeno Her2 unido a la placa. Se midieron la producción de citoquinas y la degranulación. Los datos muestran que la configuración 2 de ATA PDRA es un receptor funcional. El tratamiento sin antígeno no mostró activación de células T (datos no mostrados). La Figura 8C muestra el crecimiento de configuración 2 de ATA PDRA en relación con el vector vacío de control. Las células se crecieron en 100 u/ml de IL2 y 10 ng/ml de IL7. A partir de 100,000 células, se monitoreó el crecimiento contando muestras de cultivo a intervalos predeterminados. La configuración 2 tiene una tasa de crecimiento marcadamente reducida en relación con el control.
La Figura 9 muestra la funcionalidad de la configuración 1 de ATACD4 PDRA. La Figura 9A muestra la expresión en la superficie de ATA CD4 PDRA (rojo) en comparación con RAQ PDRA (verde) y el control de solamente RFCN (azul). Las células se sondaron con el antígeno FcHer2 específico del receptor. El histograma muestra que ATACD4 PDRA se expresa bien en la superficie. Sin embargo, su expresión máxima en la superficie es menor en comparación con la construcción de RAQ. La Figura 9B muestra el crecimiento de la configuración 1 de ATACD4. Durante dos semanas se controló el crecimiento del cultivo mediante muestreo y conteo manual de células. El vector vacío muestra un crecimiento similar al de RAQ PDRA. Sin embargo, ATA tiene una reducción en el crecimiento en comparación. Las Figuras 9C y 9D muestran el porcentaje de células positivas para diversos marcadores de activación y degradación. El vector vacío, CD4 PDRA y RAQ PDRA se incubaron con el antígeno Her2 unido a la placa o con el control de DMSO. Los resultados de tres experimentos separados se resumen utilizando el software de análisis estadístico SPICE. El gráfico de dispersión muestra el porcentaje de células positivas para un conjunto de marcadores de activación. ATA-CD4 muestra un mayor porcentaje de células, positivo para marcadores de degranulación. Las células RAQ PDRA son positivas para una variedad de marcadores de activación sin una población significativamente enriquecida de marcadores de degranulación. El gráfico circular representa los mismos datos. Este demuestra que ATA-CD4 tiene una población notablemente mayor de células centradas en la degranulación. ATA-CD4 tiene una mayoría de células activadas desgranuladas con varios niveles de producción de citoquinas. Sin embargo, los RAQ muestran un patrón de activación distribuido más aleatoriamente y la degranulación constituye menos del 50% de la población total. El patrón puede ser indicativo de una activación de células T menos controlada por los RAQ.
La Figura 10 muestra la citotoxicidad y la actividad general de ATA y RAQ. Las células diseñadas con ATA, RAQ o el vector vacío de control se incubaron con varias líneas de células tumorales humanas. MDA MB 231, SK OV 3 y A549 expresan el antígeno Her2. LOXIMVI es Her2 negativa. Se observó que, en todos los casos, ATA muestra una citotoxicidad mejorada. La línea celular LOCIMVI negativa al antígeno no está siendo el objetivo, lo que respalda que la citotoxicidad es específica al antígeno.
La Figura 11 muestra la expresión en la superficie del receptor y la activación de varios controles ATA. En la Figura 11A se muestra la expresión en la superficie celular (izquierda), la degranulación (centro) y la producción de citoquinas (derecha). Se crearon construcciones que carecían de dominios específicos para determinar la importancia de estos dominios. De arriba hacia abajo se eliminaron los siguientes dominios: Dominio de unión al antígeno PDRA y Dominio de unión a RCT UCHT1, con el ATA de longitud completa en la parte inferior. La expresión en la superficie de ATA sin el dominio UCHT1 dio como resultado una expresión mejorada en la superficie en relación con el ATACD4 de longitud completa. La mutante negativa para PDRA no se pudo detectar utilizando el antígeno FcHer2. La degranulación (centro) sólo se observó en el ATA de longitud completa. La deleción de UCHT1 y PDRA no produjo degranulación. De manera similar, la producción de citoquinas solo se observó en el ATA de longitud completa. La Figura 11B muestra la línea celular de ratón D2F2 diseñada para expresar el antígeno Her2 humano (D2F2/E2). Ambas líneas celulares se incubaron con células T diseñadas con ATA-CD4 de longitud completa o sus variantes con deleciones. Los datos muestran el punto final de proporción Efector a la Diana 4:1. Solamente el ATA-CD4 de longitud completa fue capaz de provocar una respuesta citotóxica. Esto demuestra que los dominios PDRA y UCHT1 están involucrados en la función del receptor.
