CN114733455B - 一种利用生物改性β-环糊精纳米磁颗粒进行快速哺乳动物精子分型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用生物改性β‑环糊精纳米磁颗粒进行快速哺乳动物精子分型的方法，通过该方法甚至可以在短时间内分离出大量的精子，并且可以防止分离的精子的运动性降低。所述纳米磁颗粒一方面可以作为生物大分子的载体，而且由于包被了TLR7/TLR8配体，其既有特异性识别X/Y精子的特性又有磁性的特点，因此，在从复杂样品中分离、纯化与浓集目的精子等方面具有较多优势，包括快速(5～20分钟)、特异性强、操作简便、使用范围广(几乎可用于所有样品的处理)等。可以克服常规微米级免疫磁颗粒的分离效率不高，颗粒间相互作用较强、分散性较差的缺点。

Description

一种利用生物改性β-环糊精纳米磁颗粒进行快速哺乳动物精 子分型的方法

技术领域

本发明涉及生物快速分离领域，具体涉及纳米磁颗粒快速分离技术，具体是一种阳离子聚电解质包覆磁性纳米复合颗粒快速分离哺乳动物X、Y精子的方法及其应用。

背景技术

用于家畜中的性别预选择的技术极大地有助于家畜的有效生产。 例如在养猪业中，雄性阉猪比母猪生长更快，并且在较短的育肥期中达到运输重量。猪生产中雄性后代数量的增加不仅将改善养猪业的管理，而且还将提高饲料的猪肉产量，从而导致全世界粮食产量的增加。然而，针对阉割的批评越来越多，而且目前仅一小部分牛养殖场主采用涉及性别特异性精细胞的人工授精方法作为产生具有期望性别的牲畜的手段。

现有技术中已经存在有用于包括家畜在内的哺乳动物中的性别预选择的技术，但是技术核心一般都停留在X和Y染色体之间的大小差异、细胞分选仪等技术，但所述方法并未较广泛地用于工业中，因为采用流式细胞术技术将精细胞分选成性别特异性精细胞的目前方法费用高且涉及授精之前精细胞的不可逆染色。而且使用细胞分选仪的方法具有花费时间来处理大量精子的问题。此外，由于荧光染色和暴露于特定波长的光，分离的精子具有降低的运动性，导致受精率差。基于精细胞质量、物理特征或含量鉴别和分离精细胞的费用较低且侵入性较弱的方法还没有相应的研究进展。

现有技术（JP2019010094A 20190124）中公开了一种用于分离哺乳动物精子的方法，通过该方法甚至可以在短时间内分离出大量的精子，并且可以防止分离的精子的运动性降低；以及人工授精方法和体外受精方法。用于分离哺乳动物精子的方法包括在含有TLR7配体的培养基中温育精子，并将它们分离成在培养基的上层中漂浮的精子和沉在下层中的精子。但是这种方法在实际应用中存在较大问题，主要体现在：1）效率低，不同动物精液量不同，精子浓度不同，精清黏度不同。尤其是在猪精子的分离过程中，由于猪精浓度高，而且粘稠度高，导致这种方法分离率较低，无法实现快速分离；2）损伤率高，由于所述方法采用的是离心的方法，离心力过高会造成精子机械性损伤，精子畸形率增高；3）分离率低，上述方法是理论上成立，但是由于在实际生产中，精子是活动，尤其是要保持其活力的前提下，需要保证精子的活力和动力，因此不可避免的会导致在xy临界处无法分离。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种纳米磁颗粒，所述纳米磁颗粒一方面可以作为生物大分子的载体，而且由于包被了TLR7/TLR8配体（如R848），其既有特异性识别X/Y精子的特性又有磁性的特点，因此，在从复杂样品中分离、纯化与浓集目的精子等方面具有较多优势，包括快速(5～20分钟)、特异性强、操作简便、 使用范围广(几乎可用于所有样品的处理)等。可以克服常规微米级免疫磁颗粒的分离效率不高，颗粒间相互作用较强、分散性较差的缺点。

进一步的，本发明提供上述纳米磁颗粒的制备方法，具体为：

(1)生物改性β-环糊精纳米磁颗粒的制备：

氨基修饰磁性纳米颗粒：称取FeCl₂·4H₂O加双蒸水溶解,在剧烈搅拌下加入氨水,搅拌加入3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）,高压蒸汽灭菌,收集黑色磁性溶液。反应产物离心去除大颗粒后,留取上清液,再次离心收集黑色沉淀,用双蒸水洗涤将磁性颗粒分散在双蒸水中,-20℃保存,备用。

