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ES2950435T3 - Composiciones y métodos para mejorar el crecimiento, la propagación y la eficacia oncolítica e inmunoterapéutica de virus oncolíticos de ARN - Google Patents

Composiciones y métodos para mejorar el crecimiento, la propagación y la eficacia oncolítica e inmunoterapéutica de virus oncolíticos de ARN Download PDF

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ES2950435T3
ES2950435T3 ES17857734T ES17857734T ES2950435T3 ES 2950435 T3 ES2950435 T3 ES 2950435T3 ES 17857734 T ES17857734 T ES 17857734T ES 17857734 T ES17857734 T ES 17857734T ES 2950435 T3 ES2950435 T3 ES 2950435T3
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cancer
virus
cell
vanadium
tumor
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English (en)
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Mohammed Selman
Jean-Simon Diallo
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Ottawa Health Research Institute
Original Assignee
Ottawa Health Research Institute
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Abstract

En el presente documento se proporcionan métodos para mejorar la infección, el crecimiento, la propagación o el título de un virus de ARN oncolítico en una célula cancerosa o tumoral; potenciar la actividad oncolítica, la actividad de muerte celular inducida por citoquinas y/o la actividad citotóxica de un virus de ARN oncolítico en una célula cancerosa o tumoral; regular positivamente la respuesta de citoquinas y/o mejorar la actividad inmunoterapéutica de un virus de ARN oncolítico en una célula cancerosa o tumoral; y/o tratar un tumor o cáncer en un sujeto que lo necesita. Dichos métodos emplean un compuesto que contiene vanadio, administrado a las células cancerosas o tumorales antes, después o al mismo tiempo que la infección de las células cancerosas o tumorales con el virus de ARN oncolítico. También se proporcionan composiciones, usos y kits relacionados para los mismos. También se proporcionan métodos para producir virus de ARN, vacunas contra el cáncer basadas en virus de ARN y vectores de terapia génica contra el cáncer basados en virus de ARN. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para mejorar el crecimiento, la propagación y la eficacia oncolítica e inmunoterapéutica de virus oncolíticos de ARN
Campo de la invención
La presente invención se refiere a compuestos, métodos y composiciones para mejorar la actividad del virus oncolítico de ARN en células cancerosas o tumorales.
Antecedentes
Los virus genéticamente atenuados forman la base de un número creciente de plataformas biotecnológicas y farmacéuticas. La viroterapia oncolítica, emergente en el campo de la terapia contra el cáncer, ha demostrado ser prometedora en la última década. En la actualidad se están evaluando en ensayos clínicos varios virus oncolíticos (OV) basados en una amplia gama de esqueletos virales, desde pequeños virus de ARN (por ejemplo, rabdovirus) hasta grandes virus de ADN (por ejemplo, poxvirus, herpesvirus), para tratar diversos tipos de cáncer. En 2015, la FDA aprobó el primer OV de su clase basado en el virus del herpes simple 1 (HSV-1) para el tratamiento del melanoma, lo que generó un gran interés por esta forma de terapia contra el cáncer.
Los virus oncolíticos (OV) son, normalmente, agentes bioterapéuticos autoamplificadores que se han seleccionado o genomanipulado para infectar y destruir preferentemente células cancerosas. Cuando son eficaces, los OV producen la erradicación del tumor no sólo por la lisis directa de las células cancerosas, sino también a través de la generación aguas abajo de respuestas inmunitarias contra el cáncer, el cierre vascular y la expresión de transgenes terapéuticos. Como base de su selectividad, los OV sacan partido de los defectos celulares que son inherentes al fenotipo canceroso. Esto incluye respuestas antivirales disfuncionales y evasión inmunitaria, aumento de la proliferación celular y del metabolismo, y vasculatura tumoral permeable. El entorno biológico resultante de la tumorigénesis es idóneo para favorecer el crecimiento de OV genéticamente atenuados que, de otro modo, son inofensivos para las células normales.
Los OV se perfilan como una atractiva modalidad terapéutica contra el cáncer por su potencial curativo y sus efectos secundarios relativamente leves, que equivalen a síntomas agudos similares a los de la gripe. Sin embargo, la heterogeneidad de la respuesta clínica a los OV sigue siendo un obstáculo importante que hay que superar, como se ha demostrado en varios ensayos clínicos en humanos. Esta heterogeneidad en la respuesta puede atribuirse a factores que impiden la administración eficaz del OV y su propagación dentro de los tumores.
Aunque los virus oncolíticos pueden funcionar como agentes únicos, y de hecho lo hacen, numerosos estudios han demostrado que la oncolisis viral, la propagación y la eficacia general mejoran usando compuestos farmacológicos que manipulan la respuesta inmunitaria antiviral innata celular [2-4]. Más allá de los efectos oncolíticos sobre las células tumorales, los OV también pueden reforzar la inmunidad antitumoral dirigiendo las respuestas inmunitarias hacia el tumor [5-8]. Este efecto inmunoestimulador puede mejorarse aún más integrando genes inmunoestimuladores en el genoma viral [7-10], como el T-VEC, un OV basado en el virus del herpes simple tipo 1 aprobado recientemente para el tratamiento del melanoma por la Administración de Alimentos y Fármacos (FDA) de los Estados Unidos [11-13]. La combinación de OV y otras formas de inmunoterapia ha surgido como un enfoque prometedor en pacientes humanos [6-8].
El vanadato es un inhibidor de las proteínas tirosina fosfatasas (PTPs) [14, 15], con una amplia gama de efectos en varios sistemas biológicos [16-20]. Curiosamente, numerosos estudios sugieren que el vanadato tiene efectos importantes sobre el sistema inmunitario [21-23]. Ejerce una acción estimuladora sobre las células mononucleares de sangre periférica y las células T [22, 24], mejora la señalización de Ca2+ en los linfocitos T [25], provoca la activación espontánea de las células T y la secreción de interleucina-2 [26].
Los compuestos a base de vanadato y vanadio se han propuesto para el tratamiento de varios tipos de enfermedades. Cada vez se estudian con más detenimiento por su potencial antidiabético, para el que han sido evaluados en diversos ensayos clínicos [27-29]. En los últimos años, se ha descubierto que varios compuestos a base de vanadio presentan efectos anticancerígenos, basados en su aparente capacidad para inhibir la proliferación celular, alterar el metabolismo celular y modificar los orgánulos o las proteínas fusiformes [30-33].
Si bien los compuestos de vanadato se han estudiado ampliamente por sus efectos miméticos de la insulina y se usan habitualmente como inhibidores generales de las proteínas tirosina fosfatasas, no se ha estudiado con detenimiento su modulación de la inmunidad contra el cáncer. Además, se sabe poco sobre el efecto del vanadato en la infección vírica, y lo que se ha publicado sugiere que sus efectos pueden depender del virus. Por ejemplo, se ha sugerido que el vanadato puede promover la liberación de HSV-1 latente [34], y promover la fusión celular inducida por virus de NDV (virus de la enfermedad de Newcastle) [35]. Por el contrario, se observó que el vanadato limitaba la fusión de células infectadas por el virus paramixovirus parainfluenza SV5 [36]. Por lo tanto, el impacto del vanadato en la infección vírica sigue sin estar claro y no se ha estudiado en absoluto en muchos virus.
Los compuestos y composiciones que mejoran el crecimiento, la propagación y/o la citotoxicidad de los virus son deseados en este campo. También se desean en este campo compuestos y composiciones que mejoren las respuestas inmunitarias antitumorales inducidas por la viroterapia y/o que aumenten la eficacia anticancerosa. También se desean métodos mejorados o alternativos para tratar células cancerosas in vitro e in vivo.
Resumen de la invención
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. En ciertas realizaciones, la presente invención se refiere a compuestos y composiciones para su uso en métodos que pueden mejorar la infección, el crecimiento, el título o la propagación de virus de ARN y/o potenciar la actividad oncolítica y/o inmunoterapéutica de virus oncolíticos de ARN. Los resultados descritos en el presente documento demuestran unos efectos de los compuestos que contienen vanadio, como el vanadato, que no se habían notificado anteriormente. En determinadas realizaciones, se ha demostrado que los compuestos que contienen vanadio mejoran el crecimiento y/o la propagación de los virus de ARN de replicación y aumentan la actividad anticancerígena de los virus oncolíticos de ARN, probablemente mediante el aumento de la destrucción inespecífica inducida por citocinas de las células cancerosas y/o la estimulación de la inmunidad adaptativa anticancerosa in vivo.
En una realización, se proporciona en el presente documento un compuesto que contiene vanadio para su uso en un método terapéutico para mejorar la infección, el crecimiento, la propagación o el título de un virus oncolítico de ARN en una célula cancerosa o tumoral.
En otra realización más, se proporciona en el presente documento un compuesto que contiene vanadio para su uso en un método terapéutico para mejorar la actividad oncolítica, la actividad de muerte celular inducida por citocinas y/o la actividad citotóxica de un virus oncolítico de ARN en una célula cancerosa o tumoral.
En aún otra realización, se proporciona en el presente documento un compuesto que contiene vanadio para su uso en un método terapéutico para potenciar una respuesta inmunitaria a, regular al alza una respuesta de citocinas a y/o mejorar la actividad inmunoterapéutica de un virus oncolítico de ARN en una célula cancerosa o tumoral.
En otra realización, se proporciona en el presente documento un compuesto que contiene vanadio para su uso en combinación con un virus oncolítico de ARN en un método terapéutico para tratar un tumor o cáncer en un sujeto que lo necesite, en donde dicho compuesto que contiene vanadio está destinado a la administración al sujeto antes, después o simultáneamente con el virus oncolítico de ARN.
En otra realización, se proporciona en el presente documento una composición que comprende un compuesto que contiene vanadio y un virus oncolítico de ARN.
En otra realización, no reivindicada, se proporciona en el presente documento un kit que comprende un virus oncolítico de ARN y un compuesto que contiene vanadio.
En otra realización de cualquiera de los métodos o usos anteriores, el compuesto que contiene vanadio comprende ortovanadato, metavanadato, oxitrietóxido (VOx) de vanadio (V), sulfato de óxido (VS) de vanadio (IV) y bismaltolato de oxovanadio (IV) (BMOV), tetrafluoruro de vanadio y tribromuro de vanadio, o una sal, solvato, hidrato, forma reducida u oxidada farmacéuticamente aceptable de los mismos.
En otra realización de cualquiera de los métodos o usos anteriores, el virus oncolítico de ARN puede comprender un reovirus, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la polio, virus de las paperas, virus del sarampión, virus de la gripe, virus Maraba (como MG-1), virus de la rabia, rotavirus, virus de la hepatitis A, virus de la rubéola, virus del dengue, virus de Chikungunya, virus respiratorio sincitial, LCMV, lentivirus, retrovirus de replicación o rabdovirus, o una variante o derivado de los mismos.
En otra realización de cualquiera de los métodos o usos anteriores, el virus de ARN puede comprender un rabdovirus que es el virus de la estomatitis vesicular o un derivado o variante del mismo.
En otra realización de cualquiera de los métodos o usos anteriores, el virus de ARN puede comprender un virus seleccionado en condiciones de crecimiento específicas, sometido a una o más presiones de selección, modificado genéticamente mediante una técnica recombinante, o cualquier combinación de los mismos.
En otra realización de cualquiera de los métodos o usos anteriores, la célula o sujeto puede ser mamífero.
En otra realización más de cualquiera de los métodos o usos anteriores, la célula o sujeto puede ser humano.
