ES2945359T3 - Métodos para producir epimerasas y alcaloides de bencilisoquinolina - Google Patents

Abstract

Se proporciona un método para epimerizar un alcaloide de (S)-1-bencilisoquinolina a un alcaloide de (R)-1-bencilisoquinolina. El método comprende poner en contacto el alcaloide (S)-1-bencilisoquinolina con al menos una enzima. Poner en contacto el alcaloide de (S)-1-bencilisoquinolina con al menos una enzima convierte el alcaloide de (S)-1-bencilisoquinolina en un alcaloide de (R)-1-bencilisoquinolina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para producir epimerasas y alcaloides de bencilisoquinolina

ANTECEDENTES

[0001] Mishra S, et al. ((2013) PLoS One 8(1):e52784) describe la epimerización de (S)-reticulina a (R)-reticulina en Papaver somniferum. Hirata K, et al. ((2004) Phytochemistry 65(8):1039-46) describe una sintasa que oxida (S)-reticulina a 1,2-deshidroreticulina de Papaver somniferum. De-Eknamul W, et al. ((1992) Phytochemistry 31(3): 813-821) describe las propiedades de una 1,2-deshidroreticulina reductasa de Papaver somniferum. Los documentos WO 2015/173590 y WO 2015/081437 describen, entre otros, un proceso para la transformación de (S)-reticulina en (R)-reticulina.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0002] La invención proporciona un método para epimerizar un alcaloide de (S)-1-bencilisoquinolina a un alcaloide de (R)-1-bencilisoquinolina dentro de una célula huésped microbiana manipulada, que comprende: poner en contacto el (S)-1-alcaloide de bencilisoquinolina con al menos una enzima que comprende una epimerasa, en el que el contacto del alcaloide de (S)-1-bencilisoquinolina con al menos una enzima convierte el alcaloide de (S)-1-bencilisoquinolina en un alcaloide de (R)-1-bencifisoquinolina dentro de la célula huésped microbiana manipulada, donde al menos una enzima se produce cultivando la célula microbiana manipulada que tiene una secuencia codificante para codificar al menos una enzima, donde el alcaloide de (SJ-1-bencilisoquinolina se pone en contacto con una cantidad suficiente de dicho alcaloide al menos una enzima que comprende una epimerasa tal que al menos el 5 % del alcaloide de SJ-1-bencilisoquinolina se convierte en (^-alcaloide de 1-bencilisoquinofina, y además: (i) la epimerasa tiene una secuencia de aminoácidos con al menos al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 15; o (ii) la epimerasa comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, y 15.

[0003] La epimerasa puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 15, como se enumeran en la Tabla 1.

[0004] En algunos ejemplos, una célula no vegetal modificada (es decir, microbiana) comprende una pluralidad de secuencias codificantes, cada una de las cuales codifica una enzima que se selecciona del grupo de enzimas enumeradas en la Tabla 2. En algunos ejemplos, las secuencias de codificación heterólogas pueden estar operativamente conectadas. Las secuencias de codificación heterólogas que están operativamente conectadas pueden estar dentro de la misma vía de producción de un producto de alcaloide de bencilisoquinolina y/o producto de epimerasa particular.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0005] Las características novedosas de la invención se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la invención con referencia a la siguiente descripción detallada que establece formas de realización ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la invención, y cuyos dibujos adjuntos:

FIG. 1 ilustra ejemplos de rutas de síntesis, reciclaje y recuperación de tetrahidrobiopterina, de acuerdo con formas de realización de la invención.

FIG. 2 ilustra un esquema biosintético para la conversión de glucosa en 4-HPA, dopamina y 3,4-DHPA, de acuerdo con formas de realización de la invención.

FIG. 3 ilustra un ejemplo esquemático de la formación de alcaloides de (RJ-1-bencifisoquinofina, de acuerdo con formas de realización de la invención.

FIG. 4 ilustra una secuencia de aminoácidos de una enzima CYP-COR, de acuerdo con formas de realización de la invención.

FIG. 5 ilustra un esquema biosintético para la conversión de L-tirosina en reticulina a través de norcoclaurina, de acuerdo con formas de realización de la invención.

FIG. 6 ilustra un esquema biosintético para la conversión de L-tirosina en reticulina a través de norlaudanosolina, de acuerdo con formas de realización de la invención.

FIG. 7 ilustra un esquema biosintético para la conversión de L-tirosina en alcaloides de morfinano, de acuerdo con formas de realización de la invención.

FIG. 8 ilustra un esquema biosintético para la conversión de L-tirosina en protoberberina, ftalideisoquinolina y productos de alcaloides de berberina, de acuerdo con formas de realización de la invención.

FIG. 9 ilustra un esquema biosintético para la conversión de L-tirosina en productos alcaloides de noscapina, noscapinoide y ftalideisoquinolina, de acuerdo con formas de realización de la invención.

FIG. 10 ilustra un esquema biosintético para la conversión de L-tirosina en alcaloides de sanguinarina y benzofenantridina, de acuerdo con formas de realización de la invención.

FIG. 11A ilustra un esquema biosintético para la conversión de canadina en noscapina, de acuerdo con formas de realización de la invención.

FIG. 11B ilustra un esquema biosintético para la producción de opioides semisintéticos, de acuerdo con formas de realización de la invención.

FIG. 12 ilustra mutantes de tirosina hidroxilasa que mejoran la producción de norcoclaurina a partir de azúcar en cepas de levadura manipuladas, de acuerdo con formas de realización de la invención.

FIG. 13 ilustra mutantes de tirosina hidroxilasa que mejoran la producción de reticulina a partir de azúcar en cepas de levadura manipuladas, de acuerdo con formas de realización de la invención.

FIG. 14 ilustra la coexpresión de dihidrofolato reductasa (DHFR) que mejora la producción de L-DOPA por tirosina hidroxilasa en cepas de levadura manipuladas, de acuerdo con formas de realización de la invención.

FIG. 15 ilustra (A) la adición de antioxidantes a los medios de cultivo que mejoran la producción de L-DOPA por tirosina hidroxilasa en cepas de levadura manipuladas y (B) la adición de antioxidantes a los medios de cultivo que aumentan los niveles de BH4, de acuerdo con las formas de realización de la invención.

FIG. 16 ilustra (A) un esquema biosintético para la conversión de L-tirosina en bisBIA y (B) cepas de levadura diseñadas para biosintetizar bisBIA, de acuerdo con formas de realización de la invención.

FIG. 17 ilustra un árbol filogenético de fusiones tipo citocromo P450 oxidasa-codeinona reductasa (CYP-COR), de acuerdo con formas de realización de la invención.

FIG. 18 ilustra un análisis CL-EM/EM de cepas de levadura diseñadas para convertir (SJ-reticulina en salutaridina, de acuerdo con formas de realización de la invención.

FIG. 19 ilustra un análisis CL-EM/EM quiral de cepas de levadura diseñadas para convertir la norlaudanosolina racémica en (RJ-reticulina, de acuerdo con formas de realización de la invención.

FIG. 20 ilustra fusiones diseñadas de salutaridina sintasa que elimina la glicosilación unida a N de la proteína observada cuando se expresa heterólogamente en levadura pero no en plantas, de acuerdo con formas de realización de la invención.

FIG. 21 ilustra diseños de fusión de queilantifolina sintasa-salutaridina sintasa, de acuerdo con formas de realización de la invención.

FIG. 22 ilustra la optimización de codones de salutaridina sintasa y las fusiones diseñadas que mejoran la actividad en la levadura, de acuerdo con formas de realización de la invención.

FIG. 23 ilustra un análisis CL-EM/EM de fermentación por lotes a pequeña escala en el que la levadura manipulada cataliza la conversión de (RJ-reticulina en tebaína y la conversión de rac-norlaudanosofina en tebaína, de acuerdo con formas de realización de la invención.

FIG. 24 ilustra la generación de una variante de la enzima CODM que muestra una actividad mejorada en la levadura a través de la mutagénesis aleatoria y la selección, de acuerdo con las formas de realización de la invención.

FIG. 25 ilustra la optimización de la fermentación para la conversión de (RJ-reticulina en tebaína mediante levadura manipulada, de acuerdo con formas de realización de la invención.

FIG. 26 ilustra cepas de plataforma de levadura para la producción de reticulina intermedia de punto de ramificación clave a partir de Ltirosina, de acuerdo con formas de realización de la invención.

FIG. 27 ilustra la producción de tebaína e hidrocodona en cepas de levadura manipuladas, de acuerdo con formas de realización de la invención.

FIG. 28 ilustra la producción aumentada del alcaloide de bencilisoquinolina reticulina al aumentar el número de copias del gen NCS de dos copias a tres copias en una cepa de levadura manipulada, de acuerdo con formas de realización de la invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0006] La presente descripción proporciona métodos para la producción de diversos alcaloides de bencilisoquinolina (BIA) en células huésped manipuladas. En casos particulares adicionales, la presente descripción proporciona métodos para producir diversos productos alcaloides a través de la epimerización de (SJ-reticulina a (RJ-reticulina.

Alcaloides de bencMisoquinolina (BIA) de interés

[0007] Se proporcionan células huésped que producen BIA de interés. En algunos ejemplos, las cepas modificadas de células huésped proporcionan una plataforma para producir alcaloides de bencilisoquinolina de interés y modificaciones de los mismos en varias clases estructurales que incluyen, entre otros, BIA precursores, bencilisoquinolinas, protoberberinas, protopinas, benzofenantridinas, promorfinanos, morfinanos, secoberberinas, ftalideisoquinolinas., aporfinas, bisbencilisoquinolinas y otros. Cada una de estas clases pretende incluir precursores biosintéticos, productos intermedios y metabolitos de los mismos, de cualquier miembro conveniente de una ruta biosintética de células huésped manipulada que pueda conducir a un miembro de la clase. A continuación se dan ejemplos no limitantes de compuestos para cada una de estas clases estructurales. En algunos casos, la estructura de un ejemplo dado puede caracterizarse o no como un alcaloide de bencilisoquinolina. Las presentes entidades químicas pretenden incluir todos los isómeros posibles, incluidos enantiómeros individuales, mezclas racémicas, formas ópticamente puras, mezclas de diastereoisómeros y mezclas intermedias.

[0008] Los precursores de BIA pueden incluir, entre otros, norcoclaurina (NC) y norlaudanosolina (NL), así como precursores de NC y NL, como tirosina, tiramina, 4-hidroxifenilacetaldehído (4-HPA), 4-hidroxifenilpirúvico (4-HPPA), L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA), 3,4-dihidroxifenilacetaldehído (3,4-DHPA) y dopamina. En algunas formas de realización, uno o más precursores de BIA son 3,4-dihidroxifenilacetaldehído (3,4-DHPA) y dopamina. En ciertos casos, uno o más precursores de BIA son 4-hidroxifenilacetaldehído (4-HPA) y dopamina. En particular, NL y NC pueden sintetizarse, respectivamente, a partir de moléculas precursoras a través de una reacción de condensación de Pictet-Spengler, donde la reacción puede ocurrir espontáneamente o puede ser catalizada por cualquier enzima conveniente.

[0009] Las bencilisoquinolinas pueden incluir, entre otras, norcoclaurina, norlaudanosolina, coclaurina, 3'-hidroxicoclaurina, 4'-0-metilnorlaudanosolina, 4'-0-metil-laudanosolina, N-metilnorcoclaurina, laudanosolina, N-metilcoclaurina, 3'-hidroxi-N-metilcoclaurina, reticulina, norreticulina, papaverina, laudanina, laudanosina, tetrahidropapaverina, 1,2-dihidropapaverina y orientalina.

[0010] Las protoberberinas pueden incluir, entre otras, escoulerina, qeilantifolina, estilopina, nandinina, jatrorizina, estefolidina, discretamina, c/s-N-metilestilopina, tetrahidrocolumbamina, palmatina, tetrahidropalmatina, columbamina, canadina, N-metilcanadina, 1-hidroxicanadina, berberina, N-metilofiocarpina, 1,13-dihidroxi-N-metilcanadina y 1 -hidroxi-10-0-acetil-N-metilcanadina.

[0011] Las protopinas pueden incluir, entre otras, protopina, 6-hidroxiprotopina, alocriptopina, criptopina, muramina y talictricina.

[0012] Las benzofenantridinas pueden incluir, entre otras, dihidrosanguinarina, sanguinarina, dihidroqueilirrubina, queilirrubina, dihidromarcapina, marcapina y queleritrina.

[0013] Los promorfinanos pueden incluir, entre otros, salutaridina, salutaridinol y salutaridinol-7-O-acetato.

[0014] Los morfinanos pueden incluir, entre otros, tebaína, codeinona, codeína, morfina, morfinona, oripavina, neopinona, neopina, neomorfina, hidrocodona, dihidrocodeína, 14-hidroxicodeinona, oxicodona, 14-hidroxicodeína, morfinona, hidromorfona, dihidromorfina, dihidroetorfina, etilmorfina, etorfina, metopón, buprenorfina, folcodina, heterocodeína y oximorfona.

[0015] Las secoberberinas pueden incluir, pero no se limitan a 4'-0-desmetilmacrantaldehído, 4'-0-desmetilpapaveroxina, 4'-0-desmetil-3-0-acetilpapaveroxina, papaveroxina y 3-0-aceteilpapaveroxina.

[0016] Las ftalideisoquinolinas pueden incluir, entre otras, narcotolinehemiacetal, narcotinehemiacetal, narcotolina, noscapina, adlumidina, adlumina, (+) o (-)-bicuculina, capnoidina, carlumina, corledina, corlumidina, decumbenina, 5 '-0-demetilnarcotina, (+) o (-)-a o p-hidrastina e hipecumina.

[0017] Las aporfinas pueden incluir, entre otras, magnoflorina, corituberina, apomorfina, boldina, isoboldina, isotebaína, isocorituberina y glaufina.

[0018] Las bisbencilisoquinolinas pueden incluir, entre otras, berbamunina, guattgaumerina, dauricina y liensinina.

[0019] Otros compuestos que pueden ser producidos por las cepas manipuladas pueden incluir, entre otros, rodadina, pavina, isopavina y cularina.

[0020] En ciertas formas de realización, las cepas diseñadas pueden proporcionar una plataforma para producir compuestos relacionados con la síntesis de tetrahidrobiopterina que incluyen, entre otros, trifosfato de dihidroneopterina, 6-piruvoil tetrahidropterina, 5,6,7,8-tetrahidrobiopterina, 7,8-dihidrobiopterina, tetrahidrobiopterina 4a-carbinolamina, dihidrobiopterina quinonoide y biopterina.

Células huésped

[0021] Se puede utilizar cualquier célula conveniente en las células huésped y métodos objeto. Las células huésped son células microbianas. En ciertos casos, las células huésped son células bacterianas o células de levadura. Puede utilizarse cualquier tipo conveniente de célula huésped para producir las células productoras de BIA en cuestión, véanse, por ejemplo, los documentos US2008/0176754 y US2014/0273109. Las células huésped de interés incluyen, pero no se limitan a células bacterianas, tales como Bacillus subtilis, Escherichia coli, Streptomyces y Salmonella typhimuium, y células de levadura tales como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe y Pichia pastoris. En algunos ejemplos, las células huésped son células de levadura o células E. coli. En algunos casos, la célula huésped es una célula de levadura. En algunos casos, la célula huésped proviene de una cepa de levadura diseñada para producir un BIA de interés, como un alcaloide de (R)-1-bencilisoquinolina. En algunos casos, la célula huésped proviene de una cepa de levadura diseñada para producir una enzima de interés. En algunos casos, la célula huésped proviene de una cepa de levadura diseñada para producir una epimerasa. La epimerasa puede tener una oxidasa y una reductasa. Además, la epimerasa puede ser capaz de convertir un alcaloide de (S)-1-bencilisoquinolina en un alcaloide de (R)-1-bencilisoquinolina. Además, la epimerasa se puede separar en enzimas más pequeñas que retienen la actividad oxidasa o reductasa para usarse para convertir un alcaloide de (S)-1-bencilisoquinolina en un alcaloide de (R)-1-bencilisoquinolina.

[0022] Cualquiera de las células huésped descritas en los documentos US2008/0176754 y US2014/0273109 de Smolke et al. puede adaptarse para su uso en las células y métodos objeto. En ciertas formas de realización, las células de levadura pueden ser de la especie Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). En ciertas formas de realización, las células de levadura pueden ser de la especie Schizosaccharomyces pombe. En ciertas formas de realización, las células de levadura pueden ser de la especie Pichia pastoris. La levadura es de interés como célula huésped porque las proteínas del citocromo P450 pueden plegarse correctamente en la membrana del retículo endoplásmico para que se mantenga su actividad. En ejemplos, las proteínas del citocromo P450 están involucradas en algunas rutas biosintéticas de interés. En ejemplos adicionales, las proteínas del citocromo P450 están involucradas en la producción de BIA de interés. En otros ejemplos, las proteínas del citocromo P450 están implicadas en la producción de una enzima de interés, como una epimerasa que tiene una oxidasa y una reductasa.

[0023] Las cepas de levadura de interés que encuentran uso en la invención incluyen, pero no se limitan a CEN.PK (Genotipo: MATa/a ura3-52/ura3-52 trp1-289/trp1-289 leu2-3_112/leu2-3_112 his3 Al/his3A1 MAL2-8C/MAL2-8C SUC2/SUC2), S288C, W303, D273-10B, X2180, A364A, Z1278B, AB972, SK1 y FL100. En ciertos casos, la cepa de levadura es cualquiera de S288C (MATa; SUC2 mal mel gal2 CUP1 flo l flo8-1 haμl), BY4741 (MATa; his3A1; leu2A0; met15A0; ura3A0), BY4742 (MATa; his3A1; leu2A0; lys2A0; ura3A0), BY4743 (MATa/MATa; his3A1/his3A1; leu2A0/leu2A0; met15A0/MET15; LYS2/lys2A0; ura3A0/ura3A0), y WAT11 o W(R), derivados de la cepa W303-B (MATa; ade2-1; his3-11, -15; leu2-3,-112; ura3-1; canR; cyr+) que expresan la NADPH-P450 reductasa ATR1 de Arabidopsis thaliana y la NADPH-P450 reductasa CPR1 de levadura, respectivamente. En otra forma de realización, la célula de levadura es W303alpha (MATa; his3-11,15 trp1-1 leu2-3 ura3-1 ade2-1). La identidad y el genotipo de otras cepas de levadura de interés se pueden encontrar en EUROSCARF (web.unifrankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/col_index.htm1).

Modificaciones genéticas de las células huésped

[0024] Las células huésped pueden diseñarse para incluir una o más modificaciones (tales como dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, o incluso más modificaciones) que permiten la producción de BIA de interés. Adicional o alternativamente, las células huésped pueden modificarse para incluir una o más modificaciones (tales como dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, o incluso más modificaciones) que proporcionan la producción de enzimas de interés. En algunos casos, una modificación es una modificación genética, tal como una mutación, adición o eliminación de un gen o fragmento del mismo, o regulación de la transcripción de un gen o fragmento del mismo. Como se usa en el presente documento, el término "mutación" se refiere a una deleción, inserción o sustitución de un residuo de aminoácido o de nucleótido con respecto a una secuencia o motivo de referencia. La mutación puede incorporarse como una mutación dirigida al gen nativo en el locus original. En algunos casos, la mutación puede incorporarse como una copia adicional del gen introducido como una integración genética en un locus separado, o como una copia adicional en un vector episomal como 2|j o un plásmido centromérico. En ciertos casos, la copia de la enzima inhibida por el sustrato está bajo la regulación transcripcional de la célula nativa. En algunos casos, la copia inhibida por el sustrato de la enzima se introduce con regulación constitutiva o dinámica manipulada de la expresión de proteína colocándola bajo el control de un promotor sintético. En algunos ejemplos, el objeto de una o más modificaciones puede ser un gen nativo. En algunos ejemplos, el objeto de una o más modificaciones puede ser un gen no nativo. En algunos ejemplos, se puede insertar un gen no nativo en una célula huésped. En otros ejemplos, un gen no nativo puede alterarse mediante una o más modificaciones antes de insertarse en una célula huésped.

[0025] Una célula huésped manipulada puede sobreproducir uno o más BIA de interés. Por sobreproducción se entiende que la célula tiene una producción mejorada o aumentada de una molécula de BIA de interés en relación con una célula de control (p. ej., una célula no modificada). Por producción mejorada o aumentada se entiende tanto la producción de una cierta cantidad de BIA de interés donde el control no tiene producción de BIA de interés, así como un aumento de alrededor del 10 % o más, como alrededor del 20 % o más, alrededor del 30 % % o más, aproximadamente 40 % o más, aproximadamente 50 % o más, aproximadamente 60 % o más, aproximadamente 80 % o más, aproximadamente 100 % o más, como 2 veces o más, como 5 veces o más, incluso 10 veces o más en situaciones donde el control tiene algún BIA de producción de interés.

[0026] Una célula huésped manipulada puede producir en exceso uno o más alcaloides de (S)-1-bencilisoquinolina. En algunos casos, la célula huésped diseñada puede producir cierta cantidad del alcaloide de interés (S)-1-bencilisoquinolina donde el control no tiene producción de alcaloide de (S)-1-bencifisoquinolina, así como un aumento de alrededor del 10 % o más., como alrededor del 20 % o más, alrededor del 30 % o más, alrededor del 40 % o más, alrededor del 50 % o más, alrededor del 60 % o más, alrededor del 80 % o más, alrededor del 100 % o más, como 2 veces o más, tal como 5 veces o más, incluyendo 10 veces o más en situaciones en las que el control tiene algún alcaloide de (S)-1-bencifisoquinolina de producción de interés.

[0027] Una célula huésped manipulada puede además producir en exceso uno o más alcaloides de (R)-1-bencilisoquinolina. En algunos casos, la célula huésped diseñada puede producir cierta cantidad del alcaloide de interés (R)-1-bencilisoquinolina donde el control no tiene producción de alcaloide de (R)-1-bencifisoquinofina, así como un aumento de alrededor del 10 % o más., como alrededor del 20 % o más, alrededor del 30 % o más, alrededor del 40 % o más, alrededor del 50 % o más, alrededor del 60 % o más, alrededor del 80 % o más, alrededor del 100 % o más, como 2 veces o más, tal como 5 veces o más, incluyendo 10 veces o más en situaciones en las que el control tiene algún alcaloide de (R)-1-bencifisoquinolina de producción de interés. Una célula huésped manipulada puede además producir en exceso uno o más alcaloides de morfinano, protoberberina, noscapinoide y benzofenantridina.

[0028] En algunos casos, la célula huésped manipulada es capaz de producir una mayor cantidad de (R)-reticulina en relación con una célula huésped de control que carece de una o más modificaciones (p. ej., como se describe en este documento). En ciertos casos, la cantidad aumentada de (R)-reticulina es de alrededor del 10 % o más en relación con la célula huésped de control, como alrededor del 20 % o más, alrededor del 30 % o más, alrededor del 40 % o más, alrededor del 50 % o más. más, alrededor del 60 % o más, alrededor del 80 % o más, alrededor del 100 % o más, alrededor de 2 veces o más, alrededor de 5 veces o más, o incluso alrededor de 10 veces o más en relación con la célula huésped de control. En algunos casos, la (R)-reticulina es el producto de una reacción de epimerización dentro de una célula huésped manipulada. En estos casos, la (S)-reticulina puede ser el sustrato de la reacción de epimerización.

[0029] Además, una célula huésped manipulada puede sobreproducir una o más enzimas de interés. Por sobreproducción se entiende que la célula tiene una producción mejorada o aumentada de una enzima de interés en relación con una célula de control (p. ej., una célula no modificada). Por producción mejorada o aumentada se entiende tanto la producción de alguna cantidad de la enzima de interés donde el control no tiene producción, como un aumento de alrededor del 10 % o más, como alrededor del 20 % o más, alrededor del 30 % o más, alrededor del 40 % o más, alrededor del 50 % o más, alrededor del 60 % o más, alrededor del 80 % o más, alrededor del 100 % o más, como 2 veces o más, como 5 veces o más, incluyendo 10 veces o más en situaciones donde el control tiene alguna producción de enzima de interés.

[0030] Una célula huésped manipulada puede sobreproducir una o más enzimas CYP-COR. En algunos casos, la célula huésped diseñada puede producir cierta cantidad de enzima CYP-COR cuando el control no tiene producción de enzima CYP-COR, así como un aumento de alrededor del 10 % o más, como alrededor del 20 % o más, alrededor de 30 % o más, aproximadamente 40 % o más, aproximadamente 50 % o más, aproximadamente 60 % o más, aproximadamente 80 % o más, aproximadamente 100 % o más, como 2 veces o más, como 5 veces o más, incluso 10 veces o más en situaciones en las que el control tiene alguna producción de enzima CYP-COR.

[0031] Una célula huésped manipulada puede producir además en exceso una o más enzimas que se derivan de la enzima CYP-COR. En algunos casos, la célula huésped diseñada puede producir cierta cantidad de enzimas que se derivan de la enzima CYP-COR, donde el control no tiene producción de enzimas que se derivan de la enzima CYP-COR, así como un aumento de aproximadamente 10 % o más, como aproximadamente 20 % o más, aproximadamente 30 % o más, aproximadamente 40 % o más, aproximadamente 50 % o más, aproximadamente 60 % o más, aproximadamente 80 % o más, aproximadamente 100 % o más, tales como 2 veces o más, como 5 veces o más, incluso 10 veces o más en situaciones en las que el control tiene alguna producción de enzimas que se derivan de la enzima CYP-COR.

[0032] Además, una célula huésped manipulada puede producir en exceso uno o más alcaloides de bisbencilisoquinolina (bisBIA). En particular, una célula huésped manipulada es capaz de producir una mayor cantidad de alcaloides de bisbencilisoquinolina (bisBIA) en relación con una célula huésped de control que carece de una o más modificaciones (p. ej., como se describe en este documento). En ciertos casos, la cantidad aumentada de bisBIAs es de aproximadamente 10 % o más en relación con la célula huésped de control, como aproximadamente 20 % o más, aproximadamente 30 % o más, aproximadamente 40 % o más, aproximadamente 50 % o más, aproximadamente 60 % o más, aproximadamente 80 % o más, aproximadamente 100 % o más, aproximadamente 2 veces o más, aproximadamente 5 veces o más, o incluso aproximadamente 10 veces o más en relación con la célula huésped de control. En algunos casos, el bisBIA se forma a partir de al menos un monómero BIA que es el producto, o derivado del mismo, de una reacción de epimerización dentro de una célula huésped manipulada. Una célula huésped manipulada puede además producir en exceso uno o más de cefarantina, fangquinolina, liensinina, neferina, tubocurarina, dauricina, tetrandrina, curina, berbamunina, guattegaumerina, 2'-norberbamunina y berbamina.

[0033] En algunos casos, una o más modificaciones (tales como dos o más, tres o más, o cuatro o más) pueden seleccionarse entre: una mutación que alivia la inhibición del sustrato en un gen de enzima biosintética; una inhibición del producto que alivia la mutación en un gen de una enzima biosintética; un mecanismo promotor de la recuperación de cofactores; una inhibición por retroalimentación que alivia la mutación en un gen de una enzima biosintética; una modificación de modulación transcripcional de un gen de enzima biosintética; una mutación inactivante en un gen de enzima; una modificación de epimerización; una modificación generadora de bisBIA; y una secuencia codificante heteróloga que codifica una enzima. Una célula que incluye una o más modificaciones puede denominarse célula diseñada.

Mutaciones que alivian la inhibición del sustrato

[0034] En algunos casos, las células huésped manipuladas son células que incluyen una o más mutaciones que alivian la inhibición del sustrato (como dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, o incluso más) en uno o más genes de enzimas biosintéticas de la célula. En algunos ejemplos, uno o más genes de enzimas biosintéticas son nativos de la célula (p. ej., están presentes en una célula no modificada). En algunos ejemplos, uno o más genes de enzimas biosintéticas no son nativos de la célula. Como se usa en el presente documento, el término "mutación que alivia la inhibición del sustrato" se refiere a una mutación que alivia un mecanismo de control de la inhibición del sustrato de la célula.

[0035] Una mutación que alivia la inhibición del sustrato reduce la inhibición de una enzima regulada en la célula de interés en relación con una célula de control y proporciona un mayor nivel del compuesto regulado o un producto biosintético corriente abajo del mismo. En algunos casos, aliviar la inhibición de la enzima regulada significa que la CI⁵⁰ de inhibición aumenta 2 veces o más, por ejemplo 3 veces o más, 5 veces o más, 10 veces o más, 30 veces o más, 100 veces o más, 300 veces o más, 1000 veces o más, o incluso más. Por nivel aumentado se entiende un nivel que es el 110 % o más del compuesto regulado en una célula de control o un producto corriente abajo del mismo, como 120 % o más, 130 % o más, 140 % o más, 150 % o más, 160 % o más, 170 % o más, 180 % o más, 190 % o más, o 200 % o más, como al menos 3 veces o más, al menos 5 veces o más, al menos 10 veces o más o incluso más del compuesto regulado en la célula huésped manipulada o un producto corriente abajo de la misma.

[0036] Una variedad de mecanismos de control de la inhibición del sustrato y enzimas biosintéticas en la célula huésped manipulada que se dirigen a la regulación de los niveles de BIA de interés, o precursores de los mismos, pueden ser el objetivo para el alivio de la inhibición del sustrato. La célula huésped manipulada puede incluir una o más mutaciones que alivian la inhibición del sustrato en uno o más genes de enzimas biosintéticas. La una o más mutaciones pueden localizarse en cualquier gen de enzima biosintética conveniente donde la enzima biosintética está sujeta a control regulador. En algunas formas de realización, uno o más genes de enzimas biosintéticas codifican una o más enzimas tirosina hidroxilasa. En ciertos casos, la una o más mutaciones que alivian la inhibición del sustrato están presentes en un gen de enzima biosintética que es TyrH. En algunas formas de realización, la célula huésped modificada puede incluir una o más mutaciones que alivian la inhibición del sustrato en uno o más genes de enzimas biosintéticas, como uno de los genes descritos en la Tabla 2.

[0037] En ciertas formas de realización, la una o más mutaciones que alivian la inhibición del sustrato están presentes en el gen TyrH. El gen TyrH codifica la tirosina hidroxilasa, que es una enzima que convierte la tirosina en L-DOPA. Sin embargo, la TyrH es inhibida por su sustrato, la tirosina. La actividad de la tirosina hidroxilasa de los mamíferos, como la que se observa en humanos o ratas, se puede mejorar mediante mutaciones en el gen TyrH que alivian la inhibición del sustrato. En particular, la inhibición del sustrato de la tirosina puede aliviarse mediante una mutación puntual W166Y en el gen TyrH. La mutación puntual W166Y en el gen TyrH también puede mejorar la unión del cosustrato de tirosina hidroxilasa, BH⁴ , para catalizar la reacción de tirosina a L-DOPA. Los mutantes de TyrH, cuando se expresan en cepas de levadura para producir BIA a partir de azúcar (tales como los descritos en la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° de Serie 61/899.496) pueden mejorar significativamente la producción de BIA.

[0038] Puede utilizarse cualquier número y tipo conveniente de mutaciones para aliviar un mecanismo de control de la inhibición del sustrato. En ciertas formas de realización, las células huésped diseñadas pueden incluir 1 o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 11 o más, 12 o más, 13 o más, 14 o más, o incluso 15 o más mutaciones que alivian la inhibición del sustrato, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 inhibición del sustrato que alivia las mutaciones en uno o más genes de enzimas biosintéticas dentro de la célula huésped manipulada.

Mecanismos que promueven la recuperación de cofactores

[0039] En algunos casos, las células huésped modificadas genéticamente son células que incluyen uno o más mecanismos que promueven la recuperación de cofactores (tales como dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, o incluso más) en uno o más genes de enzimas biosintéticas de la célula. En algunos ejemplos, uno o más genes de enzimas biosintéticas son nativos de la célula (p. ej., están presentes en una célula no modificada). En algunos ejemplos, uno o más genes de enzimas biosintéticas no son nativos de la célula. Como se usa en este documento, el término "mecanismo de promoción de la recuperación de cofactores" se refiere a un mecanismo que promueve un mecanismo de cofactor de control de recuperación de la célula.

[0040] Una variedad de mecanismos de control de recuperación de cofactores y enzimas biosintéticas en la célula huésped manipulada que están dirigidas a la regulación de los niveles de BIA de interés, o precursores de los mismos, pueden ser el objetivo de la promoción de la recuperación de cofactores. La célula huésped manipulada puede incluir uno o más mecanismos promotores de la recuperación de cofactores en uno o más genes de enzimas biosintéticas. En ejemplos, la célula huésped diseñada puede incluir una secuencia codificante heteróloga que codifica la dihidrofolato reductasa (DHFR). Cuando se expresa DHFR, puede convertir 7,8-dihidrobiopterina (BH² ) en tetrahidrobiopterina (BH⁴), recuperando así BH⁴ como un cosustrato de TyrH. En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede incluir uno o más mecanismos de promoción de la recuperación de cofactores en uno o más genes de enzimas biosintéticas, como uno de los genes descritos en la Tabla 2.

[0041] Se puede utilizar cualquier número y tipo conveniente de mecanismos para promover un mecanismo de control de recuperación de cofactores. En ciertas formas de realización, las células huésped diseñadas pueden incluir 1 o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 11 o más, 12 o más, 13 o más, 14 o más, o incluso 15 o más mecanismos de promoción de la recuperación de cofactores como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 mecanismos que promueven la recuperación de cofactores en uno o más genes de enzimas biosintéticas dentro de la célula huésped manipulada.