La Figura 12 muestra propiedades de diversas variantes de ATA transmembranales. La Figura 12A es una descripción general de las diversas construcciones transmembranales. El primer conjunto de variantes carece del dominio citosólico. Al ATA CD4 -citosol se le ha eliminado todo el dominio citosólico. La construcción sintética tiene el CD4 TM reemplazado por un dominio de membrana diseñado, altamente hidrofóbico. La variante de glicoforina reemplaza el dominio transmembranal CD4 con el dominio transmembranal de glicoforina. La variante de anclaje GPI utiliza la señal GPI de CD48 secuenciada para unir el ATA a la membrana utilizando el anclaje GPI. La variante Ata CD8A reemplazó el dominio CD4 transmembranal y citosólico con la contraparte CD8a. La Figura 12B muestra que las células T CD8 purificadas se diseñaron con las diversas construcciones. Se muestra la expresión en la superficie de los diversos receptores en relación con el ATA de longitud completa. Todos los datos son relativos a la intensidad fluorescente media del control. Todas las variantes tienen una expresión en la superficie del receptor significativamente menor en comparación con el ATA-CD4 de longitud completa. La variante ATA de anclaje GPI no es detectable por encima del fondo. La Figura 12C representa pruebas de las diferentes variantes para la degranulación y la producción de citoquinas. Las células se incubaron con antígeno Her2 unido a la placa. La actividad se presenta como porcentaje de células positivas para el marcador de degranulación CD107a (gráfica de barras izquierda) o el porcentaje de todas las células productoras de citoquinas tomadas en conjunto (FNTa, IFNg y FNTa/IFNg, gráfica de barras derecha). Las variantes de anclaje GPI o cD8a muestran niveles de fondo de degranulación y producción de citoquinas. Las variantes ATA de glicoforina, sintéticas y -citosol muestran un nivel moderado de degranulación y un nivel bajo de producción de citoquinas. En todos los casos, la actividad está muy por debajo de ATA-CD4 de longitud completa. En conjunto, esto muestra que el anclaje de ATA sin su dominio citosólico conduce a receptores funcionales con una actividad disminuida.
La Figura 13 muestra la interacción de Lck con variantes de ATA. En la Figura 13A, el antígeno Her2 estaba unido covalentemente a perlas magnéticas. Se diseñaron células 293TM para expresar tanto ATA como la variante de deleción citosólica de ATA, así como Lck. Las perlas se incubaron con lisados celulares durante la noche y posteriormente se lavaron y se sometieron a transferencia tipo Western. Lck se detectó utilizando un anticuerpo Lck, los ATA se detectaron mediante un anticuerpo Myc. Se utilizó actina-b como control. La actina-b no fue llevada hacia abajo y solamente se detectó en el sobrenadante (S). Sin embargo, tanto ATA de longitud completa como la deleción citosólica se llevaron hacia abajo y se detectaron de manera eficiente en la fracción del pellet (B). Los vectores de control y ATA sin dominio citosólico muestran niveles comparables de señal de Lck de fondo. Sin embargo, ATA CD4 de longitud completa muestra un nivel significativo de Lck relativo a la cantidad total. La Figura 13B muestra el análisis de densitometría de Lck detectada en el pellet. La señal se corrigió relativa al control negativo. Estos datos respaldan que Lck puede interactuar con ATA-CD4 de longitud completa.
En la Figura 14, la expresión y actividad en la superficie de ATA CD4 se compara con una variante similar a CTBi. La Figura 14A muestra solamente el control RFCN (izquierda), ATA CD4 (centro) y la variante tipo CTBi (derecha). La expresión en la superficie se probó utilizando el marcador de transducción RFCN y el antígeno Her2. ATA muestra una expresión mucho menor en la superficie en comparación con los CTBi. En particular, CTBi parece secretar suficientes anticuerpos de acoplamiento para permitir la transducción de las células negativas (RFCN-) para mostrar una fuerte expresión del receptor. Tanto la producción como la degranulación de citoquinas son mayores en las células tipo CTBi en comparación con las células diseñadas con ATA. La Figura 14B compara la citotoxicidad en diversas líneas celulares positivas para Her2 (MDA MB 231, SK OV 3, A549). A diferencia de la producción de citoquinas, las células diseñadas ATA muestran una actividad citotóxica significativamente mayor.
La Figura 15 muestra una comparación de ATA CD4 WT con una biblioteca de mutágenos aleatorios de UCHT1. Para probar la capacidad de cambiar las propiedades de ATA, se mutaron individualmente 24 aminoácidos que se encuentran en la superficie de unión de UCHT1 y RCT épsilon. Esto da lugar a un número teórico de 480 clonas únicas, todos los cuales deberían estar representados en esta biblioteca aleatoria. La Figura 15A muestra la representación esquemática de la mutante. Los marcajes indican las mutaciones, de las cuales se encuentran todas en la interfaz Fvcs-épsilon. La figura F5B es un histograma de la expresión en la superficie. Las células diseñadas se sondaron con antígeno FcHer2 para detectar el receptor expresado en la superficie. La biblioteca muestra una expresión mucho mayor del receptor en la superficie. La Figura 15C muestra células WT y ATA CD4 de la Biblioteca incubadas con antígeno unido a la placa. Se presenta su capacidad para activar y producir citoquinas. La biblioteca tiene una actividad similar a la de la WT. Sin estar limitado por ninguna teoría, esto respalda la idea de que las propiedades de expresión de ATA pueden mejorarse conservando al mismo tiempo el perfil funcional original alterando el dominio Fvcs.
