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ES2947409T3 - Profármacos de insulina a base de amida lipídica - Google Patents

Profármacos de insulina a base de amida lipídica

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ES2947409T3
ES2947409T3 ES15844864T ES15844864T ES2947409T3 ES 2947409 T3 ES2947409 T3 ES 2947409T3 ES 15844864 T ES15844864 T ES 15844864T ES 15844864 T ES15844864 T ES 15844864T ES 2947409 T3 ES2947409 T3 ES 2947409T3
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ES
Spain
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alkyl
insulin
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prodrug
acid
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Application number
ES15844864T
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English (en)
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Richard D Dimarchi
Binbin Kou
Fa Zhang
John P Mayer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Indiana University Research and Technology Corp
Original Assignee
Indiana University Research and Technology Corp
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Publication date
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Abstract

Se proporcionan formulaciones de profármacos de insulina y análogos de insulina en los que el péptido de insulina se ha modificado mediante un enlace de enlace amida de un elemento de profármaco de dipéptido. Los profármacos descritos en el presente documento tienen vidas medias prolongadas y se convierten en la forma activa en condiciones fisiológicas a través de una reacción no enzimática impulsada por la inestabilidad química. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Profármacos de insulina a base de amida lipídica
ANTECEDENTES
[0001] La insulina es una hormona peptídica compuesta por un heterodímero de dos cadenas que se deriva biosintéticamente de un precursor de proinsulina monocatenario de baja potencia mediante procesamiento enzimático. La insulina humana se compone de dos cadenas peptídicas (una "cadena A" (SEQ ID NO : 1) y una "cadena B" (SEQ ID NO : 2)) unidas por enlaces disulfuro y que tienen un total de 51 aminoácidos. La región C-terminal de la cadena B y las dos regiones terminales de la cadena A se asocian en una estructura tridimensional para ensamblar un sitio para la unión de alta afinidad al receptor de insulina.
[0002] La insulina demuestra una capacidad sin precedentes para reducir la glucosa en prácticamente todas las formas de diabetes. Desafortunadamente, su farmacología no es sensible a la glucosa y, como tal, es capaz de una acción excesiva que puede conducir a una hipoglucemia potencialmente mortal. La farmacología inconsistente es un sello distintivo de la terapia con insulina, de modo que es extremadamente difícil normalizar la glucosa en sangre sin que se produzca hipoglucemia. Además, la insulina nativa tiene una acción de corta duración y requiere modificación para hacerla adecuada para su uso en el control de la glucosa basal. Los enfoques establecidos para retrasar el inicio de la acción de la insulina incluyen la reducción de la solubilidad y la unión a la albúmina.
[0003] Tal como se muestra en la Fig. 3, las estrategias actuales para retrasar el inicio de la acción de la insulina en análogos comerciales de insulina, tales como Lantus & Degludec se basan en la creación de una reserva de insulina "insoluble" en los tejidos subcutáneos que se libera lentamente en el plasma a lo largo del tiempo (k1). La forma soluble presente en el plasma a continuación entra en el tejido diana de la insulina a una velocidad relativamente rápida (k2). Sin embargo, debido a la variabilidad asociada con el movimiento desde el tejido subcutáneo al plasma, cuando k es más lenta que k2, la captación de insulina por el tejido diana reflejará esta variabilidad. Los análogos comerciales de insulina Lantus y Degludec funcionan con ki siendo mucho más lenta que k 2. En consecuencia, es deseable un análogo de insulina que tenga una ki mucho más rápida que k2 ya que la variabilidad asociada con ki tendría un impacto mínimo en la absorción de insulina por el tejido diana.
[0004] Un derivado de insulina comercialmente disponible es [LysB29-tetradecanoil, des(B30)]insulina, donde LysB29 se ha acilado con un ácido graso C14 (Mayer et al., Peptide Science, 88, 5, 687-713). La presencia de la cadena de ácidos grasos aumenta la unión del péptido a la albúmina sérica, lo que aumenta la semivida en plasma. Sin embargo, este derivado tiene la desventaja de tener una potencia reducida in vivo. Además, este derivado de insulina también presenta variabilidad en la acción biológica de un paciente a otro. Esta variabilidad se debe en parte a las diferencias en la solubilización y el movimiento de las reservas del tejido subcutáneo a la circulación plasmática y al hecho de que k1 es más lenta que k2.
[0005] La química de los profármacos ofrece la oportunidad de controlar con precisión el inicio y la duración de la acción de la insulina después de la eliminación del sitio de administración y el equilibrio en el plasma a una concentración altamente definida. La virtud central de tal enfoque, en relación con los actuales análogos y formulaciones de insulina de acción prolongada, es que el reservorio de insulina no es el tejido adiposo subcutáneo donde tiene lugar la inyección, sino el compartimento sanguíneo (es decir, k1 es mucho más rápida que k2). Esto elimina la variabilidad en la absorción y solubilización encontrada con los derivados de insulina de inicio retardado de la técnica anterior. También permite la administración de la hormona peptídica por vías distintas a la inyección subcutánea.
[0006] La unión de la insulina a su receptor dará como resultado una estimulación biológica, pero también iniciará la desactivación posterior de la farmacología inducida por la insulina a través de la degradación enzimática del péptido de insulina. Una ventaja añadida de usar un derivado de profármaco de la insulina es que tal enfoque también prolonga la semivida biológica de la insulina basándose en una estrategia de inhibición del reconocimiento del profármaco por el receptor correspondiente. A pesar de estas ventajas asociadas con los derivados de profármacos, la naturaleza compleja de preparar dichos profármacos ha impedido, hasta ahora, la preparación de un derivado de profármaco eficaz de insulina. Para construir una hormona profármaco exitosa, se necesita una dirección estructural del sitio activo que pueda formar la base para la unión reversible de un elemento estructural profármaco. La dirección estructural debe ofrecer dos características clave; (1) el potencial para la modificación química selectiva y (2 ) la capacidad de proporcionar un alto grado de actividad en la forma nativa tras la eliminación del elemento estructural del profármaco. Los profármacos de insulina descritos en el presente documento se convierten químicamente en estructuras que pueden ser reconocidas por el receptor, en el que la velocidad de esta conversión química determinará el momento del inicio y la duración de la acción biológica in vivo. La química del profármaco descrita en la presente solicitud se basa en una reacción química intramolecular que no depende de aditivos químicos, enzimas o inhibidores de enzimas adicionales.
[0007] El profármaco ideal debería ser soluble en agua en condiciones fisiológicas (por ejemplo, un pH de 7,2 y 37 °C), y debería ser estable en forma de polvo para almacenamiento a largo plazo. También debe ser inmunológicamente silencioso y exhibir una actividad baja en relación con el fármaco original. Normalmente, el profármaco exhibirá no más del 10 % de la actividad del fármaco original, en una realización, el profármaco exhibe menos del 10 %, menos del 5 %, aproximadamente el 1 % o menos del 1 % de actividad en relación con el fármaco original. Además, el profármaco, cuando se inyecta en el cuerpo, debe convertirse cuantitativamente en el fármaco activo en un período de tiempo definido. Los solicitantes son los primeros en describir análogos de profármacos de insulina que cumplen cada uno de estos objetivos.
CARACTERÍSTICAS
[0008] La presente invención se refiere a un profármaco de insulina tal como se define en las reivindicaciones y a dicho profármaco para uso en el tratamiento de hiperglucemia o diabetes. La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende dicho profármaco de insulina.
[0009] Los fármacos basados en péptidos son medicamentos muy eficaces con una duración de acción relativamente corta y un índice terapéutico variable. La presente divulgación está dirigida a profármacos de insulina en los que el derivado de profármaco está diseñado para retrasar el inicio de la acción y prolongar la semivida del fármaco. El inicio retardado de la acción es ventajoso porque permite la distribución sistémica del profármaco antes de su activación. Por consiguiente, la administración de profármacos elimina las complicaciones provocadas por actividades máximas tras la administración y aumenta el índice terapéutico del fármaco original.
[0010] De acuerdo con una realización, un derivado de profármaco de insulina se prepara uniendo covalentemente un dipéptido a un péptido de insulina a través de un enlace amida en el que el dipéptido comprende un resto unido covalentemente (por ejemplo, un grupo alquilo o acilo no nativo) que es de suficiente tamaño para unirse irreversiblemente a una proteína plasmática de mamífero, tal como albúmina de suero de mamífero. La posterior eliminación del dipéptido a través de una reacción intramolecular, que da como resultado la formación de dicetopiperazina o dicetomorfolina, en condiciones fisiológicas y en ausencia de actividad enzimática, restaura la actividad completa del polipéptido de insulina. En una realización, los sustituyentes del dipéptido se seleccionan para producir una semivida de escisión de aproximadamente 2 a aproximadamente 168 horas o de aproximadamente 12 a aproximadamente 168 horas en suero y en condiciones fisiológicas. En una realización, los sustituyentes del dipéptido se seleccionan para producir una semivida de escisión de aproximadamente 0,5 días a aproximadamente 10 días o de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 días en suero y en condiciones fisiológicas.
[0011] De acuerdo con una realización, se describe en el presente documento un procedimiento para tratar la diabetes, o tratar/prevenir la hipertensión, que comprende administrar un profármaco de insulina. En una realización, el profármaco de insulina se administra diariamente en una dosificación fraccionada basada en la semivida del profármaco en suero en condiciones fisiológicas. Por ejemplo, si el profármaco tiene una semivida de n, en la que n es igual o superior a un día, la dosificación diaria es 1 /n de la dosificación óptima de la forma no profármaco correspondiente del péptido de insulina. Por lo tanto, un profármaco de insulina que tenga una semivida de 10 días se administraría diariamente a una décima parte de la dosificación óptima de la forma no profármaco correspondiente del péptido de insulina.
[0012] Según una realización, se proporciona un profármaco de insulina que comprende la estructura: A-B-C-Q;
en la que Q es un péptido de insulina;
A es un aminoácido o hidroxilácido que comprende una cadena lateral de (alquilo C1 - C8) NH2 , donde la cadena lateral de A está unida covalentemente a un resto que se une irreversiblemente a una proteína plasmática de mamífero, que incluye, por ejemplo, albúmina de suero de mamífero. En una realización, la cadena lateral de A está unida covalentemente a un grupo acilo o alquilo, que incluye un ácido graso, ácido cólico, sales biliares o un resto esteroideo de un ácido biliar, que tiene preferiblemente una longitud de al menos 16, 18 o 20 carbonos. En una realización, la cadena lateral de A está unida covalentemente a un grupo acilo C16 - C30 o un grupo alquilo C16 - C30;
B es un aminoácido N - alquilado; y
C es un enlace amida, X70 o X70X71 , donde X70 y X71 son aminoácidos seleccionados independientemente del grupo que consiste en glicina, ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico, ácido homoglutámico, arginina, lisina e histidina, donde A-B - Cestá unido a Q a través de un enlace amida a través de un grupo amino alifático de Q. Opcionalmente, el enlace entre la cadena lateral de A y el grupo acilo o alquilo se realiza a través de un espaciador, en el que el espaciador comprende uno o dos aminoácidos cargados. De acuerdo con una realización, la estructura A-B - Cestá unida a Q a través de una unión de enlace amida en un grupo amino alifático seleccionado del grupo amino alfa en el aminoácido N - terminal de la cadena A o la cadena B, o un grupo amino alifático en una cadena lateral de un aminoácido B3, B28 o B29 de Q. De acuerdo con una realización, B es un aminoácido N - alquilado con alquilo C1 - C18 , alquenilo C3 - C18 , (alquilo Cq - C4) (cicloalquilo C4 - C6), (alquilo C0 - C4) (heterociclo C3 - C5), o (alquilo C0 - C4) (arilo C6 - C10).
[0013] En otra realización, se proporciona un profármaco de insulina que comprende la estructura: A-B - C-Q; en la que Q es un pé
Figure imgf000004_0002
ptido de insulina y A-B-C comprende una estructura de:
en la que
R1 es (alquilo C1 - C6) NH-R9 o (alquilo C1 - C6) NH-S1 -R9;
R2 es H o alquilo C1 - C6 ;
R3 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C2 - C4, alquenilo C3 - C8 , (alquilo C0 - C4) (cicloalquilo C4 -C6 ), (alquilo C0 - C4) (heterocíclico C3 - C5), (alquilo C0 - C4) (arilo C6 - C10) y (alquilo C1 - C4) (heteroarilo C6 -C10 ) o R4 y R3 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5 o a miembros; R4 y R8 se seleccionan independiente del grupo que consiste en H, alquilo C1 - C18 , alquenilo C2 - C18 , (alquilo C1 - C18)OH, (alquilo C1 - C18 )SH, (alquilo C2 - C3)SCH3 , (alquilo C1 - C4) CONH2 , (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo C1 - C4) NH2 , (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 +) NH2 , (alquilo C0 - C4) (cicloalquilo C3 - C6 ), (alquilo C0 - C4) (heterocíclico C2 - C5), (alquilo C0 - C4) (arilo C6 - C10 )R7 , (alquilo C1 - C4) (heteroarilo C3 - Cg) y alquilo C1 -C12 (W1 ) alquilo C1 - C12 , en la que W 1 es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y O, o R4 y R8 junto con los átomos a los que están unidos forman un cicloalquilo C3 - C6 ;
R5 es NHR6 u OH; '
R6 es H o alquilo C1 - C8 ;
R7 se selecciona del grupo que consiste en H, OH, alquilo C1 - C18 , alquenilo C2 - C18 , (alquilo C0 - C4) NH2 y (alquilo C0 - C4)OH;
R9 se selecciona del grupo que consiste en acilo C18 - C30 ;
R10 , R11 , R12 y R13 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, CH2 , CHOH, CH2SH, (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo C1 - C4) NH2 , (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 +) NH2 y CH2 (heterocíclico C3-N2); y S1 es un espaciador que consiste en uno o dos aminoácidos cargados seleccionados del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico, ácido homoglutámico, arginina, lisina e histidina, en la que A-B - C está unida a Q a través de un enlace amida a través de un grupo amino alifático de Q. En una realización, R1 es (alquilo C1 - C6) NH-S1 -R9; R3 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C2 -C 4 ; R2 , R4, R11 y R13 son cada uno H; R5 es NH2 ; R8 es H o alquilo C1 - C8 ; R9 es acilo C18 - C30 ; R10 y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo C1 - C4) NH2 y (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 +) NH2 ; y S1 es un espaciador que comprende uno o dos aminoácidos cargados seleccionados del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico, ácido homoglutámico, arginina, lisina e histidina, y A-B - C está unida a Q a través de un enlace amida a través de la amina N - terminal de la cadena B de la insulina.
[0014] En una realización, se proporciona un profármaco de insulina que comprende la estructura: A-B-C-Q; en la que Q es un péptido de insulina y A-B-C comprende una estructura de:
Figure imgf000004_0001
R1 es alquilo C18 - C30, (alquilo C1 - C6) NH-R9 o (alquilo C1 - C6 ) NH-S1 -R9;
R3 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C2 - C4,
R4, R11 y R13 son cada uno H
R5 es NH2 ;
R8 es H o alquilo C1 - C8 ;
R9 es acilo C18 - C30; y
R10 y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en (alquilo Ci - C4) COOH, (alquilo C1 -C4) NH2 , (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 +) NH2 y CH2 (heterocíclico C3 - N2 ); y
S1 es un espaciador que consiste en uno o dos aminoácidos cargados seleccionados del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico, ácido homoglutámico, arginina, lisina e histidina, donde A-B-C está unido a Q a través de un enlace amida a través de un grupo amino alifático de Q. En una realización, R 1 es (CH2)4 -S1 -NHR9 o (CH2 )4 NHR9 ; R3 es alquilo C3 - C4 ; R5 es NH2 ; y R9 es acilo C18 - C28, y A-B-C está unido a Q a través de un enlace amida a través de la amina N - terminal de la cadena B de la insulina.
[0015] El péptido de insulina de los profármacos descritos en el presente documento puede comprender cualquiera de las insulinas conocidas por los expertos en la técnica que tienen actividad agonista en los receptores de insulina. De acuerdo con una realización, el péptido de insulina comprende una secuencia de cadena A de GIVEQCCX8SICSLYQLENYCX21 R44 (SEQ ID NO : 3) y una secuencia de cadena B de R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO : 20), en la que la cadena B está unida a la cadena A a través de enlaces disulfuro;
X8 se selecciona del grupo que consiste en treonina e histidina;
X21 se selecciona del grupo que consiste en asparagina, ornitina, glicina, alanina, treonina y serina;
X25 se selecciona del grupo que consiste en histidina y treonina;
X29 se selecciona del grupo que consiste en alanina, glicina y serina;
X30 se selecciona del grupo que consiste en histidina, ácido aspártico, ácido glutámico, ácido homocisteico y ácido cisteico;
X33 se selecciona del grupo que consiste en ácido aspártico y ácido glutámico;
X34 _ se selecciona del grupo que consiste en alanina y treonina;
X41 se selecciona del grupo que consiste en ácido glutámico, ácido aspártico o asparagina;
X42 se selecciona del grupo que consiste en alanina, ornitina, lisina y arginina;
X45 es tirosina o fenilalanina;
R22 se selecciona del grupo que consiste en AYRPSE (SEQ ID NO : 14), FVNQ (SEQ ID NO : 12), FVKQ (SEQ ID NO : 8), PGPE (SEQ ID NO : 11), un tripéptido glicina-prolina-ácido glutámico, un tripéptido valinaasparagina-glutamina, un dipéptido prolina-ácido glutámico, un dipéptido asparagina-glutamina, glutamina, ácido glutámico y una amina N - terminal; y
R44 es COOH o CONH2.
[0016] En una realización, el péptido de insulina de los profármacos descritos en el presente documento comprende una secuencia de cadena A de GIVEQCCX8SICSLYQLENYCX21 (SEQ ID NO : 3) y una secuencia de cadena B de R22-HLCGSHLVEALYLVCGERGFX45 (SEQ ID NO : 15), donde la cadena B está unida a dicha cadena A a través de enlaces disulfuro;
R22 es un enlace, o una secuencia de 1 a 4 aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en FVNQ (SEQ ID NO : 12), FVKQ (SEQ ID NO : 8), VNQ, NQ y Q;
X8 se selecciona del grupo que consiste en treonina e histidina;
X21 se selecciona del grupo que consiste en asparagina, lisina, glicina, alanina; y X45 es histidina, tirosina o fenilalanina.
[0017] En una realización, la cadena A comprende una secuencia GIVEQCCTSICSLYQLENYCN -R44 (SEQ ID NO : 1) y dicha cadena B comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO : 2) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT (SEQ ID NO : 9) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT (SEQ ID NO : 5) FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTEKT (SEQ ID NO : 6), donde R44 es COOH o CONH2.
[0018] En una realización, el aminoácido A y/o B del elemento profármaco es un aminoácido en la configuración del estereoisómero D. En algunas realizaciones de ejemplo, A es un aminoácido en la configuración del estereoisómero D y B es un aminoácido en la configuración del estereoisómero L. En algunas realizaciones de ejemplo, A es un aminoácido en la configuración del estereoisómero L y B es un aminoácido en la configuración del estereoisómero D. En algunas realizaciones de ejemplo, A es un aminoácido en la configuración del estereoisómero D y B es un aminoácido en la configuración del estereoisómero D. En una realización, B es un aminoácido N - alquilado, pero no es una prolina sustituida o un análogo de prolina.
[0019] De acuerdo con una realización, se proporciona un análogo de insulina en el que la cadena A del péptido de insulina comprende la secuencia GIVe Qc Ct SICSLYQLENYCN (SEQ ID NO : 1 ) y la cadena B comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en Z-FVNQHLCGSHLVEALy LVc GERGFFYTPkT (SEQ ID NO : 2), Z-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT (SEQ ID NO : 5), Z-FVKQHLCGSHLVEALYL VCGERGFFYTEKT (SEQ ID NO : 6) y Z-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT (SEQ ID NO : 9), donde Z es un péptido que comprende la estructura general:
Figure imgf000006_0001
donde Z está unido a Q a través de un enlace amida a través del aminoácido N - terminal de la cadena B, o un
grupo amino alifático en la cadena lateral de B28 o B29 de la cadena B;
R1 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo C18 - C30, (alquilo C1 - C4) NHR9, (alquilo C1 - C4)OS1 -R9, (alquilo C1 - C4)S-S1 -R9, (alquilo C1 - C4) CONH-S1 -R9, (alquilo C1 - C4) COO-S1 -R9, (alquilo C1 - C6 ) NH-S1 -R9, y (alquilo C0 - C4) (arilo C6 - C10 )-S1 -R9;
R2 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C 1 - C8, alquenilo (alquilo C1 - C4)OH, (alquilo C1 - C4)SH, (alquilo C2 - C3)SCH3, (alquilo C1 - C4) CONH2 , (alquilo C1 - C4) COOH,
(alquilo C1 - C4) NH2 , (alquilo C1 - C4) NHc (n H2 + ) NH2 , (alquilo C0 - C4) (cicloalquilo C3 - C (heterocíclico C2 - C5), (alquilo C0 - C4) (arilo C6 - C10 )R7 , (alquilo C1 - C4) (heteroarilo C3 - Cg) y alquilo C1 -C12 (W 1 ) alquilo C1 - C12 , en la que W 1 es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y O, o
R1 y R2 junto con los átomos a los que están unidos forman un cicloalquilo C3 - C12 o arilo;
R3 es alquilo C1 - C18, alquenilo C3 - C8, (alquilo C0 - C4) (cicloalquilo C4 - C6 ), (alquilo C0 - C4) (heterocíclico C3
-C5 ), (alquilo C0 - C4) (arilo C6 - C10 ) o R4 y R3 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5 ó a miembros;
R4 es H, alquilo C1 - C18 , (alquilo C1 - C6) NHR9 o (alquilo C1 - C6 ) NH-S1 -R9,
R5 es OH, o NHR6 o NHR9;
R6 es H, alquilo C1 - C8 ;
R7 se selecciona del grupo que consiste en H, OH y OR9;
R9 se selecciona del grupo que consiste en acilo C16 - C30 y alquilo C16 - C30;
cada uno de R11 y R1 3 es H;
R10 y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, CH2 , (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo
C1 - C4) NH2 , (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 +) NH2 , y CH2(heterocíclico C3 - N2 ); y
S1 es un enlace o un espaciador que consiste en uno o dos aminoácidos cargados seleccionados del grupo
que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico, ácido homoglutámico,
arginina, lisina e histidina, con la condición de que R1 es distinto de H cuando R4 es H o alquilo C1 - C18. En una realización R1 es (CH2 )4 - S1 - NHR9 o (CH2)4NHR9; R3 es alquilo C3 - C4; R5 es NH2 ; y R9 es acilo C18 - C28,
y Z está unido a la amina N - terminal de la cadena B de la insulina a través de un enlace amida .
[0020] De acuerdo con una realización, se proporcionan análogos de profármacos de insulina de cadena única.
En esta realización, el extremo carboxilo de la cadena B de la insulina humana, o un análogo funcional de la
misma, está unido covalentemente al extremo N de la cadena A de la insulina humana, o un análogo funcional
de la misma, en el que un elemento profármaco peptídico que tiene la estructura general:
Figure imgf000006_0002
está unido covalentemente al extremo N - terminal de la cadena A o B del péptido de insulina o a la cadena
lateral de un aminoácido correspondiente a las posiciones B3, B28 o B29 de la cadena B a través de un enlace
amida. En una realización, la cadena B está unida a la cadena A a través de un enlazador peptídico de 4 -i2 o
4-8 aminoácidos.
[0021] En una realización adicional, los profármacos de insulina tal como se describen en el presente documento se modifican adicionalmente para evitar la escisión del elemento profármaco peptídico durante el almacenamiento y antes de la administración a un paciente. En una realización, la amina N - terminal del elemento profármaco peptídico se une a un resto que permanece unido al extremo N - terminal hasta la administración al paciente. En una realización, el profármaco de insulina de fórmula A-B - C-Q comprende
además un resto escindible por enzima sérica unido a A a través de la amina N - terminal de A. En una realización, el resto escindible por enzima es un péptido que es escindido por la dipeptidil peptidasa IV (DPP -IV), incluyendo por ejemplo un dipéptido de Arg-Pro, Lys-Pro o Glu-Pro.
[0022] En otra realización, la solubilidad de los análogos de profármacos de insulina se potencia mediante el
enlace covalente de un resto hidrófilo al péptido. En una realización, el resto hidrófilo está unido a la amina alfa
N - terminal de la cadena B, a la cadena lateral de un aminoácido del péptido profármaco o a la cadena lateral de un aminoácido en la posición A9, A14 y A15 de la cadena A, o en la posición B1, B2, B3, B10, B22, B28 o B29 de la cadena B, incluyendo por ejemplo en la posición 28 de SEQ ID NO : 9 o el aminoácido en la posición 29 de SEQ ID NO : 2. En una realización, el resto hidrófilo es una cadena de polietilenglicol (PEG), que tiene un peso molecular seleccionado en el intervalo de aproximadamente 500 a aproximadamente 40.000 Dalton. En una realización, la cadena de polietilenglicol tiene un peso molecular seleccionado del rango de aproximadamente 500 a aproximadamente 5000 Dalton. En otra realización, la cadena de polietilenglicol tiene un peso molecular de aproximadamente 10000 a aproximadamente 20000 Dalton
[0023] La acilación o la alquilación pueden aumentar la semivida de los péptidos de insulina en circulación. La acilación o la alquilación pueden retrasar ventajosamente el inicio de la acción y/o prolongar la duración de la acción en los receptores de insulina tras la activación del profármaco. Los análogos de insulina se pueden acilar o alquilar en la misma posición de aminoácido en la que se une un resto hidrófilo, o en una posición de aminoácido diferente.
[0024] De acuerdo con una realización, se proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los nuevos análogos de profármacos de insulina descritos en el presente documento, preferiblemente con un nivel de pureza de al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97%, 98% o 99%, y un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones pueden contener un análogo de insulina A19 tal como se describe en el presente documento a una concentración de al menos 0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml. ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml, 14 mg/ml, 15 mg/ml, 16 mg/ ml, 17 mg/ml, 18 mg/ml, 19 mg/ml, 20 mg/ml, 21 mg/ml, 22 mg/ml, 23 mg/ml, 24 mg/ml, 25 mg/ml o superior. En una realización, las composiciones farmacéuticas comprenden soluciones acuosas que se esterilizan y, opcionalmente, se almacenan contenidas dentro de varios envases. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden un polvo liofilizado. Las composiciones farmacéuticas se pueden envasar además como parte de un kit que incluye un dispositivo desechable para administrar la composición a un paciente. Los envases o kits pueden estar etiquetados para almacenamiento a temperatura ambiente o a temperatura refrigerada.
[0025] De acuerdo con una realización, se proporciona un procedimiento mejorado para regular los niveles de glucosa en sangre en pacientes dependientes de insulina. El procedimiento comprende las etapas de administrar un análogo de profármaco de insulina de la presente descripción en una cantidad terapéuticamente eficaz para el control de la diabetes. En una realización, el análogo de profármaco de insulina se acila con un grupo acilo de tamaño suficiente para unirse a la albúmina con alta afinidad y/o se pegila con una cadena de PEG que tiene un peso molecular seleccionado del rango de aproximadamente 5000 a aproximadamente 40000 Dalton.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Fig. 1A y la Fig. 1B representan los resultados obtenidos a partir de una prueba comparativa de tolerancia a la insulina para el análogo de profármaco de insulina MIU-30a: B1 (Y16,L17,Y25)29a : A1 (dLys(Ac),Sar-aF19) (en el que el dipéptido acilado dLys(Ac),Sar está unido a través de un enlace amida al análogo de insulina a través de A194-aminoPhe). Se estima que la semivida del profármaco es de aproximadamente 20 horas. Los datos que se muestran en la Fig. 1A revelan que el compuesto original tiene una potencia baja, pero después de la incubación en plasma al 20 % durante 48 horas (generando "MIU-30c"), la potencia aumenta. • = control del vehículo, ▼= MIU 30a, 90 nm/kg; V= MIU 30c, 90 nm/kg; ♦= MIU 30a, 270 nm/kg; 0 = MIU 30c, 270 nm/kg. De manera similar, la Fig. 1B representa el AUC de glucosa en sangre después de 8 horas en ratones C57/Blk, lo que indica que la potencia de los compuestos aumenta con el tiempo de incubación in vitro antes de la administración.
La Fig. 2 es un gráfico que representa la actividad in vitro del profármaco acilado MIU 42: B1 (Y16,L17,Y25)29a : A (dLys(rE - C14),Sar-aF19) (en el que un aminoácido del elemento profármaco de dipéptido está acilado, unido en la posición gamma "rE" de un enlazador de ácido glutámico) en relación con el tiempo de incubación ex vivo en ACN al 30 %/PBS a pH 7,4 y 37 °C. Tal como muestran los datos, la actividad se restablece al compuesto original MIU 42 con un mayor tiempo de incubación ex vivo.
La figura 3 demuestra la terapia de insulina ultrabasal/basal/bolo. Las estrategias actuales para retrasar el inicio de la acción de la insulina en los análogos de insulina comerciales se basan en la creación de una reserva de insulina "insoluble" en los tejidos subcutáneos que se libera lentamente en el plasma con el tiempo (k1). La forma soluble presente en el plasma a continuación entra en el tejido diana de la insulina a una velocidad relativamente rápida (k2). La dosificación diaria fraccionada intencionada (qd) con una insulina soluble de acción prolongada (qw) minimiza la variabilidad inherente a la administración única.
La Fig. 4 muestra un dibujo esquemático que muestra la inactivación de un análogo de insulina mediante la unión irreversible de la albúmina sérica a un elemento profármaco lipidado unido a la amina N - terminal de la cadena B. La escisión posterior del elemento de dipéptido en condiciones fisiológicas y en ausencia de actividad enzimática da como resultado la activación de la insulina mediante la liberación del elemento profármaco de dipéptido.
La Fig. 5 proporciona un esquema sintético para preparar un análogo de insulina de dos cadenas que comprende un elemento profármaco lipidado unido a la amina N - terminal de la cadena B.
La Fig. 6 proporciona las semividas de escisión de un elemento profármaco lipidado unido a la amina N -terminal de la cadena B, en la que se modifica la N - alquilación del primer aminoácido y se varía la longitud de la cadena de alquilo se une al segundo aminoácido.
La Fig. 7 proporciona trazas de HLPC que muestran la degradación de un análogo de profármaco de insulina (Aib- (N -Me)Lys(C22) - Cys-(S-Propyl)B1-Insulin). El elemento profármaco del profármaco de insulina exhibió una semivida de aproximadamente 8 horas.
La figura 8 proporciona trazas de HLPC que muestran la degradación de un análogo de profármaco de insulina ((alfa-Me)Lys(C18)-Sar, B1-insulina). El elemento profármaco del profármaco de insulina exhibió una semivida de aproximadamente 6 horas.
La Fig. 9 proporciona trazas de HLPC que muestran la degradación de un análogo de profármaco de insulina (Lys(C18)-N(sBu)Gly,Gly B1-insulina). El elemento profármaco del profármaco de insulina exhibió una semivida de aproximadamente 16 horas.
La Fig. 10 demuestra el efecto de la N - alquilación en el segundo aminoácido del elemento profármaco de dipéptido sobre la velocidad de escisión del dipéptido.
La figura 11 proporciona realizaciones adicionales para la estructura del elemento profármaco.
La Fig. 12 proporciona un esquema sintético para introducir un grupo N - alquilo en un péptido mediante ácido 2-bromocarboxílico.
La figura 13 proporciona un esquema sintético para introducir un grupo N - alquilo en un péptido y sustitución de carbono alfa, mediante la reacción de Mitsunobu.
Las figuras 14A-14D proporcionan esquemas sintéticos adicionales. La Fig. 14A proporciona una síntesis en fase líquida para introducir un grupo N - alquilo en un péptido y sustitución de carbono alfa, mediante la reacción de Ugi. La Fig. 14B proporciona una síntesis en fase sólida alternativa para un tripéptido lipidado que tiene un aminoácido N - alquilado. La Fig. 14C proporciona un esquema sintético para la síntesis de profármacos de insulina lipidada utilizando A1, B29-di-tBoc-insulina. La Fig. 14D proporciona un esquema sintético para la síntesis de profármacos de insulina lipidada usando A1, B29-di-(Fmoc)-insulina.
Las figuras 15A-15C proporcionan datos para el experimento de tolerancia a la insulina en el que a los ratones modelo diabéticos se les administra insulina nativa o profármacos basados en insulina nativa. La Fig. 15A proporciona un resumen del procedimiento experimental y la Fig. 15B proporciona los resultados, mostrando un tiempo de acción prolongado para el análogo de insulina profármaco acilado en la reducción de los niveles de glucosa en sangre. La Fig. 15C demuestra que los niveles de insulina en sangre se correlacionan con los niveles de glucosa en sangre.
Las figuras 16A-16C proporcionan datos para el experimento de tolerancia a la insulina en el que a los ratones modelo diabéticos se les administra insulina nativa o profármacos basados en insulina nativa. La Fig. 16A proporciona un resumen del procedimiento experimental y la Fig. 16B proporciona los resultados, mostrando un tiempo de acción prolongado para el análogo de insulina profármaco acilado en la reducción de los niveles de glucosa en sangre. La Fig. 16C proporciona datos para ratones diabéticos en ayunas a los que se les administró insulina nativa o profármacos de insulina, que muestran el cambio en la glucosa en sangre después de la administración.