Mutaciones que alivian la inhibición del producto

[0042] En algunos casos, las células huésped manipuladas son células que incluyen una o más mutaciones que alivian la inhibición del producto (como dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, o incluso más) en uno o más genes de enzimas biosintéticas de la célula. En algunos ejemplos, uno o más genes de enzimas biosintéticas son nativos de la célula (p. ej., están presentes en una célula no modificada). En algunos ejemplos, uno o más genes de enzimas biosintéticas no son nativos de la célula. Como se usa en el presente documento, el término "mutación que alivia la inhibición del producto" se refiere a una mutación que alivia un mecanismo de control de la inhibición del producto a corto y/o largo plazo de una célula huésped manipulada. La inhibición del producto a corto plazo es un mecanismo de control de la célula en el que existe una unión competitiva en un sitio de unión del cosustrato. La inhibición del producto a largo plazo es un mecanismo de control de la célula en el que existe una unión irreversible de un compuesto fuera de la vía deseada.

[0043] Una mutación que alivia la inhibición del producto reduce la inhibición de una enzima regulada en la célula de interés en relación con una célula de control y proporciona un mayor nivel del compuesto regulado o un producto biosintético corriente abajo del mismo. En algunos casos, aliviar la inhibición de la enzima regulada significa que la CI⁵⁰ de inhibición aumenta 2 veces o más, por ejemplo 3 veces o más, 5 veces o más, 10 veces o más, 30 veces o más, 100 veces o más, 300 veces o más, 1000 veces o más, o incluso más. Por nivel aumentado se entiende un nivel que es el 110 % o más del compuesto regulado en una célula de control o un producto corriente abajo del mismo, como 120 % o más, 130 % o más, 140 % o más, 150 % o más, 160 % o más, 170 % o más, 180 % o más, 190 % o más, o 200 % o más, como al menos 3 veces o más, al menos 5 veces o más, al menos 10 veces o más o incluso más del compuesto regulado en la célula huésped manipulada o un producto corriente abajo de la misma.

[0044] Una variedad de mecanismos de control de la inhibición del producto y enzimas biosintéticas en la célula huésped manipulada que están dirigidas a la regulación de los niveles de BIA de interés pueden ser objeto de alivio de la inhibición del producto. La célula huésped manipulada puede incluir uno o más productos que alivian la inhibición de las mutaciones en uno o más genes de enzimas biosintéticas. La mutación puede localizarse en cualquier gen de enzima biosintética conveniente en el que la enzima biosintética esté sujeta a control regulador. En algunas formas de realización, uno o más genes de enzimas biosintéticas codifican una o más enzimas tirosina hidroxilasa. En ciertos casos, una o más mutaciones que alivian la inhibición del producto están presentes en un gen de enzima biosintética que es TyrH. En algunas formas de realización, la célula huésped modificada incluye una o más mutaciones que alivian la inhibición del producto en uno o más genes de enzimas biosintéticas, como uno de los genes descritos en la Tabla 2.

[0045] En ciertas formas de realización, la una o más mutaciones que alivian la inhibición del producto son presentes en el gen TyrH. El gen TyrH codifica la tirosina hidroxilasa, que es una enzima que convierte la tirosina en L-DOPA. TyrH requiere tetrahidrobiopterina (BH⁴) como cosustrato para catalizar la reacción de hidroxilación. Algunas cepas microbianas, como Saccharomyces cerevisiae, no producen BH⁴ de forma natural, pero se pueden diseñar para producir este sustrato a través de una ruta de síntesis y reciclaje de cuatro enzimas, como se ilustra en la FIG. 1. FIG. 1 ilustra ejemplos de rutas de síntesis, reciclaje y recuperación de tetrahidrobiopterina, de acuerdo con formas de realización de la invención. FIG. 1 proporciona el uso de las enzimas PTPS, piruvoil tetrahidropterina sintasa; SepR, sepiapterina reductasa; PCD, pterina 4a-carbinolamina deshidratasa; QDHPR, dihidropteridina reductasa; y DHFr , dihidrofolato reductasa. De las enzimas que se ilustran en la FIG. 1, la levadura sintetiza una GTP ciclohidrolasa I endógena. El GTP y el trifosfato de dihidroneopterina se sintetizan naturalmente en la levadura. Además, otros metabolitos en la FIG. 1 no se producen naturalmente en la levadura.

[0046] La TyrH es inhibida por su producto L-DOPA, así como por otras catecolaminas, particularmente la dopamina. La actividad de la tirosina hidroxilasa de mamíferos, como la de humanos o ratas, se puede mejorar a través de mutaciones que alivian la inhibición del producto. Por ejemplo, la inhibición del producto a corto plazo, como la unión competitiva en el sitio de unión del cosustrato, puede aliviarse mediante una mutación puntual W166Y en el gen TyrH. En particular, la mutación puntual W166Y en el gen TyrH puede mejorar la unión del cosustrato. Además, la inhibición del producto a corto plazo para aliviar la unión competitiva en el sitio de unión del cosustrato puede mejorarse mediante una mutación puntual S40D en el gen TyrH. La inhibición del producto a corto plazo también puede mejorarse mediante mutaciones conjuntas de R37E, R38E en el gen TyrH. En particular, las mutaciones R37E, R38E juntas pueden mejorar específicamente la actividad de la tirosina hidroxilasa en presencia de dopamina.

[0047] Además, la inhibición del producto a largo plazo puede aliviarse mediante mutaciones puntuales en el gen TyrH. El alivio de la inhibición del producto a largo plazo puede incluir la unión irreversible de la catecolamina al hierro en el sitio activo, de modo que haya menos catecolamina presente para actuar como producto inhibidor de la actividad de la tirosina hidroxilasa. La inhibición del producto a largo plazo puede aliviarse mediante las mutaciones E332D y Y371F, respectivamente, en el gen TyrH.

[0048] Se pueden hacer combinaciones de las mutaciones (tales como dos o tres o más mutaciones a la vez) para aliviar múltiples tipos de sustrato e inhibición del producto para mejorar aún más la actividad de TyrH. Los mutantes de TyrH, cuando se expresan en cepas de levadura para producir BIA a partir de azúcar (tales como los descritos en la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° de Serie 61/899.496) pueden mejorar significativamente la producción de BIA.

[0049] Puede utilizarse cualquier número y tipo conveniente de mutaciones para aliviar un mecanismo de control de inhibición del producto. En ciertas formas de realización, las células huésped diseñadas pueden incluir 1 o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 11 o más, 12 o más, 13 o más, 14 o más, o incluso 15 o más mutaciones que alivian la inhibición del producto, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 productos de inhibición que alivian las mutaciones en uno o más genes de enzimas biosintéticas dentro de la célula huésped manipulada.

Mutaciones que alivian la inhibición por retroalimentación

[0050] En algunos casos, las células huésped manipuladas son células que incluyen una o más mutaciones que alivian la inhibición por retroalimentación (tales como dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, o incluso más) en uno o más genes de enzimas biosintéticas de la célula. En algunos casos, uno o más genes de enzimas biosintéticas son nativos de la célula (p. ej., están presentes en una célula no modificada). Adicionalmente o alternativamente, en algunos ejemplos uno o más genes de enzimas biosintéticas no son nativos de la célula. Como se usa en el presente documento, el término "mutación que alivia la inhibición por retroalimentación" se refiere a una mutación que alivia un mecanismo de control de la inhibición por retroalimentación de una célula huésped manipulada. La inhibición por retroalimentación es un mecanismo de control de la célula en el que se inhibe una enzima en la vía sintética de un compuesto regulado cuando ese compuesto se ha acumulado hasta cierto nivel, equilibrando así la cantidad del compuesto en la célula. Una mutación que alivia la inhibición por retroalimentación reduce la inhibición de una enzima regulada en la célula huésped manipulada en relación con una célula de control. De esta manera, la célula huésped diseñada proporciona un mayor nivel del compuesto regulado o un producto biosintético corriente abajo del mismo. En algunos casos, aliviar la inhibición de la enzima regulada significa que la CI⁵⁰ de inhibición aumenta 2 veces o más, por ejemplo 3 veces o más, 5 veces o más, 10 veces o más, 30 veces o más, 100 veces o más, 300 veces o más, 1000 veces o más, o incluso más. Por nivel aumentado se entiende un nivel que es el 110 % o más del compuesto regulado en una célula de control o un producto corriente abajo del mismo, como 120 % o más, 130 % o más, 140 % o más, 150 % o más, 160 % o más, 170 % o más, 180 % o más, 190 % o más, o 200 % o más, como al menos 3 veces o más, al menos 5 veces o más, al menos 10 veces o más o incluso más del compuesto regulado en la célula huésped o un producto corriente abajo del mismo.

[0051] Una variedad de mecanismos de control de inhibición por retroalimentación y enzimas biosintéticas que están dirigidas a la regulación de los niveles de BIA de interés pueden ser objeto de alivio en la célula huésped. La célula huésped puede incluir una o más mutaciones que alivian la inhibición por retroalimentación en uno o más genes de enzimas biosintéticas nativos de la célula. La una o más mutaciones pueden localizarse en cualquier gen de enzima biosintética conveniente donde la enzima biosintética está sujeta a control regulador. En algunas formas de realización, uno o más genes de enzimas biosintéticas pueden codificar una o más enzimas seleccionadas de una 3-desoxi-darabinosa-heptulosonato-7-fosfato (DAHP) sintasa y una corismato mutasa. En algunas formas de realización, uno o más genes de enzimas biosintéticas codifican una 3-desoxi-d-arabinosa-heptulosonato-7-fosfato (DAHP) sintasa. En algunos casos, uno o más genes de enzimas biosintéticas pueden codificar una corismato mutasa. En ciertos casos, la una o más mutaciones que alivian la inhibición por retroalimentación pueden estar presentes en un gen de enzima biosintética seleccionado de ARO₄ y ARO7. En ciertos casos, una o más mutaciones que alivian la inhibición por retroalimentación pueden estar presentes en un gen de enzima biosintética que es ARO₄. En ciertos casos, una o más mutaciones que alivian la inhibición por retroalimentación están presentes en un gen de enzima biosintética que es ARO7. En algunas formas de realización, la célula huésped diseñada puede incluir una o más mutaciones que alivian la inhibición de la retroalimentación en uno o más genes de enzimas biosintéticas, como uno de los genes descritos en la Tabla 2.

[0052] Se puede utilizar cualquier número y tipo conveniente de mutaciones para aliviar un mecanismo de control de inhibición por retroalimentación. Como se usa en el presente documento, el término "mutación" se refiere a una deleción, inserción o sustitución de un residuo de aminoácido o de nucleótido con respecto a una secuencia o motivo de referencia. La mutación puede incorporarse como una mutación dirigida al gen nativo en el locus original. En algunos casos, la mutación puede incorporarse como una copia adicional del gen introducido como una integración genética en un locus separado, o como una copia adicional en un vector episomal como un plásmido centromérico o de 2|j o plásmido centromérico. En ciertos casos, la copia inhibida por retroalimentación de la enzima está bajo la regulación transcripcional de la célula nativa. En algunos casos, la copia inhibida por retroalimentación de la enzima se introduce con regulación constitutiva o dinámica diseñada de la expresión de la proteína colocándola bajo el control de un promotor sintético.

[0053] En ciertas formas de realización, la una o más mutaciones que alivian la inhibición por retroalimentación pueden estar presentes en el gen ARO₄. Las mutaciones de ARO₄ de interés pueden incluir, entre otras, la sustitución del residuo de lisina en la posición 229 con una leucina, una sustitución del residuo de glutamina en la posición 166 con un residuo de lisina o una mutación como la descrita por Hartmann M, et al. ((2003) Proc Natl Acad Sci EE. UU. 100(3):862-867) o Fukuda et al. ((1992) J Ferment Bioeng 74(2):117-119). En algunos casos, las mutaciones para conferir inhibición por retroalimentación pueden seleccionarse de una biblioteca mutagenizada de enzimas mutantes. Los ejemplos de dichas selecciones pueden incluir el rescate del crecimiento de o-fluoro-D,L-fenilalanina o el crecimiento de cepas de levadura mutantes aro3 en medios con exceso de tirosina como describen Fukuda et al. ((1990) Breeding of Brewing Yeast Producing a Large Amount of Beta-Phenylethyl Alcohol and Beta-Phenylethyl Acetate. Agr Biol Chem Tokyo 54(1):269-271).

[0054] En ciertas formas de realización, las células huésped diseñadas pueden incluir 1 o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 11 o más, 12 o más, 13 o más, 14 o más, o incluso 15 o más mutaciones que alivian la inhibición por retroalimentación, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 inhibición por retroalimentación que alivia las mutaciones en uno o más genes de enzimas biosintéticas dentro de la célula huésped manipulada.

Modificaciones de modulación transcripcional

[0055] Las células huésped pueden incluir una o más modificaciones de modulación transcripcional (tales como dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, o incluso más modificaciones) de uno o más genes de enzimas biosintéticas de la celúla. En algunos ejemplos, uno o más genes de enzimas biosintéticas son nativos de la célula. En algunos ejemplos, uno o más genes de enzimas biosintéticas no son nativos de la célula. Cualquier gen de enzima biosintética conveniente de la célula puede ser el objetivo de la modulación de la transcripción. Por modulación de la transcripción se entiende que la expresión de un gen de interés en una célula modificada se modula, por ejemplo, aumenta o disminuye, se potencia o se reprime, en relación con una célula de control (por ejemplo, una célula no modificada). En algunos casos, la modulación transcripcional del gen de interés incluye aumentar o potenciar la expresión. Por aumento o mejora de la expresión se entiende que el nivel de expresión del gen de interés aumenta 2 veces o más, como 5 veces o más y, a veces, 25, 50 o 100 veces o más y en ciertas formas de realización 300 veces o más o más, en comparación con un control, es decir, la expresión en la misma célula no modificada (por ejemplo, mediante el uso de cualquier ensayo de expresión génica conveniente). Alternativamente, en los casos en los que la expresión del gen de interés en una célula es tan baja que es indetectable, se considera que el nivel de expresión del gen de interés aumenta si la expresión aumenta hasta un nivel que es fácilmente detectable. En ciertos casos, la modulación transcripcional del gen de interés incluye disminuir o reprimir la expresión. Por disminución o represión de la expresión se entiende que el nivel de expresión del gen de interés se reduce en 2 veces o más, como 5 veces o más y, a veces, en 25, 50 o 100 veces o más y en ciertas formas de realización 300 veces o más o más, en comparación con un control. En algunos casos, la expresión se reduce a un nivel que es indetectable. Las modificaciones de los procesos de la célula huésped de interés que pueden adaptarse para su uso en las células huésped objeto se describen en la publicación de EE. UU. N.° 20140273109 (14/211,611) de Smolke et al.

[0056] Cualquier gen de enzima biosintética conveniente puede modularse transcripcionalmente e incluye, pero no se limita a aquellas enzimas biosintéticas descritas en la FIG. 2. En particular, la FIG. 2 ilustra un esquema biosintético para la conversión de glucosa en 4-HPA, dopamina y 3,4-DHPA, de acuerdo con formas de realización de la invención. Ejemplos de enzimas descritas en la FIG. 2 incluyen ARO₃, ARO₄, ARO1, ARO7, TYR1, TYR, TyrH, DODC, MAO, ARO10, ARO9 y TKL. En algunos casos, uno o más genes de enzimas biosintéticas pueden seleccionarse de ARO10, ARO9 y TKL. En algunos casos, uno o más genes de enzimas biosintéticas pueden ser ARO10. En ciertos casos, uno o más genes de enzimas biosintéticas pueden ser ARO9. En algunas formas de realización, uno o más genes de enzimas biosintéticas pueden ser TKL. En algunas formas de realización, la célula huésped incluye una o más modificaciones de modulación transcripcional a uno o más genes, como uno de los genes descritos en la Tabla 2.

[0057] En algunas formas de realización, la modificación de modulación transcripcional puede incluir una sustitución de un promotor fuerte por un promotor nativo de uno o más genes de enzimas biosintéticas o la expresión de una copia o copias adicionales del gen o genes bajo el control de un promotor fuerte. Los promotores que dirigen la expresión de los genes de interés pueden ser promotores constitutivos o promotores inducibles, siempre que los promotores puedan estar activos en las células huésped. Los genes de interés pueden expresarse a partir de sus promotores nativos. Adicional o alternativamente, los genes de interés pueden expresarse a partir de promotores no nativos. Aunque no es un requisito, tales promotores pueden tener una fuerza de media a alta en el huésped en el que se usan. Los promotores pueden ser regulados o constitutivos. En algunas formas de realización, pueden usarse promotores que no están reprimidos por la glucosa, o que están reprimidos sólo levemente por la presencia de glucosa en el medio de cultivo. Existen numerosos promotores adecuados, ejemplos de los cuales incluyen promotores de genes glicolíticos tales como el promotor del gen tsr de B. subtilis (que codifica la fructosa bifosfato aldolasa) o el promotor GAPDH de la levadura S. cerevisiae (que codifica para gliceraldehído-fosfato deshidrogenasa) (Bitter GA, Meth. Enzymol. 152:673 684 (1987)). Otros promotores fuertes de interés incluyen, pero no se limitan a el promotor ADHI de la levadura de panadería (Ruohonen L., et al, J. Biotechnol.

39:193203 (1995)), los promotores inducidos por falta de fosfato tales como el PHOS promotor de levadura (Hinnen, A., et al, en Yeast Genetic Engineering, Barr, PJ, et al. eds, Butterworths (1989), el promotor de la fosfatasa alcalina de B. licheniformis (Lee. JWK, et al., J. Gen. Microbiol. 137:1127 1133 (1991)), GPD1 y TEF1. Los promotores de levadura incluyen, entre otros, promotores inducibles tales como Gal1-10, Gal1, GalL, GalS, promotor reprimible Met25, tetO y promotores constitutivos tales como el promotor de la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GPD), el promotor de la alcohol deshidrogenasa (ADH), el promotor del factor 1 -alfa de elongación de la traducción (TEF), el promotor de la citocromo c-oxidasa (CYC1), el promotor de MRP7, etc. En algunos casos, el fuerte promotor es GPD1. En ciertos casos, el promotor fuerte es TEF1. Los vectores de expresión de levadura de replicación autónoma que contienen promotores inducibles por hormonas tales como glucocorticoides, esteroides y hormonas tiroideas también se conocen e incluyen, pero no se limitan a el elemento sensible a glucorticoides (GRE) y el elemento sensible a hormonas tiroideas (t Re ), véase, por ejemplo, aquellos promotores descritos en la Patente de EE. UU. N° 7.045.290. Pueden usarse vectores que contengan promotores constitutivos o inducibles tales como factor alfa, alcohol oxidasa y PGH. Además, cualquier combinación de promotor/potenciador (según la base de datos de promotores eucariotas EPDB) también podría usarse para impulsar la expresión de genes de interés. Se entiende que puede seleccionarse cualquier promotor conveniente específico para la célula huésped, p. ej., E. coli. En algunos casos, la selección de promotores puede usarse para optimizar la transcripción y, por lo tanto, los niveles de enzima para maximizar la producción mientras se minimizan los recursos energéticos.

Mutaciones de inactivación

[0058] Las células huésped manipuladas pueden incluir una o más mutaciones de inactivación en una enzima de la célula (como dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, o incluso más). La inclusión de una o más mutaciones inactivantes puede modificar el flujo de una vía sintética de una célula huésped manipulada para aumentar los niveles de una BIA de interés o una enzima o precursor deseable que conduzca a la misma. En algunos ejemplos, la una o más mutaciones inactivantes son para una enzima nativa de la célula. Adicional o alternativamente, la una o más mutaciones inactivantes son para una enzima no nativa de la célula. Como se usa en el presente documento, mutación inactivante significa una o más mutaciones en un gen o secuencia de ADN reguladora de la célula, donde la(s) mutación(es) inactiva(n) una actividad biológica de la proteína expresada por ese gen de interés. En algunos casos, el gen es nativo de la célula. En algunos casos, el gen codifica una enzima que está inactivada y forma parte de la vía sintética de un BIA de interés producido por la célula huésped o está conectada a ella. En algunos casos, una mutación inactivadora se localiza en una secuencia de ADN reguladora que controla un gen de interés. En ciertos casos, la mutación inactivadora es para un promotor de un gen. Puede utilizarse cualquier mutación conveniente (p. ej., como se describe en el presente documento) para inactivar un gen o una secuencia de ADN reguladora de interés. Por "inactivado" o "inactiva" se entiende que la actividad biológica de la proteína expresada por el gen mutado se reduce en un 10 % o más, como en un 20 % o más, un 30 % o más, un 40 % o más, un 50 % o más, 60 % o más, 70 % o más, 80 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 97 % o más, o 99 % o más, en relación con una proteína de control expresada por una proteína no mutada gen de control. En algunos casos, la proteína es una enzima y la mutación inactivadora reduce la actividad de la enzima.

[0059] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada incluye una mutación inactivante en una enzima nativa de la célula. Cualquier enzima conveniente puede ser objeto de inactivación. Las enzimas de interés pueden incluir, pero no se limitan a aquellas enzimas descritas en la Tabla 2 cuya acción en la vía sintética de la célula huésped manipulada tiende a reducir los niveles de una BIA de interés. En algunos casos, la enzima tiene actividad glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. En determinadas formas de realización, la enzima que incluye una mutación inactivadora es ZWF1. En algunos casos, la enzima tiene actividad de alcohol deshidrogenasa. En algunas formas de realización, la enzima que incluye una mutación inactivadora se selecciona de ADH₂, ADH3, ADH4, ADH5, ADH6, ADH7 y SFA1. En determinadas formas de realización, la enzima que incluye una o varias mutaciones inactivadoras es ADH₂. En determinadas formas de realización, la enzima que incluye una o varias mutaciones inactivadoras es ADH3. En determinadas formas de realización, la enzima que incluye una o varias mutaciones inactivadoras es ADH4. En determinadas formas de realización, la enzima que incluye una o varias mutaciones inactivadoras es ADH5. En determinadas formas de realización, la enzima que incluye una o varias mutaciones inactivadoras es ADH6. En determinadas formas de realización, la enzima que incluye una o varias mutaciones inactivadoras es ADH7. En algunos casos, la enzima tiene actividad de aldehído oxidorreductasa. En ciertas formas de realización, la enzima que incluye una mutación inactivadora se selecciona de ALD2, ALD3, ALD4, ALD5 y ALD6. En determinadas formas de realización, la enzima que incluye una o varias mutaciones inactivadoras es ALD2. En determinadas formas de realización, la enzima que incluye una o varias mutaciones inactivadoras es ALD3. En determinadas formas de realización, la enzima que incluye una o varias mutaciones inactivadoras es ALD4. En determinadas formas de realización, la enzima que incluye una o varias mutaciones inactivadoras es ALD5. En determinadas formas de realización, la enzima que incluye una o varias mutaciones inactivadoras es ALD6. En algunas formas de realización, la célula huésped incluye una o más mutaciones inactivantes de uno o más genes descritos en la Tabla 2.

Modificaciones de la epimerización

[0060] Algunos métodos, procesos y sistemas proporcionados en el presente documento describen la conversión de alcaloides de (S)-1-bencilisoquinolina en alcaloides de (R)-1-bencilisoquinolina. Algunos de estos métodos, procesos y sistemas pueden comprender una célula huésped diseñada. En algunos ejemplos, la conversión de alcaloides de (S)-1-bencilisoquinolina en alcaloides de (R)-1-bencilisoquinolina es un paso clave en la conversión de un sustrato en una amplia gama de alcaloides. En algunos ejemplos, la conversión de alcaloides de f'S)-1-bencilisoquinolina en alcaloides de (R)-1-bencilisoquinolina comprende una reacción de epimerización. En algunos casos, la epimerización de un alcaloide de sustrato se puede realizar oxidando un (S)-sustrato a la base correspondiente de Schiff o intermedio de imina, luego reduciendo estereoespecíficamente este intermedio a un producto (R) como se proporciona en la FIG. 3 y como se representa en general en el Esquema 1. Como se proporciona en el Esquema 1, Rⁱ , R², R³ y R⁴ pueden ser H o CH³. R⁵ puede ser H, OH u OCH³.

[0061] En algunos ejemplos, la conversión del sustrato (S) en el producto (R) puede implicar al menos una reacción de oxidación y al menos una reacción de reducción. En algunos casos, una reacción de oxidación es seguida opcionalmente por una reacción de reducción. En algunos casos, al menos una de las reacciones de oxidación y reducción se lleva a cabo en presencia de una enzima. En algunos casos, al menos una de las reacciones de oxidación y reducción es catalizada por una enzima. En algunos casos, las reacciones de oxidación y reducción se llevan a cabo en presencia de al menos una enzima. En algunos casos, al menos una enzima es útil para catalizar las reacciones de oxidación y reducción. Las reacciones de oxidación y reducción pueden ser catalizadas por la misma enzima.

[0062] En algunos métodos, procesos y sistemas descritos en el presente documento, se puede realizar una reacción de oxidación en presencia de una enzima. En algunos ejemplos, la enzima puede ser una oxidasa. La oxidasa puede usar una (S)-l-bencilisoquinolina como sustrato. La oxidasa puede convertir el sustrato (S) en una imina o derivado de base de Schiff correspondiente. La oxidasa puede denominarse 1,2-deshidroreticulina sintasa (DRS). Los ejemplos no limitantes de enzimas adecuadas para la oxidación de alcaloides de (S)-l-bencilisoquinolina en esta descripción incluyen una oxidasa de citocromo P450, una oxidasa dependiente de 2-oxoglutarato y una flavoproteína oxidasa. Por ejemplo, la (S)-tetrahidroprotoberberina oxidasa (STOX, EC 1.3.3.8) puede oxidar la (S)-norreticulina y otros (S)-l-bencilisoquinolina alcaloides a 1,2-deshidronorreticulina y otros productos 1,2-deshidro correspondientes. En algunos ejemplos, una proteína que comprende un dominio oxidasa de cualquiera de los ejemplos anteriores puede realizar la oxidación. En algunos ejemplos, la oxidasa puede catalizar la reacción de oxidación dentro de una célula huésped, tal como una célula huésped manipulada, como se describe en este documento.

[0063] En algunos ejemplos, una reacción de reducción puede seguir a la reacción de oxidación. La reacción de reducción puede ser realizada por una enzima. En algunos ejemplos, la reductasa puede usar una imina o una base de Schiff derivada de una 1-bencilisoquinolina como sustrato. La reductasa puede convertir la imina o el derivado de la base de Schiff en una (R)-l-bencilisoquinolina. La reductasa puede denominarse 1,2-deshidroreticulina reductasa (DRR). Los ejemplos no limitativos de enzimas adecuadas para la reducción de una imina o base de Schiff derivada de un alcaloide de (S)-l-bencilisoquinolina incluyen una aldo-ceto reductasa (p. ej., una enzima similar a la codeinona reductasa (EC 1.1.1.247)) y una deshidrogenasa de cadena corta (p. ej., una enzima similar a la salutaridina reductasa (EC 1.1.1.248)). En algunos ejemplos, una proteína que comprende un dominio reductasa de cualquiera de los ejemplos anteriores puede realizar la reducción. En otra forma de realización, la reducción es estereoespecífica. En algunos ejemplos, la reductasa puede catalizar la reacción de reducción dentro de una célula huésped, tal como una célula huésped manipulada, como se describe en el presente documento.

[0064] Un ejemplo de una enzima que puede realizar una reacción de epimerización que convierte alcaloides de (S)-1-bencilisoquinolina en alcaloides de (R)-1-bencilisoquinolina incluye una epimerasa que tiene un dominio oxidasa y un dominio reductasa. En particular, la epimerasa puede tener un dominio similar al citocromo P450 oxidasa 82Y2. Además, la epimerasa puede tener un dominio similar a la codeinona reductasa. Además, una epimerasa que tiene un dominio similar a 82Y2 de citocromo P450 oxidasa y que también tiene un dominio similar a codeinona reductasa puede denominarse enzima CYP-COR. En particular, una enzima CYP-COR puede ser una enzima de fusión.

[0065] Un ejemplo de una secuencia de aminoácidos de una enzima CYP-COR que puede usarse para realizar la conversión de alcaloides de (S)-l-bencilisoquinofina a alcaloides de (R)-l-bencilisoquinolina se proporciona en la FIG. 4. En particular, la FIG. 4 ilustra una secuencia de aminoácidos de una enzima CYP-COR, de acuerdo con formas de realización de la invención. Como se ve en la FIG.4 , el texto subrayado indica el dominio similar a CYP82Y2 del citocromo P450 (59 % de identidad con AFB74617.1). El texto subrayado con puntos indica el dominio similar a la codeinona reductasa dependiente de NADPH de aldo-ceto reductasa (75 % de identidad con ACM44066.1). En la Tabla 1 se exponen secuencias de aminoácidos adicionales de una enzima CYP-COR. Una secuencia de aminoácidos para una epimerasa que se utiliza para convertir un alcaloide de (S)-1-bencifisoquinolina en un alcaloide de (R)-1-bencilisoquinofina es 75 % o más idéntica a una secuencia de aminoácidos dada como se indica en la Tabla 1. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos para tal epimerasa puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 % o más, 81 % o más, 82 % o más, 83 % o más, 84 % o más, 85 % o más, 86 % o más, 87 % o más, 88 % o más, 89 % o más, 90 % o más, 91 % o más, 92 % o más, 93 % o más, 94 % o más, 95 % o más, 96 % o más, 97 % o más, 98 % o más, o 99 % o más idéntica a una secuencia de aminoácidos como se proporciona en este documento. Además, en ciertas formas de realización, una secuencia de aminoácidos "idéntica" contiene al menos 80 %-99 % de identidad a nivel de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos específica. En algunos casos, una secuencia de aminoácidos "idéntica" contiene al menos aproximadamente 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % y más en ciertos casos, en al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad, a nivel de aminoácidos. En algunos casos, la secuencia de aminoácidos puede ser idéntica pero la secuencia de ADN está alterada para optimizar el uso de codones para el organismo huésped, por ejemplo.

[0066] Se puede proporcionar una célula huésped manipulada que produzca una epimerasa que convierta el alcaloide de (S)-1-bencilisoquinolina en alcaloide de (R)-1-bencilisoquinolina, en el que la epimerasa comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 15. La epimerasa que se produce dentro de la célula huésped diseñada puede recuperarse y purificarse para como para formar un biocatalizador. En algunos casos, la epimerasa se puede dividir en una o más enzimas. Además, una o más enzimas que se producen al dividir la epimerasa pueden recuperarse de la célula huésped manipulada. Estas una o más enzimas que resultan de dividir la epimerasa también se pueden usar para catalizar la conversión de alcaloides de (S)-1-bencilisoquinofina en alcaloides de (R)-1-bencilisoquinolina. En particular, la una o más enzimas que se recuperan de la célula huésped manipulada que produce la epimerasa pueden usarse en un proceso para convertir un alcaloide de (S)-1-bencifisoquinofina en un alcaloide de (R)-1-bencilisoquinolina. El proceso puede incluir poner en contacto el alcaloide de (S)-1-bencilisoquinolina con una epimerasa en una cantidad suficiente para convertir dicho alcaloide de (S)-1-bencilisoquinolina en alcaloide de (R)-1-bencilisoquinofina. El alcaloide de (S)-1-bencilisoquinolina se pone en contacto con una cantidad suficiente de una o más enzimas de modo que al menos el 5 % de dicho alcaloide de (S)-1-bencilisoquinofina se convierte en alcaloide de (R)-1-bencilisoquinofina. En otros ejemplos, el alcaloide de (S)-1-bencifisoquinofina puede ponerse en contacto con una cantidad suficiente de una o más enzimas de manera que al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 82 %, al menos 84 %, al menos 86 %, al menos 88 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos El 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, al menos el 99,5 %, al menos el 99,7 % o el 100 % de dicho alcaloide de (S)-1-bencilisoquinolina se convierte en alcaloide de (R)-1-bencilisoquinolina.

[0067] La una o más enzimas que pueden usarse para convertir un alcaloide de (S)-1-bencifisoquinofina en un alcaloide de (R)-1-bencilisoquinolina pueden ponerse en contacto con el alcaloide de (S)-1-bencilisoquinolina in vivo.

[0068] En algunos ejemplos, los métodos proporcionan células huésped manipuladas que producen un producto alcaloide, donde la epimerización de un sustrato (S) a un producto (R) puede comprender un paso clave en la producción de un producto alcaloide. En algunos ejemplos, el alcaloide producido es un alcaloide de (R)-1-bencilisoquinofina. En aún otras formas de realización, el alcaloide producido se deriva de un alcaloide de (R)-1-bencifisoquinolina, que incluye, por ejemplo, alcaloides de promorfinano de 4 anillos y de morfinano de 5 anillos. El alcaloide de (S)-1-bencilisoquinolina es un intermediario hacia el producto de la célula huésped manipulada. En aún otras formas de realización, el producto alcaloide se selecciona del grupo que consiste en alcaloides de morfinano, protoberberina, noscapinoide y benzofenantridina.

[0069] En algunos ejemplos, el sustrato (S) es un alcaloide de (S)-1-bencilisoquinolina seleccionado del grupo que consiste en (S)-norreticulina, (S)-reticulina, (S)-tetrahidropapaverina, (S)-norcoclaurina, (S)-coclaurina, (S)-N-metilcoclaurina, (S)-3'-hidroxi-N-metilcoclaurina, (S)-norisoorientalina, (S)-orientalina, (S)-isoorientalina, (S)-norprotosinomenina, (S)-protosinomenina, (S)-norlaudanosolina, (S)-laudanosolina, (S)-4'-O-metillaudanosolina, (S)-6-O-metilnorlaudanosolina, (S)-4'-O-metilnorlaudanosolina.

[0070] En algunos ejemplos, el sustrato (S) es un compuesto de fórmula I:

o una de sus sales, en la que:

R1, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente entre hidrógeno y metilo; y

R5 se selecciona de hidrógeno, hidroxi y metoxi.

