CN113388629A - 三功能t细胞抗原偶联物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本申请涉及三功能T细胞抗原偶联物及其制备方法和用途。提供了三功能分子，其包含靶标特异性配体、结合与TCR复合体相关的蛋白的配体和T细胞受体信号传导结构域多肽。具有该新型受体的工程化T细胞引起许多T细胞功能的抗原特异性激活，包括细胞因子产生、细胞脱颗粒和细胞溶解。

Description

三功能T细胞抗原偶联物及其制备方法和用途

本申请是申请日为2015年02月06日，申请号为201580007473.7，发明名称为“三功能T细胞抗原偶联物及其制备方法和用途”的申请的分案申请。

相关申请

本申请要求于2014年2月7日提交的美国临时专利申请第61/936,906号的优先权，所述临时专利申请的内容据此通过引用整体并入。

领域

本公开涉及通过具有针对特定靶细胞的高细胞毒性和降低的脱靶毒性的工程化T细胞来治疗癌症的方法。具体地，本公开涉及表达模拟自然的T细胞活化过程的新型生物制剂的工程化T细胞。

发明背景

癌症是主要的健康挑战，其中仅在2013年，在加拿大预期诊断出超过150,000例癌症。虽然患有早期疾病的患者可以通过常规疗法(外科手术、辐射、化疗)进行有效地治疗，但患有晚期疾病的患者可利用的选择很少，并且那些选择在本质上通常为缓和性的。主动免疫疗法寻求采用患者的免疫系统来清除肿瘤种植并且为常规疗法失效的患者提供令人激动的选择(Humphries,2013)。事实上，若干临床研究已经证明T细胞的免疫疗法在患有晚期黑素瘤的患者中可以为有疗效的，从而证实了该方法的效用(Humphries,2013)。此外，罹患慢性淋巴细胞白血病(CLL)和急性淋巴细胞白血病(ALL)的患者也用T细胞免疫疗法得到有效治疗和治愈(Fry和Mackall,2013)(Kochenderfer和Rosenberg,2013)。虽然存在若干免疫治疗方法，但具有嵌合受体的工程化T细胞使任何患者的免疫细胞以主要组织相容性复合体(MHC)独立性方式靶向任何期望靶标。迄今为止，用于工程化T细胞的嵌合受体由以下组成：靶向结构域，通常为单链可变片段(scFv)；跨膜结构域；和胞质结构域，其含有来自T细胞受体的信号传导元件和相关蛋白(Dotti等人,2009)。此类嵌合受体已被称为“T体(T-body)”、“嵌合抗原受体”(CAR)或“嵌合免疫受体”(CIR)-目前，大多数研究人员使用术语“CAR”(Dotti等人,2009)。这些CAR以模块化术语被考虑并且科学家已经花费了相当长的时间研究不同的细胞质信号传导结构域对CAR功能的影响。第一代CAR采用来自CD3ζ或FcεRIγ的单个信号传导结构域。第二代CAR将CD3ζ的信号传导结构域与来自CD28或TNFR家族受体的共刺激受体的细胞质结构域组合(Dotti等人,2009)。第三代CAR组合了多个共刺激结构域，但存在担忧的是：第三代CAR可能失去抗原特异性(Han等人,2013)。在临床中试验的大多数CAR-工程化的T细胞采用第二代CAR，其中CD3ζ与CD28或CD137的细胞质结构域偶联(Han等人,2013)(Finney等人,2004)(Milone等人,2009)。

虽然CAR-工程化的T细胞已经显示出临床应用的相当大的希望，但是它们依赖合成方法来替代T细胞受体(TCR)提供的激活信号。由于该合成受体不递送所有与TCR相关的信号传导组分(例如CD3ε、Lck)，所以仍不清楚的是，T细胞是否被CAR以最佳方式激活或者CAR活化如何影响T细胞分化(例如进展至记忆T细胞)。而且，由于CAR信号传导结构域通过CAR结构的特有性质从它们的天然调控伴侣分离，所以还存在这样的固有风险：CAR可导致低水平的组成型激活，这可产生脱靶毒性。

考虑到这些局限性，优选的是重定向T细胞以经由其天然的TCR攻击肿瘤。为此，构建了一类被称为“双特异性T细胞衔接器”(BiTE)的重组蛋白(Chames和Baty,2009)(Portell等人,2013)。这些蛋白采用双特异性抗体片段以将T细胞TCR受体与靶抗原交联。这导致T细胞有效激活，从而触发细胞毒性。类似地，已产生实现该目标的双特异性抗体并且一些科学家采用化学连接将抗-CD3抗体与肿瘤特异性抗体简单地连接(Chames和Baty,2009)。虽然这些双特异性蛋白已在体外显示出一些活性，但GMP产生、短的生物半衰期和生物利用度代表这些分子在癌症治疗中成功使用的重大挑战。此外，这些分子也不能正确地重现天然的TCR信号传导，因为它们未使TCR共受体(CD8和CD4)参与。

因此，与传统的CAR相比，仍需要具有增强的活性和安全性的T细胞抗原偶联物。

发明概述

本发明人已经证明，与传统的嵌合抗原受体相比，三功能T细胞抗原偶联物具有增强的活性和安全性，所述三功能T细胞抗原偶联物通过T细胞受体(TCR)更好地模拟了天然的信号传导，同时保留了主要组织相容性复合体的不受限制的靶向。

因此，本公开的一个方面提供了核酸，其包含：

a.第一多核苷酸，其编码靶标特异性配体；

b.第二多核苷酸，其编码结合与TCR复合体相关的蛋白的配体；以及

c.第三多核苷酸，其编码T细胞受体信号传导结构域多肽。

本公开的另一方面提供了由上文所述的核酸编码的多肽。

本公开的另一方面提供了包含上文所述的核酸的表达载体。

本公开的另一方面提供了表达上文所述的核酸的T细胞。本公开的另一方面提供了包含T细胞和载体的药物组合物。

本公开还提供了T细胞在有需要的对象中治疗癌症的用途，其中所述T细胞表达核酸，其包含：

a.第一多核苷酸，其编码靶标特异性配体；

b.第二多核苷酸，其编码结合与TCR复合体相关的蛋白的配体；以及

c.第三多核苷酸，其编码T细胞受体信号传导结构域多肽。

在一个实施方案中，靶标特异性配体结合癌细胞上的抗原。

在另一实施方案中，靶标特异性配体为设计的锚蛋白重复(DARPin)多肽或scFv。

在另一实施方案中，与TCR复合体相关的蛋白为CD3。

在另一实施方案中，结合与TCR复合体相关的蛋白的配体为单链抗体。

在另一实施方案中，结合与TCR复合体相关的蛋白的配体为UCHT1或其变体。

在另一实施方案中，T细胞受体信号传导结构域多肽包含胞质结构域和跨膜结构域。

在另一实施方案中，胞质结构域为CD4胞质结构域并且跨膜结构域为CD4跨膜结构域。

在另一实施方案中，第一多核苷酸和第三多核苷酸与第二多核苷酸融合。

在另一实施方案中，第二多核苷酸和第三多核苷酸与第一多核苷酸融合。

本公开还提供了载体构建体，其包含：

a.第一多核苷酸，其编码靶标特异性配体；

b.第二多核苷酸，其编码结合与TCR复合体相关的蛋白的配体；以及

c.第三多核苷酸，其编码T细胞受体信号传导结构域多肽，和

d.在哺乳动物细胞中有功能的启动子。

在一个实施方案中，第一多核苷酸和第三多核苷酸与第二多核苷酸融合以提供T细胞抗原偶联物的融合物并且T细胞抗原偶联物的融合物的编码序列与启动子可操作地连接。

在另一实施方案中，第二多核苷酸和第三多核苷酸与第一多核苷酸融合以提供T细胞抗原偶联物的融合物并且T细胞抗原偶联物的融合物的编码序列与启动子可操作地连接。

本公开还提供了用载体构建体转染的分离的T细胞。

本申请提供了以下内容：

1.核酸，其包含：

a.第一多核苷酸，其编码靶标特异性配体；

b.第二多核苷酸，其编码结合与TCR复合体相关的蛋白的配体；以及

c.第三多核苷酸，其编码T细胞受体信号传导结构域多肽。

2.如项目1所述的核酸，其中所述靶标特异性配体结合肿瘤抗原。

3.如项目1或2所述的核酸，其中所述靶标特异性配体为设计的锚蛋白重复(DARPin)多肽或scFv。

4.如项目1-3中任一项所述的核酸，其中所述与TCR复合体相关的蛋白为CD3。

5.如项目1-4中任一项所述的核酸，其中所述结合与TCR复合体相关的蛋白的配体为单链抗体。

6.如项目1-5中任一项所述的核酸，其中所述结合与TCR复合体相关的蛋白的配体为UCHT1或其变体。

7.如项目1-6中任一项所述的核酸，其中所述T细胞受体信号传导结构域多肽包含胞质结构域和跨膜结构域。

8.如项目7所述的核酸，其中所述胞质结构域为CD4胞质结构域并且所述跨膜结构域为CD4跨膜结构域。

9.如项目1-8中任一项所述的核酸，其中所述第一多核苷酸和第三多核苷酸与所述第二多核苷酸融合。

10.如项目1-8中任一项所述的核酸，其中所述第二多核苷酸和第三多核苷酸与所述第一多核苷酸融合。

11.多肽，其由项目1-10中任一项所述的核酸编码。

12.表达载体，其包含项目1-10中任一项所述的核酸。

13.T细胞，其表达项目1-10中任一项所述的核酸。

14.载体构建体，其包含：

a.第一多核苷酸，其编码靶标特异性配体；

b.第二多核苷酸，其编码结合与TCR复合体相关的蛋白的配体；以及

c.第三多核苷酸，其编码T细胞受体信号传导结构域多肽，和

d.在哺乳动物细胞中有功能的启动子。

15.如项目14所述的载体构建体，其中所述第一多核苷酸和第三多核苷酸与所述第二多核苷酸融合以提供T细胞抗原偶联物的融合物并且所述T细胞抗原偶联物的融合物的编码序列与所述启动子可操作地连接。

16.如项目14所述的载体构建体，其中所述第二多核苷酸和第三多核苷酸与所述第一多核苷酸融合以提供T细胞抗原偶联物的融合物并且所述T细胞抗原偶联物的融合物的编码序列与所述启动子可操作地连接。