Las figuras 17A y 17B proporcionan datos para el experimento de tolerancia a la insulina en el que a los ratones normales se les administra insulina nativa o profármacos basados en insulina nativa. La Fig. 17A proporciona un resumen del procedimiento experimental y la Fig. 17B proporciona los resultados, mostrando un tiempo de acción prolongado para el análogo de insulina profármaco acilado en la reducción de los niveles de glucosa en sangre.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
DEFINICIONES
[0027] Al describir y reivindicar la presente invención, se utilizará la siguiente terminología de acuerdo con las definiciones que se exponen a continuación.
[0028] Tal como se usa en el presente documento, el término "profármaco" se define como cualquier compuesto que experimenta una modificación química antes de exhibir sus efectos farmacológicos.
[0029] Un "polipéptido bioactivo" se refiere a polipéptidos que son capaces de ejercer un efecto biológico in vitro y/o in vivo.
[0030] Tal como se usa en el presente documento, el término "aminoácido" abarca cualquier molécula que contenga grupos funcionales tanto amino como carboxilo, donde los grupos amino y carboxilato están unidos al mismo carbono (el carbono alfa). El carbono alfa puede tener opcionalmente uno o dos sustituyentes orgánicos adicionales. La designación de un aminoácido sin especificar su estereoquímica pretende abarcar la forma L o D del aminoácido o una mezcla racémica. Sin embargo, en el caso de que un aminoácido se designe por su código de tres letras e incluya un número en superíndice, la forma D del aminoácido se especifica mediante la inclusión de una d minúscula antes del código de tres letras y el número en superíndice (por ejemplo, dLys'1), donde la designación que carece de la d minúscula (por ejemplo, Lys '1) pretende especificar la forma L nativa del aminoácido. En esta nomenclatura, la inclusión del número en superíndice designa la posición del aminoácido en la secuencia peptídica de IGF, donde los aminoácidos que están ubicados dentro de la secuencia de IGF se designan mediante números en superíndice positivos numerados consecutivamente desde el extremo N - terminal. Los aminoácidos adicionales unidos al péptido IGF, ya sea en el extremo N o a través de una cadena lateral, se numeran comenzando con 0 y aumentando en valor entero negativo a medida que se eliminan más de la secuencia de IGF. Por ejemplo, la posición de un aminoácido dentro de un profármaco de dipéptido unido al extremo N - terminal de IGF se denomina aa-1 -aa0-IGF, en la que aa0 representa el aminoácido carboxi terminal del dipéptido y aa'1 designa el aminoácido amino terminal del dipéptido.
[0031] Tal como se usa en el presente documento, el término "hidroxiácido" se refiere a aminoácidos que se han modificado para reemplazar el grupo amino del carbono alfa con un grupo hidroxilo.
[0032] Tal como se usa en el presente documento, el término "aminoácido no codificado" abarca cualquier aminoácido que no sea un isómero L de cualquiera de los siguientes 20 aminoácidos: Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr.
[0033] Un "dipéptido" es un compuesto formado por la unión de un alfa aminoácido o un alfa hidroxiácido a otro aminoácido, a través de un enlace peptídico.
[0034] Un elemento profármaco peptídico, tal como se define en el presente documento, es un péptido que comprende un dipéptido autoescindible N - terminal, en el que el dipéptido experimenta espontáneamente una escisión química de un enlace amida, en condiciones fisiológicas, para formar una dicetopiperazina o dicetomorfolina. El elemento profármaco peptídico puede consistir en el dipéptido o puede incluir aminoácidos adicionales unidos mediante enlaces amida al extremo carboxilo del dipéptido autoescindible.
[0035] Tal como se usa en el presente documento, el término "escisión química", en ausencia de cualquier otra designación, abarca una reacción no enzimática que da como resultado la ruptura de un enlace químico covalente.
[0036] Un resto escindible de enzima sérica es un compuesto que puede unirse covalentemente a un péptido para formar una estructura estable en ausencia de actividad enzimática. Tras la exposición a las enzimas que se encuentran en los sueros de los mamíferos, el resto completo se escinde del péptido. Por ejemplo, el resto escindible por la enzima sérica puede ser un péptido escindible por la enzima sérica que está unido a un polipéptido a través de un enlace amida, en el que el péptido escindible por la enzima es susceptible de ser escindido por la dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV).
[0037] Un "polipéptido bioactivo" se refiere a polipéptidos que son capaces de ejercer un efecto biológico in vitro y/o in vivo.
[0038] Tal como se usa en el presente documento, una referencia general a un péptido pretende abarcar péptidos que tienen extremos amino y carboxilo modificados. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que designa los aminoácidos estándar pretende abarcar aminoácidos estándar en los extremos N y C, así como un hidroxilácido correspondiente en el extremo N y/o un aminoácido C-terminal correspondiente modificado para comprender un grupo amida en lugar del ácido carboxílico terminal.
[0039] Tal como se usa en el presente documento, un aminoácido "acilado" es un aminoácido que comprende un grupo acilo que no es nativo de un aminoácido natural, independientemente de los medios por los que se produce. Los procedimientos de ejemplo para producir aminoácidos acilados y péptidos acilados son conocidos en la técnica e incluyen la acilación de un aminoácido antes de la inclusión en el péptido o la síntesis del péptido seguido de la acilación química del péptido. En una realización, el grupo acilo hace que el péptido tenga uno o más de (i) una semivida prolongada en circulación, (ii) un inicio de acción retrasado, (iii) una duración de acción prolongada, (iv) una mejor resistencia a proteasas, tales como DPP-IV, y (v) mayor potencia en el receptor de péptido de insulina.
[0040] Tal como se usa en el presente documento, un aminoácido "alquilado" es un aminoácido que comprende un grupo alquilo que no es nativo de un aminoácido natural, independientemente de los medios por los que se produce. Los procedimientos de ejemplo para producir aminoácidos alquilados y péptidos alquilados son conocidos en la técnica e incluyen la alquilación de un aminoácido antes de la inclusión en el péptido o la síntesis del péptido seguida de la alquilación química del péptido. Sin atenerse a ninguna teoría en particular, se cree que la alquilación de péptidos logrará efectos similares, si no los mismos, que la acilación de los péptidos, por ejemplo, una semivida prolongada en circulación, un inicio de acción retardado, una duración prolongada de acción, una mayor resistencia a las proteasas, tales como la DPP-IV, y una mayor potencia en el receptor del péptido de insulina.
[0041] Tal como se usa en el presente documento, el término "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera de los portadores farmacéuticos estándar, tales como una solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones, tales como una emulsión de aceite/agua o agua/aceite, y varios tipos de agentes humectantes. El término también abarca cualquiera de los agentes aprobados por una agencia reguladora del gobierno federal de los EE. UU. o enumerados en la Farmacopea de los EE. UU. para su uso en animales, incluidos los humanos.
[0042] Tal como se usa en el presente documento, el término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a sales de compuestos que retienen la actividad biológica del compuesto original, y que no son indeseables biológicamente o de otro modo. Muchos de los compuestos descritos en el presente documento son capaces de formar sales de ácidos y/o bases en virtud de la presencia de grupos amino y/o carboxilo o grupos similares a los mismos.
[0043] Las sales de adición de bases farmacéuticamente aceptables se pueden preparar a partir de bases inorgánicas y orgánicas. Las sales derivadas de bases inorgánicas incluyen solo a modo de ejemplo, sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio y magnesio. Las sales derivadas de bases orgánicas incluyen, pero no se limitan a, sales de aminas primarias, secundarias y terciarias.
[0044] Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables se pueden preparar a partir de ácidos inorgánicos y orgánicos. Las sales derivadas de ácidos inorgánicos incluyen ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico. Las sales derivadas de ácidos orgánicos incluyen ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-tolueno-sulfónico, ácido salicílico.
[0045] Tal como se usa en el presente documento, el término "tratar'' incluye la profilaxis del trastorno o afección específico, o el alivio de los síntomas asociados con un trastorno o afección específico y/o la prevención o eliminación de dichos síntomas. Por ejemplo, tal como se usa en el presente documento, el término "tratar la diabetes" se referirá en general a mantener los niveles de glucosa en sangre cerca de los niveles normales y puede incluir aumentar o disminuir los niveles de glucosa en sangre dependiendo de una situación dada.
[0046] Tal como se usa en el presente documento, una cantidad "eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un profármaco se refiere a una cantidad no tóxica pero suficiente del profármaco para proporcionar el efecto deseado. Por ejemplo, un efecto deseado sería la prevención o el tratamiento de la hiperglucemia. La cantidad que es "eficaz" variará de sujeto a sujeto, dependiendo de la edad y condición general del individuo, modo de administración. Por lo tanto, no siempre es posible especificar una "cantidad eficaz" exacta. Sin embargo, un experto en la materia puede determinar una cantidad "eficaz" apropiada en cualquier caso individual usando experimentación rutinaria.
[0047] El término "parenteral" significa no a través del canal alimentario, sino por alguna otra ruta, tal como intranasal, inhalación, subcutánea, intramuscular, intraespinal o intravenosa.
[0048] Tal como se usa en el presente documento, el término "péptido de insulina nativo" pretende designar el heterodímero de 51 aminoácidos que comprende la cadena A de SEQ ID NO : 1 y la cadena B de SEQ ID NO : 2, así como los análogos de insulina de cadena sencilla que comprenden SEQ ID NOS: 1 y 2. El término "péptido de insulina" como se usa en el presente documento, en ausencia de un lenguaje descriptivo adicional, pretende abarcar el heterodímero de 51 aminoácidos que comprende la cadena A de SEQ ID NO : 1 y la cadena B de SEQ ID NO : 2, así como sus análogos de insulina de cadena sencilla (incluidos, por ejemplo, los divulgados en la solicitud internacional publicada WO96/34882 y patente de EE.UU. 6.630.348), e incluye heterodímeros y análogos de cadena sencilla que comprenden derivados modificados de la cadena A y/o cadena B nativa, incluida la modificación del aminoácido en la posición A19, B16 o B25 a una 4-amino fenilalanina o una o más sustituciones de aminoácidos en posiciones seleccionadas de A5, A8, A9, A10, A12, A14, A15, A17, A18, A21, B1, B2, B3, B4, B5, B9, B10, B13, B14, B17, B20, B21, B22, B23, B26, B27, B28, B29 y B30 o eliminaciones de cualquiera o todas las posiciones B1-4 y B26-30. Un "análogo de profármaco de insulina", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un péptido de insulina (o un análogo de insulina basado en IGF1, tal como se describe en el Ejemplo 9) que ha sido modificado por la unión covalente de un dipéptido, a través de un enlace amida, en una ubicación que interfiere con la actividad de la insulina o del análogo de insulina basado en IGF1 (por ejemplo, la capacidad de interactuar con la insulina y los receptores de IGF-1).
[0049] Tal como se usa en el presente documento, el término "análogo de insulina de cadena sencilla" abarca un grupo de proteínas estructuralmente relacionadas en las que las cadenas A y B de insulina están unidas covalentemente como una cadena lineal.
[0050] Tal como se usa en el presente documento, una "modificación" de un aminoácido se refiere a una sustitución, adición o eliminación de un aminoácido, o la derivación de un aminoácido mediante la adición y/o eliminación de grupos químicos al/del aminoácido, e incluye la sustitución o la adición de cualquiera de los 20 aminoácidos que se encuentran comúnmente en las proteínas humanas, así como los aminoácidos atípicos o no naturales. Las fuentes comerciales de aminoácidos atípicos incluyen Sigma-AldriCH(Milwaukee, WI), ChemPep Inc. (Miaml, FL) y Genzyme Pharmaceuticals (Cambridge, m A). Los aminoácidos atípicos pueden adquirirse de proveedores comerciales, sintetizarse de novo o modificarse químicamente o derivatizarse a partir de aminoácidos naturales.
[0051] Tal como se usa en el presente documento, una "sustitución" de aminoácidos se refiere a la sustitución de un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido diferente. A lo largo de la solicitud, todas las referencias a una posición de aminoácido en particular por letra y número (por ejemplo, posición A5) se refieren al aminoácido en esa posición de la cadena A (por ejemplo, posición A5) o de la cadena B (por ejemplo, posición B5) en la respectiva cadena A (SEQ ID NO : 1) o cadena B (SEQ ID NO : 2) de insulina humana nativa o la posición de aminoácido correspondiente en cualquiera de sus análogos. Por ejemplo, una referencia en el presente documento a "posición B28" en ausencia de más elaboración significaría la posición B27 correspondiente de la cadena B de un análogo de insulina en el que se ha eliminado el primer aminoácido de SEQ ID NO : 2.
[0052] Tal como se usa en el presente documento, el término "sustitución de aminoácidos conservativa" se define en el presente documento como intercambios dentro de uno de los siguientes cinco grupos:
I. Pequeños residuos alifáticos, apolares o ligeramente polares:
Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;
II. Residuos polares cargados negativamente y sus amidas:
Asp, Asn, Glu, Gln;
III Residuos polares cargados positivamente:
His, Arg, Lys; Ornitina (Orn)
IV. Residuos grandes, alifáticos, no polares:
Met, Leu, Ile, Val, Cys, Norleucina (Nle), homocisteína
V. Residuos grandes, aromáticos:
Phe, Tyr, Trp, acetil fenilalanina
[0053] El término general "cadena de polietilenglicol" o "cadena de PEG", tal como se usa en este documento, se refiere a mezclas de polímeros de condensación de óxido de etileno y agua, en una cadena lineal o ramificada, representada por la fórmula general H(OCH2CH2 )nOH, donde n es al menos 9. A falta de cualquier otra caracterización, se pretende que el término incluya polímeros de etilenglicol con un peso molecular total promedio seleccionado del intervalo de 500 a 80.000 Dalton. "Cadena de polietilenglicol" o "cadena de PEG" se usa en combinación con un sufijo numérico para indicar el peso molecular promedio aproximado de la misma. Por ejemplo, PEG-5000 se refiere a una cadena de polietilenglicol que tiene un promedio de peso molecular total de aproximadamente 5.000 Dalton.
[0054] Tal como se usa en el presente documento, el término "pegilado" y términos similares se refieren a un compuesto que se ha modificado desde su estado nativo uniendo una cadena de polietilenglicol al compuesto. Un "polipéptido pegilado" es un polipéptido que tiene una cadena de PEG unida covalentemente al polipéptido.
[0055] Tal como se usa en el presente documento, un "enlazador" es un enlace, molécula o grupo de moléculas que une dos entidades separadas entre sí. Los enlazadores pueden proporcionar una separación óptima de las dos entidades o pueden proporcionar además un enlace lábil que permita que las dos entidades se separen entre sí. Los enlaces lábiles incluyen grupos fotoescindibles, restos lábiles a ácidos, restos lábiles a bases y grupos escindibles con enzimas.
[0056] Tal como se usa en el presente documento, un "dímero de insulina" es un complejo que comprende dos péptidos de insulina unidos covalentemente entre sí a través de un enlazador. El término dímero de insulina, cuando se usa sin ningún lenguaje calificativo, abarca tanto los homodímeros de insulina como los heterodímeros de insulina. Un homodímero de insulina comprende dos subunidades idénticas (cada una de las cuales comprende una cadena A y B), mientras que un heterodímero de insulina comprende dos subunidades (cada una de las cuales comprende una cadena A y B) que difieren, aunque las dos subunidades son sustancialmente similares entre sí.
[0057] El término "alquilo C1 - Cn" en el que n puede ser de 1 a n, tal como se usa en el presente documento, representa un grupo alquilo lineal o ramificado que tiene desde uno hasta el número especificado de átomos de carbono. Los grupos de alquilo C1 - C6 típicos incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, N -propilo, isopropilo, butilo, iso-butilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, hexilo.
[0058] El término "alquenilo C2 - Cn" tal como se usan en el presente documento, representa un grupo ramificado o lineal olefínicamente insaturado que tiene de 2 al número especificado de átomos de carbono y al menos un doble enlace. Los ejemplos de dichos grupos incluyen, pero sin limitación, 1-propenilo, 2-propenilo ( - CH2 -CH=CH2 ), 1,3-butadienilo, ( - CH=CHCH=CH2 ), 1-butenilo ( - CH=CHCH2CH6 ), hexenilo, pentenilo.
[0059] El término "alquinilo C2- Cn" representa un grupo ramificado o lineal insaturado que tiene de 2 a n átomos de carbono y al menos un enlace triple. Los ejemplos de tales grupos incluyen, pero no se limitan a, 1-propinilo, 2-propinilo, 1 -butinilo, 2-butinilo, 1 -pentinilo.
[0060] Tal como se usa en el presente documento, el término "arilo" se define como un sistema de anillos carbocíclicos monocíclicos o bicíclicos que tienen uno o dos anillos aromáticos que incluyen fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, indenilo. El tamaño del anillo arilo y la presencia de sustituyentes o grupos de unión se indican designando el número de carbonos presentes. Por ejemplo, el término "(alquilo C1 - C3) (arilo C6 -C10)" se refiere a un arilo de 6 a 10 miembros que está unido a un resto principal a través de una cadena de alquilo de uno a tres miembros.
[0061] El término "heteroarilo", tal como se usa en el presente documento, se define como un sistema de anillos monocíclicos o bicíclicos que contienen uno o dos anillos aromáticos y que contienen al menos un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre en un anillo aromático. El tamaño del anillo de heteroarilo y la presencia de sustituyentes o grupos de unión se indican designando el número de carbonos presentes. Por ejemplo, el término "(alquilo C1 - Cn) (heteroarilo C5 - Ce)" se refiere a un heteroarilo de 5 ó 6 miembros que está unido a un resto original a través de una cadena de alquilo de uno a "n" miembros.
[0062] El término "cicloalquilo C3 - Cn" se define como un anillo no aromático, monocíclico o policíclico que comprende átomos de carbono e hidrógeno, indicando el número de subíndice el número de átomos de carbono presentes. Por ejemplo, el término cicloalquilo C3 - C8 representa los compuestos ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y ciclooctilo.
[0063] El término " heterocíclico C3 - Cn" se define como un sistema de anillos cicloalquilo que contienen de uno a "n - 1 " heteroátomos en el que los heteroátomos se seleccionan del grupo que consiste en oxígeno, azufre y nitrógeno. Por ejemplo, la frase "heterociclo de 5 miembros" o "heterociclo C5” incluye, pero no se limita a, heterociclos de 5 miembros que tienen un heteroátomo (por ejemplo, tiofenos, pirroles, furanos); heterociclos de 5 miembros que tienen dos heteroátomos en las posiciones 1,2 o 1,3 (por ejemplo, oxazoles, pirazoles, imidazoles, tiazoles, purinas); heterociclos de 5 miembros que tienen tres heteroátomos (por ejemplo, triazoles, tiadiazoles).
[0064] El término "anillo de C3 - Cn miembros", tal como se usa en el presente documento, se define como una estructura de anillo de hidrocarburo saturado o insaturado que comprende un total de tres a "n" elementos unidos entre sí para formar un anillo, en el que los elementos del anillo se seleccionan del grupo que consiste en C, O, S y N. Se pretende que el término abarque cicloalquilos, heterociclos, arilos y heteroarilos.
[0065] Tal como se usa en el presente documento, el término "halo" se define como uno o más miembros del grupo que consiste en flúor, cloro, bromo y yodo.
[0066] Tal como se usa en el presente documento, el término "aminoácido cargado" se define como un aminoácido que comprende una cadena lateral que está cargada negativamente (es decir, desprotonada) o cargada positivamente (es decir, protonada) en solución acuosa a pH fisiológico. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico y ácido homoglutámico, mientras que los aminoácidos cargados positivamente incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados incluyen los aminoácidos cargados entre los 20 aminoácidos que se encuentran comúnmente en las proteínas humanas, así como los aminoácidos atípicos o no naturales.
[0067] Tal como se usa en el presente documento, el término "aminoácido ácido" se define como un aminoácido que comprende un segundo resto ácido (es decir, distinto del grupo a - carboxilo que poseen todos los aminoácidos), que incluye, por ejemplo, un grupo ácido carboxílico o ácido sulfónico.
Tal como se usa en el presente documento, el término "paciente" sin otra designación pretende abarcar cualquier animal domesticado vertebrado de sangre caliente (incluidos, por ejemplo, ganado, caballos, gatos, perros y otras mascotas), mamíferos y seres humanos.
[0068] Tal como se usa en el presente documento, la frase "unión irreversible a proteína plasmática" o "unión irreversible a albúmina sérica" se define como una unión de alta afinidad en la que la proteína plasmática/albúmina sérica unida no se libera sustancialmente en condiciones fisiológicas. En el contexto de una insulina acilada, un grupo acilo o alquilo que es lo suficientemente grande como para "unirse irreversiblemente" a la albúmina se define como un grupo acilo o alquilo que suprime la capacidad del péptido de insulina subyacente para reducir la glucosa en sangre tras la administración a un paciente a menos de 10 % de lo logrado con el mismo péptido de insulina desprovisto del grupo acilo o alquilo, en el transcurso de 6 horas después de la administración.
[0069] La presente invención se refiere a un profármaco de insulina tal como se define en las reivindicaciones y a dicho profármaco para uso en el tratamiento de hiperglucemia o diabetes. La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende dicho profármaco de insulina.
[0070] La presente descripción proporciona derivados de profármacos de insulina que se formulan para retrasar el inicio de la acción y aumentar la semivida del péptido de insulina, mejorando así el índice terapéutico del péptido de insulina subyacente. La química del profármaco de insulina descrita en el presente documento permite la activación del profármaco a través de un mecanismo de degradación no enzimático. La química del profármaco divulgada puede unirse químicamente a restos orgánicos que se unen irreversiblemente a la proteína plasmática de mamíferos y, por lo tanto, inactivan el péptido de insulina tras la administración. En una realización, los restos orgánicos son grupos alquilo o acilo de tamaño suficiente para unirse a la albúmina sérica. En otra realización, el resto orgánico es un ácido biliar. El ácido biliar puede ser cualquier ácido biliar adecuado, incluyendo ácido cólico, ácido quenodesoxicólico, ácido desoxicólico, ácido litocólico, ácido taurocólico, ácido glicocólico y ácido de colesterol.
[0071] En una realización específica, el análogo de insulina comprende un ácido de colesterol, que está unido a un residuo Lys del análogo de insulina a través de un espaciador des-amino Cys alquilado, es decir, un espaciador de ácido 3-mercaptopropiónico alquilado. El espaciador des-amino Cys alquilado puede ser, por ejemplo, un espaciador des-amino Cys que comprende un resto de dodecaetilenglicol.
[0072] Esta nueva química de profármacos biológicamente amigable se degrada espontáneamente bajo condiciones fisiológicas (por ejemplo, pH de aproximadamente 7, a 37 °C en un medio acuoso), en donde la escisión del elemento profármaco separa la proteína plasmática unida (por ejemplo, albúmina) del péptido de insulina, restaurando la actividad del péptido de insulina. En una realización, un grupo acilo o alquilo está unido al elemento profármaco peptídico descrito en el presente documento, en el que el grupo alquilo o acilo es lineal o ramificado, y en una realización es una cadena principal hidrocarbonada de C18 a C30. Por ejemplo, el grupo acilo o alquilo puede ser cualquiera de una cadena principal de hidrocarburo de C18, C20, C22, C24, C26, C28 o C30. En una realización, la química del profármaco divulgada está químicamente unida a un ácido graso C16 a C20, por ejemplo, un ácido graso C18 o un ácido graso C20. La duración del derivado de profármaco se determina mediante la selección de la secuencia del elemento profármaco peptídico y de este modo permite la flexibilidad en la formulación del profármaco.
[0073] En una realización, se proporciona un profármaco que tiene un semitiempo de activación no enzimática (t-i/2) de entre aproximadamente 2 a aproximadamente 240 horas, de aproximadamente 2 a aproximadamente 168 horas, de aproximadamente 6 a aproximadamente 168 horas, o de aproximadamente 12 a aproximadamente 168 horas, o de aproximadamente 12 a aproximadamente 120 horas en condiciones fisiológicas. En una realización, la semivida de escisión del elemento profármaco en suero y en condiciones fisiológicas es de aproximadamente 0,5 días a aproximadamente 10 días. Las condiciones fisiológicas que se describen en el presente documento incluyen una temperatura de aproximadamente 35 a 40 °C y un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,4 y, más típicamente, incluyen un pH de 7,2 a 7,4 y una temperatura de 36 a 38 °C en un medio acuoso. En una realización, un péptido, capaz de experimentar la formación de dicetopiperazina en condiciones fisiológicas, se une covalentemente mediante un enlace amida a un grupo amino alifático del péptido de insulina.
[0074] De manera ventajosa, la velocidad de escisión y, por tanto, la activación del profármaco, depende de la estructura y la estereoquímica del pro-resto de dipéptido y también de la fuerza del nucleófilo. Los profármacos descritos en el presente documento finalmente se convertirán químicamente en estructuras que pueden ser reconocidas por el receptor nativo del fármaco, en el que la velocidad de esta conversión química determinará el tiempo de inicio y la duración de la acción biológica in vivo. La química del profármaco descrita en esta solicitud se basa en una reacción química intramolecular que no depende de enzimas o aditivos químicos adicionales. La velocidad de conversión está controlada por la naturaleza química del sustituyente de dipéptido y su escisión en condiciones fisiológicas. Dado que el pH fisiológico y la temperatura están estrictamente regulados dentro de un rango altamente definido, la velocidad de conversión del profármaco a fármaco mostrará una capacidad de reproducción elevada intrapacientes e interpacientes.
[0075] Tal como se describe en el presente documento, se proporcionan profármacos en los que los polipéptidos bioactivos tienen semividas prolongadas de al menos 1 hora, y más típicamente mayores de 24 horas, pero no mayores de 10 días, y se convierten en la forma activa en condiciones fisiológicas a través de un reacción no enzimática impulsada por la inestabilidad química inherente. En una realización, el tiempo t-i/2 de activación no enzimática del profármaco está entre aproximadamente 12 y aproximadamente 168 horas, y más típicamente entre 12 y aproximadamente 120 horas o 12 y 72 horas, y en una realización el t-i/2 está entre 24 y 48 horas, medido incubando el profármaco en una solución tampón de fosfato (por ejemplo, PBS) a 37 °C y pH de 7,2. Las semividas de los distintos profármacos se calculan mediante la fórmula 11/2= 0,693/k, donde 'k' es la constante de velocidad de primer orden para la degradación del profármaco. En una realización, la activación del profármaco se produce después de la escisión de un dipéptido unido por enlace amida y la formación de una dicetopiperazina o dicetomorfolina, y el péptido de insulina activo, en el que el dipéptido está unido covalentemente a un grupo alquilo o acilo de tamaño suficiente (por ejemplo, C18 a C30) para unirse a la albúmina sérica.
[0076] Se han identificado dipéptidos específicos compuestos por aminoácidos naturales o sintéticos que facilitan la descomposición intramolecular en condiciones fisiológicas para liberar los péptidos de insulina activos. El dipéptido se puede unir (a través de un enlace amida) a un grupo amino presente en la insulina nativa, o se puede introducir un grupo amino en el péptido de insulina mediante la modificación del péptido de insulina nativo. Se pueden agregar aminoácidos adicionales al extremo carboxilo del dipéptido para crear tripéptidos o tetrapéptidos que se pueden unir mediante un enlace amida a un péptido de insulina. En aquellas realizaciones en las que se han añadido uno o dos aminoácidos adicionales al elemento de dipéptido original, tras la escisión del dipéptido para formar una dicetopiperazina o dicetomorfolina, el uno o dos aminoácidos adicionales permanecerán unidos al péptido de insulina. En una realización, el uno o dos aminoácidos adicionales son aminoácidos cargados.
[0077] En una realización, la estructura dipeptídica se selecciona para resistir la escisión por peptidasas presentes en sueros de mamíferos, que incluyen, por ejemplo, dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV). Por consiguiente, en una realización, la tasa de escisión del elemento profármaco de dipéptido del péptido bioactivo (por ejemplo, péptido de insulina (Q)) no aumenta sustancialmente (por ejemplo, más de 2X) cuando la reacción se lleva a cabo utilizando condiciones fisiológicas en presencia de proteasas séricas, en relación con la realización de la reacción en ausencia de las proteasas. Por lo tanto, la semivida de escisión del elemento profármaco de dipéptido del péptido de insulina (en PBS en condiciones fisiológicas) no es más de dos, tres, cuatro o cinco veces la semivida de escisión del elemento profármaco de dipéptido del péptido de insulina en un solución que comprende una proteasa DPP-IV. En una realización, la solución que comprende una proteasa DPP-IV es suero, más en particular suero de mamífero, incluyendo suero humano.
[0078] En una realización, se proporciona un profármaco de insulina que comprende la estructura: A-B-C-Q;
en la que Q es un péptido de insulina, A-B-C- es un péptido unido a Q a través de un enlace amida donde A es un aminoácido, B es un aminoácido N - alquilado y C es un enlace amida, X70 o X70X71 , donde X70 y X71 son aminoácidos seleccionados independientemente del grupo que consiste en glicina, ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico, ácido homoglutámico, arginina, lisina e histidina, donde uno de A o B comprende una cadena lateral que está unida covalentemente a un grupo acilo C16 - C30 o a un grupo alquilo C16 - C30. En una realización, el aminoácido unido al grupo acilo C16 - C 30 o a un grupo alquilo C16 -C30 tiene una cadena lateral de (alquilo C1 - C8) NH2 . En una realización, A es un aminoácido o hidroxiácido que comprende una cadena lateral de (alquilo C1 - C8) NH2 , en la que la cadena lateral está unida covalentemente a un grupo acilo C16 - C30 o a un grupo alquilo C16 - C30. En una realización, el enlace entre la cadena lateral de A y el grupo acilo o alquilo se realiza a través de un espaciador, comprendiendo dicho espaciador uno o dos aminoácidos cargados. En una realización, B es un aminoácido N - alquilado; y C es un enlace amida, X70 o X70X71 , donde X70 y X71 son aminoácidos seleccionados independientemente del grupo que consiste en glicina, ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico, ácido homoglutámico, arginina, lisina e histidina. Además, A, B y C están unidos entre sí a través de enlaces amida, y el péptido A-B-C está unido a Q a través de un enlace amida a través de un grupo amino alifático de Q. En una realización, el grupo amino alifático se selecciona del grupo alfa amino en el aminoácido N - terminal de la cadena A o la cadena B, o un grupo amino alifático en una cadena lateral de un aminoácido B3, B28 o B29 de Q. En una realización, el péptido A-B-C está unido a Q a través de una amida enlace a través del grupo amino de una cadena lateral de lisina en la posición B3, B28 o B29 del péptido de insulina. En una realización, el péptido A-B-C está unido a Q a través de una amida enlace a través de la amina N - terminal de la cadena B de insulina.
[0079] En una realización adicional, el péptido A-B-C se une a Q a través de un enlace amida a través de la amina N - terminal de la cadena B de insulina, donde la cadena lateral del aminoácido A o el aminoácido B está unida covalentemente a un resto que irreversiblemente se une a una proteína plasmática. En una realización, el resto que se une irreversiblemente a una proteína plasmática es un grupo acilo C16 - C30 o un grupo alquilo C16 - C30 y, en otra realización, el aminoácido A o el aminoácido B comprende una cadena lateral con (alquilo C1 - C8) NH2 en la que el grupo acilo C16 - C30 o un grupo alquilo C16 - C30 está unido covalentemente a través de la amina alifática de la cadena lateral de (alquilo C1 - C8) NH2. En una realización, el aminoácido A está unido covalentemente a un resto que se une irreversiblemente a una proteína plasmática.
[0080] Tal como se describe en el presente documento, en una realización, el aminoácido A o B del elemento profármaco del profármaco de insulina se modifica para comprender un grupo acilo mediante la acilación de una amina, hidroxilo o tiol de una cadena lateral de A o B, ya sea directamente o a través de un resto espaciador. De acuerdo con una realización, un grupo acilo C16 - C30 o un grupo alquilo C16 - C30 se une a A a través de un espaciador, en el que el espaciador se coloca entre el aminoácido del péptido de insulina y el grupo acilo o alquilo. En realizaciones de ejemplo, el espaciador es un aminoácido, un dipéptido o un tripéptido, o un espaciador bifuncional hidrófilo. En una realización, el espaciador comprende uno o dos aminoácidos cargados. En una realización, el espaciador es un aminoácido de una sola carga. En otra realización, el espaciador es un dipéptido, en el que el dipéptido comprende uno o dos aminoácidos cargados. En una realización, el espaciador se selecciona del grupo que consiste en: Asp, Glu, His, Arg, Lys y un espaciador que comprende NH2 (CH2 CH2 O)n (CH2) m COOH, donde m es cualquier número entero de 1 a 6 y n es cualquier
número entero de 2 a 12. En una realización, A comprende una cadena lateral de (alquilo C1 - C8) NH2 acilada
con un ácido graso C18 - C22 a través de un espaciador de dipéptido ácido gamma glutámico-ácido gamma glutámico.