[0071] En algunos otros ejemplos, al menos uno de R1, R2, R3, R4 y R5 es hidrógeno.

[0072] En otros ejemplos más, el sustrato (S) es un compuesto de fórmula II:

o una de sus sales, en la que:

R³ se selecciona de hidrógeno y alquilo C¹-C⁴;

R⁶ y R⁷ se seleccionan independientemente en cada aparición de hidroxi, fluoro, cloro, bromo, carboxaldehído, acilo C¹-C⁴, alquilo C¹-C⁴ y alcoxi C¹-C⁴ ;

n es 0, 1, 2, 3 o 4; y

n' es 0, 1, 2, 3, 4 o 5.

[0073] Cuando un enlace se dibuja a través de un anillo, significa que la sustitución puede ocurrir en un átomo o posición no específica del anillo. Por ejemplo, en la fórmula II que se muestra arriba, el hidrógeno de cualquier -CH- en el anillo de 6 miembros puede reemplazarse con R⁷ para formar -CR⁷-.

[0074] En algunos ejemplos, R⁶ y R⁷ son independientemente metilo o metoxi. En algunos otros ejemplos, n y n' son independientemente 1 o 2. Todavía en otras formas de realización, R³ es hidrógeno o metilo.

[0075] En algunos otros ejemplos, el sustrato (S) es un compuesto de Fórmula III:

o una de sus sales, en la que:

R⁶ y R⁷ se seleccionan independientemente en cada aparición de hidroxi, fluoro, cloro, bromo, carboxaldehído, acilo C¹-C⁴, alquilo C¹-C⁴ y alcoxi C¹-C⁴ ; y

n y n' son independientemente 0, 1, 2, 3 o 4.

[0076] En algunos ejemplos, R⁶ y R⁷ son independientemente hidroxi, metilo o metoxi. En algunos otros ejemplos, n y n' son independientemente 1 o 2. En aún otras formas de realización, R6 y R₇ son independientemente fluoro, hidroxi, metilo o metoxi.

[0077] En algunos ejemplos, los métodos proporcionan células huésped manipuladas que producen productos alcaloides a partir de (S)-reticulina. La epimerización de (S)-reticulina a (R)-reticulina puede comprender un paso clave en la producción de diversos productos alcaloides a partir de un precursor. En algunos ejemplos, el precursor es L-tirosina o un azúcar (p. ej., glucosa). Los diversos productos alcaloides pueden incluir, sin limitación, alcaloides de morfinano, protoberberina, noscapinoide y benzofenantridina.

[0078] Se puede usar cualquier fuente de carbono adecuada como precursor de un alcaloide de 1-bencilisoquinolina epimerizado. Los precursores adecuados pueden incluir, sin limitación, monosacáridos (p. ej., glucosa, fructosa, galactosa, xilosa), oligosacáridos (p. ej., lactosa, sacarosa, rafinosa), polisacáridos (p. ej., almidón, celulosa) o una combinación de los mismos. En algunos ejemplos, pueden usarse mezclas no purificadas de materias primas renovables (p. ej., licor macerado de maíz, melaza de remolacha azucarera, malta de cebada, hidrolizado de biomasa). En aún otras formas de realización, el precursor de carbono puede ser un compuesto de un carbono (p. ej., metanol, dióxido de carbono) o un compuesto de dos carbonos (p. ej., etanol). En aún otras formas de realización, se pueden utilizar otros compuestos que contienen carbono, por ejemplo, metilamina, glucosamina y aminoácidos (p. ej., L-tirosina). En algunos ejemplos, se puede añadir un alcaloide de 1-bencilisoquinolina directamente a una célula huésped manipulada, incluyendo, por ejemplo, norlaudanosolina, laudanosolina, norreticulina y reticulina. En aún otras formas de realización, se puede agregar un alcaloide de 1-bencilisoquinolina a la célula huésped manipulada como un solo enantiómero (p. ej., un alcaloide de (S)-1-bencilisoquinolina), o una mezcla de enantiómeros, que incluye, por ejemplo, una mezcla racémica.

[0079] La al menos una enzima convierte un alcaloide de (S)-1-bencilisoquinolina en un alcaloide de (R)-1-bencilisoquinolina. En algunos ejemplos de esta conversión de un alcaloide de (S)-1-bencilisoquinolina a un alcaloide de (R)-1-bencilisoquinolina utilizando al menos una enzima, el alcaloide de (S)-1-bencilisoquinolina se selecciona del grupo que consiste en (S)-norreticulina, (S)-reticulina, (S)-tetrahidropapaverina, (S)-norcoclaurina, (S)-coclaurina, (S)-N-metilcoclaurina, (S)-3'-hidroxi-N-metilcoclaurina, (S)-norisoorientalina, (S)-orientalina, (S)-isoorientalina, (S)-norprotosinomenina, (S)-protosinomenina, (S)-norlaudanosolina, (S)-laudanosolina, (S)-4'-0-metillaudanosolina, (S)-6-0-metilnorlaudanosolina y (S)-4'-0-metilnorlaudanosolina.

[0080] En aún otras formas de realización, el alcaloide de 1-bencilisoquinolina que se epimeriza puede comprender dos o más estereocentros, donde solo uno de los dos o más estereocentros se invierte para producir un diastereoisómero del sustrato (p. ej., (S, R)-alcaloide de 1-bencilisoquinolina convertido en (R,R)-1-alcaloide de bencilisoquinolina). En los ejemplos en los que solo un estereocentro de un alcaloide de 1-bencilisoquinolina se invierte cuando se pone en contacto con al menos una enzima, el producto se denomina epímero del alcaloide de 1-bencilisoquinolina.

[0081] En algunos ejemplos, el alcaloide de 1-bencilisoquinolina se presenta a la enzima como un solo estereoisómero. En algunos otros ejemplos, el alcaloide de 1-bencilisoquinolina se presenta a la enzima como una mezcla de estereoisómeros. En aún otras formas de realización, la mezcla de estereoisómeros puede ser una mezcla racémica. En algunos otros ejemplos, la mezcla de estereoisómeros puede enriquecerse en un estereoisómero en comparación con otro estereoisómero.

[0082] En algunos ejemplos, se recupera un alcaloide de 1-bencilisoquinolina, o un derivado del mismo. En algunos ejemplos, el alcaloide de 1-bencilisoquinolina se recupera de un cultivo celular. En aún otras formas de realización, el alcaloide de 1-bencilisoquinolina recuperado está enantioméricamente enriquecido en un estereoisómero en comparación con la mezcla original de alcaloides de 1-bencilisoquinolina presentados a la enzima. En aún otras formas de realización, el alcaloide de 1-bencilisoquinolina recuperado tiene un exceso enantiomérico de al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos el 82 %, al menos el 84 %, al menos el 86 %, al menos el 88 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, al menos el 99,5 %, al menos el 99,7 % o el 100 %.

[0083] Los "isómeros" son compuestos diferentes que tienen la misma fórmula molecular. Los "estereoisómeros" son isómeros que difieren solo en la forma en que los átomos están dispuestos en el espacio. Los "enantiómeros" son un par de estereoisómeros que son imágenes especulares no superponibles entre sí. Una mezcla 1:1 de un par de enantiómeros es una mezcla "racémica". Los "diastereoisómeros" o "diastereómeros" son estereoisómeros que tienen al menos dos átomos asimétricos pero que no son imágenes especulares entre sí. El término "epímero", como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto que tiene la fórmula química idéntica pero una configuración óptica diferente en una posición particular. Por ejemplo, los estereoisómeros (R,S) y (S,S) de un compuesto son epímeros entre sí. En algunos ejemplos, un alcaloide de 1-bencilisoquinolina se convierte en su epímero (p. ej., alcaloide de epi-1-bencilisoquinolina). La estereoquímica absoluta se especifica según el sistema Cahn-Ingold-Prelog RS. Cuando un compuesto es un enantiómero puro, la estereoquímica en cada carbono quiral se puede especificar mediante R o S. Los compuestos resueltos cuya configuración absoluta se desconoce se pueden designar (+) o (-) según la dirección (dextroo levorrotatoria) en el que giran luz polarizada plana a la longitud de onda de la línea D de sodio. Ciertos compuestos descritos en este documento contienen uno o más centros asimétricos y, por lo tanto, pueden dar lugar a enantiómeros, diastereómeros y otras formas estereoisómeras que pueden definirse, en términos de estereoquímica absoluta, como (R)o (S)-.

Modificaciones generadoras de bisBIA

[0084] Algunos métodos, procesos y sistemas proporcionados aquí describen la producción de alcaloides de bisbencilisoquinolina (bisBIA). Los bisBIA son moléculas diméricas que pueden formarse mediante reacciones de acoplamiento entre dos monómeros BIA. En ejemplos, los bisBIA pueden formarse mediante reacciones de acoplamiento carbono-oxígeno. En otros ejemplos, los bisBIA pueden formarse mediante reacciones de acoplamiento carbono-carbono. En algunos ejemplos, la molécula dimérica bisBIA es un homodímero que comprende dos monómeros BIA idénticos. En ejemplos, una célula huésped diseñada puede producir un monómero BIA. En estos ejemplos, los monómeros BIA pueden formar homodímeros cuando se ponen en contacto con una o más enzimas de acoplamiento. En otros ejemplos, la molécula dimérica bisBIA es un heterodímero que comprende dos monómeros BIA diferentes. Por ejemplo, un bisBIA puede ser un heterodímero que comprende monómeros BIA que son enantiómeros entre sí. En algunos ejemplos, una célula huésped manipulada puede producir dos o más monómeros BIA. En estos ejemplos, los monómeros BIA pueden formar homodímeros y heterodímeros cuando se ponen en contacto con una o más enzimas de acoplamiento.

[0085] Algunos de estos métodos, procesos y sistemas que describen la producción de bisBIA pueden comprender una célula huésped diseñada por ingeniería. En algunos ejemplos, la célula huésped diseñada puede diseñarse para producir monómeros BIA que, a su vez, pueden usarse como moléculas de bloques de construcción para formar bisBIA. Los ejemplos de monómeros BIA que pueden usarse para formar bisBIA incluyen coclaurina, N-metilcoclaurina, laudanina, norcoclaurina, norlaudanosolina, 6-O-metil-norlaudanosolina, 3'-hidroxi-N-metilcoclaurina, 3'-hidroxicoclaurina, reticulina, norreticulina, norlaudanina, laudanosina y papaverina. En particular, las células huésped diseñadas pueden sintetizar monómeros BIA a partir de norcoclaurina o norlaudanosolina mediante la expresión de enzimas heterólogas que incluyen O-metiltransferasas, N-metiltransferasas y 3'-hidroxilasas. Los ejemplos de O-metiltransferasas pueden incluir norcoclaurina 6-O-metiltransferasa (6OMT) de Thalicrum flavum, Nelumbo nucífera, Populus euphratica u otra especie. Otros ejemplos de O-metiltransferasas pueden incluir catecol O-metiltransferasa (COMT) de Homo sapiens, Mus musculus, Rattus norvegicus, Gorilla gorilla u otra especie. Otros ejemplos de N-metiltransferasas pueden incluir coclaurina N-metiltransferasa (CNMT) de T. flavum, N. nucifera, Aristolochia fimbriata u otras especies. Los ejemplos de 3' hidroxilasas pueden incluir Nmetilcoclaurina 3'-hidroxilasa (CYP80B1) de Eschscholzia californica, T. flavum, N. nucifera u otra especie.

[0086] Las células huésped manipuladas pueden producir enantiómeros (S) o (R) de cualquier monómero BIA dado. Adicional o alternativamente, las células huésped manipuladas pueden producir una mezcla de ambos enantiómeros. La proporción de enantiómeros (S) y (R) puede determinarse mediante las especificidades de sustrato y producto de una o más enzimas que sintetizan los monómeros BIA. Alternativamente, la cantidad de cada enantiómero presente puede modificarse mediante la expresión de una enzima o enzimas adicionales que realizan la epimerización de un estereoisómero en otro, como se discutió anteriormente.

[0087] Estos monómeros de BIA se pueden fusionar en un armazón de bisBIA dimérico. En particular, los monómeros de BIA se pueden fusionar en un armazón de bisBIA dimérico utilizando una o más enzimas que son producidas por la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, los monómeros BIA se pueden fusionar en un armazón bisBIA dimérico utilizando una o más enzimas que se proporcionan a los monómeros BIA desde una fuente que es externa a la célula huésped manipulada. La una o más enzimas pueden usarse para formar reacciones de acoplamiento carbonooxígeno y/o carbono-carbono para fusionar dos monómeros BIA en una, dos o tres posiciones. En algunos ejemplos, dos monómeros BIA pueden estar unidos por un puente éter. En algunos ejemplos, se puede usar un enlace directo carbonocarbono para conectar los dos monómeros BIA. En algunos ejemplos, un bisBIA que se forma fusionando dos monómeros BIA puede comprender un enlace de éter difenílico. En algunos ejemplos, se pueden fusionar dos monómeros BIA para formar un bisBIA que comprende dos enlaces de éter difenílico. En algunos ejemplos, un bisBIA que se forma a partir de dos monómeros BIA puede comprender tres enlaces de éter difenílico. En algunos ejemplos, el bisBIA puede comprender un enlace de éter difenílico y un enlace de éter bencilfenílico. En algunos casos, el bisBIA puede comprender un enlace de bencil fenil éter y dos enlaces de difenil éter.

[0088] En ejemplos, los monómeros BIA pueden ponerse en contacto con una cantidad suficiente de una o más enzimas que pueden usarse para formar reacciones de acoplamiento para fusionar dos monómeros BIA de manera que al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 82 %, al menos 84 %, al menos 86 %, al menos 88 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, al menos el 99,5 %, al menos el 99,7 % o el 100 % de dichos monómeros BIA son convertidos a bisBIA. La una o más enzimas que pueden usarse para dimerizar los monómeros BIA en bisBIA pueden ponerse en contacto con los monómeros BIA in vitro. Además, o alternativamente, la una o más enzimas que pueden usarse para dimerizar los monómeros BIA en bisBIA pueden ponerse en contacto con los monómeros BIA in vivo. Además, la una o más enzimas dimerizantes bisBIA pueden expresarse en una célula huésped que produce monómeros BIA. Alternativamente, los monómeros de BIA se pueden proporcionar a la célula huésped manipulada que expresa la enzima dimerizante bisBIA. Alternativamente, la una o más enzimas dimerizantes bisBIA pueden proporcionarse a una célula que tiene monómeros BIA en su interior.

[0089] En algunos ejemplos, el alcaloide de bisbencilisoquinolina es un compuesto de cualquiera de las Fórmulas Va-Vu:

o una de sus sales, en la que:

R^1a, R^1b, R^2a y R^2b se seleccionan independientemente entre hidrógeno y alquilo C¹-C⁴;

R^{3 a} , R^3b, R^6a, R^6b, R^8a y R^8b se seleccionan independientemente de hidrógeno, hidroxi, fluoro, cloro, bromo, carboxaldehído, acilo C¹-C⁴ , alquilo C¹-C⁴ y alcoxi C¹-C⁴;

R^4a y R^5a se seleccionan independientemente de hidrógeno y alquilo C¹-C⁴, o R^4a y R^5a juntos forman un puente de metileno;

R^4b y R^5b se seleccionan independientemente de hidrógeno y alquilo C¹-C⁴, o R^4b y R^5b juntos forman un puente de metileno; y

R^{7 a} , R^7b y R^9a se seleccionan independientemente de hidrógeno y alquilo C¹-C⁴.

[0090] En algunos ejemplos, cada uno de R^1a y R^1b es hidrógeno; R^2a y R^2b son cada uno metilo; cada uno de R^3a y R^3b es hidrógeno; R^4a y R^5a son independientemente hidrógeno o metilo; R^4b y R^5b son independientemente hidrógeno o metilo, o R^4b y R^5b juntos forman un puente de metileno; cada uno de R^6a, R⁶b, R^8a y R^8b es hidrógeno; y R^{7 a} , independientemente hidrógeno o metilo.

[0091] Como se ilustró anteriormente, los compuestos bisBIA de fórmulas Va, Vb y Vd se forman fusionando dos monómeros BIA usando una reacción de acoplamiento de carbono-oxígeno. Además, los compuestos bisBIA de fórmulas Vc, Vf y Vh se forman fusionando dos monómeros BIA usando una reacción de acoplamiento carbono-oxígeno y una reacción de acoplamiento carbono-carbono. Además, los compuestos bisBIA de fórmulas Ve, Vg, Vi, Vj, Vk, Vl, Vm, Vo, Vp y Vq se forman fusionando dos monómeros BIA usando dos reacciones de acoplamiento carbono-oxígeno. El compuesto bisBIA de Fórmula Vn se forma fusionando dos monómeros BIA utilizando dos reacciones de acoplamiento carbono-oxígeno y una reacción de acoplamiento carbono-carbono. Además, el compuesto bisBIA de Fórmula Vr se forma fusionando dos monómeros BIA usando tres reacciones de acoplamiento carbono-oxígeno.

[0092] La una o más enzimas que pueden usarse para formar las reacciones de acoplamiento pueden incluir citocromos P450 conocidos tales como Berberís stolonifera CYP80A1 o enzimas de citocromo P450 similares de otras plantas que sintetizan naturalmente estos compuestos. Alternativamente, la reacción de acoplamiento puede ser realizada por una enzima que no sea un citocromo P450. La una o más enzimas que pueden usarse para formar las reacciones de acoplamiento pueden diseñarse para aceptar sustratos no nativos. Por consiguiente, la una o más enzimas que pueden usarse para formar las reacciones de acoplamiento pueden usarse para generar moléculas de bisBIA no naturales. En ejemplos, una o más enzimas pueden fusionar un monómero de BIA natural con un monómero de BIA no natural para producir una molécula de bisBIA no natural. En otros ejemplos, una o más enzimas pueden fusionar dos monómeros de BIA no naturales para producir una molécula de bisBIA no natural. Pueden usarse estrategias de ingeniería enzimática para identificar una o más enzimas que pueden usarse para formar las reacciones de acoplamiento que fusionan monómeros BIA para producir bisBIA. En ejemplos, las estrategias de ingeniería enzimática pueden incluir mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis aleatoria y cribado, barajado de ADN y cribado.

[0093] Una vez que se forman los bisBIA, los bisBIA pueden derivatizarse o modificarse adicionalmente. Los bisBIA pueden derivatizarse o modificarse utilizando una o más enzimas que son producidas por la célula huésped manipulada.

En particular, los bisBIA pueden derivatizarse o modificarse poniendo en contacto los bisBIA con una o más enzimas producidas por la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, los bisBIA pueden derivatizarse o modificarse poniendo en contacto los bisBIA con una o más enzimas que se proporcionan a los bisBIA desde una fuente que es externa a la célula huésped manipulada. La una o más enzimas que pueden usarse para derivatizar o modificar los bisBIA pueden usarse para realizar reacciones de adaptación. Los ejemplos de reacciones de adaptación incluyen oxidación, reducción, O-metilación, W-metilación, O-desmetilación, acetilación, formación de puentes de metilendioxi y O,O-desmetilenación. Un bisBIA se puede derivatizar o modificar utilizando una o más reacciones de adaptación.

[0094] En la Tabla 3 se proporcionan ejemplos de reacciones de adaptación. En algunos ejemplos, pueden usarse enzimas de adaptación para catalizar reacciones de acoplamiento carbono-carbono realizadas en un bisBIA, o un derivado del mismo. Los ejemplos de enzimas adaptadas que pueden usarse para catalizar reacciones de acoplamiento carbonocarbono incluyen una enzima puente de berberina (BBE) de Papaver somniferum, Eschscholzia californica, Coptis japónica, Berberís stolonifer, Thalictrum flavum u otra especie; salutaridina sintasa (SalSyn) de Papaver somniferum u otra especie; y corituberina sintasa (CorSyn) de Coptisjaponica u otra especie. En el Esquema 2 se muestran ejemplos no limitantes de reacciones que pueden catalizarse mediante enzimas adaptadas, en las que R^a , R^b, R^c y R^d se seleccionan independientemente de hidrógeno, hidroxi, fluoro, cloro, bromo, carboxaldehído, acilo C¹-C⁴, alquilo C¹-C⁴ y alcoxi C¹-C⁴. En algunos ejemplos, R^a , R^b y los átomos de carbono a los que están unidos forman opcionalmente un carbociclo o heterociclo. En algunos ejemplos, R^c , R^d y los átomos de carbono a los que están unidos forman opcionalmente un carbociclo o un heterociclo.

Esquema 2

[0095] En algunos ejemplos, pueden usarse enzimas de adaptación para catalizar reacciones de oxidación realizadas en un bisBIA, o un derivado del mismo. Ejemplos de enzimas adaptadas que pueden usarse para catalizar reacciones de oxidación incluyen una tetrahidroprotoberberina oxidasa (STOX) de Coptisjaponica, Argemone mexicana, Berberís wilsonae u otra especie; Dihidrobenzofenantridina oxidasa (DBOX) de Papaver somniferum u otra especie; metilestilopina hidroxilasa (MSH) de Papaver somniferum u otra especie; y protopina 6-hidroxilasa (P6H) de Papaver somniferum, Eschscholzia californica u otra especie.

[0096] Las enzimas de adaptación también se pueden usar para catalizar reacciones de formación de puentes de metilendioxi realizadas en un bisBIA, o un derivado del mismo. Ejemplos de enzimas adaptadas que pueden usarse para catalizar reacciones de formación de puentes de metilendioxi incluyen una Estilopina sintasa (StySyn) de Papaver somniferum, Eschscholzia californica, Argemone mexicana u otra especie; Qeilantifolina synthase (CheSyn) de Papaver somniferum, Eschscholzia californica, Argemone mexicana u otra especie; y canadina sintasa (CAS) de Thalictrum flavum, Coptis chinensis u otra especie.

[0097] En otros ejemplos, pueden usarse enzimas de adaptación para catalizar reacciones de O -metilación realizadas en un bisBIA, o un derivado del mismo. Ejemplos de enzimas adaptadas que pueden usarse para catalizar reacciones de O -metilación incluyen una norcoclaurina 6-O-metiltransferasa (6OMT) de Papaver somniferum, Thalictrum flavum, Coptis japonica, Papaver bracteatum u otra especie; 3'hidroxi-W-metilcoclaurina 4'-O-metiltransferasa (4'OMT) de Papaver somniferum, Thalictrum flavum, Coptis japonica, Coptis chinensis u otra especie; reticulina 7-O-metiltransferasa (7OMT) de Papaver somniferum, Eschscholzia californica u otra especie; y Escoulerina 9-O-metiltransferasa (9OMT) de Papaver somniferum, Thalictrum flavum, Coptis japonica, Coptis chinensis u otra especie.

[0098] Además, pueden usarse enzimas de adaptación para catalizar reacciones de W-metilación realizadas en un bisBIA, o un derivado del mismo. Ejemplos de enzimas adaptadas que pueden usarse para catalizar reacciones de W-metilación incluyen coclaurina W-metiltransferasa (CNMT) de Papaver somniferum, Thalictrum flavum, Coptis japonica u otra especie; Tetrahidroprotoberberina W-metiltransferasa (TNMT) de Papaver somniferum, Eschscholzia californica, Papaver bracteatum u otra especie.

[0099] Además, pueden usarse enzimas de adaptación para catalizar reacciones de O-desmetilación realizadas en un bisBIA, o un derivado del mismo. Ejemplos de enzimas adaptadas que pueden usarse para catalizar reacciones de O-desmetilación incluyen tebaína desmetilasa (T6ODM) de Papaver somniferum u otra especie; y codeína desmetilasa (CODM) de Papaver somniferum, u otra especie.

[0100] Las enzimas de adaptación también pueden usarse para catalizar reacciones de reducción realizadas en un bisBIA, o un derivado del mismo. Los ejemplos de enzimas adaptadas que pueden usarse para catalizar reacciones de reducción incluyen salutaridina reductasa (SalR) de Papaver somniferum, Papaver bracteatum u otra especie; codeinona reductasa (COR) de Papaver somniferum u otra especie; y Sanguinarine reductase (SanR) de Eschscholzia californica u otra especie. En otros ejemplos, pueden usarse enzimas de adaptación para catalizar reacciones de acetilación realizadas en un bisBIA, o un derivado del mismo. Un ejemplo de una enzima de adaptación que puede usarse para catalizar reacciones de acetilación incluye salutaridina acetiltransferasa (SalAT) de Papaver somniferum u otra especie.

Secuencias de codificación heterólogas

[0101] En algunos casos, las células huésped manipuladas albergan una o más secuencias de codificación heterólogas (tales como dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más) que codifican actividad(es) que permiten que las células anfitrionas para producir enzimas deseadas de interés y/o BIA de interés, por ejemplo, como se describe en el presente documento. Como se usa en el presente documento, el término "secuencia codificante heteróloga" se usa para indicar cualquier polinucleótido que codifica, o codifica en última instancia, un péptido o proteína o su secuencia de aminoácidos equivalente, por ejemplo, una enzima, que normalmente no está presente en el huésped. organismo y puede expresarse en la célula huésped en condiciones adecuadas. Como tal, "secuencias codificantes heterólogas" incluye múltiples copias de secuencias codificantes que normalmente están presentes en la célula huésped, de modo que la célula expresa copias adicionales de una secuencia codificante que normalmente no están presentes en las células. Las secuencias codificantes heterólogas pueden ser ARN o cualquier tipo de los mismos, por ejemplo, ARNm, ADN o cualquier tipo de los mismos, por ejemplo, ADNc o un híbrido de ARN/^a Dⁿ . Las secuencias de codificación de interés incluyen, entre otras, unidades de transcripción de longitud completa que incluyen características tales como la secuencia de codificación, intrones, regiones promotoras, 3'-UTR y regiones potenciadoras.

[0102] En ejemplos, las células huésped diseñadas pueden comprender una pluralidad de secuencias codificantes heterólogas, cada una de las cuales codifica una enzima, como una enzima enumerada en la Tabla 2. En algunos ejemplos, la pluralidad de enzimas codificadas por la pluralidad de secuencias codificantes heterólogas puede ser distintos unos de otros. En algunos ejemplos, algunas de la pluralidad de enzimas codificadas por la pluralidad de secuencias codificantes heterólogas pueden ser distintas entre sí y algunas de la pluralidad de enzimas codificadas por la pluralidad de secuencias codificantes heterólogas pueden ser copias duplicadas.

[0103] En algunos ejemplos, las secuencias de codificación heterólogas pueden estar operativamente conectadas. Las secuencias de codificación heterólogas que están operativamente conectadas pueden estar dentro de la misma vía de producción de un producto de alcaloide de bencilisoquinolina y/o producto de epimerasa particular. En algunos ejemplos, las secuencias codificantes heterólogas operativamente conectadas pueden ser directamente secuenciales a lo largo de la ruta de producción de un producto de alcaloide de bencilisoquinolina y/o producto de epimerasa particular. En algunos ejemplos, las secuencias codificantes heterólogas operativamente conectadas pueden tener una o más enzimas nativas entre una o más de las enzimas codificadas por la pluralidad de secuencias codificantes heterólogas. En algunos ejemplos, las secuencias codificantes heterólogas pueden tener una o más enzimas heterólogas entre una o más de las enzimas codificadas por la pluralidad de secuencias codificantes heterólogas. En algunos ejemplos, las secuencias codificantes heterólogas pueden tener una o más enzimas no nativas entre una o más de las enzimas codificadas por la pluralidad de secuencias codificantes heterólogas.

[0104] Las células huésped manipuladas también pueden modificarse para que posean una o más alteraciones genéticas para adaptarse a las secuencias codificantes heterólogas. Las alteraciones del genoma del huésped nativo incluyen, entre otras, la modificación del genoma para reducir o suprimir la expresión de una proteína específica que puede interferir con la ruta deseada. La presencia de dichas proteínas nativas puede convertir rápidamente uno de los productos intermedios o finales de la vía en un metabolito u otro compuesto que no se puede utilizar en la vía deseada. Por lo tanto, si la actividad de la enzima nativa se redujera o estuviera completamente ausente, los intermedios producidos estarían disponibles más fácilmente para su incorporación en el producto deseado.

[0105] Las secuencias codificantes heterólogas incluyen, entre otras, secuencias que codifican enzimas, secuencias de tipo salvaje o equivalentes, que normalmente son responsables de la producción de BIA de interés en plantas. En algunos casos, las enzimas para las que codifican las secuencias heterólogas pueden ser cualquiera de las enzimas de la vía 1-BIA, y pueden ser de cualquier fuente conveniente. La elección y el número de enzimas codificadas por las secuencias de codificación heterólogas para la ruta sintética particular pueden seleccionarse en función del producto deseado. En ciertas formas de realización, las células huésped pueden incluir 1 o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 11 o más, 12 o más, 13 o más, 14 o más, o incluso 15 o más secuencias de codificación heterólogas, tales como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 secuencias codificantes heterólogas.

[0106] Como se usa en el presente documento, el término "secuencias codificantes heterólogas" también incluye la parte codificante del péptido o enzima, es decir, la secuencia de ADNc o ARNm, del péptido o enzima, así como la parte codificante del péptido o enzima de longitud completa. unidad transcripcional, es decir, el gen que incluye intrones y exones, así como secuencias "optimizadas de codones", secuencias truncadas u otras formas de secuencias alteradas que codifican la enzima o codifican su secuencia de aminoácidos equivalente, siempre que la secuencia de aminoácidos equivalente produce una proteína funcional. Dichas secuencias de aminoácidos equivalentes pueden tener una deleción de uno o más aminoácidos, siendo la deleción N-terminal, C-terminal o interna. Se prevén formas truncadas siempre que tengan la capacidad catalítica indicada en este documento. También se prevén fusiones de dos o más enzimas para facilitar la transferencia de metabolitos en la vía, siempre que se mantengan las actividades catalíticas.

[0107] Los fragmentos operables, mutantes o formas truncadas pueden identificarse mediante modelado y/o cribado. En algunos En algunos casos, esto se logra mediante la eliminación de, por ejemplo, las regiones N-terminal, C-terminal o internas de la proteína de forma escalonada, seguida de análisis del derivado resultante con respecto a su actividad para la reacción deseada en comparación con la secuencia original. Si el derivado en cuestión opera en esta capacidad, se considera que constituye un derivado equivalente de la enzima propiamente dicha.

[0108] En ejemplos, algunas proteínas heterólogas pueden mostrar situaciones en las que se procesan incorrectamente cuando se expresan en un huésped recombinante. Por ejemplo, las proteínas vegetales como las enzimas del citocromo P450 expresadas en huéspedes de producción microbiana pueden tener casos de procesamiento incorrecto. En particular, la salutaridina sintasa puede experimentar glicosilación ligada a N cuando se expresa heterólogamente en levadura. Esta glicosilación ligada a N puede no observarse en las plantas, lo que puede ser indicativo de una clasificación N-terminal incorrecta del transcrito SalSyn naciente para reducir la actividad de la enzima en el huésped microbiano heterólogo. En tales ejemplos, la ingeniería de proteínas dirigida a corregir la clasificación N-terminal del transcrito naciente para eliminar el patrón de glicosilación ligado a N puede dar como resultado una actividad mejorada de la enzima salutaridina sintasa en el huésped de producción recombinante. Esto se explica adicionalmente en el Ejemplo 10 a continuación.

[0109] Los aspectos de la invención también se relacionan con secuencias de codificación heterólogas que codifican secuencias de aminoácidos que son equivalentes a las secuencias de aminoácidos nativas para las diversas enzimas. Una secuencia de aminoácidos que es "equivalente" se define como una secuencia de aminoácidos que no es idéntica a la secuencia de aminoácidos específica, sino que contiene al menos algunos cambios de aminoácidos (eliminaciones, sustituciones, inversiones, inserciones, etc.) que no afecta esencialmente a la actividad biológica de la proteína en comparación con una actividad similar de la secuencia de aminoácidos específica, cuando se usa para un propósito deseado. La actividad biológica se refiere, en el ejemplo de una epimerasa, a su actividad catalítica. También se pretende que las secuencias equivalentes incluyan aquellas que han sido manipuladas y/o evolucionadas para tener propiedades diferentes de la secuencia de aminoácidos original. Las propiedades mutables de interés incluyen actividad catalítica, especificidad de sustrato, selectividad, estabilidad, solubilidad, localización, etc.

[0110] En algunos casos, la expresión de cada tipo de enzima aumenta a través de copias de genes adicionales (es decir, copias múltiples), lo que aumenta acumulación intermedia y/o BIA de producción de intereses. Las formas de realización de la invención incluyen una mayor producción de BIA de interés en una célula huésped a través de la expresión simultánea de variantes de especies múltiples de una enzima única o múltiple. En algunos casos, se incluyen copias de genes adicionales de una o varias enzimas en la célula huésped. Puede utilizarse cualquier método conveniente que incluya copias múltiples de una secuencia codificante heteróloga para una enzima en la célula huésped.

[0111] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada incluye múltiples copias de una secuencia codificante heteróloga para una enzima, como 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, o incluso 10 o más copias. Un ejemplo de esto se describe en la FIG. 28. En particular, la FIG. 28 ilustra el aumento de la producción del alcaloide de bencilisoquinolina reticulina al aumentar el número de copias del gen NCS de dos copias a tres copias en una cepa de levadura manipulada.

[0112] En ciertas formas de realización, la célula huésped diseñada incluye múltiples copias de secuencias codificantes heterólogas para una o más enzimas, tales como múltiples copias de dos o más, tres o más, cuatro o más, etc. En algunos casos, las múltiples copias de la secuencia codificante heteróloga para una enzima se derivan de dos o más organismos fuente diferentes en comparación con la célula huésped. Por ejemplo, la célula huésped manipulada puede incluir múltiples copias de una secuencia de codificación heteróloga, donde cada una de las copias se deriva de un organismo fuente diferente. Como tal, cada copia puede incluir algunas variaciones en secuencias explícitas basadas en diferencias entre especies de la enzima de interés que está codificada por la secuencia de codificación heteróloga.

