ES2951684T3

ES2951684T3 - Métodos y composiciones para estimular la respuesta inmune

Info

Publication number: ES2951684T3
Application number: ES18716138T
Authority: ES
Inventors: Mahjoub Bihi; Ugur Sahin; Mustafa Diken; Thorsten Klamp
Original assignee: TRON Translationale Onkologie an der Universitaetsmedizin der Johannes Gutenberg Universitaet Mainz gGmbH; Biontech SE
Current assignee: TRON Translationale Onkologie an der Universitaetsmedizin der Johannes Gutenberg Universitaet Mainz gGmbH; Biontech SE
Priority date: 2017-03-24
Filing date: 2018-03-21
Publication date: 2023-10-24
Anticipated expiration: 2038-03-21
Also published as: AU2018240421B2; AU2018240421A1; US20230074462A1; EP3600389A1; EP4241786A3; EP4241786A2; CA3056819A1; US11471522B2; JP2023036615A; JP7651261B2; US20200197508A1; JP2025023916A; US12168051B2; EP3600389B1; WO2018172426A1; JP2020511504A

Abstract

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para estimular una respuesta inmune. En particular, la presente invención se refiere a moléculas de ARN inmunoestimulantes que comprenden secuencias derivadas de una molécula de ARN que codifica una nucleoproteína del virus de la influenza A que actúan como adyuvantes y/o agentes inmunoestimuladores para mejorar las respuestas inmunes del huésped. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para estimular la respuesta inmune

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para estimular una respuesta inmune. En particular, la presente invención se refiere a moléculas de ARN inmunoestimuladoras que comprenden secuencias derivadas de una molécula de ARN que codifica la nucleoproteína del virus de la gripe A que actúan como adyuvantes y/o agentes inmunoestimuladores para potenciar las respuestas inmunes del huésped.

Antecedentes de la invención

El sistema inmunitario juega un papel importante en la defensa contra microorganismos, por ejemplo, virus, hongos y bacterias, así como en el reconocimiento y repulsión de células malignas (células tumorales). La evolución del sistema inmune resultó en una red altamente efectiva basada en dos tipos de defensa: la inmunidad innata y la adaptativa. En contraste con el antiguo sistema inmune innato evolutivo que se basa en receptores invariables que reconocen patrones moleculares comunes asociados con patógenos, la inmunidad adaptativa se basa en receptores de antígenos altamente específicos en células B (linfocitos B) y células T (linfocitos T) y selección clonal. Mientras que las células B generan respuestas inmunes humorales mediante la secreción de anticuerpos, las células T median las respuestas inmunes celulares que conducen a la destrucción de las células reconocidas.

La inmunoterapia específica de antígeno tiene como objetivo mejorar o inducir respuestas inmunes específicas en pacientes para controlar enfermedades infecciosas o malignas. La identificación de un número creciente de antígenos asociados a patógenos y tumores condujo a una amplia colección de objetivos adecuados para la inmunoterapia. La vacunación y la inmunización es la introducción de un antígeno no virulento en un sujeto, en donde el antígeno provoca que el sistema inmune del sujeto genere una respuesta inmunológica. A menudo, los antígenos de las vacunas son formas muertas o atenuadas de los microbios que causan la enfermedad. Se pueden usar diferentes formatos de antígenos para la vacunación, incluyendo células enteras enfermas, proteínas, péptidos o vectores inmunizantes tales como ARN, ADN o vectores virales que se pueden aplicar directamente in vivo o in vitro por pulsación de DC después de la transferencia al paciente. Sin embargo, los antígenos a menudo no son suficientemente inmunogénicos por sí mismos y no producen una respuesta inmune adecuada.

La inmunogenicidad de un antígeno puede incrementarse administrándolo en combinación con uno o más adyuvantes. Los adyuvantes aumentan la respuesta contra el antígeno ya sea actuando directamente sobre el sistema inmune o modificando las características farmacocinéticas del antígeno, lo que resulta en un aumento del tiempo de interacción entre el antígeno y el sistema inmune. Además, la adición de un adyuvante puede permitir el uso de una dosis más pequeña de antígeno para estimular una respuesta inmune similar, reduciendo así el coste de producción de una vacuna.

Se han descrito varios compuestos que exhiben actividad adyuvante. Estos adyuvantes varían en eficacia y, a veces, no son lo suficientemente fuertes para inducir una respuesta inmune de la potencia deseada, y algunos han tenido un uso limitado en humanos debido a sus efectos tóxicos. KRANZ L M ET AL: "Identification of RNA-based vaccine adjuvants through systematic fragmentation of the Influenza A nucleoprotein sequence", vol. 137, no. Suppl. 1, Sp. Iss. SI 1 de septiembre de 2012 (2012-09-01), páginas 761-762, divulgan ARN que codifican nucleoproteínas y su uso para estimular una respuesta inmune en un sujeto. Del documento WO2005097993, también se sabía que las secuencias encontradas en o cerca de los extremos 3' de los genomas de virus de ARN monocatenario de sentido negativo eran inmunoestimuladoras y se creía que incluían ciertos puntos de contacto que les permitían estimular la señalización a través de ciertos receptores tipo Toll (TLR, incluyendo al menos uno de TLR8 y TLR7) expresados en células inmunes.

Por lo tanto, existe la necesidad de sistemas adyuvantes efectivos para mejorar la eficacia y seguridad de las vacunas existentes y futuras.

Descripción de la invención

Resumen de la invención

La invención está definida por las reivindicaciones. Las reivindicaciones se refieren a una molécula de ARN aislada que tiene actividad inmunoestimuladora, en donde dicha molécula de ARN se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y 5 a 11, y usos terapéuticos de los mismos, en donde dicho ARN inmunoestimulador se formula en una formulación liposomal. Las realizaciones relativas a otras moléculas de ARN no forman parte de la invención.

Las referencias a métodos de tratamiento en los párrafos posteriores de esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.

La presente invención se basa, al menos en parte, en la identificación de moléculas de ARN inmunoestimuladoras que comprenden secuencias derivadas de una molécula de ARN que codifica la nucleoproteína del virus de la gripe A que actúan como adyuvantes o agentes inmunoestimuladores para potenciar las respuestas inmunes del huésped. Estas moléculas de a Rn inmunoestimuladoras se pueden utilizar como inmunoestimulantes in vivo.

Como se describe en el presente documento, se ha demostrado que las moléculas de ARN inmunoestimuladoras que comprenden secuencias derivadas de una molécula de ARN que codifica la nucleoproteína del virus de la gripe A inducen altos niveles de expresión de IFN-a. in vitro, así como in vivo y fuertes respuestas específicas de células B y T in vivo. Por consiguiente, estas moléculas de ARN inmunoestimuladoras son potentes adyuvantes para la vacunación y útiles en métodos y composiciones para estimular una respuesta inmune en un sujeto. Una realización de la invención comprende administrar una molécula de ARN inmunoestimuladora, como se describe en el presente documento, al sujeto, junto con uno o más antígenos, por ejemplo, antígenos contenidos en vacunas, para potenciar o promover una respuesta inmune específica de antígeno.

Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona un método para estimular una respuesta inmune en un sujeto que comprende proporcionar al sujeto al menos un antígeno y proporcionar una molécula de ARN inmunoestimuladora, comprendiendo la molécula de ARN inmunoestimuladora una secuencia derivada de una molécula de ARN que codifica la nucleoproteína del virus de la gripe A.

En una realización, la secuencia derivada de una molécula de ARN que codifica la nucleoproteína del virus de la gripe A comprende al menos un fragmento de una molécula de ARN que codifica la nucleoproteína del virus de la gripe A, o una variante de la misma.

En diferentes realizaciones, la secuencia derivada de una molécula de ARN que codifica la nucleoproteína del virus de la gripe A o al menos un fragmento de una molécula de ARN que codifica la nucleoproteína del virus de la gripe A, o una variante de la misma, se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, y SEQ ID NO: 11

En otro aspecto, la invención proporciona un método para estimular una respuesta inmune en un sujeto que comprende proporcionar al sujeto al menos un antígeno y proporcionar una molécula de ARN inmunoestimuladora, comprendiendo la molécula de ARN inmunoestimuladora la secuencia de SEQ ID NO: 1, o una variante del mismo. En una realización, la molécula de ARN inmunoestimuladora comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2, o una variante del mismo.

En una realización, la molécula de ARN inmunoestimuladora comprende además la secuencia de SEQ ID NO: 3, o una variante del mismo. En una realización, la molécula de ARN inmunoestimuladora comprende además la secuencia de SEQ ID NO: 4, o una variante del mismo.

En una realización, la molécula de ARN inmunoestimuladora comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5, o una variante del mismo.

En una realización, la molécula de ARN inmunoestimuladora comprende la secuencia de SEQ ID NO: 6, o una variante del mismo. En una realización, la molécula de ARN inmunoestimuladora comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7, o una variante del mismo.

En una realización, la molécula de ARN inmunoestimuladora comprende la secuencia de SEQ ID NO: 8, o una variante del mismo. En una realización, la molécula de ARN inmunoestimuladora comprende la secuencia de SEQ ID NO: 9, o una variante del mismo.

En una realización, la molécula de ARN inmunoestimuladora comprende la secuencia de SEQ ID NO: 10, o una variante del mismo. En una realización, la molécula de ARN inmunoestimuladora comprende la secuencia de SEQ ID NO: 11, o una variante del mismo.

En una realización de todos los aspectos de la invención, la molécula de ARN inmunoestimuladora es capaz de inducir una respuesta inmune específica de antígeno en el sujeto.

En una realización de todos los aspectos de la invención, la respuesta inmune comprende una respuesta de células B.

En una realización de todos los aspectos de la invención, la respuesta inmune comprende la producción de anticuerpos IgG asociados con una respuesta de tipo Th1.

En una realización de todos los aspectos de la invención, la molécula de ARN inmunoestimuladora es un agonista del receptor de tipo toll (TLR). En una realización, el TLR es TLR7.

En una realización de todos los aspectos de la invención, la molécula de ARN inmunoestimuladora es capaz de inducir la secreción de interferón alfa. En una realización, la secreción de interferón alfa implica células dendríticas plasmocitoides.

En una realización de todos los aspectos de la invención, la molécula de ARN inmunoestimuladora no induce sustancialmente la secreción de uno o más del factor de necrosis tumoral alfa, interferón gamma e interleucina 10.

En una realización de todos los aspectos de la invención, el al menos un antígeno se selecciona del grupo que consiste en antígenos de cáncer, virus, bacterias, hongos o parásitos.

En una realización de todos los aspectos de la invención, el sujeto es un mamífero. En una realización de todos los aspectos de la invención, el sujeto es un ser humano.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula de ARN inmunoestimuladora, al menos un antígeno y un vehículo farmacéuticamente aceptable, comprendiendo la molécula de ARN inmunoestimuladora una secuencia derivada de una molécula de ARN que codifica la nucleoproteína del virus de la gripe A.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula de ARN inmunoestimuladora, al menos un antígeno y un vehículo farmacéuticamente aceptable, comprendiendo la molécula de ARN inmunoestimuladora la secuencia de SEQ ID NO: 1, o una variante del mismo. En una realización, la molécula de ARN inmunoestimuladora comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2, o una variante del mismo.

En una realización de la composición farmacéutica de todos los aspectos de la invención, la molécula de ARN inmunoestimuladora es un agonista del receptor de tipo toll (TLR). En una realización, el TLR es TLR7.

En una realización de la composición farmacéutica de todos los aspectos de la invención, el al menos un antígeno se selecciona del grupo que consiste en antígenos de cáncer, virus, bacterias, hongos o parásitos.

Una composición farmacéutica descrita en el presente documento puede estar en forma de vacuna, que puede ser una vacuna terapéutica o profiláctica.

En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ARN aislada que comprende una secuencia derivada de una molécula de ARN que codifica la nucleoproteína del virus de la gripe A, en donde la molécula de ARN aislada tiene actividad inmunoestimuladora.

En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ARN aislada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1, o una variante de la misma, en donde la molécula de ARN aislada tiene actividad inmunoestimuladora. En una realización, la molécula de ARN aislada comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2, o una variante del mismo.

En una realización, la molécula de ARN aislada comprende además la secuencia de SEQ ID NO: 3, o una variante del mismo. En una realización, la molécula de ARN aislada comprende además la secuencia de SEQ ID NO: 4, o una variante del mismo.

En una realización, la molécula de ARN aislada comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5, o una variante del mismo. En una realización, la molécula de ARN aislada comprende la secuencia de SEQ ID NO: 6, o una variante del mismo. En una realización, la molécula de ARN aislada comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7, o una variante del mismo. En una realización, la molécula de ARN aislada comprende la secuencia de SEQ ID NO: 8, o una variante del mismo. En una realización, la molécula de ARN aislada comprende la secuencia de SEQ ID NO: 9, o una variante del mismo. En una realización, la molécula de ARN aislada comprende la secuencia de SEQ ID NO: 10, o una variante del mismo. En una realización, la molécula de ARN aislada comprende la secuencia de SEQ ID NO: 11, o una variante del mismo. En una realización de la molécula de ARN aislada de todos los aspectos de la invención, la molécula de ARN aislada es un agonista del receptor de tipo toll (TLR). En una realización, el TLR es TLR7.

En una realización de la invención, una molécula de ARN inmunoestimuladora o una molécula de ARN aislada descrita en el presente documento no es traducible, es decir, no es una plantilla para producir péptidos o proteínas.

Otro aspecto se refiere a un método para estimular una respuesta inmune en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica proporcionada de acuerdo con la invención.

En otros aspectos, la invención proporciona los agentes y composiciones descritos en el presente documento para su uso en los métodos de tratamiento descritos en el presente documento, en particular para estimular una respuesta inmune.

Otras características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Resumen esquemático de la estrategia de fragmentación secuencial aplicada utilizando el ARN que codifica gripe NP (2-2-8, NP 1-1565) como secuencia inicial

Figura 2: Síntesis de los ARNis por transcripción in vitro, composición y secuencia de los ARNis y control de calidad tras la purificación

Figura 3: Inducción de citocinas en PBMC humanas mediante los ARNis formulados

Figura 4: las pDC son las principales células efectoras de la secreción de IFN-a tras la estimulación con los ARNis Figura 5: Dependencia de la inducción de IFN-a mediada por ARNis NP71-Seq45 en PBMC humanas en TLR ubicados endosomalmente

Figura 6: Determinación del TLR endosomal sensible a nucleótidos que es activado por NP71-Seq45

Figura 7: Análisis del perfil de citoquinas que se induce en PBMC humanas mediante los ARNis formulados

Figura 8: Inducción de citoquinas en células de ratón mediante los ARNis formulados

Figura 9: Inducción dependiente del tiempo y de la dosis de IFN-a in vivo por el ARNis formulado

Figura 10: La administración iv repetitiva de los ARNis formulados a intervalos frecuentes conduce a una tolerancia de respuesta TLR sistémica que puede superarse mediante un régimen de inmunización adaptado

Figura 11: Los ARNis formulados en combinación con las VLP de HBcAg-#A79 inducen una respuesta de células B y T específica de antígeno in vivo

Figura 12: Inducción dependiente de la dosis de respuestas de células B y T específicas de antígeno mediante inmunización utilizando los ARNis formulados en combinación con las VLP de HBcAg-#A79

Figura 13: Los anticuerpos específicos de antígeno provocados por la inmunización con los ARNis formulados y las VLP de HBcAg-#A79 matan las células positivas objetivo por CDC

Figura 14: La inmunización de los ARNis formulados en combinación con las VLP de HBcAg-#A79 da como resultado una respuesta IgG2a/IgG1 específica de antígeno equilibrada

Figura 15: Dependencia de la respuesta de anticuerpos específicos de antígeno inducida por los ARNis formulados en combinación con las VLP de HBcAg-#A79 en las pDC

Figura 16: Inducción de citoquinas por ARNis formulado con F12 in vivo.

Descripción detallada de la invención

Aunque la presente invención se describe en detalle a continuación, debe entenderse que esta invención no se limita a las metodologías, protocolos y reactivos particulares descritos en el presente documento, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente, y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen los mismos significados que entiende comúnmente un experto en la técnica.

A continuación, se describirán los elementos de la presente invención. Estos elementos se enumeran con realizaciones específicas, sin embargo, debe entenderse que pueden combinarse de cualquier manera y en cualquier número para crear realizaciones adicionales. Los ejemplos descritos de diversas formas y las realizaciones preferidas no deben interpretarse como una limitación de la presente invención únicamente a las realizaciones descritas explícitamente. Debe entenderse que esta descripción respalda y abarca realizaciones que combinan las realizaciones descritas explícitamente con cualquier número de los elementos descritos y/o preferidos. Además, cualquier permutación y combinación de todos los elementos descritos en esta solicitud debe considerarse divulgada por la descripción de la presente solicitud a menos que el contexto indique lo contrario.

Preferiblemente, los términos utilizados en el presente documento se definen como se describe en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel y H. Kolbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basilea, Suiza

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de bioquímica, biología celular, inmunología y técnicas de ADN recombinante que se explican en la literatura en el campo (cf., por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprende" y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un determinado miembro, número entero o paso o grupo de miembros, enteros o pasos pero no la exclusión de cualquier otro miembro, número entero o paso o grupo de miembros, números enteros o pasos aunque en alguno de esos otros miembros, número entero o paso o grupo de miembros, números enteros o pasos pueden ser excluidos, es decir el objeto consiste en la inclusión de un miembro, número entero o paso o grupo de miembros, números enteros o pasos establecidos. Los términos "un" y "una" y "el/la" y referencias similares utilizadas en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o claramente contradicho por el contexto. La enumeración de intervalos de valores en el presente documento tiene la intención de servir simplemente como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentra dentro del intervalo. A menos que se indique lo contrario en el presente documento, cada valor individual se incorpora a la memoria descriptiva como si se mencionara individualmente en el presente documento.

Todos los métodos descritos en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o lenguaje ilustrativo (por ejemplo, "tal como"), proporcionado en el presente documento tiene la intención de ilustrar mejor la invención y no supone una limitación en el alcance de la invención reivindicada de otro modo. Ningún lenguaje en la memoria descriptiva debe interpretarse como una indicación de cualquier elemento no reivindicado esencial para la práctica de la invención.

Se citan varios documentos a lo largo del texto de esta memoria descriptiva.

La presente invención contempla el tratamiento o la prevención de enfermedades o trastornos mediante la estimulación de una respuesta inmune a un antígeno asociado con la enfermedad o trastorno. La respuesta inmune al antígeno se potencia mediante la administración de un antígeno vacunal o un ácido nucleico que codifica el antígeno vacunal junto con una o más moléculas de ARN inmunoestimuladoras descritas en el presente documento que actúan como adyuvantes.

El término "adyuvante" se refiere a compuestos que, cuando se administran en combinación con un antígeno a un individuo, prolongan, potencian o aceleran una respuesta inmune. Se supone que los adyuvantes ejercen su actividad biológica por uno o más mecanismos, incluyendo un aumento de la superficie del antígeno, una prolongación de la retención del antígeno en el cuerpo, un retraso en la liberación del antígeno, la orientación del antígeno a los macrófagos, aumento de la captación del antígeno, potenciación del procesamiento del antígeno, estimulación de la liberación de citoquinas, estimulación y activación de células inmunes tales como células B, macrófagos, células dendríticas, células T y activación inespecífica de células inmunes.

La presente invención describe moléculas de ARN inmunoestimuladoras que comprenden secuencias derivadas de una molécula de ARN que codifica la nucleoproteína del virus de la gripe A que actúan como adyuvantes y/o agentes inmunoestimuladores para potenciar las respuestas inmunes del huésped.

El término "molécula de ARN que codifica la nucleoproteína del virus de la gripe A" se refiere a una molécula de ARN que codifica la nucleoproteína (NP) o la proteína de la nucleocápside del virus de la gripe A.

Los virus de gripe A tienen genomas que comprenden ocho segmentos de ARN que codifican 10 polipéptidos identificados. Nueve de estos polipéptidos se incorporan a los viriones. Tres polipéptidos virales se insertan en la envoltura lipídica: las glicoproteínas hemaglutinina (HA) y neuraminidasa, involucradas en la entrada y salida de la célula, respectivamente, y M2, un canal iónico de baja abundancia involucrado en el desprendimiento y la maduración de la HA. Debajo de la membrana se encuentra la matriz o proteína M1, el principal componente estructural del virión que se cree que actúa como un adaptador entre la envoltura lipídica y las partículas internas de RNP y es probablemente la fuerza impulsora detrás de la gemación del virus. Dentro del caparazón de M1 se encuentran los RNP: estos comprenden los segmentos de ARN genómico en asociación con una ARN polimerasa trimérica (subunidades PB1, PB2 y PA) y cantidades estequiométricas de NP También se encuentran en el virión pequeñas cantidades del polipéptido NEP/NS2.

En una realización, el término "molécula de ARN que codifica la nucleoproteína del virus de la gripe A" se refiere a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID NO: 12 del listado de secuencias o una variante del mismo.

En una realización, las moléculas de ARN inmunoestimuladoras descritas en el presente documento comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 1, o una variante del mismo. En una realización, las moléculas de ARN inmunoestimuladoras comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 2, o una variante del mismo.

En una realización, las moléculas de ARN inmunoestimuladoras comprenden además la secuencia de SEQ ID NO: 3, o una variante del mismo. En una realización, las moléculas de ARN inmunoestimuladoras comprenden además la secuencia de SEQ ID NO: 4, o una variante del mismo.

En una realización, las moléculas de ARN inmunoestimuladoras descritas en el presente documento comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 5, o una variante del mismo.

En una realización, las moléculas de ARN inmunoestimuladoras descritas en el presente documento comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 6, o una variante del mismo. En una realización, la molécula de ARN inmunoestimuladora comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7, o una variante del mismo.

En una realización, las moléculas de ARN inmunoestimuladoras descritas en el presente documento comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 8, o una variante del mismo. En una realización, la molécula de ARN inmunoestimuladora comprende la secuencia de SEQ ID NO: 9, o una variante del mismo.

En una realización, las moléculas de ARN inmunoestimuladoras descritas en el presente documento comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 10, o una variante del mismo. En una realización, la molécula de ARN inmunoestimuladora comprende la secuencia de SEQ ID NO: 11, o una variante del mismo.

Las moléculas de ARN inmunoestimuladoras descritas en el presente documento inducen respuestas inmunes contra antígenos cuando se administran junto con estos antígenos. En una realización, la respuesta inmune comprende una respuesta de células B. En una realización, la respuesta inmune comprende la producción de anticuerpos IgG.

En una realización, las moléculas de ARN inmunoestimuladoras descritas en el presente documento son capaces de inducir la secreción de interferón alfa. En una realización, la secreción de interferón alfa implica células dendríticas plasmocitoides.

En una realización, las moléculas de ARN inmunoestimuladoras descritas en el presente documento no inducen sustancialmente la secreción de uno o más del factor de necrosis tumoral alfa, el interferón gamma y la interleucina 10.

En una realización, las moléculas de ARN inmunoestimuladoras descritas en el presente documento son moléculas recombinantes. En una realización, las moléculas de ARN inmunoestimuladoras descritas en el presente documento se obtienen mediante transcripción in vitro.

En diversas realizaciones, las moléculas de ARN inmunoestimuladoras descritas en el presente documento tienen una longitud de entre 20 a 400 nucleótidos, 20 a 200 nucleótidos, 20 a 100 nucleótidos, en particular 30 a 200 nucleótidos o 30 a 100 nucleótidos.

De acuerdo con la invención, se prefiere administrar las moléculas de ARN inmunoestimuladoras descritas en el presente documento formuladas en portadores o vehículos de suministro, tal como en una formulación de nanopartículas, en particular una formulación de lipoplex. Por consiguiente, las moléculas de ARN inmunoestimuladoras descritas en el presente documento pueden estar presentes formuladas en portadores o vehículos de administración tales como nanopartículas o una formulación de nanopartículas, en particular una formulación de lipoplex, como se describe en el presente documento.