La Figura 16 muestra la expresión mejorada en la superficie de la mutante A85V, T161P. La biblioteca se propagó durante un período prolongado de tiempo para seleccionar mutantes con una ventaja de crecimiento sobre la WT. Se analizó una mutante seleccionada (A85V, T161P; la numeración se basa en el fragmento del dominio UCHT1). La Figura 16A muestra células mononucleares de sangre periférica (CMSP) que se diseñaron con ATA-CD4 WT o con la mutante A85V, T161P Se comparan las poblaciones finales de CD4/CD8 entre ATA CD4 (izquierda) y la mutante A85V, T161P (derecha). En particular, ATA-CD4 WT conduce a una población reducida de células CD4 positivas. Este efecto no se observa en las células mutantes. La Figura 16B muestra la expresión en la superficie, determinada por el generador de transducción de RFCN y la positividad de FcHer2, e indica una expresión mejorada en la superficie de la mutante A85V, T161P. La Figura 16C muestra que la producción de citoquinas mutantes A85V, T161P está disminuida (los controles de DMSO no mostraron actividad, no se muestran los datos). La degranulación entre ATA WT y la mutante A85V, T161P es comparable.
La Figura 17 muestra la citotoxicidad y el crecimiento de la mutante A85V, T161P. En la Figura 17A, se incubaron células T diseñadas con ATA CD4 WT y la mutante A85V, T161P con las líneas celulares positivas para el antígeno Her2 SK OV 3, MDA MB 231 y A549. En todos los casos, la mutante mostró un nivel reducido de citotoxicidad; en el caso de A549 no se detectó citotoxicidad. En la Figura 17B, se monitoreó durante dos semanas el crecimiento celular en cultivo comenzando con 100 000 células. Periódicamente se tomaron muestras y se contaron las células manualmente. La mutante A85V, T161P muestra un crecimiento notablemente mejorado en comparación con la variante WT. En conjunto, esto demuestra que es probable que la biblioteca contenga varias mutantes que permitan la modificación y optimización de varias funciones At a . Por tanto, UCHT1 se puede utilizar como modulador funcional.
Si bien la presente solicitud se ha descrito con referencia a lo que actualmente se consideran ejemplos preferidos, se debe de entender que la solicitud no se limita a los ejemplos divulgados. La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.
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Claims (14)
1. Un ácido nucleico que comprende:
a. un primer polinucleótido que codifica para un ligando específico para la diana en el que el ligando específico para la diana se une a un antígeno tumoral;
b. un segundo polinucleótido que codifica para un ligando que se une a una proteína CD3 asociada con el complejo RCT; y
c. un tercer polinucleótido que codifica para un dominio polipeptídico correceptor de células T que comprende un dominio citosólico CD4 y un dominio transmembranal CD4;
en el que los componentes (a), (b) y (c) del acoplador de células T al antígeno codificado por el ácido nucleico están fusionados directamente entre sí o unidos mediante al menos un enlazador y el ácido nucleico no codifica para un dominio de activación.
2. El ácido nucleico de la reivindicación 1, en el que el ligando específico para la diana es un polipéptido diseñado con repetición de anquirina (PDRA) o Fvcs.
3. El ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el ligando que se une a una proteína asociada con el complejo RCT es un anticuerpo de cadena sencilla o UCHT1, o una variante del mismo.
4. El ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el primer polinucleótido y el tercer polinucleótido están fusionados con el segundo polinucleótido.
5. El ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el segundo polinucleótido y el tercer polinucleótido están fusionados con el primer polinucleótido.
6. Un polipéptido codificado por el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que en el polipéptido los componentes (a), (b) y (c) están fusionados directamente entre sí o unidos mediante al menos un enlazador.
7. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
8. Un vector de construcción que comprende:
a. un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; y
b. un promotor funcional en una célula de mamífero.
9. El vector de construcción de la reivindicación 8, en el que el primer polinucleótido y el tercer polinucleótido están fusionados al segundo polinucleótido para proporcionar una fusión del acoplador de células T al antígeno y la secuencia codificante de la fusión del acoplador de células T al antígeno está conectada operativamente al promotor.
10. El vector de construcción de la reivindicación 8, en el que el segundo polinucleótido y el tercer polinucleótido están fusionados al primer polinucleótido para proporcionar una fusión del acoplador de células T al antígeno y la secuencia codificante de la fusión del acoplador de células T al antígeno está conectada operativamente al promotor.
11. Una célula T aislada que expresa el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o transfectada con el vector de construcción de una cualquiera de las reivindicaciones 8-10.
12. Una composición farmacéutica que comprende a la célula T de la reivindicación 11 y un vehículo.
13. El ácido nucleico de la reivindicación 1, en el que el segundo polinucleótido comprende una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 24.
14. El ácido nucleico de la reivindicación 1, en el que el tercer polinucleótido comprende una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO: 17.
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