17.如项目14-16中任一项所述的载体构建体，其中所述靶标特异性配体结合肿瘤抗原。

18.如项目14-17中任一项所述的载体构建体，其中所述靶标特异性配体为设计的锚蛋白重复(DARPin)多肽或scFv。

19.如项目14-18中任一项所述的载体构建体，其中所述与TCR复合体相关的蛋白为CD3。

20.如项目14-19中任一项所述的载体构建体，其中所述结合与TCR复合体相关的蛋白的配体为单链抗体。

21.如项目14-20中任一项所述的载体构建体，其中所述结合与TCR复合体相关的蛋白的配体为UCHT1或其变体。

22.如项目13-21中任一项所述的载体构建体，其中所述T细胞受体信号传导结构域多肽包含胞质结构域和跨膜结构域。

23.如项目22所述的载体构建体，其中所述胞质结构域为CD4胞质结构域并且所述跨膜结构域为CD4跨膜结构域。

24.如项目14-23中任一项所述的载体构建体，其中所述第一多核苷酸和第三多核苷酸与所述第二多核苷酸融合。

25.分离的T细胞，其用项目14-24中任一项所述的载体构建体转染。

26.药物组合物，其包含项目13或25所述的T细胞和载体。

27.T细胞在有需要的对象中治疗癌症的用途，其中所述T细胞表达如下核酸，其包含：

a.第一多核苷酸，其编码靶标特异性配体；

b.第二多核苷酸，其编码结合与TCR复合体相关的蛋白的配体；以及

c.第三多核苷酸，其编码T细胞受体信号传导结构域多肽。

28.如项目27所述的用途，其中所述靶标特异性配体结合癌细胞上的抗原。

29.如项目27或28所述的用途，其中所述靶标特异性配体为设计的锚蛋白重复(DARPin)多肽或scFv。

30.如项目27-29中任一项所述的用途，其中所述与TCR复合体相关的蛋白为CD3。

31.如项目27-30中任一项所述的用途，其中所述结合与TCR复合体相关的蛋白的配体为单链抗体。

32.如项目27-31中任一项所述的用途，其中所述结合与TCR复合体相关的蛋白的配体为UCHT1或其变体。

33.如项目27-32中任一项所述的用途，其中所述T细胞受体信号传导结构域多肽包含胞质结构域和跨膜结构域。

34.如项目33所述的用途，其中所述胞质结构域为CD4胞质结构域并且所述跨膜结构域为CD4跨膜结构域。

35.如项目27-34中任一项所述的用途，其中所述第一多核苷酸和第三多核苷酸与所述第二多核苷酸融合。

36.如项目27-34中任一项所述的用途，其中所述第二多核苷酸和第三多核苷酸与所述第一多核苷酸融合。

本公开的其它特征和优势将从下述详述中变得显而易见。然而，应理解，虽然指示本公开的优选实施方案，但该详述和具体实例仅通过示例给出，因为从此详述中，本公开的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。

附图简述

图1为相比于常规的二代CAR，三功能T细胞抗原偶联物(Tri-TAC)的图解性概述。包括在本工作中使用的构建体的示意图。

图2显示Tri-TAC变体和经典CAR的表面表达分析。

图3显示查看不同的标志物IFN-γ、TNF-α和CD107a的细胞活化的分析。

图4分析表达(D2F2E2)或不表达(D2F2)经典CAR和Tri-TAC的分子靶标的两种不同细胞系的杀伤。

图5描述了天然T细胞引发(A)，用于T细胞活化的两种目前使用的人工方法(B和C)和TAC活化技术(D)。

图6描述了(A)TAC分子的构型1和(B)TAC分子的构型2。

图7显示scFv CD4TAC的功能性。(A)为显示相对于空载体，scFvCD4TAC受体的表面表达的直方图，(B)显示表达scFv CD4TAC(上侧)或scFV CAR(下侧)的T细胞的抗原特异性激活，以及(C)显示通过scFvCD4TAC和scFv CAR对MCF-7人肿瘤细胞系(Her2阳性)的相当的杀伤。

图8表征了CD4-TAC构型2。(A)为显示相对于空载体，DARPin CD4TAC受体的表面表达的直方图，(B)显示用DARPin TAC构型2工程化的T细胞暴露于Her2抗原后的细胞因子产生和细胞脱颗粒，以及(C)显示相对于空载体对照，CD4TAC构型2的增长。

图9显示DARPin CD4TAC构型1的功能性。(A)显示与DARPin CAR和仅有NGFR对照相比，DARPin CD4YAC的表面表达(B)显示CD4TAC构型1的增长，以及(C)和(D)显示对各种活化标志物和降解标志物呈阳性的细胞的百分比。

图10显示TAC和CAR的细胞毒性和总体活性。将用TAC、CAR或空载体对照工程化的细胞在各种人肿瘤细胞系中孵育。

图11显示各种TAC对照的受体表面表达和活化。(A)显示细胞表面表达(左侧)、细胞脱颗粒(中间)和细胞因子产生(右侧)，以及(B)显示仅全长的CD4-TAC能够引发细胞毒性反应。

图12显示各种跨膜TAC变体的性质。(A)为各种跨膜结构域变体的概述，(B)显示在CD8纯化的T细胞中工程化的各个构建体的表面表达，以及(C)显示各个变体的细胞脱颗粒和细胞因子产生的测试。

图13显示Lck与TAC变体的相互作用。(A)显示全长TAC和胞质缺失能够将Lck拉下，以及(B)为在(A)的沉淀中检测到的Lck的密度测定法分析。

图14显示与BiTE样变体相比，CD4TAC表面表达和活性。(A)描述了仅有NGFR对照、CD4TAC和BiTE样变体的表面表达，以及(B)比较在各个细胞系中的细胞毒性。

图15显示野生型CD4TAC与UCHT1的随机突变文库的比较。(A)显示突变体的图示，(B)为显示文库的表面表达的直方图，以及(C)显示文库能够激活T细胞并产生细胞因子。

图16显示A85V,T161P突变体的表面表达增强。(A)比较了CD4TAC与A85V,T161P突变体之间的最终CD/CD8群，(B)显示A85V,T161P突变体的表面表达增强，以及(C)显示细胞因子产生在A85V,T161突变体中降低。

图17显示A85V,T161P突变体的细胞毒性和增长。(A)显示A85V,T161P突变体在各种细胞系中的细胞毒性，以及(B)显示在2周内于培养物中的细胞生长。

详述

(i)定义

本文使用的术语“细胞(a cell)”包括单一细胞以及多个细胞。

本文使用的术语“T细胞”是指在细胞介导的免疫中起关键作用的一类淋巴细胞。T细胞，也被称为T淋巴细胞，可以通过在细胞表面存在T细胞受体(TCR)而区别于其它淋巴细胞，如B细胞和自然杀伤细胞。存在几种具有不同功能的T细胞亚群，包括但不限于，辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞和自然杀伤T细胞。

本文使用的术语“T细胞抗原偶联物”是指当在T细胞上表达时，使T细胞靶向特定抗原的工程化的核酸构建体或多肽。

本文使用的术语“多核苷酸”和/或“核酸序列”和/或“核酸”是指由碱基、糖和糖间(骨架)键合组成的核苷或核苷酸单体的序列。术语还包括含有非天然存在的单体或其部分的修饰的或取代的序列。本申请的核酸序列可以为脱氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列(RNA)并且可以包括天然存在的碱基，所述碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。序列还可以包含修饰的碱基。此类修饰的碱基的实例包括氮杂和脱氮腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶；以及黄嘌呤和次黄嘌呤。本公开的核酸可以分离自生物有机体，可以通过基因重组的实验室方法形成或者可以通过化学合成或用于产生核酸的其它已知方案获得。

本文使用的术语“分离的多核苷酸”或“分离的核酸序列”是指当通过重组DNA技术产生时，基本上无细胞物质或培养基的核酸，或当化学合成时，基本上无化学前体或其它化学物质的核酸。分离的核酸也基本上无天然位于核酸所源自的核酸侧翼的序列(即，位于核酸的5′端和3′端的序列)。术语“核酸”意图包括DNA和RNA，可以为双链或单链的，并且代表正义链或反义链。此外，术语“核酸”包括互补的核酸序列。

本文使用的术语“重组核酸”或“工程化核酸”是指在生物有机体中不存在的核酸或多核苷酸。例如，重组核酸可以通过基因重组的实验室方法(如分子克隆)形成以构建不会以其它方式存在于自然界的序列。重组核酸也可以通过化学合成或用于产生核酸的其它已知方案来构建。

本文使用的术语“多肽”或“蛋白”描述了对应于由核酸编码的那些氨基酸的氨基酸链。本公开的多肽或蛋白可以为肽，其通常描述2至约30个氨基酸的氨基酸链。本文使用的术语“蛋白”也描述了具有超过30个氨基酸的氨基酸链，并且可以为蛋白的片段或结构域或者全长蛋白。而且，如本文所用，术语蛋白可以指氨基酸的线性链或者它可以指已经被加工并且折叠为功能蛋白的氨基酸链。然而，应理解，对于区分肽和蛋白，30为任意数，并且对于氨基酸链，术语可互换使用。本公开的蛋白可以通过从天然产生蛋白的细胞分离和纯化所述蛋白获得，通过酶促(例如蛋白水解)切割获得，和/或通过表达编码本公开的蛋白或片段的核酸重组获得。本公开的蛋白和/或片段也可以通过化学合成或用于产生蛋白和片段的其它已知方案获得。

术语“分离的多肽”是指当通过重组DNA技术产生时，基本上无细胞物质或培养基的多肽，或者当化学合成时，基本上无化学前体或其它化学物质的多肽。

本文使用的术语“抗体”意图包括单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体和抗体融合物。抗体可以来自重组来源和/或在转基因动物中产生。本文使用的术语“抗体片段”意图包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微抗体、双抗体以及它们的多聚体、多特异性抗体片段和结构域抗体。

本文使用的术语“载体”是指可以用于将核酸递送至细胞内的多核苷酸。在一个实施方案中，载体为表达载体，其包含与待在细胞中表达的核酸可操作连接的表达控制序列(例如，启动子)。领域中已知的载体包括但不限于质粒、噬菌体、粘粒和病毒。

(ii)组合物

本发明人已经开发了三功能T细胞抗原偶联物(Tri-TAC)以通过T细胞受体(TCR)更好地模拟天然信号传导，同时保留了MHC不受限制的靶向。具体地，本发明人构建了这样的分子，其中CD4共受体的跨膜区和胞内区(其分别定位于脂筏和结合Lck)与结合CD3的单链抗体融合。构建体被设计用于将CD3分子和TCR引到脂筏区并且将Lck带入到接近TCR，这类似于天然的MHC结合。为靶向嵌合受体，将设计的锚蛋白重复(DARPin)多肽与CD4-UCHT1嵌合体连接以生成三功能T细胞抗原偶联物(Tri-TAC)。

实验上，将人T细胞工程化以表达原型Tri-TAC或具有相同DARPin的常规CAR。已确定，在所有方面，用Tri-TAC工程化的T细胞显示出等同于常规CAR的功能性。对于两个参量(TNF-α产生和CD107a动员)，观察到Tri-TAC比常规CAR更活跃。此外，数据显示，以每个分子为基础，Tri-TAC显示出显著增强的活性。另外，与传统的CAR相比，Tri-TAC提供增强的安全性，这是因为激活结构域不是蛋白的一部分。

因此，本公开涉及核酸，其包含：

第一多核苷酸，其编码靶标特异性配体；

第二多核苷酸，其编码结合TCR复合体的配体；以及

第三多核苷酸，其编码T细胞受体信号传导结构域多肽。

在一个实施方案中，核酸为重组的或工程化核酸。在另一实施方案中，第一、第二和/或第三多核苷酸为重组的或工程化多核苷酸。

本公开还涉及由核酸编码的多肽和包含所述核酸的组合物。

包含第一、第二和第三多核苷酸中的每一个的核酸以及由所述核酸编码的多肽在本文还被称为三功能T细胞抗原偶联物或Tri-TAC。

靶标特异性配体

靶标特异性配体将T细胞抗原偶联物定向至靶细胞。因此，靶标特异性配体是指直接或间接结合靶细胞的任何物质。靶细胞可以为与疾病状态相关的任何细胞，所述疾病状态包括但不限于癌症。在一个实施方案中，靶标特异性配体结合靶细胞上的抗原(由可以引发免疫应答的细胞产生的蛋白)。靶标特异性配体还可以被称为抗原结合结构域。