En una realización, pueden usarse vehículos de suministro que suministren las moléculas de ARN inmunoestimuladoras a las células presentadoras de antígeno tales como las células dendríticas (DC) en el bazo después de la administración sistémica. Por ejemplo, las formulaciones de nanopartículas de ARN con un tamaño de partícula definido en las que la carga neta de las partículas es cercana a cero o negativa, tal como los lipoplejos electroneutros o cargados negativamente de ARN y liposomas, por ejemplo, los lipoplejos que comprenden DOTMA y DOPE o DOTMA y colesterol conducen a un suministro sustancial de ARN a las DC del bazo después de la administración sistémica. Particularmente preferida de acuerdo con la invención es una formulación de ARN en nanopartículas en donde la relación de carga de cargas positivas a cargas negativas en las nanopartículas es 1.4:1 o menos y/o el potencial zeta de las nanopartículas es 0 o menos. En una realización, la relación de carga de cargas positivas a cargas negativas en las nanopartículas está entre 1.4:1 y 1:8, preferiblemente entre 1.2:1 y 1:4, por ejemplo, entre 1:1 y 1:3 tal como entre 1:1.2 y 1:2, 1:1.2 y 1:1.8, 1:1.3 y 1:1.7, en particular entre 1:1.4 y 1:1.6, tal como aproximadamente 1:1.5. En una realización, el potencial zeta de las nanopartículas es -5 o menos, -10 o menos, -15 o menos, -20 o menos o -25 o menos. En diversas realizaciones, el potencial zeta de las nanopartículas es -35 o superior, -30 o superior o -25 o superior. En una realización, las nanopartículas tienen un potencial zeta de 0 mV a -50 mV, preferiblemente de 0 mV a -40 mV o de -10 mV a -30 mV. En una realización, las cargas positivas son aportadas por al menos un lípido catiónico presente en las nanopartículas y las cargas negativas son aportadas por el ARN. En una realización, las nanopartículas comprenden al menos un lípido auxiliar. El lípido auxiliar puede ser un lípido neutro o aniónico.

En una realización, las nanopartículas son lipoplejos que comprenden DOTMA y DOPE en una relación molar de 10:0 a 1:9, preferiblemente de 8:2 a 3:7, y más preferiblemente de 7:3 a 5:5 y en donde la relación de carga de cargas positivas en DOTMA a cargas negativas en el ARN es de 1.8:2 a 0.8:2, más preferiblemente de 1.6:2 a 1:2, aún más preferiblemente de 1.4:2 a 1.1:2 e incluso más preferiblemente de aproximadamente 1.2:2.

En una realización, las nanopartículas son lipoplejos que comprenden DOTMA y colesterol en una relación molar de 10:0 a 1:9, preferiblemente de 8:2 a 3:7, y más preferiblemente de 7:3 a 5:5 y en donde la relación de carga de cargas positivas en DOTMA a cargas negativas en el ARN es de 1.8:2 a 0.8:2, más preferiblemente de 1.6:2 a 1:2, aún más preferiblemente de 1.4:2 a 1.1:2 e incluso más preferiblemente de aproximadamente 1.2:2.

En una realización, las nanopartículas son lipoplejos que comprenden DOTAP y DOPE en una relación molar de 10:0 a 1:9, preferiblemente de 8:2 a 3:7, y más preferiblemente de 7:3 a 5:5 y en donde la relación de carga de cargas positivas en DOTMA a cargas negativas en el ARN es de 1.8:2 a 0.8:2, más preferiblemente de 1.6:2 a 1:2, aún más preferiblemente de 1.4:2 a 1.1:2 e incluso más preferiblemente de aproximadamente 1.2:2.

En una realización, las nanopartículas son lipoplejos que comprenden DOTMA y DOPE en una relación molar de 2:1 a 1:2, preferiblemente de 2:1 a 1:1, y en donde la relación de carga de cargas positivas en DOTMA a cargas negativas en el ARN es 1.4:1 o menos.

En una realización, las nanopartículas son lipoplejos que comprenden DOTMA y colesterol en una relación molar de 2:1 a 1:2, preferiblemente de 2:1 a 1:1, y en donde la relación de carga de cargas positivas en DOTMA a cargas negativas en el ARN es 1.4:1 o menos.

En una realización, las nanopartículas son lipoplejos que comprenden DOTAP y DOPE en una relación molar de 2:1 a 1:2, preferiblemente de 2:1 a 1:1, y en donde la relación de carga de cargas positivas en DOTAP a cargas negativas en el ARN es 1.4:1 o menos.

De acuerdo con la invención, el término "F12" designa liposomas que comprenden DOTMA y DOPE en una relación molar de 2:1 y lipoplejos con ARN que se forman usando tales liposomas.

De acuerdo con la invención, el término "F5" designa liposomas que comprenden DOTMA y colesterol en una proporción molar de 1:1 y lipoplejos con ARN que se forman usando tales liposomas.

Tal como se usa en el presente documento, el término "nanopartícula" se refiere a cualquier partícula que tenga un diámetro que la haga adecuada para la administración sistémica, en particular parenteral, de, en particular, ácidos nucleicos, típicamente un diámetro de menos de 1000 nanómetros (nm). En algunas realizaciones, una nanopartícula tiene un diámetro de menos de 600 nm. En algunas realizaciones, una nanopartícula tiene un diámetro de menos de 400 nm. En algunas realizaciones, una nanopartícula tiene un diámetro promedio en el intervalo de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 1000 nm, preferiblemente de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 400 nm, preferiblemente de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 300 nm tal como aproximadamente 150 nm a aproximadamente 200 nm. En algunas realizaciones, una nanopartícula tiene un diámetro en el intervalo de aproximadamente 200 a aproximadamente 700 nm aproximadamente 200 a aproximadamente 600 nm, preferiblemente alrededor de 250 a aproximadamente 550 nm, en particular alrededor de 300 a aproximadamente 500 nm o alrededor de 200 a aproximadamente 400 nm.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "formulación de nanopartículas" o términos similares se refieren a cualquier sustancia que contiene al menos una nanopartícula. En algunas realizaciones, una formulación de nanopartículas es una colección uniforme de nanopartículas. En algunas realizaciones, las formulaciones de nanopartículas son dispersiones o emulsiones. En general, se forma una dispersión o emulsión cuando se combinan al menos dos materiales inmiscibles.

El término "lipoplejo" o "lipoplejo de ácido nucleico", en particular "lipoplejo de ARN", se refiere a un complejo de lípidos y ácidos nucleicos, en particular ARN. Los lipoplejos se forman espontáneamente cuando los liposomas catiónicos, que a menudo también incluyen un lípido auxiliar neutro, se mezclan con ácidos nucleicos.

Si la presente invención se refiere a una carga tal como una carga positiva, una carga negativa o una carga neutra o un compuesto catiónico, un compuesto negativo o un compuesto neutro, esto generalmente significa que la carga mencionada está presente a un pH seleccionado, tal como un pH fisiológico. Por ejemplo, el término "lípido catiónico" significa un lípido que tiene una carga neta positiva a un pH seleccionado, tal como un pH fisiológico. El término "lípido neutro" significa un lípido que no tiene carga positiva o negativa neta y puede estar presente en forma de un ion anfótero neutro o sin carga a un pH seleccionado, tal como un pH fisiológico. Por "pH fisiológico" se entiende en el presente documento un pH de aproximadamente 7.5.

Los transportadores de nanopartículas, tal como los transportadores de lípidos contemplados para su uso en la presente invención, incluyen cualquier sustancia o vehículo con el que se pueda asociar un ácido nucleico tal como el ARN, por ejemplo, formando complejos con el ácido nucleico o formando vesículas en las que el ácido nucleico está encerrado o encapsulado. Esto puede dar como resultado una mayor estabilidad del ácido nucleico en comparación con el ácido nucleico desnudo. En particular, puede incrementarse la estabilidad del ácido nucleico en la sangre.

Los lípidos catiónicos, los polímeros catiónicos y otras sustancias con carga positiva pueden formar complejos con ácidos nucleicos con carga negativa. Estas moléculas catiónicas pueden usarse para complejar ácidos nucleicos, formando así, por ejemplo, los llamados lipoplexes o poliplexes, respectivamente, y se ha demostrado que estos complejos liberan ácidos nucleicos en las células.

Las preparaciones de ácidos nucleicos en nanopartículas para usar en la presente invención pueden obtenerse mediante diversos protocolos y a partir de diversos compuestos complejantes de ácidos nucleicos. Los lípidos, polímeros, oligómeros o anfípilas son agentes complejantes típicos. En una realización, el compuesto complejante comprende al menos un agente seleccionado del grupo que consiste en protamina, polietilenimina, una poli-L-lisina, una poli-L-arginina o una histona.

De acuerdo con la invención, la protamina es útil como agente portador catiónico. El término "protamina" se refiere a cualquiera de diversas proteínas fuertemente básicas de peso molecular relativamente bajo que son ricas en arginina y se encuentran asociadas especialmente con el ADN en lugar de histonas somáticas en las células espermáticas de diversos animales (como peces). En particular, el término "protamina" se refiere a las proteínas que se encuentran en el esperma de los peces que son fuertemente básicas, son solubles en agua, no se coagulan con el calor y producen principalmente arginina tras la hidrólisis. En forma purificada, se utilizan en una formulación de insulina de acción prolongada y para neutralizar los efectos anticoagulantes de la heparina. De acuerdo con la invención, el término "protamina" tal como se usa en el presente documento comprende cualquier secuencia de aminoácidos de protamina obtenida o derivada de fuentes nativas o biológicas, incluyendo fragmentos de la misma y formas multiméricas de dicha secuencia de aminoácidos o fragmento de la misma. Además, el término abarca polipéptidos (sintetizados) que son artificiales y están específicamente diseñados para propósitos específicos y no pueden aislarse de fuentes nativas o biológicas. La protamina utilizada de acuerdo con la presente invención puede ser protamina sulfatada o clorhidrato de protamina. En una realización preferida, la fuente de protamina utilizada para la producción de las nanopartículas descritas en el presente documento es protamina 5000 que contiene protamina a más de 10 mg/ml (5000 unidades neutralizantes de heparina por ml) en una solución salina isotónica.

Los liposomas son vesículas lipídicas microscópicas que a menudo tienen una o más bicapas de un lípido formador de vesículas, tal como un fosfolípido, y son capaces de encapsular un fármaco. Se pueden emplear diferentes tipos de liposomas en el contexto de la presente invención, incluyendo, sin limitarse a ellos, vesículas multilamelares (^mL^v), vesículas unilamelares pequeñas (SUV), vesículas unilamelares grandes (LUV), liposomas estéricamente estabilizados (SSL), vesículas multivesiculares (MV) y vesículas multivesiculares grandes (LMV), así como otras formas bicapa conocidas en la técnica. El tamaño y la lamelaridad del liposoma dependerán de la forma de preparación y la selección del tipo de vesículas que se van a utilizar dependerá del modo de administración preferido. Hay varias otras formas de organización supramolecular en las que los lípidos pueden estar presentes en un medio acuoso, que comprenden fases lamelares, fases hexagonales y hexagonales inversas, fases cúbicas, micelas, micelas inversas compuestas de monocapas. Estas fases también pueden obtenerse en combinación con ADN o ARN, y la interacción con ARN y ADN puede afectar sustancialmente al estado de fase. Las fases descritas pueden estar presentes en las formulaciones de ácido nucleico en nanopartículas de la presente invención.

Para la formación de lipoplejos de ácidos nucleicos a partir de ácidos nucleicos y liposomas, se puede utilizar cualquier método adecuado para formar liposomas siempre que proporcione los lipoplejos de ácidos nucleicos previstos. Los liposomas se pueden formar usando métodos estándar tales como el método de evaporación inversa (r Ev ), el método de inyección de etanol, el método de deshidratación-rehidratación (DRV), sonicación u otros métodos adecuados.

Después de la formación de los liposomas, los liposomas se pueden dimensionar para obtener una población de liposomas que tengan un intervalo de tamaño sustancialmente homogéneo.

Los lípidos formadores de bicapas suelen tener dos cadenas de hidrocarburo, en particular cadenas de acilo, y un grupo de cabeza, ya sea polar o no polar. Los lípidos formadores de bicapas están compuestos de lípidos naturales o de origen sintético, incluyendo los fosfolípidos, tal como la fosfatidilcolina, la fosfatidiletanolamina, el ácido fosfátido, el fosfatidilinositol y la esfingomielina, donde las dos cadenas hidrocarbonadas suelen tener entre 14 y 22 átomos de carbono en longitud, y tienen diversos grados de instauración. Otros lípidos adecuados para usar en la composición de la presente invención incluyen glicolípidos y esteroles tales como colesterol y sus diversos análogos que también pueden usarse en los liposomas.

Los lípidos catiónicos suelen tener una fracción lipofílica, tal como un esterol, una cadena de acilo o diacilo, y tienen una carga positiva neta global. El grupo de cabeza del lípido normalmente lleva la carga positiva. El lípido catiónico tiene preferiblemente una carga positiva de 1 a 10 valencias, más preferiblemente una carga positiva de 1 a 3 valencias y más preferiblemente una carga positiva de 1 valencia. Los ejemplos de lípidos catiónicos incluyen, pero no se limitan a, 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano (DOTMA); dimetildioctadecilamonio (DDAB); 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP); 1,2-dioleoil-3-dimetilamonio-propano (DODAP); propanos de 1,2-diaciloxi-3-dimetilamonio; propanos de 1,2-dialquiloxi-3-dimetilamonio; cloruro de dioctadecildimetilamonio (DODAC), 1,2-dimiristoiloxipropil-1,3-dimetilhidroxietilamonio (DMRIE) y 2,3-dioleoiloxi-N-[2(espermina carboxamida)etil]-N,N-dimetil-1-propanamio trifluoroacetato (DOSPA). Los preferidos son DOTMA, DOTAP, ADDAC y DOSPA. El más preferido es DOTMA.

Además, las nanopartículas descritas en el presente documento incluyen preferiblemente además un lípido neutro en vista de la estabilidad estructural y similares. El lípido neutro puede seleccionarse apropiadamente en vista de la eficiencia de suministro del complejo de ácido nucleico-lípido. Los ejemplos de lípidos neutros incluyen, pero no se limitan a, 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), diacilfosfatidil colina, diacilfosfatidil etanol amina, ceramida, esfingoemielina, cefalina, esterol y cerebrosido. Se prefiere DOPE y/o DOPC. El más preferido es DOPE. En el caso de que un liposoma catiónico incluya tanto un lípido catiónico como un lípido neutro, la relación molar del lípido catiónico al lípido neutro puede determinarse de manera apropiada en vista de la estabilidad del liposoma y similares.

De acuerdo con una realización, las nanopartículas descritas en el presente documento pueden comprender fosfolípidos. Los fosfolípidos pueden ser un glicerofosfolípido. Los ejemplos de glicerofosfolípido incluyen, sin limitarse a ellos, tres tipos de lípidos: (i) fosfolípidos zwitteriónicos, que incluyen, por ejemplo, fosfatidilcolina (PC), fosfatidilcolina de yema de huevo, PC derivada de soja en forma natural, parcialmente hidrogenada o totalmente hidrogenada, dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) esfingomielina (SM); (ii) fosfolípidos cargados negativamente: que incluyen, por ejemplo, fosfatidilserina (PS), fosfatidilinositol (PI), ácido fosfatídico (PA), fosfatidilglicerol (PG), dipalmipoil PG, dimiristoil fosfatidilglicerol (DMPG); derivados sintéticos en los que el conjugado da lugar a un fosfolípido zwitteriónico cargado negativamente, tal es el caso de metoxi-polietileno,glicol-diestearoil fosfatidiletanolamina (mPEG-DSPE); y (iii) fosfolípidos catiónicos, que incluyen, por ejemplo, fosfatidilcolina o esfingomielina cuyo fosfomonoéster se O-metiló para formar los lípidos catiónicos.

La asociación del ácido nucleico con el transportador lipídico puede ocurrir, por ejemplo, cuando el ácido nucleico llena los espacios intersticiales del transportador, de modo que el transportador atrapa físicamente al ácido nucleico, o mediante enlaces covalentes, iónicos o de hidrógeno, o mediante adsorción por enlaces no específicos.

El término "respuesta inmune" se refiere a una reacción del sistema inmune, preferiblemente a un antígeno, y preferiblemente se refiere a una respuesta inmune celular, una respuesta inmune humoral o ambas. Una respuesta inmune puede ser protectora/preventiva/profiláctica y/o terapéutica. De acuerdo con la invención, el término "respuesta inmune a" o "respuesta inmune contra" con respecto a un objetivo tal como un antígeno, una célula o un tejido, se refiere a una respuesta inmune dirigida contra el objetivo.

"Estimular una respuesta inmune" puede significar que no hubo una respuesta inmune contra un objetivo en particular, tal como un antígeno objetivo, antes de estimular una respuesta inmune, pero también puede significar que hubo un cierto nivel de respuesta inmune contra un objetivo en particular antes de estimular un sistema inmune y después de estimular una respuesta inmune se potencia dicha respuesta inmune. Por lo tanto, "estimular una respuesta inmune" incluye "inducir una respuesta inmune" y "potenciar una respuesta inmune". Preferiblemente, después de estimular una respuesta inmune en un sujeto, dicho sujeto está protegido contra el desarrollo de una enfermedad tal como una enfermedad cancerosa o se mejora la condición de la enfermedad estimulando una respuesta inmune. Por ejemplo, se puede estimular una respuesta inmune contra un antígeno tumoral en un paciente que tiene una enfermedad de cáncer o en un sujeto que está en riesgo de desarrollar una enfermedad de cáncer. Estimular una respuesta inmune en este caso puede significar que se mejora la condición de enfermedad del sujeto, que el sujeto no desarrolla metástasis, o que el sujeto que está en riesgo de desarrollar una enfermedad de cáncer no desarrolla una enfermedad de cáncer.

Los términos "respuesta inmune celular", "respuesta celular", "inmunidad mediada por células" o términos similares incluyen una respuesta celular dirigida a células caracterizada por la expresión de un antígeno y/o la presentación de un antígeno con clase I o clase II MHC. La respuesta celular se relaciona con células llamadas células T o linfocitos T que actúan como "auxiliares" o "asesinos". Las células T auxiliares (también denominadas células T CD4+) juegan un papel central en la regulación de la respuesta inmune y las células asesinas (también denominadas células T citotóxicas, células T citolíticas, células T CD8+ o CTL) matan células tal como las células enfermas.

El término "respuesta inmune humoral" se refiere a un proceso en organismos vivos en donde se producen anticuerpos en respuesta a agentes y organismos, que finalmente neutralizan y/o eliminan. La especificidad de la respuesta de anticuerpos está mediada por células T y/o B a través de receptores asociados a la membrana que se unen al antígeno de una sola especificidad. Después de la unión de un antígeno apropiado y la recepción de diversas otras señales de activación, los linfocitos B se dividen, lo que produce células B de memoria, así como clones de células plasmáticas secretoras de anticuerpos, cada uno de los cuales produce anticuerpos que reconocen el epítopo antigénico idéntico al reconocido por su receptor de antígeno. Los linfocitos B de memoria permanecen latentes hasta que su antígeno específico los activa posteriormente. Estos linfocitos proporcionan la base celular de la memoria y la escalada resultante en la respuesta de anticuerpos cuando se vuelven a exponer a un antígeno específico.

El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de inmunoglobulina, que es capaz de unirse específicamente a un epítopo en un antígeno. En particular, el término "anticuerpo" se refiere a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. El término "anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y combinaciones de cualquiera de los anteriores. Cada cadena pesada se compone de una región variable de cadena pesada (VH) y una región constante de cadena pesada (CH). Cada cadena ligera se compone de una región variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera (CL). Las regiones variables y las regiones constantes también se denominan en el presente documento dominios variables y dominios constantes, respectivamente. Las regiones VH y VL se pueden subdividir en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (^cD^r), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las CDR de una VH se denominan HCDR1, HCDR2 y HCDR3, las CDR de una VL se denominan LCDR1, LCDR2 y LCDR3. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de un anticuerpo comprenden la región constante de la cadena pesada (CH) y la región constante de la cadena ligera (CL), en donde CH se puede subdividir en el dominio constante CH1, una región bisagra y los dominios constantes CH₂y CH₃(dispuestos de extremo amino a extremo carboxi en el siguiente orden: CH1, CH₂, CH₃). Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huésped, inlcuyendo diversas células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas intactas derivadas de fuentes naturales o de fuentes recombinantes y pueden ser porciones inmunoactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos son típicamente tetrámeros de moléculas de inmunoglobulina. Los anticuerpos pueden existir en una variedad de formas que incluyen, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, Fv, Fab y F(ab)₂, así como anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos humanizados.

Los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen anticuerpos IgA tales como IgAl o IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM e IgD. En diversas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1, más particularmente un isotipo IgG1, kappa o IgG1, lambda (es decir, IgG1, k, A), un anticuerpo IgG2a (por ejemplo, IgG2a, k, A), un anticuerpo IgG2b (por ejemplo, IgG2b, k, A), un anticuerpo IgG3 (por ejemplo, IgG3, k, A) o un anticuerpo IgG4 (por ejemplo, IgG4, k, A).

El término "inmunoglobulina" se refiere a proteínas de la superfamilia de inmunoglobulinas, preferiblemente a receptores de antígenos tales como anticuerpos o el receptor de células B (BCR). Las inmunoglobulinas se caracterizan por un dominio estructural, es decir, el dominio de inmunoglobulina, que tiene un plegamiento de inmunoglobulina (Ig) característico. El término abarca inmunoglobulinas unidas a la membrana, así como inmunoglobulinas solubles. Las inmunoglobulinas unidas a membrana también se denominan inmunoglobulinas de superficie o inmunoglobulinas de membrana, que generalmente forman parte del BCR. Las inmunoglobulinas solubles se denominan generalmente anticuerpos. Las inmunoglobulinas generalmente comprenden varias cadenas, normalmente dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas que están unidas mediante enlaces disulfuro. Estas cadenas se componen principalmente de dominios de inmunoglobulina, tal como el dominio V^l(cadena ligera variable), el dominio C^l(cadena ligera constante), el dominio V^h(cadena pesada variable), y dominios C^h(cadena pesada constante) C^h1, C^h2, C^h3 y C^h4. Hay cinco tipos de cadenas pesadas de inmunoglobulina de mamífero, es decir, a, 8, £, y y M, que representan las diferentes clases de anticuerpos, es decir, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. A diferencia de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas solubles, las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas de membrana o de superficie comprenden un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático corto en su extremo carboxilo. En los mamíferos hay dos tipos de cadenas ligeras es decir lambda y kappa. Las cadenas de inmunoglobulina comprenden una región variable y una región constante. La región constante se conserva esencialmente dentro de los diferentes isotipos de las inmunoglobulinas, en donde la parte variable es muy diversa y explica el reconocimiento del antígeno.

De acuerdo con la invención, el término "antígeno" o "inmunógeno" cubre cualquier sustancia, preferiblemente un péptido o una proteína, que es el objetivo de una respuesta inmune y/o que provocará una respuesta inmune. En particular, un "antígeno" se refiere a cualquier sustancia que reacciona específicamente con anticuerpos o linfocitos T (células T). De acuerdo con la presente invención, el término "antígeno" comprende cualquier molécula que comprende al menos un epítopo tal como un epítopo de células B o células T adecuado para la vacunación. Preferiblemente, un antígeno en el contexto de la presente invención es una molécula que, opcionalmente después del procesamiento, induce una reacción inmune, que es preferiblemente específica para el antígeno o las células que expresan el antígeno. De acuerdo con la presente invención, puede usarse cualquier antígeno adecuado que sea candidato para una reacción inmune. Un antígeno es preferiblemente un producto que corresponde o se deriva de un antígeno de origen natural. Dichos antígenos de origen natural pueden incluir o pueden derivar de alérgenos, virus, bacterias, hongos, parásitos y otros agentes infecciosos y patógenos, o un antígeno también puede ser un antígeno tumoral. En realizaciones preferidas, el antígeno es o se deriva de un polipéptido de superficie, es decir, un polipéptido que se muestra de forma natural en la superficie de una célula, un patógeno, una bacteria, un virus, un hongo, un parásito, un alérgeno o un tumor. El antígeno puede provocar una respuesta inmune contra una célula, un patógeno, una bacteria, un virus, un hongo, un parásito, un alérgeno o un tumor.

De acuerdo con la presente invención, un antígeno puede seleccionarse del grupo que comprende un antígeno propio y un antígeno no propio tal como un antígeno bacteriano, un antígeno viral, un antígeno fúngico, un alérgeno o un antígeno parásito.

En una realización preferida, un antígeno está asociado con una enfermedad o trastorno, es decir, el antígeno es un antígeno asociado a una enfermedad. El término "antígeno asociado a la enfermedad" se refiere a todos los antígenos que tienen importancia patológica. En una realización particularmente preferida, un antígeno asociado a una enfermedad está presente en células, tejidos y/u órganos enfermos mientras que no está presente o está presente en una cantidad reducida en células, tejidos y/u órganos sanos y, por lo tanto, puede usarse para orientarse a células, tejidos y/u órganos enfermos. En una realización, un antígeno asociado a una enfermedad está presente en la superficie de una célula enferma. En una realización, un antígeno asociado a una enfermedad es una molécula que contiene al menos un epítopo que estimulará el sistema inmune de un huésped para generar una respuesta inmune humoral y/o celular contra la enfermedad. Por lo tanto, el antígeno asociado a la enfermedad puede usarse con fines terapéuticos. Los antígenos asociados a enfermedades están preferiblemente asociados con infección por microbios, típicamente antígenos microbianos, o asociados con cáncer, típicamente tumores.