制备PEG6000双羰基咪唑偶联试剂： PEG6000溶解在环氧乙烷中,加热后加入固体N,N-羰基二咪唑（CDI）反应2h。加入乙醚沉淀反应产物,至无沉淀产生为止,放置过夜。吸取上清液后,抽滤,所得沉淀用丙酮溶解后,加入乙醚重新沉淀,所得沉淀用乙醚洗涤2-3次,旋蒸,4℃保存,备用。

称取羟丙基-β-环糊精加水溶解,加入PEG6000双羰基咪唑偶联试剂,加入氨基修饰磁性纳米颗粒分散液和双蒸水,反应结束后,应用Nd-Fe-B强磁铁,吸附分离生物改性β-环糊精纳米磁颗粒,采用双蒸水反复洗涤磁性颗粒3遍后,将磁颗粒重新分散在双蒸水中,即得生物改性β-环糊精纳米磁颗粒磁分散液,-20℃保存,备用。

（2）TLR7/TLR8配体包被的纳米磁颗粒的制备

取生物改性β-环糊精纳米磁颗粒磁分散液,加入TLR7/TLR8配体溶液,加入双蒸水反应24小时,反应完成后,磁颗粒强磁分离,水洗3次,最后分散在双蒸水中。采用各种分析测定仪器,对TLR7/TLR8配体包被的纳米磁颗粒的各种物理化学性质以及磁学性能进行表征。

其中，TLR7/TLR8配体选自咪唑喹啉类分子CL097、R848，Thiazoloquinolone类分子CL075(3M002)等一种或者多种。

进一步的，本发明提供一种利用上述纳米磁颗粒进行哺乳动物精子分型的方法，所述方法为：

选取检测合格的新鲜哺乳动物精液加入PBS中，轻轻混匀后，慢速室温离心；

去上清，加入吸附液，震荡混匀后加入适量上述TLR7/TLR8配体包被的纳米磁颗粒悬液，混匀后，在室温避光孵育；

孵育结束后，将上述离心管置于磁分离架上吸附，吸弃液体；加入洗涤液洗涤、磁分离架吸附、吸弃液体，重复两次；

向上述的离心管内加入洗脱液，震荡，65℃放置5分钟后再次置于磁分离架上吸附5分钟，回收洗脱液于另一离心管，洗脱液内得到分离的精子。

其中，吸附液为0.01mol/L PBS，0.5%BSA，pH7.2

所述洗脱液为包含柠檬酸钠：0.1～0.5克，蔗糖：1～2克，维生素C：200毫克～400毫克，维生素B12：100毫克～200毫克的TE溶液，所述TE溶液的pH为8.0，溶剂是水，溶质是10mM的Tris-HCl，1mM的EDTA。

优选的，洗脱液为包含柠檬酸钠：0.15克，蔗糖：1.8克，维生素C：260毫克，维生素B12：150毫克的TE溶液，所述TE溶液的pH为8.0，溶剂是水，溶质是10mM的Tris-HCl，1mM的EDTA。

所述洗脱液中的Tris-HCl的浓度优选10mM、EDTA优选是1mM，所述洗脱液pH优选为8.0。在除去与固相载体结合的蛋白质、磷脂等污染物后，必须将与固相载体结合的DNA洗脱至水相溶液中才能应用于后续分析。DNA-磁性微球复合体与洗脱液接触后，可以使DNA与固相载体分离。洗脱液可以是低离子强度的水相溶液，也可以是无离子水或是一定PH的低离子强度的水溶液。洗脱液PH值必须能够保证DNA稳定性、完整性。可以是低浓度TE(10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)洗脱与固相载体结合的DNA。