[0113] El medio de células huésped diseñado puede muestrearse y monitorearse para la producción de BIA de interés. Los BIA de interés pueden observarse y medirse usando cualquier método conveniente. Los métodos de interés incluyen, pero no se limitan a métodos de CL-EM (p. ej., como se describe en este documento) en los que se analiza una muestra de interés comparándola con una cantidad conocida de un compuesto estándar. Además, existen otras formas de observar y/o medir los BIA de interés. Ejemplos de formas alternativas de observar y/o medir BIA incluyen GC-MS, espectroscopia UV-vis, RMN, CL-RMN, CL-UV, TLC, electroforesis capilar, entre otros. La identidad puede confirmarse, por ejemplo, mediante patrones de fragmentación m/z y MS/MS, y la cuantificación o medición del compuesto puede lograrse a través de picos de trazas de CL de tiempo de retención conocido y/o análisis de picos de ^m S EIC por referencia a CL-EM correspondiente análisis de una cantidad conocida de un estándar del compuesto.

[0114] Además, se puede tomar una muestra de un cultivo de la célula huésped manipulada y controlar la producción de enzimas de interés, como una enzima CYP-COR. Las enzimas de interés pueden observarse y medirse usando cualquier método conveniente. Los métodos de interés incluyen ensayos de actividad enzimática, electroforesis en gel de poliacrilamida, espectroscopia de monóxido de carbono y análisis de transferencia Western.

MÉTODOS

Etapas del proceso

[0115] Como se resume anteriormente, los aspectos de la invención incluyen métodos para preparar alcaloides de bencilisoquinolina (BIA) de interés. Una célula huésped manipulada puede cultivarse en condiciones en las que una o más modificaciones de la célula huésped (por ejemplo, como se describe en este documento) se expresan funcionalmente de manera que la célula convierte los compuestos de partida de interés en enzimas producto y/o BIA de interés. Los métodos pueden incluir el cultivo de una célula huésped manipulada en condiciones adecuadas para la producción de proteínas, de modo que una o más secuencias codificantes heterólogas se expresen funcionalmente y conviertan los compuestos de partida de interés en enzimas producto o BIA de interés. En los ejemplos, el método es un método para preparar un alcaloide de bencilisoquinolina (BIA) que incluye el cultivo de una célula huésped manipulada (p. ej., como se describe en el presente documento); añadir un compuesto de partida al cultivo celular; y recuperar el BIA del cultivo celular. En algunos ejemplos, el método es un método de preparación de una enzima que incluye el cultivo de una célula huésped manipulada (p. ej., como se describe en el presente documento); añadir un compuesto de partida al cultivo celular; y recuperar la enzima del cultivo celular.

[0116] Los medios de fermentación pueden contener sustratos de carbono adecuados. La fuente de carbono adecuada para realizar los métodos de esta descripción puede abarcar una amplia variedad de sustratos que contienen carbono. Los sustratos adecuados pueden incluir, sin limitación, monosacáridos (p. ej., glucosa, fructosa, galactosa, xilosa), oligosacáridos (p. ej., lactosa, sacarosa, rafinosa), polisacáridos (p. ej., almidón, celulosa) o una combinación de los mismos. En algunos casos, pueden usarse mezclas no purificadas de materias primas renovables (p. ej., licor macerado de maíz, melaza de remolacha azucarera, malta de cebada). En algunos casos, el sustrato de carbono puede ser un sustrato de un carbono (p. ej., metanol, dióxido de carbono) o un sustrato de dos carbonos (p. ej., etanol). En otros casos, se pueden utilizar otros compuestos que contienen carbono, por ejemplo, metilamina, glucosamina y aminoácidos.

[0117] Puede emplearse cualquier método conveniente de cultivo de células huésped manipuladas para producir las enzimas y/o BIA de interés. El protocolo particular que se emplea puede variar, por ejemplo, dependiendo de la célula huésped diseñada, las secuencias de codificación heterólogas, las enzimas de interés, los BIA de interés, etc. Las células pueden estar presentes en cualquier entorno conveniente, como un entorno en en el que las células son capaces de expresar una o más enzimas heterólogas funcionales. En algunas formas de realización, las células se cultivan en condiciones que conducen a la expresión de enzimas y con sustratos apropiados disponibles para permitir la producción de enzimas y/o BIA de interés in vivo. En algunas formas de realización, las enzimas funcionales se extraen del huésped diseñado para la producción de enzimas y/o BIA de interés en condiciones in vitro. En algunos casos, las células huésped manipuladas se vuelven a colocar en un organismo huésped multicelular. Las células huésped manipuladas se encuentran en cualquier fase de crecimiento, incluidas, entre otras, la fase estacionaria y la fase de crecimiento logarítmico, etc. Además, los propios cultivos pueden ser cultivos continuos o pueden ser cultivos discontinuos.

[0118] Las células se pueden cultivar en un medio de fermentación apropiado a una temperatura entre 14 y 40 °C. Las células pueden crecer con agitación a cualquier velocidad conveniente (p. ej., 200 rpm). Las células se pueden cultivar a un pH adecuado. Los rangos de pH adecuados para la fermentación pueden estar entre pH 5-9. Las fermentaciones se pueden realizar en condiciones aeróbicas, anaeróbicas o microaeróbicas. Puede usarse cualquier medio de crecimiento adecuado. Los medios de crecimiento adecuados pueden incluir, sin limitación, medios preparados comercialmente comunes tales como medios mínimos definidos sintéticos (DS) o medios ricos en peptona dextrosa de extracto de levadura (PDEL). Puede usarse cualquier otro medio de crecimiento rico, definido o sintético apropiado para el microorganismo.

[0119] Las células se pueden cultivar en un recipiente de esencialmente cualquier tamaño y forma. Los ejemplos de recipientes adecuados para realizar los métodos de esta divulgación pueden incluir, sin limitación, placas de agitación de pocillos múltiples, tubos de ensayo, matraces (con y sin deflectores) y biorreactores. El volumen del cultivo puede oscilar entre 10 microlitros y más de 10.000 litros.

[0120] Puede incluirse la adición de agentes a los medios de crecimiento que se sabe que modulan el metabolismo de una manera deseable para la producción de alcaloides. En un ejemplo no limitativo, se puede añadir 2'3'monofosfato de adenosina cíclica al medio de cultivo para modular la represión catabólica.

[0121] Puede utilizarse cualquier condición de cultivo celular conveniente para un tipo de célula particular. En determinadas formas de realización, las células huésped que incluyen una o más modificaciones se cultivan en condiciones estándar o fácilmente optimizadas, con suplementos y medios de cultivo celular estándar. Como ejemplo, los medios de crecimiento estándar cuando no se requiere presión selectiva para el mantenimiento de plásmidos pueden contener 20 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de peptona y 20 g/L de dextrosa (YPD). Las células huésped que contienen plásmidos se cultivan en medios completos sintéticos (SC) que contienen 1,7 g/L de base de nitrógeno de levadura, 5 g/L de sulfato de amonio y 20 g/L de dextrosa suplementados con los aminoácidos apropiados necesarios para el crecimiento y la selección. Las fuentes de carbono alternativas que pueden ser útiles para la expresión enzimática inducible incluyen, pero no se limitan a sacarosa, rafinosa y galactosa. Las células se cultivan a cualquier temperatura conveniente (p. ej., 30 °C) con agitación a cualquier velocidad conveniente (p. ej., 200 rpm) en un recipiente, por ejemplo, en tubos de ensayo o matraces en volúmenes que oscilan entre 1 y 1000 ml, o mayores, en el laboratorio.

[0122] Los volúmenes de cultivo se pueden escalar para el crecimiento en recipientes de fermentación más grandes, por ejemplo, como parte de un proceso industrial. El proceso de fermentación industrial puede llevarse a cabo en condiciones de quimiostato de lote cerrado, lote alimentado o continuo, o cualquier modo adecuado de fermentación. En algunos casos, las células pueden inmovilizarse sobre un sustrato como catalizadores de células completas y someterse a condiciones de fermentación para la producción de alcaloides.

[0123] Una fermentación discontinua es un sistema cerrado, en el que la composición del medio se establece al comienzo de la fermentación y no se altera durante el proceso de fermentación. Los organismos deseados se inoculan en el medio al comienzo de la fermentación. En algunos casos, la fermentación por lotes se realiza con modificaciones en el sistema para controlar factores como el pH y la concentración de oxígeno (pero no el carbono). En este tipo de sistema de fermentación, las composiciones de biomasa y metabolitos del sistema cambian continuamente durante el transcurso de la fermentación. Las células generalmente pasan por una fase de retraso, luego a una fase logarítmica (alta tasa de crecimiento), luego a una fase estacionaria (tasa de crecimiento reducida o detenida) y finalmente a una fase de muerte (si no se trata).

[0124] Una fermentación continua es un sistema abierto, en el que se añade continuamente un medio de fermentación definido al biorreactor y se elimina continuamente una cantidad igual de medio de fermentación del buque para su procesamiento. Los sistemas de fermentación continua generalmente funcionan para mantener condiciones de crecimiento en estado estable, de modo que la pérdida de células debida a la eliminación del medio debe equilibrarse con la tasa de crecimiento en la fermentación. Las fermentaciones continuas se realizan generalmente en condiciones en las que las células tienen una densidad celular alta constante. Las fermentaciones continuas permiten la modulación de uno o más factores que afectan la concentración del producto objetivo y/o el crecimiento celular.

[0125] El medio líquido puede incluir, pero no se limita a, un medio definido rico o sintético que tiene un componente aditivo descrito anteriormente. Los componentes de los medios pueden disolverse en agua y esterilizarse mediante calor, presión, filtración, radiación, productos químicos o cualquier combinación de los mismos. Varios componentes del medio pueden prepararse por separado y esterilizarse, y luego combinarse en el recipiente de fermentación. El medio de cultivo se puede amortiguar para ayudar a mantener un pH constante durante la fermentación.

[0126] Los parámetros del proceso que incluyen temperatura, oxígeno disuelto, pH, agitación, velocidad de aireación y densidad celular pueden monitorearse o controlarse durante el transcurso de la fermentación. Por ejemplo, la temperatura de un proceso de fermentación puede controlarse mediante una sonda de temperatura sumergida en el medio de cultivo. La temperatura del cultivo puede controlarse en el punto establecido regulando la temperatura de la camisa. El agua puede enfriarse en un enfriador externo y luego fluir hacia la torre de control del biorreactor y circular hacia la camisa a la temperatura requerida para mantener la temperatura de referencia en el recipiente.

[0127] Además, se puede controlar un parámetro de flujo de gas en un proceso de fermentación. Por ejemplo, los gases pueden fluir al medio a través de un rociador. Los gases adecuados para los métodos de esta divulgación pueden incluir aire comprimido, oxígeno y nitrógeno. El flujo de gas puede tener una tasa fija o regularse para mantener un punto de ajuste de oxígeno disuelto.

[0128] También se puede controlar el pH de un medio de cultivo. En ejemplos, el pH puede controlarse mediante una sonda de pH que se sumerge en el medio de cultivo dentro del recipiente. Si el control de pH está en efecto, el pH puede ajustarse mediante bombas de ácido y base que agregan cada solución al medio a la velocidad requerida. Las soluciones ácidas utilizadas para controlar el pH pueden ser ácido sulfúrico o ácido clorhídrico. Las soluciones base utilizadas para controlar el pH pueden ser hidróxido de sodio, hidróxido de potasio o hidróxido de amonio.

[0129] Además, el oxígeno disuelto puede controlarse en un medio de cultivo mediante una sonda de oxígeno disuelto sumergida en el medio de cultivo. Si la regulación del oxígeno disuelto está en vigor, el nivel de oxígeno puede ajustarse aumentando o disminuyendo la velocidad de agitación. El nivel de oxígeno disuelto también puede ajustarse aumentando o disminuyendo el caudal de gas. El gas puede ser aire comprimido, oxígeno o nitrógeno.

[0130] La velocidad de agitación también se puede controlar en un proceso de fermentación. En ejemplos, el motor agitador puede accionar un agitador. La velocidad del agitador puede establecerse a un régimen constante durante toda la fermentación o puede regularse dinámicamente para mantener un nivel de oxígeno disuelto establecido.

[0131] Además, la turbidez se puede controlar en un proceso de fermentación. En ejemplos, la densidad celular se puede medir utilizando una sonda de turbidez. Alternativamente, la densidad celular se puede medir tomando muestras del biorreactor y analizándolas en un espectrofotómetro. Además, las muestras pueden retirarse del biorreactor a intervalos de tiempo a través de un aparato de muestreo estéril. Las muestras pueden analizarse en busca de alcaloides producidos por las células huésped. Las muestras también pueden analizarse en busca de otros metabolitos y azúcares, el agotamiento de los componentes del medio de cultivo o la densidad de las células.

[0132] En otro ejemplo, un parámetro de materia prima puede controlarse durante un proceso de fermentación. En particular, materias primas que incluyen azúcares y otras fuentes de carbono, nutrientes y cofactores que pueden agregarse a la fermentación usando una bomba externa. También se pueden agregar otros componentes durante la fermentación, incluidos, entre otros, antiespumantes, sales, agentes quelantes, tensioactivos y líquidos orgánicos.

[0133] Cualquier técnica de optimización de codones conveniente para optimizar la expresión de polinucleótidos heterólogos en células huésped puede adaptarse para su uso en las células huésped objeto y los métodos, véase, por ejemplo, Gustafsson, C. et al. (2004) Trends Biotechnol, 22, 346-353.

[0134] El método en cuestión también puede incluir la adición de un compuesto de partida al cultivo celular. Cualquier método conveniente de adición puede adaptarse para su uso en los métodos en cuestión. El cultivo celular puede complementarse con una cantidad suficiente de los materiales de partida de interés (p. ej., como se describe en el presente documento), por ejemplo, una cantidad de mM a μM tal como entre aproximadamente 1-5 mM de un compuesto de partida. Se entiende que la cantidad de material de partida añadido, el momento y la velocidad de adición, la forma del material añadido, etc., pueden variar según diversos factores. El material de partida puede añadirse puro o predisuelto en un disolvente adecuado (p. ej., medio de cultivo celular, agua o un disolvente orgánico). El material de partida se puede agregar en forma concentrada (p. ej., 10 veces más que la concentración deseada) para minimizar la dilución del medio de cultivo celular tras la adición. El material de partida puede agregarse en uno o más lotes, o por adición continua durante un período de tiempo prolongado (por ejemplo, horas o días).

Métodos para aislar productos del medio de fermentación

[0135] Los métodos en cuestión también pueden incluir la recuperación de las enzimas y/o BIA de interés del cultivo celular. Cualquier método conveniente de separación y aislamiento (p. ej., métodos de cromatografía o métodos de precipitación) puede ser adaptado para uso en los métodos en cuestión para recuperar las enzimas y/o BIA de interés del cultivo celular. Pueden usarse métodos de filtración para separar las fracciones solubles de las insolubles del cultivo celular. En algunos casos, se pueden utilizar métodos de cromatografía líquida (p. ej., HPLC de fase inversa, exclusión por tamaño, cromatografía de fase normal) para separar el BIA de interés de otros componentes solubles del cultivo celular. En algunos casos, se pueden usar métodos de extracción (p. ej., extracción líquida, purificación basada en el pH, extracción en fase sólida, cromatografía de afinidad, intercambio iónico, etc.) para separar las enzimas y/o los BIA de interés de otros componentes del cultivo celular.

[0136] Los alcaloides producidos pueden aislarse del medio de fermentación utilizando métodos conocidos en la técnica. Se pueden realizar varios pasos de recuperación inmediatamente después (o en algunos casos, durante) la fermentación para la recuperación inicial del producto deseado. A través de estos pasos, los alcaloides (p. ej., BIA) pueden separarse de las células, los restos y desechos celulares y otros nutrientes, azúcares y moléculas orgánicas pueden permanecer en el medio de cultivo gastado. Este proceso puede usarse para producir un producto enriquecido con BIA.

[0137] En un ejemplo, se forma una corriente de producto que tiene un producto de alcaloide de bencilisoquinolina (BIA) proporcionando células de levadura manipuladas y una materia prima que incluye nutrientes y agua a un reactor por lotes. En particular, las células de levadura manipuladas pueden someterse a fermentación incubando las células de levadura manipuladas durante un período de tiempo de al menos aproximadamente 5 minutos para producir una solución que comprenda el producto BIA y el material celular. Una vez que las células de levadura manipuladas han sido sometidas a fermentación, se puede usar al menos una unidad de separación para separar el producto BIA del material celular para proporcionar la corriente de producto que comprende el producto BIA. En particular, la corriente de producto puede incluir el producto BIA así como componentes adicionales, como un medio de cultivo de levadura clarificado. Además, un producto BIA puede comprender uno o más BIA de interés, como uno o más compuestos BIA.

[0138] Se pueden usar diferentes métodos para eliminar células de un medio de biorreactor que incluya una enzima y/o BIA de interés. En ejemplos, las células pueden eliminarse por sedimentación a lo largo del tiempo. Este proceso de sedimentación puede acelerarse por enfriamiento o por la adición de agentes clarificantes como sílice. A continuación, el medio de cultivo gastado se puede sifonar desde la parte superior del reactor o las células se pueden decantar desde la base del reactor. Alternativamente, las células pueden eliminarse por filtración a través de un filtro, una membrana u otro material poroso. Las células también se pueden eliminar por centrifugación, por ejemplo, por centrifugación de flujo continuo o usando un extractor continuo.

[0139] Si algunas enzimas valiosas y/o BIA de interés están presentes dentro de las células, las células pueden permeabilizarse o lisarse y los desechos celulares pueden eliminarse mediante cualquiera de los métodos descritos anteriormente. Los agentes utilizados para permeabilizar las células pueden incluir, sin limitación, disolventes orgánicos (p. ej., DMSO) o sales (p. ej., acetato de litio). Los métodos para lisar las células pueden incluir la adición de tensioactivos como el dodecilsulfato de sodio o la rotura mecánica mediante molienda de perlas o sonicación.

[0140] Las enzimas y/o BIA de interés pueden extraerse del medio de cultivo agotado clarificado mediante extracción líquido-líquido mediante la adición de un líquido orgánico que es inmiscible con el medio de cultivo acuoso. En ejemplos, el uso de extracción líquido-líquido puede usarse además de otros pasos de procesamiento. Los ejemplos de líquidos orgánicos adecuados incluyen, entre otros, miristato de isopropilo, acetato de etilo, cloroformo, acetato de butilo, metilisobutilcetona, oleato de metilo, tolueno, alcohol oleico, butirato de etilo. El líquido orgánico se puede añadir desde un 10 % hasta un 100 % del volumen del medio acuoso.

[0141] En algunos casos, el líquido orgánico se puede agregar al comienzo de la fermentación o en cualquier momento durante la fermentación. Este proceso de fermentación extractiva puede aumentar el rendimiento de enzimas y/o BIA de interés de las células huésped mediante la eliminación continua de enzimas y/o BIA a la fase orgánica.

[0142] La agitación puede hacer que la fase orgánica forme una emulsión con el medio de cultivo acuoso. Los métodos para fomentar la separación de las dos fases en capas distintas pueden incluir, sin limitación, la adición de un desemulsionante o un agente de nucleación, o un ajuste del pH. La emulsión también se puede centrifugar para separar las dos fases, por ejemplo, mediante centrifugación continua en placa cónica.

[0143] Alternativamente, la fase orgánica se puede aislar del medio de cultivo acuoso para que se pueda eliminar físicamente después de la extracción. Por ejemplo, el disolvente se puede encapsular en una membrana.

[0144] En ejemplos, las enzimas y/o los BIA de interés pueden extraerse de un medio de fermentación usando métodos de adsorción. En ejemplos, los BIA de interés pueden extraerse del medio de cultivo agotado clarificado mediante la adición de una resina como Amberlite® XAD4 u otro agente que elimine los BIA por adsorción. A continuación, los BIA de interés pueden liberarse de la resina utilizando un disolvente orgánico. Los ejemplos de disolventes orgánicos adecuados incluyen, entre otros, metanol, etanol, acetato de etilo o acetona.

[0145] Los BIA de interés también pueden extraerse de un medio de fermentación usando filtración. A pH alto, los BIA de interés pueden formar un precipitado cristalino en el biorreactor. Este precipitado puede eliminarse directamente por filtración a través de un filtro, membrana u otro material poroso. El precipitado también puede recogerse por centrifugación y/o decantación.

[0146] Los métodos de extracción descritos anteriormente se pueden llevar a cabo in situ (en el biorreactor) o ex situ (p. ej., en un circuito externo a través del cual los medios fluyen fuera del biorreactor y entran en contacto con el agente de extracción, luego se recirculan de regreso al recipiente). Alternativamente, los métodos de extracción se pueden realizar después de que se termina la fermentación utilizando el medio clarificado extraído del recipiente del biorreactor.

Métodos para purificar productos de soluciones enriquecidas con alcaloides

[0147] Los pasos de purificación posteriores pueden implicar el tratamiento de la solución posterior a la fermentación enriquecida con productos BIA de interés usando métodos conocidos en la técnica para recuperar especies de productos individuales de interés de alta pureza.

[0148] En un ejemplo, los BIA de interés extraídos en una fase orgánica pueden transferirse a una solución acuosa. En algunos casos, el disolvente orgánico puede evaporarse mediante calor y/o vacío, y el polvo resultante puede disolverse en una solución acuosa de pH adecuado. En otro ejemplo, los BIA de interés pueden extraerse de la fase orgánica mediante la adición de una solución acuosa a un pH adecuado que promueva la extracción de los BIA de interés en la fase acuosa. A continuación, la fase acuosa se puede eliminar por decantación, centrifugación u otro método.

[0149] La solución que contiene BIA puede tratarse adicionalmente para eliminar metales, por ejemplo, tratándola con un agente quelante adecuado. La solución que contiene BIA de interés puede tratarse adicionalmente para eliminar otras impurezas, como proteínas y ADN, mediante precipitación. En un ejemplo, la solución que contiene BIA de interés se trata con un agente de precipitación apropiado tal como etanol, metanol, acetona o isopropanol. En un ejemplo alternativo, el ADN y la proteína pueden eliminarse mediante diálisis o mediante otros métodos de exclusión por tamaños que separan los alcaloides más pequeños de las macromoléculas biológicas contaminantes.

[0150] En otros ejemplos, la solución que contiene los BIA de interés se puede extraer a alta pureza mediante filtración continua de flujo cruzado utilizando métodos conocidos en la técnica.

[0151] Si la solución contiene una mezcla de BIA de interés, puede someterse a un tratamiento ácido-base para producir BIA individuales de especies de interés utilizando métodos conocidos en la técnica. En este proceso, el pH de la solución acuosa se ajusta para precipitar los BIA individuales.

[0152] Para preparaciones a pequeña escala de alta pureza, los BIA se pueden purificar en un solo paso mediante cromatografía líquida.

API de alcaloides derivados de levadura frente a API derivados de plantas

[0153] El medio de cultivo de levadura clarificado (MCLC) puede contener una pluralidad de impurezas. El medio de cultivo de levadura clarificado se puede deshidratar al vacío y/o calor para producir un polvo rico en alcaloides. Este producto es análogo al concentrado de paja de amapola (CPA) u opio, que se exporta de los países productores de amapola y lo compran los fabricantes de API. Para los fines de esta invención, ^c P^a es un ejemplo representativo de cualquier tipo de extracto de planta purificado a partir del cual el (los) producto(s) de alcaloides deseado(s) finalmente se puede purificar adicionalmente. La Tabla 4 y la Tabla 5 destacan las impurezas en estos dos productos que pueden ser específicas de MCLC o CPA o pueden estar presentes en ambos. Mientras que algunos BIA pueden tener un pigmento como impureza, otros BIA pueden clasificarse como pigmentos. En consecuencia, estos BIA pueden evaluarse en cuanto a impurezas basadas en impurezas no pigmentarias. Al analizar un producto de origen desconocido en busca de un subconjunto de estas impurezas, un experto en la técnica podría determinar si el producto se originó a partir de una levadura o un huésped de producción vegetal.

[0154] Los ingredientes farmacéuticos de grado API son moléculas altamente purificadas. Como tal, las impurezas que podrían indicar el origen de una planta o levadura de un API (como las enumeradas en la Tabla 4 y la Tabla 5) pueden no estar presentes en la etapa ^a P ⁱ del producto. De hecho, muchos de los productos API derivados de cepas de levadura de la presente invención pueden ser en gran medida indistinguibles de los API tradicionales derivados de plantas. En algunos casos, sin embargo, los compuestos alcaloides convencionales pueden estar sujetos a modificaciones químicas utilizando enfoques de síntesis química, que pueden aparecer como impurezas químicas en productos de origen vegetal que requieren dichas modificaciones químicas. Por ejemplo, la derivatización química a menudo puede dar como resultado un conjunto de impurezas relacionadas con los procesos de síntesis química. En ciertas situaciones, estas modificaciones pueden realizarse biológicamente en la plataforma de producción de levadura, evitando así que algunas de las impurezas asociadas con la derivación química estén presentes en el producto derivado de levadura. En particular, estas impurezas del producto derivado químico pueden estar presentes en un producto API que se produce usando procesos de síntesis química, pero pueden estar ausentes en un producto API que se produce usando un producto derivado de levadura. Alternativamente, si un producto derivado de levadura se mezcla con un producto derivado químicamente, las impurezas resultantes pueden estar presentes pero en menor cantidad de lo que se esperaría en un API que solo o principalmente contiene productos derivados químicamente. En este ejemplo, al analizar el producto API en busca de un subconjunto de estas impurezas, un experto en la técnica podría determinar si el producto se originó a partir de un huésped de producción de levadura o de la ruta de derivatización química tradicional.

[0155] Los ejemplos no limitativos de impurezas que pueden estar presentes en los API de morfinano derivados químicamente pero no en los API biosintetizados incluyen una impureza de codeína-0(6)-metil éter en codeína API; 8,14-dihidroxi-7,8-dihidrocodeinona en oxicodona API; y tetrahidrotebaína en API hidrocodona. La codeína-0(6)-metil éter puede formarse por sobremetilación química de la morfina. La 8,14-dihidroxi-7,8-dihidrocodeinona en API oxicodona puede formarse por sobreoxidación química de tebaína. Además, la tetrahidrotebaína en la hidrocodona API puede formarse por reducción química excesiva de tebaína.

[0156] Sin embargo, en el caso de que el compuesto derivado de levadura y el compuesto derivado de plantas se sometan ambos a modificación química a través de enfoques de síntesis química, se pueden esperar las mismas impurezas asociadas con el proceso de síntesis química en los productos. En tal situación, el material de partida (por ejemplo, MCLC o CPA) puede analizarse como se describe anteriormente.

Métodos de ingeniería de células huésped

[0157] También se incluyen métodos de ingeniería de células huésped con el fin de producir enzimas y/o BIA de interés. La inserción de ADN en las células huésped puede lograrse usando cualquier método conveniente. Los métodos se usan para insertar las secuencias de codificación heterólogas en las células huésped diseñadas de manera que las células huésped expresen funcionalmente las enzimas y conviertan los compuestos de partida de interés en enzimas producto y/o BIA de interés.

[0158] Se puede utilizar cualquier promotor conveniente en las células huésped modificadas genéticamente en cuestión y en los métodos. Los promotores que dirigen la expresión de las secuencias codificantes heterólogas pueden ser promotores constitutivos o promotores inducibles, siempre que los promotores estén activos en las células hospedantes manipuladas. Las secuencias codificantes heterólogas pueden expresarse a partir de sus promotores nativos, o pueden usarse promotores no nativos. Dichos promotores pueden tener una fuerza de baja a alta en el huésped en el que se usan. Los promotores pueden ser regulados o constitutivos. En ciertas formas de realización, se usan promotores que no están reprimidos por la glucosa, o que están reprimidos sólo levemente por la presencia de glucosa en el medio de cultivo. Los promotores de interés incluyen, entre otros, promotores de genes glicolíticos tales como el promotor del gen tsr de B. subtilis (que codifica la región promotora del gen de la fructosa bisfosfato aldolasa) o el promotor de la levadura S. cerevisiae que codifica el gen gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GPD, GAPDH o TDH3), el promotorADmde la levadura de panadería, los promotores inducidos por falta de fosfato como el promotor PHOS de la levadura, el promotor de la fosfatasa alcalina de B. licheniformis, el promotor inducible de la levadura promotores como Gal1-10, Gal1, GalL, GalS, promotor reprimible Met25, tetO y promotores constitutivos como promotor de gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GPD), promotor de alcohol deshidrogenasa (ADH), factor de elongación de traducción-1-promotora(TEF), promotor de citocromo c-oxidasa (CYC1), promotor de MRP7, etc. También se pueden usar vectores de expresión de levadura de replicación autónoma que contienen promotores inducibles por hormonas como glucocorticoides, esteroides y hormonas tiroideas e incluyen, entre otros, el elemento sensible a los glucorticoides (GRE) y el elemento sensible a la hormona tiroidea (TRE). Estos y otros ejemplos se describen en la Patente de EE. UU. N° 7.045.290. Pueden utilizarse vectores adicionales que contengan promotores constitutivos o inducibles, como factora, alcohol oxidasa y PGH. Además, cualquier combinación de promotor/potenciador (según la base de datos de promotores eucariotas EPDB) también podría usarse para impulsar la expresión de genes. Puede seleccionarse cualquier promotor apropiado conveniente para la célula huésped, p. ej., E. coli. También se puede usar la selección de promotores para optimizar la transcripción y, por lo tanto, los niveles de enzima para maximizar la producción mientras se minimizan los recursos energéticos.

[0159] Se puede utilizar cualquier vector conveniente en las células huésped modificadas genéticamente y en los métodos.

Los vectores de interés incluyen vectores para uso en levaduras y otras células. Los tipos de vectores de levadura se pueden dividir en 4 categorías generales: vectores integradores (YIp), vectores de alto número de copias que replican de forma autónoma (YEp o plásmidos de 2|j), vectores de bajo número de copias que replican de forma autónoma (YCp o plásmidos centroméricos) y vectores para la clonación de fragmentos grandes (YAC). El ADN del vector se introduce en células procariotas o eucariotas mediante cualquier técnica de transformación o transfección conveniente. Se puede usar ADN de otra fuente (por ejemplo, producto de ADN de doble cadena generado por PCR u oligonucleótidos de cadena simple o de cadena doble sintetizados) para diseñar la levadura mediante integración en el genoma. Cualquier evento de transformación individual puede incluir uno o varios ácidos nucleicos (vectores, fragmentos de ADN de cadena simple o doble) para modificar genéticamente la célula huésped.

UTILIDAD

[0160] Las células huésped manipuladas y los métodos de la invención, por ejemplo, como se describe anteriormente, encuentran uso en una variedad de aplicaciones. Las aplicaciones de interés incluyen, pero no se limitan a: aplicaciones de investigación y aplicaciones terapéuticas. Los métodos de la invención encuentran uso en una variedad de aplicaciones diferentes que incluyen cualquier aplicación conveniente en la que sea de interés la producción de enzimas y/o BIA.

[0161] Las células huésped modificadas por ingeniería genética en cuestión y los métodos encuentran uso en una variedad de aplicaciones terapéuticas. Las aplicaciones terapéuticas de interés incluyen aquellas aplicaciones en las que es de interés la preparación de productos farmacéuticos que incluyen BIA. Las células huésped manipuladas descritas aquí producen BIA de interés y enzimas de interés. La reticulina es un punto intermedio de ramificación principal de interés en la síntesis de BIA, incluidos los esfuerzos de ingeniería para producir productos finales como productos opioides. Las células huésped en cuestión se pueden utilizar para producir BIA de interés a partir de materiales de partida simples y económicos que pueden encontrar uso en la producción de BIA de interés, incluida la reticulina y los productos finales de BIA. Como tales, las células huésped en cuestión encuentran uso en el suministro de BIA terapéuticamente activos de interés.

[0162] En algunos casos, las células huésped manipuladas y los métodos encuentran uso en la producción de cantidades a escala comercial de BIA de las mismas donde la síntesis química de estos compuestos es de bajo rendimiento y no es un medio viable para la producción a gran escala. En ciertos casos, las células huésped y los métodos se utilizan en una instalación de fermentación que incluiría biorreactores (fermentadores) de, por ejemplo, 5.000-200.000 litros de capacidad que permiten la producción rápida de BIA de interés para productos terapéuticos. Dichas aplicaciones pueden incluir la producción a escala industrial de BIA de interés a partir de fuentes de carbono fermentables como celulosa, almidón y azúcares libres.

[0163] Las células huésped modificadas por ingeniería genética y los métodos en cuestión encuentran uso en una variedad de aplicaciones de investigación. Las células huésped objeto y los métodos pueden usarse para analizar los efectos de una variedad de enzimas en las rutas biosintéticas de una variedad de enzimas y/o BIA de interés. Además, las células huésped manipuladas pueden modificarse para producir enzimas y/o BIA de interés que encuentran uso en la prueba de bioactividad de interés en funciones terapéuticas aún no probadas. En algunos casos, la ingeniería de células huésped para incluir una variedad de secuencias de codificación heterólogas que codifican una variedad de enzimas aclara las rutas biosintéticas de alto rendimiento hacia enzimas y/o BIA de interés. En ciertos casos, las aplicaciones de investigación incluyen la producción de enzimas y/o BIA de interés para moléculas terapéuticas de interés que luego pueden modificarse químicamente o derivatizarse para obtener productos deseados o para la detección de mayores actividades terapéuticas de interés. En algunos casos, las cepas de células huésped se utilizan para detectar actividades enzimáticas que son de interés en tales vías, lo que puede conducir al descubrimiento de enzimas a través de la conversión de metabolitos BIA producidos en estas cepas.