En aún otra realización de cualquiera de los métodos o usos anteriores, el cáncer o tumor puede comprender leucemia linfoblástica, leucemia mieloide, carcinoma corticosuprarrenal, cánceres relacionados con el SIDA, linfoma relacionado con el SIDA, cáncer anal, cáncer de apéndice, astrocitoma, tumor teratoide/rabdoide atípico, carcinoma basocelular, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer óseo, osteosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, glioma de tronco cerebral, tumor cerebral, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral/glioma maligno, craneofaringioma, ependimoblastoma, meduloblastoma, tumores del parénquima pineal de diferenciación intermedia, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales y pineoblastoma, glioma hipotalámico y de las vías visuales, tumores de la médula espinal, cáncer de mama, tumores bronquiales, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, linfoma del sistema nervioso central, cáncer de cuello de útero, cordoma, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, linfoma cutáneo de células T, tumores embrionarios, cáncer de endometrio, ependimoblastoma, ependimoma, cáncer de esófago, tumor de células germinales extracraneal, tumor de células germinales extragonadal, cáncer de vías biliares extrahepático, cáncer ocular, melanoma intraocular, retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (de estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), tumor de células del estroma gastrointestinal, tumores de células germinales, tumor trofoblástico gestacional, ovárico, extracraneal, extragonadal, glioma, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular (de hígado), histiocitosis, cáncer de células de Langerhans, linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, tumores de células de los islotes, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de laringe, leucemia linfocítica, leucemia de células pilosas, cáncer de labio y de la cavidad bucal, cáncer de hígado, cáncer pulmonar no microcítico, cáncer pulmonar microcítico, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, histiocitoma fibroso maligno óseo y osteosarcoma, meduloblastoma, meduloepitelioma, melanoma, melanoma intraocular, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, cáncer de cuello escamoso metastásico, cáncer de boca, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas, cáncer de la cavidad nasal y de senos paranasales, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer paratiroideo, cáncer de pene, cáncer faríngeo, feocromocitoma, tumores del parénquima pineal, pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, tumor hipofisario, neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, linfoma primario del sistema nervioso central, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer de células renales (de riñón), cáncer de pelvis renal y de uréter, cáncer de células de transición, carcinoma de las vías respiratorias, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, sarcoma uterino, cáncer de piel, carcinoma cutáneo de células de Merkel, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de células escamosas, cáncer escamoso de cuello, cáncer de estómago (gástrico), tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, linfoma de células T, cáncer testicular, cáncer de garganta, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, tumor trofoblástico, cáncer de uretra, cáncer de útero, cáncer de endometrio, sarcoma uterino, cáncer vaginal, cáncer de vulva o tumor de Wilms.
En otra realización más, no reivindicada, se proporciona en el presente documento un método para producir un virus de ARN que comprende:
cultivar una célula cancerosa o tumoral infectada por el virus de ARN en un medio apropiado en presencia de un compuesto que contiene vanadio; y
producir el virus de ARN a partir de la célula cancerosa o tumoral mediante replicación viral.
En otra realización del método anterior, no reivindicada, el virus de ARN puede ser un virus de ARN atenuado, un virus de ARN genéticamente modificado o un virus oncolítico de ARN.
En otra realización más, no reivindicada, se proporciona en el presente documento un método para producir una vacuna contra el cáncer basada en virus de ARN que comprende:
cultivar una célula cancerosa o tumoral infectada por un virus de ARN en un medio apropiado en presencia de un compuesto que contiene vanadio;
producir el virus de ARN de la célula cancerosa o tumoral mediante replicación viral; y
preparar la vacuna contra el cáncer basada en virus de ARN a partir del virus de ARN producido.
En aún otra realización, no reivindicada, se proporciona en el presente documento un método para producir un vector de terapia génica contra el cáncer basado en virus de ARN que comprende:
cultivar una célula cancerosa o tumoral infectada por un virus de ARN en un medio apropiado en presencia de un compuesto que contiene vanadio;
producir el virus de ARN de la célula cancerosa o tumoral mediante replicación viral; y
preparar el vector de terapia génica contra el cáncer basado en virus de ARN a partir del virus de ARN producido. En otra realización de cualquiera de las composiciones anteriores, el virus de ARN puede ser VSVA51.
En otra realización de cualquiera de las composiciones anteriores, el compuesto que contiene vanadio puede ser un vanadato.
En aún otra realización de cualquiera de las composiciones anteriores, el compuesto que contiene vanadio puede ser una sal farmacéuticamente aceptable de ortovanadato.
La presente invención se comprenderá mejor con referencia a la siguiente descripción y dibujos adjuntos.
Breve descripción de los dibujos
Estas y otras características de la invención resultarán más evidentes a partir de la siguiente descripción en la que se hace referencia a los dibujos adjuntos, en donde:
La Figura 1 muestra los resultados en los que el vanadato mejoró la infección por virus de ARN en las células cancerosas, pero no en las células normales. (a) Estructura de ion ortovanadato. (b, c) Las líneas celulares de cáncer renal humano resistentes 786-0 se pretrataron con un intervalo de dosis de ortovanadato durante 4 horas y posteriormente se infectaron por VSVA51 oncolítico que expresaba GFP a una MOI de 0,01. (b) El título viral correspondiente se determinó 24 horas después de la infección a partir de sobrenadantes (N=3). (c) 24 horas después de la infección, se tomaron imágenes fluorescentes y de contraste de fases de las células 786-0 tratadas de forma simulada o con 200 uM de ortovanadato. (d) Curva de crecimiento de varias etapas y (e) de una sola etapa de 786-0 pretratadas con ortovanadato e infectadas con VSVA51 (d) MOI: 0,01 o (e) MOI: 0,01, los sobrenadantes se titularon mediante ensayo de placas. (f) Células 786-0 tratadas con 200 uM de ortovanadato en distintos momentos antes o después de la infección por VSVA51 (MOI: 0,01), los sobrenadantes se recogieron 24 horas después de la infección y se titularon mediante un ensayo de placas. La línea negra discontinua representa el valor del título para células 786-0 infectadas y no tratadas. (i) 786-0 fueron pretratadas con un intervalo de dosis de ortovanadato durante 4 horas y posteriormente infectadas por VSVA51 (MOI: 0,01), VSVwt (MOI: 0,01), Sarampión (MOI: 0,01), Sindbis (MOI: 10) o HSV (MOI: 0,01). Los títulos virales correspondientes se determinaron 24 (VSVA51, VSVwt) o 48 (Sarampión, Sindbis, HSV) horas después de la infección a partir de sobrenadantes (N=3). (k) La línea celular normal GM38 fue pretratada con un intervalo de dosis de ortovanadato durante 4 horas y posteriormente infectada por VSVA51 oncolítico que expresaba GFP a una MOI de 0,01. Los títulos virales correspondientes se determinaron a las 24 horas después de la infección a partir de sobrenadantes (N=3) y se tomaron las imágenes fluorescentes correspondientes. (g) 24 horas después de la infección, se recogió ARN de 786-0 y CT26WT, y se cuantificó la expresión del gen de VSV-M mediante qPCR. (h) Los tumores de CT26wt y DBT se cultivaron por vía subcutánea en ratones Balb/c y se extirparon cuando el tumor alcanzó 10 mm x 10 mm y posteriormente se extrajeron los núcleos. También se recogieron y extrajeron núcleos de tejido de bazo, músculo, pulmón y cerebro de ratones Balb/c. Los núcleos de tejido tumoral y normal se pretrataron con 300 uM de ortovanadato durante 4 horas y posteriormente se infectaron por 1x104 UFP de VSVA51 oncolítico que expresaba GFP. 24 horas después de la infección se obtuvieron imágenes fluorescentes de los núcleos de tejido tumoral y normal. Se muestran imágenes representativas de cada conjunto por triplicado;
La Figura 2 muestra los resultados en los que la mejora viral depende del vanadio. 786-0 se pretrataron durante 4 horas con diversas concentraciones (a) de sales de fosfato o pirofosfato, (b) diversos metales de transición oxidados, (c) solución de ortovanadato a diversos pH, (e, f) diversos compuestos a base de vanadato, (g) diversos compuestos a base de vanadio, y posteriormente se infectaron por VSVA51 oncolítico que expresaba GFP a una MOI de 0,01. (a, b, f, g) Los títulos virales correspondientes se determinaron 24 horas después de la infección a partir de sobrenadantes (N=3). Las barras de error indican s.e.m. (d, e) Se presentan los correspondientes recuentos de células GFP positivas 24 horas después de la infección, (g) y las correspondientes imágenes fluorescentes. (d) Se ilustra la estructura de varios compuestos a base de vanadato. (h) 786-0 se pretrataron con 200 uM de ortovanadato o se dejaron sin tratar y se trataron con ácido ascórbico (L-AA) como agente quelante, y se infectaron por VSVA51 (MOI: 0,01). Los títulos virales correspondientes se determinaron 24 horas después de la infección a partir de sobrenadantes (N=3). Las barras de error indican s.e.m;
La Figura 3 muestra los resultados en los que el vanadato facilita la muerte celular a través del interferón de tipo I y la apoptosis mediada por ROS durante la infección vírica. (a) 786-0 fueron pretratadas durante 4 horas con un intervalo de concentración de varios compuestos a base de vanadato (Meta = metavanadato, ortho = ortovanadato, VS = sulfato de óxido de vanadio (IV), VOX = oxitrietóxido de vanadio (V), BMOV = oxovanadio de bismaltolato (IV) y posteriormente fueron infectadas por VSVA51 oncolítico expresando GFP a una MOI de 0,01. La viabilidad celular se examinó en células 786-0 24 horas después de la infección. Los resultados se normalizaron con respecto al promedio de los valores obtenidos para las correspondientes células no infectadas y no tratadas (N=4). (b) 786-0 se pretrataron con un intervalo de dosis de ortovanadato durante 4 horas y posteriormente se infectaron por VSVA51 oncolítico que expresaba GFP a una MOI de 0,01. 24 horas después de la inducción de la muerte celular se determinó mediante tinción con anexina V y 7-aminoactinomicina D (7-AAD). Los números indican el porcentaje en cada cuadrante. (c, d, e) 786-0 se pretrataron con un intervalo de dosis de ortovanadato durante 4 horas y posteriormente se infectaron a una MOI de 0,01 por (c) VSVA51, VSVA51 inactivado por UV o VSVA51 Gless, o se trataron con (d) IFNa, IFNb o PoliLC. La viabilidad celular se examinó 48 horas después de la infección. (e, g) Se presenta la morfología celular correspondiente. (f) 786-0 se pretrataron con ortovanadato o se dejaron sin tratar y se trataron con N-acetil-L-cisteína (NAC), y se infectaron por VSVA51 (MOI: 0,01). (e) La viabilidad celular se examinó en células 786-024 horas después de la infección. Los resultados se normalizaron con respecto al promedio de los valores obtenidos para las correspondientes células no infectadas y no tratadas (N=4). (g) Los títulos virales se determinaron 24 horas después de la infección a partir de sobrenadantes (N=3). (h) Se recogieron lisados celulares de 786-0 tratados con ortovanadato e IFNb y se investigaron para pSTAT1, STAT1 y p-tubulina mediante inmunoelectrotransferencia. (i) Varias líneas celulares se pretrataron durante 4 horas con una serie de concentraciones de ortovanadato y posteriormente se infectaron por VSVA51 oncolítico que expresaba GFP a una MOI de 0,01. La viabilidad celular se examinó en células 786-048 horas después de la infección. Los resultados se normalizaron con respecto al promedio de los valores obtenidos para las correspondientes células no infectadas y no tratadas (N=4);