[0081] El aminoácido B de estructura A-B-C es un aminoácido N - alquilado en el que el grupo N - alquilo comprende una cadena hidrocarbonada lineal, cíclica o ramificada de C1 - C18. De acuerdo con una realización
B es un aminoácido N - alquilado con alquilo C1 - C18 , alquenilo C3 - C18 , (alquilo C0 - C4) (cicloalquilo C4 - C6),
(alquilo C0 - C4) (heterocíclico C 3 - C5 ), o (alquilo C0 - C4) (arilo C6 - C10 ). En una realización, el aminoácido B
de estructura A-B-C está N - alquilado con alquilo C1 - C6 , (alquilo C1 - C4) (arilo C5 - Ce) o (alquilo (cicloalquilo C4 - C6). En una realización, B está N - alquilado con N -propilo, iso-propilo, butilo, iso-butilo, secbutilo o terc-butilo. En una realización adicional, B está N - alquilado con isopropilo, sec-butilo o terc-butilo. En
una realización, B se selecciona del grupo que consiste en glicina (N - alquilo C1 - C10), isoleucina (N - alquilo
C1 - C10), valina (N - alquilo C1 - C10 ) y treonina (N - alquilo C1 - C10 ). En una realización, B se selecciona del
grupo que consiste en glicina (N - alquilo C1 - C6), isoleucina (N - alquilo C1 - C6), valina (N - alquilo C1 - C6)
y treonina (N - alquilo C1 - C6). En una realización, B se selecciona del grupo que consiste en glicina (N -metilo), glicina (N -etilo), glicina (N -propilo), glicina (N -butilo), glicina (sec-butilo), glicina (terc- butilo), glicina
(N -pentilo), glicina (N - hexilo), glicina (N -heptilo) y glicina (N -octilo). En una realización, B se selecciona
del grupo que consiste en glicina (N -iso-propilo), glicina (N -sec-butilo) o glicina (N -terc-butilo).
[0082] Según una realización, C de la fórmula A-B-C es un aminoácido o un dipéptido. En una realización, los aminoácidos que comprenden C incluyen al menos un aminoácido con una cadena lateral seleccionada independientemente del grupo que consiste en H, (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo C1 - C4)SO3 H, (alquilo C1 -C4) NH2 , (alquilo C1 -C4) NHC(NH2+) NH2. En una realización, C es un dipéptido en el que uno o ambos aminoácidos del dipéptido comprenden una cadena lateral seleccionada del grupo que consiste en H, (alquilo
C1 - C4) COOH, (alquilo C1 - C4)SO3 H, (alquilo C1 - C4) NH2 , (alquilo C1 - C4) NHC(NH2+) NH2. En una realización, los aminoácidos de C se seleccionan independientemente del grupo que consiste en glicina, ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico, ácido homoglutámico, arginina, lisina e histidina. En una realización, los aminoácidos de C se seleccionan independientemente del grupo que consiste
en glicina, ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, arginina y lisina.
[0083] En una realización, se proporciona un profármaco de insulina que comprende la estructura: A-B-C-Q;
donde Q es un péptido de insulina y A-B-C comprende una estructura de:
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en las que
R1 es alquilo C18 - C30, (alquilo C1 - C6) NH-R9 o (alquilo C1 - C6) NH-S1-R9;
R2 es H o alquilo C1 - C6 ;
R3 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C2 - C4, alquenilo C3 - C8 , (alquilo C0 - C4) (cicloalquilo C4 -C6), (alquilo C0 - C4) (heterocíclico C3 - C5 ), (alquilo C0 - C4) (arilo C6 - C10 ) o R4 y R3 junto con los átomos a los
que están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5 o e miembros;
R4 y R8 se seleccionan independiente del grupo que consiste en H, alquilo C1 - C18 , alquenilo C2 - C18 , (alquilo
C1 - C18)OH, (alquilo C1 - C18 )SH, (alquilo C2 - C3)SCH3 , (alquilo C1 - C4) CONH2 , (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo
C1 - C4) NH2 , (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 +) NH2 , (alquilo C0 - C4) (cicloalquilo C3 - C6), (alquilo C0 - C4) (heterocíclico C2 - C5), (alquilo C0 - C4) (arilo C6 - C10 )R7 , (alquilo C1 - C4) (heteroarilo C3 - Cg) y alquilo C1 -C12 (W1 ) alquilo C1 - C12 , en la que W 1 es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y O, o
R4 y R8 junto con los átomos a los que están unidos forman un cicloalquilo C3 - C6 ;
R5 es NHR6 u OH; '
R6 es H o alquilo C1 - C8 ;
R7 se selecciona del grupo que consiste en H, OH, alquilo C1 - C18 , alquenilo C2 - C18 , (alquilo C0 - C4) NH2 y
(alquilo C0 - C4)OH;
R9 se selecciona del grupo que consiste en acilo C18 - C30; R10 , R11 , R12 y R13 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, CH2 , CH2OH, CH2SH, (alquilo C1 - C4) CONH2 , (alquilo C1 -C4) COOH, (alquilo C1 - C4) NH2 , (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 +) NH2 y CH2 (heterocíclico C3-N2 ); y
S1 es un espaciador que consiste en uno o dos aminoácidos cargados seleccionados del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico, ácido homoglutámico, arginina, lisina e histidina, en la que A-B - C está unida a Q a través de un enlace amida a través de un grupo amino alifático de Q. En una realización, R1 es (alquilo C1 - C6) NH-S1 -R9; R3 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C2 - C4 ; R2 , R4, R11 y R13 son cada uno H; R5 es NH2 ; R8 es H o alquilo C1 - C8 ; R9 es acilo C18 - C30 ; R10 y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo C1 - C4) NH2 y (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 +) NH2 ; y S1 es un espaciador que comprende uno o dos aminoácidos cargados seleccionados del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico, ácido homoglutámico, arginina, lisina e histidina, y A-B - C está unida a Q a través de un enlace amida a través de la amina N - terminal de la cadena B de la insulina.
[0084] En una realización, se proporciona un profármaco de insulina que comprende la estructura: A-B-C-Q; donde Q es un péptido de insulina y A-B-C comprende una estructura de:
Figure imgf000016_0001
donde
R1 es alquilo C18 - C30, (alquilo C1 - C6) NH-S1 -R9 o (alquilo C1 - C6) NH - S1 - R9;
R3 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C2 - C4,
R4, R11 y R13 son cada uno H
R5 es NH2 ;
R8 es H o alquilo C1 - C8 ;
R9 es acilo C18 - C30 ;y
R10 y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo C1 -C4) NH2 , (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 +) NH2 y CH2 (heterocíclico C3 - N2); y
S1 es un espaciador que consiste en uno o dos aminoácidos cargados seleccionados del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico, ácido homoglutámico, arginina, lisina e histidina, donde A-B-C está unido a Q a través de un enlace amida a través de un grupo amino alifático de Q. En una realización, R1 es (CH2 )4-S 1 -NHR9 o (CH2 )4 NHR9; R3 es alquilo C3 - C4; R5 es NH2 ; y R9 es acilo C18 -C28, y A-B-C está unido a Q a través de un enlace amida a través de la amina N - terminal de la cadena B de la insulina.
[0085] El péptido de insulina de los profármacos descritos en el presente documento puede comprender cualquiera de las insulinas conocidas por los expertos en la técnica que tienen actividad agonista en los receptores de insulina. De acuerdo con una realización, el péptido de insulina comprende una secuencia de cadena A de GIVEQCCX8 SICSLYQLENYCX21 R44 (SEQ iD No : 3) y una secuencia de cadena B de R2 2 -X25 LCGX29 X30 LVX33 X34 LYLVCGX41 X42 GFX45 (SEQ ID NO : 20), en el que la cadena B está unida a la cadena A a través de enlaces disulfuro;
X8 se selecciona del grupo que consiste en treonina e histidina;
X21 se selecciona del grupo que consiste en asparagina, ornitina, glicina, alanina, treonina y serina;
X25 se selecciona del grupo que consiste en histidina y treonina;
X29 se selecciona del grupo que consiste en alanina, glicina y serina;
X30 se selecciona del grupo que consiste en histidina, ácido aspártico, ácido glutámico, ácido homocisteico y ácido cisteico;
X33 se selecciona del grupo que consiste en ácido aspártico y ácido glutámico;
X34 se selecciona del grupo que consiste en alanina y treonina;
X41 se selecciona del grupo que consiste en ácido glutámico, ácido aspártico o asparagina;
X42 se selecciona del grupo que consiste en alanina, ornitina, lisina y arginina;
X45 es tirosina o fenilalanina;
R 22 se selecciona del grupo que consiste en AYRPSE (SEQ ID NO : 14), FVNQ (SEQ ID NO : 12), FVKQ (SEQ ID NO : 8), PGPE (SEQ ID NO : 11), un tripéptido glicina-prolina -ácido glutámico, un tripéptido valinaasparagina-glutamina, un dipéptido prolina-ácido glutámico, un dipéptido asparagina-glutamina, glutamina, ácido glutámico y una amina N - terminal; y
R44 es COOH o CONH2.
[0086] En una realización, el péptido de insulina comprende una secuencia de cadena A de GIVEQCCX8 SICSLYQLENYCX21 (SEQ ID NO : 3) y una secuencia de cadena B de R 2 2 -HLCGSHLVEALYLVCGERGFX45 (SEQ ID NO : 15), donde dicha cadena B está unida a dicha cadena A a
través de enlaces disulfuro;
R22 es un enlace, o una secuencia de 1 a 4 aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en FVNQ (SEQ
ID NO : 12), FVKQ (SEQ ID NO : 8), VNQ, NQ y Q;
X6 se selecciona del grupo que consiste en treonina e histidina;
X21 se selecciona del grupo que consiste en asparagina, lisina, glicina y alanina; y
X45 es histidina, tirosina o fenilalanina.
[0087] En una realización, la cadena A comprende una secuencia GIVEQCCTSICSLYQLENYCN -R44 (SEQ ID
NO : 1) y dicha cadena B comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO : 2) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT
(SEQ ID NO : 9) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT (SEQ ID NO : 5) FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTEKT (SEQ ID NO : 6), donde R44 es COOH o CONH2.
[0088] Los profármacos de insulina descritos en el presente documento pueden modificarse adicionalmente
para mejorar su estabilidad durante el almacenamiento. En una realización, la amina N - terminal del elemento
de dipéptido se une a un resto que permanece unido al extremo N - terminal hasta la administración al
paciente. En una realización, el profármaco de insulina de fórmula A-B - C-Q comprende además un resto
escindible por enzima sérica unida a A a través de la amina N - terminal de A. La unión del resto escindible por
enzima sérica al extremo N - terminal de A previene la formación de dicetopiperazina o dicetomorfolina y la
escisión de A-B de la insulina en ausencia de actividad enzimática. Tras la exposición a las enzimas séricas,
se eliminará el resto escindible por la enzima sérica, y la activación subsiguiente del profármaco dependerá de
un mecanismo de degradación no enzimático que escinde A-B basándose en la estructura de A-B. En una realización, el resto escindible por enzima es un péptido que es escindido por la dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV). En una realización, el péptido escindible por enzima sérica se une a A a través de la amina N - terminal de
A y se selecciona de dipéptidos que tienen la secuencia Z-prolina o Z-alanina, donde Z se selecciona del grupo
que consiste en glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, tirosina, triptófano, serina,
treonina, metionina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido aspártico y ácido glutámico. En una realización, el resto escindible por enzima es un péptido que es escindido por la dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV), que incluye, por ejemplo, un dipéptido de Arg-Pro, Lys-Pro o Glu-Pro.
[0089] En una realización, la semivida de escisión de A-B - C de Q en suero en condiciones fisiológicas es de aproximadamente 2 a aproximadamente 168 horas. En otra realización, la semivida de escisión de A-B - C de
Q en suero en condiciones fisiológicas es de aproximadamente 0,5 días a aproximadamente 10 días.
[0090] En una realización, se proporciona un profármaco de insulina que comprende la estructura:
A-B-C-Q;
donde Q es un péptido de insulina;
A es un aminoácido que comprende una cadena lateral de (alquilo C1 - C8) NH2 , donde la cadena lateral está
unida covalentemente a un resto que se une irreversiblemente a una proteína plasmática, donde dicho resto
está unido a la cadena lateral de A a través de un espaciador, comprendiendo el espaciador uno o dos aminoácidos cargados;
B es un aminoácido N - alquilado; y
C es un enlace amida, X70 o X70 X71 , donde X70 y X71 son aminoácidos con una cadena lateral seleccionada independientemente del grupo que consiste en H, (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo C1 - C4)SO3H, (alquilo C1 -C4) NH2 , (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 + ) NH2 , en el que A-B - C está unido a Q a través de un enlace amida a
través de un grupo amino alifático de Q, dicho grupo amino alifático seleccionado del grupo alfa amino en el aminoácido N - terminal de la cadena A o la cadena B, o un grupo amino alifático en una cadena lateral de un aminoácido B3, B28 o B29 de Q. En una realización, el resto que se une irreversiblemente a una proteína plasmática es un grupo acilo C16 - C30 o un grupo alquilo C16 - C30, en el que el enlace entre la cadena lateral
de A y el grupo acilo o alquilo se realiza a través de dicho espaciador. En una realización, C es un aminoácido
o dipéptido en el que los aminoácidos de C se seleccionan del grupo que consiste en glicina, ácido aspártico,
ácido glutámico, ácido cisteico, arginina y lisina. En una realización, C es un dipéptido en el que los aminoácidos
del dipéptido se seleccionan del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, arginina
y lisina. En una realización, C es un dipéptido en el que uno de los dos aminoácidos es glicina o alanina y el
otro aminoácido del dipéptido se selecciona del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido
cisteico, arginina y lisina. En una realización adicional, B es un aminoácido N - alquilado con alquilo C1 - C18 ,
alquenilo C3 - C18 , (alquilo C0 - C4) (cicloalquilo C4 - C6), (alquilo C0 - C4) (heterocíclico C3 - C5 ), o C4) (arilo C6 - C10 ).
[0091] En una realización, el profármaco de insulina comprende un péptido de estructura general
Figure imgf000018_0001
unido al grupo amino N - terminal de la cadena A o B de insulina o a la cadena lateral de una lisina en la posición B3, B28 o B29, en donde
R1 es (alquilo C1 - C6) NH - S1 - Sg;
R2 es H o alquilo C1 - C6 ;
R3 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C2 - C4, alquenilo C3 - C8 , (alquilo C0 - C4) (cicloalquilo C4 -C6), (alquilo C0 - C4) (heterocíclico C3 - C5 ), (alquilo C0 - C4) (arilo C6 - C10 ) o R4 y R3 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5 o 6 miembros;
R4 y R8 se seleccionan independiente del grupo que consiste en H, alquilo C1 - C18 , alquenilo C2 - C18 , (alquilo C1 - C 18 )OH, (alquilo C1 - C18 )SH, (alquilo C2 - C3)SCH3 , (alquilo C1 - C4) CONH2 , (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo C1 - C4) NH2 , (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 +) NH2 , (alquilo C0 - C4) (cicloalquilo C3 - C6), (alquilo C0 - C4) (heterocíclico C2 - C5), (alquilo C0 - C4) (arilo C6 - C10 )R7 , (alquilo C1 - C4) (heteroarilo C3 - Cg) y alquilo C1 -C12 (W 1 ) alquilo C1 - C12 , en la que W 1 es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y O, o R4 y R8 junto con los átomos a los que están unidos forman un cicloalquilo C3 - C6 ;
R10 , R11 , R12 y R13 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, CH3, (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo C1 - C4) NH2 , (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 +) NH2 y CH2 (heterocíclico C3 - N2 );
R5 es NHR6 u OH;
R6 es H o alquilo C1 - C8 ;
R7 se selecciona del grupo que consiste en H, OH, alquilo C1 - C18 , alquenilo C2 - C18 , (alquilo C0 - C4) NH2 y (alquilo C0 - C4)OH;
R9 se selecciona del grupo que consiste en acilo C18 - C30; y
Sí es un enlace o un espaciador que consiste en uno a seis aminoácidos, donde dicho espaciador comprende uno o más aminoácidos cargados seleccionados del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, arginina y lisina . En una realización, S1 es un espaciador que consiste en uno o dos aminoácidos cargados seleccionados del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico, ácido homoglutámico, arginina, lisina e histidina.
[0092] En una realización, el profármaco de insulina comprende un péptido de la estructura general
Figure imgf000018_0002
R1 es alquilo C18 - C30, (alquilo C1 - C6) NH-R9 o (alquilo C1 - C6) NH-S1 - Sg;
R3 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C2 - C4,
R4, R11 y R13 son cada uno H
R5 es NH2 ;
R8 8 s H o alquilo C1 - C8;
R9 es acilo C18 - C30; y
R10 y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo C1 -C4) NH2 y (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 +) NH2 ; y
S1 es un espaciador que consiste en uno o dos aminoácidos cargados seleccionados del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, arginina y lisina unidos al grupo amino N - terminal de la cadena A o B de la insulina o a la cadena lateral de una lisina en la posición B3, B28 o B29. En una realización, S1 es un espaciador que consiste en uno o dos aminoácidos cargados seleccionados del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico, ácido homoglutámico, arginina, lisina e 9istidina. En una realización, el péptido representado por la fórmula A-B-C está unido al grupo amino N -terminal de la cadena B de la insulina. En otra realización, R1 es (CH2 )4-R9 o (CH2)4-S1 -NHR9, R3 es alquilo C3
- C4 ■ R5 es NH2 ; _ y R9 es acilo C18 - C28. En una realización adicional, R1 se selecciona del grupo que consiste
en (CH2)4NHCO(CH2)17CH3 , (CH2)4NHCO(CH2)1gCH3 y (CH2)4NHCO(CH2)2 1CH3.
[0093] De acuerdo con una realización, se proporciona un profármaco de insulina en el que la proteína de
insulina comprende una secuencia de cadena A de GIVEQc Ct SICSLYQLENYCN -R44 (Se Q ID NO : 1) y una
secuencia de cadena B seleccionada del grupo que consiste en FVNQHLCGSHLVEAlY lVCGERGFfYTp KT
(SEQ ID NO : 2) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT (SEQ ID NO : 9) FVNQHLCGSHLVEALYLV CGERGFFYTDKT (SEQ ID NO : 5) FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTEKT (SEQ ID NO : 6), donde R44
es COOH o CONH2 y un elemento profármaco unido covalentemente a dicho péptido de insulina en el grupo
amino N - terminal de la cadena A o cadena B o en la amina de la cadena lateral de una lisina en una posición
B3, B28 o B29, donde el elemento profármaco comprende la estructura:
Figure imgf000019_0001
R1 se selecciona del grupo que consiste en H, (alquilo C1 - C4)OS1-R9, (alquilo C1 - C4)S-S1 -R9, (alquilo C1 -C4) CONH-S1-R9, (alquilo C1 - C4) COO-S1-R9, (alquilo C1 - C6) NH-S1 -R9, (alquilo C1 - C6) NHR9 y (alquilo C0 -C4) (arilo C6 — C10 )-S1 -R9;
R2 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1 - C8, alquenilo C2 - C8,
(alquilo C1 — C4)OH, (alquilo C1 — C4)SH, (alquilo C2 - C3)SCH3, (alquilo C1 - C4) CONH2 , (alquilo C1 - C4) COOH,
(alquilo C1 - C4) NH2 , (alquilo C1 - C4) NHc (n H2 + ) NH2 , (alquilo C0 - C4) ( (heterocíclico C2 - C5), (alquilo C0 - C4) (arilo C6 - C10 )R7 , (alquilo C1 - C4) (heteroarilo C3 - C9) y alquilo C1 -C12 (W1 ) alquilo C1 - C12 , en la que W 1 es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y O, o
R1 y R2 junto con los átomos a los que están unidos forman un cicloalquilo C3 - C12 o arilo;
R3 es alquilo C1 - C18 , alquenilo C3 - C8, (alquilo C0 - C4) (cicloalquilo C4 - C6), (alquilo C0 - C4) (heterocíclico C3
-C5 ), (alquilo C0 - C4) (arilo C6 - C10) o R4 y R3 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5 ó e miembros;
R4 es H, alquilo C1 - C18 , (alquilo C1 - C6) NHR9 o (alquilo C1 - C6) NH-S1 -R9, R5 es OH, o NHR6;
R6 es H, alquilo C1 - C8 ;
R7 se selecciona del grupo que consiste en H, OH y OR9;
R9 se selecciona del grupo que consiste en acilo C16 - C30 y alquilo C16 - C30;
cada uno de R11 y R13 es H o alquilo C1 - C6 ;
R10 y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, CH3 , (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo
C1 - C4) NH2 , (alquilo C1 - C4)alquil) NHC(NH2 +) NH2 , y CH2(heterocíclico C3 — N2); y
S1 es un enlace o un espaciador que consiste en uno a seis aminoácidos, donde dicho espaciador comprende
uno o más aminoácidos cargados seleccionados del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico,
ácido cisteico, arginina y lisina, con la condición de que R1 sea distinto de H cuando R4 es H o alquilo C1 -C18. En una realización adicional, R1 es (alquilo C1 - C6) NHR9 o (alquilo C1 - C6) NH-S^R9; R2 , R4, R11 y R13
son cada uno H; R5 es NH2 ; R8 es H o alquilo C1 - C8; R9 es acilo C18 - C30; y S1 es un espaciador que consiste
en uno o dos aminoácidos cargados seleccionados del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico,
ácido cisteico, arginina y lisina. En otra realización, R1 es (alquilo C3 - C5 ) NH-S1 R9, o (alquilo C3 - C5) NHR9; R2 ,
R4, R11 y R13 son cada uno H; R5 es NH2 ; R8 es H o alquilo C1 - C8 ; y R9 es acilo C18 - C30.
^ 4 ] En otra realización, el profármaco de insulina comprende la estructura:
A-B - C-Q;
donde Q es un péptido de insulina; y
A-B - C comprende la estructura:
Figure imgf000019_0002
A-B - C está unido a Q a través de un enlace amida a través del aminoácido N - terminal de la cadena A o la cadena B, o un grupo amino alifático en una cadena lateral de un aminoácido B3, B28 o B29 de Q, R2 , R4, Rs, R11 y R13 son cada uno H; R1 es (alquilo C1 - C6) NHR9 o (alquilo C1 - C6) NH-S1-R9 ;R 3 es alquilo C2 - C8 , R5 es NH2 , R10 y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, CH3, (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo C1 - C4) NH2 , (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 +) NH2 , y CH2 (heterocíclico C3-N2 ), R9 se selecciona del grupo que consiste en acilo C18 - C30 y alquilo C18 - C30; y S1 es un espaciador que consiste en uno o dos aminoácidos cargados seleccionados del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, arginina y lisina. En una realización adicional, R1 es (CH2 )4NHR9 o (CH2 )4NH-S1 -R9; R3 es alquilo C3 - C4; y R9 es acilo C18 - C28.
[0095] De acuerdo con una realización, el componente de insulina de los profármacos descritos en el presente documento comprende una secuencia de cadena A de GIVEQCCX8SICSLYQLENYCX21 (SEQ ID NO : 3) y una secuencia de cadena B de R22 -HLCGSHLVEALYLVCGERGFX45 (SEQ ID NO : i5), en el que la cadena B está unida a dicha cadena A a través de enlaces disulfuro; R22 es un enlace, o una secuencia de i a 4 aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en FVNQ (SEQ ID NO : i2), FVKQ (SEQ ID NO : 8), VNQ, NQ y Q; X8 se selecciona del grupo que consiste en treonina e histidina; X21 se selecciona del grupo que consiste en asparagina, lisina, ornitina, glicina y alanina; y X45 es histidina, tirosina o fenilalanina. En una realización, el péptido de insulina comprende una cadena A y B en la que la cadena A comprende una secuencia GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO : i ) y la cadena B comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO : 2) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT (SEQ ID NO : g) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT (SEQ ID NO : 5) FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTEKT (SEQ ID NO : 6).
[OOge] De acuerdo con una realización, el componente de insulina de los profármacos descritos en el presente documento comprende una secuencia de cadena A de GIVX4X5CCX8X9X 10 CX12 LX14 X 15 LX17 X 18 YCX21-R 44 (SEQ ID NO : ig), y una secuencia de cadena B de R22 -X25LCGX2 gX30LVX33X34LYLVCGX41 X42GFX45 (SEQ ID NO : 20), donde
dicha cadena B está unida a dicha cadena A a través de enlaces disulfuro;
X4 es ácido glutámico o ácido aspártico;
X5 es glutamina o ácido glutámico
X8 es histidina, treonina o fenilalanina;
Xg es serina, arginina, lisina, ornitina o alanina;
X 10 es isoleucina o serina;
X 12 es serina o ácido aspártico;
X 14 es tirosina, arginina, lisina, ornitina o alanina;
X 15 es glutamina, ácido glutámico, arginina, alanina, lisina, ornitina o leucina;
X 17 es ácido glutámico, ácido aspártico, asparagina, lisina, ornitina o glutamina;
X i 8 es metionina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutámico o treonina;
X21 se selecciona del grupo que consiste en alanina, glicina, serina, valina, treonina, isoleucina, leucina, glutamina, ácido glutámico, asparagina, ácido aspártico, histidina, triptófano, tirosina y metionina;
X25 es histidina o treonina;
X29 se selecciona del grupo que consiste en alanina, glicina y serina;
X30 se selecciona del grupo que consiste en histidina, ácido aspártico, ácido glutámico, ácido homocisteico y ácido cisteico;
X33 se selecciona del grupo que consiste en ácido aspártico y ácido glutámico;
X34 se selecciona del grupo que consiste en alanina y treonina;
X41 se selecciona del grupo que consiste en ácido glutámico, ácido aspártico o asparagina;
X42 se selecciona del grupo que consiste en alanina, ornitina, lisina y arginina;
X45 es tirosina o fenilalanina;
R22 se selecciona del grupo que consiste en AYRPSE (SEQ ID NO : i4), FVNQ (SEQ ID NO : i2), FVKQ (SEQ ID NO : e), PGPE (SEQ ID NO : i i ) , un tripéptido glicina-prolina-ácido glutámico, un tripéptido valinaasparagina-glutamina, un dipéptido prolina-ácido glutámico, un dipéptido asparagina-glutamina, glutamina, ácido glutámico y una amina N - terminal; y
R44 es COOH o CONH2.
[00g7] De acuerdo con una realización, el profármaco de insulina comprende la estructura: A-B-C-Q;
donde Q es un péptido de insulina; y
A-B-C comprende la estructura:
Figure imgf000021_0001
donde A-B-C está unido a Q a través de un enlace amida a través del aminoácido N - terminal de la cadena A o la cadena B, o un grupo amino alifático en una cadena lateral de un aminoácido B3, B28 o B29 de Q,
R1 se selecciona del grupo que consiste en H, (alquilo C1 - C6) NH-R9, (alquilo C1 - C^OS-1-R9, (alquilo C1 -C4)S-S1-R g, (alquilo C1 - C4) CONH-S1 -R9, (alquilo C1 - C4) COO-S1 -R9, (alquilo C1 - C6) NH-S1 -R9, (alquilo C1
- C6) NHR9 y (alquilo C0 - C4) (arilo C6 - C10 )-S1 -R9;
R2 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C 1 - C8, alquenilo C2 - C8, (alquilo C1 - C4)OH, (alquilo C1 - C4)SH, (alquilo C2 - C3)SCH3, (alquilo C1 - C4) CONH2 , (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo C1 - C4) NH2 , (alquilo C1 - C4) NHc (n H2 + ) NH2 , (alquilo C0 - C4) (cicloalquilo C3 -(heterocíclico C2 - C5), (alquilo C0 - C4) (arilo C6 - C10 )R7 , (alquilo C1 - C4) (heteroarilo C3 - Cg) y alquilo C1 -C12 (W1 ) alquilo C1 - C12 , en la que W 1 es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y O, o
R1 y R2 junto con los átomos a los que están unidos forman un cicloalquilo C3 - C12 o arilo;
R3 es alquilo C1 - C18 , alquenilo C3 - C8, (alquilo C0 - C4) (cicloalquilo C4 - C6), (alquilo C0 - C4) (heterocíclico C3
-C5 ), (alquilo C0 - C4) (arilo C6 - C10 ) o R4 y R3 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5 ó e miembros;
R4 es H, alquilo C1 - C18 o (alquilo C1 - C6) NH-S1 -R9,
R5 es OH o NHR6 ;
R6 es H, alquilo C1 - C8 ;
R7 se selecciona del grupo que consiste en H, OH y OR9;
R9 se selecciona del grupo que consiste en acilo C16 - C30 y alquilo C16 - C30;
R11 y R1 3 son cada uno H;
R10 y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo C1 -C4) NH2 , (alquil C1 - C4) NHC(NH2 +) NH2 , y CH2(heterocíclico C3 - N2); y
S1 es un enlace o un espaciador que consiste en uno o dos aminoácidos cargados seleccionados del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico, ácido homoglutámico, arginina, lisina e histidina, con la condición de que R1 es distinto de H cuando R4 es H o alquilo C1 - C18. En una realización R1 es (alquilo C3 - C5) NH-S1 -R9 o (alquilo C3 - C5) NHR9; R2 , R4, R11 y R13 son cada uno H; R5 es NH2 ; _ R8 es H o alquiloC1 - C8; R9 es acilo C18 - C30; R10 y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo C1 - C4) NH2 , y (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 +) NH2 ; y
S1 es un espaciador que consiste en uno o dos aminoácidos cargados seleccionados del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, arginina y lisina. En una realización, R3 es alquilo C1 - C8 0
R4 y R3 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5 ó e miembros. En una realización, R1 es (CH2)4NHR9 o (CH2)4NH-S1 -R9; R3 es alquilo C3 - C4; y R9 es acilo C18 - C28.
[0098] Según una realización, el primer aminoácido del elemento de dipéptido del profármaco tiene estereoquímica D.
[0099] De acuerdo con una realización, se proporciona un procedimiento para tratar la hiperglucemia o la diabetes, en el que el procedimiento comprende administrar una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende un profármaco de insulina tal como se describe en el presente documento. En una realización, el profármaco de insulina está diseñado para tener una semivida en suero de mamífero mayor que un día. En tales realizaciones, el profármaco de insulina se puede administrar en una dosificación diaria que es una fracción de la dosificación que se administraría si se administrara la correspondiente forma activa no profármaco de la proteína insulina. En una realización, el profármaco se administra diariamente a una fracción, i/n, de la dosis óptima del péptido de insulina no profármaco correspondiente, en el que n representa la semivida, en días, de la escisión de A-B-C de Q en suero bajo condiciones fisiológicas.
[0100] El elemento profármaco de dipéptido está diseñado para escindir espontáneamente su enlace amida con el análogo de insulina en condiciones fisiológicas y en ausencia de actividad enzimática. En una realización, el aminoácido N - terminal de la extensión dipeptídica comprende un aminoácido alquilado en C (por ejemplo, ácido aminoisobutírico). En una realización, el aminoácido C-terminal del dipéptido comprende un aminoácido
N - alquilado (por ejemplo, prolina o N - metilglicina). En una realización, el dipéptido comprende la secuencia de un aminoácido alquilado en C N - terminal seguido de un aminoácido alquilado en N.
[0101] La cadena A y la cadena B que comprenden el análogo de profármaco de insulina pueden comprender la secuencia nativa de los péptidos respectivos (es decir, SEQ ID NO : i y SEQ ID NO : 2) o pueden comprender un derivado de SEQ ID NO : i y/o SEQ ID NO : 2, donde el derivado incluye la modificación del aminoácido en la posición A19 a una 4-amino fenilalanina y/o una o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones seleccionadas de A5, A8, A9, A10, A14, A15, A17, A18, A19 y A21, B1, B2, B3, B4, B5, B9, B10, B13, B14,
B17, B20, B22, B23, B26, B27, B28, B29 y B30 o deleciones de cualquiera o todas las posiciones B1-4 y B2e-30. En una realización, el elemento profármaco peptídico A-B - C está unido a un grupo amino N - terminal de
la cadena A o B de la insulina, donde el aminoácido B del elemento profármaco peptídico comprende un aminoácido N - alquilado y el aminoácido A del elemento profármaco peptídico es cualquier aminoácido, con la
condición de que cuando el aminoácido B del elemento profármaco peptídico es prolina, el aminoácido A del
elemento profármaco peptídico comprende un aminoácido C-alquilado.