[0164] Las células huésped modificadas por ingeniería genética y los métodos pueden usarse como una plataforma de producción para metabolitos especializados de plantas. Las células huésped y los métodos en cuestión se pueden utilizar como plataforma para el desarrollo de bibliotecas de fármacos, así como para el descubrimiento de enzimas vegetales. Por ejemplo, las células huésped modificadas y los métodos en cuestión pueden encontrar uso en el desarrollo de bibliotecas de fármacos basadas en productos naturales al tomar cepas de levadura que producen moléculas de andamiaje interesantes, como la protopina, y funcionalizar aún más la estructura del compuesto a través de biosíntesis combinatoria o por medios químicos. Al producir bibliotecas de medicamentos de esta manera, cualquier éxito potencial de medicamentos ya está asociado con un host de producción que es susceptible de cultivo y producción a gran escala. Como otro ejemplo, estas células huésped modificadas por ingeniería genética y estos métodos pueden encontrar uso en el descubrimiento de enzimas vegetales. Las células huésped en cuestión proporcionan un fondo limpio de metabolitos definidos para expresar bibliotecas EST de plantas para identificar nuevas actividades enzimáticas. Las células huésped y los métodos en cuestión proporcionan métodos de expresión y condiciones de cultivo para la expresión funcional y el aumento de la actividad de las enzimas vegetales en la levadura.

[0165] En ciertos casos, los productos BIA de interés son productos opioides, como tebaína, codeína, neopina, morfina, neomorfina, hidrocodona, oxicodona, hidromorfona, dihidrocodeína, 14-hidroxicodeína, dihidromorfina u oximorfona.

[0166] El medio de fermentación puede controlarse en cualquier momento conveniente antes y durante la fermentación mediante muestreo y análisis. Cuando se completa la conversión de los compuestos de partida en enzimas y/o productos BIA de interés, se puede detener la fermentación y se puede realizar la purificación de los productos BIA.

[0167] Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y una descripción completas de cómo fabricar y utilizar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni pretenden representar que los experimentos a continuación son todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (p. ej., cantidades, temperatura, etc.), pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio en peso, la temperatura está en grados centígrados y la presión es la atmosférica o cercana a ella.

Discusión de la lista de enzimas

[0168] Las células huésped pueden diseñarse para incluir una o más modificaciones (tales como dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, o incluso más modificaciones) que proporcionan la producción de BIA. de interés y/o enzimas de interés. La Tabla 2 proporciona una lista de ejemplos de genes sobre los que se puede actuar mediante una o más modificaciones para proporcionar la producción de BIA de interés y/o enzimas de interés en una célula huésped manipulada.

[0169] Las modificaciones de los genes que se proporcionan en la Tabla 2 pueden usarse para producir BIA de interés a partir de células huésped manipuladas que se suministran con un medio que contiene los nutrientes mínimos necesarios para el crecimiento. Este medio mínimo puede contener una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos, vitaminas y sales. Por ejemplo, las modificaciones de genes que se proporcionan en la Tabla 2 pueden usarse para producir BIA de interés a partir de células huésped manipuladas que se alimentan con azúcar. Además, las modificaciones de uno o más genes que se proporcionan en la Tabla 2 pueden usarse para aumentar los procesos biosintéticos de las células huésped que pueden diseñarse para la producción de fármacos.

[0170] Además, el uso de estas modificaciones para proporcionar la producción de BIA de interés y/o enzimas de interés en células huésped manipuladas no es fácilmente evidente a partir de la mera identificación de enzimas que pueden ser producidas por los genes. En particular, las rutas sintéticas que han sido reconstruidas en células huésped, tales como células de levadura, como se describe en este documento, comprenden una variedad de enzimas que no actúan juntas en la naturaleza dentro de un solo organismo. Además, algunas de las enzimas discutidas aquí no actúan para la biosíntesis de BIA en su contexto natural. Además, algunas de las enzimas descritas en el presente documento no se desarrollan para funcionar en células huésped particulares, tales como células de levadura, y no se desarrollan para funcionar juntas. En estos casos, no sería obvio que las enzimas mostrarían suficiente actividad en el contexto de la ruta BIA sintética en una célula huésped, como la levadura, para tener suficiente flujo a través de la ruta para producir productos finales BIA corriente abajo.

[0171] Por ejemplo, las enzimas vegetales a menudo son difíciles de expresar funcionalmente en huéspedes microbianos heterólogos, como la levadura. En muchos casos, las enzimas pueden estar mal plegadas, no localizadas correctamente dentro de la célula huésped y/o procesadas incorrectamente. Las diferencias en la traducción y procesamiento de proteínas entre la levadura y las plantas pueden conducir a estas enzimas que exhiben actividades sustancialmente reducidas a no detectables en la levadura huésped. Estos desafíos surgen comúnmente para las enzimas localizadas en la endomembrana, como los citocromos P450, que están fuertemente representados en las vías BIA. Incluso las actividades enzimáticas reducidas pueden representar un desafío sustancial para la ingeniería de levadura para producir BIA complejos, lo que requiere suficiente actividad en cada paso para garantizar una acumulación de alto nivel de los productos BIA deseados.

[0172] Además, hay enzimas/vías endógenas en algunas células huésped, como la levadura, que pueden actuar sobre muchos de los precursores tempranos en la vía BIA (es decir, intermedios de tirosina a norcoclaurina) y, por lo tanto, puede no ser evidente que habría suficiente flujo a través de la ruta heteróloga para lograr una producción sustancial de BIA dadas estas rutas endógenas competidoras. Por ejemplo, la ruta de Erlich (Hazelwood, et al. 2008. Appl. Environ. Microbiol. 74: 2259-66; Larroy, et al. 2003. Chem. Biol. Interact. 143-144: 229-38; Larroy, et al. al. 2002. Eur. J. Biochem.

269: 5738-45) en la levadura es la principal ruta endógena que actuaría para convertir muchos de los intermedios en la ruta BIA temprana en productos no deseados y desviar el flujo de la ruta sintética.

[0173] Además, muchas de las enzimas que se analizan en este documento, y como se proporciona en la Tabla 2, pueden funcionar bajo estrategias de regulación muy específicas, incluida la regulación espacial, en las plantas hospedantes nativas, que pueden perderse tras la transferencia a la levadura heteróloga hospedante. Además, las plantas presentan entornos bioquímicos muy diferentes a los de las células de levadura en los que las enzimas se desarrollan para funcionar, incluido el pH, el estado redox y las disponibilidades de sustrato, cosustrato, coenzima y cofactor. Dadas las diferencias en los entornos bioquímicos y las estrategias reguladoras entre los huéspedes nativos y los huéspedes de levadura heterólogos, no es obvio que las enzimas muestren actividades sustanciales en el contexto del entorno de la levadura y, además, no es obvio que trabajen juntas para dirigir simples precursores como el azúcar a compuestos BIA complejos. Mantener las actividades de las enzimas en la levadura huésped es particularmente importante ya que muchas de las vías tienen muchos pasos de reacción (>10), de modo que si estos pasos no son eficientes, no se esperaría la acumulación de los productos corriente abajo deseados.

[0174] Además, en los huéspedes vegetales nativos, los metabolitos asociados en estas rutas pueden localizarse en diferentes tipos de células y tejidos. En varios ejemplos, hay tipos de células que pueden especializarse para la biosíntesis y tipos de células que pueden sintetizarse para la acumulación de metabolitos. Este tipo de especialización celular puede perderse cuando se expresan las vías dentro de un huésped de levadura heterólogo y puede desempeñar un papel importante en el control de la toxicidad de estos metabolitos en las células. Por lo tanto, no es obvio que la levadura pueda diseñarse con éxito para biosintetizar y acumular estos metabolitos sin verse perjudicada por la toxicidad de estos compuestos.

[0175] Como un ejemplo, en los huéspedes de plantas nativas, se informa que la enzima BBE tiene una localización subcelular dinámica. En particular, la enzima BBE comienza inicialmente en el ER y luego se clasifica en la vacuola (Bird y Facchini. 2001. Planta. 213: 888-97). Se ha sugerido que la asociación ER de BBE en plantas (Alcantara, et al. 2005. Plant Physiol. 138: 173-83) proporciona el pH básico óptimo (pH ~8.8) para la actividad de BBE (Ziegler y Facchini. 2008. Annu. Rev. Plant Biol. 59: 735-69). Como otro ejemplo, existe evidencia de que la biosíntesis de sanguinarina ocurre en vesículas especializadas dentro de células vegetales (Amann, et al. 1986. Planta. 167: 310-20), pero solo algunos de los intermedios se acumulan en las vesículas. Esto puede ocurrir para secuestrarlos de otras actividades enzimáticas y/o efectos tóxicos.

[0176] Como otro ejemplo, las enzimas biosintéticas en la rama de la ruta del morfinano están todas localizadas en el floema, que es parte del tejido vascular en las plantas. En el floema, las enzimas de la ruta se pueden dividir en dos tipos de células: los elementos cribosos comunes a todas las plantas y el laticificador, que es un tipo de célula especializada presente solo en ciertas plantas que producen metabolitos secundarios especializados. Las enzimas aguas arriba (es decir, desde NCS hasta SalAT) se encuentran predominantemente en los elementos cribosos, y las enzimas corriente abajo (es decir, T6ODM, COR, CODM) se encuentran principalmente en el laticificador (Onoyovwe, et al. 2013. Plant Cell.

25: 4110-22). Además, se descubrió que los pasos finales en la vía biosintética de la noscapina tienen lugar en el laticificador (Chen y Facchini. 2014. Plant J. 77: 173-84). Se cree que esta compartimentación es muy importante para regular la biosíntesis mediante el aislamiento o el tráfico de intermediarios, proporcionando un pH óptimo y mejorando el suministro de cofactores, aunque la naturaleza del microambiente laticífero de la amapola aún está bajo investigación (Ziegler y Facchini. 2008. Annu. Rev. Plant Biol. 59: 735-69). Además, se predice que varias de las enzimas pueden funcionar como complejos multienzimáticos o canales metabólicos comunes al metabolismo secundario de la planta (Kempe, et al. 2009. Phytochemistry. 70: 579-89; Allen, et al. 2004. Nat. Biotechnol 22: 1559-66). Cuando se combinan enzimas biosintéticas de diferentes huéspedes y/o se expresan de forma recombinante en una célula de levadura heteróloga, no está claro que estos complejos o canales se formen como lo harían en el huésped nativo. En un ejemplo adicional, en Coptis japónica, la berberina se biosintetiza en los tejidos de la raíz y luego se acumula dentro del rizoma a través de la acción de proteínas transportadoras de cassettes de unión a ATP especializadas (Shitan, et al. 2013. Phytochemistry. 91: 109-16). En la adormidera, los alcaloides de morfinano se acumulan dentro del látex (citoplasma de las células laticíferas) (Martin, et al. 1967. Biochemistry. 6: 2355-63).

[0177] Además, incluso sin estas consideraciones, también se da el caso de que las enzimas vegetales para varios de los pasos en las vías descritas en el presente documento aún no se han caracterizado. Por ejemplo, aún no se ha caracterizado la conversión de la tirosina en el armazón del alcaloide de bencilisoquinolina primitivo norcoclaurina. Además, la conversión de (S)-reticulina a (R)-reticulina se ha caracterizado recientemente como se describe en este documento. Por lo tanto, para varios de los pasos en las rutas descritas en este documento, se produjeron esquemas biosintéticos alternativos reuniendo actividades enzimáticas que normalmente no ocurren juntas en la naturaleza para la biosíntesis de BIA o identificando nuevas actividades enzimáticas a partir de la información de la secuencia del genoma para usar en las vías de reconstrucción.

[0178] Por ejemplo, la conversión en dos pasos de tirosina en dopamina se puede lograr combinando al menos 5 enzimas de mamíferos y 1 enzima bacteriana, que no naturalmente ocurren juntos y no evolucionaron para funcionar en el contexto de esta vía o con enzimas vegetales. En estos casos, puede que no sea obvio utilizar estas enzimas para la biosíntesis de compuestos para los que no se desarrollaron en la naturaleza y que funcionarían eficazmente en el contexto de un huésped microbiano heterólogo y esta vía. Como otro ejemplo, se desconocía la enzima responsable de la conversión de (S)-reticulina en (R)-reticulina. Las enzimas novedosas, como se analiza en el presente documento, pueden realizar esta reacción de epimerización en la levadura y en el contexto de la vía BIA sintética. Como esto representa el descubrimiento de una nueva enzima, no habría sido obvio usar esta enzima en el contexto de esta ruta para la síntesis de esos compuestos BIA.

[0179] Los ejemplos de los genes que son objeto de modificaciones para producir BIA de interés y/o enzimas de interés se discuten a continuación. Además, los genes se analizan en el contexto de una serie de Figuras que ilustran vías que se utilizan para generar BIA de interés y/o enzimas de interés.

[0180] [TLK1] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima transcetolasa. La transcetolasa está codificada por el gen TKL1. En ejemplos, la transcetolasa cataliza la reacción de fructosa-6-fosfato gliceraldehído-3-fosfato ^ xilulosa-5-fosfato eritrosa-4-fosfato, como se indica en la FIG. 2. Una célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incluir la sobreexpresión constitutiva del gen TKL1 en la célula huésped modificada por ingeniería genética. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen TKL1 en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen TKL1. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen TKL1 dentro de la célula huésped modificada por ingeniería genética. El gen TKL1 puede derivar de Saccharomyces cerevisiae o de otra especie. En algunos ejemplos, el gen TKL1 puede ser 100 % similar al gen natural.

[0181] [ZWF1] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. La glucosa-6-fosfato deshidrogenasa está codificada por el gen ZWF1. En ejemplos, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa cataliza la reacción de glucosa-6-fosfato ^ 6-fosfogluconolactona, como se indica en la FIG. 2.

Se puede modificar una célula huésped modificada para eliminar la región codificante del gen ZWF1 en la célula huésped modificada. Alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para inhabilitar la funcionalidad del gen ZWF1, como por ejemplo mediante la introducción de una mutación inactivante.

[0182] [ARO₄] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato (DAHP) sintasa. La DAHP sintasa está codificada por el gen ARO₄. En ejemplos, la DAHP sintasa cataliza la reacción de eritrosa-4-fosfato ácido fosfoenolpirúvico ^ DAHP, como se hace referencia en la FIG. 2. Una célula huésped diseñada puede modificar el gen ARO₄ para incorporar una o más mutaciones que alivian la inhibición por retroalimentación. En particular, una mutación que alivia la inhibición por retroalimentación (por ejemplo, ARO₄FBR) puede incorporarse como una mutación dirigida a un gen ARO₄ nativo en el locus original; como una copia adicional introducida como integración genética en un locus separado; o como una copia adicional en un vector episomal tal como un plásmido centromérico o de 2 μm. El identificador "FBR" en la mutación ARO₄FBR se refiere a mutantes y mutaciones resistentes a la retroalimentación. La copia inhibida por retroalimentación de la enzima DAHP sintasa puede estar bajo una regulación transcripcional de levadura nativa, como cuando la célula huésped manipulada es una célula de levadura. Alternativamente, la copia inhibida por retroalimentación de la enzima DAHP sintasa puede introducirse en la célula huésped manipulada con regulación constitutiva o dinámica manipulada de la expresión de la proteína colocándola bajo el control de un promotor sintético. En algunos casos, el gen ARO₄ puede derivar de Saccharomyces cerevisiae. En algunos casos, el gen ARO₄ puede ser 100 % similar al gen natural. Los ejemplos de modificaciones en el gen ARO₄ incluyen una mutación resistente a la inhibición por retroalimentación, K₂29L o Q166K.

[0183] [ARO7] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima corismato mutasa. La corismato mutasa está codificada por el gen ARO7. En ejemplos, la corismato mutasa cataliza la reacción del chorismato ^ prefenato, como se hace referencia en la FIG. 2. Una célula huésped diseñada puede modificar el gen ARO7 para incorporar una o más mutaciones que alivian la inhibición por retroalimentación. En particular, una mutación que alivia la inhibición por retroalimentación (por ejemplo, ARO7 FBR) puede incorporarse como una mutación dirigida a un gen ARO7 nativo en el locus original; como una copia adicional introducida como integración genética en un locus separado; o como una copia adicional en un vector episomal tal como un plásmido centromérico o de 2 μm. El identificador "FBR" en la mutación ARO7 FBR se refiere a mutantes y mutaciones resistentes a la retroalimentación. La copia inhibida por retroalimentación de la enzima corismato mutasa puede estar bajo una regulación transcripcional de levadura nativa, como cuando la célula huésped manipulada es una célula de levadura. Alternativamente, la copia inhibida por retroalimentación de la enzima corismato mutasa puede introducirse en la célula huésped manipulada con regulación constitutiva o dinámica manipulada de la expresión de la proteína colocándola bajo el control de un promotor sintético. En algunos casos, el gen ARO7 puede derivar de Saccharomyces cerevisiae. En algunos casos, el gen ARO7 puede ser 100 % similar al gen natural. Los ejemplos de modificaciones en el gen ARO7 incluyen una mutación resistente a la inhibición por retroalimentación oT226I.

[0184] [ARO10] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima fenilpiruvato descarboxilasa. La fenilpiruvato descarboxilasa está codificada por el gen ARO10. En ejemplos, la fenilpiruvato descarboxilasa cataliza la reacción del hidroxifenilpiruvato ^ 4-hidroxifenilacetato (4HPA), como se indica en la FIG. 2. Una célula huésped modificada puede modificarse para incluir una sobreexpresión constitutiva del gen ARO10 en la célula huésped modificada. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen ARO10 en la célula huésped manipulada. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen ARO10. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen ARO10 dentro de la célula huésped modificada por ingeniería genética. El gen ARO10 puede derivar de Saccharomyces cerevisiae o de otra especie. En algunos ejemplos, el gen ARO10 puede ser 100 % similar al gen natural.

[0185] [ADH₂-7, SFA1] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de las enzimas alcohol deshidrogenasa. Las enzimas alcohol deshidrogenasa pueden estar codificadas por uno o más de los genes ADH₂, ADH3, ADH4, ADH5, ADH6, ADH7 y SFA1. En ejemplos, la alcohol deshidrogenasa cataliza la reacción de 4HPA ^ tirosol. Una célula huésped manipulada puede modificarse para eliminar la región codificante de uno o más de los genes ADH₂, ADH3, ADH4, ADH5, ADH6, A ^d H7 y SFA1 en la célula huésped manipulada. Alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para inhabilitar la funcionalidad de uno o más de los genes ADH₂, ADH3, ADH4, ADH5, ADH6, ADH7 y SFA1, por ejemplo mediante la introducción de una mutación inactivante.

[0186] [ALD2-6] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de las enzimas aldehido oxidasa. Las enzimas aldehído oxidasa pueden estar codificadas por uno o más de los genes ALD2, ALD3, ALD4, ALD5 y ALD6. En ejemplos, la aldehído oxidasa cataliza la reacción de 4HPA ^ ácido hidroxifenilacético. Una célula huésped manipulada puede modificarse para eliminar la región codificante de uno o más de los genes ALD2, ALD3, ALD4, ALD5 y ALD6 en la célula huésped manipulada. Alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para inhabilitar la funcionalidad de uno o más de los genes ALD2, ALD3, ALD4, ALD5 y ALD6, por ejemplo mediante la introducción de una mutación inactivante.

[0187] [ARO9] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima aminotransferasa aromática. La aminotransferasa aromática está codificada por el gen a RO9. En ejemplos, la aminotransferasa aromática cataliza la reacción de hidroxifenilpiruvato glutamato ^ tirosina alfa-cetogluterato, como se indica en la FIG. 2. Una célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incluir la sobreexpresión constitutiva del gen ARO9 en la célula huésped modificada por ingeniería genética. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen ARO9 en la célula huésped manipulada. En los ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen ARO9. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen ARO9 dentro de la célula huésped modificada por ingeniería genética. El gen ARO9 puede derivar de Saccharomyces cerevisiae o de otra especie. En algunos ejemplos, el gen ARO9 puede ser 100 % similar al gen natural.

[0188] [TYR] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima tirosinasa. La tirosinasa está codificada por el gen TYR. En ejemplos, la tirosinasa cataliza la reacción de la tirosina ^ L-DOPA, como se indica en la FIG. 2. En otros ejemplos, la tirosinasa cataliza la reacción de L-DOPA ^ dopaquinona. Una célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen TYR en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen TYR en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen TYR. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen TYR dentro de la célula huésped manipulada. El gen TYR puede derivar de Ralstonia solanacearum, Agaricus bisporus u otra especie. En algunos ejemplos, el gen TYR puede ser 100 % similar al gen natural.

[0189] [TyrH] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima tirosina hidroxilasa. La tirosina hidroxilasa está codificada por el gen TyrH. En ejemplos, la tirosina hidroxilasa cataliza la reacción de la tirosina ^ L-DOPA, como se hace referencia en las FIGS. 2 y 5. Se puede modificar una célula huésped modificada para incluir la expresión constitutiva del gen TyrH en la célula huésped modificada. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen TyrH en la célula huésped manipulada. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen TyrH. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen TyrH dentro de la célula huésped manipulada. El gen TyrH puede derivar de Homo sapiens, Rattus norvegicus, Mus musculus u otra especie. En algunos ejemplos, el gen TyrH puede ser 100 % similar al gen natural.

[0190] [DODC] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima L-DOPA descarboxilasa. La L-DOPA descarboxilasa está codificada por el gen DODC. En ejemplos, la L-DOPA descarboxilasa cataliza la reacción de L-DOPA ^ dopamina, como se hace referencia en las FIGS. 2 y 5. Una célula hospedante manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen DODC en la célula hospedante manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen DODC en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En los ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen DODC. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen DODC dentro de la célula huésped manipulada. El gen DODC puede derivar de Pseudomonas putida, Rattus norvegicus u otra especie. En algunos ejemplos, el gen DODC puede ser 100 % similar al gen natural.

[0191] [TYDC] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima tirosina/DOPA descarboxilasa. La tirosina/DOPA descarboxilasa está codificada por el gen TYDC. En ejemplos, tirosina/DOPA descarboxilasa cataliza la reacción de L-DOPA ^ dopamina, como se indica en la FIG. 2. Una célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen TYDC en la célula huésped modificada por ingeniería genética. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen TYDC en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen TYDC. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen TYDC dentro de la célula huésped manipulada. El gen TYDC puede derivar de Papaver somniferum o de otra especie. En algunos ejemplos, el gen TYDC puede ser 100 % similar al gen natural.

[0192] [MAO] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima monoaminooxidasa. La monoaminooxidasa está codificada por el gen MAO. En ejemplos, la monoamino oxidasa cataliza la reacción de la dopamina ^ 3,4-DHPA, como se indica en la FIG. 2. Una célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen MAO en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen MAO en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen MAO. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen MAO dentro de la célula huésped modificada por ingeniería genética. En algunos casos, el gen MAO puede tener codones optimizados para expresión en Saccharomyces cerevisiae. El gen MAO puede derivar de Escherichia coli, Homo sapiens, Micrococcus luteus u otra especie. En algunos ejemplos, el gen MAO puede ser un 77 % similar al gen natural.

[0193] [NCS] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima norcoclaurina sintasa. La norcoclaurina sintasa está codificada por el gen NCS. En ejemplos, la norcoclaurina sintasa cataliza la reacción de 4HPA dopamina ^ (S)-norcoclaurina, como se hace referencia en la FIG. 5. En particular, la FIG. 5 ilustra un esquema biosintético para la conversión de L-tirosina en reticulina a través de norcoclaurina, de acuerdo con formas de realización de la invención. FIG. 5 proporciona el uso de las enzimas TyrH, tirosina hidroxilasa; DODC, DOPA descarboxilasa; NCS, norcoclaurina sintasa, como se analiza en este documento; 6OMT, 6-O-metiltransferasa; CNMT, coclaurina N-metiltransferasa; CYP80B1, citocromo P450 80B1; CPR, citocromo P450 NADPH reductasa; 4'OMT, 3'hidroxi-N-metilcoclaurina 4'-O-metiltransferasa. L-DOPA, L-3,4-dihidroxifenilalanina; y 4-HPA, 4-hidroxifenilacetilaldehído. De las enzimas que se ilustran en la FIG. 5, 4-HPA y L-tirosina se sintetizan naturalmente en la levadura. Todos los demás metabolitos que se muestran no se producen naturalmente en la levadura. Además, aunque se representa que TyrH cataliza la conversión de L-tirosina en L-DOPA, también se pueden usar otras enzimas para realizar este paso como se describe en la especificación. Por ejemplo, también se pueden usar tirosinasas para realizar la conversión de L-tirosina en L-DOPA. Además, también se pueden usar otras enzimas como las oxidasas del citocromo P450 para realizar la conversión de L-tirosina en L-DOPA. Tales enzimas pueden exhibir actividad oxidasa en compuestos precursores de BIA relacionados que incluyen L-DOPA y L-tirosina.

[0194] Además, la norcoclaurina sintasa cataliza la reacción de 3,4-DHPA dopamina ^ (S)-norlaudanosolina, como se indica en la FIG. 6. En particular, la FIG. 6 ilustra un esquema biosintético para la conversión de L-tirosina en reticulina a través de norlaudanosolina, de acuerdo con formas de realización de la invención. FIG. 6 proporciona el uso de las enzimas TyrH, tirosina hidroxilasa; DODC, DOPA descarboxilasa; maoA, monoamino oxidasa; NCS, norcoclaurina sintasa; 6OMT, 6-O-metiltransferasa; CNMT, coclaurina N-metiltransferasa; 4'OMT, 3'hidroxi-N-metilcoclaurina 4'-O-metiltransferasa. L-DOPA, L-3,4-dihidroxifenilalanina; y 3,4-DHPA, 3,4-dihidroxifenilacetaldehído. De las enzimas que se ilustran en la FIG. 6, la L-tirosina se sintetiza naturalmente en la levadura. Otros metabolitos que se muestran en la FIG.

6 no se producen naturalmente en la levadura.

[0195] Una célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen NCS en la célula huésped modificada por ingeniería genética. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen NCS en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen NCS. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen NCS dentro de la célula huésped manipulada. Además, la norcoclaurina sintasa puede tener un truncamiento N-terminal. En algunos casos, el gen NCS puede tener codones optimizados para expresión en Saccharomyces cerevisiae. El gen NCS puede derivar de Coptis japonica, Papaver somniferum, Papver bracteatum, Thalicitum flavum, Corydalis saxicola u otra especie. En algunos ejemplos, el gen NCS puede ser un 80 % similar al gen natural.

[0196] [6OMT] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima norcoclaurina 6-O-metiltransferasa. La norcoclaurina 6-O-metiltransferasa está codificada por el gen 6OMT. En algunos ejemplos, la norcoclaurina 6-O-metiltransferasa cataliza la reacción de la norcoclaurina ^ coclaurina, como se hace referencia en la FIG.5. En otros ejemplos, la norcoclaurina 6-O-metiltransferasa cataliza la reacción de la norlaudanosolina ^ 3'hidroxicoclaurina, así como otras reacciones detalladas en el presente documento, como las proporcionadas en la FIG. 6. Además, la célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen 6OMT en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen 6OMT en la célula huésped manipulada. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen 6OMt . Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen 6OMT dentro de la célula huésped manipulada. El gen 6OMT puede derivar de P. somniferum, T. flavum, Coptis japonica u otra especie. En algunos ejemplos, el gen 6OMT puede ser 100 % similar al gen natural.

[0197] [CNMT] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima coclaurina W-metiltransferasa. La coclaurina-W-metiltransferasa está codificada por el gen CNMT. En algunos ejemplos, la coclaurina N-metiltransferasa cataliza la reacción de la coclaurina ^ N -metilcoclaurina, como se indica en la FIG. 5. En otros ejemplos, la enzima coclaurina-N-metiltransferasa puede catalizar la reacción de 3'hidroxicoclaurina ^ 3'hidroxi N-metilcoclaurina. En otros ejemplos, la coclaurina-N-metiltransferasa puede catalizar otras reacciones detalladas en el presente documento, como las proporcionadas en la FIG. 6. Además, la célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen CNMT en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen CNMT en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen CNMT. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen CNMT dentro de la célula huésped modificada por ingeniería genética. El gen CNMT puede derivar de P. somniferum, T. flavum, Coptisjaponica u otra especie. En algunos ejemplos, el gen CNMT puede ser 100 % similar al gen natural.

[0198] [4'OMT] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima 4'-O-metiltransferasa. La 4'-0-metiltransferasa está codificada por el gen 4'OMT. En algunos ejemplos, la 4'-O-metiltransferasa cataliza la reacción de la 3'-hidroxi-N-metilcoclaurina ^ reticulina, como se hace referencia en la FIG. 5. En otros ejemplos, la 4'-0-metiltransferasa cataliza otras reacciones detalladas en el presente documento, como las proporcionadas en la FIG. 6. Además, la célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen 4'OMT en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen 4'OMT en la célula huésped manipulada. En los ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen 4'OMT. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen 4'OMT dentro de la célula huésped manipulada. El gen 4'OMT puede derivar de P. somniferum, T. flavum, Coptisjaponica u otra especie. En algunos ejemplos, el gen 4'OMT puede ser 100 % similar al gen natural.

[0199] [CYP80B1] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima citocromo P45080B1. El citocromo P45080B1 está codificado por el gen CYP80B1. En ejemplos, el citocromo P45080B1 cataliza la reacción de N-metilcoclaurina ^ 3'-hidroxi-N-metilcoclaurina, como se indica en la FIG. 5. Se puede modificar una célula huésped modificada para incluir la expresión constitutiva del gen 80B1 del citocromo P450 en la célula huésped modificada. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen del citocromo P45080B1 en la célula huésped manipulada. En ejemplos, la célula huésped diseñada por ingeniería genética puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen 80B1 del citocromo P450. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen del citocromo P45080B1 dentro de la célula huésped manipulada. En algunos casos, el gen CYP80B1 puede tener codones optimizados para la expresión en Saccharomyces cerevisiae. El gen del citocromo P45080B1 puede derivar de P. somniferum, E. californica, T. flavum u otra especie. En algunos ejemplos, el gen P45080B1 puede ser un 77 % similar al gen natural.

[0200] [FOL2] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima GTP ciclohidrolasa. La GTP ciclohidrolasa está codificada por el gen FOL2. En algunos ejemplos, GTP ciclohidrolasa cataliza la reacción de GTP ^ trifosfato de dihidroneopterina, como se indica en la FIG. 1. La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la sobreexpresión constitutiva del gen FOL2 en la célula huésped manipulada. La célula huésped manipulada también puede modificarse para incluir regulación nativa. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen FOL2 en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En los ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen FOL2. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen FOL2 dentro de la célula huésped modificada por ingeniería genética. El gen FOL2 puede derivar de Saccharomyces cerevisiae, Homo sapiens, Mus musculus u otra especie. En algunos ejemplos, el gen FOL2 puede ser 100 % similar al gen natural.

[0201] [PTPS] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima 6-piruvoil tetrahidrobiopterina (PTP) sintasa. La piruvoil tetrahidrobiopterina sintasa está codificada por el gen PTPS. En algunos ejemplos, la 6-piruvoil tetrahidrobiopterina sintasa cataliza la reacción del trifosfato de dihidroneopterina ^ PTP, como se hace referencia en la FIG. 1. La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen PTPS en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen PTPS en la célula huésped manipulada. En los ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen PTPS. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen PTPS dentro de la célula huésped manipulada. En algunos casos, el gen PTPS puede tener codones optimizados para expresión en Saccharomyces cerevisiae. El gen PTPS puede derivar de Rattus norvegicus, Homo sapiens, Mus musculus u otra especie. En algunos ejemplos, el gen PTPS puede ser un 80 % similar al gen natural.

[0202] [SepR] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima sepiapterina reductasa. La sepiapterina reductasa está codificada por el gen SepR. En algunos ejemplos, la sepiapterina reductasa cataliza la reacción de PTP ^ BH4, como se hace referencia en la FIG. 1. La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen SepR en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen SepR en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen SepR. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen SepR dentro de la célula huésped modificada por ingeniería genética. En algunos casos, el gen SepR puede tener codones optimizados para expresión en Saccharomyces cerevisiae. El gen SepR puede derivar de Rattus norvegicus, Homo sapiens, Mus musculus u otra especie. En algunos ejemplos, el gen SepR puede ser un 72 % similar al gen natural.

[0203] [PCD] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima 4ahidroxitetrahidrobiopterina (pterin-4a-carbinolamina) deshidratasa. La 4a-hidroxitetrahidrobiopterina deshidratasa está codificada por el gen PCD. En algunos ejemplos, la 4a-hidroxitetrahidrobiopterina deshidratasa cataliza la reacción de la 4a-hidroxitetrahidrobiopterina ^ H₂O dihidropteridina quinonoide, como se indica en la FIG. 1. La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen PCD en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen PCD en la célula huésped manipulada. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen PCD. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen PCD dentro de la célula huésped manipulada. En algunos casos, el gen PCD puede tener codones optimizados para expresión en Saccharomyces cerevisiae. El gen PCD puede derivar de Rattus norvegicus, Homo sapiens, Mus musculus u otra especie. En algunos ejemplos, el gen PCD puede ser un 79 % similar al gen natural.

[0204] [QDHPR] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima quinonoide dihidropteridina reductasa. La quinonoide dihidropteridina reductasa está codificada por el gen QDHPR. En algunos ejemplos, la quinonoide dihidropteridina reductasa cataliza la reacción de la quinonoide dihidropteridina --> BH4, como se indica en la FIG. 1. La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen QDHPR en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen QDHPR en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen QDHPR. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen QDHPR dentro de la célula huésped manipulada. En algunos casos, el gen QDHPR puede tener codones optimizados para la expresión en Saccharomyces cerevisiae. El gen QDHPR puede derivar de Rattus norvegicus, Homo sapiens, Mus musculus u otra especie. En algunos ejemplos, el gen QDHPR puede ser un 75 % similar al gen natural.