La Figura 4 muestra los resultados en los que el vanadato aumenta la infección por VSVD51 en modelos de tumores singénicos resistentes. (a) Ratones singénicos portadores de tumores de CT26wt, CT26-LacZ, DBT, Pan02 fueron tratados intratumoralmente con el vehículo (PBS) o 40 mg/kg de ortovanadato durante 4 horas, y posteriormente tratados con 1x108 UFP de VSVA51 oncolítico que expresaba luciferasa de luciérnaga, intratumoralmente. Se controló la replicación viral a las 24 y 48 horas tras la infección. Se presentan imágenes representativas de bioluminiscencia de ratones. (b) Cuantificación de la luminiscencia. Escala representada en fotones. (c) Representación esquemática de la pauta de tratamiento para el modelo de CT26wt. (d-f) La supervivencia se controló a lo largo del tiempo. La prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon indica que el tratamiento combinado es significativamente más prolongado que el virus solo. (g) Se controló la supervivencia tras la reimplantación de CT26WT en ratones curados y que no han recibido tratamiento de (d);
La Figura 5 muestra los resultados en los que el tratamiento con vanadato y VSVD51 retrasa el crecimiento del tumor a distancia. (a, c) Ratones inmunocompetentes portadores de tumores de CT26-LacZ y (b, d, e) ratones desnudos portadores de tumores de CT26-LacZ o HT29 fueron tratados intratumoralmente con el vehículo (PBS) o 40 mg/kg de ortovanadato durante 4 horas, y posteriormente tratados con 1x108 UFP de VSVA51 oncolítico que expresaba luciferasa de luciérnaga, intratumoralmente. Se controló la replicación viral 48 horas después de la infección. (a, b) Se presentan imágenes representativas de bioluminiscencia de ratones. (c-e) La supervivencia se controló a lo largo del tiempo. (f) Representación esquemática de la pauta de tratamiento para DBT bilateral. (g) Se presentan imágenes representativas de bioluminiscencia de ratones. (h) Crecimiento de los tumores tratados (flanco derecho) y de DBT a distancia;
La Figura 6 muestra los resultados en los que el vanadato potencia una respuesta inmunitaria más fuerte tras la infección vírica. (a, b) Las células 786-0 y (b) CT26wt se pretrataron durante 4 horas con el vehículo, ortovanadato, metavanadato o se dejaron sin tratar y se infectaron por VSVD51 (MOI: 0,01), o se dejaron sin infectar. 24 horas después de la infección se extrajo el ARN. (a) El ARN se procesó posteriormente para la hibridación en Affymetrix Human PrimeView Array (N=1, triplicado biológico agrupado para cada condición experimental), o se procesó para la cuantificación por qPCR. (a) Mapa de calor que muestra los niveles de expresión de las citocinas y quimiocinas expresadas diferencialmente. La expresión de los genes se normalizó con respecto a los valores obtenidos para el control no tratado y no infectado. También se realizó una agrupación jerárquica de los genes de todas las muestras. En el mapa de calor, el rojo indica una expresión relativamente más alta y el azul indica una expresión relativamente más baja en relación con el control no tratado y no infectado. (b) Expresión génica de varias citocinas y quimiocinas en 786-0 y CT26wt, cuantificada por qPCR. (c) Representación esquemática de la pauta de tratamiento para el modelo de CT26wt. (d) Porcentaje de las células dentro del tumor que son linfocitos (CD45+), 10 días después del tratamiento. (e) Número absoluto de células T (células CD3+/millón de células), 10 días después del tratamiento. Se muestra la media /- SEM;
La Figura 7 muestra los resultados en los que el vanadato mejora la infección por VSVD51 en células cancerosas resistentes. Varias líneas celulares cancerosas se pretrataron durante 4 horas con la concentración indicada de ortovanadato y posteriormente se infectaron por VSVA51 oncolítico que expresaba GFP a una MOI de 0,01. (a) Se presentan las imágenes fluorescentes correspondientes (b) y se determinaron los títulos virales 24 horas después de la infección a partir de los sobrenadantes (N=3);
La Figura 8 muestra los resultados en los que el vanadato mejora la propagación de VSVD51 en células cancerosas. Varias líneas celulares cancerosas se pretrataron durante 4 horas con la concentración indicada de ortovanadato y posteriormente se infectaron por VSVA51 oncolítico que expresaba GFP, se añadió una superposición de agarosa después de 1 hora de infección, (a) Microscopía de fluorescencia de una placa representativa 24 horas después de la infección. (b) Tinción azul de Coomassie correspondiente de los pocillos llenos en (a) que ilustra la mejora de los diámetros de la placa en presencia de ortovanadato;
La Figura 9 muestra los resultados de los estudios de optimización del tratamiento con vanadato en modelos tumorales singénicos. Los ratones singénicos portadores de tumores de CT26wt fueron tratados intratumoralmente con el (a-c) vehículo (PBS), 20, 30 o 40 mg/kg de ortovanadato durante 4 horas, y posteriormente tratados con 1x108 UFP de VSVA51 oncolítico que expresaba luciferasa de luciérnaga, intratumoralmente. Se controló la replicación viral a las 24, 48 y 72 horas después de la infección. (a) Esquema de tratamiento. (c) Se presentan imágenes de bioluminiscencia representativas de ratones. (b) Cuantificación de la luminiscencia. (d, e) Para evaluar la tolerabilidad del ortovanadato a distintos pH, se trató a ratones Balb/c por vía intraperitoneal con la concentración indicada. La supervivencia se controló a lo largo del tiempo. (f) Igual que (c) pero se trataron con la concentración indicada de ortovanadato a diferentes pH;
La Figura 10 muestra los resultados en los que la administración IT de vanadato con VSVD51 no induce la propagación del virus a los órganos principales. Los ratones singénicos portadores de tumores de CT26wt fueron tratados intratumoralmente con el vehículo (PBS), 40 mg/kg de ortovanadato durante 4 horas, y posteriormente tratados con 1x108 UFP de VSVA51 oncolítico que expresaba luciferasa de luciérnaga, intratumoralmente. El tumor y el órgano principal se recogieron 1, 2 o 3 días después de la infección y se homogeneizaron antes de la cuantificación viral mediante ensayo de placas. (a) Esquema de tratamiento. (b) Título viral correspondiente presentado;
La Figura 11 muestra los resultados en los que el vanadato inhibe la respuesta del interferón de tipo I y potencia una respuesta proinflamatoria a través del interferón de tipo II. Se recogieron lisados celulares de 786-0 tratados con vanadato y VSVA51 que expresaba GFP en los puntos temporales indicados. Se extrajo ARN y se investigó la expresión de (a) los genes ifn/3, ifnY, mx2, ifitml y cxcl9 mediante qPCR (N=3; Las barras de error indican SEM; **p < 0,01, ***p<0,0001 mediante ANOVA bidireccional; comparando la condición de VSVA51 con la condición de Vanadato+VSVA51). (b) El ARN se usó para el análisis de micromatrices de expresión génica. Los datos se normalizan con respecto al control no tratado, indicando el cambio múltiplo log2 en la expresión génica de los genes documentados como inducidos por el IFN de tipo I o de tipo II. (Las barras indican la media; ANOVA unidireccional; NS, sin significación estadística, *** p<0,0001, comparando el tratamiento combinado con la condición de virus solo), (c) Mapa de calor que muestra los niveles de expresión de los genes estimulados por IFN expresados diferencialmente. La expresión de los genes se normalizó con respecto a los valores obtenidos para el control infectado tratado de forma simulada. La escala de colores indica el cambio múltiplo log2. (d) Las células 786-0 fueron pretratadas con vanadato (1000 μM) durante 4 horas y estimuladas con IFNp (100 U/ml). Una hora después, se investigaron lisados celulares fraccionados para pSTAT1, STAT1, pSTAT2, STAT2 y actina. (e) Se realizó inmunofluorescencia para pSTAT1, pSTAT2 y STAT2 en células 786-0 tratadas con vanadato (1000 μM) durante 4 horas y con IFNp humano (1000 U) durante 1 hora. Cuantificación de la fluorescencia nuclear promedio asociada a pSTAT1 o pSTAT2 en cada condición (N=30; Las barras indican la media; ANOVA unidireccional, * p<0,05, ** p<0,001, *** p<0,0001, en comparación con el homólogo en condición de simulación); y
La Figura 12 muestra los resultados en los que el vanadato disminuyó los niveles de expresión proteica de los genes inducidos por el IFN tipo I. Se recogieron lisados celulares de 786-0 tratados con vanadato y VSVA51 que expresaba GFP en los puntos temporales indicados. Se extrajo la proteína y se investigó mediante inmunoelectrotransferencia para IFITM1, VSV y actina.
Descripción detallada
La siguiente descripción es de una o más realizaciones preferidas de la invención definidas en las reivindicaciones. En una realización, se proporciona en el presente documento un compuesto que contiene vanadio para su uso en un método terapéutico para mejorar o aumentar la infección, la propagación, el título, o la actividad oncolítica o inmunoterapéutica de un virus de ARN en una célula cancerosa o tumoral, comprendiendo el método administrar dicho compuesto que contiene vanadio a dicha célula antes de, después de o simultáneamente con la infección de la célula por el virus.
En otra realización, se proporciona en el presente documento un compuesto que contiene vanadio para su uso en un método terapéutico para mejorar o aumentar la infección, la propagación, el título, o la actividad oncolítica o inmunoterapéutica de un virus oncolítico de ARN en células cancerosas o tumorales, comprendiendo el método administrar un compuesto que contiene vanadio a dichas células antes de, después de o simultáneamente con la infección de las células por el virus.
En una realización adicional, que no pretende ser limitativa, la actividad oncolítica o inmunoterapéutica del virus oncolítico de ARN se potencia en células cancerosas o tumorales en comparación con la actividad oncolítica o inmunoterapéutica del virus solo o la actividad inmunoterapéutica del compuesto que contiene vanadio solo.
En otra realización más de cualquiera de las composiciones descritas anteriormente, el compuesto que contiene vanadio mejora la infección, el crecimiento o la propagación del virus de ARN en células cancerosas resistentes a la infección.
En otra realización más de cualquiera de las composiciones descritas anteriormente, el compuesto que contiene vanadio mejora la infección, el crecimiento o la propagación del virus de ARN en células cancerosas y tumores in vivo sin inducir la propagación del virus a órganos principales.
En una realización adicional de cualquiera de las composiciones descritas anteriormente, el compuesto que contiene vanadio mejora la muerte de las células cancerosas inducida por el virus in vivo e in vitro.
En aún una realización adicional, que no pretende ser limitativa, se proporcionan composiciones que comprenden uno o más de los compuestos que contienen vanadio, y uno o más de a) un virus de ARN, un virus de ARN modificado genéticamente, un virus de ARN atenuado, un virus oncolítico de ARN, una vacuna contra el cáncer basada en virus de ARN o un vector de terapia génica contra el cáncer, b) una o más células cancerosas, c) un portador, diluyente o excipiente, d) un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, e) células no cancerosas; f) medios de cultivo celular; g) una o más terapias contra el cáncer; o cualquier combinación de a)-g). La presente invención también contempla realizaciones en donde una cualquiera o una combinación de a-g) se excluyen específicamente de la composición o kit. Si se desea, puede excluirse cualquier componente o grupo de componentes.
En otra realización más, se proporciona en el presente documento un kit que comprende uno o más de los compuestos que contienen vanadio, y uno o más de a) un virus de ARN, un virus de ARN modificado genéticamente, un virus de ARN atenuado, un virus oncolítico de ARN, una vacuna contra el cáncer basada en virus de ARN o un vector de terapia génica contra el cáncer, b) una o más células cancerosas, c) un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, d) células no cancerosas; e) medios de cultivo celular; f) una o más terapias contra el cáncer, g) una placa de cultivo celular o una placa de pocillos múltiples; h) un aparato para administrar el compuesto a una célula, medio o a un sujeto; i) instrucciones para usar el compuesto o cualquier componente en el kit, j) un portador, diluyente o excipiente, o cualquier combinación de a)-j). La presente invención también contempla kits en donde se excluye específicamente una cualquiera o una combinación de los mismos de a)-j).
El experto en la materia entenderá teniendo en cuenta las enseñanzas del presente documento que la mejora o el aumento de la actividad, la producción, la actividad oncolítica o la citotoxicidad viral pueden incluir la mejora o el aumento de al menos uno de infección viral y/o su tasa, la producción viral y/o su tasa, el título viral y/o la tasa a la que puede alcanzarse el título completo, la propagación viral y/o su tasa, la lisis celular y/o su tasa, la citotoxicidad viral y/o su tasa, o cualquier combinación de los mismos, en comparación a cuando no se usan uno o más compuestos.