[0102] En una realización, el elemento profármaco peptídico comprende la estructura general de:
Figure imgf000022_0001
en la que
R1 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, (alquilo C1 - C6) NH-R9, (alquilo C1 -C6) NH-S1-R9, alquilo C1 - C18 , alquenilo C2 - C18 , (alquilo C1 -C 18 )OH, (alquilo C1 - C18 )SH, (alquilo C2 - C3)SCH3 ,
(alquilo C1 - C4) CONH2 , (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo C1 - C5 ) NH2 , (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 +) NH2 , (alquilo
C0 - C4) (cicloalquilo C3 - C6), (alquilo C0 - C4) (heterocíclico C2 - C5 ), (alquilo C0 - C4) (arilo C6 - C1 ü )R7 , (alquilo
C1 - C4) (heteroarilo C3 - Cg), y alquilo C1 - C12 (W)alquilo C1 - C12 , donde W es un heteroátomo seleccionado
del grupo que consiste en N, S y O, o R1 y R2 junto con los átomos a los que están unidos forman un cicloalquilo
C3 - C12 o arilo;
R2 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1 - C18 , alquenilo C2 - C18 ,
(alquilo C1 - C18 )OH, (alquilo C1 - C18 )SH, (alquilo C2 - C3)SCH3 , (alquilo C1 - C4) CONH2 , (alquilo C1 - C4) COOH,
(alquilo C1 - C5) NH 2 , (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 +) NH2 , (alquilo C0 - C4) ( (heterocíclico C2 - C5 ), (alquilo C0 - C4) (arilo C6 - C10 )R 7 , (alquilo C1 - C4) (heteroarilo C3 - Cg) y alquilo C1 -C12 (W) alquilo C1 - C12 , donde W es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste de N, S y O, o R4 y
R8 junto con los átomos a los que están unidos forman un cicloalquilo C3 - C6 ;
R3 se selecciona del grupo que consiste en alquilo Ci - Cis, (alquilo C1 - C18 )OH, (alquilo C1 - C18 ) NH2 , (alquilo
C1 - C18 )SH, (alquilo C0 - C4) (cicloalquilo C3 - C6), (alquilo C0 - C4) (heterocíclico C 2 - C5 ), (alquilo C0 - C4) (arilo
C 6 - C10 )R 7 , y (alquilo C1 - C4) (heteroarilo C3 - Cg) o R4 y R3 junto con los átomos a los que están unidos
forman un anillo heterocíclico de 4, 5 o e miembros;
R5 es NHRe u OH;
R6 es H, alquilo C1 - C8 o R6 y R2 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo heterocíclico de
4, 5 ó e miembros;
R7 se selecciona del grupo que consiste en H y OH, con la condición de que cuando R4 y R3 junto con los
átomos a los que están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5 o e miembros, tanto R1 como R2 son
distintos de H
R9 se selecciona del grupo que consiste en acilo C16 - C30, y alquilo C16 - C30;
R11 y R1 3 son cada uno H;
R10 y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo C1 -C4) NH2 , (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 +) NH2 y CH2(heterocíclico C3 - N2 ); y
S1 es un enlace o un espaciador que comprende un péptido í-e en el que el péptido í-e comprende í, 2 o 3 aminoácidos cargados seleccionados del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico,
ácido homocisteico, ácido homoglutámico, arginina, lisina e histidina, con la condición de que uno de R1 o
R8 sea (alquilo C1 - C6) NH-R9, o (alquilo C1 - C6) NH-S1 -R9. En una realización, R1 es (alquilo C1 - C6) NH-R9,
o (alquilo C1 - C6) NH-S1 -R9 y R2 y R4 son H.
[0í03] En otra realización, el elemento profármaco peptídico comprende la estructura general:
Figure imgf000022_0002
en la que
R1 es (alquilo C1 - C6) NH-R9, o (alquilo C1 - C6) NH-S1 -R9;
R2 y R8 es H o alquilo C1 - C8;
R4 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo C1 - C8, alquenilo C2 - C8 , (alquilo C1 - C4)OH, (alquilo C1 - C4)SH, (alquilo C2 - C3)SCH3 , (alquilo C1 - C4) CONH2 , (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo C1 - C4) NH2 , (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 +) NH2 , (alquilo C0 - C4) (cicloalquilo C3 - C6), (alquilo C0 - C4) (heterocíclico C2 - C5), (alquilo C0 - C4) (arilo C6 - C10 )R7 y CH2(heteroarilo C3 - C9);
R3 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1 - C8 , (C3 - C6) (cicloalquilo C5 - C6) o R4 y R3 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo heterocíclico de 5 o e miembros;
R5 es NHR6 ;
R6 es H, alquilo C1 - C8 ; y
R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1 - C18 o, (alquilo C0 - C4) COOH, (alquilo C0 -C4) NH2 , (alquilo C0 - C4)OH y halo;
R9 se selecciona del grupo que consiste en acilo C16 - C30 y alquilo C16 - C30;
R11 y R13 son cada uno H;
R10 y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo C1 -C4) NH2 , (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 +) NH2 , y CH2(heterocíclico C3 - N2); y
S1 es un enlace o un espaciador que consiste en uno o dos aminoácidos cargados seleccionados del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico, ácido homoglutámico, arginina, lisina e histidina.
[o io4] En una realización, el primer aminoácido y/o el segundo aminoácido del elemento profármaco de dipéptido es un aminoácido en la configuración del estereoisómero D.
[0105] En una realización, se proporciona el elemento profármaco de fórmula general:
Figure imgf000023_0001
en la que R1 es (alquilo C1 - C6) NH-R9, o (alquilo C1 - C6) NH-S1 -R9
R2 es H; y
R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1 - C8 , alquenilo C2 - C8 , (alquilo C1 - C4)OH, (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo C1 - C4) NH2 , (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 + ) NH 2 , (alquilo C0 - C4) ( cicloalquilo C3 - C6), (alquilo C0 - C4) (arilo C6 - C10 ) R7 , y CH2 (heteroarilo C5 - Cg);
R3 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C i - Cs, (alquilo C1 - C4) (arilo C6 - C10 ) R7 , (alquilo C1 - C4) (cicloalquilo C5 - C10 ) y CH2 (heteroarilo C5 - Cg) o R4 y R3 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo heterocíclico de 5 o e miembros;
R5 es NH2 ;
R7 se selecciona del grupo que consiste en H y OH y R8 es H
R9 se selecciona del grupo que consiste en acilo C16 - C30 y alquilo C16 - C30;
R11 y R13 son cada uno H;
R10 y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo C1 -C4) NH2 , (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 +) NH2 , y CH2 (heterocíclico C3 - N2 ); y
S1 es un enlace o un espaciador que consiste en uno o dos aminoácidos cargados seleccionados del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico, ácido homoglutámico, arginina, lisina e histidina, con la condición de que R1 sea distinto de H cuando R4 es H o alquilo C1 - C18. En una realización, R3 es alquilo C1 - C8 y R4 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo C1 - C6, (alquilo C0 - C4) (arilo C6 - C10 )R7 y CH2(heteroarilo C5 - C9) o R4 y R3 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo heterocíclico de 5 ó e miembros.
[o ioe] En una realización, el primer aminoácido y/o el segundo aminoácido del elemento profármaco de dipéptido es un aminoácido no codificado y en una realización es un aminoácido en la configuración del estereoisómero D.
[o io7] En una realización, se proporciona un profármaco de insulina que tiene la estructura general de: A-B -C-Q, donde Q es un péptido de insulina que comprende una cadena A y B donde la cadena A comprende una secuencia GIVEQc Ct SICSLYQLENYCN (SEQ ID NO : i ) y la cadena B comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO : 2) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT (SEQ ID NO : g) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT (SEQ ID NO : 5) FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTEKT (SEQ ID NO : 6); y A-B - C es un elemento profármaco peptídico que tiene la estructura
Figure imgf000024_0001
en la que
R1 es (alquilo C1 - C6) NH-R9 o (alquilo C1 - C6) NH-S1-R9;
R2 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C1 - C8;
R3 es alquilo C1 - C8;
R4 es H, alquilo C1 - C8 o (alquilo C1 - C4) (arilo C6 - C10 )R7 ;
R5 es NH2 ;
R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1 - C8 y (alquilo C0 - C4)OH;
R8 es hidrógeno;
R9 se selecciona del grupo que consiste en acilo C16 - C30 y alquilo C16 - C30;
R11 y R13 son cada uno H;
R10 y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en (alquilo C 1 - C4) COOH, (alquilo C1 -C4) NH2 , (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 +) NH2 y CH2(heterocíclico C3 - N2); y
S1 es un espaciador que consiste en uno o dos aminoácidos cargados seleccionados del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico, ácido homoglutámico, arginina, lisina e histidina . En una realización adicional, R2 es hidrógeno;
R3 es alquilo C1 - C18 ;
R4 y R8 son cada uno hidrógeno;
R5 es NH2 ;
R9 se selecciona del grupo que consiste en acilo C16 - C30 y alquilo C16 - C30;
R11 y R13 son cada uno H;
R10 y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en (alquilo C 1 - C4) COOH, (alquilo C1 -C4) NH2 , y (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 +) NH2 ; y
S1 es un espaciador que consiste en uno o dos aminoácidos cargados seleccionados del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico, ácido homoglutámico, arginina, lisina e histidina.
[0 i08] Según una realización, se proporciona un análogo de profármaco de insulina que comprende un péptido de insulina y un elemento de profármaco unido a amida. Más particularmente, el análogo de profármaco de insulina comprende una secuencia de cadena A y una secuencia de cadena B en el que la cadena A comprende la secuencia Z-GIVEQCCX8SICSLYQLENYCX2 1 R44 (SEQ ID NO : 3) (SEQ ID NO : 3), o un análogo de la misma que comprende una secuencia que difiere de la SEQ ID NO : 3 en i a 9, i a 5 o i a 3 modificaciones de aminoácidos, seleccionada de las posiciones A5, A8, A9, A i0, A i4, A i5, A H, A i8 (con respecto a la cadena A de insulina nativa), y la secuencia de la cadena B comprende la secuencia de J-R22 -X25LCGX29X30LVEALYUVCGERGFX45 (SEQ ID NO : ), o un análogo de la misma que comprende una secuencia que difiere de la secuencia SEQ ID NO : i4 en i a i0, i a 5 o i a 3 modificaciones de aminoácidos, seleccionada de las posiciones B1, B2, B3, B4, B5, B13, B14, B17, B20, B22, B23, B26, B27, B28, B29 y B30 (en relación con la cadena B de insulina nativa; es decir, el aminoácido X25 de SEQ ID NO : corresponde a la posición B5 en insulina nativa), en donde
X8 se selecciona del grupo que consiste en treonina e histidina;
X21 se selecciona del grupo que consiste en asparagina, ornitina, glicina, alanina, treonina y serina;
X25 se selecciona del grupo que consiste en histidina y treonina;
X29 se selecciona del grupo que consiste en alanina, glicina y serina;
X30 se selecciona del grupo que consiste en histidina, ácido aspártico, ácido glutámico, ácido homocisteico y ácido cisteico;
X45 es tirosina o fenilalanina;
R2 2 se selecciona del grupo que consiste en FVNQ (SEQ ID NO : i2), FVKQ (SEQ ID NO : 8), un tripéptido valina-asparagina-glutamina, un dipéptido asparagina-glutamina, glutamina, ácido glutámico y una amina N -terminal; y
R44 es COOH o CONH2. Z y J son independientemente H o un elemento profármaco peptídico que comprende la estructura general de
Figure imgf000025_0001
unida a la amina N - terminal de la cadena A o B de la insulina, en las que
R1 se selecciona del grupo que consiste en (alquilo C1 - C6) NH-R9 y (alquilo C1 - C6) NH-S1 -R9;
R2 , R4 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1 - C18 , alquenilo C2 - C18 , (alquilo C1 - C18)OH, (alquilo C1 - C18)SH, (alquilo C2 - C3)SCH3 , (alquilo C1 - C4) CONH2 , (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo C1 - C4) NH2 , (alquilo C1 - C6) NH-R9, (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 +) NH2 , (alquilo C0 - C4) (cicloalquilo C3 - C6), (alquilo C0 - C4) (heterocíclico C2 - C5 ), (alquilo C 0 - C4) (arilo C6 - C10 )R7 , (alquilo C1 - C4) (heteroarilo C3 - Cg) y alquilo C1 - C12 (W)alquilo C1 - C12 , en el que W es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y O, o R1 y R2 junto con los átomos a los que están unidos forman un cicloalquilo C3 - C12 o arilo; o R4 y R8 junto con los átomos a los que están unidos forman un cicloalquilo C3 - C6 ;
R3 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1 - C18 , (alquilo C0 - C4) (cicloalquilo C3 - C6), (alquilo C0 -C4) (heterocíclico C2 - C5 ), (alquilo C0 - C4) (arilo C6 - C10 )R7 y (alquilo C1 - C4) (heteroarilo C3 - Cg) o R4 y R3 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5 ó e miembros;
R5 es NHR6 ;
R6 es H, alquilo C1 - C8 ; y
R7 se selecciona del grupo que consiste en H y OH;
R13 es COOH o CONH2 ;
R9 se selecciona del grupo que consiste en acilo C16 - C30 y alquilo C16 - C30;
R11 y R13 son cada uno H;
R10 y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo C1 -C4) NH2 , (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 +) NH 2 , y CH2 (C3 - N2 heterocíclico); y
S1 es un enlace o un espaciador que consiste en uno o dos aminoácidos cargados seleccionados del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico, ácido homoglutámico, arginina, lisina e histidina.
[0109] En una realización adicional, la cadena A comprende la secuencia GIVEQCCX8SICSLYQLENYCX2 1 R13 (SEQ ID NO : 3), la secuencia de la cadena B comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO : 2) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT (SEQ ID NO : g) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT (SEQ ID NO : 5); y FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTEKT (SEQ ID NO : e), donde R ^es COOH y el aminoácido carboxi terminal de la cadena B tiene opcionalmente una amida (CONH2) en lugar del grupo carboxi del carbono alfa natural, con las designaciones restantes definidas tal como se indica inmediatamente antes. En una realización, la cadena A comprende una secuencia GIVEQCCTSICSLYQLENYCN -R44 (SEQ ID NO : i ) y la cadena B comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO : 2) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT (SEQ ID NO : g) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT (SEQ ID NO : 5) o FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTEKT (SEQ ID NO : e).
[0110] En una realización, los análogos de insulina descritos en el presente documento comprenden una amida o éster C-terminal en lugar de un carboxilato C-terminal en la cadena A y/o la cadena B.
[0111] De acuerdo con una realización, el elemento profármaco peptídico como se describe en el presente documento que tiene la estructura general
Figure imgf000025_0002
Figure imgf000026_0001
se modifica adicionalmente para comprender un polímero grande que interfiere con la capacidad del análogo de insulina para interactuar con la insulina o el receptor de IGF-1. La escisión subsiguiente del dipéptido libera el análogo de insulina del complejo de dipéptido en el que el análogo de insulina liberado es completamente activo. De acuerdo con una realización, el elemento profármaco se une mediante un enlace amida a una amina alifática seleccionada entre la amina N - terminal de la cadena A o la cadena B o la amina de la cadena lateral de una lisina en la posición B3, B27 o B28, en la que los sustituyentes de R1 , R2 , R4, Rs , R10 , R11 , R12 y R13 se definen a lo largo de la presente divulgación. En una realización, el elemento profármaco se une covalentemente al péptido de insulina a través de un enlace amida en la amina N - terminal de la cadena A o la cadena B, o se une a una cadena lateral portadora de amina de un aminoácido interno, en donde el elemento profármaco comprende además un polímero de depósito unido al elemento profármaco. De acuerdo con una realización, el elemento profármaco peptídico tal como se describe en el presente documento tiene la estructura general de
Figure imgf000026_0002
en la que D1 es un resto escindible por enzima sérica unido covalentemente a través de un enlace amida al elemento profármaco peptídico. En una realización D1 es un péptido que es escindido por la dipeptidil peptidasa IV (DPP-lV), incluyendo por ejemplo un dipéptido de Arg-Pro, Lys-Pro o Glu-Pro. Los sustituyentes de R1 , R2 , R4, R8 , R10 , R11 , R12 y R13 se definen a lo largo de la presente descripción.
[0112] En una realización, un aminoácido nativo del péptido de insulina se sustituye con un aminoácido adecuado para formar un enlace amida con el elemento profármaco descrito en el presente documento. En una realización, un elemento de profármaco que lleva depósito está conectado en una posición seleccionada de A14, A19, B3, B16, B28 y B29. En una realización, dos o más elementos de profármaco que contienen polímero de depósito están unidos a un péptido de insulina, en el que el primer elemento de profármaco que contiene polímero de depósito está unido a la amina N - terminal de la cadena B y el segundo elemento de profármaco que contiene polímero de depósito está unido a la amina N - terminal de la cadena A o a la amina de la cadena lateral de una lisina en la posición B3, B28 o B29 de la insulina. En una realización, el polímero de depósito es un resto que se une de manera irreversible una proteína del plasma de mamífero, y en una realización, el polímero de depósito es un grupo acilo o alquilo que tiene un tamaño suficiente para unirse de manera irreversible a la albúmina de suero de mamífero. En una realización, el polímero de depósito se selecciona para que sea biocompatible y de tamaño suficiente (o sea capaz de unirse de manera irreversible a una proteína plasmática de tamaño suficiente) para que el péptido de insulina modificado por la unión covalente del elemento profármaco permanezca secuestrado en un sitio de inyección y/o o incapaz de interaccionar con su receptor correspondiente tras la administración a un paciente. La escisión posterior del elemento profármaco libera el péptido de insulina para que interactúe con su diana prevista. En una realización, dos o más elementos de profármaco que contienen polímero de depósito están unidos a un péptido de insulina, en el que el primer elemento de profármaco que contiene polímero de depósito está unido a la amina N - terminal de la cadena B y el segundo elemento de profármaco que contiene polímero de depósito está unido a la amina N - terminal de la cadena A o a la amina de la cadena lateral de una lisina en la posición B3, B28 o B29 de la insulina. En una realización, el polímero de depósito es un resto que se une de manera irreversible una proteína del plasma de mamífero, y en una realización, el polímero de depósito es un grupo acilo o alquilo que tiene un tamaño suficiente para unirse de manera irreversible a la albúmina de suero de mamífero. En una realización, el polímero de depósito se selecciona para que sea biocompatible y de tamaño suficiente (o sea capaz de unirse de manera irreversible a una proteína plasmática de tamaño suficiente) para que el péptido de insulina modificado por la unión covalente del elemento profármaco permanezca secuestrado en un sitio de inyección y/o o incapaz de interaccionar con su receptor correspondiente tras la administración a un paciente. La escisión posterior del elemento profármaco libera el péptido de insulina para que interactúe con su diana prevista.
[0113] De acuerdo con una realización, el polímero de depósito se selecciona de polímeros biocompatibles conocidos por los expertos en la técnica. Los polímeros de depósito tienen típicamente un tamaño seleccionado de un rango de aproximadamente 20.000 a 120.000 Dalton. En una realización, el polímero de depósito tiene un tamaño seleccionado de un rango de aproximadamente 40.000 a 100.000 o aproximadamente 40.000 a 80.000 Dalton. En una realización, el polímero de depósito tiene un tamaño de aproximadamente 40.000, 50.000, 60.000, 70.000 u 80.000 Dalton. Los polímeros de depósito adecuados incluyen, pero sin limitación, dextranos, polilactidas, poliglicólidos, polímeros basados en caprolactona, poli(caprolactona), polianhídridos, poliaminas, poliesteramidas, poliortoésteres, polidioxanonas, poliacetales, policetales, policarbonatos, polifosfoésteres, poliésteres, tereftalato de polibutileno, poliortocarbonatos, polifosfacenos, succinatos, poli(ácido málico), poli(aminoácidos), polivinilpirrolidona, polietilenglicol, polihidroxicelulosa, polisacáridos, quitina, quitosano, ácido hialurónico y copolímeros, terpolímeros y mezclas de los mismos, y polímeros biodegradables y sus copolímeros, incluidos polímeros a base de caprolactona, policaprolactonas y copolímeros que incluyen tereftalato de polibutileno. En una realización, el polímero de depósito se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol, dextrano, ácido poliláctico, ácido poliglicólico y un copolímero de ácido láctico y ácido glicólico, y en una realización específica, el polímero de depósito es polietilenglicol. En una realización, el polímero de depósito es polietilenglicol y el peso molecular combinado de los polímeros de depósito unidos al elemento de dipéptido es de aproximadamente 40.000 a 80.000 Dalton. En una realización, el polímero de depósito es un resto que se une de manera irreversible a una proteína del plasma de mamífero, y en una realización, el polímero de depósito es un grupo acilo o alquilo que tiene un tamaño suficiente para unirse de manera irreversible a albúmina de suero bovino.
[0114] De acuerdo con una realización, el elemento profármaco comprende además un grupo óxido de polietileno, alquilo o acilo. En una realización, una o más cadenas de óxido de polietileno están unidas al elemento profármaco peptídico en el que el peso molecular combinado de las cadenas de óxido de polietileno oscila entre aproximadamente 20.000 y aproximadamente 80.000 Dalton, o entre 40.000 y 80.000 Dalton o entre 40.000 y 60.000 Dalton. En una realización, el óxido de polietileno es polietilenglicol. En una realización, al menos una cadena de polietilenglicol que tiene un peso molecular de aproximadamente 40.000 Dalton o aproximadamente 20.000 Dalton está unida al elemento profármaco directamente o a través de un enlazador/espaciador. En otra realización, el dipéptido autoescindible del elemento profármaco peptídico se acila con un grupo acilo de tamaño suficiente para unirse a la albúmina sérica, y así inactivar el análogo de insulina tras la administración. El grupo acilo puede ser lineal o ramificado y, en una realización, es un ácido graso de C16 a C30. Por ejemplo, el grupo acilo puede ser cualquier ácido graso C16, ácido graso C18, ácido graso C20, ácido graso C22, ácido graso C24, ácido graso C26, ácido graso C28 o ácido graso C30. En una realización, el grupo acilo es un ácido graso C16 a C20, por ejemplo, un ácido graso C18 o un ácido graso C20 o es un ácido graso C18 o C30.
[0115] La selección de los sustituyentes en el elemento de dipéptido y el sitio de unión del elemento profármaco de dipéptido puede afectar a la velocidad de escisión química del elemento profármaco de dipéptido del péptido de insulina. En una realización, se proporciona un profármaco de insulina que comprende una secuencia de cadena A y una secuencia de cadena B, donde la cadena A comprende la secuencia GIVEQCCX8SICSLYQLENYCX21 R13 (SEQ ID NO : 3) y la secuencia de cadena B comprende la secuencia de X 14-X4LCGX5X6LVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO : 4) donde
X6 se selecciona del grupo que consiste en treonina e histidina;
X21 se selecciona del grupo que consiste en asparagina, glicina, alanina, treonina y serina;
X4 se selecciona del grupo que consiste en histidina y treonina;
X5 se selecciona del grupo que consiste en alanina, glicina y serina;
X6 se selecciona del grupo que consiste en histidina, ácido aspártico, ácido glutámico, ácido homocisteico y ácido cisteico; y
X 14 se selecciona del grupo que consiste en un enlace, XgVNQ (SEQ ID NO : 21), VNQ, NQ y Q, y Xg se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina y desamino-fenilalanina, donde además un elemento profármaco peptídico comprende la estructura:
Figure imgf000027_0001
está unido a la amina N - terminal del péptido de SEQ ID NO : 3 o SEQ ID NO : 4, donde R1 se selecciona del grupo que consiste en (alquilo C1 - C6) NH-R9, (alquilo C1 - C6) NH-S1 -R9;
R2 , R4 y R8 son H;
R3 es alquilo C1 - C6;
R5 es NH2 ;
R9 se selecciona del grupo que consiste en acilo C16 - C30 y alquilo C16 - C30;
R11 y R13 son cada uno H;
R10 y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo C1 -C4) NH2 , (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 +) NH2 , y CH2 (heterocíclico C3 - N2); y
S1 es un enlace o un espaciador que consiste en uno o dos aminoácidos cargados seleccionados del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico, ácido homoglutámico, arginina, lisina e histidina . En una realización, la cadena A comprende una secuencia GIVEQCCX 8SICSLYQLENYCX21 R13 (SEQ ID NO : 3) y la cadena B comprende una secuencia R22 -X25LCGAX3 oLVDALYLVCGDX42 GFY (SEQ ID NO : e5), en las que
X8 es fenilalanina o histidina;
X21 es alanina o asparagina;
X25 es histidina o treonina;
X30 se selecciona del grupo que consiste en histidina, ácido aspártico, ácido glutámico, ácido homocisteico y ácido cisteico;
X42 se selecciona del grupo que consiste en alanina ornitina y arginina;
R22 se selecciona del grupo que consiste en AYRPSE (SEQ ID NO : i4), FVNQ (SEQ ID NO : i2), FVKQ (SEQ ID NO : 8), PGPE (SEQ ID NO : i i ) , un tripéptido glicina-prolina-ácido glutámico, un tripéptido valinaasparagina-glutamina, un dipéptido prolina-ácido glutámico, un dipéptido asparagina-glutamina, glutamina, ácido glutámico y una amina N - terminal; y
R44 es COOH o CONH2. En otra realización, la cadena A comprende una secuencia GIVEQCCTSICSLYQLENYCN -R 44 (SEQ ID NO : i ) y la cadena B comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO : 2) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT (SEQ ID NO : 9) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT (SEQ ID NO : 5) FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTEKT (SEQ ID NO : e).
[0 iie ] En una realización, los profármacos que tienen el elemento profármaco de dipéptido unido al aminoácido N - terminal del péptido de la cadena A o B de la insulina y que tienen un t 1 / 2 , por ejemplo, entre aproximadamente i2 y aproximadamente 72 horas, o en una realización entre aproximadamente i2 y aproximadamente 48 horas, comprenden un elemento profármaco de dipéptido con la estructura:
Figure imgf000028_0001
en la que R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1 - C8 y (alquilo C1 - C4) NH2 , o R1 y R2 están unidos a través de (CH2)p, donde p es 2-9;
R3 es alquilo C1 - C8 o R3 y R4 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo heterocíclico de 4-e;
R4 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C1 - C8 ; y
R5 es NH2 , con la condición de que tanto R1 como R2 no sean hidrógeno.
[0117 ] En otras realizaciones, los profármacos que tienen el elemento profármaco de dipéptido unido al aminoácido N - terminal del péptido de la cadena A o B de la insulina y que tienen un t 1 / 2 , por ejemplo, entre aproximadamente i2 y aproximadamente 72 horas, o en una realización entre aproximadamente i2 y aproximadamente 48 horas, comprenden un elemento profármaco de dipéptido con la estructura:
en la que
Figure imgf000028_0002
R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1 - C8 y (alquilo C1 -C4) NH2 ;
R3 es alquilo C1 - C6 ;
R4 es hidrógeno; y
R5 es NH2 , con la condición de que tanto R1 como R2 no sean hidrógeno.
[0118 ] En una realización, los profármacos que tienen el elemento profármaco de dipéptido unido al aminoácido N - terminal del péptido de la cadena A o B de la insulina y que tienen un t 1 / 2 , por ejemplo, entre aproximadamente 12 y aproximadamente 72 horas, o en una realización, entre aproximadamente 12 y aproximadamente 48 horas, comprenden un elemento profármaco de dipéptido con la estructura:
Figure imgf000029_0001
en la que
R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C1 - C8, (alquilo C1 -C4) NH2, o
R1 y R2 están unidos a través de (CH2)p, donde p es 2-9;
R3 es alquilo C1 - C8;
R4 es (alquilo Co - C4) (arilo C6 - C1 o)R7;
R5 es NH2; y
R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1 - C8 y (alquilo Co - C4)OH, con la condición de que tanto R1 como R2 no sean hidrógeno.
[0119] Además, se proporciona un profármaco que tiene el elemento profármaco de dipéptido unido al aminoácido alfa N - terminal del péptido de la cadena A o B de la insulina y que tiene una t-i/2, por ejemplo, de aproximadamente 72 a aproximadamente 168 horas, donde el elemento profármaco de dipéptido tiene la estructura:
Figure imgf000029_0002
en la que R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1 - C8 y (alquilo C0 - C4) (arilo C6 -C-io)R7;
R3 es alquilo C1 - C18 ;
cada uno de R4 y R8 es hidrógeno;
R5 es NHR6 u OH;
R6 es H, alquilo C1 - C8, o R6 y R1 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5 ó 6 miembros; y
R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1 - C18 , alquenilo C2 - C18 , (alquilo C0 - C4) CONH2 , (alquilo C0 - C4) Co Oh , (alquilo C0 - C4) NH2 , (alquilo C0 - C4)OH y halo, con la condición de que, si R1 es alquilo o (alquilo C0 - C4) (arilo C6 - C10)R7 , entonces R1 y R5 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo heterocíclico de 4-11.
[o12o] En una realización, el elemento profármaco de dipéptido está unido a una amina de cadena lateral de un aminoácido interno del péptido de insulina en el que el aminoácido interno comprende la estructura de Fórmula IV:
Figure imgf000029_0003
en la que
n es un número entero seleccionado de 1 a 4. En una realización n es 3 o 4 y en una realización el aminoácido interno es lisina. En una realización, el elemento profármaco de dipéptido está unido a una amina primaria en una cadena lateral de un aminoácido ubicado en la posición 3, 28 o 29 de la cadena B del péptido de insulina.
[0121] En una realización, se proporciona un profármaco de insulina que comprende una secuencia de la cadena A y una secuencia de la cadena B, en el que la cadena A comprende la secuencia GIVEQCCX1 SICSLYQLENYCX3 (SEQ ID NO : 3) y la secuencia de la cadena B comprende la secuencia de X 14 -X4 LCGX5X6 LVEALX 7 LVCGERGFX 8 (SEQ ID NO : 14) en la que
X 1 se selecciona del grupo que consiste en treonina e histidina.
[0122] En otra realización, se proporciona un análogo de profármaco de insulina que comprende una secuencia de cadena A de GIVEQCCX1 SICSLYQLENYCX3 (SEQ ID NO : 3) y una secuencia de cadena B que comprende una secuencia de Z-X4 LCGX5X6 LVEAlYlVCGERGFF (Se Q ID NO : 4) en las que
Z es un péptido que comprende la estructura
general:
Figure imgf000030_0001
en las que
X 1 se selecciona del grupo que consiste en treonina e histidina;
X3 se selecciona del grupo que consiste en asparagina, glicina, alanina, treonina o serina;
X4 se selecciona del grupo que consiste en histidina y treonina;
X5 se selecciona del grupo que consiste en alanina, glicina y serina;
X6 se selecciona del grupo que consiste en histidina, ácido aspártico, ácido glutámico, ácido homocisteico y ácido cisteico;
donde R1 se selecciona del grupo que consiste en H, (alquil C1 - C6) NH-R9, (alquilo C1 - C 6) NH-S1 -R9 y alquilo C1 - C8 ;
R2 y R8 se seleccionan independientemente entre H o alquilo C1 - C4;
R4 se selecciona del grupo que consiste en H, (alquil C1 - C6) NH-R9, (alquilo C1 - C6) NH-S1-R9, alquilo C1 -C8 , alquenilo C2 - C8, (alquilo C1 - C4)OH, (alquilo C1 - C4)SH, (alquilo C2 - C3 )SCH3, (alquilo C1 - C4) CONH2 , (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo C1 - C4) NH2 , (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 +) NH2 , (alquilo C1 - C4) (cicloalquilo C3 - C6), (alquilo C1 - C4) (arilo C6 - C1 0)R7, CH2 (heteroarilo C5 - Cg) o R1 y R2 junto con los átomos a los que están unidos forman un cicloalquilo C3 - C6 ;
R3 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1 - Cs, (alquilo C1 - C4) (cicloalquilo C3 - C6), (alquilo C1 -C4) (arilo C6 - C10)R7 y (alquilo C1 - C4)OH;
R5 es NH2 ;
R7 se selecciona del grupo que consiste en H y OH;
R9 se selecciona del grupo que consiste en acilo C16 - C30 y alquilo C16 - C30;
R11 y R13 son cada uno H; R10 y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo C1 - C4) NH2 , (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 + ) NH2 y CH2(heterocíclico C3 -N 2); y S1 es un enlace o un espaciador que consiste en uno o dos aminoácidos cargados seleccionados del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico, ácido homoglutámico, arginina, lisina e histidina.
[0123] En una realización, la cadena A comprende una secuencia de GIVEQCCX 1 SICSLYQLENYCX3 (SEQ ID NO : 3) y la secuencia de la cadena B comprende la secuencia Z-XgVNQX4LCGX5X6LVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO : 10) o
ZX9VNQX4 LCGX5X6 LVEALYLVCGERGFFYTKPT (SEQ ID NO : 13), en la que X 1 se selecciona del grupo que consiste en treonina e histidina;
X3 es asparagina, glicina, alanina, treonina o serina;
X4 se selecciona del grupo que consiste en histidina y treonina;
X5 se selecciona del grupo que consiste en alanina, glicina y serina;
X6 se selecciona del grupo que consiste en histidina, ácido aspártico, ácido glutámico, ácido homocisteico y ácido cisteico;
Xg se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina y desaminofenilalanina.