在一个实施方案中，靶细胞为肿瘤细胞。此处，靶标特异性配体可以结合肿瘤细胞上的肿瘤抗原或肿瘤相关抗原。肿瘤抗原为本领域熟知的。本文使用的术语“肿瘤抗原”或“肿瘤相关抗原”意指在触发宿主免疫应答的肿瘤细胞中产生的任何抗原物质(例如，其可以由MHC复合体表示)。当为蛋白时，肿瘤抗原可以为例如8个或更多个氨基酸直至完整蛋白的序列，以及8至全长蛋白的任何数目的氨基酸的序列，所述序列包含全长蛋白的至少一个抗原片段，所述抗原片段可以以MHC复合体表示。肿瘤抗原的实例包括但不限于HER2(erbB-2)、B细胞成熟抗原(BCMA)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑素瘤相关抗原(MAGE)、前列腺特异性抗原(PSA)、胶质瘤相关抗原、β-人绒毛膜促性腺激素、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠道羧酸酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶(prostase)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、prostein、PSMA、生存素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。

靶标特异性配体的实例包括抗体及其片段，例如单链抗体，如scFV，或结合靶细胞和/或抗原的小蛋白。

靶标特异性配体的一个实例为靶向特定细胞和/或抗原的设计的锚蛋白重复(DARPin)多肽。在一个实施方案中，靶标特异性配体为靶向HER2(erbB-2)的DARPin多肽。靶向HER2(erb-2)的DARPin多肽的一个实例在本文提供为SEQ ID NO:7和8。

靶标特异性配体的另一实例为靶向特定细胞和/或抗原的scFV。在一个实施方案中，靶标特异性配体为结合HER2(erb-2)的scFv。结合HER2(erb-2)的scFv的一个实例在本文提供为SEQ ID NO:22和23。

结合TCR复合体的配体

T细胞抗原偶联物被设计用于与共受体刺激组合募集T细胞受体(TCR)。因此，T细胞抗原偶联物包含结合与T细胞受体复合体相关的蛋白的配体。

TCR(T细胞受体)为整合膜蛋白的复合体，其响应于抗原的结合而参与T细胞的激活。TCR为二硫键连接的膜锚定的异二聚体，所述异二聚体通常由被表示为具有不变的CD3(分化簇3)链分子的复合体的一部分的高度可变的alpha(α)链和beta(β)链组成。表达该受体的T细胞被称为α:β(或αβ)T细胞，虽然少数T细胞表达通过可变的gamma(γ)和delta(δ)链形成的替代受体，所述T细胞被称为γδT细胞。CD3为由四条不同的链组成的蛋白。在哺乳动物中，复合体包含CD3γ链、CD3δ链和两条CD3ε链。

如本文所用，术语“结合与T细胞受体复合体相关的蛋白的配体”包括直接或间接结合TCR的蛋白的任何物质。与TCR相关的蛋白包括但不限于TCR alpha(α)链、TCR beta(β)链、TCR gamma(γ)链、TCR delta(δ)链、CD3γ链、CD3δ链和CD3ε链。在一个实施方案中，结合与T细胞受体复合体相关的蛋白的配体为TCRεD3δ链和/或CD3ε链的抗体。

在一个实施方案中，配体为结合CD3的抗体或其片段。CD3抗体的实例为本领域已知的(莫罗单抗(muromonab)、奥昔珠单抗(otelixizumab)、替利珠单抗(teplizumab)和维西珠单抗(visilizumab))。在一个实施方案中，结合CD3的抗体为单链抗体，例如单链可变片段(scFv)。

CD3抗体的另一实例为UCHT1，其靶向CD3ε。UCHT1的序列在本文提供为SEQ ID NO:13和14。

T细胞受体信号传导结构域多肽

T细胞抗原偶联物包含T细胞受体信号传导结构域多肽。如本文所用，术语“T细胞受体信号传导结构域”是指这样的多肽，其(a)定位于脂筏和/或(b)结合Lck。T细胞受体信号传导结构域多肽可以包含一个或多个蛋白结构域，包括但不限于细胞质结构域和/或跨膜结构域。如本文所用，“蛋白结构域”是指可以独立于其余蛋白链之外发挥作用和存在的保守部分的给定蛋白序列结构。在一个实施方案中，T细胞受体信号传导结构域多肽包含细胞质结构域。在另一实施方案中，T细胞受体信号传导结构域多肽包含跨膜结构域。在进一步实施方案中，T细胞受体信号传导结构域多肽包含细胞质结构域和跨膜结构域两者。

T细胞受体信号传导结构域多肽包含TCR共受体和共刺激物以及TCR共受体和共刺激物蛋白结构域。

“TCR共受体”是指帮助T细胞受体(TCR)与抗原递呈细胞进行通讯的分子。TCR共受体的实例包括但不限于CD4、CD8、CD28、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CDt 37和CD 154。

“TCR共刺激物”是指T细胞响应于抗原所必需的分子。TCR共刺激物的实例包括但不限于PD-1、ICOS、CD27、CD28、4-1BB(CD 137)、OX40、CD30、CD40、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及特异性结合CD83的配体。

在一个实施方案中，T细胞受体信号传导结构域多肽包含TCR共受体或共刺激蛋白的细胞质结构域和跨膜结构域。细胞质结构域和跨膜结构域可以来自相同的共受体或共刺激物或者来自不同的共受体或共刺激物。细胞质结构域和跨膜结构域任选地通过连接子连接。

在一个实施方案中，T细胞受体信号传导结构域多肽包含CD4共受体的跨膜结构域和细胞质结构域(参见例如SEQ ID NO:17和18)。

在另一实施方案中，T细胞受体信号传导结构域多肽包含CD8α共受体的跨膜结构域和细胞质结构域。

在其它实施方案中，T细胞受体信号传导结构域多肽的细胞质和/或跨膜结构域为合成的。例如，跨膜结构域任选为合成的、高度疏水的膜结构域。

在另一实例中，跨膜结构域为血型糖蛋白跨膜结构域。在另一实例中，T细胞受体信号传导结构域多肽包含CD48GPI信号序列以使用GPI锚将T细胞抗原偶联物附连于膜。

除了本文所述的T细胞抗原偶联物的三种组分(靶标特异性配体、结合TCR复合体的配体和T细胞受体信号传导结构域多肽)以外，本申请考虑了其它多肽也可以包括在内。例如，T细胞抗原偶联物任选地包含另外的多肽，所述多肽直接或间接地起作用以靶向或激活T细胞。

连接子

T细胞抗原偶联物的各种组分可以彼此直接地融合，或者它们可以通过至少一个连接子(任选地肽连接子)进行连接。肽连接子可以为任何大小，条件是所述肽连接子不干扰各个连接组分的功能。在一个实施方案中，肽连接子的长度为约1至约15个氨基酸，更具体为约1至约10个氨基酸，并且最具体为约1至约6个氨基酸。

可用于T细胞抗原偶联物中的连接子的实例包括G₄S₃连接子。连接子的其它实例为对应于SEQ ID NO:11、12、15、16、19、20和21的肽以及它们的变体和片段。

构型

T细胞抗原偶联物可以以本领域技术人员容易理解的多种构型存在。

在一个实施方案中，靶标特异性配体和T细胞受体信号传导结构域多肽均与结合TCR复合体的配体融合。例如，此处所述的N-DARPinTAC(也被称为构型1；SEQ ID NO:1和2)按顺序包含：

i)N-Darpin Tri TAC前导序列(分泌信号)(SEQ ID NO:5和6)

ii)对Her2抗原特异的DARPin(SEQ ID NO:7和8)

iii)Myc标签(SEQ ID NO:9和10)

iv)连接子1(SEQ ID NO:11和12)

v)UCHT1(SEQ ID NO:13和14)

vi)连接子2(SEQ ID NO:15和16)

vii)CD4(SEQ ID NO:17和18)

在另一实施方案中，DARPin被对Her2抗原特异的scFV ScFv(SEQID NO:22和23)替换。

在另一实施方案中，结合TCR复合体的配体和T细胞受体信号传导结构域多肽均与靶标特异性配体此处所述的C-DARPin TAC(也被称为构型1；SEQ ID NO:3和4))融合。替代构型对于本领域技术人员将是显而易见的。

载体构建体

可以采用多种递送载体和表达介质以将本文所述的核酸导入细胞。因此，前述多核苷酸任选地包含在载体中以提供载体构建体，在本文也被称为载体。

因此，本公开还涉及载体，其包含：

a.第一多核苷酸，其编码靶标特异性配体；

b.第二多核苷酸，其编码结合CD3的抗体；以及

c.第三多核苷酸，其编码T细胞受体信号传导结构域多肽，

以及任选地在哺乳动物细胞中有功能的启动子。

启动子为本领域熟知的，所述启动子为特定核酸序列开始转录的DNA区域。“在哺乳动物细胞中有功能的启动子”是指驱使相关核酸序列在哺乳动物细胞中表达的启动子。驱使核酸序列表达的启动子可以被称为与核酸序列“可操作地连接”。

在一个实施方案中，第一多核苷酸和第三多核苷酸与第二多核苷酸融合以提供T细胞抗原偶联物的融合物并且T细胞抗原偶联物的融合物的编码序列与启动子可操作地连接。

在另一实施方案中，第二多核苷酸和第三多核苷酸与第一多核苷酸融合以提供T细胞抗原偶联物的融合物并且T细胞抗原偶联物的融合物的编码序列与启动子可操作地连接。

任选地，载体被设计用于在哺乳动物细胞，如T细胞中表达。在一个实施方案中，载体为病毒载体，任选为逆转录病毒载体。

可用的载体包括来源于以下的载体：慢病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)、痘病毒、致癌逆转录病毒(oncoretroviruses)、腺病毒和腺相关病毒。可用的其它递送载体包括来源于以下的载体：单纯疱疹病毒、转座子、牛痘病毒、人乳头瘤病毒、猴免疫缺陷病毒、HTLV、人泡沫病毒以及它们的。可用的其它载体包括来源于以下的载体：泡沫病毒、哺乳动物B型逆转录病毒、哺乳动物C型逆转录病毒、禽C型逆转录病毒、哺乳动物D型逆转录病毒和HTLV/BLV型逆转录病毒。在公开的组合物和方法中可用的慢病毒载体的一个实例为pCCL载体。

多核苷酸和多肽的变化

对本申请中公开的多核苷酸序列(包括载体序列和多肽序列)进行许多修饰，并且这些修饰对于本领域技术人员是显而易见的。修饰包括核苷酸或氨基酸的取代、插入或缺失或者改变核苷酸或氨基酸的相对位置或顺序。

在一个实施方案中，可以将本文所述的多核苷酸进行修饰或突变以优化编码的多肽的功能和/或T细胞抗原偶联物的功能、活性和/或表达。

在本文中，显示出，可以生成导致TAC的表面表达增强的UCHT1突变体(图15-17)。因此，在一个实施方案中，TAC包含结合TCR复合体的修饰的或突变的配体，其中相比于包含结合TCR复合体的野生型或未修饰的或未突变的配体的TAC，包含修饰的或突变的抗体的TAC具有增加的表面表达和/或活性。结合CD3的突变的或修饰的抗体的实例为本文所述的UCHT1A85V、T161P突变体(SEQ ID NO:24和25)。

序列同一性

本申请的多核苷酸还包含这样的核酸分子(或其片段)，其与本申请的核酸分子具有至少约70％的同一性、至少80％的同一性、至少90％的同一性、至少95％的同一性、至少96％的同一性、至少97％的同一性、至少98％的同一性或至少99％或99.5％的同一性。本申请的多肽还包含这样的多肽(或其片段)：其与本申请的多肽具有至少约70％的同一性、至少80％的同一性、至少90％的同一性、至少95％的同一性、至少96％的同一性、至少97％的同一性、至少98％的同一性或至少99％或99.5％的同一性。同一性是指两个核苷酸或多肽序列的相似性，将所述序列进行比对以便获得最高级匹配。根据本领域已知的方法计算同一性。例如，如果核苷酸序列(被称为“序列A”)与SEQ ID NO:1的一部分具有90％的同一性，则序列A与SEQ ID NO:1的参比部分为同一的，除了SEQ ID NO:1的参比部分的每100个核苷酸，序列A可以包含多达10个点突变(如被其它核苷酸取代)。