En algunas realizaciones, el antígeno es o se deriva de un antígeno bacteriano. En algunas realizaciones, el antígeno provoca una respuesta inmune contra una bacteria que infecta a los animales, incluyendo pájaros, peces y mamíferos, incluyendo los animales domésticos. Preferiblemente, la bacteria contra la que se provoca la respuesta inmune es una bacteria patógena.

En algunas realizaciones, el antígeno es o se deriva de un antígeno viral. Un antígeno de virus puede ser, por ejemplo, un péptido de una proteína de superficie de virus, por ejemplo, un polipéptido de cápside o un polipéptido de punta. En algunas realizaciones, el antígeno provoca una respuesta inmune contra un virus que infecta a los animales, incluyendo pájaros, peces y mamíferos, incluyendo los animales domésticos. Preferiblemente, el virus contra el que se provoca la respuesta inmune es un virus patógeno.

En algunas realizaciones, el antígeno es o se deriva de un péptido o proteína de un hongo. En algunas realizaciones, el antígeno provoca una respuesta inmune contra un hongo que infecta a los animales, incluyendo pájaros, peces y mamíferos, incluyendo los animales domésticos. Preferiblemente, el hongo contra el que se provoca la respuesta inmune es un hongo patógeno.

En algunas realizaciones, el antígeno es o se deriva de un péptido o proteína de un parásito eucariótico unicelular. En algunas realizaciones, el antígeno provoca una respuesta inmune contra un parásito eucariota unicelular, preferiblemente un parásito eucariota unicelular patógeno. Los parásitos eucariotas unicelulares patógenos pueden ser, por ejemplo, del género Plasmodium, por ejemplo P falciparum, P vivax, P malariae o P ovale, del género Leishmania, o del género Trypanosoma, por ejemplo T cruzi o T brucei.

En algunas realizaciones, el antígeno es o se deriva de un péptido alergénico o una proteína alergénica. Un péptido alergénico o proteína alergénica es adecuado para la inmunoterapia con alérgenos, también conocida como hiposensibilización.

En una realización preferida, un antígeno es un antígeno tumoral o un antígeno asociado a un tumor, es decir, un constituyente de células cancerosas que puede derivarse del citoplasma, la superficie celular y el núcleo celular, en particular aquellos antígenos que se producen, preferiblemente en gran cantidad, como antígenos de superficie en las células cancerosas.

En el contexto de la presente invención, el término "antígeno tumoral" o "antígeno asociado a un tumor" se refiere a proteínas que, en condiciones normales, se expresan específicamente en un número limitado de tejidos y/u órganos o en etapas de desarrollo específicas, por ejemplo, el antígeno tumoral puede expresarse específicamente en condiciones normales en el tejido del estómago, preferiblemente en la mucosa gástrica, en los órganos reproductores, por ejemplo, en los testículos, en el tejido trofoblástico, por ejemplo, en la placenta, o en las células de la línea germinal, y se expresan o se expresan de forma anómala en uno o más tejidos tumorales o cancerosos. En este contexto, "un número limitado" preferiblemente significa no más de 3, más preferiblemente no más de 2. Los antígenos tumorales en el contexto de la presente invención incluyen, por ejemplo, antígenos de diferenciación, preferiblemente antígenos de diferenciación específicos de tipo celular, es decir, proteínas que en condiciones normales se expresan específicamente en un determinado tipo celular en una determinada etapa de diferenciación, antígenos de cáncer/testículo, es decir, proteínas que en condiciones normales se expresan específicamente en los testículos y, a veces, en la placenta, y antígenos específicos de la línea germinal. En el contexto de la presente invención, el antígeno tumoral se asocia preferiblemente con la superficie celular de una célula cancerosa y preferiblemente no se expresa o se expresa raramente en tejidos normales. Preferiblemente, el antígeno tumoral o la expresión anómala del antígeno tumoral identifica las células cancerosas. En el contexto de la presente invención, el antígeno tumoral que es expresado por una célula cancerosa en un sujeto, por ejemplo, un paciente que padece una enfermedad de cáncer es preferiblemente una proteína propia en dicho sujeto. En realizaciones preferidas, el antígeno tumoral en el contexto de la presente invención se expresa en condiciones normales específicamente en un tejido u órgano que no es esencial, es decir, tejidos u órganos que cuando son dañados por el sistema inmune no conducen a la muerte del sujeto, o en órganos o estructuras del cuerpo que no son o son difícilmente accesibles para el sistema inmune.

Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del antígeno tumoral es idéntica entre el antígeno tumoral que se expresa en tejidos normales y el antígeno tumoral que se expresa en tejidos cancerosos.

Ejemplos de antígenos tumorales que pueden ser útiles en la presente invención son p53, ART-4, BAGE, betacatenina/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, c As P-8, CDC₂7/m, CDK4/m, CEA, las proteínas de la superficie celular de la familia de las claudinas, tales como CLAUDIN-6, CLAUDIN-18.2 y CLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (or hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, preferiblemente MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, o MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 menor BCR-abL, Pm1/RARa, PRAME, proteinasa 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 or RU2, SAGE, SART-1 or SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE y WT Los antígenos tumorales particularmente preferidos incluyen CLAUDIN-18.2 (CLDN18.2) y CLAUDIN-6 (CLDN6).

Un antígeno que se proporciona de acuerdo con la invención a un sujeto ya sea administrando el antígeno o un ácido nucleico que codifica el antígeno, es decir, un antígeno de vacuna debe dar como resultado una respuesta de células B y/o una respuesta de células T. Los anticuerpos y/o células T deben estar dirigidos contra un antígeno objetivo, en particular un antígeno objetivo expresado por o en células, tejidos y/u órganos enfermos, es decir, un antígeno asociado a la enfermedad. Así, un antígeno de vacuna puede corresponder o comprender el antígeno asociado a la enfermedad, o puede ser una variante del mismo. En una realización, dicha variante es inmunológicamente equivalente al antígeno asociado a la enfermedad. En el contexto de la presente invención, el término "variante de un antígeno" significa un agente que da como resultado una respuesta de células B y/o una respuesta de células T dirigida al antígeno, es decir, un antígeno asociado a una enfermedad, en particular cuando se expresa en células, tejidos y/u órganos enfermos, o células que expresan el antígeno y, opcionalmente, presentan el antígeno en el contexto de moléculas MHC. Así, el antígeno de la vacuna puede ser idéntico al antígeno asociado a la enfermedad, puede comprender el antígeno asociado a la enfermedad o una porción del mismo o puede comprender un antígeno que es homólogo al antígeno asociado a la enfermedad o una porción del mismo. Si el antígeno de la vacuna comprende una porción del antígeno asociado a la enfermedad o una porción de un antígeno que es homólogo al antígeno asociado a la enfermedad, dicha porción puede comprender un epítopo del antígeno asociado a la enfermedad al que se orienta la respuesta de las células B y/o la respuesta de las células T. Por lo tanto, de acuerdo con la invención, un antígeno puede comprender un fragmento inmunogénico de un antígeno asociado a una enfermedad tal como un fragmento peptídico de un antígeno asociado a una enfermedad. Un "fragmento inmunogénico de un antígeno" de acuerdo con la invención se refiere preferiblemente a una porción o fragmento de un antígeno que es capaz de estimular una respuesta de células B y/o una respuesta de células T. El antígeno vacunal o el ácido nucleico que codifica un antígeno vacunal que se va a administrar de acuerdo con la invención puede ser un antígeno recombinante o un ácido nucleico recombinante.

El término "equivalente inmunológico" significa que la molécula equivalente inmunológicamente, tal como la secuencia de aminoácidos inmunológicamente equivalente, exhibe las mismas o esencialmente las mismas propiedades inmunológicas y/o ejerce los mismos o esencialmente los mismos efectos inmunológicos, por ejemplo, con respecto al tipo del efecto inmunológico. En el contexto de la presente invención, el término "equivalente inmunológico" se usa preferiblemente con respecto a los efectos o propiedades inmunológicos de los antígenos o variantes de antígenos usados para la inmunización. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos es inmunológicamente equivalente a una secuencia de aminoácidos de referencia si dicha secuencia de aminoácidos, cuando se expone al sistema inmune de un sujeto, induce una reacción inmune que tiene la especificidad de reaccionar con la secuencia de aminoácidos de referencia.

El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico en una molécula tal como un antígeno, es decir, a una parte o fragmento de la molécula que es reconocida, es decir, unida, por el sistema inmune, por ejemplo, que es reconocida por un anticuerpo o receptor de células T Por ejemplo, los epítopos son los sitios tridimensionales discretos en un antígeno, que son reconocidos por el sistema inmune. Los epítopos suelen consistir en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y normalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque la unión a los primeros, pero no a los últimos se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes. Preferiblemente, un epítopo es capaz de provocar una respuesta inmune contra el antígeno o una célula que expresa el antígeno. Preferiblemente, el término se refiere a una porción inmunogénica de un antígeno que comprende el epítopo. Un epítopo de una proteína tal como un antígeno tumoral comprende preferiblemente una porción continua o discontinua de dicha proteína y tiene preferiblemente entre 5 y 100, preferiblemente entre 5 y 50, más preferiblemente entre 8 y 30, lo más preferiblemente entre 10 y 25 aminoácidos de longitud, por ejemplo, el epítopo puede tener preferiblemente 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos de longitud. Se prefiere que el epítopo en el contexto de la presente invención sea un epítopo de células B o un epítopo de células T

Como se usa en el presente documento, el término "epítopo de células T" se refiere a un péptido que se une a una molécula de MHC en una configuración reconocida por un receptor de células T Típicamente, los epítopos de células T se presentan en la superficie de una célula presentadora de antígeno. Un "epítopo de células T" de acuerdo con la invención se refiere preferiblemente a una porción o fragmento de un antígeno que es capaz de estimular una respuesta inmune, preferiblemente una respuesta celular contra el antígeno o células caracterizada por la expresión del antígeno y preferiblemente por la presentación del antígeno. Preferiblemente, un epítopo de células T es capaz de estimular una respuesta celular contra una célula caracterizada por la presentación de un antígeno. Preferiblemente, los epítopos de células T son péptidos presentados por MHC de clase I y/o clase II. Preferiblemente, los epítopos de células T comprenden una secuencia de aminoácidos que corresponde sustancialmente a la secuencia de aminoácidos de un fragmento de un antígeno. Preferiblemente, dicho fragmento de un antígeno es un péptido presentado por MHC de clase I y/o clase II. Un péptido que es adecuado para unirse a una molécula de MHC, en particular una molécula de MHC de clase I, preferiblemente tiene una longitud de 7 a 20 aminoácidos, más preferiblemente una longitud de 7 a 12 aminoácidos, más preferiblemente una longitud de 8 a 11 aminoácidos, en particular de 9 o 10 aminoácidos de longitud. En una realización, un epítopo de células T cuando se presenta en el contexto de MHC tal como MHC de células presentadoras de antígenos es reconocido por un receptor de células T El epítopo de células T, si es reconocido por un receptor de células T, puede inducir, en presencia de señales coestimuladoras apropiadas, la expansión clonal de las células T que llevan el receptor de células T que reconoce específicamente el epítopo de células T. Preferiblemente, los epítopos de células T, en particular si se presentan en el contexto de moléculas MHC, son capaces de estimular una respuesta inmune, preferiblemente una respuesta celular contra el antígeno del que derivan o células caracterizadas por la expresión del antígeno y preferiblemente caracterizadas por la presentación del antígeno.

De acuerdo con la invención, un epítopo de células T puede estar presente en un antígeno de vacuna como parte de una entidad mayor tal como una secuencia de vacuna y/o un polipéptido que comprende más de un epítopo de células T. El péptido presentado o el epítopo de células T se produce siguiendo un procesamiento adecuado. Además, los epítopos de células T pueden modificarse en uno o más residuos que no son esenciales para el reconocimiento de TCR o para la unión a MHC. Dichos epítopos de células T modificados pueden considerarse inmunológicamente equivalentes.

La vacunación de acuerdo con la invención usando antígenos como se describe en el presente documento da como resultado preferiblemente una respuesta inmune contra antígenos asociados a enfermedades o epítopos de los mismos. Preferiblemente, tales antígenos asociados a enfermedades o epítopos de los mismos comprenden una o más modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad, por ejemplo, comprenden o son neoantígenos o neoepítopos asociados a enfermedades. Preferiblemente, la modificación de un aminoácido específico de la enfermedad se debe a una o más mutaciones somáticas específicas de la enfermedad. En una realización particularmente preferida, una modificación de aminoácidos específica de la enfermedad es una modificación de aminoácidos específica del cáncer y una mutación somática específica de la enfermedad es una mutación somática específica del cáncer. Por lo tanto, en una realización, un antígeno de vacuna preferiblemente presenta modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad/mutaciones somáticas específicas de la enfermedad de un paciente y preferiblemente, tras la administración, proporciona uno o más neoepítopos basados en mutaciones. Por lo tanto, el antígeno de la vacuna puede comprender un péptido o polipéptido que comprende uno o más neoepítopos basados en mutaciones. En una realización, las modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad se identifican mediante la identificación de mutaciones somáticas específicas de la enfermedad, por ejemplo, secuenciando el ADN genómico y/o el ARN del tejido enfermo o de una o más células enfermas.

Tal como se usa en el presente documento, el término "neoepítopo" se refiere a un epítopo que no está presente en una referencia tal como una célula normal no enferma (por ejemplo, no cancerosa) o de línea germinal pero que se encuentra en células enfermas (por ejemplo, células cancerosas). Esto incluye, en particular, situaciones en las que en una célula normal no enferma o de línea germinal se encuentra un epítopo correspondiente, sin embargo, debido a una o más mutaciones en una célula enferma, la secuencia del epítopo cambia para dar como resultado el neoepítopo.

De acuerdo con la invención, el término "vacuna" se refiere a una preparación farmacéutica (composición farmacéutica) o producto que al administrarse induce una respuesta inmune, que reconoce y ataca a un patógeno o a una célula enferma tal como una célula cancerosa. Una vacuna puede usarse para la prevención o el tratamiento de una enfermedad. En particular, el término "vacuna" se refiere a una composición que incluye un antígeno, como se define en el presente documento.

En una realización, una vacuna proporcionada de acuerdo con la invención comprende un antígeno de vacuna, en el presente documento también denominado simplemente "antígeno", como se describe en el presente documento para estimular una respuesta inmune útil terapéutica o profilácticamente o un ácido nucleico, preferiblemente ARN, que codifica un antígeno peptídico o proteico.

Los antígenos descritos en el presente documento, cuando se administran a un sujeto, preferiblemente proporcionan uno o más epítopos adecuados para estimular una respuesta inmune específica de la enfermedad. En una realización, la respuesta inmune específica de la enfermedad es una respuesta inmune específica del antígeno que preferiblemente se dirige contra un antígeno asociado a la enfermedad. La presentación de estos epítopos, por ejemplo, por células enfermas o agentes patógenos, sirve como etiqueta para la respuesta inmune.

En una realización de la invención, un antígeno descrito en el presente documento es o se proporciona en forma de una partícula similar a un virus (VLP). Las partículas similares a virus se parecen a los virus, pero no son infecciosas porque no contienen material genético viral. La expresión de proteínas estructurales virales, tal como la envoltura o la cápside, puede dar como resultado el autoensamblaje de partículas similares a virus. Se han producido partículas similares a virus a partir de componentes de una amplia variedad de familias de virus, incluyendo Parvoviridae (por ejemplo, virus adenoasociados), Retroviridae (por ejemplo, VIH), Flaviviridae (por ejemplo, virus de la hepatitis C) y bacteriófagos (por ejemplo, Qp, AP205). Las partículas similares a virus se pueden producir en múltiples sistemas de cultivo celular que incluyen bacterias, líneas celulares de mamíferos, líneas celulares de insectos, levaduras y células vegetales. Las partículas similares a virus son útiles como vacunas. Las partículas similares a virus contienen muestras repetitivas y de alta densidad de proteínas de superficie viral que presentan epítopos virales conformacionales que pueden provocar fuertes respuestas inmunes de células T y células B. Dado que las partículas similares a virus no pueden replicarse, proporcionan una alternativa más segura a los virus atenuados.

Las partículas similares a virus, tales como las partículas similares a virus del antígeno central del virus de la hepatitis B (HBcAg), también son útiles como portadores no infecciosos de epítopos inmunológicos extraños. El antígeno central del virus de la hepatitis B (HBcAg) se ensambla espontáneamente para formar partículas de nucleocápsidas icosaédricas. Las partículas similares a virus, tales como las partículas de HBcAg recombinante, se pueden usar para mostrar epítopos de proteínas virales, epítopos de proteínas bacterianas y protozoarias, así como epítopos de antígenos tumorales. La visualización densa y altamente repetitiva y el espaciado de los epítopos insertados parecen óptimos para el entrecruzamiento del receptor de células B.

Los enfoques inmunoterapéuticos de acuerdo con la invención incluyen inmunización con antígeno peptídico o proteico (nativo o modificado), ácido nucleico que codifica antígeno peptídico o proteico, células recombinantes que codifican antígeno peptídico o proteico, virus recombinantes que codifican antígeno peptídico o proteico y células presentadoras de antígeno pulsadas con péptido o antígeno proteico (nativo o modificado) o transfectado con ácidos nucleicos que codifican antígeno peptídico o proteico.

En una realización, el objetivo es proporcionar una respuesta inmune contra las células cancerosas que expresan un antígeno tumoral y tratar una enfermedad cancerosa que implica células que expresan un antígeno tumoral. Dichas células cancerosas que expresan un antígeno tumoral pueden expresar el antígeno tumoral en la superficie de dichas células cancerosas y/o pueden presentar el antígeno tumoral en la superficie celular en el contexto de moléculas MHC. Las células cancerosas que expresan un antígeno tumoral en la superficie celular pueden ser objeto de anticuerpos dirigidos contra el antígeno tumoral, en particular, la porción extracelular del antígeno tumoral. Las células cancerosas que presentan un antígeno tumoral en la superficie celular en el contexto de las moléculas MHC pueden ser el objetivo de las células T dirigidas a un epítopo de células T del antígeno tumoral.

"Superficie celular" se usa de acuerdo con su significado normal en la técnica y, por lo tanto, incluye el exterior de la célula que es accesible para la unión por proteínas y otras moléculas. Un antígeno se expresa en la superficie de las células si está ubicado en la superficie de dichas células y es accesible para la unión, por ejemplo, anticuerpos específicos de antígeno añadidos a las células. En una realización, un antígeno expresado en la superficie de las células es una proteína de membrana integral que tiene una porción extracelular.

El término "porción extracelular" o "exodominio" en el contexto de la presente invención se refiere a una parte de una molécula tal como una proteína que se enfrenta al espacio extracelular de una célula y preferiblemente es accesible desde el exterior de dicha célula, por ejemplo, mediante la unión de moléculas tales como anticuerpos ubicados fuera de la célula. Preferiblemente, el término se refiere a uno o más bucles o dominios extracelulares o a un fragmento de los mismos.

Los términos "porción" o "parte" se usan en el presente documento de manera intercambiable y se refieren a un elemento continuo o discontinuo de una estructura tal como una secuencia de aminoácidos. El término "fragmento" se refiere a un elemento continuo de una estructura tal como una secuencia de aminoácidos. Una porción, parte o fragmento de una estructura preferiblemente comprende una o más propiedades funcionales, por ejemplo, propiedades antigénicas, inmunológicas y/o de unión, de dicha estructura. Una porción o parte de una secuencia proteica comprende preferiblemente al menos 6, en particular al menos 8, al menos 12, al menos 15, al menos 20, al menos 30, al menos 50 o al menos 100 secuencias consecutivas y/o no aminoácidos consecutivos de la secuencia proteica. Un fragmento de una secuencia proteica comprende preferiblemente al menos 6, en particular al menos 8, al menos 12, al menos 15, al menos 20, al menos 30, al menos 50 o al menos 100 aminoácidos consecutivos de la secuencia proteica.

El término "inmunogenicidad" se refiere a la eficacia relativa de un antígeno para inducir una reacción inmune.

El término "inmunoestimulador" se usa en el presente documento para referirse al aumento de la respuesta inmune global.

El término "objetivo" significará un agente tal como una célula, en particular una célula cancerosa, que es un objetivo para una respuesta inmune. Los objetivos incluyen células que presentan un antígeno o un epítopo de antígeno, es decir, un fragmento peptídico derivado de un antígeno. En una realización, la célula objetivo es una célula que expresa un antígeno objetivo que está preferiblemente presente en la superficie celular.

"Procesamiento de antígenos" se refiere a la degradación de un antígeno en productos de procesamiento, que son fragmentos de dicho antígeno (por ejemplo, la degradación de una proteína en péptidos) y la asociación de uno o más de estos fragmentos (por ejemplo, mediante unión) con moléculas MHC para presentación por células, preferiblemente células presentadoras de antígenos a células T específicas.

Una célula presentadora de antígeno (APC) es una célula que muestra antígeno en el contexto del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en su superficie. Las células T pueden reconocer este complejo usando su receptor de células T (TCR). Las células presentadoras de antígenos procesan antígenos y los presentan a las células T Una célula presentadora de antígeno incluye, pero no se limita a, monocitos/macrófagos, células B y células dendríticas (DC). De acuerdo con la invención, el término "célula presentadora de antígenos" incluye células presentadoras de antígenos profesionales y células presentadoras de antígenos no profesionales.

Las células presentadoras de antígeno profesionales son muy eficientes para internalizar el antígeno, ya sea por fagocitosis o por endocitosis mediada por receptor, y luego muestran un fragmento del antígeno, unido a una molécula MHC de clase II, en su membrana. La célula T reconoce e interactúa con el complejo de moléculas MHC de clase II de antígeno en la membrana de la célula presentadora de antígeno. Luego, la célula presentadora de antígeno produce una señal coestimuladora adicional, lo que conduce a la activación de la célula T La expresión de moléculas coestimuladoras es una característica definitoria de las células presentadoras de antígenos profesionales.

Los tipos principales de células presentadoras de antígenos profesionales son las células dendríticas, que tienen la gama más amplia de presentación de antígenos y son probablemente las células presentadoras de antígenos más importantes, los macrófagos, las células B y ciertas células epiteliales activadas.

Las células presentadoras de antígenos no profesionales no expresan constitutivamente las proteínas MHC de clase II necesarias para la interacción con las células T vírgenes; estos se expresan sólo tras la estimulación de las células presentadoras de antígenos no profesionales por ciertas citoquinas tales como IFNy.

Las células dendríticas (DC) son poblaciones de leucocitos que presentan antígenos capturados en tejidos periféricos a las células T a través de vías de presentación de antígenos MHC de clase II e I. Es bien sabido que las células dendríticas son potentes inductores de respuestas inmunes y la activación de estas células es un paso crítico para la inducción de inmunidad.

Las células dendríticas se clasifican convenientemente como células "inmaduras" y "maduras", que pueden usarse como una forma sencilla de discriminar entre dos fenotipos bien caracterizados. Sin embargo, esta nomenclatura no debe interpretarse para excluir todas las posibles etapas intermedias de diferenciación.

Las células dendríticas inmaduras se caracterizan por ser células presentadoras de antígenos con una alta capacidad de captación y procesamiento de antígenos, lo que se correlaciona con la alta expresión del receptor Fcy y del receptor de manosa. El fenotipo maduro se caracteriza típicamente por una menor expresión de estos marcadores, pero una alta expresión de moléculas de la superficie celular responsables de la activación de las células T, tal como MHC de clase I y clase II, moléculas de adhesión (por ejemplo, CD54 y CD11) y moléculas coestimuladoras (por ejemplo, CD40, CD80, CD86 y 4-1 BB).

La maduración de las células dendríticas se conoce como el estado de activación de las células dendríticas en donde tales células dendríticas presentadoras de antígeno conducen a la sensibilización de las células T, mientras que la presentación por células dendríticas inmaduras da como resultado la tolerancia. La maduración de las células dendríticas es causada principalmente por biomoléculas con características microbianas detectadas por receptores innatos (ADN bacteriano, ARN viral, endotoxina, etc.), citoquinas proinflamatorias (TNF, IL-1, IFN), ligación de CD40 en la superficie de la célula dendrítica por CD40L, y sustancias liberadas por células que sufren muerte celular estresante. Las células dendríticas se pueden obtener mediante el cultivo de células de la médula ósea in vitro con citoquinas, tal como el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y el factor de necrosis tumoral alfa.