El experto en la materia entenderá teniendo en cuenta las enseñanzas del presente documento que la mejora o el aumento de la actividad inmunoterapéutica de un virus oncolítico de ARN puede incluir la mejora o el aumento de la respuesta inmunitaria antitumoral sistémica a través de la regulación al alza de muchas citocinas, incluyendo una mayor expresión de citocinas inducidas por el virus o el compuesto que contiene vanadio solo o la regulación al alza de citocinas no reguladas al alza por el virus o el compuesto que contiene vanadio solo.
En ciertas realizaciones, y sin querer desear quedar ligado a la teoría, un compuesto que contiene vanadio, como se describe en el presente documento, puede usarse para subvertir, al menos parcialmente, la respuesta de IFN de tipo I antiviral hacia una respuesta IFN de tipo II inductora de muerte y proinflamatoria, que puede mejorar la propagación del virus oncolítico, aumentar la muerte inespecífica de las células cancerosas y/o mejorar la estimulación inmunitaria antitumoral.
Por la expresión “compuesto que contiene vanadio” se entienden compuestos que incluyen un núcleo de metal de transición de vanadio. El núcleo de vanadio puede estar en cualquier estado de oxidación. Dichos compuestos incluyen, aunque sin limitación: Ortovanadato, metavanadato, oxitrietóxido (VOx) de vanadio (V), sulfato de óxido (VS) de vanadio (IV) y oxovanadio de bismaltolato (IV) (BMOV), tetrafluoruro de vanadio y tribromuro de vanadio. En ciertas realizaciones, los compuestos que contienen vanadio pueden incluir inhibidores de la fosfatasa a base de vanadio, por ejemplo.
En ciertas realizaciones, se sabe que las sales y compuestos de vanadio experimentan diferentes conversiones hidrolíticas en solución. El ortovanadato, el metavanadato y el oxitrióxido de vanadio (V) dan lugar a una solución de H2VO4- a pH fisiológico, mientras que las soluciones preparadas a partir de sulfato de vanadilo y fluoruro de vanadio (IV) dan lugar a una solución de V(IV) y V(V) acuoso, y las preparadas a partir de bis(maltolato)oxovanadio (IV) contendrán complejos de maltolato tanto de V(IV) como de V(V). En los estudios que se describen con más detalle en el presente documento, dichos compuestos pueden, en ciertas realizaciones, mostrar una capacidad robusta para mejorar la actividad del OV, por ejemplo.
Por la expresión “virus oncolítico” se entiende un virus que infecta y lisa preferentemente células cancerosas o tumorales en comparación con células normales o no cancerosas. Ejemplos de virus oncolíticos conocidos en la técnica incluyen, sin limitación, reovirus, virus de la enfermedad de Newcastle, adenovirus, virus del herpes, virus de la polio, virus de las paperas, virus del sarampión, virus de la gripe, virus vaccinia, rabdovirus como el virus de la estomatitis vesicular y derivados/variantes de los mismos. En una realización preferida, el virus en presencia de un compuesto que contiene vanadio, tal como se describe en el presente documento, infecta y lisa preferentemente células cancerosas o tumorales en comparación con el virus solo y en comparación con células normales solas o en presencia del compuesto que contiene vanadio.
Por la expresión “virus de ARN” se entiende un virus que tiene ARN (ácido ribonucleico) como material genético. El ácido nucleico puede ser ARN monocatenario o ARN bicatenario, y el ARN puede ser de sentido negativo o de sentido positivo. Ejemplos de virus de ARN incluyen reovirus, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la polio, virus de las paperas, virus del sarampión, virus de la gripe, rabdovirus como el virus de la estomatitis vesicular.
La actividad citotóxica/oncolítica del virus puede estar presente, observarse o demostrarse in vitro, in vivo, o ambos. Preferentemente, el virus presenta actividad citotóxica/oncolítica in vivo.
Por “derivado” o “variante” de un virus, se entiende un virus obtenido mediante la selección del virus en condiciones de crecimiento diferentes, un virus que ha sido sometido a una serie de presiones de selección, que ha sido modificado genéticamente mediante técnicas recombinantes conocidas en la técnica, o un virus que ha sido genomanipulado para tener replicación defectuosa y/o expresar transgenes, o cualquier combinación de los mismos. Ejemplos de tales virus son conocidos en la técnica, por ejemplo, de las solicitudes de patente de EE. UU.
20040115170, 20040170607, 20020037543, WO 00/62735; patentes de Estados Unidos 7.052.832, 7.063.835, 7.122.182 y otras. Preferentemente, el virus es un virus de la estomatitis vesicular (VSV), o una variante/derivado de rabdovirus relacionado, por ejemplo, seleccionado en condiciones de crecimiento específicas, uno que haya sido sometido a una serie de presiones de selección, uno que haya sido modificado genéticamente usando técnicas recombinantes conocidas en la técnica, o una combinación de los mismos. En una realización preferida, el virus es VSVA51 (Stojdl et al., VSV strains with defects in their ability to shutdown innate immunity are potent systemic anticancer agents, Cancer Cell. octubre de 2003;4(4):263-75).
Los uno o más tipos de células cancerosas o tumorales pueden ser células cancerosas o tumorales in vitro o in vivo de cualquier célula, línea celular, tejido u organismo, por ejemplo, aunque sin limitación, humano, rata, ratón, gato, perro, cerdo, primate, caballo y similares. En una realización preferida, las una o más células cancerosas o tumorales comprenden células cancerosas o tumorales humanas, por ejemplo, aunque sin limitación, leucemia linfoblástica, leucemia mieloide, carcinoma corticosuprarrenal, cánceres relacionados con el SIDA, linfoma relacionado con el SIDA, cáncer anal, cáncer de apéndice, astrocitoma, tumor teratoide/rabdoide atípico, carcinoma basocelular, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer óseo, osteosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, glioma de tronco cerebral, tumor cerebral, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral/glioma maligno, craneofaringioma, ependimoblastoma, meduloblastoma, tumores del parénquima pineal de diferenciación intermedia, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales y pineoblastoma, glioma hipotalámico y de las vías visuales, tumores de la médula espinal, cáncer de mama, tumores bronquiales, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, linfoma del sistema nervioso central, cáncer de cuello de útero, cordoma, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, linfoma cutáneo de células T, tumores embrionarios, cáncer de endometrio, ependimoblastoma, ependimoma, cáncer de esófago, tumor de células germinales extracraneal, tumor de células germinales extragonadal, cáncer de vías biliares extrahepático, cáncer ocular, melanoma intraocular, retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (de estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), tumor de células del estroma gastrointestinal, tumores de células germinales, tumor trofoblástico gestacional, ovárico, extracraneal, extragonadal, glioma, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular (de hígado), histiocitosis, cáncer de células de Langerhans, linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, tumores de células de los islotes, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de laringe, leucemia linfocítica, leucemia de células pilosas, cáncer de labio y de la cavidad bucal, cáncer de hígado, cáncer pulmonar no microcítico, cáncer pulmonar microcítico, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, histiocitoma fibroso maligno óseo y osteosarcoma, meduloblastoma, meduloepitelioma, melanoma, melanoma intraocular, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, cáncer de cuello escamoso metastásico, cáncer de boca, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas, cáncer de la cavidad nasal y de senos paranasales, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer paratiroideo, cáncer de pene, cáncer faríngeo, feocromocitoma, tumores del parénquima pineal, pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, tumor hipofisario, neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, linfoma primario del sistema nervioso central, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer de células renales (de riñón), cáncer de pelvis renal y de uréter, cáncer de células de transición, carcinoma de las vías respiratorias, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, sarcoma uterino, cáncer de piel, carcinoma cutáneo de células de Merkel, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de células escamosas, cáncer escamoso de cuello, cáncer de estómago (gástrico), tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, linfoma de células T, cáncer testicular, cáncer de garganta, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, tumor trofoblástico, cáncer de uretra, cáncer de útero, cáncer de endometrio, sarcoma uterino, cáncer vaginal, cáncer de vulva o tumor de Wilms. Sin embargo, los compuestos y composiciones descritos en el presente documento pueden usarse para tratar otros cánceres o tumores in vivo o in vitro.
En otra realización, se proporciona en el presente documento una composición que comprende a) uno o más compuestos que contienen vanadato como se describe en el presente documento y b) uno o más componentes adicionales, por ejemplo, aunque sin limitación 1) un portador, diluyente o excipiente, 2) un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, 3) un virus de ARN, por ejemplo, aunque sin limitación, un virus atenuado, un virus modificado genéticamente o un virus oncolítico, 4) células cancerosas o tumorales, 5) células no cancerosas o normales, 6) medios de cultivo celular, 7) una o más terapias contra el cáncer, por ejemplo, aunque sin limitación, quimioterapéuticos. A modo de ejemplo, pero sin que se considere limitativo en modo alguno, la ciclofosfamida (CPA) es un fármaco quimioterapéutico común usado principalmente para el tratamiento del linfoma, la leucemia linfocítica crónica y los cánceres de mama, ovario y vejiga. La CPA se convierte en sus metabolitos activos, 4-hidroxiciclofosfamida y aldofosfamida, mediante oxidasas hepáticas. El uso del CPA como inmunosupresor para mejorar la oncolisis viral ha mejorado la eficacia de la viroterapia en combinación con variantes oncolíticas del HSV, adenovirus, virus del sarampión, reovirus y virus vaccinia.
Una terapia contra el cáncer adicional conocida en la técnica es el cisplatino. El cisplatino se une al ADN celular y lo reticula, provocando la apoptosis cuando el ADN no se repara. El cisplatino se ha investigado en combinación con adenovirus oncolíticos, virus del herpes, parvovirus, virus vaccinia y virus de la estomatitis vesicular. Se ha observado una mayor actividad terapéutica in vitro e in vivo al combinar cisplatino con variantes oncolíticas de adenovirus, herpesvirus, parvovirus y virus vaccinia, mientras que en el caso de la variante oncolítica del virus de la estomatitis vesicular, se observó una ligera inhibición.
La mitomicina C (MMC) es un antibiótico reticulante del ADN con propiedades antineoplásicas. La MMC mostró una citotoxicidad sinérgica con el HSV oncolítico. In vivo, la combinación de virus del herpes oncolítico y MMC mejoró significativamente los efectos terapéuticos en modelos de carcinomatosis gástrica y cáncer pulmonar microcítico. La doxorrubicina es un antibiótico antraciclínico que se intercala en el ADN e impide la acción de la topoisomerasa II. La doxorrubicina fue sinérgicamente citotóxica cuando se combinó con adenovirus oncolíticos (ONYX-015) y la combinación redujo el crecimiento tumoral en relación con las monoterapias. ONYX-015 se combinó de forma satisfactoria con la quimioterapia MAP (mitomicina C, doxorrubicina y cisplatino) en un ensayo clínico de fase I-II para el tratamiento de sarcomas avanzados.
El ganciclovir (GCV) es un agente antivírico ampliamente usado, desarrollado originalmente para el tratamiento de las infecciones por citomegalovirus. El GCV es un profármaco análogo de la guanasina que, tras la fosforilación por parte de la timidina quinasa (TK) del virus del herpes, compite con el dGTP celular por su incorporación al ADN, lo que provoca la terminación de la elongación. Los virus oncolíticos que codifican el gen TK del HSV provocan una acumulación de metabolitos tóxicos del GCV en las células tumorales que interfieren en la síntesis del ADN celular, lo que conduce a la apoptosis. Los virus oncolíticos del HSV dirigidos en combinación con GCV mejoraron significativamente la supervivencia en modelos de cáncer de ovario humano y gliosarcoma de rata. Los adenovirus, genomanipulados para expresar el gen TK del HSV, también muestran una mayor actividad antitumoral cuando se combinan con GCV.