[0124] De acuerdo con una realización, se proporciona un análogo de profármaco de insulina de cadena sencilla en el que el extremo carboxi de la cadena B de insulina humana, o un análogo funcional de la cadena B de insulina humana, está unido covalentemente al extremo N - terminal de la cadena A de insulina humana, o análogo funcional de la cadena B de insulina humana, y además en el que un resto de profármaco peptídico tiene la estructura general:
Figure imgf000031_0001
que está unida mediante un enlace amida a la amina N - terminal del análogo de insulina de cadena sencilla en el que
R1 es (alquilo C1 - C6) NH-S1 -R9 o (alquilo C1 - C6) NH-R9;
R2 es H o alquilo C1 - C6
R3 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1 - C6, alquenilo C3 - C8 , (alquilo C0 - C4) (cicloalquilo C4 -C6), (alquilo C0 - C4) ( heterocíclico C 3 - C5), (alquilo C0 - C4) (arilo C6 - C10) o R4 y R3 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5 o e miembros;
R4 y R8 se seleccionan independiente del grupo que consiste en H, alquilo C1 - C18, alquenilo C2 - C18, (alquilo C1 - C18)OH, (alquilo C1 - C18)sH, (alquilo C2 - C3)SCH3 , (alquilo C1 - C4) CONH2 , (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo C1 - C4) NH2 , (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 +) NH2 , (alquilo C0 - C4) (cicloalquilo C3 - C6), (alquilo C0 - C4) (heterocíclico C2 - C5 ), (alquilo C0 - C4) (arilo C6 - C10 )R7 , (alquilo C1 - C4) (heteroarilo C3 - Cg) y alquilo C1 -C12 (W 1 ) alquilo C1 - C12 , en la que W 1 es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y O, o R4 y R8 junto con los átomos a los que están unidos forman un cicloalquilo C3 - C6 ;
R10 , R11 , R12 y R13 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, CH3, (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo C1 - C4) NH2 , (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 +) NH2 y CH2 (heterocíclico C3-N2);
R5 es NH2 ;
R7 se selecciona del grupo que consiste en H, OH, alquilo C1 - C18, alquenilo C2 - C18 , (alquilo C0 - C4) NH2 y (alquilo C0 - C4)OH;
R9 se selecciona del grupo que consiste en acilo C18 - C30 y alquilo C6 - C30;
S1 es un enlace o espaciador que consiste en uno a seis aminoácidos, donde dicho espaciador comprende uno o más aminoácidos cargados seleccionados del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, arginina y lisina . En una realización, R1 es (alquilo C1 - C6) NH-S1 -R9 o (alquilo C1 - C6) NH-R9; R2 y R8 son ambos H; y R3 es alquilo C1 - C6. En una realización adicional, R9 es acilo C18 - C30; R11 y R13 son cada uno H; R10 y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo C1 - C4) NH2 , (alquilo C1 - C4) NHC(NH2 +) NH2 y CH2(heterocíclico C3 - N2) ; y S1 es un espaciador que consiste en uno o dos aminoácidos cargados seleccionados del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico, ácido homoglutámico, arginina, lisina e histidina. En una realización, el péptido de insulina comprende una secuencia de cadena A de GIVEQCCX 8 SICSLYQLENYCX21 (SEQ ID NO : 3) y una secuencia de cadena B de R22 -HLCGSHLVEALYLYCGERGFX45 (SEQ ID NO : i5), donde dicha cadena B está unida a dicha cadena A a través de enlaces disulfuro;
R22 es un grupo amino, o una secuencia de i a 4 aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en FVNQ (SEQ ID NO : i2), FVKQ (SEQ ID NO : 8), VNQ, NQ y Q;
X8 se selecciona del grupo que consiste en treonina e histidina;
X21 se selecciona del grupo que consiste en asparagina, lisina, glicina, alanina; y
X45 es histidina, tirosina o fenilalanina. En una realización adicional, la cadena A comprende una secuencia GIVEQCCTSICSLYQLENYCN -R 44(SEQ ID NO : i ) y dicha cadena B comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO : 2) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT (SEQ ID NO : g) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT (SEQ ID NO : 5) y FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTEKT (SEQ ID NO : e).
[o i25] De acuerdo con una realización, el análogo de insulina monocatenario comprende un compuesto de fórmula: B-P-A, en la que: B representa la cadena B de la insulina humana o uno de los análogos funcionales o profármacos de una cadena B tal como se describe en el presente documento, A representa la cadena A de insulina humana o uno de los análogos funcionales de una cadena A tal como se describe en el presente documento, y P representa un enlazador, incluido un enlazador peptídico, que une covalentemente la cadena A con la cadena B. En una realización, el enlazador es un enlazador peptídico de aproximadamente 5 a aproximadamente i8 , o de aproximadamente io a aproximadamente i4 , o de aproximadamente 4 a aproximadamente 8, o de aproximadamente e aminoácidos. En una realización, la cadena B está unida a la cadena A a través de un enlazador peptídico de 4 -i2 o 4-8 aminoácidos. En una realización, el enlazador peptídico del análogo de cadena sencilla se selecciona del grupo que consiste en GYGSSSRRAPQT; SEQ ID NO : 23, GYGSSSRR (SEQ ID NO : e i), GYGSSSOR (SEQ ID NO : e3), GAGSSSRR (SEQ ID NO : ee) o GAGSSSRRAPQT (SEQ ID NO : e4) o una secuencia que difiere de las SEQ ID NO : 23 o ee en i a 3 sustituciones de aminoácidos, o i a 2 sustituciones de aminoácidos. Opcionalmente, el resto enlazante de los análogos de cadena sencilla también puede servir como un sitio para la unión del elemento profármaco peptídico y, en una realización, el resto enlazante es un enlazador peptídico que comprende un aminoácido que tiene un grupo de cadena lateral adecuado para unir el elemento profármaco peptídico tal como se describe en el presente documento a través de un enlace amida.
[0126] De acuerdo con una realización, el enlazador peptídico tiene una longitud de 5 a 18 aminoácidos y comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg (SEQ ID NO : 22), Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-GlN -Thr (SEQ ID NO : 23), Arg-Arg-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO : 32), Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-Arg (SEQ ID NO : 24), Arg-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO : 25), Gly-Gly-Ala-Pro - Gly-Asp-Val-Lys-Arg (SEQ ID NO : 26), Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly (SEQ ID NO : 27), Gly-Gly-Tyr-Pro - Gly-Asp-Val-Lys-Arg (SEQ ID NO : 28), Arg-Arg-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly (SEQ ID NO : 29), Gly-Gly-His-Pro - Gly-Asp-Val-Lys-Arg (SEQ ID NO : 30) y Arg-Arg-His-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly (SEQ ID NO : 31). En una realización, el enlazador peptídico tiene una longitud de 7 a 12 aminoácidos y comprende la secuencia Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg (s Eq ID NO : 22) o Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-GlN -Thr (SEQ ID NO : 23).
[0127] En una realización adicional, el enlazador peptídico comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en AGRGSGK (SEQ ID NO : 35), AGLGSGK (SEQ ID NO : 36), AGMGSGK (SEQ ID NO : 37), ASWGSGK (SEQ ID NO : 38), TGLGSGQ (SEQ ID NO : 39), TGLGRGK (SEQ ID NO : 40), TGLGSGK (SEQ ID NO : 41), HGLYSGK (SEQ ID NO : 42), KGLGSGQ (SEQ ID NO : 43), VGLMSGK (SEQ ID NO : 44), VGLSSGQ (SEQ ID NO : 45), VGLYSGK (SEQ ID NO : 46), VGLSSGK (SEQ ID NO : 47), VGMSSGK (SEQ ID NO : 48), VWSSSGK (SEQ ID NO : 49), VGSSSGK (SEQ ID NO : 50), VGMSSGK (SEQ ID NO : 51), TGLGSGR (SEQ ID NO : 52), TGLGKGQ (SEQ ID NO : 53), KGLSSGQ (SEQ ID NO : 54), VKLSSGQ (SEQ ID NO : 55), VGLKSGQ (SEQ ID NO : 56), TGLGKGQ (SEQ ID NO : 57), SRVSRRSR (SEQ ID NO : 60), GYGSSSRRAPQT (SEQ ID NO : 23) y VGLSKGQ (SEQ ID NO : 58). En una realización, el enlazador comprende GSSSRRAP (SEQ ID NO : 62) o SRVSRRSR (SEQ ID NO : 60).
[0128] En una realización, el análogo de insulina monocatenario tiene la secuencia de aminoácidos: Phe-Val-AsN -GlN -His-Leu - Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr - Leu-Val - Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Gly-Ile-Val-Glu-Gln - Cys - Cys-Thr-Ser-Ile - Cys - Ser-Leu-Tyr-GlN -Leu-Glu-AsN -Tyr - Cys-Asn (SEQ ID NO : 33) o Phe-Val-AsN -GlN -His-Leu - Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val -Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val - Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-GlN -Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly -Ser-Leu-GlN -Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln - Cys - Cys-Thr-Ser-Ile - Cys-Ser-Leu-Tyr-GlN -Leu-Glu-AsN -Tyr - Cys -Asn (SEQ ID NO : 34).
[0129] Los profármacos de insulina descritos en el presente documento pueden ser parte de un dímero, trímero o multímero de orden superior que comprende al menos dos, tres o más péptidos unidos a través de un enlazador, en el que al menos uno o ambos péptidos comprenden un elemento de profármaco peptídico unido al péptido de insulina. El dímero puede ser un homodímero o heterodímero, que comprende péptidos seleccionados del grupo que consiste en insulina nativa, IGF-1 nativo, IGF-II nativo y péptidos análogos de insulina tal como se describen en este documento. En una realización, el enlazador se selecciona del grupo que consiste en un reticulador bifuncional de tiol y un reticulador bifuncional de amina. En determinadas realizaciones, el enlazador es PEG, por ejemplo, un PEG de 5 kDa, un PEG de 20 kDa. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlace disulfuro.
[0130] Por ejemplo, cada monómero del dímero puede comprender un resto Cys (por ejemplo, una Cys terminal o posicionada internamente) y el átomo de azufre de cada resto de Cys participa en la formación del enlace disulfuro entre los monómeros de insulina. Cada monómero del dímero representa un heterodímero de una cadena A y B. Las cadenas A y B están unidas mediante enlaces disulfuro o se preparan como péptidos de cadena sencilla. En algunos aspectos de la descripción, los monómeros peptídicos de insulina (cada uno de los cuales comprende una cadena A y B de insulina) están conectados a través de aminoácidos terminales (por ejemplo, N - terminal o C-terminal), a través de aminoácidos internos o a través de un aminoácido terminal de al menos un monómero y un aminoácido interno de al menos otro monómero. En aspectos específicos, los monómeros no están conectados a través de un aminoácido N - terminal. En algunos aspectos, los monómeros del multímero se unen entre sí en una orientación de "cola a cola" en la que los aminoácidos C-terminales de cada monómero se unen entre sí. Un resto conjugado puede unirse covalentemente a cualquiera de los péptidos de insulina descritos en el presente documento, incluido un dímero, trímero o multímero de orden superior.
[0131] Los profármacos descritos en el presente documento se pueden modificar adicionalmente para mejorar la solubilidad del péptido en soluciones acuosas a pH fisiológico, mientras se mejora la duración efectiva del péptido al prevenir la eliminación renal del péptido. Los péptidos se eliminan fácilmente debido a su tamaño molecular relativamente pequeño en comparación con las proteínas plasmáticas. El aumento del peso molecular de un péptido por encima de 40 kDa supera el umbral renal y prolonga significativamente la duración en el plasma. Por consiguiente, en una realización, los profármacos peptídicos se modifican adicionalmente para comprender un resto hidrófilo unido covalentemente. En una realización, el resto hidrófilo es una proteína plasmática, una cadena de óxido de polietileno o la porción Fc de una inmunoglobina. Por lo tanto, en una realización, los profármacos descritos en el presente documento se modifican adicionalmente para comprender uno o más grupos hidrófilos unidos covalentemente a las cadenas laterales de aminoácidos del péptido de insulina.
[0132] De acuerdo con una realización, los profármacos de insulina descritos en el presente documento se modifican aún más mediante la unión de un resto hidrófilo al aminoácido N - terminal de la cadena B o a la cadena lateral de un aminoácido de lisina ubicado en el extremo carboxi del cadena B, que incluye, por ejemplo, en la posición 28 de SEQ ID NO : 9 o en la posición 29 de SEQ ID NO : 2. En una realización, se proporciona un análogo de profármaco de insulina de cadena única en el que uno de los aminoácidos del enlazador peptídico es modificado mediante la unión de un resto hidrófilo a la cadena lateral del enlazador peptídico. En una realización, el aminoácido modificado es cisteína, lisina o acetilfenilalanina.
[0133] En otra realización, los análogos de profármacos de insulina descritos en el presente documento se modifican adicionalmente mediante la adición de un aminoácido modificado al extremo carboxi terminal de la cadena B del profármaco de insulina, en el que el aminoácido añadido en el extremo Cse modifica para comprender un resto hidrófilo unido al aminoácido. En una realización, el aminoácido agregado al extremo C-terminal es una cisteína, lisina o acetilfenilalanina modificadas. En una realización, un elemento profármaco peptídico tal como se describe en el presente documento está unido a la amina de la cadena lateral de un residuo de lisina que se ha añadido al extremo C-terminal de la cadena B. En una realización, el resto hidrófilo se selecciona del grupo que consiste en una proteína plasmática, una cadena de óxido de polietileno y una porción Fc de una inmunoglobina.
[0134] En una realización, el grupo hidrófilo es una cadena de óxido de polietileno, y en una realización, dos o más cadenas de óxido de polietileno están unidas covalentemente a dos o más cadenas laterales de aminoácidos del análogo de profármaco de insulina. De acuerdo con una realización, el resto hidrófilo se une covalentemente a una cadena lateral de aminoácido de un análogo de profármaco de insulina descrito en el presente documento en una posición seleccionada del grupo que consiste en A9, A14, A15, B3, B22, B28, B29 y el extremo C-terminal o N - terminal de la cadena B. Para los análogos de profármacos de insulina que tienen múltiples cadenas de óxido de polietileno, las cadenas de óxido de polietileno se pueden unir al aminoácido N - terminal de la cadena B o a la cadena lateral de un aminoácido de lisina ubicado en el extremo carboxi de la cadena B, o mediante la adición de un único aminoácido en el extremo C-terminal del péptido, en el que el aminoácido añadido tiene una cadena de óxido de polietileno unida a su cadena lateral. De acuerdo con una realización, la cadena de óxido de polietileno u otro resto hidrófilo está unido a la cadena lateral de uno de los dos aminoácidos que comprenden el elemento profármaco de dipéptido. En una realización, el elemento profármaco peptídico comprende una lisina (en la configuración D o L) con una cadena de óxido de polietileno unida a la amina de la cadena lateral de la lisina.
Unión de restos hidrófilos
[0135] En una realización, la solubilidad de los análogos de insulina descritos en el presente documento se potencia mediante el enlace covalente de un resto hidrófilo al péptido. Los restos hidrófilos se pueden unir a los análogos de insulina bajo cualquier condición adecuada utilizada para hacer reaccionar una proteína con una molécula de polímero activado. Se puede usar cualquier medio conocido en la técnica, incluso a través de acilación, alquilación reductora, adición de Michael, alquilación de tiol u otros procedimientos de conjugación/ligación quimioselectivos a través de un grupo reactivo en el resto de PEG (por ejemplo, un grupo aldehído, amino, éster, tiol, a-haloacetilo, maleimido o hidrazino) a un grupo reactivo en el compuesto diana (por ejemplo, un grupo aldehído, amino, éster, tiol, a-haloacetilo, maleimido o hidrazino). Los grupos activadores que se pueden usar para unir el polímero soluble en agua a una o más proteínas incluyen, sin limitación, sulfona, maleimida, sulfhidrilo, tiol, triflato, tresilato, azidirina, oxirano y 5-piridilo. Si se une al péptido por alquilación reductora, el polímero seleccionado debe tener un solo aldehído reactivo para que se controle el grado de polimerización. Véase, por ejemplo, Kinstler et al., Adv. Drug. Delivery Rev. 54: 477-485 (2002); Roberts et al., Adv. Drug Delivery Rev. 54: 459-476 (2002); y Zalipsky et al., Adv. Drug Delivery Rev.
16: 157-182 (1995).
[0136] Los restos hidrófilos adecuados incluyen polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, polioles polioxietilados (por ejemplo, POG), sorbitol polioxietilado, glucosa polioxietilada, glicerol polioxietilado (POG), polioxialquilenos, polietilenglicol propionaldehído, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, monometoxipolietilenglicol, mono-(C1 -C10) a lcoxi-o ariloxi-polietilenglicol, carboximetilcelulosa, poliacetales, alcohol polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poli(.beta.-aminoácidos) (ya sean homopolímeros o copolímeros aleatorios), poli (N -vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol (PPG) y otros óxidos de polialquileno, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, ácidos colónicos u otros polímeros de polisacáridos, Ficoll o dextrano y mezclas de los mismos.
[0137] El resto hidrófilo, por ejemplo, la cadena de polietilenglicol de acuerdo con una realización tiene un peso molecular seleccionado del rango de aproximadamente 500 a aproximadamente 40.000 Dalton. En una realización, el resto hidrófilo, por ejemplo, PEG, tiene un peso molecular seleccionado del rango de aproximadamente 500 a aproximadamente 5000 Dalton, o de aproximadamente 1000 a aproximadamente 5000 Dalton. En otra realización, el resto hidrófilo, por ejemplo, PEG, tiene un peso molecular de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 20.000 Dalton. En aún otras realizaciones de ejemplo, el resto hidrófilo, por ejemplo, PEG, tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 40.000 Dalton.
[0138] En una realización, se utilizan dextranos como resto hidrófilo. Los dextranos son polímeros de polisacáridos de subunidades de glucosa, predominantemente unidos por enlaces a1-6. El dextrano está disponible en muchos intervalos de peso molecular, por ejemplo, de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 100 kDa, o de aproximadamente 5, 10, 15 o 20 kDa a aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 kDa.
[0139] Se contemplan polímeros lineales o ramificados. Las preparaciones de conjugados resultantes pueden ser esencialmente monodispersas o polidispersas, y pueden tener aproximadamente 0,5, 0,7, 1, 1,2, 1,5 o 2 restos poliméricos por péptido. En una realización, el resto hidrófilo está unido a un aminoácido del elemento profármaco peptídico.
[0140] De acuerdo con una realización, los análogos de profármacos de insulina descritos en el presente documento se modifican adicionalmente mediante sustituciones de aminoácidos, en las que el aminoácido de sustitución comprende una cadena lateral adecuada para la reticulación con restos hidrófilos, que incluyen, por ejemplo, polietilenglicol. En una realización, el aminoácido en la posición del análogo de profármaco de insulina donde se va a unir el resto hidrófilo se sustituye (o se agrega en el extremo C-terminal) con un aminoácido natural o sintético para introducir, o facilitar la unión, del resto hidrófilo. Por ejemplo, en una realización, un aminoácido nativo en la posición seleccionada de A5, A8, A9, A10, A12, A14, A15, A17, A18, B1, B2, B3, B4, B5, B13, B14, B17, B21, B22, B26, B27, B28, B29 y B30 se sustituye por un residuo de lisina, cisteína o acetil fenilalanina (o una lisina, cisteína o acetil fenilalanina se añade al extremo C-terminal para permitir la unión covalente de una cadena de polietilenglicol.
[0141] En una realización, el análogo de profármaco de insulina tiene un solo residuo de cisteína agregado al extremo carboxilo de la cadena B, o el análogo de profármaco de insulina se sustituye con al menos un residuo de cisteína, donde la cadena lateral del residuo de cisteína se modifica adicionalmente con un reactivo reactivo con tiol, que incluye, por ejemplo, maleimido, vinilsulfona, 2-piridiltio, haloalquilo y haloacilo. Estos reactivos reactivos con tiol pueden contener grupos carboxi, ceto, hidroxilo y éter, así como otros restos hidrófilos, tales como unidades de polietilenglicol. En una realización alternativa, el análogo de profármaco de insulina tiene un único resto de lisina añadido al extremo carboxilo de la cadena B, o el análogo de profármaco de insulina se sustituye por lisina, y la cadena lateral del residuo de lisina de sustitución se modifica adicionalmente utilizando reactivos reactivos con amina, tales como ésteres activos (succinimido, anhídrido, etc.) de ácidos carboxílicos o aldehídos de restos hidrófilos, tales como polietilenglicol.
[0142] En aquellas realizaciones en las que el análogo de profármaco de insulina comprende una cadena de polietilenglicol, la cadena de polietilenglicol puede estar en forma de cadena lineal o puede estar ramificada. De acuerdo con una realización, la cadena de polietilenglicol tiene un peso molecular promedio seleccionado del rango de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 60.000 Dalton. Se pueden unir múltiples cadenas de polietilenglicol al análogo de profármaco de insulina para proporcionar un análogo de profármaco de insulina con propiedades óptimas de solubilidad y eliminación de la sangre. En una realización, el análogo de profármaco de insulina está unido a una única cadena de polietilenglicol que tiene un peso molecular promedio seleccionado del intervalo de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 60.000 Dalton. En otra realización, el análogo de profármaco de insulina se une a dos cadenas de polietilenglicol en las que el peso molecular promedio combinado de las dos cadenas se selecciona del intervalo de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 80.000 Dalton. En una realización, una sola cadena de polietilenglicol que tiene un peso molecular promedio de 20.000 o 60.000 Daltons se une al análogo de profármaco de insulina. En otra realización, una sola cadena de polietilenglicol está unida al análogo de profármaco de insulina y tiene un peso molecular promedio seleccionado del intervalo de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 50.000 Dalton. En una realización, dos cadenas de polietilenglicol están unidas al análogo de profármaco de insulina en el que la primera y la segunda cadenas de polietilenglicol tienen cada una un peso molecular promedio de 20.000 Dalton. En otra realización, dos cadenas de polietilenglicol están unidas al análogo de profármaco de insulina en el que la primera y la segunda cadenas de polietilenglicol tienen cada una un peso molecular promedio de 40.000 Dalton. En otra realización, el análogo de profármaco de insulina se une a dos cadenas de polietilenglicol en las que el peso molecular promedio combinado de las dos cadenas se selecciona del intervalo de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 80.000 Dalton. En una realización, una sola cadena de polietilenglicol que tiene un peso molecular promedio de 20.000 o 60.000 Daltons se une al análogo de profármaco de insulina. En otra realización, una sola cadena de polietilenglicol está unida al análogo de profármaco de insulina y tiene un peso molecular promedio seleccionado del intervalo de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 50.000 Dalton. En una realización, dos cadenas de polietilenglicol están unidas al análogo de profármaco de insulina en el que la primera y la segunda cadenas de polietilenglicol tienen cada una un peso molecular promedio de 20.000 Dalton. En otra realización, dos cadenas de polietilenglicol están unidas al análogo de profármaco de insulina en el que la primera y la segunda cadenas de polietilenglicol tienen cada una un peso molecular promedio de 40.000 Dalton.
[0143] En otra realización, se proporciona un análogo de profármaco de insulina que comprende dos o más cadenas de polietilenglicol unidas covalentemente al péptido, en el que el peso molecular total de las cadenas de polietilenglicol es de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 60.000 Dalton. En una realización, el análogo de profármaco de insulina pegilado comprende una cadena de polietilenglicol unida a uno o más aminoácidos seleccionados del extremo N - terminal de la cadena B y/o la posición 28 de SEQ ID NO : 9 o en la posición 29 de SEQ ID NO : 2, en la que el peso molecular combinado de la(s) cadena(s) de PEG es de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 80.000 Dalton.
[0144] De acuerdo con una realización, se proporciona un análogo de profármaco de insulina en el que una secuencia de aminoácidos lineal que representa la porción Fc de una molécula de inmunoglobina se ha unido covalentemente a una cadena lateral de aminoácido de un análogo de profármaco de insulina descrito en el presente documento para mejorar la solubilidad, estabilidad y /o farmacocinética del análogo de profármaco de insulina. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos que representa la porción Fc de una molécula de inmunoglobina se puede unir covalentemente al extremo N de la cadena B o al extremo Cde la cadena A o B, o al extremo Cde una cadena A o B que ha sido extendida terminalmente. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos que representa la porción Fc de una molécula de inmunoglobina se puede unir covalentemente al extremo Cde la cadena B, incluido, por ejemplo, el enlace a un aminoácido correspondiente a la posición 28 de SEQ ID NO : 9 o en la posición 29 de la SEQ ID NO : 2. La parte Fc es típicamente una aislada de IgG, pero el fragmento del péptido de Fc de cualquier inmunoglobulina debería funcionar de manera equivalente.
[0145] En un aspecto específico de la descripción, el análogo de profármaco de insulina se modifica para comprender un grupo alquilo o acilo mediante alquilación o acilación directa de una amina, hidroxilo o tiol de una cadena lateral de un aminoácido del análogo de profármaco de insulina, incluyendo, por ejemplo, el aminoácido A o B del elemento profármaco peptídico. En una realización, el análogo de profármaco de insulina se acila directamente a través de la cadena lateral de amina, hidroxilo o tiol de un aminoácido. En una realización, la acilación se realiza en una o más posiciones seleccionadas entre A9, A14, A15, B3, B22, B28 o B29 o un aminoácido del elemento profármaco peptídico. A este respecto, el análogo de profármaco de insulina acilado puede comprender una secuencia de aminoácidos de cadena A de SEQ ID NO : 3 y una cadena B de SEQ ID NO : 5, o una secuencia de aminoácidos modificada de SEQ ID NO : 3 y/o SEQ ID NO : 5 con al menos uno de los aminoácidos en las posiciones A9, A14, A15, B22, B28 o B29 modificado a cualquier aminoácido que comprenda una cadena lateral de amina, hidroxilo o tiol. En algunas realizaciones específicas, la acilación directa del análogo de profármaco de insulina se produce a través de la amina, hidroxilo o tiol de cadena lateral del aminoácido en la posición B28 o B29 o el aminoácido A o B del elemento de profármaco peptídico. En una realización adicional, el análogo de profármaco de insulina comprende un grupo acilo de un ácido carboxílico con 18-24 átomos de carbono unido al grupo épsiloN -amino de una Lys presente en la posición B28 o B29 o el aminoácido A o B del elemento de profármaco peptídico. En una realización, se proporciona un análogo de profármaco de insulina de cadena única en el que uno de los aminoácidos del enlazador peptídico se modifica para comprender un grupo acilo mediante la acilación directa de una amina, hidroxilo, o tiol de una cadena lateral de un aminoácido del enlazador peptídico. De acuerdo con una realización, el enlazador peptídico del análogo de insulina monocatenario se selecciona del grupo que consiste en AGRGSGK (SEQ ID NO : 35), AGLGSGK (SEQ ID NO : 36), AGMGSGK (SEQ ID NO : 37), ASWGSGK (SEQ ID NO : 38), TGLGSGQ (SEQ ID NO : 39), TGLGRGK (SEQ ID NO : 40), TGLGSGK (SEQ ID NO : 41), HGLYSGK (SEQ ID NO : 42), KGLGSGQ (SEQ ID NO : 43), VGLMSGK (SEQ ID NO : 44), VGLSSGQ (SEQ ID NO : 45), VGLYSGK (SEQ ID NO : 46), VGLSSGK (SEQ ID NO : 47), VGMSSGK (SEQ ID NO : 48), VWSSSGK (SEQ ID NO : 49), VGSSSGK (SEQ ID NO : 50), VGMSSGK (SEQ ID NO : 51), TGLGSGR (SEQ ID NO : 52), TGLGKGQ (SEQ ID NO : 53), KGLSSGQ (SEQ ID NO : 54), VKLSSGQ (SEQ ID NO : 55), VGLKSGQ (SEQ ID NO : 56), TGLGKGQ (SEQ ID NO : 57) y VGLSKGQ (SEQ ID NO : 58) en donde al menos un residuo de lisina en la cadena A, en la cadena B o en el péptido enlazador se ha modificado químicamente por acilación. En una realización, el grupo acilante comprende una cadena de 1-5, 10-12 o 18-24 carbonos. En una realización, al menos un resto de lisina en el péptido de enlace de un análogo de insulina de cadena sencilla se une a un elemento profármaco peptídico descrito en el presente documento a través de un enlace amida entre A-B - Cy la amina de la cadena lateral del péptido de enlace.
[0146] De acuerdo con una realización, los análogos de profármacos de insulina como se describen en el presente documento se modifican adicionalmente para unir un compuesto adicional al elemento de profármaco peptídico del análogo. En una realización, la cadena lateral de un aminoácido que comprende el elemento profármaco de dipéptido (A-B de A-B - C) está pegilada, acilada o alquilada. En una realización, el dipéptido (A-B) se acila con un grupo que comprende una cadena de 18-24 carbonos. En una realización, el dipéptido (A-B) está pegilado con una cadena de polietilenglicol de 40-80 KDa. En una realización, el dipéptido (A-B) del elemento peptídico profármaco está pegilado y el péptido de insulina unido al elemento peptídico profármaco está acilado, incluyendo, por ejemplo, la acilación en la lisina C-terminal (B28 o B29) de la cadena B. De acuerdo con una realización, un resto hidrófilo o una macromolécula secuestrante están unidos covalentemente a la cadena lateral R1 del elemento profármaco peptídico que comprende la estructura general:
Figure imgf000036_0001
donde Ri se selecciona del grupo que consiste en (alquilo Ci - C4)OH, (alquilo Ci - C4)SH y (alquilo Ci - C4) NH2. En una realización, R1 es (alquilo C3 - C4) NH2. Las macromoléculas secuestrantes son conocidas por los expertos en la técnica e incluyen dextranos y polietilenglicol de alto peso molecular (es decir, mayor o igual a 80 KDa). Mediante la unión de la macromolécula secuestrante al resto de dipéptido, el profármaco permanecerá secuestrado, mientras que el péptido de insulina activo se libera lentamente en función de la cinética de la escisión del enlace amida del dipéptido. En una realización, el elemento profármaco peptídico comprende además un segundo péptido unido covalentemente a la amina N - terminal del elemento profármaco peptídico, en el que el segundo péptido se escinde del elemento profármaco peptídico solo tras la exposición a una enzima presente en sueros de mamíferos. Además, el segundo péptido se selecciona y se une al elemento profármaco peptídico de manera que la escisión del segundo péptido deja el elemento profármaco peptídico unido al péptido de insulina y retiene la capacidad de escindirse químicamente de forma espontánea del péptido de insulina para formar una dicetopiperazina. En una realización, el segundo péptido es un péptido que es escindido por la dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV), que incluye, por ejemplo, un dipéptido de Arg-Pro, Lys-Pro o Glu-Pro. En una realización, el elemento profármaco peptídico comprende la estructura:
Figure imgf000036_0002
[0147] La presente divulgación también abarca otros conjugados en los que los análogos de profármacos de insulina de la divulgación están unidos, opcionalmente a través de un enlace covalente, y opcionalmente a través de un enlazador, a un conjugado. El enlace se puede lograr mediante enlaces químicos covalentes, fuerzas físicas, tales como interacciones electrostáticas, de hidrógeno, iónicas, de van der Waals o hidrofóbicas o hidrofílicas. Se puede usar una variedad de sistemas de acoplamiento no covalentes, que incluyen biotinaavidina, ligando/receptor, enzima/sustrato, ácido nucleico/proteína de unión a ácido nucleico, lípido/proteína de unión a lípidos, socios de moléculas de adhesión celular; o cualquiera de los socios de unión o fragmentos de los mismos que tienen afinidad entre sí.
[0148] Los ejemplos de conjugados incluyen, pero no se limitan a, un péptido o polipéptido heterólogo (que incluye, por ejemplo, una proteína plasmática), un agente de direccionamiento, una inmunoglobulina o una porción de la misma (por ejemplo, región variable, CDR o región Fc), un marcador de diagnóstico, tal como un radioisótopo, fluoróforo o marcador enzimático, un polímero que incluye polímeros solubles en agua u otros agentes terapéuticos o de diagnóstico. En una realización, se proporciona un conjugado que comprende un análogo de profármaco de insulina de la presente descripción y una proteína plasmática, en el que la proteína plasmática se selecciona del grupo que consiste en albúmina, transferina y fibrinógeno. En una realización, el resto de proteína plasmática del conjugado es albúmina o transferina. En una realización, el enlazador comprende una cadena de átomos de 1 a aproximadamente 60, o de 1 a 30 átomos o más, de 2 a 5 átomos, de 2 a 10 átomos, de 5 a 10 átomos, o de 10 a 20 átomos de largo. En una realización, los átomos de la cadena son todos átomos de carbono. En una realización, los átomos de la cadena en el esqueleto del enlazador se seleccionan del grupo que consiste en C, O, N y S. Los átomos de la cadena y los enlazadores se pueden seleccionar de acuerdo con su solubilidad esperada (hidrofilicidad) para proporcionar un conjugado más soluble. En una realización, el enlazador proporciona un grupo funcional que está sujeto a escisión por una enzima u otro catalizador o condiciones hidrolíticas que se encuentran en el tejido u órgano o célula diana. En una realización, la longitud del enlazador es lo suficientemente larga para reducir el potencial de impedimento estérico. Si el enlazador es un enlace covalente o un enlace peptídico y el conjugado es un polipéptido, el conjugado completo puede ser una proteína de fusión. Dichos enlazadores de peptidilo pueden tener cualquier longitud. Los ejemplos de enlazadores tienen una longitud de aproximadamente 1 a 50 aminoácidos, de 5 a 50, de 3 a 5, de 5 a 10, de 5 a 15 o de 10 a 30 aminoácidos. Dichas proteínas de fusión se pueden producir alternativamente mediante procedimientos de ingeniería genética recombinante conocidos por los expertos en la materia.
Acilación y alquilación
[0148] Según una realización, los análogos de insulina descritos en este documento se modifican para comprender un grupo acilo o un grupo alquilo. La acilación o alquilación pueden aumentar la vida media de los análogos de insulina en circulación. La acilación o alquilación pueden retrasar ventajosamente el inicio de la acción y/o extender la duración de la acción en los receptores de insulina y/o IGF-1 y/o mejorar la resistencia a proteasas, tales como DPP-IV y/o mejorar la solubilidad. Los análogos de insulina se pueden acilar o alquilar en la misma posición de aminoácido en la que está unido un resto hidrófilo, o en una posición de aminoácido diferente.