El término "células dendríticas plasmocitoides" o "pDC" se refiere a las células inmunes innatas que circulan en la sangre y se encuentran en los órganos linfoides periféricos. Se desarrollan a partir de células madre hematopoyéticas de la médula ósea y constituyen ≤0.4% de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC). En los seres humanos, las células dendríticas plasmocitoides exhiben morfología de células plasmáticas y expresan CD4, HLA-DR, CD123, antígeno-2 de células dendríticas derivadas de la sangre (BDCA-2), receptor tipo Toll (TLR) 7 y TLR9 dentro de los compartimentos endosómicos, pero no expresan altos niveles de CD11c o CD14, lo que las distingue de las células dendríticas o monocitos convencionales, respectivamente. Como componentes del sistema inmune innato, las células dendríticas plasmocitoides expresan receptores tipo Toll intracelulares 7 y 9 que detectan secuencias de ARNss y ADN CpG no metilado, respectivamente. Tras la estimulación y posterior activación, estas células producen grandes cantidades (hasta 1000 veces más que otros tipos de células) de interferón tipo I (principalmente IFN-a (alfa) e IFN-p (beta)).

Por "célula caracterizada por la presentación de un antígeno" o "célula que presenta un antígeno" o expresiones similares se entiende una célula tal como una célula enferma, por ejemplo, una célula cancerosa, o una célula presentadora de antígeno que presenta un antígeno o un fragmento derivado de dicho antígeno, por ejemplo, mediante el procesamiento del antígeno, en el contexto de moléculas MHC, en particular moléculas MHC de Clase I. De manera similar, los términos "enfermedad caracterizada por la presentación de un antígeno" indican una enfermedad que afecta a células caracterizadas por la presentación de un antígeno, en particular con MHC de clase I.

El término "célula inmunorreactiva" o "célula efectora" en el contexto de la presente invención se refiere a una célula que ejerce funciones efectoras durante una reacción inmune. Una "célula inmunorreactiva" preferiblemente es capaz de unirse a un antígeno o una célula caracterizada por la expresión y/o presentación de un antígeno o un epítopo y mediar en una respuesta inmune. Por ejemplo, tales células secretan citoquinas y/o quimioquinas, matan microbios, secretan anticuerpos, reconocen células infectadas o cancerosas y, opcionalmente, eliminan tales células. Por ejemplo, las células inmunorreactivas comprenden células T (células T citotóxicas, células T auxiliares, células T infiltrantes de tumores), células B, células asesinas naturales, neutrófilos, macrófagos y células dendríticas.

Preferiblemente, una "célula inmunorreactiva" reconoce un antígeno o un epítopo con algún grado de especificidad, en particular si se presenta en el contexto de moléculas MHC tales como en la superficie de células presentadoras de antígenos o células enfermas tales como células tumorales. Preferiblemente, dicho reconocimiento permite que la célula que reconoce un antígeno o un epítopo sea sensible o reactiva. Si la célula es una célula T auxiliar (células T CD4+) que portan receptores que reconocen un antígeno o un epítopo en el contexto de moléculas MHC de clase II, tal capacidad de respuesta o reactividad puede implicar la liberación de citoquinas y/o la activación de linfocitos CD8+ (CTL) y/o células B. Si la célula es un CTL, dicha capacidad de respuesta o reactividad puede implicar la eliminación de células presentadas en el contexto de moléculas MHC de clase I, es decir, células caracterizadas por la presentación de un antígeno con MHC de clase I, por ejemplo, mediante apoptosis o células mediadas por perforina. lisis. De acuerdo con la invención, la capacidad de respuesta de los CTL puede incluir el flujo sostenido de calcio, la división celular, la producción de citocinas tal como IFN-y y TNF-a, la regulación al alza de marcadores de activación tales como CD44 y CD69, y la destrucción citolítica específica de células objetivo que expresan antígenos. La capacidad de respuesta de CTL también se puede determinar utilizando un indicador artificial que indica con precisión la capacidad de respuesta de CTL. Tales CTL que reconocen un antígeno o un epítopo y son sensibles o reactivos también se denominan "CTL sensibles a antígenos" en el presente documento. Si la célula es una célula B, tal capacidad de respuesta puede implicar la liberación de inmunoglobulinas.

El término "célula T" o "linfocito T" se refiere a células derivadas del timo que participan en una variedad de reacciones inmunes mediadas por células e incluye células T auxiliares (células T CD4+) y células T citotóxicas (CTL, células T CD8+) que comprenden células T citolíticas.

Las células T pertenecen a un grupo de glóbulos blancos conocidos como linfocitos y juegan un papel central en la inmunidad mediada por células. Se pueden distinguir de otros tipos de linfocitos, tales como las células B y las células asesinas naturales, por la presencia de un receptor especial en su superficie celular llamado receptor de células T (TCR). El timo es el principal órgano responsable de la maduración de las células T. Se han descubierto varios subconjuntos diferentes de células T, cada uno con una función distinta.

Las células T auxiliares ayudan a otros glóbulos blancos en los procesos inmunológicos, incluyendo la maduración de las células B en células plasmáticas y la activación de las células T citotóxicas y los macrófagos, entre otras funciones. Estas células también se conocen como células T CD4+ porque expresan la proteína CD4 en su superficie. Las células T auxiliares se activan cuando se les presentan antígenos peptídicos por moléculas MHC de clase II que se expresan en la superficie de las células presentadoras de antígenos (APC). Una vez activados, se dividen rápidamente y secretan pequeñas proteínas llamadas citoquinas que regulan o ayudan en la respuesta inmune activa.

Las células T citotóxicas destruyen células infectadas por virus y células tumorales, y también están implicadas en el rechazo de trasplantes. Estas células también se conocen como células T CD8+, ya que expresan la glicoproteína CD8 en su superficie. Estas células reconocen sus objetivos al unirse al antígeno asociado con el MHC de clase I, que está presente en la superficie de casi todas las células del cuerpo.

La mayoría de las células T tienen un receptor de células T (TCR) que existe como un complejo de varias proteínas. El receptor de células T real se compone de dos cadenas peptídicas separadas, que se producen a partir de los genes alfa y beta de los receptores de células T independientes (TCRa y TCRp) y se denominan cadenas a- y p-TCR, células T y6 (células T gamma delta) representan un pequeño subconjunto de células T que poseen un receptor de células T distinto (TCR) en su superficie. Sin embargo, en las células T ^y§, el TCR se compone de una cadena ^yy una cadena 8. Este grupo de células T es mucho menos común (2% del total de células T) que las células T ap.

La estructura del receptor de células T es muy similar a los fragmentos Fab de inmunoglobulina, que son regiones definidas como la cadena ligera y pesada combinada de un brazo de anticuerpo. Cada cadena del TCR es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas y posee un dominio variable (V) de inmunoglobulina (Ig) N-terminal, una región transmembrana/membrana celular, y una cola citoplásmica corta en el extremo C-terminal. El dominio variable de la cadena a y la cadena p del TCR tiene tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) hipervariables, mientras que la región variable de la cadena p tiene un área adicional de hipervariabilidad (HV4) que normalmente no entra en contacto con el antígeno y por lo tanto no se considera un CDR. CDR3 es el principal CDR responsable de reconocer el antígeno procesado, aunque también se ha demostrado que CDR1 de la cadena a interactúa con la parte N-terminal del péptido antigénico, mientras que CDR1 de la cadena p interactúa con la parte C-terminal del péptido Se cree que CDR2 reconoce el MHC. No se cree que CDR4 de la cadena p participe en el reconocimiento de antígenos, pero se ha demostrado que interactúa con superantígenos. El dominio constante del dominio TCR consta de secuencias de conexión cortas en las que un residuo de cisteína forma enlaces disulfuro, lo que forma un enlace entre las dos cadenas.

El término "célula B" o "linfocito B" se refiere a un tipo de glóbulo blanco del subtipo de linfocito que funciona en la inmunidad humoral mediante la secreción de anticuerpos. Además, las células B presentan antígeno y se clasifican como células presentadoras de antígeno profesionales (APC) y secretan citoquinas. Las células B expresan receptores de células B (BCR) en su membrana celular. Los BCR permiten que la célula B se una a un antígeno específico, contra el cual iniciará una respuesta de anticuerpos. El receptor de células B se compone de dos partes, una molécula de inmunoglobulina unida a la membrana de un isotipo (IgD, IgM, IgA, IgG o IgE) que, con la excepción de la presencia de un dominio de membrana integral, son idénticas a sus formas secretadas y una fracción de transducción de señales: un heterodímero llamado Ig-a/Ig-p (CD79), unidos por puentes disulfuro. Cada miembro del dímero atraviesa la membrana plasmática y tiene una cola citoplásmica que lleva un motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptor (ITAM).

La activación de las células B se produce en los órganos linfoides secundarios, tales como el bazo y los ganglios linfáticos. Después de que las células B maduran en la médula ósea, migran a través de la sangre a los órganos linfoides secundarios, que reciben un suministro constante de antígeno a través de la linfa circulante. La activación de las células B comienza cuando la célula B se une a un antígeno a través de su BCR. Diferentes subconjuntos de células B experimentan activación dependiente de células T o activación independiente de células T.

El término "célula mononuclear de sangre periférica" o "PBMC" se refiere a una célula de sangre periférica que tiene un núcleo redondo. Estas células consisten en linfocitos (células T, células B, células NK) y monocitos, mientras que los eritrocitos y las plaquetas no tienen núcleo, y los granulocitos (neutrófilos, basófilos y eosinófilos) tienen núcleos multilobulados. Estas células se pueden extraer de la sangre completa mediante ficoll y centrifugación en gradiente, que separará la sangre en una capa superior de plasma, seguida de una capa de las PBMC y una fracción inferior de células polimorfonucleares (tales como neutrófilos y eosinófilos) y eritrocitos.

El término "complejo principal de histocompatibilidad" y la abreviatura "MHC" incluyen moléculas MHC de clase I y MHC de clase II y se relacionan con un complejo de genes que se presenta en todos los vertebrados. Las proteínas o moléculas MHC son importantes para la señalización entre linfocitos y células presentadoras de antígenos o células enfermas en reacciones inmunes, en las que las proteínas o moléculas MHC se unen a péptidos y los presentan para que los reconozcan los receptores de células T. Las proteínas codificadas por el MHC se expresan en la superficie de las células y muestran tanto antígenos propios (fragmentos peptídicos de la propia célula) como antígenos ajenos (por ejemplo, fragmentos de microorganismos invasores) a una célula T.

La región MHC se divide en tres subgrupos, clase I, clase II y clase III. Las proteínas MHC de clase I contienen una cadena a y microglobulina p2 (que no forman parte del MHC codificado por el cromosoma 15). Presentan fragmentos de antígeno a las células T citotóxicas. En la mayoría de las células del sistema inmune, específicamente en las células presentadoras de antígenos, las proteínas m Hc de clase II contienen cadenas a y p y presentan fragmentos de antígeno a las células T auxiliares. La región del MHC de clase III codifica otros componentes inmunitarios, tal como los componentes del complemento y algunos que codifican citoquinas.

En los seres humanos, los genes de la región MHC que codifican proteínas presentadoras de antígenos en la superficie celular se denominan genes del antígeno leucocitario humano (HLA). Sin embargo, la abreviatura MHC se usa a menudo para referirse a los productos del gen HLA. Los genes HLA incluyen los nueve llamados genes MHC clásicos: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA y HLA-DRB1.

En una realización preferida de todos los aspectos de la invención, una molécula MHC es una molécula HLA.

El término "funciones efectoras inmunes" o "funciones efectoras" en el contexto de la presente invención incluye cualquier función mediada por componentes del sistema inmune que den como resultado, por ejemplo, la destrucción de células. Preferiblemente, las funciones efectoras inmunes en el contexto de la presente invención son funciones efectoras mediadas por células T Tales funciones comprenden en el caso de una célula T auxiliar (célula T CD4+) el reconocimiento de un antígeno o un péptido antigénico derivado de un antígeno en el contexto de las moléculas MHC de clase II por parte de los receptores de células T, la liberación de citoquinas y/o la activación de linfocitos CD8+ (CTL) y/o células B, y en el caso de CTL, el reconocimiento de un antígeno o un péptido antigénico derivado de un antígeno en el contexto de moléculas MHC de clase I por receptores de células T, la eliminación de células presentes en el contexto de moléculas MHC de clase I, es decir, células caracterizadas por la presentación de un antígeno con MHC de clase I, por ejemplo, a través de apoptosis o lisis celular mediada por perforina, producción de citoquinas tal como IFN-^yy TNF-a, y muerte citolítica específica de células objetivo que expresan antígenos.

"Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" o "ADCC" describe la capacidad de destrucción de células de las células efectoras como se describe en el presente documento, en particular linfocitos, que preferiblemente requiere que la célula objetivo esté marcada por un anticuerpo. La ADCC ocurre preferiblemente cuando los anticuerpos se unen a los antígenos en las células tumorales y los dominios Fc del anticuerpo se acoplan a los receptores Fc (FcR) en la superficie de las células efectoras inmunes. Se han identificado varias familias de receptores Fc, y poblaciones celulares específicas expresan característicamente receptores Fc definidos. La ADCC puede verse como un mecanismo para inducir directamente un grado variable de destrucción tumoral inmediata que conduce a la presentación de antígenos y la inducción de respuestas de células T dirigidas al tumor. Preferiblemente, la inducción in vivo de ADCC conducirá a respuestas de células T dirigidas al tumor y respuestas de anticuerpos derivadas del huésped.

La "citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" es otro método de eliminación de células que puede ser dirigido por anticuerpos. IgM es el isotipo más eficaz para la activación del complemento. IgG1 e IgG3 también son muy eficaces para dirigir CDC a través de la vía clásica de activación del complemento. Preferiblemente, en esta cascada, la formación de complejos antígeno-anticuerpo da como resultado el desencubrimiento de múltiples sitios de unión de C1q muy próximos en los dominios CH₂de las moléculas de anticuerpo participantes, tal como las moléculas de IgG (C1q es uno de los tres subcomponentes del complemento C1). Preferiblemente, estos sitios de unión de Clq sin encubrir convierten la interacción C1q-IgG de baja afinidad previa en una de alta avidez, lo que desencadena una cascada de eventos que involucran una serie de otras proteínas del complemento y conduce a la liberación proteolítica de los agentes quimiotácticos/activadores de células efectoras C₃a y C5a. Preferiblemente, la cascada del complemento termina en la formación de un complejo de ataque a la membrana, que crea poros en la membrana celular que facilitan el libre paso de agua y solutos dentro y fuera de la célula.

El término "receptor tipo toll" o "TLR" se relaciona con una clase de proteínas que desempeñan un papel clave en el sistema inmune innato. Son receptores no catalíticos únicos que se extienden por la membrana y que normalmente se expresan en células centinela, tales como macrófagos y células dendríticas, que reconocen moléculas estructuralmente conservadas derivadas de microbios. Una vez que estos microbios han traspasado las barreras físicas, tal como la piel o la mucosa del tracto intestinal, los TLR reconocen y activan las respuestas de las células inmunes.

En una realización de la invención, se administra a un sujeto un ácido nucleico tal como el ARN que codifica un antígeno. Un producto de traducción antigénico del ácido nucleico puede formarse en las células del sujeto y el producto puede mostrarse al sistema inmune para la estimulación de una respuesta inmune.

Alternativamente, la presente invención prevé realizaciones en las que un ácido nucleico que expresa un antígeno mencionado en el presente documento se introduce en células tales como células presentadoras de antígenos ex vivo, por ejemplo, células presentadoras de antígenos tomadas de un paciente, y las células, opcionalmente propagadas clonalmente ex-vivo, se trasplantan de nuevo al mismo paciente. Las células transfectadas pueden reintroducirse en el paciente usando cualquier medio conocido en la técnica, preferiblemente en forma estéril mediante administración intravenosa, intracavitaria, intraperitoneal o intratumoral.

El término "ácido nucleico", como se usa en el presente documento, pretende incluir ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN) tales como ADNc, ARNm, moléculas sintetizadas químicamente y producidas de forma recombinante. Un ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario. De acuerdo con la invención, el ARN incluye ARN transcrito in vitro (IVT ARN) o ARN sintético. De acuerdo con la invención, un ácido nucleico es preferiblemente un ácido nucleico aislado. Además, los ácidos nucleicos descritos en el presente documento pueden ser moléculas recombinantes.

El término "ácido nucleico aislado" significa, de acuerdo con la invención, que el ácido nucleico (i) fue amplificado in vitro, por ejemplo, a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), (ii) se produjo de forma recombinante mediante clonación, (iii) se purificó, por ejemplo, mediante escisión y separación mediante electroforesis en gel, o (iv) se sintetizó, por ejemplo, mediante síntesis química. Se puede emplear un ácido nucleico para la introducción en, es decir, la transfección de células, por ejemplo, en forma de ARN que se puede preparar por transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN. Además, el ARN se puede modificar antes de la aplicación mediante la estabilización de secuencias, protección y poliadenilación.

En el contexto de la presente invención, el término "ADN" se refiere a una molécula que comprende residuos de desoxirribonucleótidos y preferiblemente está compuesta total o sustancialmente por residuos de desoxirribonucleótidos. "Desoxirribonucleótido" se refiere a un nucleótido que carece de un grupo hidroxilo en la posición 2' de un grupo p-D-ribofuranosilo. El término "ADN" comprende ADN aislado tal como ADN parcial o completamente purificado, ADN esencialmente puro, ADN sintético y ADN generado de forma recombinante e incluye ADN modificado que difiere del ADN natural por adición, deleción, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Dichas alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como en los extremos de un ADN o internamente, por ejemplo, en uno o más nucleótidos del ADN. Los nucleótidos en las moléculas de ADN también pueden comprender nucleótidos no estándar, tales como nucleótidos no naturales o nucleótidos sintetizados químicamente. Estos ADN alterados pueden denominarse análogos o análogos del ADN natural.

En el contexto de la presente invención, el término "ARN" se refiere a una molécula que comprende residuos de ribonucleótidos y que preferiblemente está compuesta total o sustancialmente por residuos de ribonucleótidos. Ribonucleótido se refiere a un nucleótido con un grupo hidroxilo en la posición 2' de un grupo p-D-ribofuranosilo. El término incluye ARN de doble cadena, ARN de cadena sencilla, ARN aislado tal como ARN parcial o completamente purificado, a Rn esencialmente puro, ARN sintético, ARN producido de forma recombinante, así como ARN modificado que difiere del ARN natural por la adición, eliminación, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Dichas alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como en los extremos de un ARN o internamente, por ejemplo, en uno o más nucleótidos del ARN. Los nucleótidos en las moléculas de ARN también pueden comprender nucleótidos no estándar, tales como nucleótidos no naturales o nucleótidos o desoxinucleótidos sintetizados químicamente. Estos ARN alterados pueden denominarse análogos o análogos del ARN natural. De acuerdo con la presente invención, el término "ARN" incluye y preferiblemente se refiere a "ARNm" que significa "ARN mensajero" y se refiere a un transcrito que puede producirse usando ADN como plantilla y codifica un péptido o proteína. El ARNm normalmente comprende una región 5' no traducida (5'-UTR), una región que codifica la proteína o péptido y una región 3' no traducida (3'-UTR). El ARNm tiene un tiempo medio limitado en las células e in vitro. Preferiblemente, el ARNm es producido por transcripción in vitro utilizando una plantilla de ADN. En una realización de la invención, el ARN se obtiene por transcripción in vitro o síntesis química. La metodología de transcripción in vitro es conocida por el experto en la técnica. Por ejemplo, hay una variedad de kits de transcripción in vitro disponibles comercialmente.

De acuerdo con la invención, la estabilidad y la eficiencia de traducción del ARN pueden modificarse según se requiera. Por ejemplo, se puede estabilizar el ARN y aumentar su traducción mediante una o más modificaciones que tengan efectos estabilizadores y/o aumenten la eficacia de la traducción del ARN. Para aumentar la expresión del ARN utilizado de acuerdo con la presente invención, puede modificarse dentro de la región codificante, es decir, la secuencia que codifica el péptido o la proteína expresados, preferiblemente sin alterar la secuencia del péptido o la proteína expresados, para aumentar el contenido de GC para aumentar la estabilidad del ARNm y realizar una optimización de codones y, por lo tanto, mejorar la traducción en las células.

El término "modificación" en el contexto del ARN utilizado en la presente invención incluye cualquier modificación de un ARN que no esté presente de forma natural en dicho ARN.

En una realización de la invención, el ARN usado de acuerdo con la invención no tiene 5'-trifosfatos desprotegidos. La eliminación de dichos 5'-trifosfatos sin protección puede lograrse tratando el ARN con una fosfatasa.

El ARN de acuerdo con la invención puede tener ribonucleótidos modificados para aumentar su estabilidad y/o disminuir la citotoxicidad. Por ejemplo, en una realización, en el ARN usado de acuerdo con la invención, la 5-metilcitidina se sustituye parcial o completamente, preferiblemente completamente, por citidina. Alternativa o adicionalmente, en una realización, en el ARN usado de acuerdo con la invención, la pseudouridina se sustituye parcial o completamente, preferiblemente completamente, por uridina.

En una realización, el término "modificación" se refiere a proporcionar un ARN con una tapa 5' o un análogo de la tapa 5'. El término "tapa 5'" se refiere a una estructura de tapa que se encuentra en el extremo 5' de una molécula de ARNm y generalmente consta de un nucleótido de guanosina conectado al ARNm a través de un enlace trifosfato 5' a 5' inusual. En una realización, esta guanosina está metilada en la posición 7. El término "tapa 5' convencional" se refiere a una tapa 5' de ARN natural, preferiblemente la tapa de 7-metilguanosina (m7G). En el contexto de la presente invención, el término "tapa 5'" incluye un análogo de la tapa 5' que se parece a la estructura de la tapa del ARN y se modifica para poseer la capacidad de estabilizar el ^aRⁿy/o mejorar la traducción del ARN si se une a este, preferiblemente in vivo y/o en una célula.

El ARN puede comprender otras modificaciones. Por ejemplo, una modificación adicional del ARN utilizado en la presente invención puede ser una extensión o un truncamiento de la cola poli(A) natural o una alteración de las regiones no traducidas (UTR) 5' o 3', tal como la introducción de una UTR que no está relacionada con la región que codifica dicho ARN, por ejemplo, el intercambio de la 3'-UTR existente o la inserción de una o más, preferiblemente dos copias de una 3'-UTR derivada de un gen de globina, tales como alfa2-globina, alfal-globina, beta-globina, preferiblemente beta-globina, más preferiblemente beta-globina humana.

El ARN que tiene una secuencia poli-A no enmascarada se traduce de forma más eficaz que el ARN que tiene una secuencia poli-A enmascarada. El término "cola de poli(A)" o "secuencia de poli-A" se refiere a una secuencia de residuos de adenilo (A) que normalmente se encuentra en el extremo 3' de una molécula de ARN y "secuencia de poli-A sin enmascarar" significa que la secuencia poli-A en el extremo 3' de una molécula de ARN termina con una A de la secuencia poli-A y no va seguida de nucleótidos distintos de A ubicados en el extremo 3', es decir, corriente abajo, de la secuencia poli-A. Además, una secuencia poli-A larga de aproximadamente 120 pares de bases da como resultado una estabilidad de transcripción y una eficiencia de traducción óptimas del ARN.

Por lo tanto, para aumentar la estabilidad y/o la expresión del ARN utilizado de acuerdo con la presente invención, puede modificarse para que esté presente junto con una secuencia poli-A, preferiblemente con una longitud de 10 a 500, más preferiblemente 30 a 300, incluso más preferiblemente 65 a 200 y especialmente 100 a 150 residuos de adenosina. En una realización especialmente preferida, la secuencia poli-A tiene una longitud de aproximadamente 120 residuos de adenosina. Para aumentar aún más la estabilidad y/o la expresión del ARN utilizado de acuerdo con la invención, se puede desenmascarar la secuencia poli-A.

El término "estabilidad" del ARN se relaciona con la "vida media" del ARN. La "vida media" se refiere al período de tiempo que se necesita para eliminar la mitad de la actividad, cantidad o número de moléculas. En el contexto de la presente invención, la vida media de un ARN es indicativa de la estabilidad de dicho ARN. La vida media del ARN puede influir en la "duración de la expresión" del ARN. Se puede esperar que el ARN que tiene una vida media prolongada se exprese durante un período de tiempo prolongado.

Por supuesto, si de acuerdo con la presente invención se desea disminuir la estabilidad y/o la eficiencia de traducción del ARN, es posible modificar el ARN para interferir con la función de los elementos como se describió anteriormente aumentando la estabilidad y/o la eficiencia de traducción de ARN.