La terapia enzimática/profarmacológica CD/5-FC también ha demostrado su eficacia en combinación con la viroterapia oncolítica. El 5-FU es un análogo de la pirimidina que inhibe la síntesis de timidina. La actividad antitumoral de dos virus vaccinia oncolíticos diferentes que expresan CD aumentó significativamente cuando se combinaron con la terapia 5-FC en modelos de cáncer de ovario inmunocompetente y de cáncer de colon inmunodeprimido.
Los taxanos son una clase de fármacos quimioterapéuticos, entre los que se incluyen el paclitaxel y el docetaxel, que provocan la estabilización de los microtúbulos celulares impidiendo así la función del citoesqueleto celular, un requisito para la mitosis. La combinación de docetaxel o paclitaxel con un adenovirus oncolítico dirigido al urotelio o la próstata redujo significativamente el volumen tumoral in vivo y produjo una citotoxicidad sinérgica in vitro.
La rapamicina (sirolimus) es un inmunosupresor de uso común en pacientes trasplantados; sin embargo, también se ha demostrado que aumenta significativamente los efectos oncolíticos de las variantes oncolíticas de los poxvirus mixoma y virus vaccinia.
El inhibidor prototípico del proteosoma MG-132 mejoró la expresión celular de CAR en células de carcinoma de colon Lovo, lo que se acompañó de una mayor expresión del gen diana del adenovirus oncolítico y de oncolisis. La eficacia del VSV oncolítico frente a células de leucemia linfocítica crónica se incrementó mediante terapia combinada con el inhibidor de BCL-2 EM20-25.
Un grupo demostró que una dosis única de tratamiento con el péptido angiostático cRGD antes del tratamiento con el virus oncolítico mejoró la eficacia antitumoral del HSV oncolítico.
Otros grupos han demostrado que los inhibidores del punto de control inmunitario dirigidos contra CTLA4 o PD1 en combinación con el virus oncolítico de la enfermedad de Newcastle [42], el virus oncolítico del sarampión [43] y el VSV oncolítico [44], así como el HSV-1 oncolítico [45], mejoran su actividad anticancerosa.
Para aplicaciones terapéuticas in vivo, se proporciona preferentemente una composición farmacéutica que comprende uno o más compuestos que contienen vanadato y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, que contiene opcionalmente otros solutos como sales disueltas y similares. En una realización preferida, la solución comprende suficiente solución salina, glucosa o similares para que la solución sea isotónica. Las composiciones farmacéuticas y los métodos para preparar composiciones farmacéuticas son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en “ Remington: The Science and Practice of Pharmacy” (anteriormente “ Remingtons Pharmaceutical Sciences” ); Gennaro, A., Lippincott, Williams & Wilkins, Philidelphia, Pa (2000).
La administración de dichas composiciones puede realizarse por varias vías, dependiendo de si se desea un tratamiento local y/o sistémico y del área a tratar. En una primera realización, que no pretende ser limitativa, el compuesto se administra localmente en el área a tratar. La administración puede ser tópica (incluida la oftálmica y a las membranas mucosas, incluida la administración vaginal y rectal), pulmonar (por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo por nebulizador), intratraqueal, intranasal, epidérmica y transdérmica, oral o parenteral. La administración parenteral incluye la inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular, o la administración intracraneal, por ejemplo, intratecal o intraventricular. También se contempla la inyección, perfusión o administración intratumoral en las proximidades generales del tumor o la inyección en la vasculatura que irriga un tumor. Alternativamente, los compuestos que contienen vanadato pueden formularse en un comprimido o cápsula para administración oral. También se contemplan formas farmacéuticas alternativas, incluyendo liberación lenta, liberación sostenida, liberación prolongada, como sería conocido en la técnica.
Para la administración por inhalación o insuflación, los compuestos pueden formularse en una solución acuosa o parcialmente acuosa, que luego puede usarse en forma de aerosol. Para uso tópico, los moduladores pueden formularse como polvos, cremas o lociones en vehículos farmacéuticamente aceptables, que se aplican a las partes afectadas de la piel.
Sin desear ser limitativos, los requisitos de dosificación para los compuestos que contienen vanadato de la presente invención pueden variar con las composiciones particulares empleadas, la vía de administración y el sujeto particular que se esté tratando. Los requisitos de dosificación pueden determinarse mediante técnicas clínicas estándar conocidas por un trabajador experto en la materia. Normalmente, el tratamiento se iniciará con pequeñas dosis inferiores a la dosis óptima del compuesto o compuesto/virus. Posteriormente, la dosis se incrementa hasta que se alcanza el efecto óptimo o satisfactorio según las circunstancias. En general, el compuesto que contiene vanadato o las composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto que contiene vanadato se administran a una concentración que generalmente proporcionará resultados eficaces sin causar efectos secundarios perjudiciales o nocivos significativos. La administración puede realizarse como dosis unitaria única o, si se desea, la dosis puede dividirse en subunidades convenientes que se administran en momentos adecuados a lo largo del día.
El compuesto que contiene vanadato puede emplearse en administración secuencial, por ejemplo, antes de, después de o tanto antes de como después de la administración de un virus de ARN, por ejemplo, aunque sin limitación, un virus atenuado, un virus modificado genéticamente, una vacuna contra el cáncer, un vector de terapia génica contra el cáncer o un virus oncolítico. Alternativamente, el compuesto que contiene vanadato puede administrarse simultáneamente o en combinación con un virus de ARN como el descrito anteriormente, preferentemente en combinación con un virus oncolítico. Además, el compuesto que contiene vanadato puede usarse con un virus oncolítico como se ha descrito anteriormente y en combinación con uno o más tratamientos contra el cáncer o terapias contra el cáncer como es conocido por un experto en la materia, por ejemplo, aunque sin limitación, terapia con interferón, terapia con interleucina, terapia de factor estimulante de colonias, inmunoterapia, terapia de inhibidor de punto de control inmunitario, fármacos quimioterapéuticos, por ejemplo, aunque sin limitación, 5-fluorodesoxiuridina amsacrina, bleomicina, busulfán, capecitabina, carboplatino, carmustina, clorambucil, cisplatino, cladribina, clofarabina, crisantaspasa, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, dactinomicina, daunorrubicina, docetaxel, doxorrubicina, epirrubicina, etopósido, fludarabina, fluorouracilo, gemcitabina, gliadel, hidroxicarbamida, idarrubicina, ifosfamida, irinotecán, leucovorina, lomustina, melfalán, mercaptopurina, mesna, metotrexato, mitomicina, mitoxantrona, oxaliplatino, paclitaxel, pemetrexed, pentostatina, procarbazina, raltitrexed, satraplatino, estreptozocina, tegafur-uracilo, temozolomida, tenipósido, tiotepa, tioguanina, topotecán, treosulfán, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina o una combinación de los mismos. Además, también pueden emplearse productos biológicos anticancerígenos, por ejemplo, aunque sin limitación, anticuerpos monoclonales y similares.
En otra realización, no reivindicada, se proporcionan en el presente documento métodos y usos de las composiciones descritas en el presente documento para aumentar o mejorar la propagación de un virus de ARN, por ejemplo, un virus modificado genéticamente, un virus atenuado, una vacuna contra el cáncer, un vector de terapia génica contra el cáncer o un virus oncolítico en una o más células, por ejemplo, pero sin limitarse a uno o más tipos de células cancerosas o tumorales, aumentar o mejorar la citotoxicidad/actividad oncolítica de un virus oncolítico contra una o más células cancerosas o tumorales, aumentar o mejorar la producción, el rendimiento o la capacidad reproductiva de un virus de ARN, por ejemplo, un virus modificado genéticamente, un virus atenuado, una vacuna contra el cáncer, un vector de terapia génica contra el cáncer, un virus oncolítico, o cualquier combinación de los anteriores. En una realización, que no pretende ser limitativa en modo alguno, las composiciones reducen la viabilidad de una célula cancerosa o tumoral destruyéndola o limitando su crecimiento durante un periodo de tiempo.
En otra realización, las células pueden ser células cancerosas in vivo o in vitro. En una realización adicional, las células cancerosas in vivo pueden proceder de un sujeto mamífero. En otra realización, el sujeto mamífero puede ser un sujeto humano.
En otra realización, no reivindicada, se proporciona en el presente documento una composición que comprende un medio de cultivo celular y un compuesto que contiene vanadio. En ciertas realizaciones, la composición puede usarse para cultivar una célula infectada con un virus de ARN.
En una realización no reivindicada, se proporciona en el presente documento un método para mejorar o aumentar la infección, la propagación, el título o la actividad oncolítica o inmunoterapéutica de un virus de ARN en una célula, por ejemplo, aunque sin limitación, un cáncer, tumor, célula inmortalizada u otra célula adecuada, comprendiendo el método administrar un compuesto que contiene vanadio a dicha célula antes de, después de o simultáneamente con la infección de la célula por el virus. En una realización adicional que no pretende ser limitativa en modo alguno, los compuestos y composiciones descritos en el presente documento pueden usarse en un entorno de fabricación industrial o farmacéutica para producir virus de ARN, virus de ARN modificados genéticamente, virus oncolíticos de ARN, vacunas basadas en virus de ARN y/o vectores basados en virus de ARN y similares en células que pueden incluir, entre otras, células MRC-5, WI-38 y Vero. Los virus que podrían ser deseables producir de esta manera incluyen, aunque sin limitación, reovirus, sarampión, rabdovirus (rabia, vsv, mg1), virus sindbis, virus de la gripe, poliovirus, rinovirus, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis D, virus Sindbis, virus de Semilki Forest, virus del ébola, virus de Marburg, virus de la fiebre del Valle del Rift, virus de Lassa, virus del dengue, virus de la fiebre amarilla, rotavirus, virus del zika, virus de la encefalitis japonesa, virus del Nilo Occidental, virus de Sponweni, virus de la enfermedad de Newcastle, coronavirus, SARS, virus de la rubéola, virus del río Ross, virus de Chikungunya. Virus del sarampión, virus de las paperas, virus sincitial respiratorio humano y otros, incluidos los virus de ARN del Grupo VI que incluyen, aunque sin limitación, lentivirus y retrovirus.
En ciertas realizaciones, la célula puede comprender una célula de un óvulo. A modo de ejemplo, en ciertas realizaciones, la célula puede comprender una célula de un óvulo, y el óvulo puede usarse en la producción de vacunas.