有益效果

与现有技术中各种对X精子和Y精子的分离方法相比，本申请的技术优势主要体现在：

分离过程中的作用因素多样，包括磁性、电荷、重力等多重作用，可以有助于后续分离手段的选择和叠加，可以快速、高效的进行精液的分离。本发明制备出的纳米磁颗粒，通过选择羟丙基-β-环糊精实行预修饰，得到的颗粒表面带正电并能均匀稳定地分散在水中，形成磁颗粒的水基分散液。此分散液与带负电荷的精液溶液混合，即可实现磁性纳米颗粒与精液之间的均匀稳定包覆。一方面得到了稳定、均匀的磁颗粒水基分散液，另一方面使得磁粒子与精液稳定结合，制备出的产品分散均匀、稳定，具有广泛的应用价值。同时，利用X Y精子本身所带电荷不同(其中X为-20mv,Y为-16mv)，不同类型的精子与纳米材料电荷相近、接触后可形成复合体，在磁力作用下X精子-纳米材料复合体与试管壁粘附，而Y染色体由于没有形成复合体，而且电荷吸引力较弱而会悬浮于分离稀释液体中的原理对精子进行分离，然后将分离精子进行快速的分离。

根据本公开的用于分离哺乳动物精子的方法可以在短时间内分离大量精子，同时防止分离的精子的运动性降低。因为现有技术中的分离方法多采用离心的方式，会导致上浮方法不足而从产生诸如：效率低，不同动物精液量不同，精子浓度不同，精清黏度不同；损伤率高，离心力过高会造成精子机械性损伤，精子畸形率增高；分离率低，精子是活动，在xy临界处无法分离的缺陷。而本申请所采用的方法由于采用了配体、磁力、电荷多重叠加作用而具有分离率高：根据精子浓度添加磁颗粒复合物，有效分离；效率高：分离时间短，临界点小；损伤小：分离条件温和，机械损伤小，畸形率低的特点，可以广泛应用在实际生产中。

附图说明

图1为利用本申请的方法进行精子分离前后的显微图片和数据分析，其中a为分离前的显微图片，b为分离后的显微图片；

图2纳米颗粒-配体的电镜图片，其中a、b为对比例中的纳米颗粒-配体，c、d为本申请方法中的纳米磁颗粒-配体电镜图片，其中比例尺为100nm；

图3 待检测样本中的X精子和Y精子的平均值Ct(i)与标准曲线比对，其中a为PLP基因real-time PCR检测结果，b为SRY基因的real-time PCR检测检测结果。

具体实施方式

实施例1 纳米磁颗粒的制备方法

(1)生物改性β-环糊精纳米磁颗粒的制备：

氨基修饰磁性纳米颗粒：准确称取FeCl₂·4H₂O(1.25g),加7.75mL双蒸水溶解,在剧烈搅拌下加入6.25mL氨水,继续搅拌10分钟,接着加入2.5mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）,于134℃温度下,高压蒸汽灭菌3小时,收集黑色磁性溶液。反应产物1000转离心1分钟,去除大颗粒后,留取上清液,6000转离心5分钟,收集黑色沉淀,双蒸水洗3次,无水乙醇洗两次(去除溶液中未反应完全的APTES)后,再用双蒸水洗涤沉淀2次,最后将磁性颗粒分散在5mL双蒸水中,-20℃保存,备用。

制备PEG6000双羰基咪唑偶联试剂：50g PEG6000溶解在200ml环氧乙烷中,加热至37℃,反应体系中加入固体N,N-羰基二咪唑（CDI） (16.2g), 37℃保温反应2h。加入3-4倍体积的乙醚沉淀反应产物,至无沉淀产生为止,放置过夜。吸取上清液后,抽滤,所得沉淀用丙酮溶解后,加入乙醚重新沉淀,所得沉淀用乙醚洗涤2-3次,旋蒸,4℃保存,备用。

准确称取羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD，取代度0.94,Mw=1516g/mol，购自西安宏昌药业责任有限公司）144mg,加6.0mL水溶解,准确加入定量的PEG6000双羰基咪唑偶联试剂(375mg)后,加入氨基修饰磁性纳米颗粒分散液(4.8mL,25.92mg/mL),加入11.2mL双蒸水,25℃恒温反应24小时。反应结束后,应用Nd-Fe-B强磁铁,吸附分离生物改性β-环糊精纳米磁颗粒,采用双蒸水反复洗涤磁性颗粒3遍后,将磁颗粒重新分散在llmL双蒸水中,即得生物改性β-环糊精纳米磁颗粒磁分散液,-20℃保存,备用。

（2）TLR7/TLR8配体包被的纳米磁颗粒的制备

取生物改性β-环糊精纳米磁颗粒磁分散液(2.5mL,11.57mg/mL),加入R848（0.375mL, 10mg/mL),加入9.625mL双蒸水,25℃恒温反应24小时,反应完成后,磁颗粒强磁分离,水洗3次,最后分散在3.5mL双蒸水中。采用各种分析测定仪器,对TLR7/TLR8配体包被的纳米磁颗粒的各种物理化学性质以及磁学性能进行表征。