[0150] En una realización, la divulgación proporciona un análogo de insulina modificado para comprender un grupo acilo o un grupo alquilo unido covalentemente al aminoácido en una posición correspondiente a A10, B28, B29 de la insulina nativa, o en el extremo C-terminal o N - terminal de la cadena A o B. El análogo de insulina puede comprender además un espaciador entre el aminoácido del análogo de insulina y el grupo acilo o alquilo. En algunas realizaciones, el grupo acilo es un ácido graso o ácido biliar, o sal de los mismos, por ejemplo, un ácido graso de C4 a C30, un ácido graso de C8 a C24, ácido cólico, un alquilo C4 a C30, un alquilo C8 a C24, o un grupo alquilo que comprende un grupo esteroide de un ácido biliar. El espaciador es cualquier resto con grupos reactivos adecuados para la unión de grupos acilo o alquilo. En realizaciones de ejemplo, el espaciador comprende un aminoácido, un dipéptido, o un tripéptido, o un espaciador bifuncional hidrófilo. En algunas realizaciones, el espaciador se selecciona del grupo que consiste en: Trp, Glu, Asp, Cys y un espaciador que comprende NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH, en el que m es cualquier número entero de 1 a 6 y n es cualquier número entero de 2 a 12. Dichos péptidos de insulina acilados o alquilados también pueden comprender además un grupo hidrófilo, opcionalmente un polietilenglicol. Cualquiera de los análogos de insulina anteriores puede comprender dos grupos acilo o dos grupos alquilo, o una combinación de los mismos.
[0151] La acilación se puede llevar a cabo en cualquier posición dentro del análogo de insulina, siempre que se conserve la actividad agonista de insulina del análogo de insulina. El grupo acilo se puede unir covalentemente directamente a un aminoácido del análogo de insulina, o indirectamente a un aminoácido del análogo de insulina a través de un espaciador, donde el espaciador se coloca entre el aminoácido del péptido de insulina y el grupo acilo. En un aspecto específico de la divulgación, el análogo de insulina se modifica para comprender un grupo acilo mediante la acilación directa de una amina, hidroxilo o tiol de una cadena lateral de un aminoácido del péptido de insulina. En una realización, el análogo de insulina se acila directamente a través de la cadena lateral de amina, hidroxilo o tiol de un aminoácido. En una realización, la acilación se encuentra en una posición correspondiente a A10, B28, B29 de la insulina nativa, o en el extremo C-terminal o N - terminal de la cadena A o B. En este sentido, el análogo de insulina acilado puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 9 y SEQ ID NO : 2, o una secuencia de aminoácidos modificada de la misma que comprende una o más de las modificaciones de aminoácidos descritas en el presente documento, con al menos una de los aminoácidos en una posición correspondiente a B3, B28, B29 de insulina nativa, o en el extremo C-terminal o N - terminal de la cadena A o B modificada a cualquier aminoácido que comprenda una cadena lateral de amina, hidroxilo o tiol. En algunas realizaciones específicas, la acilación directa del péptido de insulina se produce a través de la amina, hidroxilo o tiol de la cadena lateral del aminoácido en una posición correspondiente a B3, B28, B29 de la insulina nativa. De acuerdo con una realización, una de las cadenas laterales de aminoácidos del elemento profármaco peptídico está acilada.
[0152] En una realización, el aminoácido a acilar es un aminoácido de fórmula IV:
Figure imgf000037_0001
en la que n = 1 a 4
[Fórmula IV]
[0153] En algunas realizaciones de ejemplo, el aminoácido de Fórmula IV, es el aminoácido en el que n es 4 (Lys) o n es 3 (Orn).
[0154] En otras realizaciones, el aminoácido que comprende un grupo hidroxilo en la cadena lateral es un aminoácido de Fórmula V:
Figure imgf000038_0001
en la que n = 1 a 4
[Fórmula V]
[0155] En algunas realizaciones de ejemplo, el aminoácido de Fórmula V es el aminoácido en el que n es 1 (Ser).
[0156] En aún otras realizaciones, el aminoácido que comprende un tiol en la cadena lateral es un aminoácido de Fórmula VI:
Figure imgf000038_0002
en la que n = 1 a 4
[Fórmula VI]
[0157] En algunas realizaciones de ejemplo, el aminoácido de Fórmula VI es el aminoácido en el que n es 1 (Cys).
[0158] En algunas realizaciones de ejemplo, el análogo de insulina se modifica para comprender un grupo acilo mediante la acilación de una amina, hidroxilo o tiol de un espaciador, cuyo espaciador está unido a una cadena lateral de un aminoácido en la posición B3, B28 o B29 (según la numeración de aminoácidos de la insulina de tipo salvaje) o unido al aminoácido A o B del elemento profármaco peptídico. El aminoácido al que se une el espaciador puede ser cualquier aminoácido que comprenda un resto que permita la unión al espaciador. Por ejemplo, es adecuado un aminoácido que comprenda una cadena lateral NH2, -OH o - COOH (por ejemplo, Lys, Orn, Ser, Asp o Glu). En una realización, el espaciador es un aminoácido que comprende una amina, hidroxilo o tiol en la cadena lateral, o un dipéptido o tripéptido que comprende un aminoácido que comprende una amina, hidroxilo o tiol en la cadena lateral.
[0159] Cuando la acilación tiene lugar a través de un grupo amino de un espaciador, la acilación puede ocurrir a través de la amina alfa del aminoácido o una amina de cadena lateral. En el caso de que la amina alfa esté acilada, el aminoácido espaciador puede ser cualquier aminoácido. Por ejemplo, el aminoácido espaciador puede ser un aminoácido hidrofóbico, por ejemplo, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, Met, Phe, Tyr. Alternativamente, el aminoácido espaciador puede ser un residuo ácido, por ejemplo, Asp y Glu. En el caso en que la amina de la cadena lateral del aminoácido espaciador esté acilada, el aminoácido espaciador es un aminoácido que comprende una amina de la cadena lateral, por ejemplo, un aminoácido de Fórmula I (por ejemplo, Lys u Orn). En este caso, es posible acilar tanto la amina alfa como la amina de la cadena lateral del aminoácido espaciador, de manera que el péptido de insulina se diacila. La presente divulgaciñón contempla además análogos de insulina diacilados.
[0160] Cuando la acilación se produce a través de un grupo hidroxilo de un espaciador, el aminoácido o uno de los aminoácidos del dipéptido o tripéptido puede ser un aminoácido de fórmula II. En una realización de ejemplo específica, el aminoácido es Ser.
[0161] Cuando la acilación se produce a través de un grupo tiol de un espaciador, el aminoácido o uno de los aminoácidos del dipéptido o tripéptido puede ser un aminoácido de fórmula III. En una realización de ejemplo específica, el aminoácido es Cys.
[0162] En una realización, el espaciador comprende un espaciador bifuncional hidrófilo. En una realización específica, el espaciador comprende un amino poli(alquiloxi)carboxilato. En este sentido, el espaciador puede comprender, por ejemplo, NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH, donde m es cualquier número entero de 1 a 6 y n es cualquier número entero de 2 a 12, tal como, por ejemplo, ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico, que está disponible comercialmente de Peptides International, Inc. (Louisville, KY).
[0163] Se conocen en la técnica procedimientos adecuados de acilación de péptidos a través de aminas, hidroxilos y tioles. Véase, por ejemplo, Miller, Biochem Biophys Res Commun 218: 377-382 (1996); Shimohigashi y Stammer, Int J Pept Protein Res 19: 54-62 (1982); y Previero et al., Biochim Biophys Acta 263: 7-13 (1972) (para procedimientos de acilación a través de un hidroxilo); y San y Silvius, J Pept Res 66: 169-180 (2005) (para procedimientos de acilación a través de un tiol); Bioconjugated Chem. "Chemical modifications of Proteins: History and Applications”, páginas 1,2-12 (1990); Hashimoto et al., Pharmacuetical Res. "Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity" vol. 6, No: 2 pp.171-176 (1989).
[0164] El grupo acilo del péptido de insulina acilado puede tener cualquier tamaño, por ejemplo, cualquier longitud de cadena de carbono, y puede ser lineal o ramificado. En algunas realizaciones específicas de la divulgación, el grupo acilo es un ácido graso de C4 a C30. Por ejemplo, el grupo acilo puede ser cualquier ácido graso C4, ácido graso C6, ácido graso C8, ácido graso C10, ácido graso C12, ácido graso C14, ácido graso C16, ácido graso C18, ácido graso C20, ácido graso C22, ácido graso C24, ácido graso C26, ácido graso C28 o un ácido graso C30. En una realización, el grupo acilo es un ácido graso C18 a C20, por ejemplo, un ácido graso C18, un ácido graso C19 o un ácido graso C20.
[0165] En una realización alternativa, el grupo acilo es un ácido biliar. El ácido biliar puede ser cualquier ácido biliar adecuado, incluyendo ácido cólico, ácido quenodesoxicólico, ácido desoxicólico, ácido litocólico, ácido taurocólico, ácido glucocólico y ácido colesterol.
[0166] En una realización específica, el análogo de insulina comprende un ácido de colesterol, que está unido a un resto Lys del análogo de insulina a través de un espaciador des-amino Cys alquilado, es decir, un espaciador de ácido 3-mercaptopropiónico alquilado. El espaciador des-amino - Cys alquilado puede ser, por ejemplo, un espaciador des-amino - Cys que comprende un resto de dodecaetilenglicol. En una realización, el
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[0167] Los análogos de insulina acilados descritos en el presente documento pueden modificarse adicionalmente para comprender un resto hidrófilo. En algunas realizaciones específicas, el resto hidrófilo puede comprender una cadena de polietilenglicol (PEG). La incorporación de un resto hidrófilo se puede lograr a través de cualquier medio adecuado, tal como cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento.
[0168] Alternativamente, el péptido de insulina acilado puede comprender un espaciador, en el que el espaciador está tanto acilado como modificado para comprender el resto hidrófilo. Los ejemplos no limitantes de espaciadores adecuados incluyen un espaciador que comprende uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Cys, Lys, Orn, homo - Cys y Ac-Phe.
[0169] De acuerdo con una realización, el análogo de insulina se modifica para comprender un grupo alquilo que se une al análogo de insulina a través de un enlace éster, éter, tioéter, amida o alquil amina con el fin de prolongar la semivida en circulación y/o retrasar el inicio y/o prolongar la duración de la acción y/o mejorar la resistencia a proteasas, tales como DPP-IV.
[0170] El grupo alquilo del péptido de insulina alquilado puede tener cualquier tamaño, por ejemplo, cualquier longitud de cadena de carbono, y puede ser lineal o ramificado. En una realización de la descripción, el grupo alquilo es un alquilo C1 a C30. Por ejemplo, el grupo alquilo puede ser cualquiera de alquilo C1, alquilo C2, alquilo C3, alquilo C4, alquilo C6, alquilo C8, alquilo C10, alquilo C12, alquilo C14, alquilo C16, alquilo C18, alquilo C20, alquilo C22, alquilo C24, alquilo C26, alquilo C28 o un alquilo C30. En una realización, el grupo alquilo es un alquilo C18 a C20, por ejemplo, un alquilo C18, alquilo C19 o alquilo C20.
[0171] En algunas realizaciones específicas, el grupo alquilo comprende un resto esteroideo de un ácido biliar, por ejemplo, ácido cólico, ácido quenodesoxicólico, ácido desoxicólico, ácido litocólico, ácido taurocólico, ácido glucocólico y ácido colesterol.
[0172] De acuerdo con algunas realizaciones, el elemento profármaco peptídico puede modificarse adicionalmente para que comprenda un resto hidrófilo. En algunas realizaciones, el resto hidrófilo es una cadena de polietilenglicol. De acuerdo con algunas realizaciones, una cadena de polietilenglicol de 40k o superior se une covalentemente a la cadena lateral del aminoácido A o B del elemento profármaco peptídico. En otra realización, el dipéptido (A-B) del elemento profármaco peptídico se acila o alquila adicional o alternativamente con un ácido graso o ácido biliar, o una sal del mismo, por ejemplo, un ácido graso C4 a C30, un ácido graso C18 a C24, ácido cólico, un alquilo C18 a C30, un alquilo C18 a C24 o un alquilo que comprende un resto esteroideo de un ácido biliar. El aminoácido 'A' del elemento profármaco de dipéptido puede incluir, por ejemplo, d-lisina unida covalentemente a un grupo acilo o alquilo a través de su grupo amino de cadena lateral, o d - Cisteína unida covalentemente a una molécula de PEG a través de su grupo sulfhidrilo de cadena lateral. El elemento profármaco de dipéptido puede unirse directamente al resto hidrófilo, grupo acilo o grupo alquilo, o unirse al resto hidrófilo, grupo acilo o grupo alquilo a través de un espaciador, tal como se describe en el presente documento. Alternativamente, el elemento profármaco de dipéptido se puede unir a una proteína de depósito, tal como el dextrano o una molécula de PEG grande (mayor o igual a 80000 daltons) que sirve para secuestrar el profármaco en un sitio de inyección hasta que la escisión del dipéptido libera el péptido de insulina activo (Q).
Efecto de la estructura del elemento profármaco de dipéptido sobre la tasa de escisión
[0173] Tal como se describió anteriormente en el presente documento, la tasa de escisión del elemento de profármaco de dipéptido A-B del péptido bioactivo (por ejemplo, péptido de insulina (Q)) y, por lo tanto, la activación del profármaco depende de la estructura (incluida la N - alquilación, el número de sustituyentes, longitud o volumen), y la estereoquímica de los aminoácidos del elemento profármaco dipéptido. La velocidad de escisión del elemento profármaco de dipéptido A-B del (por ejemplo, péptido de insulina (Q)) también depende del impedimento estérico, la nucleofilia y la estabilidad del grupo saliente de Q durante la formación de dicetopiperazina. Algunas de estas características estructurales se describen en la Categoría I, Categoría II y Categoría III a continuación. Quedan explícitamente excluidas de cualquiera de estas categorías las secuencias peptídicas descritas en la Solicitud Internacional No. PCT/US2009/68745, presentada el 18 de diciembre de 2009 o su listado de secuencias, y las subcategorías de (1 ) elementos de profármaco de dipéptido, (2) aminoácidos A y/o (3) aminoácidos B descritos en la Solicitud Internacional No. PCT/US2009/68745, presentada el 18 de diciembre de 2009, siempre que se encuentren completamente dentro y/o se solapen con una parte de cualquiera de las subcategorías descritas en el presente documento, y solo siempre que sea necesario conferir novedad a la materia reivindicada.
[0174] De acuerdo con una realización, un elemento dipéptido autoescindible (A-B) se une covalentemente al péptido de insulina (Q) a través de un enlace amida entre A-B - Cy un grupo amino alifático de Q. Por ejemplo, el grupo amino alifático puede ser el grupo alfa amino en el aminoácido N - terminal de la cadena A o la cadena B. Alternativamente, el grupo amino alifático puede ser un grupo amino alifático en una cadena lateral de Q. En una realización, A-B - Cestá unido a la amina de la cadena lateral de una lisina, que incluye, por ejemplo, en la posición B29 de la secuencia de la cadena B FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO : 2) o en la posición B28 de la secuencia de cadena B FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT (SEQ ID NO : 9).
[0175] En una realización Q es un péptido de insulina que comprende una cadena A y una cadena B donde la cadena A comprende la secuencia GIVEQCCX1SICSLYQLENYCX3 (SEQ ID NO : 3) y la cadena B comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SeQ ID NO : 2) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT (SEQ ID NO : 9) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT (SEQ ID NO : 5) y FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTEKT (SEQ ID NO : 6).
Categoría I: Composición del aminoácido B del elemento profármaco de dipéptido
[0176] En algunas realizaciones, la semivida del profármaco, por ejemplo, la semivida de escisión química (t-io) de A-B - Cde Q de al menos aproximadamente 1 hora a aproximadamente 1 semana en PBS, en condiciones fisiológicas, depende de la presencia y la longitud del sustituyente N - alquilo en el aminoácido B. Por ejemplo, un profármaco que tiene un sustituyente N - alquilo más corto en el aminoácido B (por ejemplo, Gly (N - metil)), experimentará una tasa más lenta de escisión de A-B - Cy tendrá una semivida más prolongada que un profármaco que tiene un sustituyente N - alquilo más largo en el aminoácido B (por ejemplo, Gly (N - hexilo)).
[0177] En algunas realizaciones, la semivida del profármaco depende de la presencia o ausencia de una cadena lateral alquílica y del grado de sustitución en la posición beta de la cadena lateral alquílica del aminoácido B del elemento de dipéptido del profármaco. Por ejemplo, un profármaco que tiene un aminoácido B N - alquilado que está disustituido en la posición beta (por ejemplo, isoleucina N - alquilada) sufrirá una escisión más lenta de A-B-C y tendrá una semivida más prolongada que un profármaco que tenga un aminoácido B N - alquilado que está monosustituido en la posición beta (por ejemplo, leucina N - alquilada). Además, un profármaco que tiene un aminoácido B N - alquilado que está monosustituido en la posición beta (por ejemplo, leucina N -alquilada) sufrirá una escisión más lenta de A-B-C y tendrá una semivida más prolongada que un profármaco que tiene un aminoácido B N - alquilado que no está sustituido en la posición beta (por ejemplo, alanina N -alquilada). Además, un profármaco con un aminoácido B N - alquilado que tiene una posición beta no sustituida (por ejemplo, alanina N - alquilada) sufrirá una escisión más lenta de A-B-C y tendrá una semivida más prolongada que un profármaco que tenga glicina o glicina N - alquilada como el aminoácido B.
[0178] En algunas realizaciones, la semivida del profármaco depende del volumen de la cadena lateral del aminoácido B. Por ejemplo, un profármaco que tiene una cadena lateral más voluminosa en el aminoácido B (por ejemplo, fenilalanina N - alquilada) sufrirá una escisión más lenta de A-B-C y tendrá una semivida más prolongada que un profármaco que tenga una cadena lateral menos voluminosa en el aminoácido B (por ejemplo, alanina N - alquilada). Las velocidades de escisión de los dipéptidos se pueden diferenciar aún más por la amina del fármaco (por ejemplo, insulina) a la que están unidos. Más particularmente, el mismo dipéptido se escindirá a una velocidad más rápida cuando se une a una amina aromática en relación con una amina N -terminal, donde el dipéptido unido a una amina N - terminal se escindirá a una velocidad más rápida en relación con cuando el dipéptido está unido a la amina de cadena lateral de un residuo de lisina.
[0179] La composición del aminoácido B del elemento profármaco de dipéptido se puede clasificar en las siguientes subcategorías IA, IB e IC. En general, los elementos profármacos de dipéptidos de la subcategoría IA se escinden más rápidamente y los elementos profármacos de dipéptidos de la subcategoría IC son los que se escinden más lentamente.
Subcategoría IA: El aminoácido B del profármaco de dipéptido es glicina N - alquilada
[0180] En algunas realizaciones, el profármaco de insulina comprende la estructura: A-B-C-Q;
en la que Q es un péptido de insulina;
en la que A-B - C comprende la estructura:
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en las que
Ri es (alquilo Ci - Ce) NH-R9, o (alquilo C1 - Ce) NH-S1-R9;
R2 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo Ci - Ci8, alquenilo C2- Ci8, (alquilo Ci - Ci8)OH, (alquilo
Ci - Ci8)SH, (alquilo C2 - C3)SCH3, (alquilo Ci - C4) CONH2, (alquilo Ci - C4) (alquilo Ci - C4) Nh C(NH2+) NH2, (alquilo Co - C4) (cicloalquilo C3 - Ce), (alquilo Co - C4) (heterocíclico C2 - C5), (alquilo Co - C4) (arilo Ce - Cio)R7, (alquilo Ci - C4) (heteroarilo C3 - C9) y alquilo Ci - C i2 (Wi) alquilo Ci - C i2, en la que Wi es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y O, o Ri y R2 junto con los átomos a los que están unidos forman un cicloalquilo C3 - C i2;
R3 es alquilo Ci - Ci8;
R4 y R8 son cada uno H;
R5 es NHRe; _
Re es H o alquilo Ci - C4, o R5 y R2 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5 ó e miembros;
R7 se selecciona del grupo que consiste en H y OH;
R9 se selecciona del grupo que consiste en acilo Cie - C30 y alquilo Cie - C30;
R ii y R i3 son cada uno H;
Rio y R i2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en (alquilo Ci - C4) COOH, (alquilo Ci -C4) NH2, (alquilo Ci - C4) NHC(NH2+) NH2, y CH2(heterocíclico C3 - N2); y
Si es un enlace o un espaciador que consiste en uno o dos aminoácidos cargados seleccionados del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico, ácido homoglutámico, arginina, lisina e histidina.
[0181] En algunas realizaciones, el aminoácido B se selecciona del grupo que consiste en glicina (N - metilo), glicina (N -etilo), glicina (N -propilo), glicina (N -butilo), glicina (N -pentilo), glicina (N - hexilo), glicina (N -heptilo) y glicina (N -octilo). Por ejemplo, el aminoácido B puede ser glicina (N - metilo) o glicina (N - hexilo).
[0182] En algunas realizaciones, R2 es hidrógeno y R3 es alquilo Ci - C4.
Subcategoría IB: el aminoácido B del elemento profármaco de dipéptido no está sustituido o está monosustituido en la posición beta
[o i83] En algunas realizaciones, el profármaco de insulina comprende la estructura:
A-B - C-Q;
en la que Q es un péptido de insulina;
en la que A-B - Ccomprende la estructura:
Figure imgf000042_0002
en las que
Ri se selecciona del grupo que consiste en H, (alquilo Ci - Ce) NH-R9, (alquilo Ci - Ce) NH-Si-R9,
R2 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo Ci - Ci8, alquenilo C2 - Ci8, (alquilo Ci - Ci8)OH, (alquilo
Ci - Ci8)SH, (alquilo C2 - C3)SCH3, (alquilo Ci - C4) CONH2, (alquilo Ci - C4) COOH, (alquilo Ci - C4) NH2, (alquilo Ci - C4) NHC(NH2+) NH2, (alquilo Co - C4) (cicloalquilo C3 - Ce), (alquilo Co - C4) (heterocíclico C2 - C5), (alquilo Co - C4) (arilo Ce - Cio)R7, (alquilo Ci - C4) (heteroarilo C3 - C9) y alquilo Ci - C i2 (Wi) alquilo Ci - C i2, en la que Wi es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y O, o Ri y R2 junto con los átomos a los que están unidos forman un cicloalquilo C3 - C12;
R3 es alquilo Ci - C18;
R4 se selecciona del grupo que consiste en CH3, CH2 (alquilo C1 - C10), CH2 (alquenilo C2 - C10), CH2 (alquilo
C0 - C10)OH, CH2 (alquilo C0 - C10)SH, CH2 (alquilo C0 - C3)SCH3, CH2 (alquilo C0 - C3) CONH2, CH2 (alquilo C0
- C3) COOH, CH2 (alquilo C0 - C3) NH2, (alquilo C1 - Ca) NH-R9, (alquilo C1 - Ca) NH-S1-R9, CH2 (alquilo C0 - C3)
Nh C(NH2+) NH2, CH2 (alquilo C0 - C3) (cicloalquilo C3 - Ca), CH2 (alquilo C0 - C3) (heterocíclico C2 - C5),
CH2 (alquilo C0 - C3) (arilo Ca - C10)R7, CH2 (alquilo C1 - C3) (heteroarilo C3 - C9) y CH2 (alquilo C0 - C12) (W1)alquilo C1 - C12, en el que W 1 es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y O; o R4 y
R3 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5 ó 6 miembros;
R8 es H,
R5 es NHRa, o R5 y R2 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5 o 6 miembros;
Ra es H o alquilo C1 - C4;
R7 se selecciona del grupo que consiste en H y OH
R9 se selecciona del grupo que consiste en acilo C1a - C30 y alquilo C1a - C30;
R11 y R13 son cada uno H;
R10 y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en (alquilo C1 - C4) COOH, (alquilo C1 -C4) NH2, (alquilo C1 - C4) NHC(NH2+) NH2, y CH2 (heterocíclico C3-N2); y
S1 es un enlace o un espaciador que consiste en uno o dos aminoácidos cargados seleccionados del grupo
que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico, ácido homoglutámico,
arginina, lisina e histidina, con la condición de que R1 es H cuando R4 es (alquilo C1 - Ca) NH-R9, o (alquilo C1
- Ca) NH-S1-R9.
[0184] En algunas realizaciones, R1 es (alquilo C1 - Ca) NH-R9, o (alquilo C1 - Ca) NH-S1-R 9 y R4 se selecciona
del grupo que consiste en CH3, CH2 (alquilo C1 - C4), CH2 (alquenilo C1 - C4), CH2 (alquilo C0 - C4)OH,
CH2 (alquilo C0 - C4)SH, CH2 (alquilo C0 - C3)SCH3, CH2 (alquilo C0 - C3) CONH2, CH2 ( CH2 (alquilo C0 - C4) NH2 y CH2 (alquilo C0 - C3) NHC(NH2+) NH2.
[0185] Los ejemplos no limitantes del aminoácido B en estas realizaciones incluyen alanina (N - alquilo C1 -C10), leucina (N - alquilo C1 - C10), metionina (N - alquilo C1 - C10), asparagina (N - alquilo C1 - C10), ácido
glutámico (N - alquilo C1 - C10), ácido aspártico (N - alquilo C1 - C10), glutamina (N - alquilo C1 - C10), histidina
(N - alquilo C1 - C10), lisina (N - alquilo C1 - C10), arginina (N - alquilo C1 - C10), serina (N - alquilo C1 - C10) y
cisteína (N - alquilo C1 - C10).
[018a] En algunas realizaciones, R1 es (alquilo C1 - Ca) NH-R9, o (alquilo C1 - Ca) NH-S1-R 9 y el aminoácido B
se selecciona del grupo que consiste de alanina (N - alquilo C1 - Ca), leucina (N - alquilo C1 - Ca), metionina
(N - alquilo C1 - Ca), asparagina (N - alquilo C1 - Ca), ácido glutámico (N - alquilo C1 - Ca), ácido aspártico (N
- alquilo C1 - Ca), glutamina (N - alquilo C1 - Ca), histidina (N - alquilo C1 - Ca), lisina (N - alquilo C1 - Ca),
arginina (N - alquilo C1 - Ca), serina (N - alquilo C1 - Ca) y cisteína (N - alquilo C1 - Ca).
[0187] Por ejemplo, el aminoácido B puede incluir alanina (N - metilo), leucina (N - metilo), metionina (N -metilo), asparagina (N - metilo), ácido glutámico (N - metilo), ácido aspártico (N - metilo), glutamina (N -metilo), histidina (N -metilo), lisina (N -metilo), arginina (N -metilo), serina (N -metilo) y cisteína (N -metilo).
[0188] En algunas realizaciones, R1 es (alquilo C1 - Ca) NH-R9, o (alquilo C1 - Ca) NH-S1-R 9 y R4 se selecciona
del grupo que consiste en CH2 (alquilo C0 - C3) (cicloalquilo C3 - Ca), CH2 (alquilo C0 - C3) (heterocíclico C2 -C5), CH2 (alquilo C0 - C3) (arilo Ca - C10)R7, CH2 (alquilo C1 - C3) (heteroarilo C3 - C9) y CH2 (alquilo C0 - C12) (W1)alquilo C1 - C12, en el que W 1 es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y O, y en el
que R7 se selecciona del grupo formado por H y OH.
[0189] Los ejemplos no limitantes del aminoácido B en estas realizaciones incluyen fenilalanina (N - alquilo C1
- C10), tirosina (N - alquilo C1 - C10) y triptófano (N - alquilo C1 - C10). En algunas realizaciones, el aminoácido
B se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina (N - alquilo C1 - Ca), tirosina (N - alquilo C1 - Ca) y
triptófano (N - alquilo C1 - Ca). Por ejemplo, el aminoácido B puede incluir fenilalanina (N - metilo), tirosina (N
- metilo) y triptófano (N - metilo).
[0190] En algunas realizaciones, el aminoácido B es prolina. En algunas realizaciones, la prolina se excluye de
la Subcategoría IB.
Subcategoría IC: El aminoácido B del elemento profármaco de dipéptido disustituido en la posición beta
[0191] En algunas realizaciones, el profármaco de insulina comprende la estructura:
A-B - C-Q;
en la que Q es un péptido de insulina;
en la que A-B - C comprende la estructura:
Figure imgf000044_0001
en la que
Ri se selecciona del grupo que consiste en H, (alquilo Ci - Ce) NH-R8, (alquilo Ci - Ce) NH-S1-R9,
R2 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo Ci - Ci8, alquenilo C2 - Ci8, (alquilo Ci - Ci8)OH, (alquilo
Ci - Ci8)SH, (alquilo C2 - C3)SCH3, (alquilo Ci - C4) CONH2, (alquilo Ci - C4) COOH, (a (alquilo Ci - C4) Nh C(NH2+) NH2, (alquilo Co - C4) (cicloalquilo C3 - Ce), (alquilo Co - C4) (heterocíclico C2 - C5),
(alquilo Co - C4) (arilo Ce - Cio)R7, (alquilo Ci - C4) (heteroarilo C3 - Cg) y alquilo Ci - C i2 (Wi) alquilo Ci - C i2,
en la que Wi es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y O, o Ri y R2 junto con los
átomos a los que están unidos forman un cicloalquilo C3 - C i2; o Ri y R2 junto con los átomos a los que están
unidos forman un cicloalquilo C3 - C i2;
R3 es alquilo Ci - Ci8;
R4 se selecciona independientemente del grupo que consiste en CH (alquilo Ci - C8)2, CH (alquenilo C2 - C8)2,
CH (alquilo Ci - C8)OH, CH (alquilo Ci - C8) ((alquilo Ci - C8)SH), CH (alquilo Ci - C3) ((alquilo Ci - C8) NH2);
R8 es H o alquilo Ci - Ci8;
R5 es NHRe, o R5 y R2 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5 o 6 miembros;
Re es H o alquilo Ci - C4; y,
R7 se selecciona del grupo que consiste en H y OH
R8 se selecciona del grupo que consiste en acilo Cie - C30 y alquilo Cie - C30;
R ii y R i3 son cada uno H;
Rio y R i2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en (alquilo Ci - C4) COOH, (alquilo Ci -C4) NH2, (alquilo Ci - C4) NHC(NH2+) NH2, y CH2 (heterocíclico C3-N2); y
Si es un enlace o un espaciador que consiste en uno o dos aminoácidos cargados seleccionados del grupo
que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, ácido homocisteico, ácido homoglutámico,
arginina, lisina e histidina,
[0192] En algunas realizaciones, R4 es CH(alquilo Ci - C8)2 o CH(alquilo Ci - C8)OH. Los ejemplos no limitativos
del aminoácido B incluyen isoleucina (N - alquilo Ci - Cio), valina (N - alquilo Ci - Cio) y treonina (N - alquilo
Ci - Cio). En algunas realizaciones, el aminoácido B se selecciona del grupo que consiste en isoleucina (N -alquilo Ci - Ce), valina (N - alquilo Ci - Ce) y treonina (N - alquilo Ci - Ce). Por ejemplo, el aminoácido B puede
incluir isoleucina (N -metilo), valina (N -metilo) y treonina (N -metilo).
Categoría II: Composición del aminoácido A del elemento profármaco de dipéptido
[0193] En algunas realizaciones, la semivida del profármaco depende del número de sustituyentes en la
posición alfa del aminoácido A. Por ejemplo, un profármaco que comprende un aminoácido A que es un aminoácido monosustituido en a (por ejemplo, Ala) se escindirá más lentamente y tendrá una semivida más
larga que un profármaco que comprende un aminoácido A que es un aminoácido a,a-disustituido (por ejemplo,
Aib).
[0194] En algunas realizaciones, la semivida del profármaco depende del grado de alquilación en el grupo alfa
amino del aminoácido A. En general, cuanto mayor es el grado de alquilación, más lenta es la velocidad de
escisión y más prolongada la semivida del profármaco. Por ejemplo, un elemento profármaco de dipéptido que
tiene Ala N - alquilada se escindirá a una velocidad más lenta y tendrá una semivida más prolongada que Ala.
[0195] La composición del aminoácido A del elemento profármaco de dipéptido se puede clasificar en las siguientes subcategorías IIAy IIB. En general, los elementos profármacos de dipéptidos de la subcategoría IIA
se escinden más rápido que los elementos profármacos de dipéptidos de la subcategoría IIB.
Subcategoría IIA: el aminoácido A del elemento profármaco de dipéptido está disustituido en la posición alfa
[o ige] En algunas realizaciones, el aminoácido A del elemento profármaco de dipéptido está disustituido en la
posición alfa. En estas realizaciones, Ri y R2 de las estructuras descritas en las subcategorías IA, IB e IC se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo Ci - Cio, alquenilo C2 - Cio, (alquilo Ci -Cio)OH, (alquilo Ci - Cio)SH, (alquilo C2 - C3)s CH3, (alquilo Ci - C4) CONH2, (alquilo Ci - C4) COOH, (alquilo
Ci - C4) NH2, (alquilo C1 - C4) NHC(NH2+) NH2, (alquilo Co - C4) (cicloalquilo C3 - C6), (alquilo Co - C4) (heterocíclico C2 - C5), (alquilo Co - C4) (arilo C6 - Cio)R7, (alquilo Ci - C4) (heteroarilo C3 - Cg) y alquilo Ci -C12 (Wi) alquilo Ci - C12, en la que Wi es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y O, o Ri y R2 junto con los átomos a los que están unidos forman un cicloalquilo C3 - C i2; o Ri y R2 junto con los átomos a los que están unidos forman un cicloalquilo C3 - C i2;, y en la que R7 se selecciona del grupo que consiste en H y OH.