序列同一性优选设置为与本文提供的核苷酸序列和/或其互补序列具有至少约70％的同一性、至少80％的同一性、至少90％的同一性、至少95％的同一性、至少96％的同一性、至少97％的同一性、至少98％的同一性，或者最优选的至少99％或99.5％的同一性。序列同一还优选设置为与本文提供的多肽序列具有至少约70％的同一性、至少80％的同一性、至少90％的同一性、至少95％的同一性、至少96％的同一性、至少97％的同一性、至少98％的同一性或者最优选的至少99％或99.5％的同一性。序列同一性优选用来自Bioinformatics(University of Wisconsin)的GCG程序计算。其它程序也可获得用于计算序列同一性，如Clustal W程序(优选使用默认参数；Thompson,J D等人,Nucleic AcidRes.22:4673-4680)。

杂交

本申请包含这样的DNA，其具有的序列与本申请中所述的核酸分子具有足够的同一性以在严格杂交条件下进行杂交(杂交技术为本领域熟知的)。本申请还包含这样的核酸分子，其与本文所述的一个或多个序列和/或其互补序列进行杂交。此类核酸分子优选在高严格条件下杂交(参见，Sambrook等人Molecular Cloning:ALaboratory Manual,MostRecentEdition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)。高严格洗涤优选具有低盐(优选为约0.2％SSC)，温度为约50-65℃并且任选地进行约15分钟。

T细胞中的表达

T细胞抗原偶联物被设计用于在T细胞中表达。因此，本公开的一个方面提供了表达T细胞抗原偶联物的T细胞。本公开的另一方面涉及用T细胞抗原偶联物或包含T细胞抗原偶联物的载体转导或转染的T细胞。任选地，T细胞为分离的T细胞。

T细胞可以从许多来源获得，包括但不限于血液(例如，外周血单核细胞)、骨髓、胸腺组织、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、脾脏组织和肿瘤。在一个实施方案中，T细胞为自体T细胞。在另一实施方案中，T细胞从T细胞的细胞系获得。体外培养和维持T细胞的方法为本领域熟知的。

一旦获得，将T细胞在体外任选富集。如本领域熟知的，细胞群可以通过阳性选择或阴性选择来富集。此外，可以将T细胞任选地冷冻或低温保存，然后在稍后日期解冻。

在将T细胞抗原偶联物导入T细胞之前或之后，使用本领域熟知的方法将T细胞任选地激活和/或扩增。例如，T细胞可以通过接触这样的表面进行扩增，所述表面具有附于其上的刺激CD3/TCR复合体相关信号的试剂以及刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。

用核酸序列转导或转染T细胞以及在T细胞中表达转导的核酸的方法为本领域熟知的。例如，可以通过物理、化学或生物手段将核酸导入细胞内。物理手段包括但不限于显微注射、电穿孔、粒子轰击、脂质转染和磷酸钙沉淀。生物手段包括使用DNA和RNA载体。

在一个实施方案中，病毒载体(包括逆转录病毒载体)被用于将核酸导入T细胞并且在所述T细胞中表达。病毒载体包括来源于以下的载体：慢病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)、痘病毒、单纯疱疹病毒、I型腺病毒和腺相关病毒。载体任选地包含驱使转导的核酸分子在T细胞中表达的启动子。

多种测定可以用于确认T细胞中存在转导的核酸序列和/或核酸编码的多肽和/或转导的核酸序列和/或核酸编码的多肽在T细胞中进行了表达。测定包括但不限于Southern印迹和Northern印迹、RT-PCR和PCR、ELISA和蛋白质印迹。

在一个实施方案中，相比于不表达T细胞抗原偶联物的T细胞和/或相比于表达传统CAR的T细胞，表达T细胞抗原偶联物的T细胞在抗原存在的情况下具有增加的T细胞活化。增加的T细胞活化可以通过许多方法确定，包括但不限于增加的肿瘤细胞系杀伤、增加的细胞因子产生、增加的细胞溶解、增加的细胞脱颗粒和/或增加的活化标志物(如CD107α、IFNγ、IL2或TNFα)的表达。增加可以在单个细胞或细胞群中测量。

本文使用的术语“增加的(increased/increasing)是指相比于不表达T细胞抗原偶联物的T细胞或T细胞群和/或相比于表达传统CAR的T细胞或T细胞群，表达T细胞抗原偶联物的T细胞或T细胞群增加至少2％、5％、10％、25％、50％、100％或200％。

可以将表达T细胞抗原偶联物的T细胞，任选自体T细胞，施用于有需要的对象。因此，可以将用T细胞抗原偶联物转导的T细胞和/或表达T细胞抗原偶联物T细胞配制在药物组合物中。优选地，将T细胞配制用于静脉内施用。

药物组合物可以通过用于制备可施用于对象的药学上可接受的组合物的本身已知的方法来制备，使得有效量的T细胞与药学上可接受的载体组合在混合物中。合适的载体描述在，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences(Remington's PharmaceuticalSciences,第20版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,USA,2000)中。在此基础上，组合物包括，虽然不排除其它，与一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂结合，并且包含在具有合适pH的缓冲溶液和生理流体的等渗溶液中的物质的溶液。

合适的药学上可接受的载体基本上包括不会干扰药物组合物的生物活性的有效性的化学惰性的和无毒组分。合适的药物载体的实例包括但不限于水、盐溶液、甘油溶液、乙醇、N-(1(2,3-二油基氧基)丙基)N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和脂质体。此类组合物应包含治疗有效量的化合物以及合适量的载体以便提供用于直接施用于患者的形式。

药物组合物还可以包括但不限于冻干粉末或水性或非水性无菌可注射溶液或悬浮液，其可以进一步包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使组合物与预期接受者的组织或血液基本上等渗的溶质。可以在此类组合物中存在的其它组分包括例如水、表面活性剂(如吐温)、醇、多元醇、甘油和植物油。临时注射溶液和悬浮液可无菌粉末、颗粒、片剂或浓溶液或浓悬浮液制备。

(iii)方法和用途

本公开的一个方面提供了三功能T细胞抗原偶联物将T细胞定向至特异性抗原的用途。

因此，本公开还涉及修饰的T细胞在有需要的对象中治疗癌症的用途，其中修饰的T细胞表达这样的核酸，所述核酸包含第一多核苷酸，其编码靶标特异性配体；第二多核苷酸，其编码结合TCR复合体的配体；以及第三多核苷酸，其编码T细胞受体信号传导结构域多肽。本公开还涉及治疗癌症的方法，其包括将有效量的修饰的T细胞施用于有需要的对象。还公开了有效量的修饰的T细胞在有需要的对象中治疗癌症的用途。进一步公开了修饰的T细胞在制备在有需要的对象中治疗癌症的药物中的用途。甚至进一步公开了修饰的T细胞在有需要的对象中用于治疗癌症。在一个实施方案中，靶标特异性配体结合癌细胞上的抗原，从而将修饰的T细胞靶向癌细胞。

可以治疗的癌症包括任何形式的肿瘤性疾病。可以治疗的癌症的实例包括但不限于乳腺癌、肺癌和白血病，例如混合谱系白血病(MLL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)或急性淋巴细胞白血病(ALL)。其它癌症包括癌、胚细胞瘤、黑素瘤、肉瘤、血液学癌症、淋巴样恶性肿瘤、良性肿瘤和恶性肿瘤(malignant tumors)以及恶性肿瘤。癌症可以包括非实体瘤或实体瘤。可以治疗的癌症包括未血管化的肿瘤、或者基本上尚未血管化的肿瘤以及血管化肿瘤。

本文所述的修饰的T细胞和/或药物组合物可以施用于或用于活的生物体，包括人和动物。本文使用的术语“对象”是指动物界的任何成员，优选哺乳动物，更优选为人类。

用于分离、基因修饰T细胞以及将所述T细胞施用于有需要的对象的程序为本领域已知的。具体地，将T细胞从哺乳动物(优选人)分离，任选地扩增和/或活化，如本文所述，以及用本公开的核酸分子转导或转染。对于对象，T细胞可以为自体的。在另一实施方案中，对于对象，细胞可以为同种异体的、同源的或异种的。

修饰的T细胞可以单独施用，或者以药物组合物施用，如本文所述。本公开的组合物优选配制用于静脉内施用。

施用的修饰的T细胞和/或药物组合物的“有效量”被定义为实现期望结果必需的剂量和时段内有效的量。例如，物质的有效量可以根据诸如以下的因素而变化：个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及重组蛋白引发个体中期望响应的能力。可以调整给药方案以提供最佳治疗响应。例如，可以每天施用若干分剂量或者剂量可以按比例降低，如治疗情况的紧急状态所指示的。

例如，本文所述的修饰的T细胞和/或药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重，任选10⁵至10⁸个细胞/kg体重或10⁶至10⁷个细胞/kg体重的剂量施用。剂量可以单次或多次施用。

修饰的T细胞和/或药物组合物可以通过本领域已知的任何方法施用，包括但不限于雾化吸入、注射、摄入、灌输、植入或移植。修饰的T细胞和/或药物组合物可以皮下、皮内(intradennally)、瘤内、结内(intranodally)、髓内(intrameduliary)、肌内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用于对象。修饰的T细胞和/或其药物组合物可以直接注入肿瘤、淋巴结或感染部位。

如本文所用，并且如本领域充分理解的，“以治疗”或“治疗”为用于获得有益或期望结果(包括临床结果)的方法。有益的或期望的临床结果可以包括但不限于减轻或缓解一种或多种症状或疾况、减小疾病的程度、稳定(即，不恶化)疾病状态、预防疾病扩散、延迟或减慢疾病进展、改善或减轻疾病状态、以及缓和(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可以意指相比于如果不接受治疗的预期生存，延长生存。在一个实施方案中，“治疗”包括预防疾病或病况。

表1.序列表

¹轻链，核苷酸1-324；连接子，核苷酸325-387；重链，核苷酸388-750

²轻链，氨基酸1-108；连接子，氨基酸109-128；重链，氨基酸129-250

³细胞外连接子，核苷酸1-66；跨膜结构域，核苷酸67-132；胞质结构域，核苷酸133-254

⁴细胞外连接子，氨基酸1-22；跨膜结构域，氨基酸23-44；胞质结构域，氨基酸45-84

以上公开大致描述了本申请。更完整的理解可以通过参考下述具体实施例获得。这些实施例仅出于示例的目的进行描述并且并非意图限制本申请的范围。当环境具有或提供了便利，形式的变化和等价物的替代是可以预期的。尽管本文采用特定术语，但这些术语意图为描述性意义而不是出于限制的目的。

本申请的下述非限制性实施例是示例性的。

实施例

实施例1.