Los ácidos nucleicos descritos en el presente documento pueden estar comprendidos en un vector que puede usarse para administrar un ácido nucleico al interior de una célula. El término "vector", como se usa en el presente documento, incluye cualquier vector conocido por el experto en la técnica, incluyendo vectores de plásmidos, vectores de cósmidos, vectores de fagos tal como el fago lambda, vectores virales tales como vectores adenovirales o baculovirales, vectores retro o lentivirales, transposones o vectores de cromosomas artificiales tales como los cromosomas artificiales bacterianos (BAC), los cromosomas artificiales de levadura (YAC) o los cromosomas artificiales P1 (PAC). Dichos vectores incluyen tanto vectores de expresión como de clonación. Los vectores de expresión comprenden plásmidos, así como vectores virales y generalmente contienen una secuencia de codificación deseada y secuencias de ADN apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia de codificación unida operativamente en un organismo huésped particular (por ejemplo, bacterias, levaduras, plantas, insectos o mamíferos) o en sistemas de expresión in vitro. Los vectores de clonación se utilizan generalmente para diseñar y amplificar un determinado fragmento de ADN deseado y pueden carecer de las secuencias funcionales necesarias para la expresión de los fragmentos de ADN deseados.

Los expertos en la técnica de la biología molecular generalmente saben cómo usar promotores, potenciadores y combinaciones de tipos de células para la expresión de proteínas. Los promotores empleados pueden ser constitutivos, específicos de tejido, inducibles y/o útiles en las condiciones apropiadas para dirigir un alto nivel de expresión del segmento de ácido nucleico introducido. El promotor puede ser heterólogo o endógeno. Las secuencias promotoras constitutivas que pueden usarse de acuerdo con la invención incluyen, pero no se limitan a, la secuencia promotora temprana inmediata del citomegalovirus (CMV), el promotor temprano del virus simio 40 (SV40), el virus del tumor mamario de ratón (MMTV), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) promotor de repetición terminal larga (LTR), promotor del virus de Moloney, promotor del virus de la leucemia aviar, promotor temprano inmediato del virus de Epstein-Barr, promotor del virus del sarcoma de Rous, así como promotores de genes humanos tales como, entre otros, la actina promotor, el promotor de miosina, el promotor de hemoglobina y el promotor de creatina muscular. Además, la invención no debe limitarse al uso de promotores constitutivos. Los promotores inducibles también se contemplan como parte de la invención. El uso de un promotor inducible en la invención proporciona un interruptor molecular capaz de activar la expresión de la secuencia polinucleotídica a la que está unida operativamente cuando se desea dicha expresión, o desactivar la expresión cuando no se desea la expresión. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen, pero no se limitan a, un promotor de metalotionina, un promotor de glucocorticoides, un promotor de progesterona y un promotor de tetraciclina. Además, la invención incluye el uso de un promotor específico de tejido, cuyo promotor es activo únicamente en un tejido deseado. Los promotores específicos de tejido son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, el promotor HER-2 y las secuencias promotoras asociadas a PSA.

Los ácidos nucleicos se pueden transferir a una célula huésped por medios físicos, químicos o biológicos.

Los métodos físicos para introducir un ácido nucleico en una célula huésped incluyen precipitación con fosfato de calcio, lipofección, bombardeo de partículas, microinyección, electroporación y similares.

Los métodos biológicos para introducir un ácido nucleico de interés en una célula huésped incluyen el uso de vectores de ADN y ARN. Los vectores virales, y especialmente los vectores retrovirales, se han convertido en el método más utilizado para insertar genes en mamíferos, por ejemplo, células humanas. Otros vectores virales pueden derivarse de lentivirus, poxvirus, virus herpes simplex I, adenovirus y virus adenoasociados, y similares.

Los medios químicos para introducir un ácido nucleico en una célula huésped incluyen sistemas de dispersión coloidal, tal como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal preferido para su uso como vehículo de administración in vitro y en vivo es un liposoma (es decir, una vesícula de membrana artificial). La preparación y el uso de tales sistemas son bien conocidos en la técnica.

"Codificación" se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un ácido nucleico para servir como plantillas para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen una secuencia definida de nucleótidos o una secuencia definida de aminoácidos. Así, un ácido nucleico codifica una proteína si la expresión (traducción y opcionalmente transcripción) del ácido nucleico produce la proteína en una célula u otro sistema biológico.

El término "expresión" se usa de acuerdo con la invención en su significado más general y comprende la producción de ARN y/o péptidos o polipéptidos, por ejemplo, mediante transcripción y/o traducción. Con respecto al ARN, el término "expresión" o "traducción" se refiere en particular a la producción de péptidos o polipéptidos. También comprende la expresión parcial de ácidos nucleicos. Además, la expresión puede ser transitoria o estable.

En el contexto de la presente invención, el término "transcripción" se refiere a un proceso en donde el código genético en una secuencia de ADN se transcribe en ARN. Posteriormente, el ARN puede traducirse en proteína. De acuerdo con la presente invención, el término "transcripción" comprende 'transcripción in vitro ", en donde el término “transcripción in vitro " se refiere a un proceso en donde el ARN, en particular el ARNm, se sintetiza in vitro en un sistema libre de células, preferiblemente usando extractos celulares apropiados. Preferiblemente, los vectores de clonación se aplican para la generación de transcritos. Estos vectores de clonación se designan generalmente como vectores de transcripción y, de acuerdo con la presente invención, están abarcados por el término "vector". De acuerdo con la presente invención, el ARN utilizado en la presente invención preferiblemente es ARN transcrito in vitro (IVT-ARN) y puede obtenerse por transcripción in vitro de una plantilla de ADN apropiada. El promotor para controlar la transcripción puede ser cualquier promotor de cualquier ARN polimerasa. Ejemplos particulares de ARN polimerasas son las ARN polimerasas T7, T3 y SP6. Preferiblemente, la transcripción in vitro de acuerdo con la invención está controlada por un promotor T7 o SP6. Una plantilla de ADN para la transcripción in vitro puede obtenerse clonando un ácido nucleico, en particular ADNc, e introduciéndolo en un vector apropiado para transcripción in vitro. El ADNc se puede obtener por transcripción inversa de ARN.

El término "traducción" de acuerdo con la invención se refiere al proceso en los ribosomas de una célula mediante el cual una hebra de ARN mensajero dirige el ensamblaje de una secuencia de aminoácidos para producir un péptido o polipéptido.

Las secuencias de control de expresión o secuencias reguladoras, que de acuerdo con la invención pueden estar unidas funcionalmente con un ácido nucleico, pueden ser homólogas o heterólogas con respecto al ácido nucleico. Una secuencia codificante y una secuencia reguladora están unidas "funcionalmente" si están unidas covalentemente, de modo que la transcripción o traducción de la secuencia codificante está bajo el control o la influencia de la secuencia reguladora. Si la secuencia codificante se va a traducir en una proteína funcional, con enlace funcional de una secuencia reguladora con la secuencia codificante, la inducción de la secuencia reguladora conduce a una transcripción de la secuencia que codifica, sin causar un cambio del marco de lectura en la secuencia codificante o incapacidad de la secuencia codificante para traducirse en la proteína o el péptido deseado.

El término "secuencia de control de expresión" o "secuencia reguladora" comprende, de acuerdo con la invención, promotores, secuencias de unión a ribosomas y otros elementos de control, que controlan la transcripción de un ácido nucleico o la traducción del ARN derivado. En ciertas realizaciones de la invención, las secuencias reguladoras pueden controlarse. La estructura precisa de las secuencias reguladoras puede variar según la especie o el tipo de célula, pero generalmente comprende secuencias no transcritas en 5' y no traducidas en 5' y 3', que están involucradas en el inicio de la transcripción o traducción, tales como caja TATA, secuencia de tapado, secuencia CAAT y similares. En particular, las secuencias reguladoras no transcritas en 5' comprenden una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del gen unido funcionalmente. Las secuencias reguladoras también pueden comprender secuencias potenciadoras o secuencias activadoras cadena arriba.

De acuerdo con la invención, se prefiere que un ácido nucleico tal como el ARN que codifica un péptido o una proteína una vez captado o introducido, es decir, transfectado o transducido, en una célula, célula que puede estar presente in vitro o en un sujeto da como resultado la expresión de dicho péptido o proteína. La célula puede expresar el péptido o proteína codificado intracelularmente (por ejemplo, en el citoplasma y/o en el núcleo), puede secretar el péptido o proteína codificado, o puede expresarlo en la superficie.

De acuerdo con la invención, términos tales como "expresión de ácido nucleico" y "codificación de ácido nucleico" o términos similares se usan indistintamente en el presente documento y con respecto a un péptido o polipéptido particular significa que el ácido nucleico, si está presente en el entorno apropiado, preferiblemente dentro de una célula, puede expresarse para producir dicho péptido o polipéptido.

Términos tales como "transferir", "introducir", "transfectar" o "transducir" se usan indistintamente en el presente y se relacionan con la introducción de ácidos nucleicos, en particular ácidos nucleicos exógenos o heterólogos, tales como ARN en una célula. De acuerdo con la presente invención, la célula puede estar presente in vitro o en vivo, por ejemplo, la célula puede formar parte de un órgano, un tejido y/o un organismo. De acuerdo con la invención, la transfección puede ser transitoria o estable. Para algunas aplicaciones de transfección, es suficiente que el material genético transfectado se exprese solo de forma transitoria. Dado que el ácido nucleico introducido en el proceso de transfección normalmente no se integra en el genoma nuclear, el ácido nucleico extraño se diluirá por mitosis o se degradará. Las líneas celulares que permiten la amplificación episomal de ácidos nucleicos reducen en gran medida la tasa de dilución. Si se desea que el ácido nucleico transfectado permanezca realmente en el genoma de la célula y sus células hijas, debe producirse una transfección estable. El a Rn se puede transfectar en células para expresar transitoriamente su proteína codificada.

"Fragmento" con respecto a una secuencia de ácido nucleico se refiere a una parte de la secuencia de ácido nucleico, es decir, una secuencia que representa la secuencia de ácido nucleico acortada en los extremos 5' y/o 3'. Un fragmento de una secuencia de ácido nucleico comprende preferiblemente al menos 6, en particular al menos 8, al menos 12, al menos 15, al menos 20, al menos 30, al menos 50 o al menos 100 nucleótidos consecutivos de la secuencia de ácido nucleico.

La presente invención también incluye "variantes" de los ácidos nucleicos o secuencias de ácidos nucleicos tales como moléculas de ARN inmunoestimuladoras descritas en el presente documento.

De acuerdo con la invención, las variantes de ácido nucleico incluyen deleciones, adiciones, mutaciones y/o inserciones de nucleótido único o múltiple en comparación con el ácido nucleico de referencia. Las deleciones incluyen la eliminación de uno o más nucleótidos del ácido nucleico de referencia. Las variantes de adición comprenden fusiones del terminal 5' y/o 3' de uno o más nucleótidos, tal como 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 o más nucleótidos. Las mutaciones pueden incluir, entre otras, sustituciones, en las que se elimina al menos un nucleótido de la secuencia y se inserta otro nucleótido en su lugar (tales como transversiones y transiciones), sitios básicos, sitios entrecruzados y bases alteradas o modificadas químicamente. Las inserciones incluyen la adición de al menos un nucleótido en el ácido nucleico de referencia.

Preferiblemente, el grado de identidad entre una secuencia de ácido nucleico dada y una secuencia de ácido nucleico que es una variante de dicha secuencia de ácido nucleico dada será al menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %. El grado de identidad se da preferiblemente para una región de ácido nucleico que es al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90% o aproximadamente 100% de la longitud total de la secuencia de ácido nucleico de referencia. Por ejemplo, si la secuencia de ácido nucleico de referencia consta de 200 nucleótidos, el grado de identidad se da preferiblemente para al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 120, al menos aproximadamente 140, al menos aproximadamente 160, al menos aproximadamente 180 o aproximadamente 200 nucleótidos, preferiblemente nucleótidos continuos. El grado de identidad se da preferiblemente para un segmento de al menos 80, al menos 100, al menos 120, al menos 150, al menos 180, al menos 200 o al menos 250 nucleótidos. En realizaciones preferidas, el grado de identidad se proporciona para la longitud total de la secuencia de ácido nucleico de referencia.

La "identidad de secuencia" entre dos secuencias de ácido nucleico indica el porcentaje de nucleótidos que son idénticos entre las secuencias.

El término "% de identidad" se refiere, en particular, a un porcentaje de nucleótidos que son idénticos en un alineamiento óptimo entre dos secuencias que se van a comparar, siendo dicho porcentaje puramente estadístico, y las diferencias entre las dos secuencias pueden distribuirse aleatoriamente. por toda la longitud de la secuencia y la secuencia que se va a comparar puede comprender adiciones o deleciones en comparación con la secuencia de referencia, con el fin de obtener una alineación óptima entre dos secuencias. Las comparaciones de dos secuencias se realizan habitualmente comparando dichas secuencias, después de un alineamiento óptimo, con respecto a un segmento o "ventana de comparación", para identificar regiones locales de secuencias correspondientes. La alineación óptima para una comparación puede realizarse manualmente o con la ayuda del algoritmo de homología local por Smith y Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, con la ayuda del algoritmo de homología local por Neddleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, y con la ayuda del algoritmo de búsqueda de similitud por Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. EE. UU. 85, 2444 o con la ayuda de programas informáticos que utilizan dichos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N y TFASTAen Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

La identidad porcentual se obtiene determinando el número de posiciones idénticas en las que corresponden las secuencias que se van a comparar, dividiendo este número por el número de posiciones comparadas y multiplicando este resultado por 100.

Las variantes de secuencias de ácidos nucleicos específicas o secuencias de ácidos nucleicos que tienen un grado particular de identidad con secuencias de ácidos nucleicos específicas tienen preferiblemente al menos una propiedad funcional de dichas secuencias específicas y preferiblemente son funcionalmente equivalentes a dichas secuencias específicas, por ejemplo, secuencias de ácidos nucleicos que exhiben propiedades idénticas o similares a las de las secuencias específicas de ácido nucleico.

Una propiedad importante incluye la capacidad de actuar como adyuvante o agente inmunoestimulador, en particular cuando se administra junto con un antígeno o ácido nucleico que codifica un antígeno.

De acuerdo con la presente invención, el término "péptido" se refiere a sustancias que comprenden dos o más, preferiblemente 3 o más, preferiblemente 4 o más, preferiblemente 6 o más, preferiblemente 8 o más, preferiblemente 10 o más, preferiblemente 13 o más, preferiblemente 16 más, preferiblemente 21 o más y hasta preferiblemente 8, 10, 20, 30, 40 o 50, en particular 100 aminoácidos unidos covalentemente mediante enlaces peptídicos.

El término "proteína" se refiere a péptidos grandes, es decir, polipéptidos, preferiblemente a péptidos con más de 100 residuos de aminoácidos, pero en general los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" son sinónimos y se usan indistintamente en el presente documento.

La presente invención también incluye "variantes" de los péptidos, proteínas o secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento.

Para los fines de la presente invención, las "variantes" de una secuencia de aminoácidos comprenden variantes de inserción de aminoácidos, variantes de adición de aminoácidos, variantes de eliminación de aminoácidos y/o variantes de sustitución de aminoácidos.

Las variantes de inserción de aminoácidos comprenden inserciones de uno o dos o más aminoácidos en una secuencia de aminoácidos particular. En el caso de las variantes de la secuencia de aminoácidos que tienen una inserción, se insertan uno o más residuos de aminoácidos en un sitio particular en una secuencia de aminoácidos, aunque también es posible la inserción aleatoria con la selección apropiada del producto resultante.

Las variantes de adición de aminoácidos comprenden fusiones amino- y/o carboxi-terminales de uno o más aminoácidos, tales como 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 o más aminoácidos.

Las variantes de deleción de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia, tal como la eliminación de 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 o más aminoácidos. Las deleciones pueden estar en cualquier posición de la proteína. Las variantes de deleción de aminoácidos que comprenden la eliminación en el extremo N-terminal y/o C-terminal de la proteína también se denominan variantes de truncamiento N-terminal y/o C-terminal.

Las variantes de sustitución de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de al menos un residuo de la secuencia y la inserción de otro residuo en su lugar. Se da preferencia a que las modificaciones estén en posiciones de la secuencia de aminoácidos que no se conservan entre proteínas o péptidos homólogos y/o a la sustitución de aminoácidos por otros que tengan propiedades similares. Preferiblemente, los cambios de aminoácidos en las variantes de proteínas son cambios de aminoácidos conservadores, es decir, sustituciones de aminoácidos cargados o no cargados de forma similar. Un cambio conservativo de aminoácido implica la sustitución de uno de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos naturales generalmente se dividen en cuatro familias: ácidos (aspartato, glutamato), básicos (lisina, arginina, histidina), no polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) y aminoácidos polares no cargados (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). La fenilalanina, el triptófano y la tirosina a veces se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos.

Preferiblemente, el grado de similitud, preferiblemente de identidad entre una secuencia de aminoácidos dada y una secuencia de aminoácidos que es una variante de dicha secuencia de aminoácidos dada será al menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82 %, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%. El grado de similitud o identidad se da preferiblemente para una región de aminoácidos que es al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 % %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90% o aproximadamente 100% de la longitud total de la secuencia de aminoácidos de referencia. Por ejemplo, si la secuencia de aminoácidos de referencia consta de 200 aminoácidos, el grado de similitud o identidad se proporciona preferiblemente para al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 120, al menos aproximadamente 140, al menos aproximadamente 160, al menos aproximadamente 180 o aproximadamente 200 aminoácidos, preferiblemente aminoácidos continuos. El grado de similitud o identidad se da preferiblemente para un segmento de al menos 80, al menos 100, al menos 120, al menos 150, al menos 180, al menos 200 o al menos 250 aminoácidos. En realizaciones preferidas, el grado de similitud o identidad se da para la longitud total de la secuencia de aminoácidos de referencia. La alineación para determinar la similitud de la secuencia, preferiblemente la identidad de la secuencia se puede realizar con herramientas conocidas en la técnica preferiblemente usando la mejor alineación de la secuencia, por ejemplo, usando Align, usando la configuración estándar, preferiblemente EMBOSS: needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5.

“Similitud de secuencia” indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos o que representan sustituciones conservativas de aminoácidos. Identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos entre las secuencias.

El término "% de identidad" pretende referirse, en particular, a un porcentaje de residuos de aminoácidos que son idénticos en un alineamiento óptimo entre dos secuencias que se van comparar, siendo dicho porcentaje puramente estadístico, y las diferencias entre las dos secuencias pueden distribuirse aleatoriamente a lo largo de toda la secuencia y la secuencia que se va comparar puede comprender adiciones o deleciones en comparación con la secuencia de referencia, con el fin de obtener una alineación óptima entre dos secuencias. Las comparaciones de dos secuencias se realizan habitualmente comparando dichas secuencias, después de un alineamiento óptimo, con respecto a un segmento o "ventana de comparación", para identificar regiones locales de secuencias correspondientes. La alineación óptima para una comparación puede realizarse manualmente o con la ayuda del algoritmo de homología local por Smith y Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, con la ayuda del algoritmo de homología local por Neddleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, y con la ayuda del algoritmo de búsqueda de similitud por Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. EE. UU. 85, 2444 o con la ayuda de programas informáticos que utilizan dichos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N y TFASTAen Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

Las secuencias homólogas de aminoácidos presentan de acuerdo con la invención al menos 40 %, en particular al menos 50 %, al menos 60 %, al menos el 70 %, al menos 80 %, al menos 90 % y preferiblemente al menos 95 %, al menos 98 o al menos 99% de identidad de los residuos de aminoácidos.

De acuerdo con la invención, una variante, fragmento, parte o porción de una secuencia de aminoácidos, péptido o proteína tiene preferiblemente una propiedad funcional de la secuencia de aminoácidos, péptido o proteína, respectivamente, de la que se ha derivado, es decir, es funcionalmente equivalente. En una realización, una variante, fragmento, parte o porción de una secuencia de aminoácidos, péptido o proteína es inmunológicamente equivalente a la secuencia de aminoácidos, péptido o proteína, respectivamente, de la que se deriva. En una realización, la propiedad funcional es una propiedad inmunológica.

La invención incluye derivados de los péptidos o proteínas descritos en el presente documento que están comprendidos por los términos "péptido" y "proteína". De acuerdo con la invención, los "derivados" de proteínas y péptidos son formas modificadas de proteínas y péptidos. Dichas modificaciones incluyen cualquier modificación química y comprenden sustituciones, deleciones y/o adiciones únicas o múltiples de cualquier molécula asociada con la proteína o el péptido, tales como carbohidratos, lípidos y/o proteínas o péptidos. En una realización, los "derivados" de proteínas o péptidos incluyen los análogos modificados resultantes de la glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, palmitoilación, miristoilación, isoprenilación, lipidación, alquilación, derivatización, introducción de grupos protectores/bloqueantes, escisión proteolítica o unión a un anticuerpo o a otro ligando celular. El término "derivado" también se extiende a todos los equivalentes químicos funcionales de dichas proteínas y péptidos. Preferiblemente, un péptido modificado tiene mayor estabilidad y/o mayor inmunogenicidad.

El término "derivado" significa de acuerdo con la invención que una entidad particular, en particular una secuencia particular, está presente en el objeto del que se deriva, en particular un organismo o molécula. En el caso de secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos, especialmente regiones de secuencias particulares, "derivado" en particular significa que la secuencia de aminoácidos o secuencia de ácidos nucleicos relevante se deriva de una secuencia de aminoácidos o secuencia de ácidos nucleicos en donde está presente.

El término "célula" o "célula huésped" es preferiblemente una célula intacta, es decir, una célula con una membrana intacta que no ha liberado sus componentes intracelulares normales, tales como enzimas, orgánulos o material genético. Preferiblemente, una célula intacta es una célula viable, es decir, una célula viva capaz de llevar a cabo sus funciones metabólicas normales. Preferiblemente dicho término se refiere de acuerdo con la invención a cualquier célula que pueda transformarse o transfectada con un ácido nucleico exógeno. El término "célula" incluye, de acuerdo con la invención, células procariotas (por ejemplo, E. coli) o células eucariotas (por ejemplo, células dendríticas, células B, células CHO, células COS, células K562, células HEK₂93, células HELA, células de levadura y células de insectos). El ácido nucleico exógeno se puede encontrar dentro de la célula (i) libremente dispersado como tal, (ii) incorporado en un vector recombinante o (iii) integrado en el genoma de la célula huésped o en el ADN mitocondrial. Se prefieren particularmente células de mamíferos, tales como células de seres humanos, ratones, hámsteres, cerdos, cabras y primates. Las células pueden derivar de un gran número de tipos de tejido e incluyen células primarias y líneas celulares.

Una célula que comprende un ácido nucleico, por ejemplo, que ha sido transfectada con un ácido nucleico, preferiblemente expresa el péptido o la proteína codificada por el ácido nucleico.

El término "expansión" se refiere a un proceso en donde se multiplica una entidad específica. En una realización de la presente invención, el término se utiliza en el contexto de una respuesta inmunológica en donde los linfocitos son estimulados por un antígeno, proliferan y se amplifica el linfocito específico que reconoce dicho antígeno. Preferiblemente, la expansión clonal conduce a la diferenciación de los linfocitos.

"Aislado", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que está sustancialmente libre de otras moléculas tales como otro material celular.

El término "recombinante" en el contexto de la presente invención significa "fabricado mediante modificación genética". Preferiblemente, un "objeto recombinante" tal como una célula recombinante o un ácido nucleico en el contexto de la presente invención no se produce de forma natural.

El término "de origen natural", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere al hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, un péptido o ácido nucleico que está presente en un organismo (incluyendo los virus) y puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio se produce de forma natural.

Términos tales como "reducir", "inhibir" o "disminuir" se relacionan con la capacidad de provocar una disminución general, preferiblemente del 5 % o más, del 10 % o más, del 20 % o más, más preferiblemente del 50 % o más, y lo más preferiblemente del 75% o más, en el nivel. Estos términos incluyen una inhibición completa o esencialmente completa, es decir, una reducción a cero o esencialmente a cero.

Términos tales como "aumentar", "mejorar", "promover" o "estimular" se relacionan con la capacidad de provocar un aumento general, preferiblemente del 5 % o más, del 10 % o más, del 20 % o más, del 50 % o más, del 75% o más, del 100% o más, del 200% o más, o del 500% o más, en el nivel. Estos términos pueden relacionarse con un aumento, mejora, promoción o estimulación desde cero o un nivel no medible o no detectable hasta un nivel de más de cero o un nivel que es medible o detectable. Alternativamente, estos términos también pueden significar que hubo un cierto nivel antes de un aumento, mejora, promoción o estimulación y después del aumento, mejora, promoción o estimulación, el nivel es más alto.