实施例2 利用生物改性β-环糊精纳米磁颗粒进行精子的分型分离

选取检测合格的新鲜猪精作为实验样本并用密度仪检测原精实际浓度，取1亿鲜精加入5ml0.1％PBS中，轻轻混匀后，1500rpm，室温离心7min；

去上清，加入300μL0.01mol/L PBS，0.5%BSA，pH7.2的吸附液，震荡混匀后加入适量实施例1制备的TLR7/TLR8配体包被的纳米磁颗粒悬液（3-5μl），混匀后，在室温避光孵育30min；

孵育结束后，将上述离心管置于磁分离架上吸附5分钟，吸弃液体（留取部分进行后续实验）；加入300μL0.01mol/L PBS,0.5%BSA,2mM EDTA,pH7.2的洗涤液洗涤、磁分离架吸附、吸弃液体，重复两次；

向上述的离心管内加入300μL洗脱液（柠檬酸钠：0.15克，蔗糖：1.8克，维生素C：260毫克，维生素B12：150毫克的TE溶液，pH为8.0），震荡，65℃放置5分钟后再次置于磁分离架上吸附5分钟，回收洗脱液于另一离心管，洗脱液内得到分离的精子。

测定上述分型分离在A级精子百分率、B级精子百分率、顶体完整率、平均路径速度（VAP）、平均移动角度(MAD)、曲线运动速度(VCL)、直线性(LIN)、摆动性(WOB),侧摆幅度(ALH)，直线运动速度(VSL)进行比较。A级精子百分率、B级精子百分率、顶体完整率、平均路径速度（VAP）、平均移动角度(MAD)、曲线运动速度(VCL)、直线性(LIN)、摆动性(WOB)、侧摆幅度（ALH），采用精子自动分析仪进行自动分析。

顶体完整率及检测方法如下：

（1）精液解冻后立即在35℃～37℃的温度下进行活率检查。评定时，用玻璃棒蘸取1滴精液，滴于载玻片上，加上盖玻片，使盖玻片和载玻片之间充满精液，然后置于400倍～600倍显微镜下观察。在显微镜视野中，通过对精液上、中、下三层液面精子活动情况综合观察，评定精子活率。

（2）取一滴解冻后的精液滴在干净的载玻片上，用另一载玻片呈45度，将精液抹向另一侧，制成抹片。自然风干后用1～2毫升福尔马林磷酸盐缓冲液固定15分钟，水洗干燥后用姬姆萨染色90分钟，然后除去抹片上的染液，风干后置于1000倍生物显微镜下观察500个精子，记录精子总数和顶体完整精子数，最后得到顶体完整率。

图1为利用上述方法进行精子分离前后的数据，从中可以发现，本申请的方法对精子的损伤几乎可以忽略不计，在精子密度、活率、活力等各个方面都没有产生影响。

为了检测精液分离的效果，对分离出的X精子和磁分离步骤后舍弃的上清液（将精液DNA浓度调整到180-220ng/μL之间）分别进行PLP基因和SRY基因的real-time PCR检测，并将X精子和Y精子分别得到的Ct值均作为变量因素与X精子和Y精子浓度比制备标准曲线，然后将待检测样本中的X精子和Y精子的平均值Ct(i)与标准曲线比对（图3），得到待检测样本中X精子和Y精子的浓度比，从而得到待检测样本的纯度。

所述PLP基因引物对的序列如下：

PLP-F：5’-TCGTCGTGTGCTTCACC-3’(SEQ ID NO.1)；

PLP-R：5’-CGGCACATATGTGTTAGC-3’(SEQ ID NO.2)；

所述SRY基因引物对的序列如下：

SRY-F：5’-CCCAGAGAAATGCCTTGC-3’(SEQ ID NO.3)；

SRY-R：5’-CGGTGTACCCAATCATACGTT-3’(SEQ ID NO.4)。

将装引物的离心管12 000r离心3min，轻轻打开盖，按照说明加入适当量的无菌超纯水，涡旋混匀，PCR扩增体系： 2×Premix Ex Taq 12.5μL，上游引物终浓度为0.1μM,下游引物终浓度为0.2μM，待检样品加入量为25-100ng，补充ddH₂O至25μL体系。其中，2×PremixEx Taq为Takara公司产品，货号为RR390A。