[0197] Por ejemplo, el aminoácido A puede incluir ácido aminoisobutírico (Aib).
Subcategoría IIB: el aminoácido A del elemento profármaco de dipéptido no está sustituido o está monosustituido en la posición alfa
[0198] En algunas realizaciones, el aminoácido A del elemento profármaco de dipéptido no está sustituido o está monosustituido en la posición alfa. En estas realizaciones, Ri de las estructuras descritas en las subcategorías IA, IB e IC es H, y R2 de las estructuras descritas en las subcategorías IA, IB e IC se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo Ci - Cio, alquenilo C2 - Cio, (alquilo Ci - Cio)OH, (alquilo Ci - Cio)SH, (alquilo C2 - C3)SCH3, (alquilo Ci - C4) CONH2, (alquilo Ci - C4) COOH, (alquilo Ci - C4) NH2, (alquilo Ci - C4) NHC(NH2+) NH2, (alquilo Co - C4) (cicloalquilo C3 - Cg), (alquilo Co - C4) (heterocíclico C2 - C5), (alquilo Co - C4) (arilo C6 - Cio)R7, (alquilo Ci - C4) (heteroarilo C3 - Cg) y alquilo Ci - C i2 (Wi) alquilo Ci - C i2, en el que R7 se selecciona del grupo que consiste en H y OH, en la que Wi es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y O, o Ri y R2 junto con los átomos a los que están unidos forman un cicloalquilo C3 - C i2; o R2 y R5 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5 o 6 miembros.
[0199] En algunas realizaciones, el aminoácido A del elemento profármaco de dipéptido tiene estereoquímica 'D'. Los ejemplos no limitantes del aminoácido A en estas realizaciones incluyen lisina, cisteína y alanina. Por ejemplo, d-lisina, d-cisteína y d-alanina. En algunas realizaciones, la estereoquímica d puede mejorar la semivida mediante la reducción de la degradación proteolítica del péptido profármaco.
[0200] En algunas realizaciones, el aminoácido A está N - alquilado con un grupo que tiene de i a 4 átomos de carbono, tal como Ala (N - alquilo Ci - C4), Lys (N - alquilo Ci - C4) y Cys (N - alquilo Ci - C4). Por ejemplo, el aminoácido A puede ser Ala (N - metilo), Lys (N - metilo) y Cys (N - metilo). La N - alquilación del aminoácido A disminuye la velocidad de escisión del elemento profármaco de dipéptido de Q y proporciona una semivida más larga.
Categoría III: sitio de conjugación del elemento profármaco de dipéptido (A-B) con el fármaco peptídico (Q)
[0201] En algunas realizaciones, la semivida del profármaco depende del impedimento estérico, la nucleofilia y la estabilidad del grupo saliente en Q durante la formación de dicetopiperazina. Cuanto menos impedido estéricamente sea el grupo saliente, menos nucleófilo sea el grupo saliente, o cuanto más estable sea el grupo saliente después de la escisión, más corta será la semivida del profármaco. El tipo de grupo saliente en Q puede determinarse por el tipo de enlace entre A-B-C y un grupo amino de Q, tal como se describe en las subcategorías IIIA y IIIB a continuación. Generalmente, los elementos profármacos de dipéptidos de la subcategoría IIIB se escinden más rápido de Q y tienen una semivida más corta que los elementos profármacos de dipéptidos de la subcategoría IIIA.
Subcategoría IIIA: A-B Ligado a un Grupo Amino Alifático de Q
[0202] En algunas realizaciones, A-B-C se une a Q a través de un enlace amida entre A-B-C y un grupo amino alifático de Q para dar como resultado un profármaco con una semivida de escisión química (ti/2) de A-B de Q de al menos aproximadamente i hora a aproximadamente i semana en PBS, en condiciones fisiológicas, tal como se ha descrito anteriormente en este documento.
[0203] En algunas realizaciones, A-B-C se une a Q a través de un enlace amida entre A-B-C y el grupo alfa amino del aminoácido N - terminal de Q. Por ejemplo, un elemento profármaco de dipéptido que tiene un aminoácido B de cualquiera de las subcategorías IA, IB e IC y un aminoácido A de cualquiera de las subcategorías IIA y IIB pueden unirse al aminoácido N - terminal de Q, más particularmente, a la amina N -terminal de la cadena A o B de la insulina, para dar como resultado un profármaco con una semivida de escisión química (ti/2) de A-B de Q de al menos aproximadamente i hora a aproximadamente i semana en PBS, en condiciones fisiológicas.
[0204] En algunas realizaciones, A-B-C se une a Q a través de un enlace amida entre A-B-C y un grupo amino alifático en una cadena lateral de un aminoácido de Q. Por ejemplo, un elemento profármaco de dipéptido que tiene un aminoácido B de cualquiera de las subcategorías IA, IB e IC y un aminoácido A de cualquiera de las subcategorías IIA y IIB se pueden unir a un grupo amino alifático de una cadena lateral de un aminoácido de Q para dar como resultado un profármaco con una semivida de escisión química (ti/2) de A-B de Q de al menos aproximadamente i hora a aproximadamente i semana en PBS, en condiciones fisiológicas.
[0205] En algunas realizaciones, cuando A-B-C se une a Q a través de un enlace amida entre A-B-C y un grupo amino alifático de Q, A debe ser un aminoácido a,a-disustituido (Subcategoría IIA) o B debe ser N - alquilado (cualquiera de las Subcategorías IA, IB o IC), o ambos. Por ejemplo, cuando A es un aminoácido amonosustituido (por ejemplo, Ala), B no está alquilado en N y A-B-C está unido a Q a través de un grupo amino alifático de Q, entonces no habrá una escisión significativa de A-B.
[0206] En otras realizaciones, cuando A-B-C está unido a Q a través de un enlace amida entre A-B-C y un grupo amino alifático de Q, y A es un aminoácido que no está sustituido en la posición alfa (por ejemplo, glicina) y B es un aminoácido de la Subcategoría IA (glicina N - alquilada), el sustituyente N - alquilo del aminoácido B tiene una longitud de al menos cinco átomos de carbono (por ejemplo, N - alquilo C5 - C8).
[0207] En aún otras realizaciones, cuando A-B-C está unido a Q a través de un enlace amida entre A-B-C y un grupo amino alifático de Q, y el aminoácido A no está sustituido o está monosustituido en la posición alfa (Subcategoría IIB), el aminoácido B no es prolina.
Subcategoría IIIB: A-B enlazado a un grupo amino aromático de Q
[0208] En algunas realizaciones, A-B-C se une a Q a través de un enlace amida entre A-B-C y un grupo amino aromático de una cadena lateral de un aminoácido de Q para dar como resultado un profármaco con una semivida de escisión química (ti/2) de A-B de Q de al menos aproximadamente 1 hora a aproximadamente 1 semana en PBS, en condiciones fisiológicas, tal como se describió anteriormente en este documento. Por ejemplo, un elemento profármaco de dipéptido que tiene un aminoácido B de cualquiera de las subcategorías lA, iB e IC y un aminoácido A de cualquiera de las subcategorías IIA y IIB se puede unir a un grupo amino aromático de una cadena lateral de un aminoácido de Q para dar como resultado un profármaco con una semivida de escisión química (ti/2) de A-B de Q de al menos aproximadamente 1 hora a aproximadamente 1 semana en PBS, en condiciones fisiológicas.
[0209] Cualquiera de los aminoácidos B definidos por la Categoría I puede combinarse con cualquiera de los aminoácidos A definidos por la Categoría II para formar un elemento profármaco de dipéptido. Este elemento profármaco de dipéptido se puede unir a cualquiera de las posiciones descritas en la Categoría III. La semivida del profármaco se puede ajustar mediante la selección de:
(i) el número de sustituyentes en la posición alfa del aminoácido A;
(ii) el grado de N - alquilación de los aminoácidos A y B;
(iii) el número de sustituyentes en la posición beta del aminoácido B;
(iv) el volumen de la cadena lateral del aminoácido B; y
(v) el impedimento estérico, la nucleofilia y la estabilidad del grupo saliente en Q durante la formación de dicetopiperazina.
Modificación del elemento profármaco de dipéptido A-B
[0210] Los elementos profármacos de dipéptidos descritos anteriormente se pueden modificar adicionalmente para que comprendan un resto hidrófilo, un grupo acilo o un grupo alquilo, tal como se describió anteriormente en este documento. En algunas realizaciones, el elemento profármaco de dipéptido incluye lisina que está conjugada con un grupo acilo o un grupo alquilo a través de su grupo amino de cadena lateral. En algunas realizaciones, el elemento profármaco de dipéptido incluye cisteína que está conjugada con un resto hidrófilo (por ejemplo, PEG de 40 kD) a través del grupo sulfhidrilo de la cadena lateral. El resto hidrófilo, el grupo acilo o el grupo alquilo se pueden conjugar directamente con el elemento profármaco de dipéptido o a través de un espaciador. En algunas realizaciones de ejemplo, el grupo hidrófilo, el grupo alquilo y/o el grupo acilo se conjugan con el aminoácido A del elemento profármaco de dipéptido.
[0211] En algunas realizaciones, los siguientes elementos profármacos de dipéptidos están PEGilados: dCys-Gly (N - hexil) dCys-Gly (N - metil) y dCys-Phe (N - metil). En algunas realizaciones, los siguientes elementos profármacos de dipéptidos incluyen un grupo acilo: dLys-Gly (N - hexilo), dLys-Gly (N - metilo) y dLys-Phe (N -metilo). En algunas realizaciones, los siguientes elementos profármacos de dipéptidos incluyen un grupo alquilo: dLys-Gly (N - hexilo), dLys-Gly (N - metilo) y dLys-Phe (N - metilo).
Realizaciones de ejemplo
[0212] El elemento profármaco de dipéptido tal como se describe en el presente documento puede incluir combinaciones de cualquiera de los aminoácidos B de la Categoría I con cualquiera de los aminoácidos A de la Categoría II. Los ejemplos no limitativos de aminoácidos adecuados para el aminoácido A y para el aminoácido B del elemento profármaco de dipéptido se enumeran en la siguiente tabla.
Figure imgf000046_0001
Figure imgf000047_0001
Figure imgf000048_0001
Subcategoría IA: El aminoácido B del profármaco de dipéptido es glicina N - alquilada
[2313] En algunas realizaciones, el aminoácido B del elemento profármaco de dipéptido es glicina N -alquilada. En la siguiente tabla se muestran ejemplos no limitativos de elementos profármacos de dipéptidos que tienen glicina N - alquilada como el aminoácido B.
Figure imgf000048_0002
Figure imgf000049_0001
Subcategoría IB: el aminoácido B del elemento profármaco de dipéptido no está sustituido o está monosustituido en la posición beta
[0214] En algunas realizaciones, el aminoácido B del elemento profármaco de dipéptido no está sustituido o está monosustituido en la posición beta y tiene una cadena lateral relativamente no voluminosa. En la siguiente tabla se muestran ejemplos no limitativos de elementos profármacos de dipéptidos que tienen un aminoácido B que no está sustituido o está monosustituido en la posición beta y una cadena lateral relativamente no voluminosa.
Figure imgf000049_0002
Figure imgf000050_0001
Figure imgf000051_0001
[0215] En algunas realizaciones, el aminoácido B del elemento profármaco de dipéptido está monosustituido en la posición beta y tiene una cadena lateral relativamente voluminosa, tal como se muestra en la siguiente tabla.
Figure imgf000051_0002
Figure imgf000052_0001
Subcategoría IC: Aminoácido B del elemento profármaco de dipéptido disustituido en la posición beta
[0216] En algunas realizaciones, el aminoácido B del elemento profármaco de dipéptido está disustituido en la posición beta. En la siguiente tabla se muestran ejemplos no limitantes de elementos profármacos de dipéptidos que tienen un aminoácido B que está disustituido en la posición beta.
Figure imgf000052_0002
Figure imgf000053_0001
[0217] En algunas realizaciones de ejemplo, Aib-Gly (N - hexilo), dLys-Gly (N - hexilo), dCys-Gly (N - hexilo), dAla-Gly (N - hexilo), Aib-Gly (N - metilo), dLys-Gly (N - metilo), dCys-Gly (n - metilo), dAla-Gly (N - hexilo), Aib-Phe (N - metilo), dLys-Phe (N - metilo), dCys-Phe (N - metilo) o dAla-Phe (N - metilo) se conjuga con el grupo alfa amino N - terminal del péptido de insulina a través de la estructura A-B - C.
[0218] De acuerdo con una realización, el elemento de dipéptido comprende uno de los tres aminoácidos en la B del dipéptido A-B: Gly (N - hexilo), Gly (N - metilo) o Phe (N - metilo). Los dipéptidos seleccionados de uno de estos tres grupos de dipéptidos tienen velocidades de escisión relativas en las que Gly (N - hexilo) > Gly (N - metilo) > Phe (N - metilo) y todos los demás factores son iguales. En una realización, se proporciona Cys o Lys en la primera posición (es decir, el aminoácido A) para proporcionar una ubicación para la acilación o pegilación. Ala se usa como el aminoácido A en una realización en la que no se desea acilación ni pegilación. En una realización, un Aib en la primera posición (es decir, el aminoácido A) aumenta la velocidad de escisión en relación con los aminoácidos naturales, tales como Ala, Cys y Lys.
[0219] Los dipéptidos de ejemplo incluyen:
dAla-Phe (N - metilo)
dCys-Phe (N - metilo)
dLys-Phe (N - metilo)
Aib-Phe (N - metilo)
dAla-Gly (N - metilo)
dCys-Gly (N - metilo)
dLys - Gly (N - metilo)
Aib-Gly (N - metilo)
dAla-Gly (N - hexilo)
dCys-Gly (N - hexilo)
dLys-Gly (N - hexilo)
Aib-Gly (N - hexilo)
[0220] De acuerdo con una realización, se proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los nuevos análogos de profármacos de insulina descritos en el presente documento, preferiblemente con un nivel de pureza de al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97%, 98% o 99%, y un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones pueden contener un análogo de insulina A19 tal como se describe en el presente documento a una concentración de al menos 0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml. ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml, 14 mg/ml, 15 mg/ml, 16 mg/ ml, 17 mg/ml, 18 mg/ml, 19 mg/ml, 20 mg/ml, 21 mg/ml, 22 mg/ml, 23 mg/ml, 24 mg/ml, 25 mg/ml o superior. En una realización, las composiciones farmacéuticas comprenden soluciones acuosas que se esterilizan y, opcionalmente, se almacenan contenidas dentro de varios envases. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden un polvo liofilizado. Las composiciones farmacéuticas se pueden envasar además como parte de un kit que incluye un dispositivo desechable para administrar la composición a un paciente. Los envases o kits pueden estar etiquetados para almacenamiento a temperatura ambiente o a temperatura refrigerada.
[0221] En una realización, se proporciona una composición que comprende una mezcla de un primer y segundo análogos de profármacos de insulina, en la que los primero y segundo análogos de profármacos de insulina difieren entre sí en función de la estructura del elemento de profármaco. Más particularmente, el primer análogo de profármaco de insulina puede comprender un elemento de profármaco de dipéptido que tiene una semivida sustancialmente diferente del elemento de profármaco de dipéptido del segundo análogo de profármaco de insulina. Por consiguiente, la selección de diferentes combinaciones de sustituyentes en el elemento de dipéptido permitirá la preparación de composiciones que comprenden una mezcla de análogos de profármacos de insulina que se activan de forma controlada durante un marco de tiempo deseado y en intervalos de tiempo específicos. Por ejemplo, las composiciones se pueden formular para liberar insulina activa a la hora de las comidas seguido de una activación posterior de la insulina durante la noche con dosis adecuadas que se liberan en función del momento de la activación. En otra realización, la composición farmacéutica comprende una mezcla de un análogo de profármaco de insulina descrito en este documento e insulina nativa, o un derivado bioactivo conocido de la insulina.
[0222] Se cree que los análogos de profármacos de insulina descritos son adecuados para cualquier uso que se haya descrito previamente para los péptidos de insulina. Por consiguiente, los análogos de profármacos de insulina descritos en el presente documento se pueden usar para tratar la hiperglucemia o tratar otras enfermedades metabólicas que resultan de niveles elevados de glucosa en sangre. Por consiguiente, la presente invención abarca composiciones farmacéuticas que comprenden un análogo de profármaco de insulina de la presente descripción y un vehículo farmacéuticamente aceptable para usar en el tratamiento de un paciente que sufre niveles elevados de glucosa en sangre. De acuerdo con una realización, el paciente a tratar usando los análogos de profármacos de insulina descritos en el presente documento es un animal doméstico y, en otra realización, el paciente a tratar es un ser humano.
[0223] Un procedimiento para tratar la hiperglucemia de acuerdo con la presente divulgación comprende los pasos de administrar el análogo de profármaco de insulina actualmente divulgado a un paciente utilizando cualquier vía estándar de administración, incluida la parenteral, tal como por vía intravenosa, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular, intratecal, por vía transdérmica, rectal, oral, nasal o por inhalación. En una realización, la composición se administra por vía subcutánea o intramuscular. En una realización, la composición se administra por vía parenteral y la composición de análogo de profármaco de insulina se envasa previamente en una jeringa.
[0224] Los análogos de profármacos de insulina descritos en el presente documento pueden administrarse solos o en combinación con otros agentes antidiabéticos. Los agentes antidiabéticos conocidos en la técnica o bajo investigación incluyen insulina nativa, glucagón nativo y derivados funcionales de los mismos, sulfonilureas, como tales tolbutamida (Orinase®), acetohexamida (Dymelor™), tolazamida (Tolinase ™), clorpropamida (Diabinese®), glipizida (Glucotrol ®), gliburida (Diabeta ®, Micronase®, Glynase ®), glimepirida (Amaryl ®) o gliclazida (Diamicron ®); meglitinidas, tales como repaglinida (Prandin ®) o nateglinida (Starlix®); biguanidas, tales como metformina (Glucophage®) o fenformina; tiazolidinedionas, tales como rosiglitazona (Avandia®), pioglitazona (Actos®) o troglitazona (Rezulin ™), u otros inhibidores de PPARy; inhibidores de alfa glucosidasa que inhiben la digestión de carbohidratos, tales como miglitol (Glyset ®), acarbosa (Precose/Glucobay); exenatida (Byetta®) o pramlintida; inhibidores de la dipeptidil peptidasa-4 (DPP-4), tales como vildagliptina o sitagliptina; inhibidores de SGLT (transportador de glucosa dependiente de sodio 1); o inhibidores de FBPasa (fructosa 1,6-bisfosfatasa).
[0225] Las composiciones farmacéuticas que comprenden los análogos de profármacos de insulina descritos en el presente documento pueden formularse y administrarse a pacientes usando portadores estándar farmacéuticamente aceptables y vías de administración conocidas por los expertos en la técnica. Por consiguiente, la presente descripción también abarca composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los análogos de profármacos de insulina descritos en el presente documento, o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización, la composición farmacéutica comprende una concentración de 1 mg/ml del análogo de profármaco de insulina a un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 7,0 en un sistema tampón de fosfato. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender el análogo de profármaco de insulina como único componente farmacéuticamente activo, o el análogo de profármaco de insulina se puede combinar con uno o más agentes activos adicionales. De acuerdo con una realización, se proporciona una composición farmacéutica que comprende uno de los análogos de profármacos de insulina descritos en el presente documento, preferiblemente estéril y preferiblemente con un nivel de pureza de al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97%, 98% o 99%, y un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones pueden contener un análogo de profármaco de insulina en el que el péptido activo resultante está presente en una concentración de al menos 0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml., 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml, 14 mg/ml, 15 mg/ml, 16 mg/ml, 17 mg/ml, 18 mg/ml, 19 mg/ml, 20 mg/ml, 21 mg/ml, 22 mg/ml, 23 mg/ml, 24 mg/ml, 25 mg/ml o más alta. En una realización, las composiciones farmacéuticas comprenden soluciones acuosas que se esterilizan y, opcionalmente, se almacenan en varios recipientes. Los compuestos descritos en el presente documento se pueden usar de acuerdo con una realización para preparar soluciones preformuladas listas para inyección. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden un polvo liofilizado. Las composiciones farmacéuticas se pueden envasar además como parte de un kit que incluye un dispositivo desechable para administrar la composición a un paciente. Los recipientes o kits pueden estar etiquetados para almacenamiento a temperatura ambiente o a temperatura refrigerada. De acuerdo con una realización, se proporciona una composición farmacéutica que comprende uno de los análogos de profármacos de insulina descritos en el presente documento, preferiblemente estéril y preferiblemente con un nivel de pureza de al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97%, 98% o 99%, y un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones pueden contener un análogo de profármaco de insulina en el que el péptido activo resultante está presente en una concentración de al menos 0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml., 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml, 14 mg/ml, 15 mg/ml, 16 mg/ml, 17 mg/ml, 18 mg/ml, 19 mg/ml, 20 mg/ml, 21 mg/ml, 22 mg/ml, 23 mg/ml, 24 mg/ml, 25 mg/ml o más alta. En una realización, las composiciones farmacéuticas comprenden soluciones acuosas que se esterilizan y, opcionalmente, se almacenan en varios recipientes. Los compuestos descritos en el presente documento se pueden usar de acuerdo con una realización para preparar soluciones preformuladas listas para inyección. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden un polvo liofilizado. Las composiciones farmacéuticas se pueden envasar además como parte de un kit que incluye un dispositivo desechable para administrar la composición a un paciente. Los recipientes o kits pueden estar etiquetados para almacenamiento a temperatura ambiente o a temperatura refrigerada.
[0226] Todos los procedimientos terapéuticos, composiciones farmacéuticas, kits y otras realizaciones similares descritas en el presente documento contemplan que los análogos de profármacos de insulina incluyen todas sus sales farmacéuticamente aceptables.
[0227] En una realización, el kit se proporciona con un dispositivo para administrar la composición de análogo de profármaco de insulina a un paciente. El kit puede incluir además una variedad de recipientes, por ejemplo, viales, tubos, botellas. Preferiblemente, los kits también incluirán instrucciones de uso. De acuerdo con una realización, el dispositivo del kit es un dispositivo dispensador de aerosol, en el que la composición está preenvasada dentro del dispositivo de aerosol. En otra forma de realización, el kit comprende una jeringa y una aguja, y en una forma de realización, la composición del análogo de insulina está preenvasada dentro de la jeringa.
[0228] Los compuestos que se describen en el presente documento se pueden preparar mediante procedimientos sintéticos estándar, técnicas de ADN recombinante o cualquier otro procedimiento para preparar péptidos y proteínas de fusión. Aunque ciertos aminoácidos no naturales no pueden expresarse mediante técnicas estándar de ADN recombinante, las técnicas para su preparación son conocidas en la técnica. Los compuestos descritos en el presente documento que abarcan porciones no peptídicas pueden sintetizarse mediante reacciones químicas orgánicas estándar, además de reacciones estándar de química de péptidos cuando sea aplicable.
EJEMPLO 1
Síntesis de las cadenas A y B de insulina
[0229] Las cadenas A y B de insulina se sintetizaron en resina de 4-metilbenzhirilamina (MBHA) o resina de 4-hidroximetil-fenilacetamidometilo (PAM) usando química Boc. Los péptidos se escindieron de la resina usando HHp - Cresol 95:5 durante 1 hora a 0° C. Después de la eliminación del HF y la precipitación con éter, los péptidos se disolvieron en ácido acético acuoso al 50 % y se liofilizaron. Alternativamente, los péptidos se sintetizaron usando química Fmoc. Los péptidos se escindieron de la resina utilizando ácido trifluoroacético (TFA)/triisopropilsilano (TIS)/H2O (95:2.5:2.5), durante 2 horas a temperatura ambiente. El péptido se precipitó mediante la adición de una cantidad excesiva de éter dietílico y el sedimento se solubilizó en tampón ácido acuoso. La calidad de los péptidos se controló mediante RP-HPLC y se confirmó mediante espectrometría de masas (ESI o MALDI).
[0230] Las cadenas de insulina A se sintetizaron con una sola cisteína libre en el aminoácido 7 y todas las demás cisteínas se protegieron como acetamidometil A-(SH)7 (Acm)61120 Las cadenas B de insulina se sintetizaron con una única cisteína libre en la posición 7 y la otra cisteína se protegió como acetamidometil B-(SH)7 (Acm)19. Los péptidos brutos se purificaron mediante RP-HPLC convencional.
[0231] Las cadenas A y B sintetizadas se unieron entre sí a través de su enlace de unión disulfuro nativo como se describió previamente en el documento US-2011-0257076. La cadena B respectiva se activó al derivado Cys7-Npys mediante disolución en DMF o DMSO y se hizo reaccionar con 2,2'-ditiobis (5-nitropiridina) (Npys) en una relación molar 1:1, a temperatura ambiente. La activación fue monitorizada por RP-HPLC y el producto fue confirmado por ESI-MS.
[0232] El primer enlace disulfuro B7-A7 se formó mediante la disolución de los respectivos A-(SH)7(Acm)61120 y B-(Npys)7(Acm)19en una relación molar de 1:1 a una concentración de péptido total de 10 mg/ml. Cuando se completó la reacción de combinación en cadena, la mezcla se diluyó hasta una concentración de ácido acético acuoso al 50 %. Los dos últimos enlaces disulfuro se formaron simultáneamente mediante la adición de yodo. Se añadió a la solución un exceso molar de 40 veces de yodo y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una hora más. La reacción se terminó mediante la adición de una solución acuosa de ácido ascórbico. La mezcla se purificó por RP-HPLC y el compuesto final se confirmó por MALDI-MS. Tal como se muestra en los datos de la Tabla 1, la insulina sintética preparada de acuerdo con este procedimiento se compara bien con la insulina purificada para la unión al receptor de insulina.
[0233] Los péptidos de insulina que comprenden un aminoácido modificado (tal como 4-amino fenilalanina en la posición A19) también se pueden sintetizar in vivo utilizando un sistema que permite la incorporación de aminoácidos no codificados en proteínas, incluido, por ejemplo, el sistema enseñado en las Patentes de EE.UU. Nos. 7,045,337 y 7,083,970.
Tabla 1: Actividad de la insulina sintetizada en relación con la insulina nativa
Figure imgf000055_0001
Pegilación de grupos amina (N - terminal y lisina) por alquilación reductora
a. Síntesis
[0234] Se disolvieron insulina (o un análogo de insulina), mPEG20k-aldehído y NaB^CN, en una relación molar de 1:2:30, en tampón de ácido acético a un pH de 4,1-4,4. La solución de reacción estaba compuesta por NaCl 0,1 N, ácido acético 0,2 N y Na2CO3 =,1 N. La concentración de péptido de insulina fue de aproximadamente 0,5 mg/ml. La reacción tiene lugar durante seis horas a temperatura ambiente. El grado de reacción se controló mediante RP-HPLC y el rendimiento de la reacción fue de aproximadamente el 50 %.
b. Purificación
[0235] La mezcla de reacción se diluyó de 2 a 5 veces con TFA al 0,1 % y se aplicó a una columna de RP-HPLC preparativa. Condición de HPlC: columna C4; caudal 10 ml/min; tampón A al 10 % ACN y TFA al 0,1 % en agua; tampón B TFA al 0,1% en ACN; gradiente lineal de A, B % de 0-40 % (0-80 min); se eluyó insulina-PEG o análogos con aproximadamente un 35 % de tampón B. Los compuestos deseados se verificaron mediante MALDI-TOF, después de la modificación química mediante sulfólisis o degradación de tripsina.
[0236] Pegilación de grupos amina (N terminal y lisina) mediante acilación de N -hidroxisuccinimida.
a. Síntesis
[0237] Se disolvieron insulina (o un análogo de insulina) junto con mPEG20k-NHS en tampón Bicine 0,1 N (pH 8,0) en una proporción molar de 1:1. La concentración de péptido de insulina fue de aproximadamente 0,5 mg/ml. El progreso de la reacción se controló mediante HPLC. El rendimiento de la reacción es aproximadamente del 90 % después de 2 horas a temperatura ambiente.
b. Purificación
[0238] La mezcla de reacción se diluyó de 2 a 5 veces y se cargó en RP-HPLC.
Condición de HPLC: columna C4; caudal 10 ml/min; tampón A al 10 % ACN y TFA al 0,1 % en agua; tampón B TFA al 0,1% en ACN; gradiente lineal de A, B % de 0-40 % (0-80 min); se eluyó insulina-PEG o análogos con aproximadamente un 35 % de tampón B. Los compuestos deseados se verificaron mediante MALDI-TOF, después de la modificación química mediante sulfólisis o degradación de tripsina.
Pegilación aminada reductora del grupo acetilo en el anillo aromático de la fenilalanina
a. Síntesis
[0239] Se disolvieron insulina (o un análogo de insulina), mPEG20k-hidrazida y NaBHaCN en una proporción molar de 1:2:20 en tampón de ácido acético (pH de 4,1 a 4,4). La solución de reacción estaba compuesta por NaCl 0,1 N, ácido acético 0,2 N y Na2CO30,1 N. La concentración de insulina o de análogos de insulina fue de aproximadamente 0,5 mg/ml. a temperatura ambiente durante 24 horas. El proceso de reacción se controló por HPLC. La conversión de la reacción fue aproximadamente del 50 % (calculado por HPLC)
b. Purificación
[0240] La mezcla de reacción se diluyó de 2 a 5 veces y se cargó en RP-HPLC.
Condición de HPLC: columna C4; caudal 10 ml/min; tampón A al 10 % ACN y TFA al 0,1 % en agua; tampón B TFA al 0,1% en ACN; gradiente lineal de A, B % de 0-40 % (0-80 min); se recogió insulina-PEG o análogo de insulina-PEG con aproximadamente un 35 % de B. Los compuestos deseados se verificaron mediante MALDI-TOF, después de la modificación química mediante sulfólisis o degradación de tripsina.
EJEMPLO 3
Ensayo de unión al receptor de insulina:
[0241] La afinidad de cada péptido por el receptor de insulina o IGF-1 se midió en un ensayo de unión competitivo utilizando tecnología de proximidad de centelleo. Se realizaron diluciones en serie de 3 veces de los péptidos en tampón Tris - Cl (Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, albúmina sérica bovina al 0,1 % p/v) y se mezclaron en placas de 96 pocillos (Corning Inc., Acton, MA) con (3-[125I]-yodotirosil) A TyrA14 insulina 0,05 nM o (3-[125I]-yodotirosil) IGF-1 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). En cada pocillo estaba presente una alícuota de 1-6 microgramos de fragmentos de membrana plasmática preparados a partir de células que sobreexpresaban los receptores de insulina o IGF-1 humanos y 0,25 mg/pocillo de perlas de ensayo de proximidad de centelleo de tipo A con aglutinina de germen de trigo tratadas con polietilenimina (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Después de cinco minutos de agitación a 800 rpm, la placa se incubó durante 12 horas a temperatura ambiente y se midió la radiactividad con un contador de centelleo líquido MicroBeta1450 (PerkiN -Elmer, Wellesley, MA). La radiactividad no unida específicamente (NSB) se midió en los pocillos con un exceso de concentración cuatro veces mayor de ligando nativo "frío" que la concentración más alta en las muestras de prueba. Se detectó radiactividad unida total en los pocillos sin competidor. El porcentaje de unión específica se calculó como se indica a continuación: % de unión específica = (unida - NSB/unida total - NSB) x 100. Los valores IC50 se determinaron usando el software Origin (OriginLab, Northampton, MA).
EJEMPLO 4
Ensayo de fosforilación del receptor de insulina
[0242] Para medir la fosforilación del receptor de insulina o análogo de insulina, se sembraron células HEK293 transfectadas con receptor en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos (Costar #3596, Cambridge, MA) y se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 100 UI/ml penicilina, estreptomicina 100 |jg/ml, HEPES 10 mM y suero de crecimiento bovino al 0,25 % (HyClone SH30541, Logan, UT) durante 16-20 horas a 37 °C, CO2 al 5 % y humedad del 90 %. Se prepararon diluciones en serie de insulina o análogos de insulina en DMEM suplementado con albúmina de suero bovino al 0,5 % (Roche Applied Science #100350, Indianapolis, IN) y se añadieron a los pocillos con células adheridas. Después de 15 min de incubación a 37°C en atmósfera humidificada con 5 % de CO2 las células se fijaron con paraformaldehído al 5 % durante 20 min a temperatura ambiente, se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato pH 7,4 y se bloquearon con albúmina de suero bovino al 2 % en PBS durante 1 h. A continuación, la placa se lavó tres veces y se llenó con anticuerpo contra fosfotirosina conjugado con peroxidasa de rábano picante (Upstate biotechnology #16-105, Temecula, CA) reconstituido en PBS con albúmina de suero bovino al 2 % según las recomendaciones del fabricante. Después de 3 horas de incubación a temperatura ambiente, la placa se lavó 4 veces y se añadieron 0,1 ml de sustrato de solución única TMB (Invitrogen, #00-2023, Carlbad, CA) a cada pocillo. El revelado del color se detuvo 5 minutos después mediante la adición de 0,05 ml de HCl 1 N. La absorbancia a 450 nm se midió en Titertek Multiscan MCC340 (ThermoFisher, Pittsburgh, PA). Se representaron las curvas de dosis respuesta con la absorbancia frente a la concentración de péptido y se determinaron los valores de EC50 utilizando el software Origin (OriginLab, Northampton, MA).