Los agentes y composiciones descritos en el presente documento se pueden usar para tratar a un sujeto con una enfermedad, por ejemplo, una enfermedad caracterizada por la presencia de un antígeno o células enfermas que expresan un antígeno. Las enfermedades particularmente preferidas son las enfermedades cancerosas. Los agentes y composiciones descritos en el presente documento también se pueden usar para inmunización o vacunación para prevenir una enfermedad descrita en el presente documento.

El término "enfermedad" se refiere a una condición anormal que afecta el cuerpo de un individuo. Una enfermedad a menudo se interpreta como una condición médica asociada con síntomas y signos específicos. Una enfermedad puede ser causada por factores originarios de una fuente externa, tal como una enfermedad infecciosa, o puede ser causada por disfunciones internas, tales como enfermedades autoinmunes. En los humanos, "enfermedad" a menudo se usa de manera más amplia para referirse a cualquier condición que causa dolor, disfunción, angustia, problemas sociales o la muerte del individuo afectado, o problemas similares para quienes están en contacto con el individuo. En este sentido más amplio, a veces incluye lesiones, discapacidades, trastornos, síndromes, infecciones, síntomas aislados, conductas desviadas y variaciones atípicas de estructura y función, mientras que en otros contextos y para otros fines pueden considerarse categorías distinguibles. Las enfermedades generalmente afectan a las personas no solo físicamente, sino también emocionalmente, ya que contraer y vivir con muchas enfermedades puede alterar la perspectiva de la vida y la personalidad. De acuerdo con la invención, el término "enfermedad" incluye enfermedades infecciosas y enfermedades cancerosas. Cualquier referencia en el presente documento a cáncer o formas particulares de cáncer también incluye metástasis de cáncer de los mismos.

Una enfermedad que se va a tratar de acuerdo con la invención es preferiblemente una enfermedad que implica un antígeno o que está asociada con un antígeno.

El término "enfermedad asociada con un antígeno" o "enfermedad que implica un antígeno" se refiere a cualquier enfermedad que implica un antígeno, por ejemplo, una enfermedad que se caracteriza por la presencia de un antígeno o células que expresan un antígeno. La enfermedad que afecta a un antígeno puede ser una enfermedad infecciosa, una enfermedad cancerosa o simplemente un cáncer. Como se mencionó anteriormente, el antígeno puede ser un antígeno asociado a una enfermedad, tal como un antígeno asociado a un tumor, un antígeno viral o un antígeno bacteriano.

El término "enfermedad infecciosa" se refiere a cualquier enfermedad que pueda transmitirse de un individuo a otro o de un organismo a otro, y que esté provocada por un agente microbiano. Las enfermedades infecciosas son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, una enfermedad viral, una enfermedad bacteriana o una enfermedad parasitaria, enfermedades que son causadas por un virus, una bacteria y un parásito, respectivamente. En este sentido, la enfermedad infecciosa puede ser, por ejemplo, hepatitis, enfermedades de transmisión sexual (por ejemplo, clamidia o gonorrea), tuberculosis, VIH/síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), difteria, hepatitis B, hepatitis C, cólera, enfermedades respiratorias agudas graves (SARS), la gripe aviar y la gripe.

Los términos "enfermedad de cáncer" o "cáncer" se refieren o describen la condición fisiológica en un individuo que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cánceres incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Más particularmente, los ejemplos de tales cánceres incluyen cáncer de hueso, cáncer de sangre, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de recto, cáncer de región anal, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de útero, carcinoma de los órganos sexuales y reproductivos, enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de tiroides, cáncer de glándula paratiroidea, cáncer de glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, carcinoma de células renales, carcinoma de pelvis renal, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), neuroectodérmico cáncer, tumores del eje espinal, glioma, meningioma y adenoma hipofisario. El término "cáncer" de acuerdo con la invención también comprende metástasis de cáncer. Preferiblemente, una "enfermedad cancerosa" se caracteriza por células que expresan un antígeno tumoral y una célula cancerosa expresa un antígeno tumoral.

En una realización, una enfermedad cancerosa es una enfermedad maligna que se caracteriza por las propiedades de anaplasia, invasividad y metástasis. Un tumor maligno puede contrastarse con un tumor benigno no canceroso en que una malignidad no es autolimitada en su crecimiento, es capaz de invadir los tejidos adyacentes y puede ser capaz de diseminarse a tejidos distantes (hacer metástasis), mientras que un tumor benigno tumor no tiene ninguna de esas propiedades.

De acuerdo con la invención, el término "tumor" o "enfermedad tumoral" se refiere a un crecimiento anormal de células (llamadas células neoplásicas, células tumorigénicas o células tumorales) que forman preferiblemente una hinchazón o una lesión. Por "célula tumoral" se entiende una célula anormal que crece mediante una proliferación celular rápida e incontrolada y continúa creciendo después de que cesan los estímulos que iniciaron el nuevo crecimiento. Los tumores muestran una falta parcial o total de organización estructural y coordinación funcional con el tejido normal y, por lo general, forman una masa distinta de tejido, que puede ser benigno, premaligno o maligno.

Por "metástasis" se entiende la propagación de células cancerosas desde su sitio original a otra parte del cuerpo. La formación de metástasis es un proceso muy complejo y depende del desprendimiento de células malignas del tumor primario, la invasión de la matriz extracelular, la penetración de las membranas basales endoteliales para ingresar a la cavidad corporal y los vasos, y luego, después de ser transportado por la sangre, infiltración de órganos objetivo. Finalmente, el crecimiento de un nuevo tumor, es decir, un tumor secundario o un tumor metastásico, en el sitio objetivo depende de la angiogénesis. La metástasis tumoral a menudo se produce incluso después de la extirpación del tumor primario porque las células o los componentes tumorales pueden permanecer y desarrollar un potencial metastásico. En una realización, el término "metástasis" de acuerdo con la invención se refiere a "metástasis a distancia" que se refiere a una metástasis que está alejada del tumor primario y del sistema de ganglios linfáticos regionales. En una realización, el término "metástasis" de acuerdo con la invención se refiere a la metástasis en los ganglios linfáticos.

Una recaída o recurrencia ocurre cuando una persona se ve afectada nuevamente por una condición que la afectó en el pasado. Por ejemplo, si un paciente ha padecido una enfermedad tumoral, ha recibido un tratamiento exitoso de dicha enfermedad y vuelve a desarrollar dicha enfermedad, dicha enfermedad recién desarrollada puede considerarse como recaída o recurrencia. Sin embargo, de acuerdo con la invención, una recaída o recurrencia de una enfermedad tumoral puede ocurrir, pero no necesariamente, en el sitio de la enfermedad tumoral original. Así, por ejemplo, si una paciente ha sufrido un tumor de ovario y ha recibido un tratamiento exitoso, una recaída o recurrencia puede ser la aparición de un tumor de ovario o la aparición de un tumor en un sitio diferente al ovario. Una recaída o recurrencia de un tumor también incluye situaciones en las que un tumor aparece en un sitio diferente al sitio del tumor original, así como en el sitio del tumor original. Preferiblemente, el tumor original para el que el paciente ha recibido un tratamiento es un tumor primario y el tumor en un sitio diferente al sitio del tumor original es un tumor secundario o metastásico.

El término "tratamiento" o "tratamiento terapéutico" se refiere a cualquier tratamiento que mejora el estado de salud y/o prolonga (aumenta) la vida útil de un individuo. Dicho tratamiento puede eliminar la enfermedad en un individuo, detener o retardar el desarrollo de una enfermedad en un individuo, inhibir o retardar el desarrollo de una enfermedad en un individuo, disminuir la frecuencia o gravedad de los síntomas en un individuo y/o disminuir la recurrencia en un individuo que actualmente tiene o que ha tenido previamente una enfermedad.

Los términos "tratamiento profiláctico" o "tratamiento preventivo" se refieren a cualquier tratamiento que pretende prevenir que ocurra una enfermedad en un individuo, en particular un individuo que está en riesgo de padecer la enfermedad. Los términos "tratamiento profiláctico" o "tratamiento preventivo" se usan en el presente documento de manera intercambiable.

Por "estar en riesgo" se entiende un sujeto, es decir, un paciente, que se identifica que tiene una probabilidad superior a la normal de desarrollar una enfermedad, en particular cáncer, en comparación con la población general. Además, un sujeto que ha tenido, o que actualmente tiene, una enfermedad, en particular cáncer, es un sujeto que tiene un mayor riesgo de desarrollar una enfermedad, ya que tal sujeto puede continuar desarrollando una enfermedad. Los sujetos que actualmente tienen, o que han tenido, un cáncer también tiene un mayor riesgo de metástasis de cáncer.

El término "inmunoterapia" se refiere al tratamiento de una enfermedad o afección mediante la inducción o potenciación de una respuesta inmune. El término "inmunoterapia" incluye inmunización con antígenos o vacunación con antígenos, o inmunización con tumores o vacunación con tumores.

Los términos "inmunización" o "vacunación" describen el proceso de proporcionar un antígeno a un individuo con el fin de inducir una respuesta inmune, por ejemplo, por motivos terapéuticos o profilácticos.

El término "in vivo" se refiere a la situación en un sujeto.

El término "individuo" o "sujeto" se refiere a los vertebrados, particularmente a los mamíferos. Por ejemplo, los mamíferos en el contexto de la presente invención son humanos, primates no humanos, mamíferos domésticos tales como perros, gatos, ovejas, vacas, cabras, cerdos, caballos, etc., animales de laboratorio tales como ratones, ratas, conejos, conejillos de indias, etc. así como animales en cautividad como animales de zoológicos. El término "sujeto" también se refiere a vertebrados que no son mamíferos, tales como aves (en particular, aves domesticadas, tales como pollos, patos, gansos, pavos) y peces (en particular, peces de piscifactoría, por ejemplo, salmón o bagre). El término "animal" como se usa en el presente documento también incluye humanos. Preferiblemente, el término "paciente" se refiere a un individuo enfermo.

El término "autólogo" se usa para describir cualquier cosa que se derive del mismo sujeto. Por ejemplo, "trasplante autólogo" se refiere a un trasplante de tejido u órganos derivados del mismo sujeto. Dichos procedimientos son ventajosos porque superan la barrera inmunológica que, de lo contrario, da como resultado el rechazo.

El término "alogénico" se usa para describir cualquier cosa que se deriva de diferentes individuos de la misma especie. Se dice que dos o más individuos son alogénicos entre sí cuando los genes en uno o más loci no son idénticos.

El término "singénico" se usa para describir cualquier cosa que se derive de individuos o tejidos que tengan genotipos idénticos, es decir, gemelos idénticos o animales de la misma cepa endogámica, o sus tejidos.

El término "heterólogo" se usa para describir algo que consta de múltiples elementos diferentes. Como ejemplo, la transferencia de la médula ósea de un individuo a un individuo diferente constituye un trasplante heterólogo. Un gen heterólogo es un gen derivado de una fuente distinta del sujeto.

Los agentes descritos en el presente documento pueden administrarse en forma de cualquier composición farmacéutica adecuada. El término "composición farmacéutica" se refiere a una formulación que comprende un agente terapéuticamente eficaz o una de sus sales, preferiblemente junto con excipientes farmacéuticos tales como tampones, conservantes y modificadores de la tonicidad. Dicha composición farmacéutica es útil para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno mediante la administración de dicha composición farmacéutica a un individuo. Una composición farmacéutica también se conoce en la técnica como una formulación farmacéutica. La composición farmacéutica se puede administrar local o sistémicamente.

El término "administración sistémica" se refiere a la administración de un agente terapéuticamente eficaz de manera que el agente se distribuye ampliamente en el cuerpo de un individuo en cantidades significativas y desarrolla un efecto biológico. De acuerdo con la presente invención, se prefiere que la administración sea por vía parenteral.

El término "administración parenteral" se refiere a la administración de un agente terapéuticamente eficaz de manera que el agente no pase por el intestino. El término "administración parenteral" incluye la administración intravenosa, la administración subcutánea, la administración intradérmica o la administración intraarterial, pero no se limita a las mismas.

En realizaciones particulares, un antígeno o un ácido nucleico que codifica un antígeno se administra antes, simultáneamente y/o después de la administración de las moléculas de ARN inmunoestimuladoras descritas en el presente documento. El antígeno o ácido nucleico que codifica un antígeno y las moléculas de ARN inmunoestimuladoras pueden estar presentes en una composición común, es decir, mezcladas entre sí. Además, también se contemplan realizaciones de acuerdo con la invención en las que el antígeno o ácido nucleico que codifica un antígeno y las moléculas de ARN inmunoestimuladoras están presentes juntos, pero no en la misma composición. Dichas realizaciones se refieren en particular a kits con al menos dos recipientes, donde un recipiente contiene una composición que comprende el antígeno o ácido nucleico que codifica un antígeno, y otro recipiente contiene una composición que comprende las moléculas de ARN inmunoestimuladoras.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender adyuvantes distintos de las moléculas de ARN inmunoestimuladoras descritas en el presente documento. Dichos adyuvantes comprenden un grupo heterogéneo de compuestos tales como emulsiones de aceite (por ejemplo, adyuvantes de Freund), compuestos minerales (tales como el alumbre), productos bacterianos (tal como la toxina de Bordetella pertussis) o complejos inmunoestimulantes. Los ejemplos de adyuvantes incluyen saponinas, adyuvantes de Freund incompletos, adyuvantes de Freund completos, tocoferol o alumbre, pero no se limitan a ellos.

La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se aplica generalmente en una "cantidad farmacéuticamente eficaz" y en "una preparación farmacéuticamente aceptable".

El término "cantidad farmacéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad que logra una reacción deseada o un efecto deseado solo o junto con dosis adicionales. En el caso del tratamiento de una enfermedad particular, la reacción deseada se refiere preferiblemente a la inhibición del curso de la enfermedad. Esto comprende ralentizar el progreso de la enfermedad y, en particular, interrumpir o revertir el progreso de la enfermedad. La reacción deseada en el tratamiento de una enfermedad también puede ser el retraso de la aparición o la prevención de la aparición de dicha enfermedad o dicho estado. Una cantidad efectiva de las composiciones descritas en el presente documento dependerá de la condición que se va a tratar, la severidad de la enfermedad, los parámetros individuales del paciente, incluyendo edad, condición fisiológica, tamaño y peso, la duración del tratamiento, el tipo de un acompañante terapia (si está presente), la vía específica de administración y factores similares. Por consiguiente, las dosis administradas de las composiciones descritas en el presente documento pueden depender de diversos de dichos parámetros. En el caso de que una reacción en un paciente sea insuficiente con una dosis inicial, se pueden usar dosis más altas (o dosis efectivamente más altas alcanzadas por una vía de administración diferente y más localizada).

El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a la no toxicidad de un material que no interactúa con la acción del componente activo de la composición farmacéutica.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden contener sales, tampones, conservantes, vehículos y, opcionalmente, otros agentes terapéuticos. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden uno o más vehículos, diluyentes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.

El término "excipiente" pretende indicar todas las sustancias en una composición farmacéutica que no son ingredientes activos tales como aglutinantes, lubricantes, espesantes, agentes tensioactivos, conservantes, emulsionantes, tampones, aromatizantes o colorantes.

El término "diluyente" se refiere a un agente diluyente y/o espesante. Además, el término "diluyente" incluye uno cualquiera o más de suspensión y/o medios de mezcla fluidos, líquidos o sólidos.

El término "vehículo" se refiere a uno o más rellenos o diluyentes sólidos o líquidos compatibles, que son adecuados para una administración a un ser humano. El término "vehículo" se refiere a un componente orgánico o inorgánico natural o sintético que se combina con un componente activo para facilitar la aplicación del componente activo. Preferiblemente, los componentes del vehículo son líquidos estériles tales como agua o aceites, incluyendo los que se derivan de aceite mineral, animales o plantas, tal como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite de sésamo, aceite de girasol, etc. Soluciones salinas y dextrosa acuosa y soluciones de glicerina también se pueden usar como compuestos portadores acuosos.

Los vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985). Los ejemplos de vehículos adecuados incluyen, por ejemplo, carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina, dextrina, almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, cera de bajo punto de fusión, manteca de cacao y similares. Los ejemplos de diluyentes adecuados incluyen etanol, glicerol y agua.

Los vehículos, excipientes o diluyentes farmacéuticos se pueden seleccionar con respecto a la vía de administración prevista y la práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender como portadores, excipientes o diluyentes, o además de estos, cualquier aglutinante, lubricante, agente de suspensión, agente de recubrimiento y/o agente solubilizante. Los ejemplos de aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales tales como glucosa, lactosa anhidra, lactosa de flujo libre, beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas, tales como acacia, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa y polietilenglicol. Los ejemplos de lubricantes adecuados incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio y similares. En la composición farmacéutica se pueden proporcionar conservantes, estabilizantes, colorantes e incluso agentes aromatizantes. Los ejemplos de conservantes incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. También se pueden usar antioxidantes y agentes de suspensión.

En una realización, la composición es una composición acuosa. La composición acuosa puede comprender opcionalmente solutos, por ejemplo, sales. En una realización, la composición está en forma de una composición liofilizada. Se puede obtener una composición liofilizada liofilizando una composición acuosa respectiva.

Los agentes y composiciones proporcionados en el presente documento pueden usarse solos o en combinación con otros regímenes terapéuticos tales como cirugía, irradiación, quimioterapia y/o trasplante de médula ósea (autólogo, singénico, alogénico o no relacionado).

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitativos del alcance de la invención.

Ejemplos

Las técnicas y métodos utilizados en el presente documento se describen en el presente documento o se llevan a cabo de una manera conocida per se y como se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y Todos los métodos, incluido el uso de kits y reactivos, se llevan a cabo de acuerdo con la información del fabricante, a menos que se indique específicamente.

Materiales y métodos

Adyuvantes de control y oligonucleótidos de ARN sintético

El agonista de TLR3 Poli (I:C), el ligando TLRH8 CL097, un derivado del compuesto de imidazoquinolina R₈48, el agonista de TLR8 humano ARNss40 complejado con lípido catiónico (LyoVec), el agonista de TLR9 humano/murino tipo C CpG ODN2395 y el agonista de TLR9 humano tipo D CpG ODN2216 se adquirió de Invivogen y se usó como adyuvante de control en diversos experimentos. Se utilizó bafilomicina A1 (Invivogen) como inhibidor de la acidificación endosomal para bloquear la activación de TLR. Se usó adyuvante de Freund completo e incompleto (CFNIFA) para inmunizaciones de control s.c. de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Sigma-Aldrich). El ARNis de NP71-Seq4 sintetizado químicamente (Chem. Synth.) y ARN de Poli (A) como control se adquirieron de Biomers.

Partículas similares a virus (VLP) derivadas del antígeno central del virus de la hepatitis B quimérico (HBcAg)

Se generaron HBcAg-VLP que muestran un epítopo seleccionado (#A79) del antígeno asociado a tumor (TAA) Claudin-6 (CLDN6) en su superficie como se describe en Klamp, T y col.; Cáncer Res 71(2), 1-12 (2011).

Transcripción in vitro y purificación de los ARNis

Plantillas de plásmidos para transcripción in vitro (IVT) de los ARNis se basaron en el vector pST1-A120 descrito en Kuhn, A. y col.; Gene Ther 17(8), 961-971 (2010). Los fragmentos de gripe NP seleccionados se clonaron entre sitios de restricción SpeI and XhoI utilizando métodos estándar de biología molecular. Los plásmidos resultantes se linealizaron con XhoI (Fermentas, ThermoFisher) y se purificaron mediante separación magnética utilizando ácido carboxílico Dynabeads MyOne (Invitrogen). La siguiente reacción IVT se realizó de acuerdo con los protocolos descritos previamente en Kreiter, S. et al.; Cancer Immunol Immunother 56, 1577-1587 (2007). La purificación a pequeña escala de los ARN de IVT se realizó con membranas a base de sílice usando el Kit RNeasy Mini (QIAGEN) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la purificación a gran escala de los ARN de IVT, se aplicó un método basado en FPLC que utiliza una columna de intercambio aniónico débil (HiTrap DEAE Sepharose FF, GE Healthcare) (Easton, LE. et al., RNA 16(3), 647-653 (2010)).

Formulación de ARNis

Dependiendo del uso para experimentos in vitro o in vivo, se formularon ARNis derivados de gripe NP purificados con lípidos catiónicos que difieren en su composición de lípidos/lípidos auxiliares y carga superficial (Kranz, LM. et al.; Naturaleza 534, 396-401 (2016)). Para asegurar una captación celular óptima en experimentos in vitro, los ARNis se formularon con la composición liposomal F5, mientras que la composición F12 se usó para experimentos in vivo. Las formulaciones de F12 permitieron una alta estabilidad sérica de los ARNis y la orientación al bazo de ARNis-lipoplejos después de la administración iv.

Ratones

Se obtuvieron ratones hembra Balb/cJRj y C57BL/6 de Janvier Laboratories (Francia). Los ratones transgénicos BDCA2-DTR criados en un entorno C57BL/6 expresan el receptor de la toxina diftérica de los simios (DTR) específicamente en células dendríticas plasmocitoides (pDC) y se adquirieron en Jackson Laboratory (EE. UU.). Los ratones tenían de 6 a 10 semanas de edad al comienzo de los experimentos. Todos los animales se mantuvieron en condiciones libres de patógenos.

Aislamiento de PBMC y pDC humanos

Las PBMC humanas se aislaron recientemente de sangre de donantes masculinos o femeninos sanos mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll como se describe en Lin, Z. et al.; Nature protocols 9, 1563-1577 (2014). Las células dendríticas plasmocitoides (pDC) se aislaron de PBMC humanas utilizando la tecnología de separación MACS y el CD304 MicroBead Kit (Miltenyi Biotec).

Aislamiento de células de médula ósea de ratón, esplenocitos, pDC y cDC

Se recolectaron células de médula ósea (BMC) de ratón de fémur y tibia murinos usando protocolos estándar. Los eritrocitos se lisaron mediante incubación durante 5 min con 5 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC) frío (Sigma-Aldrich), seguido de la adición de 20 ml de PBS 1x (Gibco) para detener la reacción de lisis. Los BMC se sedimentaron por centrifugación y se resuspendieron en medio de cultivo celular. Los esplenocitos de ratón se prepararon como se describe en Kreiter S et al; Cancer Immunol Immunother 56 1577-1587 (2007) Las pDC se aislaron de los esplenocitos mediante separación MACS utilizando el kit II de aislamiento de pDC de ratón (Miltenyi Biotec). Se generaron DC convencionales (cDC; CD11c alto, B220 bajo) a partir de BMC de ratón mediante cultivo durante 6 días en presencia de 20 ng/ml de GM-CSF y 20 ng/ml de IL4 (ambos de Peprotech).

Cultivo de células

Se cultivaron células humanas y de ratón primarias en RPMI1640 complementado con 10 % (v/v) de FBS inactivado por calor, 1 % (v/v) de aminoácidos no esenciales (NEAA), 1 % (v/v) de piruvato de sodio y solución de penicilina/estreptomicina al 0.5% (v/v). Se obtuvieron células K1 de ovario de hámster chino (CHO) transfectadas de manera estable con CLDN6 humano o CLDN9 humano de TRON gGmbH (Mainz, Alemania) y se cultivaron en DMEM complementado con 10% (v/v) de FBS inactivado por calor, 1 mg/ml de G418 y solución de penicilina/estreptomicina al 0.5% (v/v). Se obtuvieron células de riñón embrionario humano (HEK) 293 o células HEK₂93 de tipo silvestre que coexpresan de manera estable TLR3, TLR7 o TLR8 humanos y un gen informador de luciferasa inducible por NF-^kB de (Invivogen) y se cultivaron en DMEM suplementado con FBS inactivado por calor al 10 % (v/v), NEAA al 1 % (v/v), piruvato de sodio al 1 % (v/v) y solución de penicilina/estreptomicina al 0.5 % (v/v). Dependiendo del transfectante HEK₂93 utilizado, el medio se complementó adicionalmente con Blasticidin (10 μg/ml), Zeocin (100 μg/ml) o Geneticin (250 μg/ml), todos de Invivogen. FBS se adquirió de Biochrom y todos los demás reactivos de cultivo celular de Gibco.

Estimulación in vitro de células con ARNis

La estimulación celular con ARNis o controles se realizó por triplicado en placas de 96 pocillos (Corning) con un volumen total de 200 μl. A menos que se indique lo contrario, se usaron 5 * 10 A 5 células por pocillo y se estimularon durante 12-16 h a 37 ° C y 5% de CO²con ARNis formulados con F5 en una concentración de 0.167 μg/pocillo o reactivos de control utilizando concentraciones como las indicadas en los ejemplos.