背景和概述

开发了三功能T细胞抗原偶联物(Tri-TAC)以通过TCR更好地体现天然信号传导，同时保留了MHC不受限制的靶向。T细胞活化在通过TCR连接MHC之后发生并且T细胞上的共受体(CD4或CD8)同时结合MHC分子内的保守区(Yin等人,2012)(Kuhns和Davis,2012)。共受体具体定位在“脂筏”内(Fragoso等人,2003)(Arcaro等人,2000)，所述脂筏为膜微结构域，其对于TCR信号复合体的形成是特别重要的(He和Marguet,2008)。除了确保TCR活化复合体的正确微结构域定位之外，这些共受体还直接结合Lck(Kim等人,2003)，所述Lck为对T细胞活化至关重要的蛋白激酶(Methi等人,2005)(Acuto和Cantrell,2000)。如先前所述，现有的嵌合受体或双功能蛋白并不能使共受体分子或Lck参与。构建了这样的分子，其中CD4共受体的跨膜区和胞内区(其分别定位于脂筏和结合Lck)与结合CD3的单链抗体(UCHT1；SEQID NO:13和14；序列也在公共领域中)融合。该构建体被设计用于将CD3分子和TCR引到脂筏区并且将Lck带入到接近TCR，这类似于天然的MHC结合。为靶向该嵌合受体，将设计的锚蛋白重复(DARPin)多肽与CD4-UCHT1嵌合体连接以生成三功能T细胞抗原偶联物(Tri-TAC)。在该具体情况下，DARPin对于原癌基因，erbB-2是特异的。

将人T细胞工程化以表达原型Tri-TAC或具有相同DARPin的常规CAR。已确定，在所有方面，用Tri-TAC工程化的T细胞显示出等同于常规CAR的功能性。有趣地是，对于2个参量(TNF-α产生和CD107a动员)，观察到Tri-TAC比常规CAR更活跃。此外，数据显示，以每个分子为基础，Tri-TAC显示出显著增强的活性。另外，与传统的CAR相比，Tri-TAC提供增强的安全性，这是因为激活结构域不是蛋白的一部分。

传统的CAR通过组合若干信号传导结构域在刺激T细胞中是有效的(图1C)。相比之下，Tri-TAC(图1A/B)不包含自身的任何信号传导结构域。它纯粹地依赖于以抗原依赖性方式促进其它关键参与者(以灰色显示)之间所提出的相互作用。为检验该设计的假设，生成全长N-Darpin Tri-TAC的若干变体(图1D)。

先前的工作已经建立了CAR分子的一致的和显著的细胞表面表达。发现DarpinCAR显示出稳健的表面表达(图2)。相比之下，Tri-TAC显示出低得多的表面表达。这在具有UCHT1结构域的所有变体中观察到。然而，无UCHT1结构域的Tri-TAC变体显示出与DarpinCAR类似的表面表达。

将工程化以表达Tri-TAC、Tri-TAC变体或DARPin CAR的T细胞用板上结合的抗原刺激。被工程化以表达Tri-TAC和DARPin CAR的T细胞能够发挥所有测量的功能(TNF-α产生、IFN-γ产生和CD107a动员)(图3A和3B)。发现Tri-TAC结合CD3和靶抗原对于T细胞发挥它们的功能是关键的。在图3中，显示出去除UCHT1(其取消与CD3的结合)消除Tri-TAC的功能。在其它数据中，确定了从Tri-TAC去除DARPin也消除功能。

如所预期的，当测试这些T细胞的细胞毒性时，Tri-TAC-UCHT1-Darpin未显示出杀伤表达抗原的细胞的能力(图4)。N-Darpin Tri-TAC显示出高水平的选择性细胞毒性，这与经典DARPin-CAR非常类似。有趣地是，表达DARPin-CAR的T细胞在高的T细胞：靶细胞比率下似乎显示出脱靶杀伤(参见图4中对D2F2的杀伤)，然而表达Tri-TAC的T细胞未显示出这些效果。

实验

图1为示意概述。(A)描述了N-Darpin Tri-TAC。使用(G₄S)₃连接子，将靶向Her2的锚蛋白重复结构域与单链可变片段(scFv)UCHT1融合。然后，将scFv与CD4分子连接。CD4包含连接区域和跨膜区域以及细胞质锚定区域。可能的相互作用以褪色灰显示。(B)描述了C-DarpinTri-TAC。在该构建体中，用Darpin结构域更换scFv UCHT1。可能的相互作用再次以褪色灰描述。(C)经典的第二代CAR的模型。Darpin靶向结构域经由CD8α连接子与CD28跨膜结构域连接。然后，将具有3个激活的ITAM基序的CD3ζ结构域与CD28的胞质部分连接。(D)各个Tri-TAC对照的概述，所述对照无Darpin靶向结构域、结合CD3的scFv部分或CD4结构域的胞质部分。

图2显示用直方图上显示的各个Tri-TAC变体转导的T细胞的表型表面表达分析。将T细胞与Her2Fc孵育，随后经由流式细胞术检测。提供的数据以CD8+淋巴细胞设门。基于未转导的对照选择显示的门控。

图3为工程化T细胞的功能分析。在(A)中，在含有GolgiPlug^TM的培养基中，将细胞用板上结合的Her2Fc刺激4小时。将细胞首先针对CD8+染色，然后进行透化并分析TNF-α和IFN-γ产生。初始的门控针对单峰CD8+淋巴细胞设置。基于未转导的对照设置显示的门控。在B)中，如先前所述，将细胞用板上结合的Her2Fc刺激。培养基包含GolgiPlug^TM以及抗-CD107a抗体。预期活跃脱粒的细胞具有较高比率的CD107a再循环，并且随后针对抗-CD107a显示出较高的信号。

图4显示工程化T细胞的细胞毒性。在添加T细胞之前，将两种不同的贴壁的小鼠肿瘤细胞系进行铺板保持24小时。已将D2F2/E2工程化以表达人Her2，然而未将D2F2工程化。将指定比率的T细胞添加至含有肿瘤的孔中。将肿瘤细胞与T细胞孵育6h。随后，经由洗涤，去除T细胞。将含有10％阿尔玛蓝(Alamar blue)的培养基添加至各孔保持3小时。经由端点分析确定代谢活性(作为细胞存活的指标)。将无T细胞的孔定义为最大存活性/代谢活性，并且设置为100％，然而将无细胞孵育的培养基设为为0％的代谢活性。提供的数据为3次重复的平均值。

讨论

使用嵌合受体使T细胞以MHC独立性方式重定向特定靶标为治疗癌症的有吸引力的方法并且可以适用于传染病，其中来自病原体的抗原存在于质膜中。嵌合受体将导致：(1)针对靶细胞的特定细胞毒性和(2)最小的脱靶毒性。常规CAR在这方面是有局限性的，因为它们依赖于合成结构，在信号传导结构域位于异常位置的情况下，它们可能不能接收到适当调控，因此特异性活性的细胞控制存在降低。

Tri-TAC被设计用于重定向天然TCR的信号传导组分，而无需采用信号传导结构域的异位定位。用下述原则设计Tri-TAC：(1)嵌合受体应与重要的活化蛋白复合体相互作用并促进其有序组装，(2)嵌合受体应利用已存在的细胞适应，如微结构域环境以及(3)嵌合受体不应具有任何活化结构域。在激活速率等于(如果不能更好的情况下)第二代CAR的激活速率时，Tri-TAC能够有效地实现这一点，如数据所显示。

因此，该Tri-TAC非常适合用于与另外设计的共受体进一步整合以进一步微调T细胞活化。最终，这应导致脱靶效应大量降低，而不会损害靶向的细胞毒性。Tri-TAC似乎显示出比现有CAR低的毒性。DarpinCAR在高的细胞与靶标比率下显示出轻微的脱靶杀伤，当用于治疗时，这可能变得有问题。然而，Tri-TAC，其功能几乎与传统的CAR一样，不显示脱靶效应。因为DARPins以高亲和力结合靶标，脱靶效应可在表达高水平嵌合受体的细胞中更常见，所述嵌合受体采用DARPin。因此，在不被理论所束缚的情况下，Tri-TAC的低的表面表达可能是有利的，因为它降低了此类脱靶效应的可能性。

最终，Tri-TAC技术的模块化性质允许更加精细地微调T细胞活化过程。例如，TCR复合体的募集可以通过具有较低CD3亲和力的工程化Tri-TAC分子调节。这可以用于模拟天然的低的TCR亲和力(Chervin等人,2009)，同时保留了对靶向结构域的高亲和力以检测癌症靶标。与经典CAR不同，Tri-TAC技术可以被工程化以与上述情形更接近。

总之，提供的Tri-TAC技术为高度有效的分子工具，其能够(1)有效触发T细胞活化和细胞毒性，(2)能够通过模拟天然的T细胞活化实现这点，以及(3)不需要自身的激活结构域。

实施例2.Tri-TAC技术的表征

Tri-TAC技术的概述提供于图5中。

图5A显示基于不同受体以及它们的相关蛋白伴侣的共组装，CD8T细胞活化的实例。最初，主要组织相容性复合体I递呈抗原(helix)。这通过能够结合抗原的T细胞受体(TCR)复合体识别。TCR复合体包含若干单独的亚基。α/β结构域能够与MHC-I递呈的抗原直接相互作用。然后，α/β结构域与若干其它结构域(ε、γ、δ和ζ)相互作用，所述所有结构域经由各种细胞内激活结构域参与T细胞活化。TCR复合体可以与CD8共受体同时与MHC-I相互作用。CD8共受体以抗原独立性方式结合MHC-I。CD8与Lck直接相互作用，所述Lck为对于激活TCR受体复合体重要的蛋白激酶。CD8和Lck相互作用还确保了它们与脂筏(膜部分)微结构域的结合，假设所述微结构域组织和包封其它相关信号传导部分(黑色球体)。然后，激活的后期阶段导致CD28募集。如果该相互作用级联平行发生若干次，T细胞变为活化的并且能够发挥它们的细胞毒性作用。

图5B提供了嵌合抗原受体(CAR)的概述。CAR试图通过将若干重要的激活结构域，如ζ和CD28组合在单一合成工程化分子中来重现T细胞活化的复杂机制。然后，使用特异性结合结构域，CAR与选择的抗原直接相互作用。此处描述的是锚蛋白重复蛋白(DARPin)。认为平行发生的若干此类相互作用导致T细胞活化。

图5C描述了双特异性T细胞衔接器(BiTE)样分子，其通过将TCR复合体与选择的抗原直接交联来使T细胞参与。此处描述的BiTE样分子包含两个结合结构域。DARPin部分与靶抗原相互作用。单链可变片段结构域(scFv)经由其ε结构域结合TCR复合体。平行发生若干此类交联导致T细胞活化。

图5D为模拟天然激活过程的TAC技术的概述。T细胞抗原偶联物(TAC)能够经由DARPin结合结构域结合T细胞抗原偶联物的抗原。然后，将DARPin与能够结合TCR复合体的ε结构域的scFv连接。然后，将TAC与CD4跨膜结构域和胞质结构域结合。CD4，如同CD8，与Lck相互作用并且位于脂筏。因此，TAC将TCR募集与共受体刺激组合。不受理论的束缚，认为平行发生若干此类相互作用导致T细胞活化。

TAC分子的不同构型是可能的。图6A显示呈构型1的TAC分子的模型。CD4-尾、跨膜结构域和连接子结构域与TCR-ε特异的scFv(UCHT1)组合。然后，将scFv与抗原结合结构域连接。该结构域是可互换的。在本方案中，使用的抗原结合结构域为对Her2抗原特异的scFv或DARPin结构域。图6B显示呈构型2的TAC分子。此处，CD4结构域首先与抗原结合结构域相互作用。然后，该结构域与募集TCR的scFv(UCHT1)结构域连接。