EJEMPLO 5
Determinación de la velocidad de escisión del dipéptido modelo (en PBS)
[0243] Se usó un hexapéptido específico (HSRGTF-NH2 ; SEQ ID NO : 17) como péptido modelo sobre el cual se pudo estudiar la velocidad de escisión de las extensiones N - terminales del dipéptido. Los péptidos modelo extendidos con dipéptido se prepararon protegidos con Boc y se añadieron sucesivamente sarcosina y lisina a la resina unida al péptido modelo para producir el péptido A (Lys-Sar-HSRGTF-NH2; SEQ ID NO : 18). El péptido A se escindió mediante HF y se purificó mediante HPLC preparativa.
[0244] Se determinó la velocidad de escisión para los respectivos propéptidos. Las concentraciones de los propéptidos y del péptido original modelo se determinaron por sus áreas máximas respectivas. Las constantes de velocidad de disociación de primer orden de los profármacos se determinaron trazando el logaritmo de la concentración del profármaco en varios intervalos de tiempo. La pendiente de este gráfico proporciona la constante de velocidad 'k'. Las semividas de escisión de los diversos profármacos se calcularon utilizando la fórmula t-i/2 = 0,693/k. Se determinó que la semivida de la extensión Lys-Sar a este péptido modelo HSRGTF-NH2 (SEQ ID NO : 17) era de 14,0 h.
EJEMPLO 6
Tasa de semivida de escisión del dipéptido en plasma determinada con un péptido modelo todo en isoforma d
[0245] Se usó un hexapéptido modelo adicional (dHdTdRGdTdF-NH2 SEQ ID NO : 21) para determinar la tasa de escisión del dipéptido en plasma. El isómero d de cada aminoácido se usó para evitar la escisión enzimática del péptido modelo, con la excepción de la extensión del profármaco. Este modelo de hexapéptido de isómero d se sintetizó de manera análoga al isómero l. La sarcosina y la lisina se agregaron sucesivamente al extremo N tal como se informó anteriormente para el péptido A para preparar el péptido B (dLys-dSardHdTdRGdTdF-NH2 SEQ ID NO : 59)
[0246] Se determinó la tasa de escisión para los respectivos propéptidos. Las concentraciones de los propéptidos y del péptido original modelo se determinaron por sus áreas máximas respectivas. Las constantes de velocidad de disociación de primer orden de los profármacos se determinaron representando el logaritmo de la concentración del profármaco en varios intervalos de tiempo. La pendiente de este gráfico proporciona la constante de velocidad 'k'. Se determinó que la semivida de la extensión Lys-Sar a este péptido modelo dHdTdRGdTdF-NH2 (SEQ ID NO : 21) era de 18,6 h.
EJEMPLO 7
[0247] La tasa de escisión para dipéptidos adicionales unidos al hexapéptido modelo (HSRGTF-NH2; SEQ ID NO : 17) se determinó usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 5. Los resultados generados en estos experimentos se presentan en las Tablas 2 y 3.
Tabla 2: Escisión de los dipéptidos O-U que están unidos a la cadena lateral de una para-amino-Phe N -terminal del hexa é tido modelo HSRGTF-NH2 SEQ ID NO : 17 en PBS
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Tabla 3: Escisión de los dipéptidos U-O unidos histidina (o derivados de histidina) en la posición 1 (X) del hexa é tido modelo XSRGTF-NH2 SEQ ID NO : 17
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[0248] Además, se han preparado varios derivados profármacos de análogos de insulina IGF1YL en los que se ha unido un elemento de dipéptido a través de un enlace amida a través del residuo 4-amino-fenilalanina presente en A19 de IGF1YL. El análisis in vitro de estos compuestos utilizando los procedimientos del Ejemplo 5 revela que la actividad de estos compuestos aumenta con el tiempo de incubación en tampón PBS o en plasma al 20%. Además, se midió la actividad in vitro del profármaco análogo de IGF MIU30: Al(aF19 -dLys(Ac),Sar) (dipéptido unido a través de un enlace amida a 4-aminoPhe en A19) para la unión del receptor de insulina en relación con la insulina nativa con el tiempo (1 hora, 3 horas, 6 horas, 9 horas y 10,5 horas) incubado en plasma al 20 %. La Tabla 3A compara la unión relativa al receptor de insulina a lo largo del tiempo incubado en plasma al 20 %/PBS a 37 °C. Tal como se indica por los datos presentados en un ensayo de unión in vitro, véase la tabla 3A, y un ensayo de fosforilación in vitro, véase la tabla 3B, la actividad aumentada se recupera de la muestra del derivado de profármaco A19 IGF con el tiempo, a medida que la forma profármaco se convierte en el péptido IGF1YL activo.
Tabla 3A
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Tabla 3B
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[0249] Pruebas de tolerancia a la glucosa in vivo utilizando ratones C57/Blk a los que se administró el análogo de insulina MIU-30a: B1 (Y16, L17, Y25) 29a : A1 (dLys(Ac),Sar-aF19) (dipéptido unido a través de un enlace amida a 4-aminoPhe de A19), MIU 30 disuelto en p Bs (pH 7,4) con plasma al 20 % e incubado durante 48 horas a 37 °C (generando "MIU-30c"). Las muestras incubadas durante 0 horas (MIU 30a) y 48 horas (MIU 30c) se extrajeron y se inyectaron en ratones negros C57 a 90 nmol/kg y 270 nmol/kg para medir la reducción de la glucosa (prueba de tolerancia a la insulina). En la Fig. 1A se muestra el perfil de reducción de glucosa de MIU 30a y MIU 30c en varios tiempos durante 8 horas. El compuesto original tiene una potencia baja, pero después de la incubación en plasma al 20 % durante 48 horas (generando "MIU-30c"), la potencia aumenta (ver Fig. 1A). En la Fig. 1B, la glucosa en sangre total de MIU 30a y MIU 30c en comparación con el vehículo se describe como área diferencial bajo la curva (AUC). A 90 nmol/kg, MIU 30a indica poco cambio en la glucosa, mientras que MIU 30c provoca una disminución considerable. A 270 nmol/kg, tanto MIU 30a como MIU 30c demuestran una disminución de la glucosa, pero la última muestra posee una potencia hipoglicémica significativamente mayor. En resumen, la forma de profármaco del análogo de insulina MIU30 muestra una potencia reductora de glucosa apreciablemente menor cuando se inyecta antes de la conversión ex vivo en condiciones fisiológicas al análogo de insulina original. Estos resultados in vivo son consistentes con el análisis in vitro. Se estima que la semivida del profármaco es de aproximadamente 20 horas.
EJEMPLO 8
Tolerancia comparativa a la insulina para análogos de profármacos de insulina
[0250] Se administró a ratones normales un análogo de heterodímero de insulina [B1 (Y16, L17, Y25) 29a: A1 (aF19-NH2)], o un derivado profármaco del mismo. El derivado de profármaco MIU-29:
[B1 (Y16,L17,Y25)29a : A1 (aF19-dLys(Ac),NLeu)] comprende una sustitución de 4-amino-fenilalnina en la posición A19 en la que un dipéptido dLys(Ac),NLeu se ha unido covalentemente en la posición 4-amino del residuo A19. Este dipéptido se escindirá automáticamente en condiciones fisiológicas con una semivida de aproximadamente 4,4 horas. Después de incubar el derivado del profármaco [B1 (Y16,L17,Y25)29a : A1(aF19-dLys(Ac),NLeu)] durante 24 horas ex vivo, el compuesto resultante se administró a ratones y se comparó su capacidad para reducir la glucosa en sangre con el compuesto original. Los dos compuestos se comportaron de manera casi idéntica.
[0251] Se investigó la acilación de los análogos de profármacos de insulina para determinar si se podían mejorar los tiempos de retención in vivo. La actividad in vitro de MIU 42 [B1 (Y16,L17,Y25)29a : A1 (dLys(rE - C14),SaraF19)], que tiene un elemento profármaco de dipéptido acilado, aumenta con el tiempo de incubación ex vivo en ACN al 30 %/PBS a pH 7,4, 37°C (que proporciona el tiempo para la conversión del profármaco) en relación con el profármaco no acilado (véase la Fig. 2). Las pruebas comparativas de potencia de insulina realizadas usando el profármaco MIU 42 administrado sin una etapa de preincubación muestran que el profármaco no es muy potente en relación con el compuesto original no profármaco (MIU-27). También se encontró que esto era cierto para un análogo de insulina acilado MIU-46 [B1 (H5,10 Y16,L17,Y25, K29 - C14)28a : A1 (N18,21, aF19NH2)] que tiene acilación en la posición B29. El compuesto no exhibió una potencia in vivo deseada o un perfil basal cuando se probó in vivo en ratones. En consecuencia, al menos en ratones, la acilación no produce el perfil deseado.
EJEMPLO 9
Biosíntesis y purificación de análogos de profármacos de insulina pegilados
[0252] La cadena B de IGF1 (2-25) H 510 Y16 L17 SH7 Acm19 amida se sintetizó en una resina MBHA usando química Boc en fase sólida. Después de la escisión del péptido de la resina con la eliminación simultánea de la protección de la cadena lateral de aminoácidos, la cadena B cruda se mezcló con 2,2'-ditiobis(5-nitropiridina) en DMSO para producir un derivado de cisteína-NpyS en Cys7. La adición de Boc-aminooxiacetilo (Aoa) al extremo N - terminal de la cadena B se logró mediante la reacción entre la cadena B y Boc-Aoa-OSu. La cadena B de IGF1 purificada (2-25) (BocAoa)0 H 510 Y16 L17 SH7 Acm19 amida se combinó con Acm 6711 N 1821 (aa1aa2)-pNH-F19 ácido de cadena A de IGF1 usando el procedimiento "1+2" descrito en US-2011-0257076 para generar el análogo de insulina con Boc-Aoa en el extremo N terminal de la cadena B. Boc se eliminó por tratamiento del péptido con un breve tratamiento con HCl 6N en presencia de hemiclorhidrato de O-(carboximetil)hidroxilamina como depurador. Después de la eliminación de Boc y purificación, el péptido se disolvió en anilina al 1 %/ACN al 30 %/NaOAc 0,2 M (pH 4,6) a una concentración de 3 mg/ml. Se añadió a la solución una cantidad en exceso doble de aldehído propiónico PEG 20 KD, la reacción se llevó a cabo con agitación durante una hora a temperatura ambiente, seguida de la purificación final para producir el análogo de insulina pegilado.
[0253] La adición de un PEG de 20 kDa al extremo amino de un análogo de insulina de dos cadenas reduce la potencia del análogo de insulina. La adición de un elemento profármaco de dipéptido autoescindible (dLys(rE -C14),Nleu) en la posición A19 reduce aún más la potencia del compuesto en aproximadamente 100 veces. Sin embargo, la preincubación del profármaco en PBS a 37 °C durante 78 horas (el dipéptido tiene una semivida de aproximadamente 4,4 horas) restablece la potencia hasta un valor cercano al compuesto pegilado original. Consulte la Tabla 4 que enumera la EC50 de los análogos en los subtipos A y B del receptor de insulina medidos en un ensayo de fosforilación in vitro.
T l 4 A ivi l r f rm in lin il
Figure imgf000060_0001
EJEMPLO 10
Biosíntesis y purificación de análogos de insulina de cadena única
[0254] Un minigén de insulina-IGF-I que comprende una cadena B y A de insulina nativa unida a través de la cadena C de IGF-I (B0 - C1 -A0) se clonó en el vector de expresión pGAPZa A (adquirido de Invitrogen) bajo el promotor GAP (promotor de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH)) para la expresión constitutiva y la purificación de la proteína recombinante en la levadura Pichia pastoris. El minigen se fusionó con un péptido N - terminal que codificaba la señal líder del factor de apareamiento a de Saccharomyces cerevisiae para la secreción de la proteína recombinante en el medio. Se usó un sitio de escisión de Kex2 entre el minigén y la secuencia líder del factor de apareamiento a para escindir la secuencia líder para la secreción del minigén con extremos amino nativos. Se introdujeron mutaciones de alanina de sitio único en el péptido C en las posiciones 1 (G1A), 2 (Y2A), 3 (G3A), 4 (S4A), 5 (S5A), 6 (S6A), 7 (R7A), 8 (R8A)), 10 (P10A), 11 (Q11A) y 12 (T12A) del minigén B0 - C1 - A0.
[0255] Los minigenes que incluyen B 0 - C1 - A0, once mutantes de alanina y otros derivados seleccionados se transformaron en levadura Pichia pastoris mediante electroporación. Los transformantes positivos se seleccionaron en placas con mínimó de metanol y se realizó una preparación genómica de cada aislado de Pichia y la integración de las construcciones en el genoma de la levadura se confirmó mediante PCR. Se visualizó un producto de PCR de 833 pares de bases en un gel de ADN de agarosa. Los análogos de insulina se produjeron por fermentación de una línea de levadura correspondiente. Las células de levadura se sedimentaron mediante centrifugación a 5 K durante 20 minutos en tubos de centrífuga Beckman de 500 ml y el medio se guardó para la posterior purificación de proteínas.
[0256] Los sobrenadantes del medio de cultivo se filtraron a través de un filtro Millipore de 0,2 μm. Se añadió acetonitrilo (ACN) al sobrenadante hasta un volumen final del 20 %. El sobrenadante se purificó sobre una resina Amberlite XAD7HP de Sigma, preequilibrada con ACN acuoso al 20 %. A continuación, la resina se enjuagó dos veces con 30 ml de ACN acuoso al 20 % y los contaminantes se eliminaron con ACN acuoso al 30 % que contenía TFA al 0,1 %. Los análogos de insulina parcialmente purificados se eluyeron de la columna con ACN acuoso al 54 % que contenía TFA al 0,1 % y se liofilizaron. Las muestras liofilizadas se resuspendieron en NH3HCO30,025 M a pH 8 y se purificaron en una columna Luna C18 (tamaño de partícula 10 μm, tamaño de poro 300 A°). La proteína se eluyó de la columna usando un gradiente lineal de ACN acuoso al 20-60 %. Las fracciones positivas de MALDI-MS se agruparon y se transfirieron a un vial de centelleo desechable para la liofilización posterior. A continuación, las muestras liofilizadas se resuspendieron en ACN acuoso al 20 % que contenía t Fa al 0,1 % y se purificaron en una columna Luna C18 (tamaño de partícula de 10 μm, tamaño de poro de 300 A°). La proteína se eluyó de la columna utilizando un gradiente lineal de ACN acuoso al 18-54 % con TFA al 0,1 %. La elución de proteínas se controló a una absorbancia de 280 nm. Las fracciones positivas de MALDI-TOF MS se analizaron a través de una columna analítica C8 para asegurar la pureza.
[0257] El análogo B0 - C1 - A 0 demostró una potencia que fue igualmente eficaz tanto en las isoformas del receptor de insulina como en el receptor de lGF-1. La mutación de la tirosina en la posición 2 a alanina o el acortamiento del péptido C a ocho aminoácidos mediante la eliminación de C9-12 proporcionó una mejora selectiva en la especificidad de la acción de la insulina mediante una reducción significativa en la actividad del receptor de IGF-1. Véanse los datos proporcionados en las Tablas 5A y 5B:
Tabla 5A Análisis de unión fosforilación de insulina B0C1A0
Figure imgf000061_0001
____________ Tabla 5B Análisis de unión y fosforilación de insulina (B0C1A0) ____________ Péptido I Unión a IGF-1 I Fosforilación de IGF-1
Figure imgf000062_0001
[0258] Las posiciones 2 y 3 en el péptido C son más sensibles a la modificación en el receptor de IGF-1, demostrando el receptor de insulina que es relativamente inmune a la modificación. Todos los análogos mantuvieron la actividad nanomolar de una sola unidad y ciertos análogos específicos demostraron tener una potencia ligeramente aumentada (nanomolar de una sola unidad baja). Los análogos más selectivos de la insulina fueron aquellos a los que les faltaban los últimos cuatro residuos del péptido C, tenían una mutación de alanina en la posición dos del péptido C o una combinación de los dos cambios.
[0259] Se investigó la estabilidad de las quimeras insulina/IGF exponiendo análogos de insulina a la enzima degradante específica de insulina (IDE) y analizando la actividad.
[0260] Ensayos de degradación de insulina: el IDE de rata de DNAr se obtuvo de EMD Chemicals Inc. Los péptidos se prepararon como alícuotas de 15 mM en tampón de bicarbonato de amonio. La concentración inicial se estimó en función de la absorbancia UV a 276 nm y se confirmó posteriormente mediante análisis HPLC con patrón interno. El pH de la solución se mantuvo entre 7,8 y 8,4. Se añadió IDE y se llevó a cabo la digestión a 37 °C a lo largo del tiempo (12 a 48 horas). Se utilizó una relación 1:350-450 (enzima:sustrato) dependiendo del experimento. Se extrajeron alícuotas en intervalos de tiempo en solución tamponada con TFA con péptido de referencia interno para el análisis de HPLC. Se extrajeron alícuotas adicionales en medio de ensayo DMEM para evaluar la actividad. Todas las alícuotas se congelaron inmediatamente en hielo seco y se mantuvieron a -55 °C hasta su análisis.
[0261] Ensayo de HPLC: el perfil de degradación de los péptidos investigados se evaluó en un ensayo de HPLC. Se realizaron dos ciclos en una columna Agilant Zorbax C8 conectada a un sistema Beckman - Coulter utilizando tampón TFA para cada alícuota (gradiente de 20 a 60 % B en 10 min, donde B = 90 % AcN).
[0262] Bioactividad: la potencia residual de los análogos después de la incubación con IDE se determinó como la mitad de la concentración efectiva máxima (EC50) en un ensayo ELISA de fosforilación del receptor de insulina. Cuando los péptidos preparados durante la degradación enzimática se sometieron a un ensayo de bioactividad por fosforilación del receptor de insulina, observamos que todos los análogos de la cadena A de IGF-2 y la insulina pierden sustancialmente toda la actividad, mientras que todos los análogos de la cadena A de IGF-1 la retienen. La escisión de los análogos de insulina por la enzima degradante específica de insulina (IDE) es extremadamente robusta y se detecta fácilmente en aquellos análogos de insulina en los que la cadena A se deriva de la secuencia de insulina nativa. Por el contrario, aquellos análogos en los que la cadena A se deriva de la secuencia de IGF-1 parecen ser extremadamente resistentes a la proteólisis.
[0263] La perspectiva de que la mayor estabilidad podría generar una mayor mitogenicidad, sin embargo, no parecía haber una correlación de los análogos de mayor potencia de insulina con una mayor proliferación. Además, y de importancia específica para la estabilidad proteolítica, los análogos que eran más resistentes a IDE no parecían tener mayor potencial mitógeno.
[0264] Se sometió un conjunto de análogos de insulina a pruebas in vivo en ratones normales (Melior Research Labs). Todos los péptidos de interés demostraron una potencia reductora de la glucosa similar o mejorada en comparación con el tratamiento estándar con insulina. Sin embargo, cuando se compararon los análogos con insulina A frente a la cadena A de IGF1 con las mismas cadenas B, no se observaron diferencias significativas en la potencia. Esto respalda la conclusión de que la degradación de IDE y la eliminación de la insulina no es un mecanismo primario o fisiológicamente relevante.
EJEMPLO 11
Biosíntesis y purificación de profármacos de insulina N - alquilada y lipidada
1. Síntesis en fase líquida de tripéptidos tal como se describe en la Fig. 14A
Procedimiento general para la Reacción Ugi (8a, 8b)
[0265] Se agitó una solución de amina primaria y aldehído en MeOH a temperatura ambiente durante 1 hora seguido de la adición de t-Boc-D-Lys(Fmoc) o Fmoc-D-Lys(t-Boc) e isocianoacetato de metilo. La mezcla de reacción se agitó durante 10 horas a temperatura ambiente y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó con cromatografía en columna ultrarrápida (“flash”) para dar el producto.
Procedimiento general para la acilación de ácidos grasos (9a, 9b)
[0266] El grupo protector de la cadena lateral de la lisina se eliminó con piperidina al 1 %/1,8-diazabicicloundec-7-eno (DBU) al 1 %/diclorometano (para 8a) o TFA al 50 %/DCM (para 8b). La amina libre se aciló con el ácido graso apropiado en presencia de clorhidrato de N -(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida/6-Cloro-1-hidroxibenzotriazol deshidratado en DCM y el producto resultante se purificó por cromatografía ultrarrápida.
Procedimiento general para hidró lis is de éster metílico (10a, 10b)
[0267] El éster metílico se hidrolizó en una solución de hidróxido de litio en THF/agua en condiciones básicas. A continuación, la reacción se ajustó a pH 2 mediante la adición de solución de HCl, la mezcla de reacción se extrajo con DCM y el producto se recuperó mediante cromatografía en columna ultrarrápida.
Procedimiento general para la activación de ácidos carboxílicos (11a, 11b)
[0268] El ácido carboxílico se activó con NMP usando DIC/NHS en NMP, o se activó con DIC/NHS/NMP, y se usó en la siguiente etapa.
2. Síntesis en fase sólida de tripéptidos (Fig. 14B)
Procedimiento general para la carga de aminoácidos protegidos con Fmoc (1)
[0269] Se suspendieron 1,0 g (1,1 mmol) de resina de cloruro de 2 - Clorotritilo (malla 100-200; DVB al 1%; carga 1,1 mmol/g), el aminoácido protegido con Fmoc (2,2 mmol, 2 eq.) y 350 μl de N,N -diisopropiletilamina (2,2 mmol, 2 eq.) en DCM (10 ml) y se agitaron durante la noche a temperatura ambiente. La resina se drenó, se lavó 3 veces con DMF (10 ml) y 3 veces con DCM (10 ml), a continuación, se trató con una solución de DCM (10 ml), MeOH (2 ml) y N,N -diisopropiletilamina (1 ml) para desactivar los sitios de cloruro de 2 - Clorotritilo no reaccionados. Finalmente, la resina se lavó 3 veces con DMF (10ml) y 3 veces con DCM (10ml) y se secó al vacío.
Procedimiento general para los a-bromoacil-Gly-aminoácidos unidos a resina (2)
[0270] La resina unida 1 se trató dos veces durante 15 minutos con piperidina al 20 % en DMF, la resina se lavó repetidamente con DMF (10 ml), DCM (10 ml) y DMF (10 ml) de nuevo. Se trató una porción de 0,2 g (0,22 mmol) de resina con 146 mg de ácido a-bromoacético (1,1 mmol, 5 eq.), 187 mg de 6 - Cloro-1-hidroxibenzotriazol deshidratado (1,1 mmol, 5 eq.) y 154 μl de N,N -diisopropilcarbodiimida (1,1 mmol, 5 eq.) en DMF (3ml) a temperatura ambiente. Después de 2 horas, la resina se drenó, se lavó 3 veces con DMF (10 ml) y DCM (10 ml).
Procedimiento general para aN -(R1)-Gly unida a resina (3)
[0271] Se trataron 0,2 g de resina con 3,0 mmol de amina primaria y 525 μl (3 mmol) de DIEA en 3 ml de DMSO a temperatura ambiente durante la noche. A continuación, se drenó la resina, se lavó con DMF y DCM.
t-Boc-D-Lys (Fmoc)-N -(Rl)-Gly unida a resina (4)
[0272] Se trataron 0,2 g (0,22 mmol) de resina 3 con piperidina al 20 % en DMF (10 ml), la resina se lavó con DMF (10 ml), DCM (10 ml) y DMF (10 ml) nuevamente, a continuación se mezcló con 515 mg de t-Boc -D-Lys (Fmocl)-OH (1,1 mmol, 5 equiv.), 330 mg 3-(Dietoxifosforiloxi)-1,2,3 - benzotriaziN -4(3H)-ona (DEPBT) (1,1 mmol, 5 equiv.) y 192 μl de DIEA (1,1 mmol, 5 eq.) en DMF (3 ml) a temperatura ambiente durante la noche. La resina se drenó, se lavó con DMF (10 ml) y DCM (10 ml).
t-Boc-D-Lys (acilo graso)-N -Rl-Gly-aminoácido unido a resina (5)
[0273] La resina unida 4 se desprotegió con piperidina al 20 % en DMF, la resina se lavó con DMF (10 ml), DCM (10 ml) y DMF (10 ml) de nuevo. Una porción de resina de 0,2 g (0,22 mmol) se trató con un ácido graso de cadena larga (1,1 mmol, 5 eq.), 399 mg de 3-óxido hexafluorofosfato de 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio (HATU) (1,05 mmol, 4,75 eq.) y 193 μl de DIEA (1,05 mmol, 4,75 eq.) en DCM (2 ml) y DMF (2 ml) a temperatura ambiente durante la noche. La resina se drenó, se lavó con DMF (10 ml) y DCM (10 ml) y se secó al vacío.
t-Boc -D-Lys (acilo graso)-N -Rl-Gly-aminoácido (6)
[0274] La resina 5 unida se escindió en 10 ml de TFA al 0,1 %, trifluoroetanol (TFE) al 20 % en DCM. Después de 1 hora, se recogió el filtrado y se enjuagó la resina con 5 ml de DCM. El filtrado combinado y los lavados con DCM se combinaron y evaporaron a presión reducida para producir un aceite amarillo. Este material bruto se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (4%-12% de MeOH en DCM como eluyente) para producir los productos como un sólido blanco o un aceite de color amarillo claro.
t-Boc-D-Lys (acilo graso)-N -Rl-Gly-aminoácido-NHS éster (7)
[0275] Se activaron 12,8 mg del ácido libre 6 (0,02 mmol) usando 4,6 mg de NHS (0,04 mmol, 2 eq.) y 5,6 μl de DlC (0,04 mmol, 2 eq.) en 1 ml de NMP durante la noche y se usaron sin purificación adicional.
3. Unión del tripéptido lipidado a la insulina (ver Fig. 14C y 14D)
Síntesis de profármacos de insulina lipidada usando A1, B29-di-tBoc-insulina (Fig. 14C)
Preparación de Al, B29-di-tBoc-insulina (12)
[0276] Se suspendió insulina (150 mg, 0,026 mmol) en DIENDMF al 2 % (15 ml) y se añadieron 12,7 mg de 2-(terc-butiloxicarbonil-oxiimino)-2-fenilacetonitrilo (0,052 mmol, 2 eq.) a la solución turbia y se agitó durante 4 horas a temperatura ambiente. Después de 4 horas, la solución se volvió transparente y, a continuación, la reacción se inactivó con 135 ml de tampón AcOH al 1 % y ACN al 20 %. La HPLC preparativa proporcionó el producto deseado en forma de un polvo blanco (60,2 mg, 38,5 % de rendimiento).
Procedimiento general para acoplar tripéptido a A1, B29-di-tBoc-insulina (14)
[0277] A una solución de Al, B29-di-tBoc-insulina en una mezcla de NMP/tampón bicina (pH 8,2) (3:1) se añadieron 2 eq. de éster succinato de tripéptido (2 eq.) en NMP. El progreso de la reacción se controló con LC-MS. Después de 4 horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se trató con un exceso de ácido fosfórico al 85 %, se inactivó mediante dilución con agua y se purificó mediante HPLC preparativa para dar el producto.
Síntesis de profármacos de insulina lipidados usando A1, B29-di-(Fmoc)-insulina (Fig. 14D)
A1, B29-di-(Fmoc)-insulina (15)
[0278] Se disolvió insulina (116 mg, 0,02 mmol) en una mezcla de 5 ml de NMP (4 ml) y tampón bicina (pH 8,2) (1 ml). Se añadió lentamente éster de Fmoc-NHS (13,5 mg, 0,04 mmol, 2 eq.) a la solución resultante y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente con monitorización por LC-MS. Una vez completada, la reacción se inactivó con 135 ml de AcOH al 1 % y tampón de ACN al 20 %. La HPLC preparativa proporcionó el producto deseado como un polvo blanco (25,2 mg, 20,5 % de rendimiento).
Procedimiento general para acoplar el resto tripeptídico a la A1, B29-di-Fmoc insulina (17)
[0279] La solución de Al, B29-di-Fmoc-insulina en NMP/tampón de bicina (pH 8,2) (3:1) se trató con el éster succinato de tripéptido (2 eq.) en NMP y la reacción se controló con LC-MS. Después de 4 horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se trató con piperidina al 20 % en DMF, se inactivó mediante la adición de una solución de ácido clorhídrico 0,1 N y se purificó con HPLC preparativa para dar el profármaco final.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Profármaco de insulina que comprende la estructura:
A-B-C-Q;
en la que Q es un péptido de insulina; y
A-B-C comprende la estructura:
Figure imgf000065_0001
en la que A-B-C está unida a Q a través de un enlace amida a través del aminoácido N - terminal de la cadena A o la cadena B,
R10 es H;
R1 es (alquilo C1 -C6) NHR8 o (alquilo C1 - C6) NH-S1-R9;
R2, R4 y R11 son cada uno H;
R5 es NH2;
R8es acilo C18 - C30;
S1 es un espaciador que consiste en uno o dos aminoácidos cargados seleccionados del grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, ácido cisteico, arginina y lisina,
R3 es alquilo C1 - C18, alquenilo C3 - C8, (alquilo C1 - C4) (cicloalquilo C4 - C6), (alquilo C1 - C4) (heterocíclico C3 - C5), o (alquilo C1 - C4) (arilo C6 - C10); y
R8 es H o alquilo C1 - C8,
en el que el péptido de insulina Q comprende una secuencia de cadena A de GIVEQCCX8Xg ICSLYQLENYCX21-R44 (SEQ ID NO: 73) y una secuencia de cadena B de R22-X25 LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41 X42GFX45(SEQ ID NO: 20), en el que
dicha cadena B está unida a dicha cadena A a través de enlaces disulfuro;
X8 es histidina o treonina;
Xg es serina, lisina o alanina;
X21 es alanina, glicina o asparagina;
X25 es histidina o treonina;
X29 se selecciona del grupo que consiste en alanina, glicina y serina;
X30 se selecciona del grupo que consiste en histidina, ácido aspártico, ácido glutámico, ácido homocisteico y ácido cisteico;
X33 se selecciona del grupo que consiste en ácido aspártico y ácido glutámico;
X34 se selecciona del grupo que consiste en alanina y treonina;
X41 se selecciona del grupo que consiste en ácido glutámico, ácido aspártico o asparagina;
X42 se selecciona del grupo que consiste en alanina, ornitina, lisina y arginina;
X45 es tirosina o fenilalanina;
R22 se selecciona del grupo que consiste en FVNQ (SEQ ID NO: 12), FVKQ (SEQ ID NO: 8), un tripéptido valina-asparagina-glutamina, un dipéptido asparagina-glutamina, glutamina y una amina N - terminal; y R44 es COOH o CONH2.
2. Profármaco según la reivindicación 1, en el que
R1 es (alquilo C1 - C6) NHR8;
R2, R4 y R11 son cada uno H;
R5 es NH2;
R8 es H o alquilo C1 - C8; y
R8 es acilo C18 - C30.
3. Profármaco según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que
R3 es alquilo C1 - C8.
4. Profármaco de la reivindicación 3, en el que
R1 es (CH2)4NHR8 o (CH2)4NH-S1 -R8;
R3 es alquilo C3 - C4; y
R8 es acilo C18 - C 28.
5. Profármaco según la reivindicación 1, en el que
R1 es (CH2)4-S1-NHR8 o (C^^NHR8;
R3 es alquilo C3 - C^
R5 es NH2;
R9 es acilo C18 - C28; y
A-B-C está unido a Q a través de un enlace amida a través de la amina N - terminal de la cadena B de la insulina.
6. Profármaco según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la cadena A comprende una secuencia GIYEQCCTSICSLYQLENYCN-R 44 (SEQ ID NO : 1) y dicha cadena B comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 2), FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT (SEQ ID NO : 9), FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT (SEQ ID NO : 5) y FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTEKT (SEQ ID NO : 6).
7. Profármaco de la reivindicación 1, en el que R2 es H y B se selecciona del grupo que consiste en glicina (N -metilo), glicina (N -etilo), glicina (N -propilo), glicina (N -butilo), glicina (N -pentilo), glicina (N -hexilo), glicina (N -heptilo) y glicina (N -octilo).
8. Profármaco de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que A tiene estereoquímica D.
9. Profármaco según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el profármaco se selecciona del grupo que consiste en:
dLys(C22)-(N - terc-Bu)Gly-Gly, B1-insulina;
dLys(C18)-(N - tBu)Gly-Gly, B1-insulina;
dLys(C18)-(N - sBu)Gly-Gly, B1-insulina;
dLys(C18)-(N - iPro)Gly-Gly, B1-insulina;
dLys(C18)-(N - ciclohexilmetil)Gly-Gly, B1-insulina;
dLys(C18)-(N - metil)Gly-Gly, B1-insulina;
dLys(C18)-(N - ciclobutil)Gly-Gly, B1-insulina; y
dLys(C18)-(N - ciclohexil)Gly-Gly, B1-insulina.
10. Composición farmacéutica que comprende el profármaco de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y un portador farmacéuticamente aceptable.
11. Profármaco de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para uso en el tratamiento de hiperglucemia o diabetes.
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