PCR反应程序：95℃预变性3min，94℃变性10s，63℃退火20s，70℃延伸20s，35个循环，70℃延伸10min，4℃保存。

对其结果分析如表1所示，从表中可以看出，利用本申请所述的方法可以快速有效的分离其中的X精子和Y精子，技术人员可以根据需要对其中的精子进行选择，根据具体的目的和要求选择保留其中的X精子或者Y精子进行下一步的研究和应用。

表1分离上清液和洗脱液中X精子和Y精子的分布情况

	X精子（%）	Y精子（%）
			分离上清液	8.2	91.4
洗脱液	92.3	7.6

对比例利用离心方式分离含有TLR7配体的培养基中的温育精子

对比实验采用现有技术（JP2019010094A 20190124）中的方法，简而言之，于37℃，5％CO2下在通过将TLR7配体添加到胚胎培养基(HTF)中制备的培养基(500μL)中将猪精子温育。所使用的TLR7配体是瑞喹莫德R-848(以下称为R-848)。R-848的含量为0.3μM。3h或6h后，使用离心机(产品名称：Tabletop Micro RefrigeratedCentrifuge3520型，由KUBOTACorporation Co.,Ltd.生产)在37℃将培养基300g离心30分钟，离心后，收集150μL每种培养基的上层(上层的30％)、下层(下层的30％)进行相应的检测。

测定上述分型分离与对比例分离的精子在A级精子百分率、B级精子百分率、顶体完整率、平均路径速度、平均移动角度、曲线运动速度、直线性、摆动性测摆幅度，直线运动速度进行比较。A级精子百分率、B级精子百分率、顶体完整率、平均路径速度、平均移动角度、曲线运动速度、直线性、摆动性测摆幅度，直线运动速度采用精子自动分析仪进行自动分析（表2）。

表2 本申请分离方法与对比例分离的精子的特性数据表

MAD

VCL

VSL

LIN

STR

VAP

ALH

分离前

0.34±0.02

90.15±4.78

49.17±2.69

0.55±0.02

0.72±0.03

70.40±4.27

8.97±0.45

分离后

0.35±0.02

88.17±3.58

48.38±2.76

0.55±0.03

0.68±0.04

68.09±5.05

8.76±0.51

Control

0.29±0.01

70.28±5.47

30.29±2.01

0.42±0.03

0.52±0.02

40.37±2.06

8.16±0.47

	WOB	活率	活力	顶体完整率	畸形率
						分离前	0.78±0.03	88.21±5.01	78.35±3.47	75.39±3.35	5.02±1.07
分离后	0.72±0.05	89.32±4.75	75.21±4.21	72.73±2.76	6.03±2.05
						control	0.66±0.04	70.68±5.06	60.27±3.29	62.28±2.04	10.67±2.53

从电镜图（图2）和上述表格数据中可以发现，利用对比例中单一的配体方式进行精子分离，效果并不明显，在初期的分离过程中可以明显看出，TLR7配体是零散的分布在精液当中，并没有出现“携带X染色体的精子的活性并使其沉到培养基的下层，然后分离出在上层中漂浮的携带Y染色体的精子”的聚集现象，携带X染色体的精子和携带Y染色体的精子并没有出现明显的分离（其中a为对比例中孵育3h后的结果，b为孵育6h后的结果），而利用本申请所述的方法可以看出，在配体-纳米磁颗粒的磁性、电荷、重力多重作用下，携带X染色体的精子和携带Y染色体的精子出现明显的分离，而且目标精子出现了极其明显的聚集现象，这种现象的出现会极大的方便后续的分离步骤，只需要简单的分离即可以实现分离XY精子的实验目的，不再需要高强度和长时间的离心等分离手段，可以进一步的避免对精子的损伤，保证精子的活力。而且在此过程中并不需要如对比例孵育太长时间，只需要进行孵育30min即可实现精子的快速分离，一方面可以极大的提升分离效率，另一方面在缩短时间的同时可以保证减少精子的损伤，保证精子的活力。

前述内容出于解释目的描述了一些示例性实施方案。尽管前面的讨论已经给出了具体的实施方案，但是本领域技术人员将认识到，可以在形式和细节上做出改变，而不脱离本发明的更广泛的精神和范围。因此，说明书和附图应当以说明性的而不是限制性的意义考虑。因此，该详细描述不应以限制性意义理解，并且本发明的范围仅由所包括的权利要求书以及这些权利要求书所享有的等同方案的全部范围来限定。