[0205] [DHFR] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima dihidrofolato reductasa. La dihidrofolato reductasa está codificada por el gen DHFR. En algunos ejemplos, la dihidrofolato reductasa cataliza la reacción de 7,8-dihidrobiopterina (BH₂) ^ 5,6,7,8-tetrahidrobiopterina (BH4), como se indica en la FIG. 1. Esta reacción puede ser útil para recuperar BH4 como cosustrato para la conversión de tirosina en L-DOPA, como se ilustra en la FIG. 5. La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen DHFR en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen DHFR en la célula huésped manipulada. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen DHFR. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen DHFR dentro de la célula huésped manipulada. En algunos casos, el gen DHFR puede tener codones optimizados para expresión en Saccharomyces cerevisiae. El gen DHFR puede derivar de Rattus norvegicus, Homo sapiens u otra especie. En algunos ejemplos, el gen DHFR puede ser un 77 % similar al gen natural.

[0206] [CYP-COR] Como se discutió anteriormente con respecto a la epimerización de 1-BIA, la célula huésped diseñada puede modificar la expresión de una epimerasa BIA. La epimerasa BIA está codificada por el gen CYP-COR (p. ej., el gen CYP82Y2-COR). En algunos ejemplos, CYP-COR también puede denominarse DRS-DRR. En algunos ejemplos, la epimerasa BIA cataliza la conversión de (S)-1-BIA ^ (R)-1-BIA, como se indica en la FIG. 7. En particular, la FIG. 7 ilustra un esquema biosintético para la conversión de L-tirosina en alcaloides de morfinano, de acuerdo con formas de realización de la invención. FIG. 7 proporciona el uso de las enzimas CPR, citocromo P450 reductasa; CYP-COR, fusión similar a la codeinona reductasa del citocromo P450 CYP82Y1-fike; SalSyn, salutaridina sintasa; SalR, salutaridina reductasa; SalAT, salutaridinol 7-O-acetiltransferasa; T6ODM, tebaína 6-O-desmetilasa; COR, codeinona reductasa; y CODM, codeína-O-desmetilasa.

[0207] La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen CYP-COR en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen CYP-COR en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen CYP-COR. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen CYP-COR dentro de la célula huésped modificada por ingeniería genética. El gen CYP-COR puede derivar de Papaver bracteatum, Papaver somniferum, Papaver setigerum, Chelidonium majus u otra especie. En algunos ejemplos, el gen CYP-COR puede ser un 77 % similar al gen natural.

[0208] [CPR] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima citocromo P450 reductasa. La citocromo P450 reductasa está codificada por el gen CPR. En algunos ejemplos, la citocromo P450 reductasa cataliza la reacción de (R)-reticulina ^ salutaridina, como se hace referencia en la FIG. 7. Además, la citocromo P450 reductasa cataliza otras reacciones como las descritas en las FIGs. a lo largo de la aplicación. La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen CPR en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen CPR en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen CPR. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen CPR dentro de la célula huésped modificada por ingeniería genética. El gen CPR puede derivar de E. californica, P. somniferum, H. sapiens, S. cerevisiae, A. thaliana u otra especie. En algunos ejemplos, el gen CPR puede ser 100 % similar al gen natural.

[0209] [SalSyn] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima salutaridina sintasa. La salutaridina sintasa está codificada por el gen SalSyn. En algunos ejemplos, la salutaridina sintasa cataliza la reacción de (R)-reticulina ^ salutaridina, como se hace referencia en la FIG. 7. La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen SalSyn en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen SalSyn en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En los ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen SalSyn. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen SalSyn dentro de la célula huésped manipulada. En algunos casos, el gen SalSyn puede tener codones optimizados para la expresión en Saccharomyces cerevisiae. En algunos ejemplos, SalSyn puede modificarse en el extremo N-terminal. El gen SalSyn puede derivar de Papaver somniferum, Papaver spp, Chelidonium majus u otra especie. En algunos ejemplos, el gen SalSyn puede ser un 78 % similar al gen natural.

[0210] [SaIR] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima salutaridina reductasa. La salutaridina reductasa está codificada por el gen SalR. En algunos ejemplos, la salutaridina reductasa cataliza reversiblemente la reacción de salutaridinol ^ salutaridina, como se hace referencia en la FIG. 7. La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen SalR en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen SalR en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen SalR. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen SalR dentro de la célula huésped modificada por ingeniería genética. En algunos casos, el gen SalR puede tener codones optimizados para expresión en Saccharomyces cerevisiae. El gen SalR puede derivar de Papaver somniferum, Papaver bracteatum, Papaver spp., Chelidonium majus u otra especie. En algunos ejemplos, el gen SalR puede ser del 80 al 100 % similar al gen natural.

[0211] [SalAT] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima acetil-CoA:salutaridinol 7-O-acetiltransferasa. La acetil-CoA:salutaridinol 7-O-acetiltransferasa está codificada por el gen SalAT. En algunos ejemplos, acetil-CoA:salutaridinol 7-O-acetiltransferasa cataliza la reacción de acetil-CoA salutaridinol ^ CoA 7-O-acetilsalutaridinol, como se indica en la FIG. 7. La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen SalAT en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen SalAT en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen SalAT. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen SalAT dentro de la célula huésped modificada por ingeniería genética. En algunos casos, el gen SalAT puede tener codones optimizados para la expresión en Saccharomyces cerevisiae. El gen SalAT puede derivar de Papaver somniferum, Papaver bracteatum, Papaver orientate, Papaver spp. u otra especie. En algunos ejemplos, el gen SalAT puede ser 77-80 % similar al gen natural.

[0212] [T6ODM] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima tebaína 6-O-desmetilasa. La tebaína 6-O-desmetilasa está codificada por el gen T6ODM. En algunos ejemplos, la tebaína 6-O-desmetilasa cataliza la reacción de la tebaína ^ neopinona, como se hace referencia en la FIG. 7. Una vez que se ha producido la neopinona, la neopinona puede convertirse en codeinona. La conversión de neopinona ^ codeinona puede ocurrir espontáneamente. Alternativamente, la conversión de neopinona ^ codeinona puede ocurrir como resultado de una reacción catalizada. En otros ejemplos, la enzima T6ODM puede catalizar la O-desmetilación de sustratos distintos de la tebaína. Por ejemplo, T6ODM puede O-desmetilar oripavina para producir morfinona. Alternativamente, T6ODM puede catalizar la O-desmetilación de BIA dentro de las clases de 1-bencilisoquinolina, protoberberina o protopina, como papaverina, canadina y alocriptopina, respectivamente. La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen T6ODM en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen T6ODM en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen T6ODM. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen T6ODM dentro de la célula huésped modificada por ingeniería genética. En algunos casos, el gen T6ODM puede tener codones optimizados para la expresión en Saccharomyces cerevisiae. El gen T6ODM puede derivar de Papaver somniferum u otra especie. En algunos ejemplos, el gen T6ODM puede ser un 76,2 % similar al gen natural.

[0213] [COR] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima codeinona reductasa. La codeinona reductasa está codificada por el gen COR. En algunos ejemplos, la codeinona reductasa cataliza la reacción de codeinona a codeína, como se indica en la FIG. 7. En algunos casos, la codeinona reductasa puede catalizar la reacción de neopinona a neopina. En otros ejemplos, la COR puede catalizar la reducción de otros morfinanos, incluidos hidrocodona ^ dihidrocodeína, 14-hidroxicodeinona ^ 14-hidroxicodeína e hidromorfona ^ dihidromorfina. La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen COR en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen COR en la célula huésped manipulada. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen COR. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen COR dentro de la célula huésped modificada por ingeniería genética. En algunos casos, el gen COR puede tener codones optimizados para expresión en Saccharomyces cerevisiae. Adicional o alternativamente, el gen COR puede modificarse con la adición de secuencias dirigidas a mitocondrias, vacuolas, retículo endoplásmico o una combinación de los mismos. El gen COR puede derivar de Papaver somniferum u otra especie. En algunos ejemplos, el gen COR puede seR76-78 % similar al gen natural. En ejemplos, el gen COR puede ser 76,8 %, 77,0 %, 77,3 % o 77,7 % similar al gen natural.

[0214] [CODM] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima codeína Odesmetilasa. La codeína O-desmetilasa está codificada por el gen CODM. En algunos ejemplos, la codeína O-desmetilasa cataliza la reacción de codeína a morfina, como se indica en la FIG. 7. La codeína O-desmetilasa también puede catalizar la reacción de neopina a neomorfina. La codeína O-desmetilasa también puede catalizar la reacción de tebaína a oripavina. En otros ejemplos, CODM puede catalizar la O-desmetilación de BIA dentro de las clases de 1-bencilisoquinolina, aporfina y protoberberina tales como reticulina, isocoridina y scoulerina, respectivamente. En otros ejemplos, la enzima CODM puede catalizar una reacción de O,O-desmetilenación para escindir las estructuras del puente metilendioxi en las protopinas. La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen CODM en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen CODM en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen CODM. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen CODM dentro de la célula huésped manipulada. En algunos casos, el gen CODM puede tener codones optimizados para expresión en Saccharomyces cerevisiae. Adicional o alternativamente, el gen CODM puede modificarse con la adición de secuencias dirigidas a las mitocondrias. El gen CODM puede derivar de Papaver somniferum, Papaver spp. u otra especie. En algunos ejemplos, el gen CODM puede ser un 75 % similar al gen natural. En ejemplos, el gen CODM puede ser un 75,2 % similar al gen natural.

[0215] [BBE] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima puente de berberina. La enzima puente de berberina está codificada por el gen BBE. En algunos ejemplos, la enzima puente de berberina cataliza la reacción de (SJ-reticulina ^ (SJ-scoulerina, como se indica en la FIG. 8. FIG. 8 ilustra un esquema biosintético para la conversión de L-tirosina en alcaloides de protoberberina, de acuerdo con formas de realización de la invención. En particular, la FIG. 8 proporciona el uso de las enzimas BBE, enzima puente de berberina; S9OMT, escoulerina 9-O-metiltransferasa; c As , canadina sintasa; RCP, citocromo P450 reductasa; y STOX, tetrahidroprotoberberina oxidasa. La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen BBE en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen BBE en la célula huésped manipulada. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen BBE. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen BBE dentro de la célula huésped manipulada. El gen BBE puede derivar de Papaver somniferum, Argemone mexicana, Eschscholzia californica, Berberís stolonifera, Thalictrum flavum subsp. glaucum, Coptis japonica, Papaver spp. u otra especie. En algunos ejemplos, el gen BBE puede ser 99 % similar al gen natural.

[0216] [S9OMT] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima S-adenosil-L-metionina:(SJ-scoulerina 9-O-metiltransferasa. La S-adenosil-L-metionina:(SJ-escoulerina 9-Ometiltransferasa está codificada por el gen S9OMT. En algunos ejemplos, S-adenosil-L-metionina:(SJ-scoulerina 9-0-metiltransferasa cataliza la reacción de S-adenosil-L-metionina (SJ-scoulerina ^ S- adenosil-L-homocisteína (SJ-tetrahidrocolumbamina, como se indica en la FIG. 8. La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen S9OMT en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen S9OMT en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen S9OMT. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen S9OMT dentro de la célula huésped modificada por ingeniería genética. En algunos casos, el gen S9OMT puede tener codones optimizados para expresión en Saccharomyces cerevisiae. El gen S9OMT puede derivar de Thalictrum flavum subsp. glaucum, Coptis japónica, Coptis chinensis, Papaver somniferum, Thalictrum spp., Coptis spp., Papaver spp. u otra especie. En algunos ejemplos, el gen S9OMT puede ser 100 % similar al gen natural. En ejemplos, el gen S9OMT puede ser un 80 % similar al gen natural.

[0217] [CAS] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima (SJ-canadina sintasa. La (Sj-canadina sintasa está codificada por el gen CAS. En algunos ejemplos, la (SJ-canadina sintasa cataliza la reacción de (SJ-tetrahidrocolumbamina ^ (SJ-canadina, como se indica en la FIG. 8. La célula huésped manipulada puede modificarse para expresar el gen CAS en la célula huésped manipulada. La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen CAS en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen CAS en la célula huésped manipulada. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen CAS. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen CAS dentro de la célula huésped manipulada. El gen CAS puede derivar de Thalictrum flavum subsp. glaucum, Coptis japonica, Thalictrum spp., Coptis spp. u otra especie. En algunos ejemplos, el gen CAS puede ser 100 % similar al gen natural.

[0218] [STOX] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima (S)-tetrahidroprotoberberina oxidasa. La (SJ-tetrahidroprotoberberina oxidasa está codificada por el gen STOX. En algunos ejemplos, la (S)-tetrahidroprotoberberina oxidasa cataliza la reacción de ('S)-tetrahidroberberina 2 O 2 ^ berberina 2 H₂O2, como se indica en la FIG. 8. La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen STOX en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen STOX en la célula huésped manipulada. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen STOX. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen STOX dentro de la célula huésped modificada por ingeniería genética. En algunos ejemplos, STOX puede modificarse en el extremo N-terminal. En algunos casos, el gen STOX puede tener codones optimizados para la expresión en Saccharomyces cerevisiae. El gen STOX puede derivar de Berberis wilsonae, Coptis japonica, Berberís spp., Coptis spp. u otra especie. En algunos ejemplos, el gen STOX puede ser un 78 % similar al gen natural.

[0219] [TNMT] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima tetrahidroprotoberberina-A-metiltransferasa. La tetrahidroprotoberberina-N-metiltransferasa está codificada por el gen TNMT. En algunos ejemplos, la tetrahidroprotoberberina-N-metiltransferasa cataliza la reacción de canadina ^ N-metilcanadina, como se indica en la FIG. 9. FIG. 9 ilustra un esquema biosintético para la conversión de L-tirosina en noscapina, noscapinoide y ftalideisoquinolina, de acuerdo con formas de realización de la invención. En particular, la FIG.

9 proporciona el uso de las enzimas BBE, enzima puente de berberina; S9OMT, escoulerina 9-O-metiltransferasa; CAS, canadina sintasa; RCP, citocromo P450 reductasa; TNMT, tetrahidroprotoberberina cis-N-metiltransferasa; CYP82Y1, N-metilcanadina 1-hidroxilasa; CYP82X2, 1-hidroxi-N-metilcanadina 13-hidroxilasa; ATI, 1,13-dihidroxi-N-metilcandina 13-O-acetiltransferasa; CYP82X1, 4'-0-desmetil-3-0-acetilpapaveroxina sintasa; CXE1, narcotina hemiacetal sintasa; NOS (o SDR1), noscapina sintasa; MT2, narcotolina-4'-0-metiltransferasa 1; MT3, narcotolina-4'-0-metiltransferasa 2; y 6OMT, 6-O-metiltransferasa.

[0220] En otros ejemplos, la tetrahidroprotoberberina-N-metiltransferasa cataliza la reacción de estilopina ^ cis N-metilestilopina, como se indica en la FIG. 10. FIG. 10 ilustra un esquema biosintético para la conversión de L-tirosina en alcaloides de sanguinarina y benzofenantridina, de acuerdo con formas de realización de la invención. En particular, la FIG. 10 proporciona el uso de las enzimas BBE, enzima puente de berberina; CFS, queilantifolina sintasa; STS, estilopina sintasa; TNMT, tetrahidroberberina N-metiltransferasa; MSH, cis-N-metilestilopina 14-hidroxilasa; P6H, protopina 6-hidroxilasa; y DBOX, dihidrobenzofenantrida oxidasa. La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen TNMT en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen TNMT en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen TNMT. Además o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento de promotor fuerte para la sobreexpresión del gen TNMT dentro de la célula huésped manipulada. En algunos casos, el gen TNMT puede tener codones optimizados para expresión en Saccharomyces cerevisiae. El gen TNMT puede derivar de Papaver somniferum, Eschscholzia californica, Papaverbracteatum, Argemone mexicana u otra especie. En algunos ejemplos, el gen TNMT puede ser 100 % similar al gen natural. En ejemplos, el gen TNMT puede ser un 81 % similar al gen natural.

[0221] [CYP82Y1] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima N-metilcanadina 1-hidroxilasa. La W-metilcanadina 1-hidroxilasa está codificada por el gen CYP82Y1. En algunos ejemplos, la W-metilcanadina 1-hidroxilasa cataliza la reacción de W-metilcanadina ^ 1-hidroxi-W-metilcanadina, como se indica en la FIG. 9. La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen CYP82Y1 en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen CYP82Y1 en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen CYP82Y1. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen CYP82Y1 dentro de la célula huésped manipulada. En algunos casos, el gen CYP82Y1 puede tener codones optimizados para la expresión en Saccharomyces cerevisiae. En algunos ejemplos, el CYP82Y1 puede modificarse en el extremo N-terminal. El gen CYP82Y1 puede derivar de Papaver somniferum, Papaver spp., Plantago arenaria, Rauwolfia heterophylla, Adlumia fungosa, Hydrastis canadensis, Stylomecon heterophylla, Hypecoum u otra especie. En algunos ejemplos, el gen CYP82Y1 puede ser 70-78 % similar al gen natural.

[0222] [CYP82X2] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima 1-hidroxi-N-metilcanadina 13-hidroxilasa. La 1-hidroxi-N-metilcanadina 13-hidroxilasa está codificada por el gen CYP82X2. En algunos ejemplos, la 1-hidroxi-N-metilcanadina 13-hidroxilasa cataliza la reacción de 1-hidroxi-W-metilcanadina ^ 1-hidroxi-N-metilofiocarpina (es decir, 1,13-dihidroxi-W-metilcanadina), como se indica en la FIG. 9. La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen CYP82X2 en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen CYP82X2 en la célula huésped manipulada. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen CYP82X2. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen CYP82X2 dentro de la célula huésped manipulada. En algunos casos, el gen CYP82X2 puede tener codones optimizados para la expresión en Saccharomyces cerevisiae. En algunos ejemplos, el CYP82X2 puede modificarse en el extremo N. El gen CYP82X2 puede derivar de P. somniferum, Papaver spp, Plantago arenaria, Rauwolfiaheterophylla, Adlumia fungosa, Hydrastis Canadensis, Stylomecon heterophylla, Dactylicapnos torulosa, Glaucium flavum, Berberis laurina, B. Vulgaris, Corydalis spp, Fumaria spp, Dactylicapnos spp. u otra especie. En algunos ejemplos, el gen CYP82X2 puede ser 70-77 % similar al gen natural. En otros ejemplos, el gen CYP82X2 puede someterse a ingeniería del extremo N-terminal. En ejemplos, la ingeniería N-terminal puede incluir el truncamiento N-terminal.

[0223] [CYP82X1] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima 4'-0-desmetil-3-O-acetilpapaveroxina sintasa. La 4'-0-desmetil-3-0-acetilpapaveroxina sintasa está codificada por el gen CYP82X1. En algunos ejemplos, la 4'-0-desmetil-3-0-acetilpapaveroxina sintasa cataliza la reacción de 1 -hidroxi-13-O-acetil-N-metilcanadina --> 4'-0-desmetil-3-0-acetilpapaveroxina, como se hace referencia en la FIG. 9. Además, CYP82X1 cataliza la reacción de 1-hidroxi-W-metilcanadina --> 4'-O-desmetilmacrantaldehído. La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen CYP82X1 en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen CYP82X1 en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen CYP82X1. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen CYP82X1 dentro de la célula huésped manipulada. En algunos casos, el gen CYP82X1 puede tener codones optimizados para la expresión en Saccharomyces cerevisiae. En algunos ejemplos, el CYP82X1 puede modificarse en el extremo N. El gen CYP82X1 puede derivar de Papaver somniferum, Papaver spp., Plantago arenaria, Rauwolfia heterophylla, Adlumia fungosa, Hydrastis canadensis, Stylomecon heterophylla, Hypecoum u otra especie. En algunos ejemplos, el gen CYP82X1 puede ser 71-77 % similar al gen natural. En otros ejemplos, el gen CYP82X1 puede someterse a ingeniería del extremo N-terminal. En ejemplos, la ingeniería del N-terminal puede incluir el truncamiento del N-terminal.

[0224] [CFS] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima queilantifolina sintasa. La queilantifolina sintasa está codificada por el gen CFS. En los ejemplos, la queilantifolina sintasa cataliza la reacción de escoulerina ^ qeilantifolina, como se indica en la FIG. 10. Una célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen CFS en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen CFS en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen CFS. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen CFS dentro de la célula huésped modificada por ingeniería genética. El gen CFS puede derivar de P. somniferum, E. californica, A. mexicana u otra especie. En algunos ejemplos, el gen CFS puede ser 77 %, 78 % o 79 % similar al gen natural. Además, el gen CFS puede tener codones optimizados para la expresión en Saccharomyces cerevisiae.

[0225] [STS] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima estilopina sintasa. La estilopina sintasa está codificada por el gen STS. En los ejemplos, la estilopina sintasa cataliza la reacción de queilanthifolina ^ estilopina, como se indica en la FIG. 10. Una célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen STS en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen STS en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen STS. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen STS dentro de la célula huésped modificada por ingeniería genética. El gen STS puede derivar de P. somniferum, E. californica, A. mexicana u otra especie. En algunos ejemplos, el gen STS puede ser 76 %, 78 % o 79 % similar al gen natural. Además, el gen STS puede tener codones optimizados para la expresión en Saccharomyces cerevisiae.

[0226] [MSH] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima cis-N-metilestilopina 14-hidroxilasa. La cis-N-metilestilopina 14-hidroxilasa está codificada por el gen MSH. En ejemplos, la cis-N-metilestilopina 14-hidroxilasa cataliza la reacción de cis-N-metilestilopina ^ protopina, como se indica en la FIG. 10.

Una célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen MSH en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen MSH en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen MSH. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen MSH dentro de la célula huésped modificada por ingeniería genética. El gen MSH puede derivar de P. somniferum o de otra especie. En algunos ejemplos, el gen MSH puede ser un 79 % similar al gen natural. Además, el gen MSH puede tener codones optimizados para la expresión en Saccharomyces cerevisiae.

[0227] [P6H] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima protopina-6-hidroxilasa. La protopina-6-hidroxilasa está codificada por el gen P6H. En los ejemplos, la protopina-6-hidroxilasa cataliza la reacción de Protopina ^ 6-hidroxiprotopina, como se indica en la FIG. 10. Una célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen P6H en la célula huésped modificada por ingeniería genética. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen P6H en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen P6H. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen CFS dentro de la célula huésped modificada por ingeniería genética. El gen P6H puede derivar de P. somniferum, E. californica u otra especie. En algunos ejemplos, el gen P6H puede ser un 79 % similar al gen natural. Además, el gen P6H puede tener codones optimizados para la expresión en Saccharomyces cerevisiae.

[0228] [DBOX] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima dihidrobenzofenantridina oxidasa. La dihidrobenzofenantridina oxidasa está codificada por el gen DBOX. En ejemplos, la dihidrobenzofenantridina oxidasa cataliza la reacción de dihidrosanguinarina ^ sanguinarina, como se indica en la FIG.

10. Una célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen DBOX en la célula huésped modificada por ingeniería genética. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen DBOX en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen DBOX. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen DBOX dentro de la célula huésped manipulada. El gen DBOX puede derivar de P. somniferum o de otra especie. En algunos ejemplos, el gen DBOX puede ser 100 % similar al gen natural. Además, el gen DBOX puede tener codones optimizados para la expresión en Saccharomyces cerevisiae.

[0229] [AT1] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima 1, 13-dihidroxi-N-metilcanadina 13-0 acetil transferasa. La 1,13-dihidroxi-N-metilcanadina 13-0 acetiltransferasa está codificada por el gen AT1. En algunos ejemplos, la 1,13-dihidroxi-N-metilcanadina 13-0 acetiltransferasa cataliza la reacción de 1,13-dihidroxi-N-metilcanadina ^ 1-hidroxi-13-O-acetil-N-metilcanadina, como se indica en la FIG. 11A. FIG. 11A ilustra un esquema biosintético para la conversión de canadina en noscapina, de acuerdo con formas de realización de la invención. La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen AT1 en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen AT1 en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen AT1. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen AT1 dentro de la célula huésped manipulada. En algunos casos, el gen AT1 puede tener codones optimizados para expresión en Saccharomyces cerevisiae. El gen AT1 puede derivar de P. somniferum, Papaver spp, Plantago arenaria, Rauwolfia heterophylla, Adlumia fungosa, Hydrastis Canadensis, Stylomecon heterophylla, Hypecoum leptocarpum, Dactylicapnos torulosa, Glaucium flavum, Berberis laurina, B. Vulgaris, Corydalis spp, Fumaria spp, Dactylicapnos spp, u otra especie. En algunos ejemplos, el gen AT1 puede ser un 81 % similar al gen natural.

[0230] [CXE1 o CXE2] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima narcotinehemiacetal sintasa. La narcotinehemiacetal sintasa está codificada por el gen CXE1. La enzima codificada por el gen CXE2 también puede funcionar como una narcotinehemiacetal sintasa. En algunos ejemplos, la narcotinehemiacetal sintasa cataliza la reacción de 4'-O-desmetil-3-O-acetilpapaveroxina ^ narcotolinehemiacetal y 3-O-acetilpapaveroxina ^ narcotinehemiacetal, como se indica en la FIG. 11A. La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen CXE1 o CXE2 en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen CXE1 o CXE2 en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen CXEl o CXE2. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen CXE1 o CXE2 dentro de la célula huésped modificada por ingeniería genética. En algunos casos, el gen CXE1 o CXE2 puede tener codones optimizados para la expresión en Saccharomyces cerevisiae. El gen CXE1 o CXE2 puede derivar de P. somniferum, Papaver spp, Plantago arenaria, Rauwolfia heterophylla, Adlumia fungosa, Hydrastis Canadensis, Stylomecon heterophylla, Hypecoum leptocarpum, Dactylicapnos torulosa, Glaucium flavum, Berberís laurina, B. Vulgaris, Corydalis spp, Fumaria spp, Dactylicapnos spp, u otra especie. En algunos ejemplos, el gen CXE1 o el gen CXE2 puede ser un 78 % similar al gen natural.

[0231] [SDR1] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima noscapina sintasa. La noscapina sintasa está codificada por el gen SDR1. En algunos ejemplos, la noscapina sintasa cataliza la reacción de narcotolina hemiacetal ^ narcotolina, como se indica en la FIG. 11A. Además, la noscapina sintasa cataliza la reacción de narcotinehemiacetal ^ noscapina. La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen SDR1 en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen SDR1 en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen SDR1. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen SDR1 dentro de la célula huésped modificada por ingeniería genética. En algunos casos, el gen SDR1 puede tener codones optimizados para expresión en Saccharomyces cerevisiae. El gen SDR1 puede derivar de P. somniferum, Papaver spp, Plantago arenaria, Rauwolfia heterophylla, Adlumia fungosa, Hydrastis Canadensis, Stylomecon heterophylla, Hypecoum leptocarpum, Dactylicapnos torulosa, Glaucium flavum, Berberis laurina, B. Vulgaris, Corydalis spp, Fumaria spp, Dactylicapnos spp, u otra especie. En algunos ejemplos, el gen SDR1 puede ser un 79 % similar al gen natural.

[0232] [MT2 y MT3] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima narcotolina 4'-O-metilasa. La narcotolina 4'-O-metilasa es un heterodímero formado por el monómero O-metiltransferasa codificado por los genes MT2 y MT3. En algunos ejemplos, la narcotolina 4'-O-metilasa cataliza la reacción de narcotolina ^ noscapina, como se indica en la FIG. 11A. Además, la narcotolina 4'-0-metilasa cataliza la reacción de narcotolinenehemiacetal ^ narcotinehemiacetal y 4'-0-desmetil-3-0-acetilpapaveroxina ^ 3-O-acetilpapaveroxina. La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva de los genes MT2 y MT3 en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para regular sintéticamente la expresión de los genes MT2 y MT3 en la célula huésped manipulada. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales de los genes MT2 y MT3. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión de los genes ^m T2 y MT3 dentro de la célula huésped modificada por ingeniería genética. En algunos casos, los genes MT2 y MT3 pueden tener codones optimizados para la expresión en Saccharomyces cerevisiae. Los genes MT2 y MT3 pueden derivar de P. somniferum, Papaver spp, Fumaria parviflora, Plantago arenaria, Rauwolfia heterophylla u otra especie. En algunos ejemplos, los genes MT2 y MT3 pueden ser un 80 % y un 79 % similares, respectivamente, a los genes naturales.

[0233] [morA] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima morfina deshidrogenasa. La morfina deshidrogenasa está codificada por el gen morA. En algunos ejemplos, la morfina deshidrogenasa cataliza la reacción de morfina ^ morfinona, como se indica en la FIG. 11B. En otros ejemplos, la morfina deshidrogenasa cataliza la reacción de codeinona ^ codeína, también como se indica en la FIG. 11B. FIG. 11B ilustra un esquema biosintético para la producción de opiáceos semisintéticos, de acuerdo con formas de realización de la invención. En particular, la FIG. 11B ilustra transformaciones extendidas de tebaína en levadura mediante la incorporación de morA, morfina deshidrogenasa; y morB, morfina reductasa.

[0234] La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen morA en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen morA en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen morA. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen morA dentro de la célula huésped modificada por ingeniería genética. En algunos casos, el gen morA puede tener codones optimizados para su expresión en Saccharomyces cerevisiae. El gen morA puede derivar de Pseudomonas putida o de otra especie. En algunos ejemplos, el gen morA puede ser un 73,7 % similar al gen natural.

[0235] [morB] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificar la expresión de la enzima morfinona reductasa. La morfinona reductasa está codificada por el gen morB. En algunos ejemplos, la morfinona reductasa cataliza la reacción de codeinona ^ hidrocodona, como se indica en la FIG. 11B. En otros ejemplos, la morfinona reductasa cataliza la reacción de morfinona ^ hidromorfona, también como se indica en la FIG. 11B. En otros ejemplos, la morfinona reductasa cataliza la reacción 14-hidroxicodeinona ^ oxicodona. La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen morB en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen morB en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen morB. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen morB dentro de la célula huésped manipulada. En algunos casos, el gen morB puede tener codones optimizados para expresión en Saccharomyces cerevisiae. El gen morB puede derivar de Pseudomonas putida o de otra especie. En algunos ejemplos, el gen morB puede ser un 67,2 % similar al gen natural.

[0236] [CYP80A1] En algunos ejemplos, la célula huésped manipulada puede expresar la enzima berbamunina sintasa. La berbamunina sintasa está codificada por el gen de la enzima 80A1 del citocromo P450 (CYP80A1). En algunos ejemplos, CYP80A1 cataliza la reacción (Sj-W-metilcoclaurina (Rj-W-metilcoclaurina ^ berbamunina. En otros ejemplos, CYP80A1 cataliza la reacción (Rj-W-metilcoclaurina (Rj-W-metilcoclaurina ^ guattegaumerina. En otros ejemplos, CYP80A1 cataliza la reacción (Rj-W-metilcoclaurina (Sj-coclaurina ^ 2'norberbamunina. La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen CYP80A1 en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen CYP80A1 en la célula huésped manipulada. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen CYP80A1. Adicional o alternativamente, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen CYP80A1 dentro de la célula huésped manipulada. En algunos casos, el gen CYP80A1 puede tener codones optimizados para la expresión en Saccharomyces cerevisiae. El gen CYP80A1 puede derivar de Berberis stolonifera o de otra especie. En algunos ejemplos, el gen CYP80A1 puede ser un 76 % similar al gen natural.

[0237] [PODA] En algún ejemplo, la célula huésped manipulada puede expresar la enzima protopina O-desalquilasa. La protopina O-desalquilasa está codificada por el gen PODA. En algunos ejemplos, PODA cataliza la O,O-desmetilenación de protoberberinas y protopinas tales como canadina, estilopina, berberina, criptopina, alocriptopina y protopina. En algunos ejemplos, PODA cataliza la O-desmetilación de BIA que incluyen tetrahidropapaverina, tetrahidropalmatina y criptopina. La célula huésped manipulada puede modificarse para incluir la expresión constitutiva del gen PODA en la célula huésped manipulada. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para regular sintéticamente la expresión del gen PODA en la célula huésped modificada por ingeniería genética. En ejemplos, la célula huésped manipulada puede modificarse para incorporar una copia, copias o copias adicionales del gen PODA. Adicional o alternativamente, la célula huésped modificada por ingeniería genética puede modificarse para incorporar la introducción de un elemento promotor fuerte para la sobreexpresión del gen PODA dentro de la célula huésped modificada por ingeniería genética. En algunos casos, el gen PODA puede tener codones optimizados para la expresión en Saccharomyces cerevisiae. El gen PODA puede derivar de Papaver somniferum o de otras especies. En algunos ejemplos, el gen PODA puede ser 70-100 % similar al gen natural.

[0238] Los ejemplos de los genes antes mencionados se pueden expresar a partir de varias plataformas diferentes en la célula huésped, incluido el plásmido (2 m, ARS/CEN), YAC o genoma. Además, los ejemplos de las secuencias génicas antes mencionadas pueden ser nativas o con codones optimizados para la expresión en el huésped heterólogo deseado (p. ej., Saccharomyces cerevisiaej.