Detección de citoquinas

Se detectaron IFN-a y otras citoquinas seleccionadas en los sobrenadantes de células humanas o de ratón o en suero sanguíneo de ratón usando kits ELISA disponibles comercialmente (PBL Assay Science) o el sistema Bio-Plex usando Bio-Plex Pro Kit III y perlas magnéticas acopladas Bio-Plex específicas de citoquinas (BioRad) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Experimentos in vivo de estimulación e inmunización

Para experimentos in vivo de estimulación, se inyectaron ratones Balb/c iv en el plexo venoso retrobulbar con diferentes cantidades de los ARNis formulados con F12. Dependiendo de la configuración experimental, las muestras de sangre para la preparación del suero se recolectaron en diferentes puntos de tiempo después de la inyección, como se indica en los ejemplos. El suero sanguíneo se preparó después de la coagulación por centrifugación usando protocolos estándar y se almacenó hasta su uso posterior a -20°C. Los experimentos de inmunización se realizaron por inyección iv de 20 μg de ARNis formulados con F12 mezclados con 50 μg de las VLP de HBcAg-#A79 purificadas (volumen total 100 μl) en el plexo venoso retrobulbar. A menos que se indique lo contrario, se aplicaron tres inyecciones con intervalos de dos semanas y se tomaron muestras de sangre finales 10 días después de la última inmunización. La preparación del suero sanguíneo se realizó como se ha descrito anteriormente.

Citometría de flujo

La inducción de anticuerpos específicos contra la proteína CLDN6 nativa después de la inmunización con las VLP de HBcAg-#A79 con o sin adyuvante se analizó mediante citometría de flujo. Se incubaron 2 * 10A5 células CHO-K1 CLDN6 o CLDN9 por pocillo durante 1 hora a 4 °C con antisuero de ratón policlonal diluido 1:100 en tampón FACS (1x PBS, 5 % (v/v) FBS, 5 mM EDTA). Después de tres pasos de lavado, las células se tiñeron durante 30 min a 4 °C con un anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-ratón de cabra conjugado con AlexaFluor 647 (ThermoFisher) diluido 1:600 en tampón FACS. Los anticuerpos no unidos se eliminaron mediante pasos de lavado adicionales y se determinó la viabilidad usando 7-AAD (Sigma). Las señales de fluorescencia de las células vivas fueron detectadas por un sistema FACS Canto II (BD Biosciences).

Análisis IFN-^yELISpot

Se incubaron 5 * 10A5 esplenocitos de ratón recién aislados en una placa de 96 pocillos (Merck Millipore) recubierta con anticuerpo monoclonal anti-IFN-Y (10 μg/ml AN18, Mabtech) en presencia de 5 μg/ml #A79 o un péptido irrelevante (JPT Peptide Technologies) durante 18 h a 37°C. Las placas se incubaron secuencialmente con anticuerpo monoclonal anti-IFN-Y secundario conjugado con biotina (R4-6A2, Mabtech) y fosfatasa alcalina extravidina (Sigma-Aldrich) antes de que se detectara la secreción de citoquinas mediante la adición de sustrato BCIP/NBT (Sigma-Aldrich). Para cada grupo se realizaron triplicados técnicos. Las placas se escanearon y analizaron utilizando un analizador ImmunoSpot S5 Versa ELISpot, el software ImmunoCapture 6.3 y el software ImmunoSpot 5.0.3 (todo Cellular Technology Ltd.).

Ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)

Para analizar las funciones efectoras citocidas mediadas por anticuerpos, se realizaron ensayos de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Se incubaron células CHO-K1 que expresaban CLDN6 humano de forma estable a una concentración de 1*10A4 células/pocillo en una placa de 96 pocillos (Corning Costar, Sigma-Aldrich) durante 17.5 h a 37 °C y 7.5 % de CO². Posteriormente las células se incubaron durante 80 min en un volumen total de 50 μl/pocillo con 5 μl de antisuero policlonal de ratón diluido en 32 μl de medio de cultivo y 13 μl de complemento de suero humano (Quidel Corporation) como fuente de complemento. Los sueros de ratón se derivaron de experimentos de inmunización con las VLP de HBcAg-#A79 adyuvadas de manera diferente. Se utilizó como control positivo un anticuerpo monoclonal específico de CLDN6 (Ganymed Pharmaceuticals AG, Mainz) en una concentración de 600 o 150 ng/ml. El complemento de suero humano inactivado por calor sirvió como control negativo y para la confirmación de un efecto citolítico mediado por anticuerpos dependiente del complemento. Las células no tratadas y las células lisadas por Triton X-100 (Applichem) se usaron como puntos de referencia para la lisis celular al 0 % y al 100 %, respectivamente. La viabilidad celular se analizó con el kit II de proliferación celular basado en el ensayo XTT (Roche Diagnostics) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La absorción a 480 nm se midió con el lector Infinite M200 Pro (Tecan). La actividad citolítica mediada por anticuerpos se calculó mediante la siguiente ecuación:

% de lisis de células = 100% -((Señal de antisuero - Señal de 100% de lisis/Señal de células no tratadas) x 100)

ELISA de isotipado de inmunoglobulina de ratón

Las placas de 96 pocillos acopladas con estreptavidina (Nunc, ThermoFisher) se recubrieron durante 1 h con 100 ng/pocillo de péptido #A79 biotinilado (JPT Peptide Technologies) seguido del bloqueo de las superficies sin recubrimiento durante 1 h con PBS 300 μl/pocillo 1x, FBS 2 % (v/v) y lavado con PBS 1x, Tween20 al 0.05 % (Sigma-Aldrich) utilizando un lavador de placas HydroSpeed (Tecan). Los antisueros policlonales de ratón se diluyeron en serie 10 veces con tampón de bloqueo de caseína 1x (Sigma-Aldrich) y se añadieron 100 μl de sueros diluidos por pocillo y se incubaron durante 1 h con agitación ligera en una plataforma de agitación (Infors). Los anticuerpos unidos se detectaron después de pasos de lavado adicionales mediante incubación durante 1 h con anticuerpos secundarios específicos de isotipo IgG anti-ratón de cabra diluidos 1:5000 conjugados con HRP (ThermoFisher), seguidos de pasos de lavado finales y la adición de sustrato TMB (Sigma-Aldrich) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La absorción a 450 nm se midió con un lector Infinite M200 Pro (Tecan). Todos los pasos se realizaron a temperatura ambiente y las diluciones de antisuero se midieron por triplicado.

Análisis estadístico

Todos los resultados se expresan como media /- error estándar de la media (SEM). Los cálculos estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism versión 6. Se usó la prueba T para comparar dos grupos. Para más de dos grupos se utilizó ANOVA de una vía. La diferencia entre los grupos se consideró estadísticamente significativa en P≤0.05

Ejemplo 1: La fragmentación secuencial del ARN que codifica la nucleoproteína (NP) de la gripe permite la identificación y selección de pequeñas moléculas de ARN inmunoestimulantes (ARNis) con especificidad de TLR definida y perfil de inducción de citoquinas.

Basado en la observación de que el ARN genómico completo de gripe A indujo altos niveles de interferón-alfa (IFN-a) en células dendríticas plasmocitoides (pDC) por medio de la estimulación del receptor tipo Toll 7 (TLR7) (Diebold SS. et al.; Ciencia 303 (5663), 1529-1531 (2004), se seleccionó el ARN que codifica la nucleoproteína (NP) de la gripe A (1565 nt) como secuencia parental para establecer una estrategia de fragmentación secuencial para la identificación de moléculas de ARN monocatenarias (ARNis) inmunoestimuladoras definidas y cortas responsables de la dependencia de TLR7, actividad inductora de IFN-a. A diferencia del ARN genómico completo de la gripe A u otro ARN completo derivado de virus, las moléculas cortas de ARNis que inducen un perfil definido de inducción de citoquinas y una modulación de la respuesta inmune adaptativa específica se pueden producir a gran escala en condiciones GMP mediante síntesis química o transcripción in vitro, lo que permite su aplicación clínica como adyuvantes para vacunas basadas en proteínas recombinantes.

La Figura 1 muestra una descripción general esquemática de la estrategia de fragmentación secuencial aplicada utilizando ARN que codifica NP de gripe (2-2-8, NP 1-1565) como secuencia de inicio. La fragmentación se realizó en ciclos iterativos y los fragmentos seleccionados se transcribieron in vitro en ARN, purificado y posteriormente cribado in vitro por sus actividades inmunoestimuladoras y especificidad TLR. Se seleccionaron fragmentos con la mayor especificidad de TLR7, capacidad de inducción de IFN-a y un perfil de inducción de citoquinas favorable para ciclos de fragmentación adicionales. La estrategia de fragmentación realizada secuencialmente finalmente dio como resultado la identificación y selección de ARNis pequeños con una longitud de 38-60 nucleótidos designados como NP71-Seq4, Inno71-5A, NP71-Seq44 y NP71-Seq45.

Ejemplo 2: Síntesis de ARNis por transcripción in vitro, composición y secuencia de ARNiss y control de calidad tras la purificación.

Las secuencias de ADN que codifican fragmentos de NP de gripe seleccionados se clonaron corriente abajo de un promotor de ARN polimerasa de bacteriófago T7 en el plásmido pST1 usando sitios de restricción SpeI y XhoI. Los plásmidos linealizados Xho sirvieron como plantilla de ADN para la siguiente transcripción in vitro (TVI) El ARN IVT sintetizado por la ARN polimerasa T7 consistía en el fragmento de ARN NP de gripe seleccionado flanqueado en ambos lados por tramos cortos derivados de la plantilla del plásmido pST1 (Fig. 2A).

Las secuencias de los ARNis NP71-Seq4, Inno71-5A, NP71-Seq44 y NP71-Seq45 finalmente seleccionados y su tamaño total (en nucleótidos, nt) incluidas las partes de secuencia derivadas de pST1 se muestran en la Figura 2B. Las secuencias derivadas de la plantilla pST1 están subrayadas. El extremo 5' de los ARNis se caracteriza por una guanosina triple que representa el sitio de inicio de la transcripción de la polimerasa de ARN T7 (Imburgio, D. et al.; Biochemistry 39(34), 10419-10430 (2000).

Después de la purificación con membranas a base de sílice o columnas de intercambio aniónico débil, se controló la calidad de los ARNis de forma predeterminada utilizando una variedad de métodos analíticos. El tamaño, la homogeneidad y la integridad de los ARNis purificados se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 10% (PAA) desnaturalizante (Fig. 2C) y mediante electroforesis capilar en chip utilizando el sistema Bioanalyzer 2100 (Agilent) (Fig. 2D). Los resultados se ejemplifican para ARNis de NP71-Seq4 que se produjo mediante IVT o se sintetizó completamente químicamente (Chem. Synth.). NP71-Seq4 (IVT) se caracterizó por una banda única distinta del tamaño esperado en geles de PAA y un pico pronunciado en electroforesis capilar que indica una población homogénea sin signos de pérdida de integridad de ARN. Por el contrario, el ARNis de NP71-Seq4 sintetizado químicamente reveló un hombro de pico y un segundo pico menor después de la electroforesis capilar que apunta hacia una población de ARN más heterogénea. Por lo tanto, se usó ARN de IVT en todos los experimentos posteriores.

Ejemplo 3: Los ARNis formulados inducen altos niveles de IFN-a en PBMC humanas.

Los posibles candidatos de ARNis derivados de la fragmentación secuencial se seleccionaron después de la purificación y el control de calidad para determinar su capacidad inmunoestimuladora en ensayos in vitro celulares. Un comportamiento diferencial en su capacidad para inducir las citoquinas principales IFN-a (inducción fuerte) versus TNF-a (inducción débil o ausente) se definió como un criterio clave inicial para la selección de candidatos y los pasos posteriores de fragmentación. La inducción mediada por ARNis de la fuerte citoquina proinflamatoria TNF-a debe minimizarse, ya que podría provocar efectos secundarios sistémicos dañinos y, por lo tanto, afectar negativamente el perfil de seguridad de los ARNis identificados cuando se usan como adyuvantes de vacunas.

Se estimularon 1 * 10 A 6 PBMC humanas recién aisladas por pozo con ARN de NP71 IVT formulado con F5 o fragmentos derivados de este (NP71-Seq1 - NP71-Seq4; véase también la Fig. 1) y los niveles de IFN-a y TNF-a secretado en los sobrenadantes del cultivo celular tras la estimulación se analizó mediante ELISA. Se usaron candidatos de prueba de ARNis en dos concentraciones diferentes (0.167 y 0.041 μg/pocillo) que reflejaban la cantidad equivalente o la molaridad equivalente al fragmento de ARN de NP71 original más grande. Se utilizaron Poli (I:C) formulado con F5 (0.167 μg/pocillo) y CL097 sin formular (0.2 μg/pocillo) como controles positivos para la inducción de IFN-a y TNF-a respectivamente. La incubación de células con liposomas F5 medios o vacíos sirvió como control negativo. La actividad inmunoestimuladora de los ARN de IVT analizados se basó en una forma apropiada de administración, como se ilustra en la Figura 3A mediante la formulación liposomal de fragmentos de ARN de NP71 (0.167 μg/pocillo). El fragmento de ARN de NP71 parental indujo altos niveles tanto de IFN-a como de TNF-a. En contraste con NP71, el ensayo ELISA reveló que la estimulación de PBMC humanas con ARNis NP71-Seq4 dio como resultado el perfil de inducción de citoquinas favorecido con cantidades altas de IFN-a y bajas de TNF-a secretadas en el sobrenadante celular. Todos los demás candidatos de la prueba provocaron una inducción más equilibrada de ambas citoquinas que se volvieron prominentes especialmente cuando se usaron concentraciones de ARN más altas (0.167 μg/pocillo) y no se tuvieron en cuenta para los pasos de fragmentación posteriores. Este resultado indicó que la estrategia de fragmentación secuencial aplicada era capaz de identificar y seleccionar fragmentos de ARN definidos con la actividad inmunoestimuladora deseada.

Se seleccionó NP71-Seq4 para una mayor fragmentación para identificar motivos de secuencia central aún más cortos responsables del efecto inductor de IFN-a observado. Los pequeños fragmentos de ARNis resultantes Inno71-5A, NP71-Seq44 y NP71-Seq45 (véanse también la Fig. 1 y la Fig. 2B) se formularon con liposomas F5 y se usaron en una concentración de 0.167 μg/pocillo para la estimulación de 1*10 A6 PBMC humanas por pocillo (Fig. 3B). La incubación con liposomas F5 vacíos o medio solo sirvió como control negativo. Se usó CpG ODN2395 sin formular (5 μg/ml) como control positivo para la inducción de IFN-a analizada por ELISA. El ARNis de Inno71-5A, que representa el tramo de secuencia más corto de NP71-Seq4, indujo niveles de IFN-a comparables a los de su NP71-Seq4 original. Este resultado indicó que Inno71-5A contenía el motivo de secuencia de reconocimiento principal necesario para el efecto inmunoestimulador observado de NP71-Seq4. Inesperadamente, NP71-Seq44 formulado con F5 y especialmente ARNis de NP71-Seq45 fueron capaces de inducir niveles de IFN-a aún más altos que el NP71-Seq4 original. A diferencia de Inno71-5A que representaba una parte de la secuencia 5' de NP71-Seq4, NP71-Seq44 y NP71-Seq45 contenían las secuencias de los extremos 5' y 3' originales de NP71-Seq4 y se caracterizaron por un agotamiento interno de las partes de la secuencia de ARN de NP71-Seq4 (véase la Fig. 1).

Ejemplo 4: las pDC pueden orientarse in vitro por los ARNis formulados con F5 y son las principales células efectoras de la secreción de IFN-a tras la estimulación con ARNis.

Se sabe que las pDC humanas y de ratón son los principales productores celulares de IFN-a tras la estimulación con ARN viral monocatenario (ss) o ARNss que contiene motivos de secuencia específicos. Para investigar si los ARNis cortos formulados con F5 derivados de gripe NP son capaces de dirigirse a las pDC y activar la producción de IFN-a, las pDC humanas se separaron de las PBMC utilizando la tecnología MACS y se usaron para un ensayo in vitro de estimulación Los liposomas F5 vacíos y las células tratadas con medio solo sirvieron como controles negativos. CpG ODN2216 sin formular (5 μg/ml) sirvió como control positivo para la inducción de IFN-a (Fig. 4). Los resultados de ELISA indicaron que los pDC pueden ser el objetivo de los ARNis formulados con liposomas y producir grandes cantidades de IFN-a tras la estimulación. Las PBMC empobrecidas por pDC mostraron una inducción de IFN-a fuertemente disminuida en comparación con las PBMC completas, lo que indica que es probable que las pDC sean los principales productores de IFN-a a los que se dirigen los ARNis formulados con liposomas. En concordancia con resultados previos utilizando PBMC completas, la estimulación de pDC con ARNis Inno71-5A que representa la secuencia de ARNis más corta dio como resultado niveles de IFN-a muy similares a los inducidos por el ARNis parental NP71-Seq4. La estimulación de pDC con ARNis NP71-Seq45 formulado con F5 indujo mayores cantidades de IFN-a que NP71-Seq4, lo que confirma experimentos previos con PBMC completas (ver Fig. 3B). Sobre la base de estos resultados, se seleccionó ARNis NP71-Seq45 como candidato principal y se utilizó principalmente en otros experimentos.

Ejemplo 5: la inducción de IFN-a mediada por ARNis NP71-Seq45 en PBMC humanas depende de los TLR localizados endosomalmente.

La inducción de IFN-a en pDC por el ARN genómico completo de la gripe A depende de la activación del TLR7 ubicado endosomalmente (Diebold SS. et al.; Science 303(5663), 1529-1531 (2004)). Con el fin de evaluar que la inducción de IFN-a tras la estimulación con ARNis formulados con F5 depende de la detección de ácido nucleico, los TLR endosomales, las PBMC humanas enteras recién aisladas se pretrataron durante 1 h con bafilomicina A1 250 nM y posteriormente se incubaron durante 14 h con NP71- Seq45 (Fig. 5). La bafilomicina A1 previene la acidificación endosomal al inhibir la H+ATPasa vacuolar, lo que resulta en el bloqueo de los TLR ubicados en el endosoma que detectan ácidos nucleicos como TLR3, TLRH8 o TLR9. Los liposomas F5 vacíos y las células incubadas con medio solo sirvieron como controles negativos, mientras que CpG ODN2216 (ligando TLR9) sin formular funcionó como control positivo para el tratamiento con bafilomicina A1. Como se esperaba, el pretratamiento con bafilomicina A1 disminuyó fuertemente la inducción de IFN-a por CpG ODN216 mientras que la viabilidad celular no se vio afectada por la concentración de bafilomicina A1 utilizada (datos no mostrados). Se pudo observar una fuerte reducción similar de la secreción de IFN-a para las PBMC incubadas con bafilomicina A1 seguida de estimulación con NP71-Seq45, lo que indica que los ARNis son reconocidos por un TLR endosomal.

Ejemplo 6: ARNis NP71-Seq45 es un agonista específico para TLR7.

Con el fin de analizar qué TLR endosomal sensible a nucleótidos es activado por NP71-Seq45, se incubaron células HEK₂93 que coexpresan de forma estable TLR3, TLR7 o TLR8 humanos además de un gen informador de luciferasa inducible por NF-^kB con ARNis NP71-formulado con F5. Las señales de Seq45 y luciferasa se compararon con células no tratadas (solo medio) (Fig. 6). Se excluyeron las células HEK₂93 que expresan TLR9, ya que TLR9 reconoce exclusivamente moléculas de ADN específicas. Los controles positivos fueron Poli (I:C) formulado con F5 para TLR3, CL097 sin formular para TLR7 y TLR8, así como ARNss40 en complejo con lípidos catiónicos para TLR8. Las células tratadas con liposomas F5 vacíos sirvieron como control negativo. La adición de ARNis de NP71-Seq45 formulado con F5 activó el gen informador solo en células HEK₂93 que coexpresan TLR7 humano, mientras que no se obtuvieron señales de luciferasa en otras células que expresan TLR. Este resultado indicó que NP71-Seq45 actúa como un ligando específico para TLR7 humano.

En conjunto, estos resultados revelaron que los ARNis formulados en liposomas son capaces de inducir la producción de IFN-a in vitro en pDCs y que la actividad inmunoestimuladora está mediada principalmente por TLR7 localizado en endosomas.

Ejemplo 7: Los ARNis formulados con F5 inducen altos niveles de IFN-a, pero solo niveles marginales de IFN-^y, TNF-a e IL10 en PBMC humanas.

Un parámetro clave para la selección de ARNis como adyuvantes de vacunas fue su capacidad para inducir niveles altos de IFN-a y niveles mínimos o nulos de citoquinas fuertemente proinflamatorias como TNF-a e IFN-y que podrían causar efectos secundarios sistémicos dañinos tras la vacunación. Además, los adyuvantes basados en ARNis no deberían conducir a una fuerte inducción de citoquinas antiinflamatorias como IL10 que inhibe la actividad de las células Th1, las células asesinas naturales (NK) y los macrófagos, promoviendo así un fenotipo Th2 de la respuesta inmune.

Para analizar el perfil de citoquinas inducido por ARNis NP71-Seq45 y su fragmento original NP71-Seq4, se realizó un inmunoensayo de perlas multiplexadas. Se incubaron 1 * 10 A 6 PBMC humanas recién aisladas por pocillo con ARNis formulados con F5 (0.167 μg/pocillo) o CpG ODN2216 sin formular (1 μg/pocillo) como liposomas F5 positivos y vacíos como control negativo. Las concentraciones de citoquinas analizadas en el sobrenadante celular incluyeron IFN-a, IL6, IFN-^y, TNF-a e IL10 (Fig. 7). Ambos ARNis indujeron altos niveles de IFN-a y NP71-Seq45 tuvo un efecto superior, lo que confirma los resultados anteriores. Las cantidades de IFN-a detectadas estaban en un intervalo similar al observado para CpG ODN2216 de tipo D que se sabe que induce una fuerte secreción de pDC IFN-a. Para TNF-a, IFN-^ye IL10 solo se detectaron niveles marginales, mientras que IL6, una citocina con propiedades proinflamatorias y antiinflamatorias dependientes del contexto e involucrada en la activación y maduración de las células B, fue moderadamente inducida por ARNis o CpG ODN2216.

El perfil de citoquinas inducido por los ARNis en PBMC humanas in vitro indica que los ARNis identificados montan una respuesta inmune innata caracterizada por la producción de citoquinas Th1 con el potencial de mejorar la generación de respuestas inmunes humorales y celulares específicas de antígeno al tiempo que minimizan la inducción de citoquinas proinflamatorias principales potencialmente dañinas.

Ejemplo 8: La estimulación in vitro de células de ratón con ARNis formulados con F5 da como resultado una fuerte inducción dependiente de pDC de IFN-a y solo una secreción marginal de TNF-a.

Los resultados in vitro anteriores que utilizan PBMC humanas recién preparadas podrían demostrar claramente la fuerte capacidad inmunoestimuladora de los ARNis identificados con una inducción alta de IFN-a y solo marginal de TNF-a. Para realizar un trabajo significativo estudios preclínicos in vivo utilizando modelos de ratón en experimentos posteriores, el efecto inmunoestimulador, incluyendo las principales células objetivo responsables, tuvo que ser confirmado in vitro.

Por lo tanto, las células Balb/c derivadas de la médula ósea y los esplenocitos se aislaron y se incubaron con ARNis NP71-Seq4 o NP71-Seq45 formulado con F5, CpG ODN2359 sin formular (0.5 μg/pocillo) o liposomas F5 vacíos (Fig. 8A). Las células no tratadas (sólo células) sirvieron como control negativo. Además, los esplenocitos empobrecidos por pDC, pDC enriquecidas y células dendríticas convencionales enriquecidas (cDC) se estimularon como se indicó anteriormente (Fig. 8B). Las concentraciones de citoquinas en los sobrenadantes celulares se analizaron mediante ELISA.

Confirmando los resultados obtenidos en PBMC humanas, la estimulación de esplenocitos de ratón o células derivadas de médula ósea con ARNis conduce a una fuerte inducción de IFN-a y solo a una inducción marginal de TNF-a. Por el contrario, la incubación con el agonista de TLR9 clase C CpG ODN2359 provocó una fuerte inducción de ambas citoquinas probadas. Además, y de acuerdo con resultados de PBMC humano in vitro (véase también Fig. 3B) NP71-Seq45 reveló una capacidad inmunoestimuladora más fuerte que su fragmento de ARN parental NP71-Seq4. La inducción de IFN-a tras la estimulación con ARNis dependía estrictamente de las pDC, como ya se observó utilizando células humanas.