La presente invención se ilustrará adicionalmente en los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1: El vanadato mejora la propagación de los virus oncolíticos de ARN
Se analizó el impacto del ortovanadato sódico (Fig. 1a) en el crecimiento del VSVA51 oncolítico en células de carcinoma renal 786-0. El VSVA51 es una versión genéticamente atenuada del virus de la estomatitis vesicular de tipo silvestre (wtVSV), un virus de ARN monocatenario negativo perteneciente a la familia de los rhabdoviridae. Si bien el wtVSV es intrínsecamente tumorotrópico, el VSVA51 consigue una mayor selectividad tumoral que el wtVSV debido a su incapacidad para superar las defensas antivirales celulares [37]. Mediante el ensayo de placa, se descubrió que entre dosis de 10-1000 uM, el vanadato podía aumentar significativamente la producción viral (Fig. 1b). El uso de un VSVA51 que expresa GFP reveló un aumento correspondientemente marcado en el número de células infectadas por el virus (Fig. 1c). Se obtuvieron resultados comparables en varias líneas celulares de cáncer humano y de ratón resistentes a la infección por VSVA51 (Figura 7). Las curvas de crecimiento de una única etapa y de múltiples etapas en células 786-0 revelaron que el vanadato aumentaba de forma más robusta el rendimiento de VSVA51 cuando se proporcionaba a una multiplicidad de infección (MOI) baja en comparación con una MOI alta, lo que indica que el vanadato favorece una mejor propagación viral (comparar Fig. 1 d, e). Para evaluar aún más la capacidad del vanadato para mejorar la propagación del virus, se trataron e infectaron varias líneas celulares de cáncer de humano y de ratón. Las placas formadas se detectaron mediante fluorescencia GFP y, además, mediante tinción de Coomassie. El vanadato aumentó sustancialmente el tamaño de las placas en múltiples líneas celulares, incluidas tanto las resistentes como las sensibles a la infección (Figura 8). Mientras que la propagación del VSVA51 se vio fuertemente mejorada por el vanadato, se observaron leves mejoras en el rendimiento del wtVSV, sugiriendo de nuevo la posibilidad de que el vanadato mejora la propagación viral, ya que el wtVSV puede superar eficazmente las respuestas antivirales celulares en la línea celular 786-0. El impacto del vanadato en el crecimiento viral fue cada vez más evidente con el aumento del tiempo de pretratamiento (máximo analizado 24 h), siendo el efecto del vanadato casi nulo cuando se proporcionaba más de 12h después de la infección (Fig. 1f). Correspondientemente con los títulos virales y los datos de expresión de GFP, la Fig. 1g muestra que el vanadato aumentó la producción de ARNm de proteína de matriz (M) de VSVA51 y/o genomas virales en células 786-0 infectadas, así como en células de cáncer de colon CT26-WT de ratón. Posteriormente, se analizó el vanadato con diferentes virus de ARN y de ADN. De forma similar al VSVA51, el rendimiento de los virus del sarampión y Sindbis (virus de ARN monocatenario negativo y positivo, respectivamente) mejoró tras el tratamiento de las células 786-0 con vanadato. Por el contrario, el HSV-1 (mutante N212) se inhibió de forma robusta, lo que sugiere que los efectos promotores del crecimiento del vanadato son específicos del virus (Fig. 1i). A continuación, se comprobó si el vanadato también podía mejorar el VSVA51 en fibroblastos GM38 y se descubrió que el crecimiento viral no se mejoraba en estas células normales (Fig. 1k). Se comparó además la capacidad de los núcleos tumorales de ratón, así como de los tejidos normales de pulmón, músculo y bazo obtenidos de ratones implantados con tumores de CT26WT y DBT (glioma) a infectar por VSVA51-GFP en presencia y ausencia de vanadato. Las imágenes de microscopía de fluorescencia de la Fig. 1h muestran que el vanadato aumentó en gran medida el crecimiento del virus en los núcleos tumorales, pero no en los núcleos de tejido normal.
Ejemplo 2: Los compuestos a base de vanadio tienen propiedades de mejora viral únicas
Se ha demostrado que el ortovanadato inhibe las tirosina fosfatasas, una actividad relacionada con su gran parecido estructural y estérico con el fosfato [46]. Por lo tanto, se analizó si el fosfato podría reproducir efectos similares, pero se descubrió que, en contraste con el vanadato, varias sales de fosfato no tenían ningún impacto en el crecimiento viral (Fig. 2a). Una característica clave del ortovanadato es su núcleo de metal de transición de vanadio oxidado. Se deseaba determinar si otros metales de transición oxidados podrían mejorar potencialmente el crecimiento viral. En marcado contraste con el vanadio, ni las sales de manganeso, molibdeno u óxido de tungsteno pudieron mejorar el crecimiento del VSVA51 (Fig. 2b). El trióxido de cromo mejoró el crecimiento viral, pero sólo a una única dosis analizada (10 uM, Fig. 2b) y fue altamente tóxico en comparación con el ortovanadato (no mostrado). El estado de protonación del ortovanadato a diferentes pH no tuvo ningún impacto en su actividad (Fig. 2c). Como esto sugería que el efecto potenciador del virus estaba relacionado con el propio vanadio, se analizaron otros complejos oxidados de vanadio, incluyendo metavanadato, oxitrietóxido (VOx) de vanadio (V), sulfato de óxido (VS) de vanadio (IV) y oxovanadio de bismaltolato (IV) (BMOV). Todos estos compuestos mejoraron eficazmente el crecimiento de VSVA51 (Fig. 2d-f). Se obtuvieron resultados similares usando tetrafluoruro de vanadio y tribromuro de vanadio (Fig. 2g). Curiosamente, la actividad proviral del ortovanadato fue anulada con la inclusión de ácido L-ascórbico, un potente agente quelante de metales (Fig. 2h).
Ejemplo 3: El vanadato mejora el virus y la muerte inducida por citocinas
Si bien nuestros datos sugerían que los compuestos a base de vanadio mejoraban la propagación del VSVA51 en células cancerosas, nos preguntamos si esto también podría afectar a su actividad oncolítica. La Figura 3a muestra, en efecto, que mientras que los compuestos a base de vanadio tienen algunos efectos anticancerígenos por sí solos a dosis elevadas, la citotoxicidad aumentó enormemente tras la coinfección con una MOI baja de VSVA51 que, por lo demás, es inofensivo para las células 786-0. Se observó un efecto similar usando ortovanadato en varias líneas celulares de cáncer humano y de roedor (Fig. 3i). Se observó que el modo de muerte celular presentaba características de apoptosis, según se determinó mediante citometría de flujo tras la tinción con anexina V y 7-AAD (Fig. 3b). Curiosamente, el impacto del vanadato sobre la muerte celular fue independiente del efecto del vanadato sobre la replicación viral, ya que también se observó un aumento de la muerte de células 786-0 usando VSV inactivado por UV, así como usando una versión de VSVA51 desprovista de su capacidad para producir glicoproteína (G-less), que sólo puede someterse a una ronda de infección y no se propaga (Fig. 3c). Esto sugirió un potencial para la destrucción inespecífica, por lo que se analizó si el IFN antiviral normalmente secretado tras la infección de células 786-0 por VSVA51 podría producir efectos similares en combinación con vanadato. Efectivamente, las Figuras 3d-e muestran que el IFN de tipo I (a y p), podía provocar citotoxicidad en las células 786-0 en presencia de vanadato. Se obtuvieron efectos similares al estimular las células con poli I:C, un agonista de TLR3. Dado que se ha demostrado anteriormente que el vanadato aumenta las especies reactivas del oxígeno (ROS) [47], nos preguntamos si los efectos del vanadato sobre la muerte inducida por el virus podrían estar mediados por ROS. Para evaluar esto, se trataron a las células infectadas con vanadato y concentraciones crecientes de N-acetil cisteína (NAC), que repone el glutatión celular y reduce los niveles de ROS celulares [48]. El aumento de NAC tuvo el efecto de antagonizar la capacidad del vanadato para aumentar la muerte inducida por el virus (Fig. 3f). Sin embargo, la dosis más alta de NAC no anuló la capacidad del vanadato para aumentar la propagación viral (Fig. 3g), sugiriendo de nuevo que estas actividades del vanadato son distintas. Dado que el IFN de tipo I está implicado en la limitación de la propagación viral, pero también induce una muerte más significativa en combinación con vanadato, nos preguntamos qué efecto tendría el tratamiento con vanadato sobre la inducción de la fosforilación de STAT-1, un evento que se produce inmediatamente aguas abajo de la unión de citocina a los receptores IFN de tipo I, y que está regulado por varias quinasas y fosfatasas [49]. Se comprobó que contrariamente a lo que se esperaría de un potenciador de la propagación del virus debido a su asociación con la señalización antiviral, la fosforilación de STAT1 se incrementó por vanadato en el valor inicial. Como era de esperar, el IFN-p indujo la fosforilación de STAT1; sin embargo, esto no se vio alterado por el tratamiento con vanadato (Fig. 3h).
Ejemplo 4: El vanadato mejora la actividad oncolítica del VSVA51 in vivo
Dada la observación de que el vanadato mejoraba tanto la propagación como la actividad oncolítica del VSVA51 in vitro, nos preguntamos si la combinación de VSVA51 y vanadato podría tener efectos anticancerígenos en modelos animales de cáncer. Dados los informes en la bibliografía que sugieren que el vanadato tiene propiedades inmunomoduladoras, se realizaron experimentos en un panel de modelos de ratones inmunocompetentes singénicos. Las Fig. 4a-b (Fig. 9a-b) muestran que la inyección directa de vanadato y VSVA51 que expresaba luciferasa en tumores de CT26WT, 4T1 (cáncer de mama), DBT y Pan02 (cáncer de páncreas) aumentó de forma robusta la expresión génica de luciferasa asociada al virus, según se evaluó usando un sistema de formación de imágenes in vivo (IVIS). Si bien se observaron indicios de toxicidad cuando se usó ortovanadato sin tampón, esta se redujo considerablemente al acidificar la solución de vanadato a pH 7 (Fig. 9d, e), que conservó su actividad (Fig. 9f) acorde con los datos in vitro (Fig. 2c). De manera adicional, los estudios de biodistribución mostraron que no se detectó virus en los órganos principales tras la infección en combinación con ortovanadato (Fig. 10). Este régimen de tratamiento condujo a una supervivencia significativamente mejorada de los ratones expuestos a los tumores de DBT, CT26WT y 4T1 en comparación con las monoterapias (Fig. 4c-f). En CT26WT, esto condujo a la remisión completa en aproximadamente el 20 % de los ratones (Fig. 4d), que posteriormente se volvieron inmunes a una nueva provocación con las mismas células cancerosas (Fig. 4g). Una excepción a esta tendencia fueron los tumores de CT26-LacZ, que anteriormente habían demostrado ser significativamente más susceptibles a la infección por VSVA51 [50], donde el vanadato disminuyó algo la luminiscencia asociada al virus (Fig.4a-b). Sin embargo, la combinación de vanadato y VSVA51 condujo a una mejora significativa de la supervivencia sobre las monoterapias en este modelo, alcanzando casi el 90 % de remisiones completas (Fig. 5c). Si bien el aumento de la destrucción inespecífica, como se observa en la Fig. 3, podría explicar este fenómeno hasta cierto punto, nos preguntamos si el aumento de la respuesta inmunitaria adaptativa podría desempeñar un papel en la generación de una tasa de curación tan alta con una única dosis intratumoral de vanadato y VSVA51. Por tanto, se repitieron estos experimentos con los tumores de CT26-LacZ implantados en ratones desnudos atímicos desprovistos de células T. Sorprendentemente, el efecto potenciador del ortovanadato quedó completamente anulado en este contexto, aunque la luminiscencia asociada al virus no se vio afectada en general (Fig. 5d). De forma similar, mientras que el vanadato mejoró el crecimiento viral de VSVA51 en células humanas HT29 de cáncer de colon implantadas en ratones desnudos (Fig. 5e), no se observaron mejoras en la supervivencia usando la combinación de vanadato y VSVA51 (Fig. 5e). Para evaluar aún más la implicación potencial de una respuesta inmunitaria antitumoral, se les implantó a los ratones inmunocompetentes tumores bilaterales de DBT y se les inyectó tumores en el flanco derecho sólo con la combinación de VSVA51 y vanadato (o monoterapias/PBS) (Fig. 5f). Curiosamente, se descubrió que mientras que la mejora de la luminiscencia asociada al virus se vio reforzada únicamente por el vanadato en los tumores inyectados en el lado derecho, los tumores de la izquierda también se redujeron tras la terapia de combinación (Fig. 5g, h). Aunque algunos tumores desaparecieron tras el tratamiento con vanadato, esto no ocurrió en el contexto del VSVA51 sólo (Fig. 5h). En general, esto sugiere que el vanadato mejora la actividad oncolítica de los tumores de VSVA51 in vivo, lo que conduce a la estimulación de una respuesta inmunitaria antitumoral sistémica robusta.