图7显示scFv CD4TAC的功能性。图7A为显示相对于空载体，scFvCD4TAC受体的表面表达的直方图。将细胞使用FcHer2抗原染色，继而使用荧光标记的抗体检测。图7B显示表达scFv CD4TAC(上侧)或scFV CAR(下侧)的T细胞的抗原特异性激活。将表达scFv CD4TAC(上侧)或scFv CAR(下侧)的T细胞与板上结合的Her2抗原孵育。两种修饰的细胞显示出抗原特异性激活。DMSO阴性对象对照未显示出活性(数据未示出)。图7C显示通过scFv CD4TAC和scFv CAR对MCF-7人肿瘤细胞系(Her2阳性)的相当的杀伤。将scFv CD4TAC和scFv CAR与MCF-7人肿瘤细胞系(Her2阳性)孵育并与空载体对照进行比较。

图8为CD4-TAC构型2的表征。图8A为相对于载体对照，DARPinCD4-TAC构型2的直方图。用FcHer2修饰的抗原探测表面表达。表达CD4-TAC构型2的细胞在FcHer2结合中显示出明显的增加，从而显示出受体的高的表面表达。为清楚起见，显示了CD4TAC构型2的模型。图8B显示用DARPin TAC构型2工程化的T细胞暴露于板上结合的Her2抗原中。测量细胞因子产生和细胞脱颗粒。数据显示DARPin TAC构型2为功能受体。未用抗原的治疗未显示出T细胞活化(数据未示出)。图8C显示相对于空载体对照，CD4TAC构型2的增长。使细胞生长在100u/ml IL2 10ng/ml IL7中。以100,000个细胞为起始，通过在预定间隔对培养样品进行计数来监测生长。相对于对照，构型2具有显著降低的增长率。

图9显示DARPin CD4TAC构型1的功能性。图9A显示与DARPinCAR(绿色)和仅有NGFR对照(蓝色)相比，DARPin CD4TAC(红色)的表面表达。用受体特异性抗原FcHer2探测细胞。直方图显示DARPin CD4TAC在表面上很好地表达。然而，与CAR构建体相比，DARPin CD4TAC的最大表面表达较低。图9B显示CD4TAC构型1的增长。对于两周的培养物，通过取样并对细胞手动计数来监测生长。空载体显示出与DARPin CAR类似的增长。然而，相比之下，TAC具有降低的增长。图9C和9D显示出对各种活化标志物和降解标志物呈阳性的细胞的百分比。将空载体、DARPin CD4和DARPin CAR与板上结合的抗原Her2或DMSO对照孵育。使用统计学分析软件SPICE概述了三个单独实验的结果。散点图显示对一组活化标志物呈阳性的细胞的百分比。CD4-TAC显示出对细胞脱颗粒标志物呈阳性的细胞的百分比较高。DARPin CAR细胞对多种活化标志物呈阳性，而无细胞脱颗粒标志物的显著富集群体。饼形图代表相同数据。饼形图显示CD4-TAC具有明显较高的集中于细胞脱颗粒的细胞群。CD4-TAC具有使大多数活化的细胞脱颗粒，同时产生各种水平的细胞因子。然而，CAR显示出更随机分布的活化和细胞脱颗粒模式，所述模式构成了小于50％的总群体。所述模式可以指示通过CAR的较少受控的T细胞活化。

图10显示TAC和CAR的细胞毒性和总体活性。将用TAC、CAR或空载体对照工程化的细胞与各种人肿瘤细胞系孵育。MDA MB 231、SK OV3和A549均表达Her2抗原。LOXIMVI为Her2阴性的。观察到，在所有情况下，TAC显示出增强的细胞毒性。抗原阴性细胞系LOCIMVI未被靶向，这支持了细胞毒性为抗原特异的。

图11显示各种TAC对照的受体表面表达和活化。图11A显示细胞表面表达(左侧)、细胞脱颗粒(中间)和细胞因子产生(右侧)。无特异性结构域的构建体被用于测定这些结构域的重要性。从上到下，去除下述结构域：DARPin抗原结合结构域和UCHT1TCR结合结构域，在底端的为全长TAC。相对于全长CD4TAC，无UCHT1结构域的TAC的表面表达导致增强的表面表达。使用FcHer2抗原不能检测到DARPin阴性突变体。细胞脱颗粒(中间)仅在全长TAC中观察到。UCHT1和DARPin缺失导致无细胞脱颗粒。类似地，细胞因子产生仅在全长TAC中观察到。图11B显示将小鼠细胞系D2F2工程化以表达人Her2抗原(D2F2/E2)。将两种细胞系用具有全长CD4-TAC或其缺失变体的工程化的T细胞孵育。数据显示效应子与靶标比率为4:1(终点)。仅全长CD4-TAC能够引发细胞毒性反应。这显示DARPin和UCHT1结构域参与受体功能。

图12显示各种跨膜TAC变体的性质。图12A为各种跨膜构建体的概述。第一组变体无胞质结构域。CD4TAC-胞质去除全部胞质结构域。合成构建体使CD4TM被设计的、高度疏水性膜结构域替代。血型糖蛋白变体用血型糖蛋白跨膜结构域替代CD4跨膜结构域。GPI锚变体利用CD48GPI信号序列以使用GPI锚将TAC附连于膜。CD8A TAC变体用CD8α对应物替代跨膜结构域和胞质CD4结构域。图12B显示将CD8纯化的T细胞用各个构建体工程化。显示了相对于全长TAC的各个受体的表面表达。所有数据相对于对照的中值荧光强度。与全长CD4-TAC相比，所有变体具有显著较低的受体表面表达。GPI锚定的TAC变体在背景水平以上不可检测。图12C描述了不同变体的细胞脱颗粒和细胞因子产生的测试。将细胞与板上结合的Her2抗原孵育。活性表示为对细胞脱颗粒标志物CD107a呈阳性的细胞的百分比(左侧条形图)或所有产生细胞因子的细胞合起来的百分比(TNFa、IFNg和TNFa/IFNg，右侧条形图)。GPI锚定的或CD8a变体显示背景水平的细胞脱颗粒和细胞因子产生。血型糖蛋白、合成的和-胞质TAC变体显示中等水平的细胞脱颗粒和低水平的细胞因子产生。在所有情况下，活性远低于全长CD4-TAC。总之，这显示锚定无胞质结构域的TAC-导致功能受体的活性降低。

图13显示Lck与TAC变体的相互作用。在图13A中，将Her2抗原与磁珠共价连接。将293TM细胞工程化以表达TAC和TAC胞质缺失变体以及Lck。将珠子与细胞裂解物孵育过夜，随后洗涤并进行蛋白质印迹分析。使用Lck抗体检测Lck，经由Myc抗体检测TAC。将B-肌动蛋白用作对照。b-肌动蛋白未被拉下并且仅在上清液(S)中检测到。然而，全长TAC和胞质缺失被有效地拉下并且在沉淀部分(B)中检测到。载体对照和无胞质结构域的TAC显示出相当水平的背景Lck信号。然而，相对于总量，全长CD4TAC显示出显著水平的Lck。图13B显示在沉淀中检测到的Lck的密度测定法分析。相对于阴性对照校正信号。数据支持Lck能够与全长CD4-TAC相互作用。

在图14中，将CD4TAC表面表达和活性与BiTE样变体进行比较。图14A显示仅有NGFR对照(左侧)、CD4TAC(中间)和BiTE样变体(右侧)。使用转导标志物NGFR和Her2抗原测试表面表达。与BiTE相比，TAC显示出低得多的表面表达。最显著的是，BiTE似乎分泌充足的偶联抗体以使转导阴性细胞(NGFR-)能够显示出强的受体表达。与TAC工程化细胞相比，细胞因子产生和细胞脱颗粒在BiTE样细胞中均较高。图14B比较了在各种Her2阳性细胞系(MDA MB231、SK OV 3、A549)中的细胞毒性。与细胞因子产生相反，TAC工程化细胞显示出显著增强的细胞毒性活性。

图15显示CD4TAC WT与UCHT1的随机突变文库的比较。为测试改变TAC性质的能力，将在UCHT1和TCRε的结合表面上存在的24个氨基酸单独地突变。这产生480个唯一克隆的理论数，所有克隆应表示在该随机文库中。图15A显示突变体的图示。标记表明突变，其全部在scFv-ε界面处。图15B为表面表达的直方图。用FcHer2抗原探测工程化细胞以检测表面表达的受体。文库显示受体的表面表达大大增强。图15C显示WT和文库CD4TAC细胞与板上结合的抗原进行孵育。显示了它们激活和产生细胞因子的能力。与WT相比，文库具有类似的活性。不受理论的束缚，这支持了这样的观点：TAC的表达性质可以通过改变scFv结构域得到改善，同时保留了最初功能特征。

图16显示A85V,T161P突变体的表面表达增强。将文库繁殖延长的时段以选择相对于WT具有生长优势的突变体。分析选择的突变体(A85V,T161P；编号基于UCHT1结构域片段)。图16A显示将外周血单核细胞(PBMC)用WT CD4-TAC或A85V,T161P突变体工程化。比较CD4TAC(左侧)和A85V,T161P突变体(右侧)之间的最终CD4/CD8群体。显然，WT CD4-TAC导致CD4阳性细胞群减少。在突变细胞中未观察到该作用。图16B显示表面表达，如通过NGFR转导标志物和FcHer2阳性所测定，并且表明A85V,T161P突变体的表面表达增强。图16C显示A85V,T161P突变体细胞因子产生降低(DMSO对照未显示出活性，数据未示出)。WTTAC与A85V,T161P突变体之间的细胞脱颗粒是相当的。

图17显示A85V,T161P突变体的细胞毒性和增长。在图17A中，将用WT CD4TAC和A85V,T161P突变体工程化的T细胞与Her2抗原阳性细胞系SK OV 3、MDA MB 231和A549孵育。在所有情况下，突变体显示出降低水平的细胞毒性；就A549而言，未检测到细胞毒性。在图17B中，在2周内监测以100 000个细胞为起始的培养物中的细胞生长。对样品进行定期取样并且对细胞进行手动计数。与WT变体相比，A85V，T161P突变体显示出显著改善的增长。总之，这显示文库可能包含使若干TAC功能能够进行修饰和优化的各种突变体。因此，UCHT1可以被用作功能调节剂。

虽然已参考目前被认为是优选的实施例对本申请进行了描述，但应理解本申请不限于公开的实施例。相反地，本申请意图涵盖在所附权利要求的精神和范围内包括的各种修改和等效布置。

所有出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请具体地和单独地表示为通过引用整体并入。

参考文献

Acuto，O.，and Cantrell，D.(2000).T cell activation and the cytoskeleton.Annu.Rev.Immunol.18，165-184.

Arcaro，a，Grégoire，C.，Boucheron，N.，Stotz，S.，Palmer，E.，Malissen，B.，andLuescher，I.F.(2000).Essential role of CD8 palmitoylation in CD8 coreceptorfunction.J.Immunol.165，2068-2076.

Chames，P.，and Baty，D.(2009).Bispecific antibodies for cancer therapy：the light at the end of the tunnel？MAbs 1，539-547.

Chervin，A.S.，Stone，J.D.，Hol|er，P.D.，Bai，A.，Chen，J.，Eisen，H.N.，andKranz，D.M.(2009).The impact of TCR-binding properties and antigenpresentation format on T cell responsiveness.J.Immunol.183，1166-1178.

Dotti，G.，Savoldo，B.，and Brenner，M.(2009).Fifteen years of genetherapy based on chimeric antigen receptors：“are we nearly there yet？”.Hum.Gene Ther.20，1229-1239.

Finney，H.M.，Akbar，A.N.，and Lawson，A.D.G.(2004).Activation of restinghuman primary T cells with chimeric receptors：costimulation from CD28，inducible costimulator，CD134，and CD137 in series with signals from the TCRzeta chain.J.Immunol.172.104-113.