Los resultados in vitro con células murinas recién preparadas indicaron la amplia aplicabilidad de los ARNis identificados y permitió más experimentos in vivo utilizando ratones como sistema modelo.

Ejemplo 9: Estimulación de ARNis formulado con F12 in vivo conduce a una inducción de IFN-a dependiente del tiempo y la dosis.

Las relaciones de tiempo y dosis-respuesta tras la aplicación de adyuvantes ARNis son parámetros importantes para la evaluación de la seguridad y el desarrollo de un régimen de inmunización óptimo. Por lo tanto, a los ratones Balb/c se les inyectó iv una vez con dosis crecientes de ARNis de NP71-Seq4 formulado. A diferencia de la formulación liposomal F5 utilizada en experimentos in vitro, la formulación liposomal F12 utilizada para los estudios in vivo se adaptó para una entrega óptima de ARNis en el bazo, el lado principal de la activación inmune tras la administración iv. Se tomaron muestras de scrum de ratón después de 1, 3, 5, 8 y 24 h después de la inyección para analizar el efecto estimulador in vivo de los ARNis con respecto a la inducción dependiente de la dosis y el tiempo de IFN-a medida por ELISA (Fig. 9).

Independientemente de la dosis administrada, la inducción máxima de IFN-a in vivo ya se alcanzó 5 horas después de la inmunización y disminuyó a niveles normales a partir de entonces. La administración iv de 10 μg de ARNis de NP71-Seq4 ya era suficiente para el efecto estimulador máximo y no podía incrementarse con dosis más altas. Incluso después de la inyección de 40 μg de ARNis, los efectos adversos no fueron visibles, lo que indica la buena tolerabilidad de los ARNis después de la aplicación sistémica.

Ejemplo 10: La administración iv repetitiva de ARNis formulados con F12 a intervalos frecuentes condujo a una tolerancia de respuesta TLR sistémica que puede superarse mediante un régimen de inmunización adaptado.

La tolerancia a la respuesta de TLR es un efecto bien conocido, en donde la exposición repetida a los agonistas de TLR da como resultado una respuesta de liberación de citoquinas disminuida. Broad, A. et al.; Curr Med Chem 13(21), 2487-2502 (2006)). Como consecuencia, la vacunación con la administración conjunta de adyuvantes de ARNis a frecuencias demasiado altas tendría un impacto perjudicial en la respuesta inmune general y debería evitarse. Por lo tanto, era importante analizar en qué intervalos de tiempo se pueden administrar los ARNis sin que se produzca una tolerancia a la respuesta de los TLR.

El ARNis de NP71-Seq4 formulado con F12 se inyectó iv dos veces en ratones Balb/c a un intervalo de 5 (1er grupo) o 7 días (2do grupo) (Fig. 10). A ambos grupos se les inyectaron 20 μg de ARNis/ratón y se tomaron muestras de sangre 4 horas después de cada inyección. La concentración de ARNis utilizada y el tiempo de muestreo de sangre después de la inyección demostraron ser óptimos en experimentos anteriores (véase la Fig. 9). Los niveles séricos de IFN-a se detectaron mediante ELISA. La administración de ARNis de NP71-Seq4 formulado con F12 en un intervalo de tiempo de 5 días dio como resultado un efecto pronunciado de tolerancia a la respuesta de TLR con una secreción de IFN-a fuertemente disminuida después de la segunda inyección. Sin embargo, la capacidad de respuesta de TLR podría restaurarse casi por completo con un intervalo de inyección de 7 días. Por lo tanto, los experimentos de vacunación posteriores que combinaron un antígeno modelo y adyuvantes de ARNis se realizaron usando inmunizaciones múltiples con un intervalo de tiempo mínimo de 10 a 14 días después de cada inyección para garantizar un efecto adyuvante de ARNis máximo.

Ejemplo 11: Los ARNis formulados con F12 en combinación con las VLP de HBcAg-#A79 inducen una respuesta de células B y T específica de antígeno in vivo.

En experimentos anteriores pudimos demostrar que los ARNis identificados pueden estimular el sistema inmune innato, especialmente las pDC, de manera altamente eficiente y en gran medida dependiente de TLR7, lo que da como resultado la liberación de altas cantidades de IFN-a. En posteriores estudios in vivo de inmunización, se quería analizar si la activación del sistema inmune innato por los ARNis se puede traducir en una respuesta inmune adaptativa eficiente y específica de antígeno de las células B y T

Para este propósito, se combinó ARNis seleccionados con el antígeno modelo basado en partículas similares a virus (VLP) HBcAg-#A79. Las VLP consisten en proteínas estructurales virales con la capacidad inherente de autoensamblarse en estructuras macromoleculares. Las VLP se parecen al virus del que se originaron, pero no contienen ningún material genético viral. Por lo tanto, las VLP no son infecciosas y generalmente se consideran un formato de vacuna seguro. La alta inmunogenicidad intrínseca de las VLP se puede transferir a epítopos heterólogos que se muestran de manera repetitiva en la superficie de las VLP. El antígeno modelo utilizado HBcAg-#A79 se basa en VLP quiméricas producidas de forma recombinante derivadas del antígeno central del virus de la hepatitis B (HBcAg), que presenta un epítopo insertado genéticamente del antígeno CLDN6 asociado a tumor (TAA) localizado en la superficie celular. El epítopo CLDN6 #A79 fue un candidato ideal para los estudios de inmunización porque funciona como un epítopo combinado de células B y T, el último restringido a MHC-clase I H-2 Kd expresado por ratones Balb/c consanguíneos.

Se inmunizaron ratones Balb/c iv cuatro veces a intervalos de dos semanas con las VLP de HBcAg-#A79 combinadas con ARNis NP71-Seq4 o NP71-Seq45 formulado con F12. Los ratones no tratados o los ratones inmunizados con liposomas F12 vacíos, ARN Poli(A) formulado con F12 o HBcAg-#A79-VLP con adyuvante con CFNIFA (inmunizados s.c.) sirvieron como controles. Diez días después de la tercera inmunización, se tomaron muestras de sangre para el análisis de la respuesta inmune humoral específica de antígeno por citometría de flujo (Fig. 11A). Cinco días después de la cuarta inmunización, se sacrificaron los animales y se aislaron los esplenocitos para analizar la inducción de una respuesta de células T específica mediante un ensayo ImmunoSpot ligado a enzimas (ELlSpot) (Fig. 11B).

El análisis de citometría de flujo se realizó utilizando células CHO-K1 vivas transfectadas de forma estable con el TAA CLDN6 objetivo o su homólogo cercano CLDN9 para el control de la especificidad. La detección de anticuerpos unidos se expresó mediante el desplazamiento de la intensidad de fluorescencia media (MFI) calculado dividiendo la MFI del suero inmune por el MFI del respectivo suero previo al sangrado (antes de la primera inmunización). Los cambios de MFI superiores a 2 veces se consideraron como respuestas positivas de anticuerpos específicos de antígeno. Las VLP de HBcAg-#A79 inmunizadas sin la adición de adyuvantes inducen una respuesta inmune específica de antígeno débil y solo unos pocos animales muestran reacciones positivas. La respuesta inmune específica de antígeno aumentó ligeramente mediante la adyuvancia con ARN de Poli (A), CFNIFA o liposomas F12 vacíos. Sin embargo, este efecto no fue significativo (ns) en comparación con las VLP de HBcAg-#A79 sin adyuvante. La coadministración de ARNis NP71-Seq4 o NP71-Seq45 aumentó de manera fuerte y muy significativa la respuesta de anticuerpos específicos del antígeno CLDN6 tras la inmunización con VLP de HBcAg-#A79 sin aumentar ninguna unión inespecífica de anticuerpos a CLDN9. La inmunización de animales usando ARNis de NP71-Seq45 como adyuvante resultó generalmente en cambios de MFI de anticuerpos más altos que NP71-Seq4.

El análisis ELISpot reveló que las inmunizaciones que usaban las VLP de HBcAg-#A79 adyuvadas con ARN de Poli (A) o CFNIFA, así como la adición de liposomas F12 vacíos dieron como resultado una falta total de respuestas de células T detectables. Por el contrario, la coadministración de ARNis indujo una respuesta de células T específica del péptido #A79 altamente significativa en donde NP71-Seq4 condujo a un mayor número de manchas de IFN-y en comparación con NP71-Seq45.

Los resultados obtenidos mediante la inmunización de ratones con las VLP de HBcAg-#A79 en combinación con adyuvantes de ARNis formulados con liposomas indicaron claramente que la inducción eficiente de una respuesta de anticuerpos específica de antígeno y de alto título capaz de detectar el TAA objetivo en su conformación nativa en células vivas dependía en gran medida de los adyuvantes de ARNis utilizados. Además, solo la combinación del antígeno modelo con ARNis formulados fue capaz de inducir simultáneamente una respuesta de células T específica de péptido TAA reflejada por un alto número de puntos de IFN-y. Por lo tanto, los ARNis identificados administrados iv en una formulación liposomal pueden actuar como un adyuvante para impulsar la generación de respuestas inmunes específicas de antígeno humorales y celulares in vivo cuando se combina con una vacuna basada en proteína recombinante.

Ejemplo 12: Las respuestas de células B y T específicas de antígeno inducidas por la inmunización de ARNis formulados con F12 en combinación con VLP de HBcAg-#A79 dependen de la dosis.

En un experimento anterior (véase la Fig. 9), se pudo demostrar que la inducción in vivo de IFN-a por los ARNis formulados depende del tiempo y de la dosis y ya se ha logrado un efecto máximo después de una sola inyección de 10 |jg de ARNis. La correlación de esta dependencia de la dosis con la inducción in vivo se analizó de una respuesta combinada y específica de antígeno de células B y T inmunizando ratones iv con VLP de HBcAg-#A79 adyuvadas con dosis crecientes (5, 10, 20 y 40 jg/inyección) de ARNis de NP71-Seq45 formulado con F12. El programa de inmunización y la configuración experimental fueron idénticos a los descritos en el ejemplo 11.

Ya 5 jg/inyección de ARNis de NP71-Seq45 formulado con F12 fueron suficientes para mostrar una respuesta de anticuerpos claramente mejorada, como se muestra por citometría de flujo (Fig. 12A). Además, se detectó una respuesta de anticuerpos específicos de antígeno dependiente de la dosis hasta una concentración de 20 jg/inyección de ARNis sin aumento adicional al aplicar 40 jg/inyección. Esta dependencia de la dosis se parecía al curso dependiente de la dosis de la secreción de IFN-a que apuntaba hacia un papel crucial de IFN-a en la actividad adyuvante de los ARNis formulados con F12. Se detectó una mejora significativa de la respuesta de células T específica del péptido #A79 mediante IFN-y ELISpot al aplicar al menos 10 jg/inyección de ARNis (Fig. 12B). Además, y en contraste con los resultados observados para las respuestas de células B desencadenadas por ARNis, la respuesta de células T específicas de péptido se mejoró aún más al aumentar la dosificación de adyuvante de ARNis hasta 40 jg/inyección de NP71-Seq45. La reactividad inespecífica de las células T contra un péptido irrelevante derivado del tAa CLDN18.2 estuvo ausente incluso con la dosis más alta de NP71-Seq45.

Estos resultados indicaron un comportamiento diferencial dependiente de la dosis de la respuesta inmune de células B y T inducida por ARNis que permite su modulación adaptando la dosis de ARNis aplicada.

Ejemplo 13: Los anticuerpos específicos de antígeno provocados por la inmunización con ARNis formulados con F12 y VLP de HBcAg-#A79 destruyen las células positivas objetivo mediante CDC.

Las estrategias de vacunación exitosas podrían depender de la inducción de anticuerpos específicos de antígeno que puedan unirse a su proteína objetivo en su conformación nativa y, posteriormente, mediar en la destrucción de células positivas objetivo a través de mecanismos efectores inmunes. Una de las principales funciones efectoras citolíticas mediadas por la porción Fc de los anticuerpos es la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) que se analizó utilizando sueros sin purificar diluidos 1:10 derivados del experimento de inmunización descrito en el ejemplo 11.

Los ensayos de los CDC revelaron que los sueros de ratones inmunizados con VLP de HBcAg-#A79 y ARNis formulados con F12 ejercen funciones efectoras citocidas eficientes (Fig. 13). La actividad citolítica dependía estrictamente del complemento activo ya que el complemento inactivado por calor (1:10 hi) disminuía fuertemente la muerte celular. Los sueros derivados de inmunizaciones con VLP de HBcAg-#A79 en combinación con liposomas F12 vacíos, CFNIFA o adyuvados con ARN de Poli (A) formulado con F12 no pudieron ejercer una función efectora comparable. La función efectora citocida de los anticuerpos inducidos se correlacionó en gran medida con su cambio de MFI calculado.

En ratones, el isotipo IgG3 es el mejor activador del complemento seguido de IgG2a e IgG2b. Por lo tanto, los resultados del ensayo de los CDC indicaron que los adyuvantes de ARNis inducen un medio de citoquinas in vivo promoviendo el cambio de clase de inmunoglobulina y que los anticuerpos específicos de antígeno provocados son capaces de matar células positivas objetivo por CDC.

Ejemplo 14: La inmunización de ARNis formulado con F12 en combinación con VLP de HBcAg-#A79 dio como resultado una respuesta IgG2a/IgG1 específica de antígeno equilibrada.

Para una mejor comprensión de las propiedades adyuvantes de los ARNis identificados en combinación con el antígeno modelo de VLP de HBcAg-#A79, la determinación del cambio de isotipo de inmunoglobulina (Ig) puede proporcionar información sobre si la composición de la vacuna influye en el equilibrio entre el perfil Th1 o Th2 de una respuesta inmune. En el sistema del ratón, la presencia de niveles elevados de isotipos de IgG2a es indicativa de una respuesta inmune mediada por Th1, mientras que los niveles elevados de anticuerpos IgG1 son un sello distintivo de una respuesta inmune mediada por Th2.

Para el análisis de los niveles de isotipo de Ig, se usaron sueros de ratones inmunizados como se describe en el ejemplo 11 y se analizaron mediante ELISA las titulaciones de anticuerpos IgG1 o IgG2a que reaccionaban específicamente contra el péptido lineal #A79 (Fig. 14A y 14B). Se calcularon la mitad de los títulos de anticuerpos máximos y se representaron como la proporción de IgG2a frente a IgG1 (Fig. 14C). La inmunización con las VLP de HBcAg-#A79 sin adyuvante o las VLP combinadas con liposomas F12 vacíos dio como resultado títulos de anticuerpos IgG1 altos y IgG2a muy bajos, lo que se refiere a una respuesta inmune impulsada predominantemente por Th2. Por el contrario, los anticuerpos generados por inmunizaciones con VLP de HBcAg-#A79 adyuvadas con NP71-Seq45 formulado con F12 provocaron IgG1 moderadamente más altos y títulos de anticuerpos IgG2a específicos del péptido #A79 fuertemente mejorados, lo que resultó en una respuesta inmune Th1/Th2 equilibrada.

Ejemplo 15: La respuesta de anticuerpos específicos de antígeno inducida por ARNis formulado con F12 en combinación con VLP de HBcAg-#A79 depende principalmente de las pDC.

Los experimentos in vitro anteriores indicaron que los ARNis identificados ejercían su efecto inmunoestimulador principalmente mediante la activación de TLR endosomal en pDC, lo que resultaba en la secreción de altas cantidades de IFN-a (véase la Fig. 4 y Fig. 8).

Para confirmar estos resultados in vivo, los ratones BDAC₂-DTR tratados con toxina diftérica (DT) que resultó en el agotamiento de pDC y ratones C57BL/6 de tipo silvestre no tratados se inmunizaron iv tres veces a un intervalo de 14 días con 50 μg/inyección de VLP de HBcAg-#A79 combinado con 20 μg/inyección de ARNis de NP71-Seq45 formulado con F12. Los controles fueron ratones C57BL/6 de tipo silvestre inmunizados con las VLP de HBcAg-#A79 solas o en combinación con liposomas F12 vacíos y ratones BDAC₂-DTR tratados con DT solo pero que no recibieron el antígeno más el adyuvante ARNis. Se tomaron muestras de suero 4 h después de la primera inmunización para analizar la inducción de IFN-a por ELISA (Fig. 15A) y diez días después de la última inmunización para determinar las respuestas de anticuerpos específicos de antígeno inducidas por citometría de flujo utilizando células CHO-K1 de forma estable transfectadas con el TAA CLDN6 objetivo o su homólogo cercano CLDN9 (Fig. 14B). La ablación de pDC mediante el tratamiento con toxina diftérica redujo fuertemente los niveles séricos de IFN-a tras la administración iv de NP71-Seq45 formulado con F12 en combinación con las VLP de HBcAg-#A79. Los niveles detectables estaban en un intervalo similar al observado para los ratones BDAC₂-DTR tratados con DT solo. La inyección de las VLP de HBcAg-#A79 sin adyuvante o con adyuvante con liposomas F12 vacíos no dio como resultado niveles séricos detectables de IFN-a. El análisis de anticuerpos específicos de CLDN6 mediante citometría de flujo reveló que el agotamiento de pDC mediado por DT provocó una reducción muy significativa en la respuesta de anticuerpos específicos de antígeno tras la inmunización con ARNis de NP71-Seq45 formulado con F12 en combinación con las VLP de HBcAg-#A79 en comparación con C₆7BL/6 ratones de tipo silvestre. Sin embargo, la respuesta de anticuerpos observada en ratones BDAC₂-DTR seguía siendo ligeramente elevada en comparación con ratones C57BL/6 inmunizados con las VLP de HBcAg-#A79 sin adyuvante.

Los resultados indicaron que las pDC son los principales objetivos y productores de IFN-a tras la administración iv de ARNis formulados in vivo y estudios in vitro previos confirmados. Además, la falta de inducción de IFN-a condujo a una respuesta inmune humoral específica de antígeno fuertemente disminuida.

Ejemplo 16: La estimulación de ARNis formulado con F12 da como resultado una inducción sustancial de IFN-a y solo marginal de TNF-a in vivo.

Los datos anteriores in vitro que utilizaron células inmunes humanas o de ratón demostraron la capacidad de los ARNis identificados, en particular la secuencia NP71-Seq45, para inducir altos niveles de interferón tipo I (IFN-a) y solo niveles marginales de la citoquina TNF-a fuertemente proinflamatoria. Para investigar si los ARNis formulados pueden inducir un perfil de citoquinas similar in vivo, a los ratones Balb/c se les administró iv una vez ARNis de NP71-Seq45 formulado con F12. A continuación, se recogieron los sueros en diversos puntos temporales (4, 8 y 24 horas después de la inyección) y se analizaron los niveles de IFN-a o TNF-a en los sueros mediante kits ELISA disponibles en el mercado (Thermo Fischer). De acuerdo con los datos in vitro obtenidos anteriormente, se pudo demostrar claramente que la administración iv de ARNis de NP71-Seq45 formulado con F12 dio como resultado una secreción muy alta pero transitoria de IFN-a, mientras que los niveles de TNF-a permanecieron muy bajos (Fig. 16).

Las secuencias a las que se hace referencia en el presente documento son las siguientes:

SEQ ID NO: 1

aacuucugga gggguga

SEQ ID NO: 2

aacuucugga ggggugagaa u

SEQ ID NO: 3

uugcuu

SEQ ID NO: 4

aagaauugcu u

SEQ ID NO: 5

gggcgaacua guaacuucug gaggggugag aaucucga

SEQ ID NO: 6

aacuucugga ggggugauug cuu

SEQ ID NO: 7

gggcgaacua guaacuucug gaggggugau ugcuucucga

SEQ ID NO: 8

aacuucugga ggggugagaa uggacgaaaa acaagaauug cuu

SEQ ID NO: 9

gggcgaacua guaacuucug gaggggugag aauggacgaa aaacaagaau ugcuucucga SEQ ID NO: 10

aacuucugga ggggugagaa uaagaauugc uu

SEQ ID NO: 11

gggcgaacua guaacuucug gaggggugag aauaagaauu gcuucucga

SEQ ID NO: 12

ag caaaag ca ggguagauaa ucacucacug agugacauca aaaucauggc gucucaaggc accaaacgau cuuacgaaca gauggagacu gauggagaac gccagaaugc cacugaaauc agagcauccg ucggaaaaau gauuggugga auuggacgau ucuacaucca aaugugcacc g aacu caaac ucagugauua ugagggacgg uugauccaaa acagcuuaac aauagagaga auggugcucu cugcuuuuga cgaaaggaga aauaaauacc uugaagaaca ucccagugcg gggaaagauc cuaagaaaac uggaggaccu auauacagga gaguaaacgg aaaguggaug agagaacuca uccuuuauga caaag aag aa auaaggcgaa ucuggcgcca agcuaauaau ggugacgaug caacggcugg ucugacucac augaugaucu ggcauuccaa uuugaaugau gcaacuuauc agaggacíaag agcucuuguu cg caccggaa uggaucccag gaugugcucu cugaugcaag guucaacucu cccuaggagg ucuggagccg caggugcugc agucaaagga gtiuggaacaa uggugaugga auuggucaga augaucaaac gu.gggaucaa ugaucggaac uucuggaggg gugagaaugg acgaa aaac a agaauugcuu augaaagaau gugcaacauu cucaaaggga aauuucaaac ugcugcacaa aaagcaau ga uggaucaagu gagagagagc cggaacccag ggaaugcuga guucgaagau cucacuuuuc uagcacgguc ugcacucaua uugagagggu cgguugcuca caaguccugc cugccugccu guguguaugg accugccgua gccagugggu acgacuuuga aagggaggga uacucucuag ucggaauaga cccuuucaga cugcuucaaa acagccaagu guacagccua au cagaccaa augagaaucc ag cacacaag agucaacugg uguggauggc augccauucu gccgcauuug aagaucuaag aguauuaagc uucaucaaag ggacgaaggu gcucccaaga gggaagcuuu ccacuagagg aguucaaauu gcuuccaaug aaaauaugga gacuauggaa ucaaguacac uugaacugag aagcagguac ugggccauaa ggaccagaag uggaggaaac accaau caac agagggcaijc ugcgggccaa aucagcauac aaccuacguu cucaguacag agaaaucucc cuuuugacag aacaaccguu auggcagcau ucagugggaa uacagagggg agaacaucug acaugaggac cgaaaucaua aggaugaugg aaagugcaag accagaagau gugucuuucc aggggcgggg agucuucgag cucucggacg aaaaggcagc gagcccgauc gugccuuccu uugacaugag uaaugaagga ucuuauuucu u cggagacaa ugcagaggaa uacgauaauu aaagaaaaau acccuuguuu cuacu

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ARN inmunoestimuladora para usar en un método de terapia para estimular una respuesta inmune en un sujeto que comprende proporcionar al sujeto al menos un antígeno y proporcionar una molécula de ARN inmunoestimuladora, en donde la molécula inmunoestimuladora se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y 5 a 11 y en donde dicho ARN inmunoestimulador se formula en una formulación liposomal.

2. La molécula de ARN inmunoestimuladora para uso de la reivindicación 1, en donde la respuesta inmune comprende una respuesta de células B.

3. La molécula de ARN inmunoestimuladora para uso de la reivindicación 1 o 2, en donde la respuesta inmune comprende la producción de anticuerpos IgG asociados con una respuesta de tipo Th1.

4. La molécula de ARN inmunoestimuladora para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el al menos un antígeno se selecciona del grupo que consiste en antígenos de cáncer, virus, bacterias, hongos o parásitos.

5. La molécula de ARN inmunoestimuladora para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el sujeto es un mamífero, preferiblemente un ser humano.

6. La molécula de ARN inmunoestimuladora para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el antígeno es un antígeno tumoral, preferiblemente CLAUDIN-18.2 (CLDN18.2) o CLAUDIN-6 (CLDN6).

7. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de ARN inmunoestimuladora, al menos un antígeno y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde la molécula inmunoestimuladora se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y 5 a 11 y en donde dicho ARN inmunoestimulador se formula en una formulación liposomal.

8. La composición farmacéutica de la reivindicación 7, en donde al menos un antígeno se selecciona del grupo que consiste en antígenos de cáncer, virus, bacterias, hongos o parásitos.

9. La composición farmacéutica de la reivindicación 7 u 8, en donde el antígeno es un antígeno tumoral, preferiblemente CLAUDIN-18.2 (CLDN18.2) o CLAUDIN-6 (CLDN6).

10. Una molécula de ARN aislada que tiene actividad inmunoestimuladora, en donde dicha molécula de ARN se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y 5 a 11.