Ejemplo 5: El vanadato potencia una respuesta inmunogénica después de la infección
Para comprender mejor cómo el tratamiento de combinación con vanadato y VSVA51 podría conducir a una inmunidad antitumoral robusta, se usaron micromatrices de expresión génica para analizar el impacto del VSVA51 y de los compuestos a base de vanadio (ortovanadato y metavanadato), solos o en combinación, en los perfiles de expresión génica 24 h después de la infección de células 786-0. En consonancia con nuestra demostración de que el vanadato estimula una respuesta inmunitaria antitumoral, los análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes mediante GOrilla revelaron que el vanadato por sí solo inducía respuestas inflamatorias, y procesos del sistema inmunitario; que se potenciaron aún más en combinación con VSVA51. De forma única, la infección de las células tratadas con vanadato condujo a un aumento de la expresión de una serie de citocinas proinflamatorias (CCL8, CCL3, IL6, TNF, IFNp, CCL5) y muchos genes normalmente inducidos por IFN tipo II (IFNy), incluyendo quimiocinas como CXCL9, CXCL10 y CXCL11 (Fig. 11 b,c y Fig. 6a,b). Entre otras, la CXCL9 desempeña un papel clave en el tráfico de leucocitos y su ARNm se reguló al alza en más de 100.000 veces durante la infección vírica de células tratadas con vanadato en comparación con la simulación (Fig. 6a, b, Fig. 11a). Se validó además el aumento mediado por vanadato en la expresión de ARNm de quimiocinas inducidas por IFNy como CXCL9 en células CT26WT de ratón que se usaron para nuestros modelos in vivo, así como su secreción por ELISA en varias líneas celulares de cáncer humano (Fig. 6b). Si bien muchos genes normalmente inducidos por IFNy fueron regulados al alza tras la infección de células tratadas con vanadato, el propio IFNy no fue regulado al alza en ningún momento tras la infección bajo ninguna condición analizada en 786-0 (Fig. 11a,b). Por otro lado, el ARNm de IFNp se reguló al alza en más de 10 veces 24 horas después de la infección (Fig. 11a) en las células tratadas con vanadato en comparación con la simulación. Sorprendentemente, los genes normalmente inducidos por el IFN tipo I no se vieron afectados o disminuyeron en estas condiciones (Fig. 11b, c). De hecho, los genes inducidos por el IFN tipo I, como MX2 e IFITM1 con una función antiviral conocida contra los rabdovirus, fueron fuertemente regulados a la baja ya a las 8 h después de la infección (Fig. 11a). Por otra parte, los niveles de expresión proteica de IFITM1 fueron potentemente reprimidos por el vanadato en células infectadas 16 y 24 h después de la infección (Fig. 12). La regulación al alza sinérgica de CXCL9 también se observó en las células de cáncer de colon CT26WT (Fig. 6b), en las que el tratamiento de combinación con ortovanadato potenció remisiones completas cercanas al 20 % en ratones singénicos. En este modelo, se observó que el tratamiento de combinación conducía a una mayor acumulación de células T dentro del tumor (Fig. 6c, d).
Es importante destacar que IFNp e IFNy se unen a receptores distintos y conducen a la activación diferencial de factores de transcripción STAT1 y STAT2 (Transductor de Señal y Activador de la transcripción). La fosforilación de los STAT conduce a su dimerización y translocación nuclear para activar la transcripción de los genes estimulados por IFN (ISGs). Algunos de estos genes están regulados tanto por IFN de tipo I como de tipo II, mientras que otros están regulados selectivamente por uno u otro. Los IFN de tipo I inducen la fosforilación tanto de STAT1 como de STAT2, dando lugar a la formación del complejo ISGF3 compuesto por un heterodímero STAT1-STAT2 e IRF9 que se une a regiones promotoras específicas conocidas como elementos de respuesta estimulada por IFN (ISREs); mientras que los IFN de tipo II inducen principalmente la fosforilación de STAT1, dando lugar a la formación de homodímeros STAT1-STAT1 que se unen a elementos de secuencia activada por IFNy (GAS) (Mechanisms of type-1 and type-ii-interferon-mediated signaling, Plantanias, LC, Nat Rev Immunol, 2005). En consonancia con un cambio de una respuesta IFN de tipo I a una de tipo II, el tratamiento con vanadato inhibió la fosforilación de STAT2 inducida por IFNp y redujo su acumulación nuclear, pero no afectó de forma similar a STAT1, como se observó mediante inmunoelectrotransferencia (Fig. 11 d). Apoyando esta idea, la inmunofluorescencia también reveló que mientras que STAT1 activado se translocó al núcleo tras la infección de las células tratadas con vanadato, STAT-2 permaneció principalmente en el citoplasma (Fig. 11e). Sorprendentemente, esto sugiere, sin desear quedar ligado a la teoría, que el vanadato aumenta la actividad del OV a través de un mecanismo previamente no apreciado que convierte una respuesta IFN predominantemente antiviral de tipo I en una respuesta IFN de tipo II, a través de la represión preferencial de la activación de STAT2. Este “ recableado” de señales puede conducir a la regulación al alza de citocinas y quimiocinas proinflamatorias que favorecen la generación de una respuesta antitumoral dependiente de células T.
Los análisis de agrupación (Fig. 6a) revelaron un subconjunto de genes que codifican proteínas secretadas que fueron inducidas por compuestos de vanadio, VSVA51, o la combinación de ambos en comparación con las simulaciones. En consonancia con la inmunomodulación, el tratamiento de las células con compuestos a base de vanadio condujo a la regulación al alza de múltiples citocinas, sobre todo IL6, CXCL8, CCL20, TNF, IL17B y CXCL2. Como era de esperar, la infección por VSVA51 también condujo a la regulación al alza de múltiples pero diferentes conjuntos de citocinas, incluyendo TNFSF13B, CXCL10, IFNB1, CCL5, CXCL11 e IFNL1. Con la excepción de TNFSF13B, estas mismas citocinas se expresaron sustancialmente mucho más en las células infectadas por VSVA51 cotratadas con compuestos a base de vanadio, acorde con el aumento de la infección viral resultante del tratamiento con compuestos de vanadio en estas células (Fig. 1c). Es importante destacar que la combinación de VSVA51 y compuestos de vanadio condujo a la regulación al alza de múltiples citocinas no reguladas al alza por VSVA51 o compuestos de vanadio usados como agentes individuales. Lo más significativo es que esto incluye citocinas como CXCL9, CCL8, CCL3, IFNW1, IFNA10, IFNA17, INHBA, TNFSF15 e IFNA7. La validación por PCR en tiempo real de los datos de expresión génica reveló que los quimioatrayentes de las células T, como CXCL9, aumentaron enormemente (más de 100.000 veces con respecto al VSVA51 solo) en las células 786-0 tras el tratamiento de combinación con ortovanadato (Fig. 6b).
Materiales y métodos
Fármacos, productos químicos y citocinas. Los fármacos, productos químicos y citocinas y su respectivo proveedor y disolvente usados en este estudio se enumeran a continuación.
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Líneas celulares. Se obtuvieron células de cáncer de ratón CT26wt (colon), CT26-LacZ (colon), DBT (astrocitos) y Pan02 (páncreas); 786-0 (renal), células de cáncer humano SKOV3 (ovario); células de riñón de mono Vero; y los fibroblastos humanos normales GM-38 de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Las células se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco con alto contenido en glucosa HyQ (Hyclone, Waltham,MA) complementado con un 10 % de suero fetal de ternera (CanSera, Etobicoke, Ontario, Canadá). Todas las líneas celulares se incubaron a 37 °C en un incubador humidificado con un 5 % de CO2.
Virus y cuantificación. A lo largo de este estudio se usó el serotipo Indiana de VSV (VSVD51 o tipo silvestre) y se propagó en células Vero. Los VSVD51 que expresan GFP o luciferasa de luciérnaga son derivados recombinantes de VSVD51 descritos previamente [37]. Todos los virus se propagaron en células Vero y se purificaron en un gradiente de 5-50 % de Optiprep (Sigma, St Louis, MO) y todos los títulos virales se cuantificaron mediante el ensayo de placa estándar en células Vero como se ha descrito previamente [38].
Ensayo de viabilidad celular. La actividad metabólica de las células se evaluó usando alamarBlue (Bio-Rad, Mississauga, ON) según el protocolo del fabricante. Las células tratadas y/o infectadas en una placa de 96 pocillos (Corning, Manassas, VA) se trataron, a la hora indicada, con 10 ul de alamarBlue en cada pocillo y se incubaron durante 2 a 4 horas. La fluorescencia se midió a 590 nm tras excitación a 530 nm usando un Fluoroskan Ascent FL (Thermo Labsystems, Beverly, MA).
Micromatriz y análisis. Las células 786-0 se sembraron a una densidad de 1 x 106 en placas de 6 pocillos y se dejaron adherir durante toda la noche. Al día siguiente, las células se pretrataron durante 4 horas con ortovanadato (150 uM), metavanadato (150 uM) o el vehículo. Tras el pretratamiento, las células se infectaron por VSVA51 a una MOI de 0,01 o se dejaron sin infectar. Veinticuatro horas después de la infección, se recogió el ARN con un kit RNA-easy (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.). Posteriormente, se agruparon triplicados biológicos y se midió la calidad del ARN con el bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies) antes de la hibridación. La hibridación con Affymetrix Human PrimeView Array fue realizada por The Centre for Applied Genomics, The Hospital for Sick Children, Toronto, Canadá. Los datos de micromatrices se procesaron mediante una Consola de Análisis del Transcriptoma (TAC) 3.0 con los parámetros predeterminados del análisis de expresión diferencial a nivel de genes. Se calculó el cambio múltiple en la expresión génica para cada gen en relación con el control no infectado y no tratado. Los mapas de calor de los valores de expresión normalizados se generaron usando el paquete R pheatmap. Se generaron gráficos volcano de los valores de expresión génica usando R. El análisis de enriquecimiento de la ontología génica se evaluó usando GOrilla [39] tras la corrección para pruebas de hipótesis múltiples (Benjamini-Hochberg).
Modelos de tumor de ratón.
Modelos de CT26wt, CT26-LacZ, DBT, Pan02. A ratones Balb/c hembra de seis semanas de edad (o ratones C57BL/6 para el modelo Pan02) obtenidos de Charles River Laboratories (Wilmington, MA) se les administró tumores subcutáneos mediante inyección de 3 x 105 células singénicas de CT26wt, CT26-LacZ o DBT (o 1 x 105 para el modelo de Pan02) suspendidas en 100 |ul de PBS. 11 días (CT26wt, CT26-LacZ), 13 días (DBT) o 45 días (Pan02) después de la implantación, los tumores se trataron intratumoralmente una vez con un compuesto químico (disuelto en 25 |ul de PBS) o con el vehículo como se indica. Cuatro horas después, los tumores se inyectaron intratumoralmente con 1 x 108 ufp. (en 25 |ul de PBS) del virus indicado. El tamaño de los tumores se midió cada dos días con un calibrador electrónico. El volumen tumoral se calculó como = (longitud2 x anchura)/2. Para los estudios de supervivencia, los ratones se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron los 1.500 mm3. Para la formación de imágenes in vivo, se usó un IVIS (Perkin Elmer, Waltham, MA) como se ha descrito anteriormente [40][41]. La cuantificación de las intensidades de señal bioluminiscentes en cada ratón se midió mediante el uso del software Living Image® v2.50.1
Estudios de incremento escalonado de la dosis. A ratones Balb/c de seis semanas de edad se les administró por vía intraperitoneal varias dosis de compuestos químicos disueltos en PBS (aproximadamente 50 |ul) según lo indicado. Se controló la mortalidad y la pérdida de peso corporal durante 10-14 días. Los ratones fueron eutanasiados al final del experimento (cuando el tratamiento farmacológico provocó una pérdida de peso corporal superior al 20 %). Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices de los Servicios Veterinarios y de Cuidado de Animales de la Universidad de Ottawa para el cuidado de animales según los protocolos OHRI-2265 y OHRI-2264.