EJEMPLOS

[0239] Los siguientes ejemplos se dan con el propósito de ilustrar varias formas de realización de la invención y no pretenden limitar la invención de ninguna manera. Cuando se indique, se entiende que las construcciones de expresión incorporan un promotor, un gen y un terminador adecuados, incluso si no se especifica la secuencia exacta del terminador utilizada. Los presentes ejemplos, junto con los métodos descritos en el presente documento, son actualmente representativos de formas de realización preferidas, son ejemplares y no pretenden limitar el alcance de la invención. Los cambios en el mismo y otros usos que están abarcados por el alcance de la invención, que se define en las reivindicaciones adjuntas, se les ocurrirán a los expertos en la técnica.

Ejemplo 1: Los mutantes de tirosina hidroxilasa mejoran la producción de norcoclaurina en cepas de levadura modificadas genéticamente

[0240] La tirosina hidroxilasa de R. norvegicus se optimizó en codones de levadura, se sintetizó y se clonó en un plásmido de bajo número de copias. Se generaron mutantes simples (W166Y, E332D, S40D y R37ER38E), mutantes dobles (W166Y y E332D, W166Y y S40D, W166Y y R37ER38E) y un mutante triple (W166Y, R37ER38E y E332D) mediante mutagénesis dirigida al sitio. Cada mutante de TyrH se expresó a partir de un plásmido de bajo número de copias con el promotorGPDen una levadura que contiene las siguientes mutaciones en el metabolismo central (tal como se describe en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos con el número de serie 61/899,496): ARO₄FBR, AZWF1 y reemplazo del promotor GPD-TKL1. Además, la cepa expresó una copia cromosómicamente integrada de DOPA descarboxilasa (DODC) de P. putida, cuatro genes cromosómicamente integrados de R. norvegicus que generan el cosustrato tetrahidrobiopterina (piruvoil tetrahidropterina sintasa, PTPS; sepiapterina reductasa, SepR; pterina 4a-carbinolamina deshidratasa, PCD, dihidropteridina reductasa, QDHPR) y norcoclaurina sintasa (NCS) de C. japónica expresadas a partir de un plásmido de bajo número de copias con un promotor GPD. Las cepas que albergaban mutantes de TyrH se cultivaron en medios selectivos definidos (YNB) que carecen de tirosina con dextrosa al 2 % durante 96 horas, y la producción de norcoclaurina se midió en los medios mediante CL-EM/EM en modo MRM con la transición 272 m/z a 107 m/z. FIG. 12 muestra los resultados de este ensayo y demuestra que los mutantes de TyrH pueden mejorar la producción de norcoclaurina hasta 9 veces en comparación con TyrH de tipo salvaje. Como tal, la FIG. 12 ilustra mutantes de tirosina hidroxilasa que mejoran la producción de norcoclaurina a partir de azúcar en cepas de levadura manipuladas, de acuerdo con formas de realización de la invención.

Ejemplo 2: Los mutantes de tirosina hidroxilasa mejoran la producción de reticulina en cepas de levadura modificadas genéticamente

[0241] La tirosina hidroxilasa de R. norvegicus se optimizó en codones de levadura, se sintetizó y se clonó en un plásmido de bajo número de copias. Se generaron mutantes simples (W166Y, E332D, S40D y R37ER38E), mutantes dobles (W166Y y E332D, W166Y y S40D, W166Y y R37ER38E) y un mutante triple (W166Y, R37ER38E y E332D) mediante mutagénesis dirigida al sitio. Cada mutante de TyrH se expresó a partir de un plásmido de bajo número de copias con el promotorGPDen una cepa de levadura que contenía las siguientes mutaciones en el metabolismo central (como se describe en la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos con el número de serie 61/899,496): ARO₄FBR, AZWF1 y sustitución del promotor GPD-TKL1. Además, la cepa expresó una copia cromosómicamente integrada de DOPA descarboxilasa (DODC) de P. putida, cuatro genes cromosómicamente integrados de R. norvegicus que generan el cosustrato tetrahidrobiopterina (piruvoil tetrahidropterina sintasa, PTPS; sepiapterina reductasa, SepR; pterina 4acarbinolamina deshidratasa, PCD, dihidropteridina reductasa, QDHPR), norcoclaurina sintasa (NCS) de C. japónica expresada a partir de un plásmido de bajo número de copias con un promotor GPD, y cinco genes para la biosíntesis de reticulina a partir de norcoclaurina (P. somniferum 6-O-metiltransferasa, Ps6OMT, P. somniferum coclaurina N-metiltransferasa, PsCNMT, E. californica citocromo P450 80B1, EcCYP80B1, P. somniferum citocromo P450 NADPH reductasa, PsCPR, y P. somniferum 3'hidroxi-N-metilcoclaurina 4'-O-metiltransferasa, Ps4'OMT). Las cepas que albergaban mutantes de TyrH se cultivaron en medios selectivos definidos (YNB) que carecían de tirosina con dextrosa al 2 % durante 96 horas, y se midió la producción de reticulina en los medios mediante CL-EM/EM en modo MRM con la transición 330 m/z a 137 m/z. FIG. 13 muestra los resultados de este ensayo y demuestra que los mutantes de TyrH pueden mejorar la producción de reticulina hasta 5 veces en comparación con TyrH de tipo salvaje. Como tal, la FIG. 13 ilustra mutantes de tirosina hidroxilasa que mejoran la producción de reticulina a partir de azúcar en cepas de levadura manipuladas, de acuerdo con formas de realización de la invención.

Ejemplo 3: La expresión de DHFR mejora la actividad de tirosina hidroxilasa en cepas de levadura manipuladas

[0242] La dihidrofolato reductasa (DHFR) de R. norvegicus se optimizó, sintetizó y clonó en un plásmido de bajo número de copias bajo el control de un promotor GPD. DHFR se coexpresó con RnTyrH de tipo salvaje (plásmido de copia baja con un promotor GPD) en una cepa de levadura que contenía las siguientes mutaciones en el metabolismo central (como se describe en la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos con el número de serie 61/899,496): ARO₄FBR, reemplazo del promotor AZWF1 y GPD-TKL1. Además, la cepa expresó cuatro genes integrados cromosómicamente de R. norvegicus que generan el cosustrato tetrahidrobiopterina (piruvoil tetrahidropterina sintasa, PTPS; sepiapterina reductasa, SepR; pterina 4a-carbinolamina deshidratasa, PCD; dihidropteridina reductasa, QDHPR). Las cepas que expresan DHFR y RnTyrH de tipo salvaje se cultivaron en medios selectivos definidos (YNB) que carecen de tirosina con dextrosa al 2 % durante 96 horas, y se midió la producción de L-DOPA en los medios mediante CL-EM/EM en modo MRM con la transición 198 m/z a 152 m/z. La expresión de DHFR con RnTyrH de tipo salvaje aumenta la producción de L-DOPA en 1,8 veces, como se ilustra en la FIG. 14. Como tal, la FIG. 14 ilustra la coexpresión de dihidrofolato reductasa (DHFR) que mejora la producción de L-DOPA por tirosina hidroxilasa en cepas de levadura manipuladas, de acuerdo con formas de realización de la invención.

Ejemplo 4: La adición de antioxidantes al medio de cultivo mejora la actividad de la tirosina hidroxilasa en cepas de levadura manipuladas

[0243] Una cepa de levadura que contiene las siguientes mutaciones en el metabolismo central (como se describe en la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° de Serie 61/899,496): ARO₄FBR, AZWF1 y reemplazo del promotor GPD-TKL1 y expresión de cuatro genes integrados cromosómicamente de R. norvegicus que generan el cosustrato tetrahidrobiopterina (piruvoil tetrahidropterina sintasa, PTPS; sepiapterina reductasa, SepR; pterina 4a-carbinolamina deshidratasa, PCD; dihidropteridina reductasa, QDHPR) como así como RnTyrH de tipo salvaje de un plásmido de bajo número de copias bajo el control del promotorGPDse cultivó en medio selectivo definido (YNB) que carece de tirosina con galactosa al 2 % y ácido ascórbico 2 mM durante 96 horas.

[0244] La producción de L-DOPA se midió en los medios a través de CL-EM/EM en modo MRM con la transición de 198 m/z a 152 m/z. La adición de ácido ascórbico 2 mM mejora la producción de L-DOPA con RnTyrH de tipo salvaje en 1,8 veces. Además, la concentración de intermedios BH4 se midió con CL-EM/EM en modo MRM con las siguientes transiciones: B, 238 m/z a 178 m/z; BH₂, 240 m/z a 165 m/z y BH4, 242 m/z a 166 m/z. La adición de ácido ascórbico también aumenta el BH4 en el medio, lo que indica que se previene la oxidación de BH4 a BH₂.

[0245] En consecuencia, la FIG. 15 ilustra (A) la adición de antioxidantes a los medios de cultivo que mejoran la producción de L-DOPA por tirosina hidroxilasa en cepas de levadura manipuladas y (B) la adición de antioxidantes a los medios de cultivo que aumentan los niveles de BH4, de acuerdo con las formas de realización de la invención. En particular, la FIG.

15A ilustran una RnTyrH de tipo salvaje (expresada a partir de un plásmido de bajo número de copias bajo el control de un promotor de GPD) que se expresó en una cepa de levadura que contenía las siguientes mutaciones en el metabolismo central (como se describe en la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos, número de serie 61/ 899,496): reemplazo del promotor ARO₄FBR, AZWF1 y GPD-TKL1. Además, la cepa expresó cuatro genes integrados cromosómicamente de R. norvegicus que generan el cosustrato tetrahidrobiopterina (piruvoil tetrahidropterina sintasa, PTPS; sepiapterina reductasa, SepR; pterina 4a-carbinolamina deshidratasa, PCD; dihidropteridina reductasa, QDHPR). Las cepas que expresan RnTyrH de tipo salvaje se cultivaron en medios selectivos definidos (YNB) que carecen de tirosina con dextrosa al 2 %, con y sin ácido ascórbico 2 mM (aa) durante 96 horas. La producción de L-DOPA se midió en los medios mediante CL-EM/E^m en modo MRM con la transición de 198 m/z a 152 m/z. Además, la FIG. 15B ilustra, en la misma cepa descrita en la FIG. 15A, la concentración del intermedio BH4 se midió en el medio de cepas cultivadas con y sin ácido ascórbico 2 mM (aa) con CL-EM/EM en modo MRM con la siguiente transición: BH4, 242 m/z a 166 m/z.

Ejemplo 5: Cepas de levadura diseñadas para producir la berbamunina bisBlA

[0246] FIG. 16 ilustra (A) un esquema biosintético para la conversión de L-tirosina en bisBIA y (B) cepas de levadura diseñadas para biosintetizar bisBIA, de acuerdo con formas de realización de la invención. En particular, la FIG. 16 ilustra (A) una ruta que se usa para producir bisBIA berbamunina y guattegaumerina. FIG. 16 proporciona el uso de las enzimas ARO9, aminotransferasa aromática; ARO10, fenilpiruvato descarboxlasa; TyrH, tirosina hidroxilasa; DODC, DOPA descarboxilasa; NCS, norcoclaurina sintasa; 6OMT, 6-O-metiltransferasa; CNMT, coclaurina N-metiltransferasa; CYP80A1, citocromo P45080A1; RCP, citocromo P450 NADPH reductasa. De los metabolitos proporcionados en la FIG.

16, 4-HPA, 4-HPP y L-tirosina se sintetizan naturalmente en la levadura. Otros metabolitos que se muestran en la FIG. 16 no se producen naturalmente en la levadura.

[0247] En los ejemplos de la invención, una cepa de levadura productora de bisBIA, que produce bisBIA como las generadas utilizando la vía ilustrada en (A), se modifica mediante la integración de una única construcción en el locus YDR514C. Además, la FIG. 16 proporciona (B) ejemplos de cepas de levadura diseñadas para sintetizar bisBIA. Ps6OMT, PsCNMT, PsCPR y BsCYP80A1 se integraron en el genoma de la levadura en un solo locus (YDR514C). Cada enzima se expresó a partir de un promotor constitutivo. La disposición y orientación de los casetes de expresión génica se indican mediante flechas en el esquema. Estas cepas convierten (R)-y (SJ-norcoclaurina en coclaurina y luego en N-metilcoclaurina. En un ejemplo, las cepas pueden entonces conjugar una molécula de (RJ-N-metilcoclaurina y una molécula de (SJ-N-metilcoclaurina para formar berbamunina. En otro ejemplo, las cepas pueden conjugar dos moléculas de (RJ-N-metilcoclaurina para formar guattegaumerina. En otro ejemplo, las cepas pueden conjugar una molécula de (RJ-N-metilcoclaurina y una molécula de (SJ-coclaurina para formar 2'-norberbamunina. En otra forma de realización, la cepa puede diseñarse para suministrar los precursores (R)-y (SJ-norcoclaurina de L-tirosina, como se proporciona en la FIG.5.

[0248] La construcción incluye casetes de expresión para las enzimas 6OMT y CNMT de P. somniferum expresadas como sus secuencias de nucleótidos de plantas nativas. Una tercera enzima de P. somniferum, CPR, tiene codones optimizados para expresión en levadura. El PsCPR respalda la actividad de una cuarta enzima, Berberis stolonifera CYP80A1, también con codones optimizados para expresión en levadura. Cada casete de expresión incluye terminadores y promotores constitutivos de levadura únicos. Finalmente, la construcción de integración incluye un marcador de selección LEU2 flanqueado por sitios loxP para la escisión por la recombinasa Cre.

[0249] Se cultiva una cepa de levadura que expresa Ps6OMT, PsCNMT, BsCYP80A1 y PsCPR en un medio selectivo durante 16 horas a 30 °C con agitación. Las células se recogen mediante centrifugación y se resuspenden en 400 μL de tampón de ruptura (Tris-HCl 100 mM, pH 7,0, glicerol al 10 %, 2-mercaptoetanol 14 mM, cóctel inhibidor de proteasa). Las células se rompen físicamente mediante la adición de perlas de vidrio y agitación vorticial. Se elimina el líquido y se añaden los siguientes sustratos y cofactores para iniciar la reacción: (R,SJ-norcoclaurina 1 mM, S-adenosil metionina 10 mM, NADPH 25 mM. El lisado celular crudo se incuba a 30°C durante 4 horas y luego se apaga mediante la adición 1:1 de etanol acidificado con ácido acético al 0,1 %. La reacción se centrifuga y el sobrenadante se analiza mediante espectrometría de masas por cromatografía líquida (CL-EM) para detectar los productos bisBIA berbamunina, guattegaumerina y 2'-norberbamunina por su retención y masa/carga.

Ejemplo 6. Identificación de una enzima epimerasa

[0250] Para identificar una enzima epimerasa adecuada para realizar las reacciones de epimerización de los métodos divulgados del presente documento, se identificaron un dominio similar a 82Y1 de citocromo P450 oxidasa y un dominio similar a codeinona reductasa en un solo marco de lectura abierto (CYP-COR) en transcriptomas de plantas. Las fusiones CYP-COR se identificaron a partir de una búsqueda BLAST del 1000 Plants Project (Matasci, et al. 2014. Gigascience. 3: 17) y PhytoMetaSyn (Facchini, et al. 2012. Trends Biotechnol. 30: 127-31; Xiao, et al. 2013. J. Biotechnol. 166: 122-34) transcriptomas usando blastn con la consulta siendo la secuencia de una construcción de VIGS silenciadora de COR publicada previamente que resultó en la acumulación de reticulina (Wijekoon y Facchini. 2012. Plant J. 69: 1052-63). Una vez que se observó una secuencia de fusión de CYP-COR como un acierto, esa secuencia se tradujo y la secuencia de aminoácidos se usó como consulta para una segunda búsqueda en ambas bases de datos con tblastn. en la FIG. 17. Las secuencias se identificaron a partir de las bases de datos de transcriptomas de The 1000 Plants Project y PhytoMetaSyn basándose en una búsqueda bioinformática. Además, en la FIG. 4, como se discutió anteriormente. Además, la Tabla 1 enumera varios ejemplos de secuencias de aminoácidos identificadas para esta enzima CYP-COR, que provienen de varias plantas, incluidas Papaver somniferum (adormidera), Papaver setigerum (adormidera de Troya), Papaver bracteatum (adormidera iraní) y Chelidonium majus. (celidonia mayor).

Ejemplo 7. Epimerización de (S)-reticulina a (R)-reticulina en una célula huésped no vegetal manipulada

[0251] Se modificaron células huésped no vegetales para expresar de forma heteróloga las enzimas descritas en el presente documento. Por ejemplo, se diseñaron cepas de levadura (Saccharomyces cerevisiae) para expresar heterólogamente las epimerasas identificadas descritas en el Ejemplo 6 y para verificar su función en el contexto de este huésped microbiano. Las secuencias de codificación de ADN optimizadas por codón de levadura para las secuencias de aminoácidos parciales pbr.PBRST1PF_4328 y pbr.PBRST1PF_89405 se sintetizaron en el marco con la secuencia codificante optimizada por codón de levadura para los aminoácidos 1-40 de SSDU-2015634 (Tabla 1) para generar CYP-COR_4328 y CYP-CO^r_89405, respectivamente. Estas secuencias codificantes de CYP-COR se clonaron en un plásmido de pocas copias que albergaba un marcador de selección URA3 y se expresaron a partir del promotor TDH3. Los plásmidos se transformaron en cepas de levadura que albergaban un casete de expresión para una citocromo P450 reductasa (P^tefi-ATR1 o P^tef1-PsCPRv2) integrada en el cromosoma. Estas cepas de levadura que albergan los dos plásmidos se cultivaron en medios completos sintéticos con la solución de abandono apropiada (-Ura-Trp). Las cepas de levadura se alimentaron con (S)-reticulina y los metabolitos de BIA se analizaron después de 72 horas de crecimiento mediante análisis CL-EM/EM.

Ejemplo 8. Producción de salutaridina a partir de (S)-reticulina en una célula de levadura manipulada

[0252] Se diseñaron cepas de levadura (Saccharomyces cerevisiae) para expresar heterólogamente las epimerasas identificadas descritas en el Ejemplo 6 y para verificar su función en el contexto de este huésped microbiano. Las secuencias de codificación de ADN optimizadas por codón de levadura para las secuencias de aminoácidos parciales pbr.PBRST1PF_4328 y pbr.PBRST1PF_89405 se sintetizaron en el marco con la secuencia codificante optimizada por codón de levadura para los aminoácidos 1-40 de SSDU-2015634 (Tabla 1) para generar CYP-COR_4328 y c Yp -COR_89405, respectivamente. Estas secuencias codificantes de CYP-COR se clonaron en un plásmido de pocas copias que albergaba un marcador de selección URA3 y se expresaron a partir del promotor TDH3. La secuencia codificante de la salutaridina sintasa (SalSyn) se clonó en un plásmido de pocas copias que albergaba un marcador de selección TRPI y se expresó a partir del promotor TDH3. Los plásmidos se transformaron en cepas de levadura que albergaban un casete de expresión para una citocromo P450 reductasa (P^tef1-ATR1 o P^tef1-PSCPRv2) integrada en el cromosoma. Estas cepas de levadura que albergan los dos plásmidos se cultivaron en medios completos sintéticos con la solución de abandono apropiada (-Ura-Trp). Las cepas de levadura se alimentaron con (S)-reticulina y los metabolitos de BIA se analizaron después de 72 horas de crecimiento mediante análisis CL-EM/EM. El análisis indicó que las células de levadura manipuladas fueron capaces de convertir (S)-reticulina en (R)-reticulina, sobre la que luego actuó la salutaridina sintasa para formar salutaridina, un alcaloide de promorfinano de 4 anillos (FIG. 7, FIG. 18). Se ha demostrado previamente que la salutaridina sintasa actúa sobre la (R)-reticulina y no tiene actividad observable sobre la (S)-reticulina (Gesell, et al.

2009. J. Biol. Chem. 284: 24432-42).

[0253] Como se muestra en la FIG. 7 , CYP-COR cataliza la conversión de (S)-reticulina a (R)-reticulina, sobre la que luego actúa la salutaridina sintasa para producir el alcaloide promorfinano salutaridina. FIG. 18 ilustra (A) trazas de cromatograma que muestran reticulina y salutaridina para dos variantes de epimerasa (CYP-COR 89405, CYP-COR_4328) y un estándar. FIG. 18 también ilustra (B) las mismas trazas de cromatograma para salutaridina en (A) como se representa nuevamente para demostrar la coelución con el estándar. En este experimento, la levadura contiene dos plásmidos CEN/ARS de bajo número de copias con marcadores selectivos URA3 y TRPI, promotores TDH3 y las secuencias codificantes CYP-COR y SalSyn. La levadura se cultivó a partir de colonias recién transformadas en 3 ml de medio selectivo durante la noche, se retrodiluyó en 3,5 ml de medio hasta una DO de 0,8, se cultivó durante 7 horas, se sedimentó y luego se resuspendió en tampón HEPES de pH 7,4 con 100 μm (S)-reticulina (Specs). Después de 16 horas en un agitador a 30 °C, la levadura se sedimentó y el sobrenadante del tampón se analizó mediante CL-EM/EM. Cada trazo es de una sola muestra representativa de 2. Los picos se normalizan de modo que el pico más grande en todos los cromatogramas sea 100 %.

Ejemplo 9. Producción de (R)-reticulina a partir de norlaudanosolina racémica en una célula huésped no vegetal manipulada

[0254] Se diseñaron cepas de levadura (Saccharomyces cerevisiae) para expresar heterólogamente las epimerasas identificadas descritas en el Ejemplo 6 y verificar su función en el contexto de este huésped microbiano. La secuencia de codificación de ADN optimizada con codón de levadura CYP-COR_89405 descrita en el Ejemplo 7 se clonó en un plásmido de pocas copias que albergaba un marcador de selección URA3 y se expresó a partir del promotor TDH3. Este plásmido se transformó en cepas de levadura que albergaban casetes de expresión para una citocromo P450 reductasa (P^tefi-ATR1 o P^tefi-P^sCPR^v2) y tres metiltransferasas (Papaver somniferum norcoclaurina-6-O-metiltransferasa, coclaurina W-metiltransferasa y 3’-h¡droxi-N-met¡lcoclaur¡na 4'-O-metiltransferasa, todos expresados a partir de PTEF1) integrados en el cromosoma. Esta cepa de levadura que albergaba el plásmido se cultivó en medio completo sintético con la solución de abandono apropiada (-Ura). La cepa de levadura se alimentó con norlaudanosolina racémica y los metabolitos de BIA se analizaron después de 72 horas de crecimiento mediante análisis CL-EM/EM. Para la caracterización quiral, la reticulina se concentró a partir de medios de levadura sedimentando 5 mL de cultivo de levadura y agregando 120 mg de resina XAD-4 a 4 mL de sobrenadante, incubando en un rotador durante la noche a temperatura ambiente y eluyendo con 0,5 mL de metanol. El concentrado se fraccionó por HPLC de fase inversa (Pursuit XRs-C18, 5 |jm, 50 mm x 10 mm) con metanol isocrático al 15 % con ácido fórmico al 0,1 % durante 6,5 min con un caudal de 5 ml/min y un volumen de inyección de 40-50 jL . Las fracciones basadas en picos se recogieron aproximadamente a los 4,5 min. Las fracciones se agruparon, se secaron por congelación y se resuspendieron en 0,5 ml de isopropanol. Dependiendo de la concentración, se inyectaron 0,5-5 ml en una columna quiral (Phenomenex Lux celulosa-1, 3 jm , 150 mm x 2 mm) y se separaron con isocrático 72 % N-hexano, 28 % isopropanol, 0,1 % dietilamina con un caudal de 0,3 mL/min y detección por MS y 250 nm UV. La detección de MS se realizó con un espectrómetro de masas Agilent 6320 Ion Trap con temperatura de gas fuente ESI de 350 °C, flujo de gas de 10 L/min, presión de nebulizador de 40 PSI y aislamiento de m/z 330,1 con ancho 1,0. El tiempo de retención de los picos de reticulina se comparó con el de los estándares auténticos de (S)-reticulina y (R)-reticulina. El análisis indicó que las células de levadura modificadas que contenían el plásmido CYP-COR podían convertir la norlaudanosolina racémica en (R)-reticulina, mientras que las células de levadura modificadas genéticamente con un plásmido vacío producían exclusivamente (S)-reticulina (FIG. 19).

Ejemplo 10: Ingeniería de proteínas de salutaridina sintasa para mejorar su procesamiento y actividad cuando se expresa en un huésped microbiano

[0255] Las proteínas heterólogas pueden procesarse incorrectamente cuando se expresan en un huésped recombinante, por ejemplo, proteínas vegetales como las enzimas del citocromo P450 expresadas en huespedes de producción microbiana. Por ejemplo, la salutaridina sintasa, que convierte la (R)-reticulina en salutaridina, experimenta glicosilación ligada a N cuando se expresa heterólogamente en levadura (FIG. 20). El patrón de glicosilación ligado a N observado en la salutaridina sintasa no se observa cuando la enzima se expresa en plantas y es indicativo de una clasificación N-terminal incorrecta del transcrito SalSyn naciente, lo que reduce la actividad de la enzima en el huésped microbiano heterólogo. Por lo tanto, la ingeniería de proteínas dirigida a corregir la clasificación N-terminal del transcrito naciente y, por lo tanto, eliminar el patrón de glicosilación ligado a N dará como resultado una actividad mejorada de la enzima salutaridina sintasa en el huésped de producción recombinante.

[0256] Por ejemplo, se usaron hélices alfa N-terminales de queilanthifolina sintasa (CFS) para reemplazar las hélices alfa N-terminales de salutaridina sintasa (SalSyn, FIG. 21). Los puntos de unión para estas fusiones se seleccionaron sobre la base de motivos de estructura secundaria de CFS y SalSyn o sobre la base de alineaciones de aminoácidos de CFS y SalSyn. Las fusiones se clonaron amplificando el fragmento N-terminal de CFS y el fragmento C-terminal de SalSyn con 15-40 nucleótidos de superposición con el otro fragmento, y luego se ensamblaron entre sí y con un vector principal mediante el ensamblaje de Gibson para formar la fusión completa. marco de lectura abierto (Gibson, et al. 2009. Nat Methods. 6: 343-5).

[0257] Como otro ejemplo, la secuencia codificante para el dominio del citocromo P450 de la salutaridina sintasa se colocó directamente en la región codificante de P450 de otros citocromos P450 expresados de forma estable, como la enzima BM3. Por ejemplo, el dominio del citocromo P450 conservado de la salutaridina sintasa y el dominio del citocromo P450 de una variante diseñada de la monooxigenasa CYP102A1 de Bacillus megaterium P450 (BM3, (Michener and Smolke.

2012. Metab. Eng. 14: 306-16)) fueron identificados por la búsqueda de dominio conservado NCBI. Los cebadores se diseñaron para fusionar la secuencia de codificación de los primeros aminoácidos de BM3 con la secuencia de codificación del dominio P450 de la salutaridina sintasa, seguida de la secuencia de codificación de los dominios BM3 C-terminal al dominio P450. Como antes, esta construcción se ensambló a través del ensamblaje de Gibson.

[0258] Las fusiones de proteínas de salutaridina sintasa modificadas por ingeniería genética se analizaron mediante análisis de transferencia Western para confirmar la expresión completa y la modificación o eliminación de patrones de glicosilación ligados a N en levadura (FIG.20). Las fusiones de proteína y enzima salutaridina sintasa se marcaron en el extremo C con el epítopo de hemaglutinina (HA) de influenza humana y se clonaron en plásmidos de expresión apropiados para la expresión en levaduras y plantas. Para la levadura, las secuencias codificantes de la enzima se clonaron en una levadura de bajo número de copias/vector E. coli lanzadera que alberga un marcador de selección URA3 y se expresa a partir del promotor TDH3. Para las plantas, las secuencias se clonaron en un vector lanzadera de E. coli/Agrobacterium tumefaciens con resistencia a la kanamicina y el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) con regiones flanqueantes 5' y 3' no traducidas del ARN-2 del virus del mosaico del caupí para expresión de plantas transitoria mediante infiltración de Agrobacterium tumefaciens. Con ingeniería de levadura para expresar salutaridina sintasa mostró un patrón de bandas indicativo de glicosilación ligada a N. Confirmamos que este patrón se debía a la glicosilación ligada a N mediante la realización de mutagénesis dirigida al sitio en el sitio de glicosilación. Por el contrario, la expresión de plantas de esta enzima no dio como resultado un patrón de bandas indicativo de glicosilación ligada a N, como se ve en (A) de la FIG.20. Aunque los sitios de glicosilación unidos a N no estaban modificados, las fusiones de proteína salutaridina sintasa manipuladas no estaban N-glucosiladas cuando se expresaban en levadura, como se ve en (B) de la FIG. 20. Por transferencia Western, demostramos que las enzimas de fusión expresadas en levadura estaban presentes como una sola banda, similar a la expresión observada para la enzima original expresada en plantas, lo que indica que el procesamiento incorrecto de la proteína naciente en la levadura que resultó en glicosilación vinculada a N que fue reparada por las fusiones diseñadas.

[0259] Las fusiones de proteínas de salutaridina sintasa modificadas por ingeniería genética se analizaron para mejorar la actividad enzimática cuando se expresaban heterólogamente en levadura. Las secuencias de codificación para la salutaridina sintasa y las fusiones manipuladas se clonaron en un plásmido de pocas copias que albergaba un marcador de selección U R A 3 y se expresaron a partir del promotor TDH3. La levadura tiene P ^tefi-P ^s C P R ^v2 integrado en el locus TRP1 y contiene un único plásmido de pocas copias con el marcador selectivo U R A 3 y la secuencia codificante de salutaridina sintasa con el promotor TDH3. La levadura se cultivó a partir de colonias recién transformadas en 1 mL de medio selectivo (-Ura) durante la noche y se retrodiluyó 1:20 en 0,5 mL de medio selectivo en placas de 96 pocillos con 10 |^jM (R)-reticulina (Toronto Research Chemicals). Después de 72-96 horas en la incubadora con agitación, la levadura se sedimentó y el sobrenadante del medio se analizó mediante CL-EM/EM. El análisis indicó que las enzimas salutaridina sintasa manipuladas mostraron una actividad mejorada con respecto a la de la secuencia de tipo salvaje cuando se expresaban heterólogamente en levadura (FIG. 22).

[0260] FIG. 22 ilustra la optimización de codones de salutaridina sintasa y las fusiones diseñadas que mejoran la actividad en la levadura, de acuerdo con formas de realización de la invención. Como se ve en la FIG. 22, una barra negra indica una secuencia nativa de tipo salvaje para la salutaridina sintasa, PsCYP719B1. Las barras grises con bordes negros son variantes optimizadas de codones de levadura de P a p a v e r so m n ife ru m y una secuencia recién identificada de P a p a v e r b ra c te a tu m . La barra con patrón diagonal indica la fusión de ingeniería más mejorada, que se basa en la secuencia de P. b ra c te a tu m . Las barras de error indican el rango de al menos dos réplicas biológicas. En estas cepas modificadas pueden utilizarse variantes naturales, sintéticas con codones optimizados y/o modificadas con proteínas de la salutaridina sintasa de P. b ra c te a tu m , P. so m n ife ru m o P. se tig e ru m (o una planta relacionada).

[0261] Las fusiones de proteínas de salutaridina sintasa manipuladas pueden usarse en el contexto de una ruta biosintética para aumentar la producción de productos de alcaloides de bencilisoquinolina cadena abajo. En un ejemplo, se modificó la levadura para expresar heterólogamente genes optimizados de codón de levadura que codifican una fusión de salutaridina sintasa modificada, salutaridin reductasa de P. b ra c te a tu m y salutaridinol 7-O-acetiltransferasa de P. so m n ife ru m . Los tres casetes de expresión (PTDH3-D94yPsSS, P T P I1 -yP bS a lR , PTEF1-y P s S a lA T ) se ensamblaron en un cromosoma artificial de levadura (YAC) con un marcador de sección TRP1. El YAC se colocó en una levadura que albergaba un casete de expresión para una citocromo P450 reductasa (P ^tef1-ATR1 o PTEF1-y P sC P R v2 ) integrada en el cromosoma. Las cepas de levadura se cultivaron en medios completos sintéticos con la solución de abandono apropiada (-Trp) y se alimentaron con ('R)-reticulina. Los metabolitos de BIA se analizaron después de 96 horas de crecimiento mediante análisis CL-EM/EM. El análisis indica que las cepas de levadura modificadas genéticamente con las enzimas salutaridina sintasa modificadas genéticamente y otras enzimas de la ruta producen el alcaloide morfinano tebaína, como se ilustra en (A) de la FIG. 23.

[0262] En consecuencia, la FIG. 23 ilustra (A) un análisis CL-EM/EM de fermentación por lotes a pequeña escala en el que la levadura manipulada cataliza la conversión de (R)-reticulina en tebaína, de acuerdo con formas de realización de la invención. Como se prevé en (A) de la FIG. 23, las cepas de levadura están diseñadas para tener un casete de expresión P ^tef1-ATR1 integrado en el locus T R P I y contienen un solo cromosoma artificial de levadura con el marcador selectivo T R P Iy tres casetes de expresión: P ^tdh3 -y E c C F S 1-83-y P s S S 95-505, P jp n -y P b S a lR y PTEF1-y P s S a lA T . La levadura se cultivó a partir de colonias recién transformadas en 3 ml de medio selectivo durante la noche y se retrodiluyó 1:20 en 0,5 ml de medio selectivo (-Trp) en tubos de cultivo con 100 j M (R)-reticulina (Toronto Research Chemicals). Después de 72 horas en la incubadora con agitación, la levadura se sedimentó y el sobrenadante del medio se analizó mediante CL-EM/EM. Las trazas del cromatograma muestran la tebaína producida por esta cepa y salutaridinol y salutaridina acumulados, junto con los estándares. Estos rastros son representativos de dos muestras.

Ejemplo 11: Ingeniería de proteínas de enzimas en la rama de morfinano cadena abajo para mejorar la producción de productos de morfinano de un huésped microbiano heterólogo.