Fragoso，R.，Ren，D.，Zhang，X.，Su，M.W.-C.，Burakoff，S.J.，and Jin，Y.-J.(2003).Lipid raft distribution of CD4 depends on its palmitoylation andassociation with Lck，and evidence for CD4-induced lipid raft aggregation asan additional mechanism to enhance CD3 signaling.J.Immunol.170，913-921.

Fry，T.J.，and Mackall，C.L.(2013).T-cell adoptive immunotherapy fbracute lymphoblastic leukemia.Hematology Am.Soc.Hematol.Educ.Program 2013，348-353.

Han，E.Q.，Li，X.，Wang，C.，Li，T.，and Han，S.(2013).Chimeric antigenreceptor-engineered T cells for cancer immunotherapy：progress andchallenges.J.Hematol.Oncol.6，47.

He，H.-T.，and Marguet，D.(2008).T-cell antigen receptor triggering andlipid refts：a matter of space and time scales.Talking Point on theinvolvement of lipid rafts in T-cell activation.EMBO Rep.9，525-530.

Humphries，C.(2013).Adoptive cell therapy：Honing that killerinstinct.Nature 504，S13-5.

Kim，P.W.，Sun，Z.J.，Blacklow，S.C.，Wagner，G.，and Eck，M.J.(2003).A zirlcclasp structure tethers Lck to T cell coreceptors CD4 and CD8.Science 301，1725-1728.

Kochenderfer，J.N.，and Rosenberg，S.A.(2013).Treating B-cell cancerwith T cells expressing anti-CD19 chimeric antigenreceptors.Nat.Rev.Clin.Oncol.10，267-276.

Kuhns，M.S.，and Davis，M.M.(2012).TCR Signaling Emerges from the Sum ofMany Parts.Front.Immunol.3，159.

Methi，T.，Ngai，J.，Mahic，M.，Amarzguioui，M.，Vang，T.，and Tasken，K.(2005).Short-interfering RNA-mediated Lck knockdown results in augmented downstreamT cell responses.J.lmmunol.175，7398-7406.

Milone，M.C.，Fish，J.D.，Carpenito，C.，Carroll，R.G.，Binder，G.K.，Teachey，D.，Samanta，M.，Lakhal，M.，Gloss，B.，Danet-Desnoyers，G.，et al.(2009).

Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domainsmediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy invivo.Mol.Ther.17，1453-1464.

Portell，C.a，Wenzell，C.M.，and Advani，A.S.(2013).Clinical andpharmacologic aspects of blinatumomab in the treatment of B-cell acutelymphoblastic leukemia.Clin.Pharmacol.5，5-11.

Yin，Y.，Wang，X.X.，and Mariuzza，R.a(2012).Crystal structure of acomplete ternary complex of T-cell receptor，peptide-MHC，and CD4.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.109，5405-5410.

序列表

<110> 麦克马斯特大学

<120> 三功能T细胞抗原偶联物及其制备方法和用途

<130> 3244-P47791PC00

<150> US 61/936,906

<151> 2014-02-07

<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1575

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成

<400> 1

atggatttcc aggtccagat tttctccttc ctgctgattt ccgcaagcgt cattatgtca 60

cggggctccg acctgggcaa aaagctgctg gaggccgcta gggccgggca ggacgatgaa 120

gtgagaatcc tgatggccaa cggggctgac gtgaatgcta aggatgagta cggcctgacc 180

cccctgtatc tggctacagc acacggccat ctggagatcg tggaagtcct gctgaaaaac 240

ggagccgacg tgaatgcagt cgatgccatt gggttcactc ctctgcacct ggcagccttt 300

atcggacatc tggagattgc agaagtgctg ctgaagcacg gcgctgacgt gaacgcacag 360

gataagttcg gaaaaaccgc ttttgacatc agcattggca acggaaatga agacctggct 420

gaaatcctgc agaaactgaa tgaacagaaa ctgattagcg aagaagacct gaaccccggg 480

ggaggaggag ggagcggggg aggaggcagc ggcgggggag gctctggagg aggagggagc 540

ggatccatgg acatccagat gactcagacc acaagctccc tgtctgcaag tctgggcgac 600

cgggtgacaa tctcctgcag agcctctcag gatattagga actacctgaa ttggtatcag 660

cagaaacctg atggcacagt caagctgctg atctactata ccagccggct gcactcaggc 720

gtgccaagca aattctcagg aagcggctcc gggactgact actccctgac catctctaac 780

ctggagcagg aagatattgc tacctatttc tgccagcagg gcaatacact gccctggact 840

tttgccggag gcaccaaact ggagatcaag gggggaggcg ggagtggagg cgggggatca 900

ggaggaggag gcagcggagg aggagggtcc gaggtccagc tgcagcagag cggaccagaa 960

ctggtgaagc ccggagcaag tatgaaaatc tcctgtaagg cctcaggata cagcttcacc 1020

ggctatacaa tgaactgggt gaaacagtcc catggcaaga acctggaatg gatggggctg 1080

attaatcctt acaaaggcgt cagcacctat aatcagaagt ttaaagacaa ggccacactg 1140

actgtggata agtctagttc aaccgcttac atggagctgc tgtccctgac atctgaagac 1200

agtgccgtgt actattgtgc tcggtctggc tactatgggg acagtgattg gtacttcgat 1260

gtctggggac agggcactac cctgaccgtg ttttctacta gtggcggagg aggatcactc 1320

gagagcggac aggtgctgct ggaatccaat atcaaagtcc tgcccacttg gtctaccccc 1380

gtgcagccta tggctctgat tgtgctggga ggagtcgcag gactgctgct gtttatcggg 1440

ctgggaattt tcttttgcgt gcgctgccgg caccggagaa ggcaggccga gcgcatgagc 1500

cagatcaagc gactgctgag cgagaagaaa acctgtcagt gtccccatag attccagaag 1560

acctgttcac ccatt 1575

<210> 2

<211> 525

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成

<400> 2

Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Ile Met Ser Arg Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala

20 25 30

Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly

35 40 45

Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Tyr Gly Leu Thr Pro Leu Tyr Leu

50 55 60

Ala Thr Ala His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn

65 70 75 80

Gly Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Ala Ile Gly Phe Thr Pro Leu His

85 90 95

Leu Ala Ala Phe Ile Gly His Leu Glu Ile Ala Glu Val Leu Leu Lys

100 105 110

His Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe

115 120 125

Asp Ile Ser Ile Gly Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln

130 135 140

Lys Leu Asn Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Pro Gly

145 150 155 160

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

165 170 175

Gly Gly Gly Ser Gly Ser Met Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser

180 185 190

Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala

195 200 205

Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp

210 215 220

Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly

225 230 235 240

Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu

245 250 255

Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln

260 265 270

Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu

275 280 285

Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

290 295 300

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu

305 310 315 320

Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly

325 330 335

Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly

340 345 350

Lys Asn Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser

355 360 365

Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys

370 375 380

Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp

385 390 395 400

Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp

405 410 415

Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Phe Ser

420 425 430

Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Ser Gly Gln Val Leu Leu Glu

435 440 445

Ser Asn Ile Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val Gln Pro Met

450 455 460

Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly

465 470 475 480

Leu Gly Ile Phe Phe Cys Val Arg Cys Arg His Arg Arg Arg Gln Ala

485 490 495

Glu Arg Met Ser Gln Ile Lys Arg Leu Leu Ser Glu Lys Lys Thr Cys

500 505 510

Gln Cys Pro His Arg Phe Gln Lys Thr Cys Ser Pro Ile

515 520 525

<210> 3

<211> 1647

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成

<400> 3

atggactttc aggtgcagat tttctctttt ctgctgattt ccgcaagcgt catcgagctc 60

gggggggggg ggtcaggatc catggacatc cagatgactc agaccacaag ctccctgagc 120

gcatccctgg gcgaccgagt gacaatctca tgcagagcca gccaggatat taggaactac 180

ctgaattggt atcagcagaa acctgacggc acagtcaagc tgctgatcta ctatacttcc 240

cggctgcact ctggcgtgcc aagtaaattc tctgggagtg gatcaggcac tgactactca 300

ctgaccatca gcaacctgga gcaggaagat attgctacct atttctgcca gcagggcaat 360

acactgccct ggacttttgc aggcgggacc aaactggaga tcaagggcgg cggcggaagt 420

ggaggaggag gctcaggcgg aggagggagc ggcggaggag gcagcgaggt ccagctgcag 480

cagagcggac cagaactggt gaagcctggc gcatccatga aaatctcttg taaggcctct 540

gggtacagtt tcaccggata tacaatgaac tgggtgaaac agtctcatgg caagaacctg 600

gaatggatgg gcctgattaa tccttacaaa ggcgtcagca cctataatca gaagtttaaa 660

gacaaggcca cactgactgt ggataagtct agttcaaccg cttacatgga gctgctgtca 720

ctgacaagcg aagactccgc cgtgtactat tgcgctagga gcggatacta tggcgactcc 780

gattggtact tcgatgtctg ggggcaggga actaccctga ccgtgtttag cactagtgga 840

ggaggaggct ctggaggagg agggagtgga ggcgggggat caggaggagg aggcagcgat 900

atcatgtcac ggggctccga cctgggcaaa aagctgctgg aggccgctag ggccgggcag 960

gacgatgaag tgagaatcct gatggccaac ggggctgacg tgaatgctaa ggatgagtac 1020

ggcctgaccc ccctgtatct ggctacagca cacggccatc tggagatcgt ggaagtcctg 1080

ctgaaaaacg gagccgacgt gaatgcagtc gatgccattg ggttcactcc tctgcacctg 1140

gcagccttta tcggacatct ggagattgca gaagtgctgc tgaagcacgg cgctgacgtg 1200

aacgcacagg ataagttcgg aaaaaccgct tttgacatca gcattggcaa cggaaatgaa 1260

gacctggctg aaatcctgca gaaactgaat gaacagaaac tgattagcga agaagacctg 1320

aacgtcgacg gaggaggagg gtctggagga gggggaagtg gcgggggagg cagcggggga 1380

ggcgggtctc tcgagagtgg ccaggtgctg ctggaaagca atatcaaggt cctgccaact 1440

tggtccaccc cagtgcagcc tatggctctg attgtgctgg gaggagtcgc aggactgctg 1500

ctgtttatcg gcctggggat tttcttttgc gtgcgctgcc ggcaccggag aaggcaggct 1560

gagcgcatgt ctcagattaa gcgactgctg agcgagaaga agacctgtca gtgcccccat 1620

agattccaga aaacctgttc acccatt 1647

<210> 4

<211> 549

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成

<400> 4

Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Ile Glu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Met Asp Ile Gln Met

20 25 30

Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr

35 40 45

Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr

50 55 60

Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser

65 70 75 80

Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

85 90 95

Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala

100 105 110

Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Ala Gly

115 120 125

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln

145 150 155 160

Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser

165 170 175

Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val

180 185 190

Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro

195 200 205

Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr

210 215 220

Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser

225 230 235 240

Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr

245 250 255

Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr

260 265 270

Leu Thr Val Phe Ser Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

275 280 285

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Met Ser Arg

290 295 300

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

305 310 315 320

Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala

325 330 335

Lys Asp Glu Tyr Gly Leu Thr Pro Leu Tyr Leu Ala Thr Ala His Gly

340 345 350

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn

355 360 365

Ala Val Asp Ala Ile Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Ile

370 375 380

Gly His Leu Glu Ile Ala Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val

385 390 395 400

Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Gly

405 410 415

Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn Glu Gln

420 425 430

Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Val Asp Gly Gly Gly Gly Ser

435 440 445

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu

450 455 460

Glu Ser Gly Gln Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile Lys Val Leu Pro Thr