〈110〉 北京田园奥瑞生物科技有限公司

<120>一种利用生物改性β-环糊精纳米磁颗粒进行快速哺乳动物精子分型的方法

<160>4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211>17

<212> DNA

<213>PLP-F

TCGTC GTGTG CTTCA CC

<210> 2

<211>18

<212> DNA

<213>PLP-R

CGGCA CATAT GTGTT AGC

<210> 3

<211>18

<212> DNA

<213>SRY-F

CCCAG AGAAA TGCCT TGC

<210> 4

<211>20

<212> DNA

<213>SRY-R

CGGTG TACCC AATCA TACGTT

Claims (4)

1.一种无损快速的利用生物改性β-环糊精纳米磁颗粒进行哺乳动物精子分型方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

生物改性β-环糊精纳米磁颗粒的制备：

氨基修饰磁性纳米颗粒：称取FeCl₂·4H₂O加双蒸水溶解,在剧烈搅拌下加入氨水,搅拌加入3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES,高压蒸汽灭菌,收集黑色磁性溶液；

反应产物离心去除大颗粒后,留取上清液,再次离心收集黑色沉淀,用双蒸水洗涤将磁性颗粒分散在双蒸水中,-20℃保存,备用；

制备PEG6000双羰基咪唑偶联试剂： PEG6000溶解在环氧乙烷中,加热后加入固体N,N-羰基二咪唑CDI反应2h；

加入乙醚沉淀反应产物,至无沉淀产生为止,放置过夜；

吸取上清液后,抽滤,所得沉淀用丙酮溶解后,加入乙醚重新沉淀,所得沉淀用乙醚洗涤2-3次,旋蒸,4℃保存,备用；

称取羟丙基-β-环糊精加水溶解,加入PEG6000双羰基咪唑偶联试剂,加入氨基修饰磁性纳米颗粒分散液和双蒸水,反应结束后,应用Nd-Fe-B强磁铁,吸附分离生物改性β-环糊精纳米磁颗粒,采用双蒸水反复洗涤磁性颗粒3遍后,将磁颗粒重新分散在双蒸水中,即得生物改性β-环糊精纳米磁颗粒磁分散液,-20℃保存,备用；

（2）TLR7/TLR8配体包被的纳米磁颗粒的制备

取生物改性β-环糊精纳米磁颗粒磁分散液,加入TLR7/TLR8配体溶液,加入双蒸水反应24小时,反应完成后,磁颗粒强磁分离,水洗3次,最后分散在双蒸水中；

采用各种分析测定仪器,对TLR7/TLR8配体包被的纳米磁颗粒的各种物理化学性质以及磁学性能进行表征；

（3）精子分型

选取检测合格的新鲜哺乳动物精液加入PBS中，轻轻混匀后，慢速室温离心；

去上清，加入吸附液，震荡混匀后加入适量上述TLR7/TLR8配体包被的纳米磁颗粒悬液，混匀后，在室温避光孵育；

孵育结束后，将离心管置于磁分离架上吸附，吸弃液体；加入洗涤液洗涤、磁分离架吸附、吸弃液体，重复两次；

向离心管内加入洗脱液，震荡，65℃放置5分钟后再次置于磁分离架上吸附5分钟，回收洗脱液于另一离心管，洗脱液内得到分离的精子。

2.如权利要求1所述的方法，其中TLR7/TLR8配体选自咪唑喹啉类分子CL097、R848，Thiazoloquinolone类分子CL075中的一种或者多种。

3. 如权利要求2所述的方法，其中吸附液为0.01mol/L PBS，0.5%BSA，pH7.2；

所述洗脱液为包含柠檬酸钠：0.1～0.5克，蔗糖：1～2克，维生素C：200毫克～400毫克，维生素B12：100毫克～200毫克的TE溶液，所述TE溶液的pH为8.0，溶剂是水，溶质是10mM的Tris-HCl，1mM的EDTA。

4.如权利要求3所述的方法，其中洗脱液为包含柠檬酸钠：0.15克，蔗糖：1.8克，维生素C：260毫克，维生素B12：150毫克的TE溶液，所述TE溶液的pH为8.0，溶剂是水，溶质是10mM的Tris-HCl，1mM的EDTA。

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