[0263] En este ejemplo, se introdujeron mutaciones en el marco de lectura abierto de una enzima de ruta particular mediante amplificación con Mutazyme II (ver Tabla 6). Se incluyó suficiente ADN molde en la reacción de amplificación para dar como resultado una tasa de mutación de 1-4 sustituciones de nucleótidos por gen. La biblioteca mutagenizada se clonó en el vector pYESIL mediante reparación de huecos directamente en la levadura. En varios casos, las cepas de levadura seleccionadas para la expresión de la biblioteca contenían copias integradas de genes que generan el sustrato de la enzima mutagenizada. Por ejemplo, una biblioteca de variantes de CODM se transformó en una cepa con copias integradas de T6ODM y COR1.3 y se alimentó con tebaína en el medio de cultivo. La expresión de T6ODM y COR1.3 en estas cepas aseguró que la codeína y la neopina estarían disponibles como sustratos para cada variante CODM introducida. Las colonias individuales se inocularon en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante 96 horas, luego se ensayó la producción de su producto mediante espectrometría de masas por cromatografía líquida (CL-EM). En el ejemplo de la biblioteca CODM, los productos analizados fueron morfina y neomorfina. En cada pantalla, las variantes con producción mejorada de BIA se secuenciaron y se volvieron a clonar para su validación. La Tabla 6 incluye un resumen de las variantes de enzimas mutadas identificadas a través de los análisis que dieron como resultado una mayor producción de BIA en la levadura.

[0264] FIG. 24 muestra datos de la actividad potenciada validada de uno de estos mutantes. En particular, la FIG. 24 ilustra la generación de una variante de la enzima CODM que exhibe actividad potenciada en levadura a través de mutagénesis aleatoria y cribado, de acuerdo con formas de realización de la invención. Se generó una biblioteca de variantes de CODM mutagenizando la región codificante mediante PCR propensa a errores. Una variante identificada mediante el cribado de esta biblioteca, CODM N35S,G335V, se volvió a clonar y se expresó en una cepa de levadura que albergaba copias integradas de T6ODM y COR1.3. Esta cepa y otra cepa de control que expresaba CODM de tipo salvaje se cultivaron en medio líquido con tebaína 1 mM. Después de 96 horas, se analizó la actividad CODM del medio de cultivo mediante CL-EM. La variante CODM N35S,G335V produjo 1,4 veces más morfina y 2,6 veces más neomorfina que una cepa que expresa CODM de tipo salvaje.

Ejemplo 12: Optimización de la expresión y las condiciones de crecimiento para mejorar la producción de alcaloides de bencilisoquinolina a partir de un huésped microbiano heterólogo

[0265] La producción de alcaloides de becilisoquinolina a partir de un huésped microbiano diseñado puede mejorarse aún más optimizando la expresión de las enzimas de la ruta y las condiciones de crecimiento. En un ejemplo, la expresión de salutaridinol 7-O-acetiltransferasa se alteró en levadura expresando la enzima de una serie de diferentes promotores. La levadura se modificó para expresar heterólogamente genes de levadura con codones optimizados que codifican P. somniferum salutaridinol 7-O-acetiltransferasa de diferentes promotores (como se proporciona en (A) de la FIG. 25). Se ensamblaron dos casetes de expresión (PTPii-yPbSalR, Px-yPsSalAT) en un cromosoma artificial de levadura (YAC) con un marcador de sección TRPI. El YAC se colocó en la levadura y las células se cultivaron en medios completos sintéticos con la solución de abandono adecuada (-Trp) y se alimentaron con salutaridina. Los metabolitos de BIA se analizaron después de 72 horas de crecimiento mediante análisis CL-EM/EM. La optimización del nivel de expresión de la enzima de la ruta puede dar como resultado una mayor producción del alcaloide morfinano tebaína (como se proporciona en (A) de la FIG. 25).

[0266] La optimización de las condiciones de cultivo de la cepa, que incluye, entre otros, la fuente de azúcar, la temperatura de crecimiento y el pH, se puede usar para aumentar la producción de alcaloides de bencilisoquinolina a partir de cepas de levadura modificadas (como se proporciona en (B) y (C) de la FIG. 25). En un ejemplo, se varió el pH para aumentar la producción de tebaína a partir de cepas de levadura manipuladas. Se ensamblaron dos casetes de expresión (PTPii-yPbSalR, PTEFi-yPsSalAT) en un cromosoma artificial de levadura (YAC) con un marcador de sección TRP1. El YAC se colocó en levadura y las células se cultivaron en medio completo sintético con la solución de abandono adecuada (-Trp), se resuspendieron en tampón a pH 5,7-9 y se alimentaron con salutaridina. Los metabolitos de BIA se analizaron después de 16 horas de incubación mediante análisis CL-EM/EM. Los niveles del alcaloide de promorfinano de 4 anillos salutaridinol y del alcaloide de morfinano de 5 anillos tebaína aumentaron en función del aumento del pH (como se proporciona en (B) de la FIG. 25).

[0267] En otro ejemplo, se variaron la temperatura, el azúcar y el contenido de tampón del medio para aumentar la producción de tebaína a partir de cepas de levadura manipuladas. Se ensamblaron tres casetes de expresión (P^tdh3-D94yPsSS, PTPii-yPbSalR, P^tefi- yPsSalAT) en un cromosoma artificial de levadura (YAC) con un marcador de sección TRP1. El YAC se colocó en una levadura que albergaba un casete de expresión para una citocromo P450 reductasa (P^tefi-ATR1 o PTEFi-y PsCPRv2) integrada en el cromosoma. Las cepas de levadura se cultivaron en medios completos sintéticos con la solución de abandono apropiada (-Trp) y se alimentaron con (R)-reticulina. Los metabolitos de BIA se analizaron después de 72 horas de crecimiento mediante análisis CL-EM/EM. El análisis indica que la producción microbiana del alcaloide morfinano tebaína aumenta bajo ciertas condiciones de cultivo (medios tamponados con dextrosa a 30 °C, como se proporciona en (C) de la FIG. 25).

[0268] En consecuencia, la FIG. 25 ilustra la optimización de la fermentación para la conversión de (R)-reticulina en tebaína mediante levadura manipulada, de acuerdo con formas de realización de la invención. El análisis CL-EM/EM del ensayo tamponado de células completas de (A) variantes del promotor SalAT, (B) cepas SalR y SalAT cultivadas en diferentes condiciones de pH y (C) optimización de la fuente de azúcar, la temperatura de crecimiento y el contenido de tampón de medios. (A) Cepas de levadura diseñadas para contener un solo cromosoma artificial de levadura con el marcador selectivo TRPI y dos casetes de expresión: PTPii-yPbSalR y Px-yPsSalATcon varios promotores de SalAT. La levadura se cultivó a partir de colonias recién transformadas en 3 mL de medio selectivo durante la noche y se retrodiluyó 1:20 en 0,5 mL de medio en tubos de cultivo con salutaridina 100 μM (Specs). Después de 72 horas en la incubadora con agitación, la levadura se sedimentó y el sobrenadante del medio se analizó mediante CL-EM/EM. (B) Cepas de levadura diseñadas para contener un solo cromosoma artificial de levadura con el marcador selectivo TRP1 y dos casetes de expresión: Pjp n -yPbSalR y PTEF1-yPsSalAT. La levadura se cultivó a partir de colonias recién transformadas en 3 mL de medio selectivo durante la noche, se retrodiluyó en 3,5 mL de medio hasta una DO de 0,8, se cultivó durante 7 horas, se sedimentó y luego se resuspendió en pH 5,7 MOPS o tampón Tris de pH 7, 8 o 9 con Salutaridina 10 μM (Especificaciones). Después de 16 horas en un agitador a 30 °C, la levadura se sedimentó y el sobrenadante del tampón se analizó mediante CL-EM/EM. Las barras de error representan el rango de dos muestras. (C) Optimización de la fuente de azúcar, la temperatura de crecimiento y el contenido de tampón de medios. En este experimento, las cepas de levadura están diseñadas para tener P^tefi-ATR1 integrado en el locus TRPI y contienen un solo cromosoma artificial de levadura con el marcador selectivo TRPI y tres casetes de expresión: P^tdh3- yECFS1-83-yPsSS95-505, PTPzi-yPbSalR y P^tefi-yPsSalAT. Las levaduras se cultivaron a partir de colonias recién transformadas en 3 mL de medio selectivo durante la noche y se diluyeron 1:20 en 0,5 ml de medio en tubos de cultivo con 100 μM (R)-reticulina (Toronto Research Chemicals). Después de 72 horas en la incubadora con agitación, la levadura se sedimentó y el sobrenadante del medio se analizó mediante CL-EM/EM.

Ejemplo 13: Levadura diseñada para la producción de tebaína a partir de un armazón de alcaloide de 1-bencilisoquinolina temprano

[0269] Las cepas de levadura pueden diseñarse para la producción del alcaloide de morfinano tebaína, o alcaloides de morfinano derivados de tebaína, a partir de alcaloides de 1-bencilisoquinolina tempranos. Como ejemplo, las cepas de levadura manipuladas pueden producir productos de alcaloides de morfinano a partir de racémico o (SJ-norcoclaurina o racémico o (SJ-norlaudanosolina (FIGS.5, 6, 7 y (B) de 23). Las cepas de levadura se modifican para producir (SJ-reticulina a partir de (SJ-norcoclaurina o racémica o (Sj-norlaudanosolina mediante la integración de tres o cinco casetes de expresión en el genoma de la levadura. Para producir (SJ-reticulina a partir de (SJ-norlaudanosolina racémica, los casetes de expresión integrados codifican Papaver somniferum norcoclaurina 6-O-metiltransferasa (Ps6OMT, EC 2.1.1.128), 4'-O-metiltransferasa (Ps4'OMT, EC 2.1.1.116), y coclaurina-N-metiltransferasa (CNMT, EC 2.1.1.140), cada una con un promotor TEF1 (Hawkins y Smolke. 2008. Nat. Chem. Biol. 4: 564-73). Para producir (S)-reticulina a partir de racémica o (S)-norcoclaurina, la cepa alberga además casetes de expresión integrados para Eschscholzia californica N-metilcoclaurina 3'-hidroxilasa (yEcCYP80B1, EC 1.14.13.71) y ATR1 oryPsCPRv2 con codón optimizado de levadura. reductasa expresada a partir del promotor TDH3 o TEF1 (CpR, EC 1.6.2.4). Estas cepas se modifican aún más para incorporar enzimas que catalizan la epimerización (p. ej., CYP-COR), salutaridina sintasa, salutaridin reductasa y salutaridinol acetiltransferasa para convertir racémica o (S)-norcoclaurina o racémica o (SJ-norlaudanosolina en el alcaloide morfinano tebaína, o alcaloides de morfinano derivados de tebaína (FIG. 7). Como alternativa a la expresión de una enzima que cataliza la epimerización, se pueden diseñar 6OMT, 4'OMT, CNMT y/o CYP80B1 de manera que se produzca rac-reticulina a partir de rac-norcoclaurina o rac-norlaudanosolina.

[0270] En un ejemplo, se modificó una cepa de levadura para convertir rac -norlaudanosolina en tebaína. La cepa de levadura alberga casetes de expresión integrados que codifican Ps6OMT, Ps4'OMT, CNMT e yPsCPRv2, cada uno con un promotor TEF1. Se ensamblaron cuatro casetes de expresión (P^tdh3- yEcCFS1-83-yPsSS95-505, PTPii-yPbSalR, P^tefi-yPsSalAT, P^{h x t z} -CYP-COR 89405) en un cromosoma artificial de levadura (YAC) con un marcador selectivo TRP1 en esta cepa. La cepa de levadura que albergaba el YAC y los casetes integrados se cultivó en medios completos sintéticos con la solución de abandono adecuada (-Trp) y sustrato rac-norlaudanosolina 1 mM. Después de 96 horas de crecimiento, se analizó el medio en busca de metabolitos BlA mediante análisis CL-EM/EM. Se detectó tebaína casi 200 nM ((B) de la FIG. 23). En esta cepa también se pueden usar otras variantes de salutaridina sintasa modificada por ingeniería genética (FIG. 22, Ejemplo 10).

Ejemplo 14: Cepas de levadura de plataforma diseñadas para la producción de reticulina a partir de L-tirosina

[0271] Se construyó una cepa de levadura de plataforma que produce la (S)-reticulina intermedia BlA de punto de ramificación clave a partir de L-tirosina (FIG. 5). Específicamente, se integraron cuatro construcciones de expresión multigénica en el genoma de una cepa de levadura. La composición de las cuatro construcciones se indica en la FIG. 26.

Cada construcción consta de 4 o 5 genes expresados a partir de promotores constitutivos fuertes. Los genes se colocan en cada locus como casetes de expresión completos que comprenden un promotor, un marco de lectura abierto de genes y un terminador, como se especifica en las anotaciones sobre el esquema. El esquema muestra la orientación de cada casete de expresión según la dirección de la flecha que representa un gen determinado. Los marcadores seleccionables están en cursiva en la anotación y representados por flechas grises en el esquema. Cada marcador de selección está flanqueado por sitios loxP para permitir la eliminación del marcador del locus. Además, cada construcción tiene un marcador seleccionable flanqueado por sitios loxP para que pueda ser eliminado por la recombinasa Cre.

[0272] En la primera construcción de integración, se integran cuatro genes heterólogos de Rattus norvegicus en el locus YBR197C junto con un marcador de selección G418 (KanMXJ. Se requieren RnPTPS, RnSepR, RnPCD y RnQDHPR para sintetizar y regenerar tetrahidrobiopterina (BH4) a partir de la ruta de síntesis de folato endógeno de levadura. Cada gen tiene codones optimizados para la expresión en levadura.

[0273] En la segunda construcción de integración, se integran cuatro genes heterólogos en el locus HIS3 junto con el marcador de selección HISS. La tirosina hidroxilasa de Rattus norvegicus (RnTyrHJ convierte la tirosina en L-DOPA usando el cosustrato BH4 generado por la construcción de integración anterior. El gen RnTyrH puede ser cualquiera de los mutantes mejorados o de tipo salvaje que confieren actividad potenciada (p. ej., W166Y, R37^e y R38E, Ejemplo 2). Un segundo gen de Rattus norvegicus, RnDHFR, codifica una enzima que reduce la dihidrobiopterina (un producto de oxidación de BH4) a BH4, aumentando así la disponibilidad de este cosustrato. En la tercera construcción también se incluye PpDODC de Pseudomonas putida, una enzima que convierte la L-DOPA en dopamina. La cuarta enzima es CjNCS de Coptis japonica, que condensa 4-HPA y dopamina para producir norcoclaurina. Cada gen tiene codones optimizados para la expresión en levadura.

[0274] En la tercera construcción de integración, cinco genes heterólogos de plantas y el marcador de selección LEU2 se integran en el locus YDR514C. Ps6OMT, Ps4'OMT y PsCNMT son metiltransferasas de Papaver somniferum y se expresan como secuencias de nucleótidos de plantas nativas. Un cuarto gen de P. somniferum, yPsCPRv2, tiene codones optimizados para levaduras y codifica una reductasa que respalda la actividad de un citocromo P450 de Eschscholzia californica, EcCYP80Al. EcCYP80A1 se expresa como su secuencia de nucleótidos de plantas nativas. Las enzimas codificadas en esta construcción realizan dos O-metilaciones, una N-metilación y una hidroxilación para producir reticulina a partir de la norcoclaurina producida por la construcción de integración anterior.

[0275] En la construcción de integración final, se integran copias adicionales de los genes endógenos de Saccharomyces cerevisiae ARO₄Q166K, ARO7T226, TKL1 y ARO10 en el locus ARO₄ junto con un marcador de selección de resistencia a la higromicina. ARO4Q166K y ARO7T2261 son mutantes resistentes a la retroalimentación de ARO4 y ARO10, cada uno de los cuales codifica una sustitución de un solo par de bases con respecto a la secuencia de tipo salvaje. TKL1 y AROIO son idénticos a los genes de levadura nativos, pero se expresan detrás de potentes promotores. Aro4p y Aro7p son enzimas en la biosíntesis de aminoácidos aromáticos, incluida la tirosina. La eliminación de la inhibición por retroalimentación de estas enzimas da como resultado una regulación al alza de la biosíntesis de tirosina endógena. La sobreexpresión de Tkl1p aumenta la vía de las pentosas fosfato, lo que da como resultado un mayor suministro de eritrosa 4-fosfato (E4P), un precursor de la tirosina. La sobreexpresión de Aro 10p aumenta la producción de 4-HPA.

[0276] Las cepas de levadura de plataforma se pueden construir con cualquier número de los cuatro casetes de expresión. Específicamente, las cepas de levadura de plataforma se construyeron con las construcciones de integración 1-4 y las construcciones de integración 1-3. en la última cepa en la que se excluye la construcción de sobreproducción de tirosina (construcción 4), se puede suministrar tirosina adicional en el medio de cultivo para apoyar la biosíntesis de reticulina. Se pueden incorporar modificaciones genéticas adicionales en las cepas de la plataforma para respaldar la producción de BIA corriente abajo y aumentar el flujo hacia la biosíntesis de BIA.

[0277] Las cepas de levadura se cultivaron en medios completos sintéticos con la solución de eliminación de aminoácidos apropiada a 25 y 30 °C. Los metabolitos de BIA en el sobrenadante del medio se analizaron después de 48 y 96 horas de crecimiento mediante análisis CL-EM/EM.

Ejemplo 15: Levadura modificada para la producción de tebaína y otros alcaloides de morfinano a partir de L-tirosina

[0278] Las cepas de levadura pueden modificarse para la producción del alcaloide de morfinano tebaína, o alcaloides de morfinano derivados de tebaína, a partir de precursores tempranos como la tirosina. Como ejemplo, las cepas de levadura de plataforma descritas en el Ejemplo 14 pueden modificarse adicionalmente para producir los productos de alcaloides de morfinano a partir de L-tirosina (FIG. 7).

[0279] La cepa de levadura plataforma que produce (S)-reticulina a partir de L-tirosina (véase la descripción en el Ejemplo 14) se diseñó adicionalmente para incorporar enzimas catalizadoras de la epimerización, como la CYP-COR recientemente identificada, salutaridina sintasa, salutaridina reductasa y salutaridinol acetiltransferasa para convertir la (S)-reticulina biosintetizada en el alcaloide de morfinano tebaína, o alcaloides de morfinano derivados de tebaína (FIG. 7). Se ensamblaron tres casetes de expresión (PTDH3-yEcCFS1-26-yPbSS33-504, PTPii-yPbSalR, PTEFi-yPsSalAT) en un cromosoma artificial de levadura (YAC) con un marcador selectivo TRPI directamente en la cepa de levadura de plataforma. También se pueden incorporar al YAC otras variantes de salutaridina sintasa modificadas por ingeniería genética (FIG. 22, Ejemplo 10). La cepa de levadura resultante también se transformó con un plásmido CEN/ARS de bajo número de copias con un marcador selectivo URA3, un promotor TDH3 y una secuencia codificante de CYP-COR.

[0280] Las cepas de levadura que albergan el YAC, el plásmido de bajo número de copias y los casetes integrados se cultivaron en medios completos sintéticos con la solución de abandono adecuada (-Ura-Trp) a 25 y 30 °C. Después de 96 horas de crecimiento, se analizó el medio en busca de metabolitos BIA mediante análisis c L-EM/e M. Se realizó una mayor optimización del cultivo con respecto a la temperatura, la fuente de carbono, la condición de pH y la composición de los medios para mejorar la producción de BIA.

[0281] Se pueden introducir modificaciones genéticas adicionales en las cepas de levadura para producir alcaloides de morfinano derivados de la tebaína (FIG. 7). En un ejemplo, los casetes de expresión P^{a d hi}-T60DM-Y^adhi, P^hxt7-COR-Y^pgki y P^tefi-CODM-T^cyci se ensamblaron e integraron directamente en el locus trp l de la cepa de levadura productora de tebaína (Thodey et al. al., 2014). En otro ejemplo, estas cepas de levadura pueden modificarse aún más para producir alcaloides de morfina adicionales ensamblando directamente los casetes de expresión PGPD-morA-TcYci, PpGKi-morB-T^pho5 e integrando esta construcción en el locus ura3 en el cromosoma (Thodey et al., 2014).

Ejemplo 16: Levadura modificada para la producción de berberina y otros alcaloides de protoberberina a partir de L-tirosina

[0282] Las cepas de levadura pueden modificarse para la producción del alcaloide berberina y de protoberberina, ftalideisoquinolina y alcaloides de berberina derivados de berberina o los intermedios involucrados en la formación de berberina, a partir de Ltirosina (FIGS. 5, 8). Por ejemplo, se ensamblaron tres o cuatro casetes de expresión (P^{pc ki}- P^sBBE-T^pho5, P jEFi-yPsS9OMT-YcYci, P jDHs-yCjCAS-TADHi, con o sin Pjp h-yBwSTOX-TsjE2) en una levadura artificial. cromosoma (YAC) con un marcador de sección TRP1. El YAC se colocó en una cepa de levadura de plataforma que produce (S)-reticulina a partir de L-tirosina (ver Ejemplo 14) y además alberga un casete de expresión para una citocromo P450 reductasa (P^tefi-ATR1 o P^tefi-PsCPRv2) integrado en el cromosoma. Un plásmido de alto número de copias adicional que contenía el casete de expresión P^tefi-S90MT-T^cyci se transformó en esta cepa para mejorar el flujo hacia los productos corriente abajo.

[0283] Las cepas de levadura se cultivaron en medios completos sintéticos con la solución de eliminación de aminoácidos apropiada (-Trp) a 25 y 30 °C. Los metabolitos de BIA en el sobrenadante del medio se analizaron después de 48 y 96 horas de crecimiento mediante análisis CL-EM/EM.

Ejemplo 17: Levadura diseñada para la producción de noscapina y otros alcaloides noscapinoideos a partir de L-tirosina

[0284] Las cepas de levadura se pueden diseñar para la producción de alcaloides de ftalideisoquinolina tales como narcotolina y noscapina, los intermedios implicados en la formación de noscapina, o derivados de los mismos a partir de L-tirosina (Figuras 5, 9).

[0285] Por ejemplo, los casetes de expresión P^{a d h i}-CAS-T^adhi, P^hxt7-CYP82Y1-Y^pgki, P^tefi-S90MT-T^cyci y P^{pg ki}-BBE-T^pho5 se ensamblaron e integraron directamente en el locus trp l de una cepa de levadura de plataforma que produce (S)-reticulina a partir de L-tirosina (ver Ejemplo 14) y además alberga un casete de expresión para una citocromo P450 reductasa (P^tefi-ATR1 o P^tefi-PsCp R v 2) integrado en el cromosoma. A continuación, los casetes de expresión P^gpd-TNMT-T^cyci, P^pgki -PsMT2-Y^pho5, P^{a d h i}-CYP82X1 -T^gapi y P^{p yki}-PsCXE1-T^mü se ensamblaron e integraron directamente en el locus ura3 del Cepa de levadura. A continuación, los casetes de expresión P^hxt7-CYP82X2-Y^cyci, P^gpd-PsAT1-T^{a d hi}, PTPii-PsSDR1-TSTE2y P^{pg ki}-PsMT3-Y^pho5 se ensamblaron e integraron directamente en el locus leu2 de la cepa de levadura. Un plásmido adicional de copia alta que contenía el casete de expresión P^tefi-S90MT-T^cyci y un plásmido adicional de copia baja que contenía el casete de expresión P^hxt7-CYP82X2-T^cyci se transformaron en esta cepa de levadura para mejorar el flujo hacia los productos corriente abajo.

[0286] Las cepas de levadura se cultivaron en medios completos sintéticos con la solución de eliminación de aminoácidos apropiada (-Trp, Ura) a 25 y 30 °C. Los metabolitos de BIA en el sobrenadante del medio se analizaron después de 48 y 96 horas de crecimiento mediante análisis CL-EM/EM.

Ejemplo 18: Levadura modificada para la producción de sanguinarina y otros alcaloides de benzofenantridina a partir de L-tirosina

[0287] Las cepas de levadura se pueden modificar para la producción de alcaloides de protoberberina, protopina y benzofenantridina como el producto final sanguinarina, los intermedios implicados en la formación de sanguinarina, o derivados de la misma a partir de L-tirosina (Figuras 5, 10).

[0288] Por ejemplo, los casetes de expresión P^{a d hi}-TNMT-T^adhi, P^hxt7-EcSTS -T^pgki, P^gpd-EcCFS-T^cyci y P^{pg ki}-BBE-T^pho5 se ensamblaron e integraron directamente en el locus trp1 de una cepa de levadura de plataforma que produce (S)-reticulina a partir de L-tirosina (ver Ejemplo 14) y además alberga un casete de expresión para una citocromo P450 reductasa (P^tef1-ATR1 o P^tef1-PsCPRv2) integrado en el cromosoma. A continuación, los casetes de expresión P^gpdP^sMSH -T^cyci, P^{pg ki}-P^sP6H -T^pho5 se ensamblaron directamente y se integraron en el locus ura3 de la cepa de levadura.

[0289] Las cepas de levadura se cultivaron en medios completos sintéticos con la solución de eliminación de aminoácidos apropiada a 25 y 30 °C. Los metabolitos de BIA en el sobrenadante del medio se analizaron después de 48 y 96 horas de crecimiento mediante análisis CL-EM/EM.

Ejemplo 19: Levadura modificada para la producción de hidrocodona y otros alcaloides de morfinano a partir de L-tirosina

[0290] Las cepas de levadura pueden modificarse para la producción de hidrocodona. Como ejemplo, la cepa de levadura productora de tebaína descrita en el Ejemplo 15 puede modificarse adicionalmente para producir el ingrediente farmacéutico activo hidrocodona. FIG. 27 ilustra la producción de tebaína e hidrocodona en cepas de levadura manipuladas, de acuerdo con formas de realización de la invención. En la FIG. 27A, se incorporaron construcciones multigénicas en cepas de levadura manipuladas que contenían las construcciones 1-4 (FIG. 26). En la FIG. 27B, la integración de la construcción 5 aumentó los títulos de reticulina con respecto a la cepa que contenía las construcciones 1-4. en la FIG. 27C, la integración de la construcción 6 conduce a la producción de tebaína a partir de azúcar. La tebaína producida por la cepa modificada se identificó en el medio de cultivo mediante análisis CL-EM/EM y se comparó con un estándar de referencia comercial. en la FIG. 27D, la introducción de la construcción 7 en un YAC conduce a la producción de hidrocodona a partir de azúcar. La hidrocodona producida por la cepa modificada se identificó en el medio de cultivo mediante análisis CL-EM/EM y se comparó con un estándar de referencia comercial.

[0291] En un ejemplo, la cepa de levadura que produce reticulina a partir de L-tirosina (consulte la descripción en el Ejemplo 14) se diseñó adicionalmente para aumentar la producción de reticulina, luego se modificó aún más para incorporar las enzimas productoras de tebaína descritas en el Ejemplo 15 y luego se modificó además de incorporar tebaína desmetilasa y morfinona reductasa para convertir la tebaína biosintetizada en hidrocodona. Se incorporaron tres construcciones de expresión multigénica en la cepa de levadura productora de reticulina descrita en el Ejemplo 14; dos como integraciones cromosómicas y una tercera como una construcción YAC episomal.

[0292] En la primera construcción, se incorporaron genes para aumentar la biosíntesis de (S)-reticulina a partir de la cepa descrita en el Ejemplo 14. Para aumentar la producción de (S)-reticulina, copias adicionales de CjNCS (para aumentar la incorporación de dopamina en norcoclaurina) y Ps4'OMT (para aumentar la incorporación de 3-hidroxi-N-metilcoclaurina en (S)-reticulina) se incorporaron a la cepa. También se incluyó una copia adicional de RnTyrH para aumentar la entrada de tirosina en la vía heteróloga para la biosíntesis de reticulina. Los tres casetes de expresión (PpGKi-yCjNCS-YpHO5, P^tefi-Ps4'OMT-T^cyci, y PGPD-RnTyrHWR-TADHi) se integraron en el locus YPL250C junto con el marcador de selección ble para la resistencia a la fleomicina (FIG. 27A). La cepa de levadura resultante exhibió un aumento de 4 veces en la acumulación de reticulina (FIG. 27B).

[0293] En la segunda construcción, se incorporaron genes para producir tebaína a partir de (S)-reticulina biosintetizada. Se ensamblaron cuatro enzimas para la producción de tebaína descritas en el Ejemplo 15 como cuatro casetes de expresión (PHXT7-yPbCYP-COR-TcYci, YGPD-yEcCFS1-83-yPbSalSyn92-504-YADHi, PTPii-yPbSalR-TsTE2, y P^{pg ki}- yPsSalAT-T^pho5) e integrado en el locus TRP1 con el marcador de selección KIURA3 (FIG. 27A). La cepa de levadura resultante produjo tebaína cuando se cultivó en medio de cultivo de levadura estándar (FIG. 27C).

[0294] En la tercera construcción, se incorporaron genes para producir hidrocodona a partir de tebaína biosintetizada. En este ejemplo, la actividad de tebaína desmetilasa se incorporó como enzima T6ODM de P. somniferum para convertir tebaína en neopinona, y la actividad de morfinona reductasa se incorporó como enzima morB de P. putida para convertir codeinona en hidrocodona. En este ejemplo, la conversión intermedia de neopinona en codeinona ocurrió espontáneamente. En otro ejemplo, se incluye una enzima isomerasa para convertir enzimáticamente neopinona en codeinona. Los genes T6ODM y morB se optimizaron por codones para levadura y se incluyeron como dos casetes de expresión (PGPD-yT6 ODM-YADH1 y PPGK1-yPbmorB-TPHO5) ensamblados en un ^y A^c con marcador de selección TRP1 (FIG. 27A). En este ejemplo, la cepa de levadura se cultiva en un medio complementado con 2-oxoglutarato 50 mM para respaldar la actividad de T6ODM, una dioxigenasa dependiente de 2-oxoglutarato. En otro ejemplo, la célula huésped de levadura se modifica para acumular 2-oxoglutarato a niveles suficientes para soportar la actividad de T6ODM. La cepa de levadura que albergaba las construcciones multigénicas descritas y cultivadas en el medio de cultivo descrito biosintetizó hidrocodona a partir de glucosa (FIG. 27D).

Ejemplo 20: Aumento del número de copias de genes para superar los cuellos de botella en el flujo de la ruta

[0295] En algunos casos, las cepas de levadura pueden optimizarse para mejorar la producción de alcaloides de bencilisoquinolina aumentando el número de copias de genes para enzimas cuya actividad es limitante.

[0296] En un ejemplo, la producción de reticulina en una cepa productora de reticulina como se describe en el Ejemplo 19 se optimizó mediante la adición de una tercera copia del gen de ACS (FIG. 28). En este ejemplo, la cepa original tenía una copia de ACS integrada en el locus YMR206Wy otra en el locus YPL250C, cada una expresada a partir del promotor PGK1. Se integró una tercera copia de ACS (expresada a partir de un promotor TDH3) en el locus BUD9 y esta modificación resultó en un aumento de 2 veces en los títulos de reticulina. En otro ejemplo, se incorporan a la cepa copias adicionales de otras enzimas en la vía. para aumentar aún más los títulos de reticulina.

Tabla 3. Enzimas de adaptación

Tabla 4: Comparación de impurezas que pueden estar presentes en concentrado de paja de amapola (u opio) y medio de cultivo de levadura clarificado.

(Continuación)

Tabla 6. Mutaciones beneficiosas de varias enzimas identificadas mediante selección de mutagénesis.

[0297] Mientras que las formas de realización preferidas de la invención se han mostrado y descrito en este documento, será obvio para los expertos en la técnica que dichas formas de realización se proporcionan de manera de ejemplo solamente. a los expertos en la técnica se les ocurrirán ahora variaciones, cambios y sustituciones sin apartarse de la invención tal como se describe en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un método para epimerizar un alcaloide de (S)-l-bencilisoquinolina a un alcaloide de (R)-l-bencilisoquinolina dentro de una célula huésped microbiana manipulada, que comprende:

poner en contacto el alcaloide de (S)-1-bencilisoquinolina con al menos una enzima que comprende una epimerasa,

en la que el contacto del alcaloide de (S)-1-bencilisoquinolina con al menos una enzima convierte el alcaloide de (S)-1-bencilisoquinolina en un alcaloide de (R)-1-bencilisoquinolina dentro de la célula huésped microbiana manipulada, en el que la al menos una enzima se produce mediante el cultivo de la célula microbiana manipulada que tiene una secuencia de codificación para codificar al menos una enzima,

donde el alcaloide de (S)-1-bencilisoquinolina se pone en contacto con una cantidad suficiente de dicha al menos una enzima que comprende una epimerasa tal que al menos el 5 % del alcaloide de (S)-1-bencilisoquinolina se convierte en alcaloide de (R)-1-bencilisoquinolina,

y además:

(i) la epimerasa tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 15; o

(ii) la epimerasa comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, y 15.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además: añadir un alcaloide de (S)-1-bencilisoquinolina al cultivo celular.

3. El método de la reivindicación 2, que comprende además: recuperar el alcaloide de (R)-1-bencilisoquinolina, o un derivado del mismo, del cultivo celular.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la epimerasa comprende un dominio oxidasa y un dominio reductasa.

5. El método de la reivindicación 4, en el que el dominio oxidasa es un dominio similar a la oxidasa del citocromo P450.

6. El método de la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en el que el dominio de reductasa es un dominio similar a la codeinona reductasa.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la célula microbiana manipulada es una célula de levadura manipulada.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el alcaloide de (S)-1-bencilisoquinolina es (S)-reticulina.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el alcaloide de (R)-1-bencilisoquinolina es (R)-reticulina.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el alcaloide de (S)-1-bencilisoquinolina se produce dentro de la célula microbiana por una ruta metabólica que comienza con L-tirosina.