465 470 475 480

Trp Ser Thr Pro Val Gln Pro Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val

485 490 495

Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile Phe Phe Cys Val Arg

500 505 510

Cys Arg His Arg Arg Arg Gln Ala Glu Arg Met Ser Gln Ile Lys Arg

515 520 525

Leu Leu Ser Glu Lys Lys Thr Cys Gln Cys Pro His Arg Phe Gln Lys

530 535 540

Thr Cys Ser Pro Ile

545

<210> 5

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成

<400> 5

atggatttcc aggtccagat tttctccttc ctgctgattt ccgcaagcgt catt 54

<210> 6

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成

<400> 6

Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Ile

<210> 7

<211> 387

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成

<400> 7

atgtcacggg gctccgacct gggcaaaaag ctgctggagg ccgctagggc cgggcaggac 60

gatgaagtga gaatcctgat ggccaacggg gctgacgtga atgctaagga tgagtacggc 120

ctgacccccc tgtatctggc tacagcacac ggccatctgg agatcgtgga agtcctgctg 180

aaaaacggag ccgacgtgaa tgcagtcgat gccattgggt tcactcctct gcacctggca 240

gcctttatcg gacatctgga gattgcagaa gtgctgctga agcacggcgc tgacgtgaac 300

gcacaggata agttcggaaa aaccgctttt gacatcagca ttggcaacgg aaatgaagac 360

ctggctgaaa tcctgcagaa actgaat 387

<210> 8

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成

<400> 8

Met Ser Arg Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg

1 5 10 15

Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp

20 25 30

Val Asn Ala Lys Asp Glu Tyr Gly Leu Thr Pro Leu Tyr Leu Ala Thr

35 40 45

Ala His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala

50 55 60

Asp Val Asn Ala Val Asp Ala Ile Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Ile Gly His Leu Glu Ile Ala Glu Val Leu Leu Lys His Gly

85 90 95

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile

100 105 110

Ser Ile Gly Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu

115 120 125

Asn

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成

<400> 9

gaacagaaac tgattagcga agaagacctg 30

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成

<400> 10

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

<210> 11

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成

<400> 11

aaccccgggg gaggaggagg gagcggggga ggaggcagcg gcgggggagg ctctggagga 60

ggagggagcg gatcc 75

<210> 12

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成

<400> 12

Asn Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser

20 25

<210> 13

<211> 750

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成

<400> 13

atggacatcc agatgactca gaccacaagc tccctgtctg caagtctggg cgaccgggtg 60

acaatctcct gcagagcctc tcaggatatt aggaactacc tgaattggta tcagcagaaa 120

cctgatggca cagtcaagct gctgatctac tataccagcc ggctgcactc aggcgtgcca 180

agcaaattct caggaagcgg ctccgggact gactactccc tgaccatctc taacctggag 240

caggaagata ttgctaccta tttctgccag cagggcaata cactgccctg gacttttgcc 300

ggaggcacca aactggagat caagggggga ggcgggagtg gaggcggggg atcaggagga 360

ggaggcagcg gaggaggagg gtccgaggtc cagctgcagc agagcggacc agaactggtg 420

aagcccggag caagtatgaa aatctcctgt aaggcctcag gatacagctt caccggctat 480

acaatgaact gggtgaaaca gtcccatggc aagaacctgg aatggatggg gctgattaat 540

ccttacaaag gcgtcagcac ctataatcag aagtttaaag acaaggccac actgactgtg 600

gataagtcta gttcaaccgc ttacatggag ctgctgtccc tgacatctga agacagtgcc 660

gtgtactatt gtgctcggtc tggctactat ggggacagtg attggtactt cgatgtctgg 720

ggacagggca ctaccctgac cgtgttttct 750

<210> 14

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成

<400> 14

Met Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu

1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn

20 25 30

Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu

65 70 75 80

Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

130 135 140

Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

145 150 155 160

Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Met

165 170 175

Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

180 185 190

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

195 200 205

Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp

225 230 235 240

Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Phe Ser

245 250

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成

<400> 15

actagtggcg gaggaggatc actcgag 27

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成

<400> 16

Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu

1 5

<210> 17

<211> 252

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成

<400> 17

agcggacagg tgctgctgga atccaatatc aaagtcctgc ccacttggtc tacccccgtg 60

cagcctatgg ctctgattgt gctgggagga gtcgcaggac tgctgctgtt tatcgggctg 120

ggaattttct tttgcgtgcg ctgccggcac cggagaaggc aggccgagcg catgagccag 180

atcaagcgac tgctgagcga gaagaaaacc tgtcagtgtc cccatagatt ccagaagacc 240

tgttcaccca tt 252

<210> 18

<211> 84

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成

<400> 18

Ser Gly Gln Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile Lys Val Leu Pro Thr Trp

1 5 10 15

Ser Thr Pro Val Gln Pro Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala

20 25 30

Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile Phe Phe Cys Val Arg Cys

35 40 45

Arg His Arg Arg Arg Gln Ala Glu Arg Met Ser Gln Ile Lys Arg Leu

50 55 60

Leu Ser Glu Lys Lys Thr Cys Gln Cys Pro His Arg Phe Gln Lys Thr

65 70 75 80

Cys Ser Pro Ile

<210> 19

<211> 56

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成

<400> 19

Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Leu Glu Ala Glu Ala

20 25 30

Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala

35 40 45

Ala Lys Ala Gly Gly Gly Gly Ser

50 55

<210> 20

<211> 55

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成

<400> 20

Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Leu Ser Pro Ser Pro Leu Ala Pro Gly

1 5 10 15

Pro Ala Ala Pro Ala Ala Leu Ala Pro Ala Pro Leu Ala Pro Gly Pro

20 25 30

Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ser Pro Ser Pro Leu Ala Pro Gly Pro Ser

35 40 45

Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser

50 55

<210> 21

<211> 66

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成

<400> 21

Ser Gly Ala Val Leu Leu Ala Ser Ala Val Ala Val Leu Pro Ser Ala

1 5 10 15

Ser Ser Pro Val Ala Pro Ser Gly Ala Val Leu Leu Ala Ser Ala Val

20 25 30

Ala Val Leu Pro Ser Ala Ser Ser Pro Val Ala Pro Ser Gly Ala Val

35 40 45

Leu Leu Ala Ser Ala Val Ala Val Leu Pro Ser Ala Ser Ser Pro Val

50 55 60

Ala Pro

65

<210> 22

<211> 729

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成

<400> 22

atgtctagac aggtacaact gcagcagtca ggacctgaac tgaagaagcc tggagagaca 60

gtcaagatct cctgcaaggc ctctgggtat cctttcacaa actatggaat gaactgggtg 120

aagcaggctc caggacaggg tttaaagtgg atgggctgga ttaacacctc cactggagag 180

tcaacatttg ctgatgactt caagggacgg tttgacttct ctttggaaac ctctgccaac 240

actgcctatt tgcagatcaa caacctcaaa agtgaagaca tggctacata tttctgtgca 300

agatgggagg tttaccacgg ctacgttcct tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtt 360

tcctctggcg gtggcggttc tggtggcggt ggctccggcg gtggcggttc tgacatccag 420

ctgacccagt ctcacaaatt cctgtccact tcagtaggag acagggtcag catcacctgc 480

aaggccagtc aggatgtgta taatgctgtt gcctggtatc aacagaaacc aggacaatct 540

cctaaacttc tgatttactc ggcatcctcc cggtacactg gagtcccttc tcgcttcact 600

ggcagtggct ctgggccgga tttcactttc accatcagca gtgtgcaggc tgaagacctg 660

gcagtttatt tctgtcagca acattttcgt actccattca cgttcggctc ggggacaaaa 720

ttggagatc 729

<210> 23

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成

<400> 23

Met Ser Arg Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys

1 5 10 15

Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe

20 25 30

Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

35 40 45

Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Ser Thr Gly Glu Ser Thr Phe Ala

50 55 60

Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Asp Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn

65 70 75 80

Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp Met Ala Thr

85 90 95

Tyr Phe Cys Ala Arg Trp Glu Val Tyr His Gly Tyr Val Pro Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser

130 135 140

His Lys Phe Leu Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys

145 150 155 160

Lys Ala Ser Gln Asp Val Tyr Asn Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys

165 170 175

Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr

180 185 190

Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe

195 200 205

Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe

210 215 220

Cys Gln Gln His Phe Arg Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys

225 230 235 240

Leu Glu Ile

<210> 24

<211> 750

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成

<400> 24

atggacatcc agatgactca gaccacaagc tccctgtctg caagtctggg cgaccgggtg 60

acaatctcct gcagagcctc tcaggatatt aggaactacc tgaattggta tcagcagaaa 120

cctgatggca cagtcaagct gctgatctac tataccagcc ggctgcactc aggcgtgcca 180

agcaaattct caggaagcgg ctccgggact gactactccc tgaccatctc taacctggag 240

caggaagata ttgttaccta tttctgccag cagggcaata cactgccctg gacttttgcc 300

ggaggcacca aactggagat caagggggga ggcgggagtg gaggcggggg atcaggagga 360

ggaggcagcg gaggaggagg gtccgaggtc cagctgcagc agagcggacc agaactggtg 420

aagcccggag caagtatgaa aatctcctgt aaggcctcag gatacagctt caccggctat 480

ccgatgaact gggtgaaaca gtcccatggc aagaacctgg aatggatggg gctgattaat 540

ccttacaaag gcgtcagcac ctataatcag aagtttaaag acaaggccac actgactgtg 600

gataagtcta gttcaaccgc ttacatggag ctgctgtccc tgacatctga agacagtgcc 660

gtgtactatt gtgctcggtc tggctactat ggggacagtg attggtactt cgatgtctgg 720

ggacagggca ctaccctgac cgtgttttct 750

<210> 25

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成

<400> 25

Met Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu

1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn

20 25 30

Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu

65 70 75 80

Gln Glu Asp Ile Val Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

130 135 140

Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

145 150 155 160

Pro Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Met

165 170 175

Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

180 185 190

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

195 200 205

Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp

225 230 235 240

Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Phe Ser

245 250

Claims (10)

1.核酸，其包含：

a.第一多核苷酸，其编码靶标特异性配体；

b.第二多核苷酸，其编码结合与TCR复合体相关的蛋白的配体；以及

c.第三多核苷酸，其编码T细胞受体信号传导结构域多肽。

2.如权利要求1所述的核酸，其中所述靶标特异性配体结合肿瘤抗原。

3.如权利要求1或2所述的核酸，其中所述靶标特异性配体为设计的锚蛋白重复(DARPin)多肽或scFv。

4.如权利要求1-3中任一项所述的核酸，其中所述与TCR复合体相关的蛋白为CD3。

5.如权利要求1-4中任一项所述的核酸，其中所述结合与TCR复合体相关的蛋白的配体为单链抗体。

6.如权利要求1-5中任一项所述的核酸，其中所述结合与TCR复合体相关的蛋白的配体为UCHT1或其变体。

7.如权利要求1-6中任一项所述的核酸，其中所述T细胞受体信号传导结构域多肽包含胞质结构域和跨膜结构域。

8.如权利要求7所述的核酸，其中所述胞质结构域为CD4胞质结构域并且所述跨膜结构域为CD4跨膜结构域。

9.如权利要求1-8中任一项所述的核酸，其中所述第一多核苷酸和第三多核苷酸与所述第二多核苷酸融合。

10.如权利要求1-8中任一项所述的核酸，其中所述第二多核苷酸和第三多核苷酸与所述第一多核苷酸融合。

Images