Modelo tumoral ex vivo. Se implantaron células de CT26wt o DBT en ratones Balb/c por vía subcutánea. Los ratones fueron sacrificados cuando los tumores alcanzaron un tamaño mínimo de 10 mm x 10 mm. Se extrajo tejido tumoral, pulmonar, del bazo y cerebral de los ratones, se cortó en pedazos de 2 mm de grosor y se extrajeron núcleos en trozos de 2 mm x 2 mm usando una biopsia con sacabocados. Cada núcleo de tejido se incubó en 1 ml de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con un 10 % de suero bovino fetal, HEPES 30 mM y se incubaron a 37 0C en una incubadora humidificada con un 5 % de CO2. Los núcleos se trataron durante 4 horas con la concentración indicada de compuesto químico. A continuación, los núcleos se infectaron por VSVA51 -GFP. Se tomaron imágenes de GFP de cada núcleo 24 horas después de la infección.
Inmunoelectrotransferencia. Las células se sedimentaron y se lisaron en hielo durante 30 minutos en HEPES 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 10 mM, Na4P2O7 10 mM, NaF 100 mM, Na3VO4 2 mM, cóctel inhibidor de proteasas (Roche) y 1 % Tritón X-100. Tras la determinación de proteínas mediante el ensayo de Bradford (Bio-Rad Protein Assay Solution, Mississauga, ON), se electroforizaron 20 μg de extracto celular clarificado en geles precast Mini-PROTEAN® TGX™ al 4-15 % (Bio-Rad) usando los sistemas Mini-PROTEAN® Tetra Cell (Bio-rad) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Hybond-C, Bio-Rad). Las transferencias se bloquearon con BSA al 5 % y se ensayaron con anticuerpos policlonales de conejo específicos para fosfo-Stat1 (Tyr701, n.° 9171, Cell Signalling Technology, Danvers, MA, usado a 1:1.000 durante 1 hora) y Stat1 (n.° 9172, Cell Signalling Technology, Danvers, MA, usado a 1:1.000), con anticuerpos monoclonales de conejo o ratón específicos para p-actina (n.° 4970, Cell Signalling Technology, Danvers, MA, usado a 1:1.000) o a-tubulina (sc-8035, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, usado a 1:500). A continuación, las transferencias se ensayaron con anticuerpos de cabra anti-conejo o de ratón conjugados con peroxidasa (Jackson Immunoresearch Labs, West Grove, PA). Las bandas se visualizaron con el sustrato quimioluminiscente Supersignal West Pico (Thermo Scientific Pierce, Rockford IL).
PCR cuantitativa en tiempo real. Las células 786-0 o Ct26wt se pretrataron durante 4 h con el compuesto químico o el vehículo, y se infectaron por VSVA51 a una MOI 0,01 o se dejaron sin infectar. 24 horas después de la infección, se recogieron las células y se realizó la extracción de ARN usando el kit Qiagen RNeasy (Qiagen). La cantidad y pureza del ARN se evaluó con un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific, Waltham, MA). El ARN se convirtió en ADNc con el kit de síntesis de ADNc de primera cadena RevertAid H Minus (Thermo Scientific). Las reacciones de PCR en tiempo real se realizaron según el protocolo del fabricante con el kit QuantiTect SYBR Green PCR (Qiagen) en un sistema 7500 PCR en tiempo real rápida (Applied Biosystems, Foster City, CA). Expresión génica relativa a GAPDH o b-actina. La inducción múltiple se calculó en relación con las muestras no tratadas/no infectadas para cada gen. A continuación, se enumeran los cebadores qPCR usados en este estudio.
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Elisa. Las células 786-0 se sembraron en placas de 12 pocilios, se pretrataron con el fármaco o con el vehículo durante 4 h y posteriormente se infectaron por VSVA51-GFP a la MOI indicada o se dejaron sin infectar. Los sobrenadantes celulares se recogieron en diferentes momentos tras la infección, como se indica. La cuantificación de IFN alfa e IFN beta se realizó usando el kit ELISA Verikine Human IFN alfa o IFN beta (PBL Assay Science) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los valores de absorbancia a 450 nM se midieron en un lector de microplacas Multiskan Ascent (MXT Lab Systems, Vienna, VA).
Transferencia del sobrenadante y experimento de filtrado. Las células 786-0, sembradas en placas de 12 pocillos, se pretrataron con el fármaco o el vehículo durante 4 h, y posteriormente se infectaron por VSVAM51-AG-GFP a una MOI de 10. Este virus puede infectar las células, pero no puede salir de la célula debido a la falta de la proteína G viral, lo que impide la liberación de partículas virales en el sobrenadante. 24 después de la infección, los sobrenadantes se filtraron a través de un filtro de 3 kDa (Millipore, Billerica, MA) antes de transferirlos a 786-0 frescas y procesarlos para su posterior análisis.
Cuantificación de células T tumorales. Se sacrificó a los ratones y se recogieron los tumores en los puntos temporales indicados. Los tumores se disociaron usando el kit de disociación MACS para tumores de ratón (Miltenyi Biotec, Alemania). La lisis de los glóbulos rojos se realizó usando el tampón de lisis ACK. Para la tinción de superficie, las células se incubaron con combinaciones de anti-CD45-BV786 y anti-CD3-AF300 (BD Biosciences, San Jose, CA) durante 30 minutos. A continuación, las células se lavaron dos veces y se resuspendieron en tampón FACS para su análisis mediante un citómetro de flujo BD LSRFortessa (BD Biosciences, San Jose, CA).
Matriz de citocinas. Los sobrenadantes de las células 786-0 tratadas se analizaron con el RayBio® Cytokine Antibody Arrays - Human Cytokine Antibody Array System 3 (RayBiotech, Norcross, GA). El ensayo se realizó según las instrucciones del fabricante. Los datos se analizaron usando ImageJ y Analysis Tool para AAH-CYT-3 (RayBiotech).
Análisis estadístico. La significación estadística se calculó mediante la prueba de la T de Student con la corrección de Welch, la prueba ANOVA unidireccional o bidireccional, según se indica en las leyendas de las figuras. Se usó la prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon para determinar las diferencias significativas en los gráficos de los estudios de supervivencia. Para todos los estudios, se consideró significativo un valor P inferior o igual a 0,05. Las barras de error representan el error estándar de la media. Los análisis estadísticos se realizaron usando GraphPad Prism 6.0 y Excel.
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto o composición que contiene vanadio para su uso en un método terapéutico para mejorar la infección, el crecimiento, la propagación o el título de un virus oncolítico de ARN en una célula cancerosa o tumoral, comprendiendo dicho método administrar dicho compuesto o composición que contiene vanadio a la célula cancerosa o tumoral antes de, después de o simultáneamente con la infección de la célula cancerosa o tumoral por el virus oncolítico de ARN.
2. El compuesto o composición que contiene vanadio para su uso según la reivindicación 1, en donde la administración del compuesto o composición que contiene vanadio mejora una actividad oncolítica, una actividad de muerte celular inducida por citocinas, y/o una actividad citotóxica del virus oncolítico de ARN.
3. El compuesto o composición que contiene vanadio para su uso según la reivindicación 1, en donde la administración del compuesto o composición que contiene vanadio potencia una respuesta inmunitaria a, regula al alza una respuesta de citocinas a, y/o mejora una actividad inmunoterapéutica del virus oncolítico de ARN.
4. El compuesto o composición que contiene vanadio para su uso según la reivindicación 1, en donde la administración del compuesto o composición que contiene vanadio a la célula cancerosa o tumoral está destinada al tratamiento de un tumor o cáncer en un sujeto que lo necesite.
5. El compuesto o composición que contiene vanadio para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el compuesto o composición que contiene vanadio comprende ortovanadato, metavanadato, oxitrietóxido (VOx) de vanadio (V), sulfato de óxido (VS) de vanadio (IV) y bismaltolato de oxovanadio (IV) (BMOV), tetrafluoruro de vanadio y tribromuro de vanadio, o una sal, solvato, hidrato, forma reducida u oxidada farmacéuticamente aceptable de los mismos.
6. El compuesto o composición que contiene vanadio para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el virus oncolítico de ARN comprende un reovirus, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la polio, virus de las paperas, virus del sarampión, virus de la gripe, virus Maraba (como MG-1), virus de la rabia, rotavirus, virus de la hepatitis A, virus de la rubéola, virus del dengue, virus de Chikungunya, virus respiratorio sincitial, LCMV, lentivirus, retrovirus de replicación o rabdovirus, o una variante o derivado de los mismos.
7. El compuesto o composición que contiene vanadio para su uso según la reivindicación 6, en donde el virus de ARN comprende un rabdovirus que es el virus de la estomatitis vesicular o un derivado o variante del mismo.
8. El compuesto o composición que contiene vanadio para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el virus de ARN comprende un virus seleccionado en condiciones de crecimiento específicas, sometido a una o más presiones de selección, modificado genéticamente usando una técnica recombinante, o cualquier combinación de los mismos.
9. El compuesto o composición que contiene vanadio para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la célula o sujeto es mamífero.
10. El compuesto o composición que contiene vanadio para su uso según la reivindicación 9, en donde la célula o sujeto es humano.
11. El compuesto o composición que contiene vanadio para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el cáncer o tumor comprende leucemia linfoblástica, leucemia mieloide, carcinoma corticosuprarrenal, cánceres relacionados con el SIDA, linfoma relacionado con el SIDA, cáncer anal, cáncer de apéndice, astrocitoma, tumor teratoide/rabdoide atípico, carcinoma basocelular, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer óseo, osteosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, glioma de tronco cerebral, tumor cerebral, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral/glioma maligno, craneofaringioma, ependimoblastoma, meduloblastoma, tumores del parénquima pineal de diferenciación intermedia, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales y pineoblastoma, glioma hipotalámico y de las vías visuales, tumores de la médula espinal, cáncer de mama, tumores bronquiales, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, linfoma del sistema nervioso central, cáncer de cuello de útero, cordoma, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, linfoma cutáneo de células T, tumores embrionarios, cáncer de endometrio, ependimoblastoma, ependimoma, cáncer de esófago, tumor de células germinales extracraneal, tumor de células germinales extragonadal, cáncer de vías biliares extrahepático, cáncer ocular, melanoma intraocular, retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (de estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), tumor de células del estroma gastrointestinal, tumores de células germinales, tumor trofoblástico gestacional, ovárico, extracraneal, extragonadal, glioma, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular (de hígado), histiocitosis, cáncer de células de Langerhans, linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, tumores de células de los islotes, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de laringe, leucemia linfocítica, leucemia de células pilosas, cáncer de labio y de la cavidad bucal, cáncer de hígado, cáncer pulmonar no microcítico, cáncer pulmonar microcítico, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, histiocitoma fibroso maligno óseo y osteosarcoma, meduloblastoma, meduloepitelioma, melanoma, melanoma intraocular, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, cáncer de cuello escamoso metastásico, cáncer de boca, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas, cáncer de la cavidad nasal y de senos paranasales, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer paratiroideo, cáncer de pene, cáncer faríngeo, feocromocitoma, tumores del parénquima pineal, pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, tumor hipofisario, neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, linfoma primario del sistema nervioso central, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer de células renales (de riñón), cáncer de pelvis renal y de uréter, cáncer de células de transición, carcinoma de las vías respiratorias, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, sarcoma uterino, cáncer de piel, carcinoma cutáneo de células de Merkel, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de células escamosas, cáncer escamoso de cuello, cáncer de estómago (gástrico), tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, linfoma de células T, cáncer testicular, cáncer de garganta, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, tumor trofoblástico, cáncer de uretra, cáncer de útero, cáncer de endometrio, sarcoma uterino, cáncer vaginal, cáncer de vulva o tumor de Wilms.
12. Una composición que contiene vanadio que comprende un virus oncolítico de ARN y un compuesto que contiene vanadio.
13. La composición de la reivindicación 12, en donde el virus de ARN es VSVA51.
14. La composición de la reivindicación 12, en donde el compuesto que contiene vanadio es un vanadato.
15. La composición de la reivindicación 12, en donde el compuesto que contiene vanadio es una sal farmacéuticamente aceptable de ortovanadato.
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